SE526185C2 - Metod och anordning för immunanalys - Google Patents

Description

I: 10 15 20 25 30 Denna teknik kan utföras i flera kombinationer, varvid det vanligaste förfarandet är att belägga brunnarna i en mikrotiterplatta med antigen och tillåta reaktion med en antikropp som är konjugerad till lämpligt enzym, så- som horseradish-peroxidas eller alkalisk fosfatas. Alternativt är brunnarna belagda med en monoklonal antikropp följt av en reaktion med antigenen.

Antigenen reageras därefter med en annan monoklonal antikropp som är konjugerad med lämpligt enzym. Den förra kallas direkt ELlSA-teknik och den senare sandwich-ELlSA. I ytterligare ett utförande är brunnarna belagda med antigen följt av reaktion med en monoklonal antikropp som tillåts reage- ra vidare med ett annat den första antikroppen specifikt antikropp-enzym- konjugat. l sådana analyser verkar enzymet som en märkning för mätning av reaktionens omfattning. Exempelvis är antalet med brunnen förbundna en- zymmolekyler en indikation på mängden antigen i brunnama. l JP-A-62169054 visas en fastfasimmunanalys där små mängder anti- genlösning bestäms genom att adsorbera antigen på ett polymerrörs inre vägg och utföra en antigen-antikropp-reaktion i provlösningen.

'US-A-562485O skildrar immunanalyseri genomskinliga kapillärrör sär- skilt för detektering av antibiotika i mjölk. Ett proteinkonjugat i form av en med ett protein kovalent bunden hapten används. Detektering åstadkommes ge- nom att bestråla en specifik bindningspardel sammansatt med en fluoresce- rande märkning.

Pâ samma sätt bestäms en herbicid ien kompetitiv immunanalys (Dzgoev et al., Analytica Chimica Acta 347 (2097) 87-83). Guldbelagda glas- kapillärrör fungerar som bärare i avbíldande ELISA, varvid bundna konjugat av herbicid/bovint serum albumin bestäms genom kvantifiering av kemilumi- niscensemissionen från enzymsönderfall av ett luminogent substrat. Det längs hela kapillärörets längd emitterade ljuset komplicerade tolkningen av erhållen data. Även om ELlSA är en analytisk immunokemisk metod med hög käns- lighet för mätning av koncentration av alla ovan angivna proteiner finns fortfa- rande ett behov av en mer känslig metod. Fysiologiskt viktiga substanser, p4056se0Ops se översättn; utskrivet 2003-03-04ap 10 15 20 25 30 _)\ u 5.72* pn-n n J i låš s såsom akut-fasproteiner, har tidigare kunnat mätas ner till omkring 10” M och pesticider har kunnat detekteras för koncentrationer ner till 1040 M.

Det finns dock mycket känsliga metoder för bestämning av koncentra- tion av substanser, såsom akut-fasproteiner, med hjälp av ELISA-system beskrivna i känd teknik. WO9920998 beskriver en sådan känslig metod, var- vid ELlSA utförs i ett kapillärrör från vilken ljus emitteras. Ljuset detekteras och kvantifieras och detekteringen sker huvudsakligen från den kapillärrörets längdriktning.

Ett problem med metoder och anordningar av känd teknik är att de är tidsödande och kostsamma. Således krävs en mer kostnadseffektiv och snabbare analys där tvättningsförfarandet av exempelvis fysiologiska prov förenklas. Det är även önskvärt att åstadkomma ett analyssystem som är robust och kan användas på plats.

En nackdel med metoder och anordningar av känd teknik är att de er- fordrar stora vätskevolymer. Följaktligen resulterar detta i klen diffusion av vätskorna i kapillärrören.

Ytterligare ett problem med metoder och anordningar av känd teknik är den otillräckliga reproducerbarheten, vilket påverkar analysens precision.

Exempelvis beror analysresultaten från metoder med kapillärrör, från vilken ljus emitteras och detektering skeri en riktning längs kapillärröret, på avstän- det mellan vätskeytan i kapillärröret och detektorn. Således mäste varje ka- pillärrör fyllas till exakt samma nivå för att erhålla reproducerbarhet.

Ytterligare ett problem med metoder och anordningar av känd teknik är att vätskeflödet är svårt att hantera.

Ytterligare en nackdel med metoder och anordningar enligt känd teknik är att endast statiska processer kan analyseras.

UPPFlNNlNGEN I SAMMANFATTNING Ett syfte med föreliggande uppfinning är att undanröja ovan angivna nackdelaroch problem med metoder och anordningar för analys av koncent- p4056se00ps se översättn; utskrivet 2003-O3-04ap o a o ola Oo n u u .n 10 15 20 25 30 525485 nnn nnnn n n nn n n nn nn n n n n n n n n nn n nn nn nn n n n n n n nn nnn nnnnnn nn n ann n nnn nn nn v n nan n nn n n .n n n nn 4 . . . . . .. ration av en biologiskt aktiv substans i ett prov med hjälp av ELlSA enligt _ känd teknik. Föreliggande uppfinning åstadkommer en effektiv metod och anordning för utförande av sådana analyser inom kort tid.

Metoden och anordningen enligt uppfinningen har utvecklats för analys av en okänd koncentration av en substans i ett prov, varvid substansen ana- lyseras i ett analyssystem i en rörledning genom att detektera och kvantitiera från analyssystemet emitterad strålning, såsom ljus. Även andra typer av strålning kan användas, såsom radioaktiv strålning och liknande, vilket är uppenbart för en fackman. Företrädesvi-s används dock ljus.

Den substans som ska analyseras kan vara en naturlig proteinsub- stans eller en molekyl som spontant binder till en sådan substans. Substan- sen är exempelvis en biologiskt aktiv substans, såsom proteiner, akut- fasproteiner, virus, bakterier, etc. Ett exempel på akut-fasproteiner är hjärtin- farktmarkörer, såsom FABP (Fatty Acid Binding Proteins eller fettsyrabindan- de proteiner), CK-MB, triponin-T eller triponin-l, myoglobin och GPBB (Gly- cogene Phosphorolase iso-enzyme BB). Ett exempel på proteiner är cystatin C som kan användas som markör för njurskador. Naturligtvis kan även andra substanser analyseras, vilket är uppenbart för en fackman.

Föreliggande uppfinning innefattar en fast bärare i form av en rörled- ning som fungerar som reaktionscell för ELlSA. Rörledningen är anordnad i en mikroplatta där åtminstone ett parti därav år strålnings- eller ljuspermea- belt. Mikroplattan sträcker sig i huvudsakligen ett plan. Således kan mikro- plattan vara en tunn platta med en plan yta. Mikroplattan kan vara försedd med rörledningen längs mikroplattans plan, vilken rörledning leder vätskor genom mikroplattans plan.

