WO2007138789A1 - 免疫学的測定法およびチップ - Google Patents

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WO2007138789A1
WO2007138789A1 PCT/JP2007/057830 JP2007057830W WO2007138789A1 WO 2007138789 A1 WO2007138789 A1 WO 2007138789A1 JP 2007057830 W JP2007057830 W JP 2007057830W WO 2007138789 A1 WO2007138789 A1 WO 2007138789A1
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antibody
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reaction chamber
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Yukari Hataoka
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Panasonic Corporation
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
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    • B01L3/502753—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by bulk separation arrangements on lab-on-a-chip devices, e.g. for filtration or centrifugation

Definitions

  • the present invention relates to an immunoassay method for measuring the amount of a specific component in a sample solution using an antigen-antibody reaction, and more particularly to an immunoassay method suitable for implementation on a chip.
  • the present invention also relates to a chip suitable for carrying out this immunological assay.
  • Immunological measurement methods are roughly classified into an immunoturbidimetric method and a labeled immunization method.
  • the immunoturbidimetric method is a method for measuring a change in turbidity of a sample solution caused by an antigen-antibody complex caused by an antigen-antibody reaction.
  • the labeled immunization method is a method in which an antibody labeled with a labeling substance is used and a change in the amount of the labeling substance after an antigen-antibody reaction is measured.
  • Labeled immunization is subdivided according to the type of labeling substance. For example, radioimmunoassay that uses a radioisotope as a labeling substance, enzymno assay (EIA) that uses an enzyme, and fluorescent immunoassay that uses a phosphor. Compared to other labeled immunization methods, EIA can be carried out by simple operations with high safety of the labeled substance, and is also actively used because of high measurement accuracy.
  • a typical EIA is exemplified by an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • a solution containing a capture antigen having the same epitope as that of the antigen to be measured is introduced into the reaction chamber 7 and held at a predetermined temperature for a predetermined time, whereby the capture antigen is adsorbed on the surface of the reaction chamber 7. Thereafter, the adsorbed capture antigen is covered with a protein not involved in the subsequent antigen-antibody reaction and enzyme reaction (blocking). Thereby, the solid phase antigen 6 is formed inside the reaction chamber 7.
  • the solid phase antigen 6 is shown in the reaction chamber 7 table. It is fixed to the surface and is not removed from the reaction chamber 7 by the cleaning described later.
  • Step 1 B Binding reaction between antigen to be measured and solid phase antigen and antibody
  • an antibody 3 that specifically binds to the antigen 2 to be measured is added to the sample solution 9.
  • Antibody 3 is labeled with a labeling substance (enzyme) 4.
  • a sample solution 9 containing the antibody 3 is introduced into the reaction chamber 7.
  • an antigen-antibody reaction proceeds between the solid phase antigen 6 and the measurement target antigen 2 and the antibody 3.
  • the amount of the labeled substance 4 possessed by the conjugate of the solid phase antigen 6 and the antibody 3 remaining in the reaction chamber 7 is measured.
  • the measurement is performed as follows, for example. First, a solution containing a measurement reagent that reacts with the labeling substance 4 (for example, an enzyme substrate) is prepared. The solution is prepared by adding the measuring reagent to a buffer solution typified by Tris-HQ buffer. Next, the measurement solution 10 containing the conjugate of the solid phase antigen 6 and the antibody 3 and the measurement reagent is obtained in the reaction chamber 7 by introducing the solution into the reaction chamber 7. In the measurement solution 10, after the reaction between the measurement reagent and the labeling substance 4, the signal reflecting the amount of the reaction product is detected.
  • the amount of the antigen 2 to be measured in the sample solution 9 is calculated based on the amount of the solid phase antigen 6 and the amount of the sample solution 9 introduced into the reaction chamber in Step 1-B as a result of the measurement.
  • JP-A-2-062952 discloses an insulating substrate, an electrode system disposed on the substrate, an enzyme reaction layer disposed on the electrode system, and a substrate so that the electrode system and the enzyme reaction layer are exposed.
  • a chip-type biosensor provided with an insulating layer having a notch disposed thereon. Enzyme anti The reaction layer contains a measurement reagent for inducing an enzyme cycling reaction, typified by oxidoreductase and electron mediator.
  • an enzyme using the substance to be measured as a substrate is used.
  • gnoleoxysoxidase is used when measuring the amount of glucose
  • cholesterol oxidase is used when measuring the amount of cholesterol, for example.
  • the sample solution is dropped into the notch and the measurement reagent is dissolved in the sample solution, whereby the reaction between the measurement target substance and the enzyme (enzyme cycling reaction) proceeds via the electron mediator.
  • the amount of the substance to be measured in the sample solution is calculated based on the oxidation current value obtained by electrochemically oxidizing the electron mediator reduced by the enzyme reaction.
  • Step 1-D is performed using the measurement solution 10 using a buffer as a solvent.
  • a buffer solution from the outside of the chip or to hold the buffer solution on the chip in advance.
  • the buffer solution is supplied from the outside, it takes extra time for the supply.
  • the buffer solution should be held on the chip in a sealed state and at the time of measurement, containing a component that reacts with the labeling substance and easily introduced into the reaction chamber. Is desirable.
  • the present invention provides an immunoassay method suitable for implementation on a chip, which does not require the solvent of the measurement sample to be supplied from the outside of the chip or previously held on the chip. Objective. Another object of the present invention is to provide a chip suitable for carrying out this immunoassay. Another object of the present invention is to provide a measurement method using this chip.
  • the present invention is a method for measuring the amount of an antigen to be measured contained in a sample solution using a chip, the chip comprising a reaction chamber, a solvent holding chamber, a waste liquid chamber, and the sample.
  • An injection hole into which a solution is injected is provided, the injection hole and the reaction chamber are connected by a first flow path, and the injection hole and the solvent holding chamber are connected by a second flow path.
  • the solvent holding chamber and the reaction chamber are connected by a third flow path, and the reaction chamber and the waste liquid chamber are connected by a fourth flow path, and the injection hole From the injection hole to the reaction chamber via the second flow path, the solvent holding chamber, and the third flow path. Injecting the sample solution, Dividing the sample solution into the reaction chamber through the first flow path and the solvent holding chamber through the second flow path, and the measurement target contained in the sample solution in the reaction chamber.
  • a step of binding an antigen and an antibody that specifically binds to the antigen to be measured to obtain an antigen-antibody complex By sending i) the antigen-antibody complex, and ii) the antibody that is not bound to the antigen to be measured, force.
  • Another aspect of the present invention is a method for measuring the amount of an antigen to be measured contained in a sample solution using a chip, the chip comprising a reaction chamber, a solvent holding chamber, a waste liquid chamber, And an injection hole into which the sample solution is injected, and the injection hole and the reaction chamber are connected by a first flow path.
  • Yamba is connected by a second flow path
  • the solvent holding chamber and the waste liquid chamber are connected by a third flow path
  • the reaction chamber and the waste liquid chamber are not connected.
  • a measurement reagent is connected from the injection hole to the waste liquid chamber via the second flow path, the solvent holding chamber, and the third flow path.
  • the method includes injecting the sample solution from the injection hole, and passing the sample solution through the first channel through the reaction chamber and through the second channel through the solvent holding chamber.
  • the antigen to be measured contained in the sample solution is bound to an antibody that specifically binds to the antigen to be measured to obtain an antigen-antibody complex, Of the sample solution,
  • the force while leaving the selected one in the reaction chamber, The other is moved to the waste liquid chamber to separate the antigen-antibody complex from the antibody not bound to the antigen to be measured.
  • the waste liquid chamber holds the solvent holding chamber.
  • a method for measuring the amount of a measurement target antigen contained in a sample solution, wherein the measurement target antigen and the measurement target antigen are specifically bound in a reaction chamber A step of binding an antibody to be obtained to obtain an antigen-antibody complex, a step of separating the antigen-antibody complex and an antibody not bound to the measurement target antigen, and the antigen-antibody complex or the measurement target antigen.
  • a step of obtaining a measurement solution by adding the sample solution containing a measurement reagent to an unbound antibody, the antigen-antibody complex contained in the measurement solution or the antigen to be measured is not bound
  • a method comprising the steps of measuring the amount of an antibody, and calculating the amount of the antigen to be measured contained in the sample solution from the amount measured in the measuring step.
  • the amount of the antigen to be measured contained in the sample solution is measured.
  • the chip has a reaction chamber, a solvent holding chamber, a waste chamber, and an injection hole into which the sample solution is injected, and a first gap is provided between the injection hole and the reaction chamber.
  • a second flow path is connected between the injection hole and the solvent holding chamber, and a third flow path is connected between the solvent holding chamber and the reaction chamber.
  • the reaction chamber and the waste liquid chamber are connected by a fourth flow path, and the sample solution injected from the injection hole passes through the first flow path and the reaction chamber and the first flow path.
  • the sample solution in the reaction chamber is selected from i) the antigen-antibody complex, and i) an antibody that is not bound to the measurement target antigen by flowing into the waste liquid chamber through the fourth channel.
  • One is left in the reaction chamber, and the other is moved to the waste liquid chamber to separate the antigen-antibody complex and the antibody that is not bound to the antigen to be measured.
  • a measuring reagent is disposed between the second flow path, the solvent holding chamber, and the third flow path to the reaction chamber. After the separation, the solvent is placed in the reaction chamber.
  • Another aspect of the present invention is a chip for measuring the amount of an antigen to be measured contained in a sample solution, the chip comprising a reaction chamber, a solvent holding chamber, a waste chamber, and the sample solution.
  • An injection hole to be injected; the injection hole and the reaction chamber are connected by a first flow path; and the injection hole and the solvent holding chamber are connected by a second flow path.
  • the solvent holding chamber and the waste liquid chamber are connected by a third flow path, and the reaction chamber and the waste liquid chamber are connected by a fourth flow path from the injection hole.
  • the injected sample solution is divided into the reaction chamber through the first flow path and the solvent holding chamber through the second flow path, and in the reaction chamber, the antigen to be measured,
  • the measurement It is bound an antibody that specifically binds to target antigen, the antigen-antibody complex is obtained, the reaction Chang
  • the sample solution in the flow path is selected from i) the antigen-antibody complex, and ii) an antibody that is not bound to the antigen to be measured, by flowing into the waste chamber through the fourth flow path. Is left in the reaction chamber, and the other moves to the waste chamber to separate the antigen-antibody complex from the antibody that is not bound to the antigen to be measured.
  • a measuring reagent is disposed between the flow path, the solvent holding chamber, and the waste liquid chamber via the third flow path, and after the separation, the solvent holding chamber is placed in the waste liquid chamber.
  • a chip in which the sample solution held in the container is injected together with the measurement reagent through the third flow path.
  • FIG. 1 is a process diagram for explaining an example of a conventional immunological measurement method.
  • FIG. 2 is a process diagram for explaining an example of the immunological measurement method of the present invention.
  • FIG. 3 is a diagram for explaining an example in which the immunological assay of the present invention is performed using an unlabeled primary antibody and a labeled secondary antibody.
  • FIG. 4 is a diagram for explaining an example of a chip of the present invention.
  • FIG. 5 is a diagram for explaining another example of the chip of the present invention.
  • FIG. 6 is a diagram for explaining another example of the chip of the present invention.
  • FIG. 7 is a graph showing experimental results of Examples and Reference Examples.
  • FIG. 8 is a process diagram for explaining an example in which an antigen-antibody reaction between an antibody and an antigen to be measured is performed by a sandwich method.
  • the solid phase antigen 6 is formed.
  • the capture antigen may be fixed in the same manner as in Step 1A in a conventional ELISA.
  • Examples of the material of the reaction chamber 7 include resins such as polystyrene, polyethylene terephthalate (PET), polycarbonate, and polydimethylsiloxane, glass, and magnetic materials.
  • the reaction chamber 7 preferably has a shape capable of holding a liquid, such as a tube type or a well type typified by a microplate.
  • a predetermined amount of a part 1 of the sample solution is dispensed.
  • the sample solution include liquid biological samples such as blood, urine, saliva, sweat, and tears.
  • the antibody 3 labeled with the labeled substance 4 is added to a part 1 of the sample solution.
  • Antibody 3 is a primary antibody that specifically binds to antigen 2 to be measured. Store the other part 8 of the sample solution without adding antibody 3.
  • Antibody 3 may be a commercially available antibody, or may be an antibody created uniquely using experimental animals.
  • the antibody 3 may be a polyclonal antibody, but a monoclonal antibody is preferable from the viewpoint of enhancing the specificity and sensitivity of the antigen-antibody reaction.
  • antigen 2 to be measured examples include proteins with high clinical attention such as C-reactive protein (CRP), serum amyloid A, troponin T, creatinine kinase IV, and retinol-binding protein.
  • CRP C-reactive protein
  • the labeling substance 4 is preferably an enzyme, but may be a fluorescent dye or a radioisotope.
  • a portion 1 of the sample solution in a state immediately after adding the labeled antibody 3 is introduced into the reaction chamber 7 to which the solid phase antigen 6 is immobilized.
  • a part 1 of the sample solution is introduced into the reaction chamber 7.
  • a part 1 of the sample solution after introduction is held in the reaction chamber 7 at a predetermined temperature for a predetermined time.
  • the immunoassay method of the present invention has a solid phase antigen immobilized in a reaction chamber.
  • the binding step the antigen-antibody complex and the antibody are bound to the solid phase antigen, and bind to the antigen to be measured to obtain the antibody.
  • the antigen-antibody reaction in the reaction chamber 7 may be a non-competitive reaction.
  • non-competitive reaction a portion 1 of the sample solution to which labeled antibody 3 has been added is held at a predetermined temperature for a predetermined time before being introduced into reaction chamber 7, and the reaction between antigen 2 to be measured and labeled antibody 3 is reacted.
  • a part 1 of the sample solution is introduced into the reaction chamber 7 and allowed to proceed by reacting the antibody 3 not bound to the antigen 2 to be measured with the solid phase antigen 6.
  • Goodbye What is necessary is just to set suitably the temperature and time for making an antigen antibody reaction advance according to the kind of an antigen and an antibody. The same applies to the subsequent antigen-antibody reaction.
  • a portion 1 of the sample solution is removed from the reaction chamber 7 using, for example, a pipette.
  • the antigen-antibody complex is removed from the reaction chamber 7 and an antibody not bound to the antigen to be measured is left in the reaction chamber 7.
  • the antigen-antibody complex obtained in the binding step (step 2-B) and the antibody not bound to the antigen to be measured are separated. From the viewpoint of improving the accuracy of separation, it is preferable to wash the reaction chamber using a washing solution typified by a Tris-HC luffer after removing the sample solution.
  • the amount of the labeled substance 4 in the antibody not bound to the antigen to be measured, which is left in the reaction chamber 7, is measured.
  • the measurement may be performed as follows. First, a solution containing a measuring reagent is prepared. At this time, the other part 8 of the sample solution stored in the binding step (Step 2 -B) is used as the solvent of the solution.
  • the measurement reagent may be selected according to the type of the labeling substance 4. For example, if the labeling substance 4 is an enzyme typified by alkaline phosphatase (ALP), it may be used as a substrate for the enzyme.
  • ALP substrate is p-nitrophenyl phosphate (pNPP).
  • the immunoassay method of the present invention obtains a measurement solution without using a buffer solution by using the sample solution as a solvent. Subsequently, after the reaction between the measurement reagent and the labeling substance 4 is allowed to proceed in the measurement solution, the amount of the reaction product is reflected using known optical measurement means and electrochemical measurement means. Detect the amount of signal.
  • the amount of the antigen to be measured is calculated. More specifically, the measurement result, the amount of solid phase antigen 6 immobilized in reaction chamber 7, and the amount of part 1 of the sample solution introduced into the reaction chamber in the binding step (step 2-B). Based on the above, the amount of the antigen to be measured is calculated.
  • the amount of the antigen to be measured may be a physical amount related to the amount, for example, a concentration.
  • the amount of the antigen to be measured contained in the sample solution is calculated from the amount of the antibody not bound to the antigen to be measured, or the amount of the antigen-antibody complex as described later, measured in the measurement step.
  • a fixed amount of a capture antibody that binds to the measurement target antigen 2 contained in the sample solution is immobilized on the surface of the reaction chamber 7 to form a solid phase antibody 19.
  • the capture antibody may be immobilized in the same manner as in Step 2_A in the immunoassay shown in FIG.
  • Dispense a predetermined amount of sample solution This prepares part 1 of the sample solution and another part 8 of the sample solution.
  • Part 1 of the sample solution is introduced into the reaction chamber 7 to which the solid phase antibody 19 is immobilized (step 8). B). By this operation, a part 1 of the sample solution is introduced into the reaction chamber 7. Part of the introduced sample solution 1 is held in the reaction chamber 7 at a predetermined temperature for a predetermined time. As a result, an antigen-antibody reaction proceeds between the solid phase antibody 19 and the measurement target antigen 2, and a conjugate of the measurement target antigen 2 and the solid phase antibody 19 is formed in the reaction chamber 7.
  • Step 8_C the measurement target antigen 2 that has not bound to the solid phase antibody 19 is removed from the reaction chamber 7, and a conjugate of the measurement target antigen 2 and the solid phase antibody 19 remains in the reaction chamber 7.
  • a washing solution typified by Tris-HQ buffer was also added. It is preferred to use to clean the reaction chamber 7.
  • the solution 30 is introduced into the reaction chamber 7.
  • the solution 30 is prepared by adding a predetermined amount of the antibody 3 labeled with the labeling substance 4 to a solvent not containing a protein having the same epitope as the epitope 2 of the antigen 2 to be measured.
  • a primary antibody that can also bind to the antigen 2 to be measured in a state bound to the solid phase antibody 19 is used.
  • An example of the solvent for the solution 30 is Tris-HC Luffer.
  • the introduced solution 30 is held in the reaction chamber 7 at a predetermined temperature for a predetermined time (step 8-D). As a result, the antigen-antibody reaction proceeds between the measurement target antigen 2 in a state bound to the solid phase antibody 19 and the labeled antibody 3.