Mikroplattan kan formas i ett material, såsom glas, plastmaterial, en polymer, kisel eller kiselföreningar. Företrädesvis är mikroplattan utförd i po- lystyren. Mikroplattan kan vara ljuspermeabel eller transparant i en riktning mot detektom. Mikroplattan kan vara ljusperrneabel i en riktning motsatt de- tektorn, varvid ljusspridning reduceras och ljuset koncentreras eller reflekte- ras mot detektorn. Altemativt kan ett ljusreflekterande skikt eller en ljusreflek- terande platta vara anordnad vid mikroplattan för att reflektera det emitterade p4056se00ps se översättn; utskrivet 2003-O3-04ap 10 15 20 25 30, 523 'lWlfÉ 5 ljuset i en riktning mot detektorn. Exempelvis är mikropiattan anordnad mel- lan detektorn och det Ijusreflekterande skiktet. Mikroplattan kan vara en for- msprutad produkt eller en formpressad produkt. Således kan mikropiattan med rörledningen formas på konventionella sätt. Vidare kan rörledningen formas genom att fräsa ut lämpliga spàri en bottenplatta hos mikropiattan och därefter förse bottenplattan med en täckplatta, varvid bottenplattan och täckplattan bildar mikropiattan. Denna metod används dock lämpligen vid tillverkning av mikroplattori liten skala eftersom den erfordrar relativt omfat- tande arbetsinsats.

Mikroplattan innefattar åtminstone ett inlopp för att föra in vätskor i rör- ledningen och åtminstone ett utlopp för vätskorna. Mikroplattan kan innefatta ett flertal inlopp för att undvika kontamination. Exempelvis innefattar mikro- piattan ett första inlopp för proteiner, ett andra inlopp för ett tvättningsmedium och ytterligare inlopp för exempelvis substrat etc. Följaktligen kan mikroplat- i tan innefatta ett flertal inlopp för att föra in ett flertal vätskor i rörledningen.

Vätskorna kan föras in i mikroplattans rörledning på konventionellt sätt.

Vätskorna kan även ledas genom rörledningen på konventionellt sätt, såsom med hjälp av tryck eller kapillärkrafter. I ett utförande av uppfinningen kan vätskor ledas med hjälp av enperistaltisk pump. Utloppet kan vara utfört för att leda vätskor till ett utloppskärl. l ett alternativt utförande av föreliggande uppfinning kan mikropiattan innefatta inuti mikropiattan anordnade behållare. Behållarna kan vara för- bundna med rörledningen eller reaktionscellen genom rör för att leda vätskor från behållarna till reaktionscellen i en förutbestämd ordning då analysen ini- tieras.

Rörledningens yta kan behandlas fysiskt, såsom med plasma, eller kemiskt för att förbättra adsorption eller kovalent bindning med ytan. Exem- pelvis är ytan behandlad med MaxisorpW' (NUNC A/S, Roskilde, Denmark) eller liknande. Maxisorpm är en polystyrenbaserad modifierad yta med hög affinitet för polära grupper och används vanligtvis i samband med ELISA.

Altemativt kan rörledningsytorna behandlas med en beläggning av typ sol- Moseseoops se översäim; urskfivei zooeos-ozzap 10 15 20 25 30 gel. Beläggningen av typ sol-gel kan användas för en mikroplatta gjord av glas.

Mikroplattan kan vara placerad mot en detektor för detektering av från rörledningen emitterat ljus. Således kan mikroplattans plan vara anordnad huvudsakligen i rät vinkel mot detektorn, varvid även vätskeflödet är i huvud- sakligen rät vinkel däremot. Enligt uppflnningen detekteras således ljuset från analyssystemet i huvudsakligen vinkelrät riktning mot mikroplattan. Detektorn kan vara en Ijuskänslig detektor, såsom en fotocell, fotodiod, optisk fiber, fastfassensor (innefattande en uppsättning ljuskänsliga celler) eller en foto- multiplikator anordnad på lämpligt avstånd från mikroplattan. Detektom kan , vara förbunden med en display, en dator och en registreringsapparat på kon- ventionellt sätt för behandling och återgivning av erhållna resultat.

Rörledningen ger en stor aktiv yta och är anordnad inuti mikroplattan i en struktur som ger en reaktionscell med stort detektionsområde och goda vätskeflödesegenskaper. Reaktionscellen motsvarar väsentligen ett parti av rörledningen där reaktionen sker och detektom detekterar. l ett utförande av uppfinningen innefattar rörledningen kurvor, varvid reaktionscellen är anord- nad med ett flertal kurvor i detektionsområdet. Således böjer varannan kurva hos rörledningen i reaktionscellen huvudsakligen 180° till höger och återstå- ende kurvor 180°'till vänster. Vidare ökar avståndet mellan respektive kurva i riktning från inloppet eller inloppen mot en centrumposition hos reaktionscel- len och minskar från reaktionscellens centrumposition mot utloppet. Även andra strukturer hos rörledningen i reaktionscellen är möjliga. l ett alternativt utförande av föreliggande uppfinning är rörledningen i reaktionscellen utförd som en spiral med utloppet i mitten därav. l ytterligare* ett utförande av upp- finningen är rörledningen utförd med större bredd i reaktionscellen, varvid ett stort detektionsområde åstadkommes. Rörledningen kan exempelvis innefat- ta ett parti som skjuter ut i mikroplattans plan, i vilket parti vätskor kan distri- bueras för att åstadkomma en reaktionscell med stort detektionsområde. En mikroplatta kan även innefatta ett flertal rörledningar och ett flertal reaktions- celler som möjliggör analys och detektering av en substans i ett flertal prov samtidigt. En detektor kan vara anordnad för att detektera emitterat ljus från respektive reaktionscell individuellt eller från ett flertal reaktionscelleri kom- p4056seO0ps se översåttn; utskrivet 2003-03-04ap 10 15 20 25 30 526 185 neon o ao nu n i o so I o o 0 o o nano o o» n oo n n o 0 annons oo n I. o :nu nu lo I n soc-o u. a c nu »in on oo T . . . . . .. .. .. .. .. . bination. Således kan mikroplattan åstadkomma ett multlanalyssystem för analys av ett flertal protein samtidigt. Exempelvis kan mikroplattan innefatta 3 eller fler oberoende reaktionsceller, varvid det från respektive reaktionscell emitterade ljuset detekteras.

Rörledningens tvärsektlon kan vara rektangulär, triangulär, cirkulär, halvcirkelformad eller utförd med annan lämplig form. Rörledningen kan vida- re ha ett djup på omkring 0,2 mm och en bredd på omkring 0,2 mm.