  • the antigen-antibody complex that is a conjugate of the solid phase antibody 19, the antigen 2 to be measured, and the antibody 3 and the remaining antigen 21 of the labeled antibody 3 are the antigen to be measured. And unbound antibody.
  • the remainder 21 of the antibody 3 is present in the solution 30 in a state released from the surface of the reaction chamber 7.
  • the solid phase antibody is arranged in the reaction chamber, and in the binding step, the solid phase antibody and the antigen to be measured are bound, and further, the solid phase antibody.
  • the antigen-antibody complex which is a conjugate of the solid phase antibody, the antigen to be measured, and the above-mentioned part of the antibody, and the remainder of the antibody by binding a part of the antibody to the antigen to be measured in a state bound to An antibody that is not bound to the antigen to be measured may be obtained.
  • Step 8_E This removal is the same as in Step 8-C. It can be done in the same way.
  • the antibody that is not bound to the antigen to be measured is removed from the reaction chamber 7, and the antigen-antibody complex is left in the reaction chamber 7. In this way, the antigen-antibody complex obtained in step 8-D is separated from the antibody not bound to the antigen to be measured.
  • the amount of the labeled substance 4 in the antigen-antibody complex remaining in the reaction chamber 7 is measured. This measurement may be performed in the same manner as in Step 2-D in the immunological assay shown in FIG.
  • the measurement solution used for the measurement is obtained by using the other part 8 of the sample solution stored in Step 8-B as the solvent. In this way, a measurement solution capable of performing good measurement can be obtained without using a buffer solution and using a sample solution as a solvent.
  • the amount of the antigen to be measured is calculated. More specifically, based on the measurement result, the amount of the solid phase antibody 19 immobilized in the reaction chamber 7 and the amount of the part 1 of the sample solution introduced into the reaction chamber 7 in the binding step (step 8-B), Calculate the amount of antigen 2 to be measured.
  • the amount of the antigen to be measured is as described above, and may be a physical amount associated with the amount, for example, a concentration.
  • the immunological measurement method of the present invention is operated and used as long as a signal reflecting the concentration of the substance to be measured can be detected to a level comparable to that when a buffer solution is used as the solvent of the measurement solution. You may change an instrument suitably.
  • a signal reflecting the concentration of the substance to be measured can be detected to a level comparable to that when a buffer solution is used as the solvent of the measurement solution.
  • FIGS. 2 and 8 the case where the primary antibody for obtaining the antigen-antibody complex or the antibody not bound to the measurement target antigen is labeled with a labeling substance has been described. Instead, as shown in the conceptual diagram of FIG.
  • the primary antibody 22 for binding to the antigen-antibody complex or the antigen to be measured is obtained as unlabeled, and the unlabeled primary antibody 22
  • the secondary antibody 18 to be bound to may be labeled with a labeling substance.
  • the measurement step is performed for one selected from the antigen-antibody complex and the antibody not bound to the measurement target antigen, which is left in the reaction chamber 7 after the separation step.
  • the measurement process may be performed on the other side removed from the reaction chamber 7 by the separation process.
  • the immunological assay of the present invention is as described above.
  • a substrate having a shape capable of holding a liquid, represented by a microplate, as a reaction chamber it does not exclude the use of a substrate having a shape that is difficult to hold liquid, such as beads.
  • a solvent for preparing a measurement solution may be prepared by collecting a new sample solution.
  • FIG. 4 is a diagram for explaining an example of a chip suitable for carrying out the immunological measurement method of the present invention.
  • the chip 100 includes a chip substrate 11, and a reaction chamber 12, a solvent holding chamber 14, a waste liquid chamber 15, and a sample solution injection hole 17 formed on the substrate 11.
  • Examples of the material of the chip substrate 11 include materials for the reaction chamber 7 used in the immunological measurement method of the present invention represented by PET.
  • the injection hole 17 and the reaction chamber 12 are connected by a flow path 16 a formed in the chip substrate 11.
  • the injection hole 17 and the solvent holding chamber 14 are connected by a flow path 16b formed in the chip substrate 11.
  • the channel 16a and the channel 16b are not in communication with each other. For this reason, when the sample solution is injected into the injection hole 17, the sample solution is divided into the reaction chamber 12 through the flow path 16a and the cleaning liquid holding chamber 14 through the flow path 16b. In this way, a part of the sample solution is sent to the reaction chamber 12, and another part of the sample solution is sent to the solvent holding chamber 14 and held in the chamber 14.
  • a measuring reagent 13 is arranged in the solvent holding chamber 14.
  • the measurement reagent 13 is a reagent for measuring the amount of the antibody not bound to the antigen-antibody complex or the antigen to be measured in the measurement solution.
  • the measurement reagent 13 is arranged in a state that it can be dissolved in the solvent introduced into the solvent holding chamber 14. For this reason, when the other part of the sample solution is introduced into the solvent holding chamber 14, a state in which the measurement reagent is added to the other part of the sample solution is formed in the solvent holding chamber 14.
  • the measurement reagent 13 may be disposed on a path (for example, the channel 16b) until the other part of the sample solution is introduced into the solvent holding chamber. Further, it may be arranged on a path from the solvent holding chamber 14 to the reaction chamber 12.
  • the measurement reagent 13 may be arranged in a measurement reagent holding chamber 40 formed by deforming a part of the flow path 16c as in the chip 101 shown in FIG.
  • any one selected from (1) a solid phase antigen and (2) a solid phase antibody is immobilized in the reaction chamber 12.
  • a primary antibody that specifically binds to the measurement target antigen in the sample solution is dissolved in the sample solution on the path until the part of the sample solution is introduced into the reaction chamber 12 or inside the reaction chamber 12. It is desirable to be arranged in a state where it is possible.
  • the primary antibody is preferably in a state labeled with a labeling substance.
  • the antigen-antibody complex which is a conjugate of the antigen to be measured and the antibody And an antibody not bound to the antigen to be measured, which is a conjugate of the solid phase antigen and the antibody, and (2) when the solid phase antibody is immobilized in the reaction chamber 12, And an antigen-antibody complex that is a conjugate of the antigen to be measured and an antibody, and an antibody that is the remainder of the antibody and that is not bound to the antigen to be measured.
  • the reaction chamber 12 and the waste liquid chamber 15 are connected by a flow path 16d formed in the chip substrate 11.
  • the above-mentioned part of the sample solution is sent from the reaction chamber 12 to the waste liquid chamber 15 through the flow path 16d after the antigen-antibody reaction in the reaction chamber 12 reaches a steady state.
  • one selected from the antigen-antibody complex and the antibody not bound to the measurement target antigen remains in the reaction chamber 12 and the other moves to the waste liquid chamber 15.
  • the solid phase antigen is arranged in the reaction chamber 12
  • an antibody that is not bound to the antigen to be measured and when the solid phase antibody is arranged in the reaction chamber 12, the antigen-antibody complex is obtained. Remaining in the reaction chamber 12, the antigen-antibody complex is separated from the antibody not bound to the antigen to be measured.
  • the chip of the present invention has the solid phase antigen fixed in the reaction chamber, and the antibody not bound to the antigen to be measured is bound to the solid phase antigen.
  • the antibody that is not bound to the antigen to be measured may remain in the reaction chamber, and the antigen-antibody complex may move to the waste chamber.
  • the solid phase antibody is fixed to the reaction chamber, and the antigen-antibody complex is a conjugate of the solid phase antibody, the antigen to be measured, and the antibody.
  • the antigen-antibody complex may be left in the reaction chamber, and the antibody not bound to the antigen to be measured may move to the waste liquid chamber.
  • the sample solution (the other part) held in the solvent holding chamber 14 is injected into the reaction chamber 12 together with the measuring reagent 13 through the flow path 16c.
  • the measurement solution containing the antigen-antibody complex remaining in the reaction chamber 12 and the antibody force not bound to the antigen to be measured is selected, and the measurement reagent 13. can get.
  • the liquid flow through each channel is a method using an electroosmotic flow (for example, Barker et al., Anal. Chem .; (Article); 2000; 72 (24); 5925-5929), by a pump A method using a jet force or a suction force (for example, Hisamoto et al., Anal. Chem. (Article); 1999; 71 (24); 4669-46 78).
  • an electroosmotic flow for example, Barker et al., Anal. Chem .; (Article); 2000; 72 (24); 5925-5929
  • a jet force or a suction force for example, Hisamoto et al., Anal. Chem. (Article); 1999; 71 (24); 4669-46 78).
  • a measurement solution can be obtained without using a buffer solution by utilizing a sample solution as a solvent.
  • the signal reflecting the concentration of the substance to be measured can be detected with a precision comparable to that when a buffer solution is used by the measurement solution thus obtained.
  • the detection of the signal may be performed on one of the remaining ones in the reaction chamber 12 or may be performed on the other one moved to the waste chamber 15.
  • the measurement process is performed on the other side moved to the waste liquid chamber 15, the other part of the sample solution is not kept in the reaction chamber 12 but is further sent to the waste liquid chamber 15, thereby
  • the measurement solution may be obtained in chamber 15.
  • the waste liquid chamber can be used not only for storage of waste liquid but also for carrying out enzyme reactions, and its use is not limited by the term “waste liquid”.