Följaktligen åstadkommer föreliggande uppfinning en reaktionscell med goda diffusionsegenskaper och ett stort detektionsområde som endast behöver små volymer vätska. Detta resulterar i en mer kostnadseffektiv och snabbare analys som är enkel att använda och där vätskeflödet är enkelt att hantera, vilket är fördelaktiga egenskaper för instrument vid behandling. An- ordningen och metoden enligt uppfinningen resulterar även i utmärkt repro- ducerbarhet, vilket påverkar analysens precision positivt. Föreliggande upp- finning möjliggör vidare analys av dynamiska processer till följd av det konti- nuerliga vätskeflödet och den goda diffusionen. Ytterligare en fördel med fö- religgande uppfinning är möjligheten till multi-analys för att analysera ett fler- tal substanser samtidigt.

I andra tillämpningsområden kan uppfinningen även användas för att analysera och detektera patogena substanser och antioxidanteri livsmedel etc.

KORT BESKRIVNING AV RlTNlNGARNA Uppfinningen ska nu närmare beskrivas med hjälp av utföringsexem- pel under hänvisning till bifogade ritningar, på vilka Fig. 1 är en principiell figur som visar uppställning av en anordning en- ligt uppfinningen, Fig. h2 är en schematisk vy som visar mikroplattan i rät vinkel mot mik- roplattans plan enligt ett utförande av uppfinningen, p4056se00ps se översättn; utskrivet 2003-03-04ap 10 15 20 25 30 få) 6 'l LT! C C* CPI 8 ä ä .2 - 2.: -fi Fig. 3 är en schematisk vy som visar mikropiattan i rät vinkel mot mik- roplattans plan enligt ett alternativt utförande av uppfinningen, Fig. 4 är en schematisk vy som visar mikropiattan i rät vinkel mot mik- roplattans plan enligt ytterligare ett alternativt utförande av uppfinningen, Fig. 5 är en schematisk vy som visar mikropiattan i rät vinkel mot mik- roplattans plan enligt ytterligare ett alternativt utförande av uppfinningen, Fig. 6 är en schematisk vy som visar mikropiattan i rät vinkel mot mik- roplattans plan enligt ytterligare ett alternativt utförande av uppfinningen, Fig. 7 är en schematisk vy som visar mikropiattan i rät vinkel mot mik- roplattans plan enligt ytterligare ett alternativt utförande av uppfinningen, Fig. 8 är en schematisk vy som visar mikropiattan i rät vinkel mot mik- roplattans plan enligt ytterligare ett alternativt utförande av uppfinningen, Fig. 9 är en schematisk tvärsektionsvy av rörledningen enligt ett ut- förande av uppfinningen, Fig. 10 är en schematisk tvärsektionsvy av rörledningen enligt ett al- ternativt utförande av uppfinningen, Fig. 11 är en schematisk tvärsektionsvy av rörledningen enligt ytterli- gare ett alternativt utförande av uppfinningen, Fig. 12 är en schematisk tvärsektionsvy av rörledningen enligt ytterli- gare ett alternativt utförande av uppfinningen, Fig. 13 är en schematisk tvärsektionsvy av rörledningen enligt ytterli- gare ett alternativt utförande av uppfinningen, och Fig. 14 är en schematisk tvärsektionsvy av mikropiattan enligt utföran- det i Fig. 13.

UPPFlNNlNGEN Den principiella figuren i Fig. 1 visar en uppställning av en analysan- ordning för enzymkopplad immunabsorberande analys (ELlSA) enligt uppfin- ningen. Föreliggande uppfinning innefattar en fast bärare för ELISA inuti en p4056se00ps se översättn; utskrivet 2003-03-04ap ~~ 10 15 20 25 30 E36 lšlíš n n 0 nn nnn nn nn n ny; nn. gg n. o n :nn n nn n n n: n n nn nn I n n n n nn on on nn nn stràlnings- eller ljuspermeabel mikroplatta 10. Mikroplattan 10 är utförd som en tunn platta med en huvudsakligen plan yta. Således sträcker sig mikro- plattan 10 huvudsakligen i ett plan. Mikroplattan 10 är utförd för att leda vätskor genom mikroplattans 10 plan. Exempelvis leds vätskorna till mikro- plattan 10 från åtminstone ett kärl 11, innefattande vätskan som ska föras in i mikroplattan 10 genom åtminstone ett inloppsrör 12. våtskeflödet förs genom mikroplattan 10 och vidare till ett utloppskärl 13 genom ett utloppsrör 14. Den huvudsakliga riktningen hos våtskeflödet genom mikroplattan 10 visas med hjälp av pilen A. Analysuppställningen kan innefatta ett flertal kärl 11 och in- loppsrör 12 för att föra in vätskor i mikroplattan 10.

Mikroplattan 10 är placerad mot en detektor 15 för detektering av det från mikroplattan emitterade ljuset till följd av en ELlSA-relaterad reaktion.

Således är mikroplattans 10 plan huvudsakligen vinkelrätt i förhållande till detektom 15, varvid även våtskeflödet är huvudsakligen vinkelrätt däremot.

Ljuset från analyssystemet detekteras således enligt uppfinningen från en riktning i huvudsakligen rät vinkel mot mikroplattans 10 plan. Detektom 15 är exempelvis en ljuskänslig detektor, såsom en fotocell, fotodiod eller en optisk fiber, anordnad på lämpligt avstånd från mikroplattan 10. l deti Fig. 1 visade utförandet är detektorn 15 förbunden med en pro- cessor och en display i form av en dator 16 på konventionellt sätt för behand- ling och återgivning av erhållna resultat. Analyssystemet kan även var för- bundetmed konventionella förstärkare, styrorgan och registreringsapparater, vilka ej visas i figurema, för att underlätta behandling och återgivning av er- hållna resultat ytterligare.

Med hänvisning till Fig. 2 och Fig. 3 visas mikroplattan 10 enligt upp- finningen. Mikroplattan 10 innefattar eninuti mikroplattan 10 anordnad rör- ledning 17 för ledning av vätskor däri. En yta hos rörledningen 17 bildar den fasta bäraren för ELISA-processen. Mikroplattan 10 innefattar åtminstone ett inlopp för att föra in vätskor i rörledningen 17 och åtminstone ett utlopp för vätskorna. Mikroplattan 10 kan innefatta ett flertal inlopp för olika vätskor för att undvika kontamination. I det i Fig. 2 visade utförandet innefattar mikroplat- tan 10 ett första inlopp 18 för att föra in en första vätska i rörledningen 17 p4056seOOps se översåttn; utskrivet 2003-03-04ap 10 15 20 25 30 C TT i* 3 ON ...x C C (Ti 10 inuti mikroplattan 10, ett andra inlopp 19 för att föra in en andra vätska i rör- ledningen 17 och ett utlopp 20 för vätskor som lämnar rörledningen till ut- loppskärlet 13. l det i Fig. 3 visade utförandet innefattar mikroplattan 10 även ett flertal inlopp 21 för att föra in ytterligare vätskor, såsom en tvättningsväts- ka, i rörledningen 17. Således innefattar mikroplattan 10 ett flertal inlopp 21 för att föra in ett flertal vätskor i rörledningen 17. I det visade utförandet är inloppen 18, 19, 21 och utloppet 20 anordnade vinkelrätt mot mikroplattans 10 plan, varvid vätskorna förs in i mikroplattan 10 i en riktning motsatt detek- torn 15. Exempelvis förs vätskorna in och leds genom rörledningen 17 med hjälp av tryck eller kapillärkrafter. Exempelvis förs vätskoma in i och leds ge- nom rörledningen 17 med hjälp av en peristaltisk pump.

Rörledningen 17 är anordnad inuti mikroplattan 10 i en struktur som i åstadkommer en reaktionscell som ger en stor aktiv yta och har ett stort de- tektionsområde 22 såväl som goda vätskeflödesegenskaper. Detektionsom- rådet 22 visas med hjälp av streckade linjer i figurerna. Reaktionscellen mot- svarar väsentligen ett parti av rörledningen 17 där ELISA-relaterade reaktio- ner sker. Rörledningen 17 innefattar ett flertal kurvor som bildar en reaktions- cell med stort detektionsområde 22. Företrädesvis är detektorn 15 anordnad för att detektera från reaktionscellen emitterat ljus. l de i Fig. 2 och Fig. 3 visade utförandena innefattar rörledningen kur- vor, varvid reaktionscellen innefattar ett flertal kurvor i detektionsområdet 22.

Således böjer varannan av rörledningens 17 kurvori reaktionscellen av hu- vudsakligen 180° till höger och återstående 180° till vänster. Avståndet mel- lan respektive kurva ökar i en riktning från det första inloppet 18 och det andra inloppet 19 mot mitten av reaktionscellen och minskar från mitten av reaktionscellen mot utloppet 20 för att åstadkomma en reaktionscell med goda vätskeflödesegenskaper och ett stort ljusemitterande område. Rörled- ningens 17 kurvor sträcker sig i mikroplattans 10 plan.

Med hänvisning även till Fig. 4, som visar ytterligare ett alternativt ut- förande av rörledningens 17 struktur inuti mikroplattan 10, är rörledningen 17 utförd med kurvor i fom1 av en spiral som sträcker sig i mikroplattans 10 plan. l det i Fig. 4 visade utförandet är utloppet 20 placerat i mitten av spiralen, p4056se0Ops se översättn; utskrivet 2003-03-04ap 10 15 20 25 30 526 135 __ .,_ _ 11 .: ': ' .E 3.: .f varvid utloppet 20 är anordnat huvudsakligen i mitten av reaktionscellen.

Andra strukturer hos rörledningen 17 är uppenbara för en fackman och om- fattas av uppfinningen.

Med hänvisning till Fig. 5 är rörledningen 17 utförd med en större bredd -i området för reaktionscellen, varvid ett stort detektionsområde 22 åstadkommes. l det i Fig. 5 visade utförandet innefattar rörledningen 17 ett parti som sträcker sig i mikroplattans plan, i vilket parti vätskor kan fördelas för att åstadkomma en reaktionscell med stort detektionsområde 22. Exem- pelvis ökar rörledningens 17 bredd i en riktning från inloppen 18, 19 mot mit- ten av reaktionscellen och minskar från mitten av reaktionscellen mot utlop- pet 20, varvid ett huvudsakligen cirkulärt eller elliptiskt utrymme åstadkom- mes till följd av det parti hos rörledningen 17 som huvudsakligen skjuter uti mikroplattans plan. Dimensionerna hos rörledningen kan således variera för att åstadkomma en lämplig reaktionscell med stort detektionsområde 22.

Rörledningens 17 dimension tvärs mikroplattans 10 plan kan också varieras.

Andra strukturer hos rörledningen 17 är uppenbara för en fackman och om- fattas av uppfinningen.

Med hänvisning till Fig. 6 och Fig. 7 kan en mikroplatta 10 även inne- fatta ett flertal rörledningar 17 och ett flertal reaktionsceller, vilket gör det möj- ligt att analysera och detektera substanser i ett flertal prov samtidigt. Mikro- plattan 10 kan således ge ett multianalyssystem för analys av ett flertal prote- iner samtidigt. l det i Fig. 6 visade utförandet innefattar mikroplattan 10 tre oberoende rörledningar 18, varvid inloppen 18, 19 och utloppen 20 är speci- fika för respektive rörledning 17. Mikroplattan 10 är således utförd med ett flertal rörledningar 17 som ger ett flertal reaktionsceller, varvid det från re- spektive reaktionscell emitterade ljuset detekteras. Med hänvisning till Fig. 6 kan det från respektive reaktionscell emitterade ljuset detekteras separat, varvid respektive reaktionscell motsvarar ett enskilt detektionsområde 22.

Med hänvisning till Fig. 7 kan det från ett flertal reaktionsceller emitterade ljuset detekteras i kombination, varvid detektionsområdet 22 innefattar ett flertal reaktionsceller. Detektorn 15 täcker således ett flertal reaktionsceller samtidigt. Andra strukturer och antal av rörledningen 17 är uppenbara för en fackman och omfattas av uppfinningen. ' p4056se0Ops se översättn; utskrivet 2003-03-04ap 10 15 20 25 30 526 183% 12 o 000000 Med hänvisning till Fig. 8 innefattar mikroplattan 10 behållare 22-24 anordnade inuti mikroplattan 10. Behållarna 22-24 är förbundna med rörled- ningen 17, eller reaktionscellen, för att leda vätskor från behållarna 22-24 till reaktionscellen. l det i Fig. 8 visade utförandet innefattar mikroplattan 10 en första behållare 22 för en första vätska, en andra behållare 23 för en andra vätska och en utloppsbehållare 23 för förbrukade vätskor. Exempelvis är be- hållarna 22, 23 i förväg fyllda med lämpliga vätskor för utförande av analy- sen, vilka vätskor kan ledas till reaktionscellen i en förutbestämd ordning då analysen initieras. Exempel på sådana vätskor är buffert, tvättningsvätskor, substrat, plasma, etc. Behållarna 22-24 kan ersätta kärlen 11 och utloppskär- let 13. Andra strukturer och antal av behållarna 22-24 är uppenbara för en fackman och omfattas av uppfinningen.