  • the chip of the present invention can perform measurements as good as when a buffer solution is used. As long as possible, the design may be changed as appropriate. For example, separately form a flow path for introducing the labeled antibody into the reaction chamber so that the antigen-antibody reaction can be performed by the sandwich method. Further, for example, as shown in FIG. 6, a chip 102 that performs the measurement process only in the waste liquid chamber 15 may be used. The chip 102 is formed in the same manner as the chip 100 except that the flow path 16e is formed on the chip substrate 11 to connect the solvent holding chamber 14 and the waste liquid chamber 15 instead of the flow path 16c. .
  • the other part of the sample solution is injected together with the measurement reagent 13 from the solvent holding chamber 14 into the waste liquid chamber 15 via the flow path 16 e without passing through the reaction chamber 12.
  • the measurement reagent 13 may be arranged anywhere on the path from the injection hole 17 to the waste liquid chamber 15 via the flow path 16b, the solvent holding chamber 14, and the flow path 16e.
  • a plurality of ⁇ 5mm holes were formed in a lmm thick PET plate. Thereafter, another PET plate was attached on one side of the PET plate using a known photo-curing adhesive (Lux Track) so as to cover one end of the hole. Thus, a plurality of reaction chambers were produced.
  • a 42.3 nM CRP solution was prepared using 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5).
  • the CRP solution was introduced into each reaction chamber by 10 / L. Subsequently, each reaction chamber was sealed with a resin sheet (96-hole sheet) and held at 35 ° C. for 1 hour to adsorb CRP to the reaction chamber. The reaction chamber was then washed with 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5). Next, 10 ⁇ L of a blocking agent (ApplieDuo, CatNo. 200140 manufactured by Seikagaku Corporation) was added to each reaction chamber and held at 35 ° C. for 1 hour. In this way, the adsorbed CRP was blocked to form a solid phase antigen in the reaction chamber. The reaction chamber was then washed again with 50 mM Tris-HCl buffer ( ⁇ 5 ⁇ 5). [0058] [Antigen-antibody reaction]
  • Sample solutions with CRP concentrations of OnM, 3.8 nM, 6.3 nM, 9.5 nM and 19 nM were prepared by adding CRP to serum (manufactured by Shinotest, human control serum).
  • CRP CRP to serum
  • 88 nM anti-CRP monoclonal antibody labeled with alkaline phosphatase (ALP) and the sample solution were introduced and kept at 35 ° C. for 15 minutes.
  • ALP alkaline phosphatase
  • an antigen-antibody complex which is a conjugate of CRP and an antibody, and an antibody that is a conjugate of a solid phase antigen and an antibody and that is not bound to the antigen to be measured were separated. More specifically, the antigen-antibody complex was removed from the reaction chamber and bound to the antigen to be measured, leaving the antibody and antibody in the reaction chamber.
  • a measurement solution was obtained in each reaction chamber by introducing 10 / i L of p-nitrophenyl phosphate solution (PNPP Liquid Substrate, Cat No. F008-1000; pNPP, manufactured by Cygnus) into each reaction chamber.
  • PNPP Liquid Substrate Cat No. F008-1000
  • pNPP manufactured by Cygnus
  • the sample solution used as the solvent was prepared by dispensing a part of the sample solution for inducing the antigen-antibody reaction.
  • an enzyme cycling reaction reagent consisting of potassium ferricyanide, diaphorase, NADP, malate dehydrogenase and sodium malate was used.
  • FIG. 7 is a graph showing the measurement results obtained from the reference examples and the examples.
  • the absorbance is a value obtained by measurement at 495 nm.
  • the absorbance and current value reflecting the difference in CRP concentration in the sample solution were measured.
  • immunological measurement could be performed with a precision comparable to that when a buffer solution was used.
  • the present invention provides an immunoassay method for obtaining a measurement solution for detecting a signal reflecting the amount of a substance to be measured without using a buffer solution. It has great utility value in each field that requires the implementation of biological measurement methods.

Abstract