Med hänvisning till Fig. 9-12, som är tvärsektionsvyer av rörledningen 17 längs mikroplattans 10 plan, kan rörledningens 17 tvärsektion vara rek- tangulär, triangulär, cirkulär eller halvcirkelformad. l det i Fig. 9 visade utfö- randet är rörledningen 17 utförd med rektangulär tvärsektion med en sida riktad mot detektorn 15. Då triangulär eller halvcirkelformad tvärsektion an- vänds är rörledningen 17 utförd för att reflektera ljuset mot detektorn 15. Sä- ledes är en plan yta hos rörledningen 17 anordnad i en riktning mot detektorn 15. l det i Fig. 10 visade utförandet är rörledningen 17 utförd med en tvärsek- tion i form av en liksidig triangel med en sida sträckande mot detektorn 15 och en spets sträckande tvärs mikroplattans 10 plan i motsatt riktning. l det i Fig. 11 visade utförandet är rörledningen 17 utförd med en halvcirkelformad tvärsektion med en plan sida sträckande mot detektorn 15 och en båge sträckande tvärs mikroplattans 10 plan i motsatt riktning. l det i Fig. 12 visade utförandet är rörledningen 17 utförd med cirkulär tvärsektion. Rörledningen 17 är dimensionerad för god diffusion av vätskor däri. Företrädesvis är rör- ledningen 17 anordnad med ett djup på omkring 0,2 mm och en bredd mot detektorn 15 på omkring 0,2 mm. Andra former på rörledningens 17 tvärsek- tion och dimensioner hos rörledningen 17 är uppenbara för en fackman och omfattas av uppfinningen.

Med hänvisning till Fig. 13 och Fig. 14 visas mikroplattan 10 enligt yt- terligare ett utförande. Mikroplattan 10 innefattar en bottenplatta 23 och en p4056se00ps se översättn; utskrivet 2003-03-04ap 10 15 20 25 30 000000 O I 0 0 täckplatta 24. Bottenplattan 23 är försedd med ett spår. Täckplattan 24 är anordnad på bottenplattan 23 i en riktning mot detektorn 15 för att täcka spå- ret, varvid rörledningen 17 bildas. Bottenplattan 23 är exempelvis utförd i ett ljuspermeabelt material eller ett ljusreflekterande material och täckplattan 24 är utförd i ett ljuspermeabelt material, varvid det från reaktionscellen emitte- rade ljuset riktas mot detektorn 15. Alternativt är ett ljusreflekterande skikt 25 anordnat vid mikroplattan i en riktning motsatt detektorn 15. Det ljusreflekte- rande sklktet 25 är således anordnat under mikroplattan 10 i figurerna, varvid mikroplattan 10 är placerad mellan det ljusreflekterande sklktet 25 och detek- tom 15. Det ljusreflekterande skiktet 25 är utfört för att reflektera det från re- aktionscellen emitterade ljuset, varvid ljusspridning reduceras och ljuset rik- ' tas mot detektom 15.

Mikroplattor av olika material kan användas i metoden enligt uppfin- ningen. Exempelvis är mikroplattan gjord av glas, plastmaterial, polymerer, kisel, kiselföreningar eller liknande material. Företrädesvis är mikroplattan gjord av polystyren. Företrädesvís är det eller de material som täcker mikro- plattan mot detektorn permeabla för fotoner som alstras av analyssystemet inuti rörledningen. Alternativt är reaktionscellsomràdet täckt med transparant material eller ljuspermeabelt material, varvid därifrån emitterat ljus kan detek- teras av detektom. Ett ljuspermeabelt material kan användas för återstoden av mikroplattan, dvs partier hos mikroplattan anordnade i en riktning motsatt detektorn, för att reducera ljusspridning. Altemativt är mikroplattan endast försedd med ett ljusperrneabelt material mellan reaktionscellen och detek- torn, varvid ett ”fönster” mot detektom åstadkommas. Mikroplattan kan såle- des vara utförd för att koncentrera ljuset mot detektom. Exempelvis är mikro- plattan en formsprutad produkt eller en formpressad produkt. Således kan den med rörledningen försedda mikroplattan formas på konventionella sätt.

Alternativt kan rörlednigen formas genom att fräsa ut lämpliga spår i en bot- tenplatta hos mikroplattan och därefter förse bottenplattan med en täckplatta, varvid bottenplattan och täckplattan bildar mikroplattan.

Rörledningens yta kan behandlas för att öka dess kapacitet, dvs öka antalet molekyler eller partiklar som är förbundna med ytan. Exempelvis be- handlas ytan genom fysiska eller kemiska ytbehandlingsmetoder. Rörled- p4056se00ps se översâttn: utskrivet 2003-03-04ap 00 0000 00 0000 0> 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 00 00 00 0 0 0000 0000 0 0 0 0 IIOGOO 10 15 20 25 fw 526 185 14 “noen o ningens yta kan behandlas med Maxisorpf" (NUNC A/S, Roskilde, Danmark) eller liknande före immobilisering. Maxisorpf” är en polystyrenbaserad modi- fierad yta med hög affinitet för polära grupper och används vanligtvis i sam- band .med ELlSA. Andra exempel päytbehandling är plasmabehandling, be- handling för ökad kovalent bindning med rörledningens yta, etc. Exempelvis behandlas rörledningen i en mikroplatta av glas med en beläggning av typ sol-gel. Vid behandling med sol-gel kan den fasta bäraren i form av rörled- ningen i mikroplattan förbehandlas med specifika reagens för att avlägsna interfererande molekyler följt av sllanisering av ytan med silanbaserade före- ningar. Silanets karaktär är av särskilt intresse till följd av effekten på bind- ning av reagens med fastfasbäraren. Två olika metoder kan användas. Den första innebär att behandlingen kan begränsas till en typ av silan som före- trädesvis bildar en beläggning av typ sol-gel i rörledningen och den andra innebär att blandade silaner med kortare beredníngstider används för att bil- da en matris på den fasta fasens yta. Exempelvis kan ett kontinuerligt flöde av silanlösning som är lämplig förjämn sllanisering av den fasta bäraren fö- ras in i glasmikroplattan med hjälp av en peristaltlsk pump eller liknande.

Ett exempel på silanlösning för sol-gel-beläggning bereds genom att blanda 5 ml tetrametoxisilan (TMOS), 5 ml 3-gycidylpropoxitrimetoxisilan (GPTMOS), 90 ml avjoniserat vatten och 100 ul 0,1 M HCI. Silanlösningens pH korrigerades till 4,0 med en 10-procentig ättiksyralösning och lösningen omrördes över natten vid 4°C och 200 rpm i en lufttät behållare för hydrolys av silanet för att erhålla sol-lösningen. Den erhållna klara lösningen använ- des för sol-gel-beläggningsprocessen.

Ytterligare ett exempel innefattar aktiverade bärarmaterial för kovalent bindning av en bioaktiv molekyl via en ändgrupp därav. De funktionella de- larna på bärarmaterialet (kiselmaterial, såsom glaspartiklar, kolloidal kiseldi- oxid, CPG, hydrogel, etc) är avsett för hydroxyl- eller sulfhydrylgrupper då det ej är aktiverat, varvid kloratomer substitueras med hydroxyl- eller sulfhyd ryl- grupper för kovalent bindning av den bioaktiva molekylen via dess ändgrupp.