　本発明は、チップ上での実施に適した免疫学的測定法を提供する。反応チャンバ７において測定対象抗原２と抗体３とが結合した状態にある抗原抗体複合体を得た後、試料溶液８を溶媒として用いることにより得た測定溶液を使用して、抗原抗体複合体、または測定対象抗原に結合していない抗体の量を測定する、免疫学的測定法とする。本発明によれば、測定対象抗原の量を反映したシグナルを検出するための測定溶液を、タンパク質などの測定対象物質を含有しない、緩衝液を使用せずに得ることができる。これにより、緩衝液をチップの外部から供給したりチップ上に予め保持させたりする必要がなくなるため、チップ上で容易に免疫学的測定法を実施できる。

Description

明 細 書
免疫学的測定法およびチップ
技術分野
[0001] 本発明は、抗原抗体反応を利用して試料溶液中の特定成分の量を測定する免疫 学的測定法に関し、特に、チップ上での実施に適した免疫学的測定法に関する。ま た、本発明は、この免疫学的測定法の実施に適したチップに関する。
背景技術
[0002] 生体試料 (例えば、血液）に含有されるアレルギー反応の原因物質、ウィルスおよ び細菌などのタンパク質を、高精度に同定および定量する方法として、免疫学的測 定法が注目されている。
[0003] 免疫学的測定法は、免疫比濁法と、標識化免疫法とに大別される。免疫比濁法は 、抗原抗体反応によって生じる抗原抗体複合体に起因する、試料溶液の濁度変化を 測定する方法である。標識化免疫法は、標識物質で標識された抗体を使用し、抗原 抗体反応後の標識物質量の変化を測定する方法である。
[0004] 標識化免疫法は、標識物質の種類に応じて細分化される。例えば、標識物質とし て放射性同位元素を使用するラジオィムノアツセィ、酵素を使用するェンザィムィムノ アツセィ (EIA)、蛍光体を使用する蛍光ィムノアッセィなどが挙げられる。 EIAは、他 の標識化免疫法と比較すると、標識物質の安全性が高ぐ簡便な操作によって実施 でき、測定精度も高いため、盛んに利用されている。
[0005] 代表的な EIAとしては、固相酵素免疫検定法（Enzyme-Linked Immunosorbent Ass ay;ELISA)が例示できる。 ELISAの一例について、図 1を参照して説明する。
[0006] (工程 1一 A:固相抗原の形成）
測定対象抗原のェピトープと同一のェピトープを有する捕獲抗原を含有する溶液 を、反応チャンバ 7に導入し、所定温度で所定時間保持することにより、捕獲抗原を 反応チャンバ 7の表面に吸着させる。その後、吸着させた捕獲抗原を、後の抗原抗 体反応および酵素反応には関与しないタンパク質で覆う（ブロッキング)。これにより、 反応チャンバ 7の内部に固相抗原 6を形成する。固相抗原 6は、反応チャンバ 7の表 面に固定された状態にあり、後述する洗浄によって反応チャンバ 7から除去されない
[0007] (工程 1 B :測定対象抗原および固相抗原と、抗体との結合反応）
試料溶液 9に、測定対象抗原 2に特異的に結合する抗体 3を添加する。抗体 3は、 標識物質 (酵素) 4で標識された状態にある。その後、当該抗体 3を含有する試料溶 液 9を、反応チャンバ 7に導入する。これにより、反応チャンバ 7において、固相抗原 6 および測定対象抗原 2と、抗体 3との間で、抗原抗体反応が進行する。
[0008] (工程 1 - C：未反応の抗体および抗原抗体複合体の除去）
洗浄液を用い、反応チャンバ 7の内部を洗浄する。これにより、測定対象抗原 2に抗 体 3が結合することにより形成された抗原抗体複合体と、固相抗原 6に結合しなかつ た抗体 3とが、反応チャンバ 7から除去され、固相抗原 6と抗体 3との結合体が、反応 チャンバ 7に残される。
[0009] (工程 1 D :標識物質の量の測定）
反応チャンバ 7に残された固相抗原 6と抗体 3との結合体が有する標識物質 4の量 を測定する。当該測定は、例えば次のようにして実施される。まず、標識物質 4と反応 する測定用試薬 (例えば、酵素の基質)を含有する溶液を調製する。当該溶液は、測 定用試薬を、 Tris-HQバッファーに代表される緩衝液に添加することにより調製する 。次に、当該溶液を反応チャンバ 7に導入することにより、反応チャンバ 7において、 固相抗原 6と抗体 3との結合体と、測定用試薬と、を含有する測定溶液 10を得る。測 定溶液 10中で、測定用試薬と標識物質 4との反応を進行させた後、反応生成物の量 を反映したシグナルを検出する。
[0010] 試料溶液 9中の測定対象抗原 2の量は、当該測定の結果、固相抗原 6の量、およ び工程 1—Bにおいて反応チャンバに導入した試料溶液 9の量に基づき算出される。
[0011] 試料溶液中の測定対象物質の量を、微量の試料溶液を用い、短時間に測定する 観点から、チップ型のバイオセンサが注目されている。例えば、特開平 2— 062952 号公報は、絶縁性の基板、基板上に配置された電極系、電極系上に配置された酵 素反応層、ならびに電極系および酵素反応層が露出するように基板上に配置された 、切り欠き部を有する絶縁層を備えた、チップ型のバイオセンサを開示する。酵素反 応層は、酸化還元酵素および電子メディエーターなどに代表される、酵素サイクリン グ反応を誘導するための測定用試薬を含有する。酸化還元酵素としては、測定対象 物質を基質とする酵素が使用される。例えば、グルコース量を測定する場合はグノレコ ースォキシダーゼが、また例えば、コレステロール量を測定する場合はコレステロ一 ルォキシダーゼが使用される。このバイオセンサでは、切り欠き部に試料溶液を滴下 し、測定用試薬を試料溶液に溶解させることにより、電子メディエーターを介した測定 対象物質と酵素との反応 (酵素サイクリング反応）が進行する。試料溶液中の測定対 象物質の量は、酵素反応により還元された電子メディエーターを電気化学的に酸化 することにより得られる、酸化電流値に基づいて算出される。
[0012] 図 1に示すような従来の免疫学的測定法では、上記のとおり、緩衝液を溶媒とする 測定溶液 10を用いて工程 1—Dを実施する。このため、当該免疫学的測定法をチッ プ上で実施するためには、緩衝液をチップの外部から供給する、または緩衝液を予 めチップ上に保持させておく必要がある。しかし、緩衝液を外部から供給する場合、 当該供給のための手間が余分にかかる。緩衝液をチップ上に保持させる場合は、当 該液を、密封状態で、かつ測定時には、標識物質と反応する成分を含有しつつ反応 チャンバに容易に導入できる状態で、チップ上に保持させることが望ましい。しかし、 このような保持状態をチップ上で形成することは容易ではない。
発明の開示
[0013] 本発明は、測定試料の溶媒をチップの外部から供給したりチップ上に予め保持さ せたりする必要のない、チップ上での実施に適した免疫学的測定法を提供することを 目的とする。また、本発明は、この免疫学的測定法の実施に適したチップを提供する ことを目的とする。また、本発明は、このチップを用いた測定方法を提供することを目 的とする。
[0014] 従来、免疫学的測定法において、測定溶液の溶媒として、タンパク質などの測定対 象物質を含有しない、緩衝液を使用することが重要と考えられていた。ところが、本発 明者は、意外にも、緩衝液に代えて、タンパク質などの測定対象物質を含有する生 体試料を測定溶液の溶媒として使用しても、測定対象物質の量を反映したシグナル を検出できることを見出した。 [0015] 本発明は、試料溶液に含まれる測定対象抗原の量を、チップを用いて測定する方 法であって、前記チップは、反応チャンバ、溶媒保持チャンバ、廃液チャンバ、およ び前記試料溶液が注入される注入孔を有し、前記注入孔と前記反応チャンバとの間 は第 1流路により接続されており、前記注入孔と前記溶媒保持チャンバとの間は第 2 流路により接続されており、前記溶媒保持チャンバと前記反応チャンバとの間は第 3 流路により接続されており、前記反応チャンバと前記廃液チャンバとの間は第 4流路 により接続されており、前記注入孔から、前記第 2流路、前記溶媒保持チャンバ、お よび前記第 3流路を経由して前記反応チャンバまでの間に、測定用試薬が配置され ており、前記方法は、前記注入孔から前記試料溶液を注入し、前記試料溶液を、前 記第 1流路を通って前記反応チャンバと、前記第 2流路を通って前記溶媒保持チヤ ンバとに分ける工程、前記反応チャンバにおいて、前記試料溶液に含まれる測定対 象抗原と、前記測定対象抗原に特異的に結合する抗体とを結合させ、抗原抗体複 合体を得る工程、前記反応チャンバ中の前記試料溶液を、前記第 4流路を介して前 記廃液チャンバに送ることにより、 i)前記抗原抗体複合体、および ii)前記測定対象 抗原と結合していない抗体、力 選ばれる一方を前記反応チャンバに残すとともに、 他方を前記廃液チャンバに移動させて、前記抗原抗体複合体と、前記測定対象抗 原と結合していない抗体と、を分離する工程、前記溶媒保持チャンバに保持されて いる前記試料溶液を、 A1)前記反応チャンバに前記第 3流路を介して、または B1) 前記廃液チャンバに前記第 3流路および前記第 4流路を介して、前記測定用試薬と 共に注入する工程、前記抗原抗体複合体および前記測定対象抗原と結合していな い抗体のうち、 A2)前記反応チャンバに残っている方の量、または B2)前記廃液チヤ ンバに移動させた方の量、を測定する工程、および前記測定する工程において測定 された量から、前記試料溶液に含まれる前記測定対象抗原の量を算出する工程、を この順に有する、方法を提供する。
[0016] 本発明は、その別の側面から、試料溶液に含まれる測定対象抗原の量を、チップ を用いて測定する方法であって、前記チップは、反応チャンバ、溶媒保持チャンバ、 廃液チャンバ、および前記試料溶液が注入される注入孔を有し、前記注入孔と前記 反応チャンバとの間は第 1流路により接続されており、前記注入孔と前記溶媒保持チ ヤンバとの間は第 2流路により接続されており、前記溶媒保持チャンバと前記廃液チ ヤンバとの間は第 3流路により接続されており、前記反応チャンバと前記廃液チャン バとの間は第 4流路により接続されており、前記注入孔から、前記第 2流路、前記溶 媒保持チャンバ、および前記第 3流路を経由して前記廃液チャンバまでの間に、測 定用試薬が配置されており、前記方法は、前記注入孔から前記試料溶液を注入し、 前記試料溶液を、前記第 1流路を通って前記反応チャンバと、前記第 2流路を通って 前記溶媒保持チャンバとに分ける工程、前記反応チャンバにおいて、前記試料溶液 に含まれる測定対象抗原と、前記測定対象抗原に特異的に結合する抗体とを結合さ せ、抗原抗体複合体を得る工程、前記反応チャンバ中の前記試料溶液を、前記第 4 流路を介して前記廃液チャンバに送ることにより、 i)前記抗原抗体複合体、および ii) 前記測定対象抗原と結合していない抗体、力 選ばれる一方を前記反応チャンバに 残すとともに、他方を前記廃液チャンバに移動させて、前記抗原抗体複合体と、前記 測定対象抗原と結合していない抗体と、を分離する工程、前記廃液チャンバに、前 記溶媒保持チャンバに保持されている前記試料溶液を、前記第 3流路を介して前記 測定用試薬と共に注入する工程、前記抗原抗体複合体および前記測定対象抗原と 結合していない抗体のうち、前記廃液チャンバに移動させた方の量を測定する工程 、および前記測定する工程において測定された量から、前記試料溶液に含まれる前 記測定対象抗原の量を算出する工程、をこの順に有する、方法を提供する。
[0017] 本発明は、その別の側面から、試料溶液に含まれる測定対象抗原の量を測定する 方法であって、反応チャンバにおいて、前記測定対象抗原と、前記測定対象抗原に 特異的に結合する抗体とを結合させ、抗原抗体複合体を得る工程、前記抗原抗体 複合体と、前記測定対象抗原と結合していない抗体と、を分離する工程、前記抗原 抗体複合体または前記測定対象抗原と結合していない抗体に、測定用試薬を含有 する前記試料溶液を添加することにより、測定溶液を得る工程、前記測定溶液に含 まれる前記抗原抗体複合体または前記測定対象抗原と結合していない抗体の量を 測定する工程、および前記測定する工程において測定された量から、前記試料溶液 に含まれる前記測定対象抗原の量を算出する工程、を有する方法を提供する。
[0018] 本発明は、その別の側面から、試料溶液に含まれる測定対象抗原の量を測定する ためのチップであって、前記チップは、反応チャンバ、溶媒保持チャンバ、廃液チヤ ンバ、および前記試料溶液が注入される注入孔を有し、前記注入孔と前記反応チヤ ンバとの間は第 1流路により接続されており、前記注入孔と前記溶媒保持チャンバと の間は第 2流路により接続されており、前記溶媒保持チャンバと前記反応チャンバと の間は第 3流路により接続されており、前記反応チャンバと前記廃液チャンバとの間 は第 4流路により接続されており、前記注入孔から注入された前記試料溶液は、前記 第 1流路を通って前記反応チャンバと、前記第 2流路を通って前記溶媒保持チャン バとに分かれ、前記反応チャンバ内では、前記測定対象抗原と、前記測定対象抗原 に特異的に結合する抗体とを結合させ、抗原抗体複合体が得られ、前記反応チャン バ中の前記試料溶液が、前記第 4流路を通って前記廃液チャンバに流れることにより 、 i)前記抗原抗体複合体、および Π)前記測定対象抗原と結合していない抗体、から 選ばれる一方が前記反応チャンバに残されるとともに、他方が前記廃液チャンバに 移動して、前記抗原抗体複合体と、前記測定対象抗原と結合していない抗体と、が 分離され、前記注入孔から、前記第 2流路、前記溶媒保持チャンバ、および前記第 3 流路を経由して前記反応チャンバまでの間に、測定用試薬が配置されており、前記 分離の後で、前記反応チャンバに、前記溶媒保持チャンバに保持されている前記試 料溶液が、前記第 3流路を通って前記測定用試薬と共に注入される、チップを提供 する。
本発明は、その別の側面から、試料溶液に含まれる測定対象抗原の量を測定する ためのチップであって、前記チップは、反応チャンバ、溶媒保持チャンバ、廃液チヤ ンバ、および前記試料溶液が注入される注入孔を有し、前記注入孔と前記反応チヤ ンバとの間は第 1流路により接続されており、前記注入孔と前記溶媒保持チャンバと の間は第 2流路により接続されており、前記溶媒保持チャンバと前記廃液チャンバと の間は第 3流路により接続されており、前記反応チャンバと前記廃液チャンバとの間 は第 4流路により接続されており、前記注入孔から注入された前記試料溶液は、前記 第 1流路を通って前記反応チャンバと、前記第 2流路を通って前記溶媒保持チャン バとに分かれ、前記反応チャンバ内では、前記測定対象抗原と、前記測定対象抗原 に特異的に結合する抗体とを結合させ、抗原抗体複合体が得られ、前記反応チャン バ中の前記試料溶液が、前記第 4流路を通って前記廃液チャンバに流れることにより 、 i)前記抗原抗体複合体、および ii)前記測定対象抗原と結合していない抗体、から 選ばれる一方が前記反応チャンバに残されるとともに、他方が前記廃液チャンバに 移動して、前記抗原抗体複合体と、前記測定対象抗原と結合していない抗体と、が 分離され、前記注入孔から、前記第 2流路、前記溶媒保持チャンバ、および前記第 3 流路を経由して前記廃液チャンバまでの間に、測定用試薬が配置されており、前記 分離の後で、前記廃液チャンバに、前記溶媒保持チャンバに保持されている前記試 料溶液が、前記第 3流路を通って前記測定用試薬と共に注入される、チップを提供 する。
[0020] 本発明によれば、免疫学的測定法の実施に際し、緩衝液を使用することなしに、測 定対象物質の量を反映したシグナルを検出するための測定溶液を得ることができる。 図面の簡単な説明
[0021] [図 1]図 1は、従来の免疫学的測定法の一例について説明するための工程図である
[図 2]図 2は、本発明の免疫学的測定法の一例について説明するための工程図であ る。
[図 3]図 3は、本発明の免疫学的測定法を、非標識の一次抗体および標識された二 次抗体を用いて実施する場合の一例について説明するための図である。
[図 4]図 4は、本発明のチップの一例について説明するための図である。
[図 5]図 5は、本発明のチップの別例について説明するための図である。
[図 6]図 6は、本発明のチップの別例について説明するための図である。
[図 7]図 7は、実施例および参考例の実験結果を示すグラフである。
[図 8]図 8は、抗体と測定対象抗原との抗原抗体反応を、サンドイッチ法により実施す る場合の一例について説明するための工程図である。
発明を実施するための最良の形態
[0022] 本発明の免疫学的測定法の一例について、図 2の工程図を用いて説明する。
[0023] (工程 2— A:固相抗原の形成）
試料溶液中に含有される特定のタンパク質 (測定対象抗原 2)のェピトープと同一 のェピトープを有する捕獲抗原を、反応チャンバ 7の表面に所定量固定することによ り、固相抗原 6を形成する。捕獲抗原の固定は、例えば、従来型の ELISAにおける 工程 1 Aと同様にして行えばよい。
[0024] 反応チャンバ 7の材質としては、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート（PET)、 ポリカーボネートおよびポリジメチルシロキサンなどの樹脂、ガラス、磁性体などを例 示できる。反応チャンバ 7は、チューブ型、マイクロプレートに代表されるゥエル型など の、液体を保持可能な形状を有することが望ましい。
[0025] (工程 2— B :結合工程）
まず、試料溶液の一部 1を所定量分注する。試料溶液としては、血液、尿、唾液、 汗、涙などの液状の生体試料を例示できる。続いて、試料溶液の一部 1に、標識物 質 4によって標識された抗体 3を添加する。抗体 3は、測定対象抗原 2に特異的に結 合する一次抗体である。試料溶液の他の一部 8は、抗体 3を添加しない状態で保存 する。抗体 3は、市販の抗体であってもよいし、実験動物を利用して独自に作成した 抗体であってもよい。抗体 3は、ポリクローナル抗体であってよいが、抗原抗体反応の 特異性および感度などを高める観点からは、モノクローナル抗体が好ましい。測定対 象抗原 2としては、 C反応性蛋白（CRP)、血清アミロイド A、トロポニン T、クレアチニ ンキナーゼ ΜΒ、レチノール結合蛋白などの、臨床的な注目度の高いタンパク質を例 示できる。標識物質 4は、酵素が好ましいが、蛍光色素、さらには放射性同位体であ つてもよい。
[0026] 標識された抗体 3を添加した直後の状態にある、試料溶液の一部 1を、固相抗原 6 が固定された反応チャンバ 7に導入する。この操作により、試料溶液の一部 1が反応 チャンバ 7に導入される。導入後の試料溶液の一部 1を、所定温度で所定時間、反 応チャンバ 7に保持する。これにより、固相抗原 6および測定対象抗原 2と、抗体 3と の間で抗原抗体反応が競合的に進行し、反応チャンバ 7において、測定対象抗原 2 と抗体 3との結合体である抗原抗体複合体と、固相抗原 6と抗体 3との結合体とが形 成される。固相抗原 6と抗体 3との結合体は、測定対象抗原 2に結合していないため 、本明細書では、抗体 3と同様「測定対象抗原に結合していない抗体」として扱う。こ のように、本発明の免疫学的測定法は、反応チャンバに固相抗原が固定されており 、結合工程において、抗原抗体複合体と、固相抗原に抗体が結合した状態にある、 測定対象抗原と結合してレ、なレ、抗体と、を得るようにしてよレ、。
[0027] 反応チャンバ 7における抗原抗体反応は、非競合反応であってもよい。非競合反応 は、標識された抗体 3を添加した試料溶液の一部 1を、反応チャンバ 7に導入する前 に所定温度で所定時間保持し、測定対象抗原 2と標識された抗体 3との反応を定常 状態に到達させた後、当該試料溶液の一部 1を反応チャンバ 7に導入し、測定対象 抗原 2に結合していない抗体 3と、固相抗原 6とを反応させることより進行させればよ レ、。抗原抗体反応を進行させるための温度および時間は、抗原および抗体の種類に 応じて適宜設定すればよい。以降の抗原抗体反応においても同様である。
[0028] (工程 2— C :分離工程）
試料溶液の一部 1を、例えばピペットを使用し、反応チャンバ 7から除去する。これ により、抗原抗体複合体が、反応チャンバ 7から取り除かれるとともに、測定対象抗原 と結合していない抗体が反応チャンバ 7に残される。こうして、結合工程（工程 2— B) において得た、抗原抗体複合体と、測定対象抗原と結合していない抗体と、を分離 する。分離の精度を高める観点からは、試料溶液を除去した後、さらに、 Tris-HCレく ッファーに代表される洗浄液を用い、反応チャンバを洗浄することが好ましい。