Det emitterade ljuset avläses därefter optiskt med hjälp av den ljus- känsliga detektorn som är placerad på lämpligt avstånd från mikroplattan, p4056se00ps se översättn; utskrivet 2003-03-04ap 10 15 20 25 30 “Eíió 185 15 ï .ï -.I= ' ï..= -.É= ' 'Äš 513 ' ' varvid det från mikroplattan enligt uppfinningen emitterade ljuset detekteras i huvudsakligen rät vinkel däremot. Exempelvis innefattar en sådan ljusdetek- tor en fotodiod, fotocell, optisk fiber, fotomultiplikator eller lavinfotodiod (APD).

Genom denna uppställning och placering av mikroplattan åstadkom- mes utmärkt uppsamling av ljus och analysens effektivitet ökar väsentligt jämfört med analysmetoder av känd teknik.

Analysmetoden enligt uppfinningen är lämplig för ljus som emitteras genom kolorimetriska, fluorescerande och kemiluminiscerande system. Såle- des kan kvantitativa analyser utföras som alstrar en signal, exempelvis från en kemiluminiscensalstrande reaktion, vilken mäts numeriskt, såsom med hjälp av en optisk avläsningsmekanism med multianalysfunktion.

Kvantitativa analysresultat kan exempelvis erhållas med hjälp av ett system som alstrar en signal från luminiscens där ett specifikt bindningsrea- gens är begränsat till en fast fas istället för att vara fördelat i analysmediet.

Detta kan åstadkommas om den i den fasta fasen i mikroplattan alstrade sig- nalen registreras med hjälp av en ljuskänslig anordning. Således kan kost- samma optiska avläsningssystem undvikas och den alstrade signalen kan lagras direkt i form av tid mot intensitet. l synnerhet är analysresultat i denna formåanvändbara då ett stort antal prover undersöks. Genom denna uppställ- ning kan en substans i ett prov analyseras för koncentrationer nertill 1049 M enligt uppfinningens metod.

Genom att använda metoden enligt uppfinningen åstadkommes en ro- bust och enkel analys som kan användas för att bestämma koncentrationen av ett fysiologiskt analyt vid immunanalys. Närmare bestämt åstadkommes en metod för analys av en biologiskt aktiv substans i ett prov där den använ- da signalen för bestämning av analytet registreras direkt i en persondator med hjälp av lämpligt gränssnitt. Det registrerade ljuset erhålls från en ljus- källa i mikroplattan, vars intensitet är ett mått på analytkoncentrationen.

Genom att använda metoden enligt uppfinningen åstadkommes vidare analysmetoder för att i ett prov bestämma förekomst av naturligt protein eller en molekyl som spontant förbinds därmed. En immunosorbent förbunden p4056se00ps se översättn; utskrivet 2003-03-04ap 10 15 20 25 30 526 li?- UI CCI C I II QIO' Il 0 I 22 22 1 s 2 .' . . 22.. 2' ' 16 å" 32 °._.'X _Z.__2'2__I .“2'2 .. 22 med den fasta fasen i en enzym-immunanalys kan exempelvis vara ett antigenprotein eller motsvarande antikropp.

Exempel på intressanta akut-fasproteiner är FABP, CK-MB, troponin- T, troponin-l, myoglobin, GPBB och Cystatin. Andra klassiska exempel på akut-fasproteiner är ceruloplasmin, komplement CS och C4, orosomuooid, a1- antitrypsin, on-antichymotrypsin, heptaglobin, fibrinogen, C-reaktivt protein och serumamyloid A. Ytterligare exempel på sådan proteiner är retinolbin- dande protein (RBP) och mannosbindande protein (MBP). Den enzymmärkta lmmunoreaktanten kan vara en antikropp till det aktuella proteinet eller en molekyl som spontant förbinds därmed.

Enzymmärkningen är lämpligen inblandad i en luminiscensalstrande reaktion och företrädesvis i en kemiluminiscensalstrande reaktion. Det emit- terade ljuset används som medel för att bestämma omfattningen av kom- plexbildning mellan immunosorbenten och den enzymmärkta reaktanten.

Bindningen mellan märkt reagens och fast fas detekteras därefter av detek- torn som avläser kemiluminiscenssignalen och den elektroniska signalen re- gistreras exempelvis i en dator. Reaktionens omfattning avläses följaktligen som från reaktionscellen inuti mikroplattan alstrade intensitetsenheter på lämpligt avstånd.

Reaktionens omfattning kan även bestämmas efter ytterligare före- ningar tillsatts blandningen som ska analyseras. l synnerhet är föreningar som kan bringas luminiscera med hjälp av fotokemiska, kemiska eller elek- trokemiska medel av intresse. Vid fotoluminiscens bringas föreningen lysa i en process där den absorberar elektromagnetisk strålning, såsom fluore- i scens eller fosforescens. Vid kemiluminiscens alstras ett lysande ämne ge- nom att energi kemiskt överförs till den aktuella föreningen.

Då en sådan förening exciteras till luminiscerande tillstånd på kemisk väg erhålls ett högenergiderivat, exempelvis genom kemisk oxidation. Efter oxidation emitterar det kemiluminiscerande ämnet en foton. Vissa föreningar som kan användas i luminiscensbaserade metoder, såsom luminol, är inte repetitiva för detektering utan producerar endast en foton per molekyl. Såda- na föreningar är särskilt användbara i samband med uppfinningen. Luminol p4056se0Ops se översättn; utskrivet 2003-03-04ap 10 15 20 25 30 f* :a | a.) (rs i\> gm 11"! ooo ooo o o oo oo oo o o o oo oo o o o o o o oo oooo o oo oo oo o o o o o o oooo ooo oooooo oo o ooo o ooo oo oo o o o ooo o oo o o oo o o oo oo o o o o o o oo oo oo oo ooo o används företrädesvis som kemiluminiscerande medel. Det finns dock ett flertal alternativa föreningar som kan användas, såsom isoluminol, luciferin och andra akridinestrar.

Således åstadkommes ett effektivt detekteringssystem exempelvis med en märkning av horseradish-peroxidas tillsammans med luminol och en peroxid, såsom H2O2, i reaktionsmediet.

Vanligtvis har kemiluminiscerande reaktioner kort livstid och resulterar itidsbegränsningar vid utförande av experiment. Detta problem kan undanrö- jas genom användning av förstärkare som förbättrar ljusemissionens effekti- va varaktighet. Sådana reagens förlänger emissionen med avseende på tid och möjliggör tillbörlig mätning.

Genom att tillsätta en lämplig förstärkare till reaktionsmediet, vilken är tillräckligt kemiskt inert och inte påverkas av peroxidreaktionen, förses såle- des ljuset från mediet med lämplig våglängd, vilken är tillräckligt hög för att möjliggöra förstärkning av signalen efter reaktionen. Förstärkningen av de kemiluminiscerande reaktionema åstadkommes företrädesvis med hjälp av föreningar som väsentligen är substituerade fenoler, såsom p-jodfenol. En lämplig kemiluminiscerande blandning innefattar således en lösning av 0,5 mM luminol, 0,01 mM 4-jodfenol och 50% väteperoxid.