[0029] (工程 2— D :測定工程）
反応チャンバ 7に残された、測定対象抗原と結合していない抗体における標識物 質 4の量を測定する。当該測定は、例えば次のように実施すればよい。まず、測定用 試薬を含有する溶液を調製する。この際、当該溶液の溶媒として、結合工程 (工程 2 -B)において保存した、試料溶液の他の一部 8を用いる。測定用試薬は、標識物質 4の種類に応じて選択すればよい。例えば、標識物質 4がアルカリホスファターゼ (A LP)に代表される酵素であれば、当該酵素の基質とすればよい。 ALPの基質として は、 p—ニトロフヱニルリン酸 (pNPP)を例示できる。次に、当該溶液を反応チャンバ 7に導入することにより、反応チャンバ 7において、測定対象抗原と結合していない抗 体と、測定用試薬と、を含有する測定溶液を得る。こうして、試料溶液の他の一部で あって、試料溶液の上記一部と分離された後に添加された測定用試薬を含有する当 該他の一部と、測定対象抗原と結合していない抗体とを混合することにより、測定溶 液を得る。このように、本発明の免疫学的測定法は、試料溶液を溶媒として用いるこ とにより、緩衝液を使用せずに、測定溶液を得る。続いて、測定溶液中で、測定用試 薬と標識物質 4との反応を進行させた後、公知の光学的測定手段および電気化学的 測定手段などを用いて、反応生成物の量を反映するシグナル量を検出する。
[0030] 上記のとおり、従来、測定溶液の溶媒としては、タンパク質を含有しなレ、、緩衝液を 使用することが重要と考えられていた。反応を阻害する物質なしに測定反応を行うた めである。ところが、こうして試料溶液を溶媒として用いても、良好な測定を実施でき る測定溶液を調製できるようである。後述する実施例に示すように、緩衝液を溶媒とし て使用した場合に匹敵する程度に優れた精度で、測定対象物質の量を反映したシ ダナノレを検出できるためである。
[0031] (算出工程）
測定工程において測定された量 (測定結果）に基づき、測定対象抗原の量を算出 する。より具体的には、当該測定結果、反応チャンバ 7に固定した固相抗原 6の量、 および結合工程（工程 2— B)におレ、て反応チャンバに導入した試料溶液の一部 1の 量に基づき、測定対象抗原の量を算出する。測定対象抗原の量とは、当該量に関連 付けられる物理量、例えば濃度であってよい。こうして、測定工程において測定され た、測定対象抗原と結合していない抗体の量から、または後述するように抗原抗体複 合体の量から、試料溶液に含まれる測定対象抗原の量を算出する。
[0032] 本発明の免疫学的測定法の別例について、図 8の工程図を用いて説明する。この 例は、抗体と測定対象抗原との抗原抗体反応を、サンドイッチ法によって実施する。
[0033] (工程 8— A:固相抗体の形成）
試料溶液中に含有される測定対象抗原 2に結合する捕獲抗体を、反応チャンバ 7 の表面に所定量固定することにより、固相抗体 19を形成する。捕獲抗体の固定は、 例えば、図 2に示す免疫学的測定法における工程 2_Aと同様にして行えばよい。
[0034] (工程 8_B〜D :結合工程）
試料溶液を所定量分注する。これにより、試料溶液の一部 1、および試料溶液の他 の一部 8を用意する。
[0035] 試料溶液の一部 1を、固相抗体 19が固定された反応チャンバ 7に導入する（工程 8 B)。この操作により、試料溶液の一部 1が反応チャンバ 7に導入される。導入した 試料溶液の一部 1を、反応チャンバ 7において、所定温度で所定時間保持する。これ により、固相抗体 19と測定対象抗原 2との間で抗原抗体反応が進行し、反応チャン バ 7において、測定対象抗原 2と固相抗体 19との結合体が形成される。
[0036] 続いて、例えばピペットを使用し、試料溶液の一部 1を反応チャンバ 7から除去する
(工程 8_C)。これにより、固相抗体 19に結合しなかった測定対象抗原 2が反応チヤ ンバ 7から取り除かれ、測定対象抗原 2と固相抗体 19との結合体が反応チャンバ 7に 残される。固相抗体 19に結合しなかった測定対象抗原 2をより確実に反応チャンバ 7 力 取り除く観点からは、試料溶液の一部 1を除去した後、さらに、 Tris-HQバッファ 一に代表される洗浄液を用いて反応チャンバ 7を洗浄することが好ましい。
[0037] その後、溶液 30を反応チャンバ 7に導入する。溶液 30は、標識物質 4によって標識 された抗体 3を、測定対象抗原 2のェピトープと同一のェピトープを有するタンパク質 を含有しない溶媒に所定量添加することにより調製する。抗体 3は、固相抗体 19に結 合した状態にある測定対象抗原 2に対しても結合できる一次抗体を使用する。溶液 3 0の溶媒としては、 Tris-HCレくッファーを例示できる。導入した溶液 30を、反応チャン バ 7において、所定温度で所定時間保持する（工程 8— D)。これにより、固相抗体 19 に結合した状態にある測定対象抗原 2と、標識された抗体 3との間で抗原抗体反応 が進行する。当該抗原抗体反応により、反応チャンバ 7において、固相抗体 19と測 定対象抗原 2と抗体 3との結合体である抗原抗体複合体と、標識された抗体 3の残部 21である、測定対象抗原と結合していない抗体とが得られる。抗体 3の残部 21は、 反応チャンバ 7の表面から遊離した状態で、溶液 30中に存在する。
[0038] このように、本発明の免疫学的測定法は、反応チャンバに固相抗体が配置されて おり、結合工程において、固相抗体および測定対象抗原を結合させ、さらに、固相抗 体に結合した状態にある測定対象抗原に、抗体の一部を結合させることにより、固相 抗体と測定対象抗原と抗体の上記一部との結合体である、抗原抗体複合体と、抗体 の残部である、測定対象抗原と結合していない抗体と、を得るようにしてよい。
[0039] (工程 8— E :分離工程）
溶液 30を反応チャンバ 7から除去する（工程 8 _E)。当該除去は、工程 8— Cと同 様にして実施すればよい。これにより、測定対象抗原と結合していない抗体が反応チ ヤンバ 7から取り除かれ、抗原抗体複合体が反応チャンバ 7に残される。こうして、ェ 程 8— Dにおいて得た抗原抗体複合体と、測定対象抗原と結合していない抗体と、を 分離する。
[0040] (工程 8— F :測定工程）
反応チャンバ 7に残された、抗原抗体複合体における標識物質 4の量を測定する。 当該測定は、図 2に示す免疫学的測定法における工程 2— Dと同様にして実施すれ ばよレ、。当該測定に使用する測定溶液は、工程 8— Bにおいて保存した、試料溶液 の他の一部 8を溶媒に用いることにより得る。こうして、緩衝液を用いずに、試料溶液 を溶媒として用いても、良好な測定を実施できる測定溶液が得られる。
[0041] (算出工程）
測定工程において測定された量 (測定結果）に基づき、測定対象抗原の量を算出 する。より具体的には、当該測定結果、反応チャンバ 7に固定した固相抗体 19の量、 および結合工程（工程 8— B)において反応チャンバ 7に導入した試料溶液の一部 1 の量に基づき、測定対象抗原 2の量を算出する。測定対象抗原の量とは、上記のと おり、当該量に関連付けられる物理量、例えば濃度であってよい。
[0042] 本発明の免疫学的測定法は、測定溶液の溶媒として緩衝液を使用した場合に匹 敵する程度に、測定対象物質の濃度を反映したシグナルを検出できる限り、操作お よび使用する器具を適宜変更してよい。例えば、図 2および 8に示す免疫学的測定 法では、抗原抗体複合体または測定対象抗原と結合していない抗体を得るための一 次抗体を標識物質で標識した場合について説明したが、これに代えて、図 3の概念 図に示すように、抗原抗体複合体または測定対象抗原と結合してレ、なレ、抗体を得る ための一次抗体 22は非標識とし、当該非標識の一次抗体 22に結合させる二次抗体 18を標識物質で標識してもよい。また、図 2および 8に示す免疫学的測定法では、分 離工程後に反応チャンバ 7に残された、抗原抗体複合体および測定対象抗原と結合 していない抗体から選ばれる一方を対象として測定工程を実施する場合について説 明したが、これに代えて、分離工程により反応チャンバ 7から除去された他方を対象と して測定工程を実施してもよい。また、本発明の免疫学的測定法は、上記のとおり、 チップ上での実施を容易にする観点から、反応チャンバとして、マイクロプレートに代 表される、液体を保持可能な形状を有する基体を使用することが望ましいが、これに 代えて、樹脂ビーズおよび磁性ビーズなどのビーズ体に代表される、液体の保持が 容易でない形状を有する基体を使用することを排除しない。また、図 2および 8に示 す免疫学的測定法では、試料溶液を分注し、反応チャンバにおいて抗原抗体反応 を誘導するための溶液と、測定溶液を調製するための溶媒とを準備する場合につい て説明したが、これに代えて、試料溶液を新たに採取することにより測定溶液を調製 するための溶媒を準備しても構わない。
[0043] 図 4は、本発明の免疫学的測定法の実施に適したチップの一例について説明する ための図である。
[0044] チップ 100は、チップ基板 11と、当該基板 11に形成された、反応チャンバ 12、溶 媒保持チャンバ 14、廃液チャンバ 15および試料溶液の注入孔 17とを有する。チッ プ基板 11の材質としては、 PETに代表される、本発明の免疫学的測定法で使用す る反応チャンバ 7のための材質を例示できる。
[0045] 注入孔 17と反応チャンバ 12は、チップ基板 11に形成された流路 16aにより接続さ れている。また、注入孔 17と溶媒保持チャンバ 14は、チップ基板 11に形成された流 路 16bにより接続されている。流路 16aおよび流路 16bは、互いに連通しない状態に ある。このため、試料溶液を注入孔 17に注入すると、当該試料溶液は、流路 16aを 通って反応チャンバ 12と、流路 16bを通って洗浄液保持チャンバ 14とに分けられる 。こうして、試料溶液の一部が反応チャンバ 12に送られ、また、試料溶液の他の一部 が溶媒保持チャンバ 14に送られて当該チャンバ 14に保持される。