Det är fördelaktigt att införliva ett fluorescerande system i reaktions- blandningen som kan absorbera kemiluminiscensljuset och emittera ljus vid en annan våglängd. Ett sådant system underlättar avläsning av effekten hos det i provet alstrade ljuset, i synnerhet om det emitterade ljuset avläses ge- nom lämpligt filter. Exempelvis kan blått ljus från luminol absorberas av cou- marin, vilket ger ett gult/grönt ljus. Det fluorescerande medlet är placerat på eller nära det signalavläsande organet. Alternativt kan det fluorescerande medlet användas som en i provet fördelad markör så att endast lokalt alstrad kemiluminiscens detekteras. l en väl utförd och företrädesvis använd sandwich-immunanalys im- mobiliseras ett första specifikt reagens (en monoklonal antikropp) med speci- fik reaktivitet för analytet (t.ex. ett protein) på den fasta fasen. l detta sam- p4056seO0ps se översättn; utskrivet 2003-03-04ap 10 15 20 25 30 manhang avser en specifik antikropp en antikropp som har valts ut bland fle- ra liknande lämpliga antikroppar.

Analysmediet, vilket vanligtvis är vattenhaltigt, innehåller ett andra bin- dande reagens med specificitet för analytet och en bunden märkning. l från- varo av analyt sker ingen koppling med det första reagenset och således alstras ingen detekterbar signal. l sandwichstrukturen verkar analytet huvud- sakligen som en länkmolekyl mellan det omärkta (första) och det märkta (andra) reagenset och bindningsomfattningen ger ett mått på analytkoncent- rationen i provet.

En typisk direkt immunanalys utförs vanligtvis i vattenhaltigt medium som är i kontakt med den fasta fasen som innehåller den immobiliserade specifika molekylen (dvs en känd mängd av det analyt som ska analyseras) med särskild specificitet för igenkänningsmolekylen (dvs en monoklonal anti- kropp) som bestäms. Analysmediet består av ett kvantitativt överskott av märkt monoklonal antikropp (eller analoga ämnen med identiska igenkän- ningsplatser) som tillåts reagera med olika mängder av det immobiliserade analytet, varvid en kalibreringskurva åstadkommas. Den okända mängden analyt bestäms genom att immobilisera analytet på rörledningens väggar och fylla upp oreagerade platser hos den fasta fasen med inert protein (exempel- vis en gelatinfraktion). Analytet tillåts därefter reagera med det specifika och märkta reagenset. Reaktionens omfattning bestäms av signalen från det märkta reagenset och avläses med hjälp av en enzymatisk analys som alst- rar ett detekterbart ljus. Detta ljus kan exempelvis vara fluorescens eller ke- miluminiscens som avläses med hjälp av lämpliga detektorer. Det emitterade ljuset jämförs med referensresultat, dvs resultat som erhålls i frånvaro av analyt, och en mätning av analytkoncentrationen i provet åstadkommes.

I en kompetitiv immunanalys, vilken vanligtvis utförs med vattenfasen i kontakt med den fasta fas som innehåller den immobiliserade monoklonala antikroppen, är analytet i den flytande fasen. Konkurrensen sker mellan märkt och omärkt analyt. Om analyt förekommer i ett prov blandas märkt analyt med provet i lämplig proportion och tillåts reagera med den immobili- serade fasta fasens specifika reagens. En referens erhålls genom att låta det p4056se00ps se översättn; utskrivet 2003-03-O4ap riff' 57-5 “IN .. . ... 19 =._.= i _E ~ šnš - š_ märkta analytet reagera med den ímmobiliserade fasta fasen och är ett mått på det totala reaktionen. Förekomst av omärkt analyt i provet resulterari en viss procentuell förlust av signalen, vilket således är ett mått på omärkt analyt i provet. Vanligtvis bestämmer en utspädning av provet hur den ursprungliga koncentrationen analyt i provet ska beräknas. p4056se00ps se översättn; utskrivet 2003-03-O4ap I I 000: anno 0 n u

Claims (37)

10 15 20 25 30 E? 6 l 8 f zo PATENTKRAV

1. Anordning för bestämning av koncentration av en biologiskt aktiv substans i ett prov med hjälp av enzymkopplad immunabsorberande analys (ELISA) och luminiscens, innefattande en fast bärare i en rörledning (17) för mottag- ning och bindning av en immunosorbent och mottagning av ELISA-relaterade vätskor, såsom en enzymmärkt immunoreaktant och ett enzymsubstrat, för att i en genom rörledningen (17) bildad reaktionscell åstadkomma en lumini- scensalstrande reaktion som emitterar av en detektor (15) detekterbart ljus, kännetecknad av att reaktionscellen är anordnad i en i huvudsakligen ett plan utsträckt mik- roplatta (10), vilken mikroplatta är en platta försedd med åtminstone ett ljuspermeabelt parti för att möjliggöra detektering av i reaktionscel- len alstrad Iuminiscens i huvudsakligen rät vinkel mot mikroplattans plan, att reaktionscellen innefattar ett flertal kurvpartier eller ett bredare parti av rörledningen (17) under bildande av en mer omfattande aktiv yta för den luminiscensalstrande reaktionen och ett reaktionscellen huvud- sakligen motsvarande detektionsomrâde (22), och att detektorn (15) är anordnad i huvudsakligen rät vinkel mot reaktionscel- len för att över detektionsområdet detektera det från reaktionscellen emitterade ljuset.

2. Anordning enligt krav 1, varvid mikroplattan (10) innefattar ett första inlopp (18) för att föra in en första vätska i rörledningen ( 17) och ett andra inlopp (19) för att föra in en andra vätska i rörledningen (17).

3. Anordning enligt krav 2, varvid mikroplattan (10) innefattar ett flertal inlopp (21) för att föra in ett flertal vätskor i rörledningen (17).

4. Anordning enligt krav 1, varvid mikroplattan (10) innefattar ett transparent eller ljusgenomträngligt material mellan reaktionscellen och detektorn (15). p4056se00ps se översåttndoc; utskrivet 2005-03-15ap 10 15 20 25 30 526 185 21

5. Anordning enligt krav 4, varvid mikroplattan (10) är försedd med ett ljusre- flekterande skikt (25) i en riktning motsatt detektorn (15).

6. Anordning enligt krav 4, varvid mikroplattan (10) innefattar ett för ljus oge- nomträngligt material i en riktning motsatt detektorn (15) för att reducera ljus- spridning.

7. Anordning enligt krav 1, varvid mikroplattan (10) är utförd i plastmaterial eller polymennaterial, såsom polystyren.

8. Anordning enligt krav 7, varvid mikroplattan (10) är en forrnsprutad pro- dukt eller en formpressad produkt.

9. Anordning enligt krav 1, varvid detektorn (15) är en fotodiod, fotocell, op- tisk fiber, fastfassensor eller en fotomultiplikator för detektering av från reak- tionscellen emitterat ljus.

10. Anordning enligt krav 1, varvid en tvärsektion hos rörledningen (17) är utförd för att reflektera emitterat ljus mot detektom (15).

11. Anordning enligt krav 1, varvid rörledningen (17) är utförd med en rek- tangulär, triangulär, cirkulär eller halvcirkelformad tvärsektion.

12. Anordning enligt krav 11, varvid rörledningens (17) tvärsektion är utförd med en mot detektorn (15) utskjutande plan sida och en i rät vinkel mot mik- roplattans (10) plan i motsatt riktning sträckande spets eller båge.

13. Anordning enligt krav 1, varvid rörledningens (17) kurvor sträcker sig i mikroplattans (10) plan. p4056se00ps se översättndoc; utskrivet 2005-03-15ap 10 15 20 25 30 26 'lâš CH G1 22

14. Anordning enligt krav 13, varvid varannan av rörledningens (17) kurvor i reaktionsoellen böjer av omkring 180° till höger och återstående kurvor böjer av omkring 180° till vänster.

15. Anordning enligt krav 14, varvid avståndet mellan respektive kurva hos rörledningen (17) ökar i en riktning mot en central position hos reaktionscel- len.

16. Anordning enligt krav 13, varvid rörledningens (17) kurvor är utförda som en spiral med ett utlopp (20) i mitten därav.

17. Anordning enligt krav 1, varvid mikroplattan (10) innefattar ett flertal en- skilt anordnade reaktionsceller för samtidig analys av ett flertal substanser.

18. Anordning enligt krav 17, varvid detektom (15) är anordnad för separat detektering av från respektive reaktionscell emitterat ljus.

19. Anordning enligt krav 17, varvid detektorn (15) är anordnad för att täcka ett flertal reaktionsceller samtidigt för detektering av det från ett flertal reak- tionsceller samlade emitterade ljuset.

20. Anordning enligt krav 17, varvid anordningen är utförd för multianalys av olika biologiska substanser.

21. Anordning enligt krav 20, varvid anordningen är utförd för multianalys av akut-fasproteiner.

22. Anordning enligt krav 21, varvid anordningen är utförd för multianalys av infarktmarkörer.

23. Anordning enligt krav 1, varvid mikroplattan (10) innefattar ett flertal inuti mikroplattan (10) anordnade behållare (22-24) för vätskor. p4056se00ps se óversättndoc; utskrivet 2005-O3-15ap 10 15 20 25 30 23

24. Anordning enligt krav 23, varvid en första behållare (22) och en andra behållare (23) är anordnade för att rymma vätskor för utförande av analysen, vilka behållare (22, 23) är förbundna med reaktionscellen för att leda vätskorna till reaktionscellen i en förutbestämd ordning då analysen initieras och varvid en utloppsbehâllare (24) är anordnad för utloppsvätskor.

25. Anordning enligt krav 1, varvid rörledningen (17) är ytbehandlad med Maxisorpf" eller ett kemiskt skikt.

26. Anordning enligt krav 1, varvid rörledningen (17) innefattar ett aktiverat bärarmaterial för kovalent bindning av en bioaktiv molekyl via en ändgrupp därav, varvid funktionella delar på bärarmaterialet (kiselartade material, så- som glaspartiklar, kolloidal kiseldioxid, CPG, hydrogel, etc.) är avsedda för hydroxyl- eller sulfhydrylgrupper då de inte är aktiverade och varvid klorato- mer är substituerade med hydroxyl- eller sulflwydrylgruppema för kovalent bindning av den bioaktiva molekylen via dess änd-aminogrupp.

27. Metod för bestämning av koncentration av en biologiskt aktiv substans i ett prov med hjälp av enzymkopplad immunabsorberande analys (ELISA) och luminiscens, varvid analysen utförs på en fast bärare inuti en rörledning (17) för mottagning och bindning av en immunosorbent och mottagning av ELISA-relaterade vätskor för att i en genom rörledningen (17) bildad reak- tionscell åstadkomma en luminiscensalstrande reaktion som emitterar av en detektor (15) detekterbart och kvantifierbart ljus och varvid det emitterade ljuset är proportionellt mot mängden av den analyserade biologiskt aktiva substansen, innefattande stegen att föra in ELISA-relaterade vätskor i en i huvudsakligen ett plan utsträckt mikroplatta (10) som innefattar reaktionscellen, vilken mikroplatta är en platta försedd med ett ljuspermeabelt parti för att möjliggöra detektering av i reaktionscellen alstrad luminiscens i huvudsakligen rät vinkel mot mikro- plattans plan, p4056se00ps se översättndoc; utskrivet 2005-03-15ap 10 15 20 25 30 (_11 f 3 _ .3 C ä C51 i reaktionscellen åstadkomma en mer omfattande aktiv yta för den luminiscensalstrande reaktionen och ett reaktionscellen huvudsakligen motsvarande detektionsområde (22) genom ett flertal kurvpartier eller ett bre- dare parti av rörledningen (17) i reaktionscellen, och över detektionsområdet detektera det från reaktionscellen emit- terade ljuset i huvudsakligen rät vinkel mot reaktionscellen.

28. Metod enligt krav 27, vidare innefattande steget att föra in en första väts- ka i rörledningen (17) genom ett första inlopp (18) och föra in en andra väts- ka i rörledningen (17) genom ett andra inlopp (19) för att undvika kontamina- tion.

29. Metod enligt krav 27, vidare innefattande steget att leda vätskorna till ett utloppskärl 13 via ett utlopp (20).

30. Metod enligt krav 27, vidare innefattande steget att föra in ett flertal vätskori rörledningen (17) genom ett flertal inlopp (21).

31. Metod enligt krav 27, vidare innefattande steget att detektera det från reaktionscellen emitterade ljuset med hjälp av en fotodiod, fotocell, optisk fiber, fastfassensor eller en fotomultiplikator.

32. Metod enligt krav 27, vidare innefattande steget att leda vätskor till ett flertal enskilt anordnade reaktionsceller för samtidig analys av ett flertal sub- stanser.

33. Metod enligt krav 32, vidare innefattande steget att analysera olika bio- logiska substanser.

34. Metod enligt krav 33, vidare innefattande steget att analysera akut- fasproteiner. p4056se00ps se översättndoc; utskrivet 2005-03-15ap 10 523 185 fx 25

35. Metod enligt krav 34, vidare innefattande steget att analysera infarktmar- körer.

36. Metod enligt krav 32, vidare innefattande steget att detektera det från respektive reaktlonscell emitterade ljuset separat.

37. Metod enligt krav 32, vidare innefattande steget att detektera det från ett flertal reaktionsceller samlade emitterade ljuset. p4056se00ps se översättndoc; utskrivet 2005-03-15ap