[0046] 溶媒保持チャンバ 14には、測定用試薬 13が配置されている。測定用試薬 13は、 本発明の免疫学的測定方法の説明で述べたように、測定溶液中の抗原抗体複合体 または測定対象抗原と結合していない抗体の量を測定するための試薬である。測定 用試薬 13は、溶媒保持チャンバ 14に導入される溶媒に溶解できる状態で配置され ている。このため、試料溶液の上記他の一部が溶媒保持チャンバ 14に導入されると 、当該溶媒保持チャンバ 14において、試料溶液の上記他の一部に測定用試薬が添 カロされた状態が形成される。測定用試薬 13は、例えば、液状の試薬を溶媒保持チヤ ンバ 14に滴下し乾燥させることにより、溶媒に溶解できる状態で配置できる。測定用 試薬 13は、試料溶液の上記他の一部が溶媒保持チャンバ 14に導入されるまでの経 路上 (例えば流路 16b)に配置されていてもよい。また、溶媒保持チャンバ 14から反 応チャンバ 12に導入されるまでの経路上に配置されていてもよい。例えば、測定用 試薬 13は、図 5に示すチップ 101のように、流路 16cの一部を変形させて形成した測 定用試薬保持チャンバ 40に配置してもよい。
[0047] 反応チャンバ 12には、 (1)固相抗原、および（2)固相抗体、から選ばれるいずれか 一方が固定されていることが望ましい。試料溶液の上記一部が反応チャンバ 12に導 入されるまでの経路上または反応チャンバ 12の内部には、試料溶液中の測定対象 抗原に特異的に結合する一次抗体が、当該試料溶液に溶解できる状態で配置され ていることが望ましい。一次抗体は、標識物質により標識された状態にあることが好ま しい。試料溶液の上記一部が反応チャンバ 12に導入されると、（1)反応チャンバ 12 に固相抗原が固定されている場合は、測定対象抗原と抗体との結合体である、抗原 抗体複合体と、固相抗原と抗体との結合体である、測定対象抗原と結合していない 抗体とが得られ、（2)反応チャンバ 12に固相抗体が固定されている場合は、固相抗 体と測定対象抗原と抗体との結合体である、抗原抗体複合体と、抗体の残部である、 測定対象抗原と結合していない抗体と、が得られる。
[0048] 反応チャンバ 12と廃液チャンバ 15は、チップ基板 11に形成された流路 16dにより 接続されている。試料溶液の上記一部は、反応チャンバ 12における抗原抗体反応 が定常状態に達した後、流路 16dを介して反応チャンバ 12から廃液チャンバ 15に送 られる。これにより、抗原抗体複合体および測定対象抗原と結合していない抗体から 選ばれる一方が反応チャンバ 12に残されるとともに、他方が廃液チャンバ 15に移動 する。こうして、反応チャンバ 12に固相抗原が配置されている場合は測定対象抗原と 結合していない抗体が、また、反応チャンバ 12に固相抗体が配置されている場合は 抗原抗体複合体が、それぞれ反応チャンバ 12に残されて、抗原抗体複合体と、測定 対象抗原と結合していない抗体と、が分離される。
[0049] このように、本発明のチップは、反応チャンバに固相抗原が固定されており、測定 対象抗原と結合していない抗体が、固相抗原に結合した状態にあり、上記分離にお いて、測定対象抗原と結合していない抗体が反応チャンバに残され、抗原抗体複合 体が廃液チャンバに移動するようにしてよい。また、上述のように、本発明のチップは 、反応チャンバに固相抗体が固定されており、抗原抗体複合体が、固相抗体と測定 対象抗原と抗体との結合体であり、上記分離において、抗原抗体複合体が反応チヤ ンバに残され、測定対象抗原と結合していない抗体が廃液チャンバに移動するよう にしてもよい。
[0050] 溶媒保持チャンバ 14に保持されている試料溶液（上記他の一部）は、上記分離の 後で、流路 16cを介して、反応チャンバ 12に、測定用試薬 13と共に注入される。これ により、反応チャンバ 12において、反応チャンバ 12に残された抗原抗体複合体およ び測定対象抗原と結合していない抗体力も選ばれる上記一方と、測定用試薬 13と、 を含有する測定溶液が得られる。
[0051] それぞれの流路を介した送液は、電気浸透流を利用する方法 (例えば、 Barkerら、 Anal.Chem. ;(Article);2000;72(24);5925-5929)、ポンプによる噴射力または吸引力を 利用する方法（例えば、 Hisamotoら、 Anal.Chem. ;(Article);2001 ;73(22);5551_5556)、 遠心力を利用する方法（例えば、 Duffyら、 Anal.Chem. ;(Article); 1999;71(24);4669-46 78)などの公知の送液方法により実施すればよい。
[0052] 以上のように、本発明のチップによれば、試料溶液を溶媒として活用することにより 、緩衝液を使用せずに測定溶液を得ることができる。本発明の免疫学的測定方法の 説明で述べたように、こうして得た測定溶液により、緩衝液を使用した場合に匹敵す る精度で、測定対象物質の濃度を反映したシグナルを検出できる。シグナルの検出 は、反応チャンバ 12に残された上記一方を対象として実施してもよいし、廃液チャン バ 15に移動させた上記他方を対象として実施してもよレ、。廃液チャンバ 15に移動さ せた上記他方を対象として、測定工程を実施する場合は、試料溶液の上記他の一 部を、反応チャンバ 12に留めず、さらに廃液チャンバ 15へと送ることにより、廃液チ ヤンバ 15において測定溶液を得ればよい。このように廃液チャンバは、廃液の貯蔵 以外に、酵素反応の実施にも使用でき、用語「廃液」によってその用途は限定されな レ、。
[0053] 本発明のチップは、緩衝液を使用した場合に匹敵する程度に良好な測定を実施で きる限り、その設計を適宜変更してよい。例えば、抗原抗体反応をサンドイッチ法によ り実施できるように、標識された抗体を反応チャンバに導入するための流路を別途形 成してよレ、。また、例えば、図 6に示すように、廃液チャンバ 15のみにおいて測定ェ 程を実施するチップ 102としてもよい。チップ 102は、流路 16cに代えて、溶媒保持 チャンバ 14と廃液チャンバ 15とを導通させる流路 16eがチップ基板 11に形成されて レ、ること以外は、チップ 100と同様に形成されている。チップ 102では、試料溶液の 上記他の一部が、反応チャンバ 12を経由せずに、流路 16eを介して、溶媒保持チヤ ンバ 14から廃液チャンバ 15に、測定用試薬 13と共に注入される。チップ 102では、 流路 16b、溶媒保持チャンバ 14および流路 16eを経由する、注入孔 17から廃液チヤ ンバ 15までの経路上であれば、測定用試薬 13をどこに配置してもよい。
[0054] 以下、実施例により、本発明をさらに詳細に説明する。
[0055] (参考例）
まず、緩衝液を溶媒とする測定溶液を使用することにより、免疫学的測定を実施し た、参考例について説明する。
[0056] [反応チャンバの作製]
厚さ lmmの PET板に φ 5mmの孔を複数個形成した。その後、当該孔の一方の端 部を覆うように、当該 PET板の片面上に、別の PET板を、公知の光硬化型接着剤（ ラックストラック）を用いて貼り付けた。こうして反応チャンバを複数個作製した。
[0057] [CRPの固定化]
50mMの Tris-HClバッファー（pH7.5)を用レ、、 42. 3nMの CRP溶液を調製した。 当該 CRP溶液を、それぞれの反応チャンバに 10 / Lずつ導入した。続いて、それぞ れの反応チャンバを樹脂シート（96穴用シート）でシールし、 35°Cで 1時間保持する ことにより、反応チャンバに CRPを吸着させた。その後、反応チャンバを、 50mMの T ris-HClバッファー（pH7.5)を用いて洗浄した。次に、ブロッキング剤（生化学工業社 製 ApplieDuo, CatNo.200140)を、それぞれの反応チャンバに 10 μ Lずつ加え、 35°C で 1時間保持した。こうして、吸着させた CRPをブロッキングし、反応チャンバに固相 抗原を形成した。その後、反応チャンバを、 50mMの Tris-HClバッファー（ρΗ7·5)を 用いて再度洗浄した。 [0058] [抗原抗体反応]
CRPを血清（シノテスト社製、ヒトコントロール血清）に添加することにより、 OnM、 3. 8nM、 6. 3nM、 9. 5nMおよび 19nMの CRP濃度の試料溶液を調製した。反応チ ヤンバに、アルカリホスファターゼ (ALP)により標識された 88nMの抗 CRPモノクロ一 ナル抗体と、試料溶液とを導入し、 35°Cで 15分間保持した。こうして固相抗原および CRPと、抗体との間で抗原抗体反応を進行させた。
[0059] [分離]
50mMの Tris-HClバッファー（ρΗ7·5) 10 μ Lを、反応チャンバに導入し、除去した 。これにより、 CRPと抗体との結合体である、抗原抗体複合体と、固相抗原と抗体と の結合体である、測定対象抗原と結合していない抗体と、を分離した。より具体的に は、抗原抗体複合体を反応チャンバから除去するとともに、測定対象抗原と結合して レ、なレ、抗体を反応チャンバに残した。
[0060] [測定]
それぞれの反応チャンバに p—二トロフエニルリン酸溶液（Cygnus社製 PNPP Liquid Substrate, CatNo.F008-1000; pNPP) 10 /i Lを導入することにより、反応チャンバに おいて測定溶液を得た。測定溶液中で、測定対象抗原と結合していない抗体におけ る ALPと、 pNPPとの間の酵素反応を進行させた後、当該酵素反応の生成物である p—ニトロフエノール (pNP)の吸光度を、それぞれの反応チャンバから測定した。
[0061] (実施例）
pNPPに代えて、試料溶液を溶媒として得た測定溶液を用レ、、吸光度測定に代え て、電気化学的測定手段を用いて酵素反応の生成物の量を測定したこと以外は、参 考例と同様にして免疫学的測定を実施した。
[0062] 溶媒として用いた試料溶液は、抗原抗体反応を誘導するための試料溶液の一部を 分注することにより準備した。
[0063] 測定用試薬は、フェリシアン化カリウム、ジァホラーゼ、 NADP、リンゴ酸デヒドロゲ ナーゼおよびリンゴ酸ナトリウムからなる酵素サイクリング反応用試薬を用いた。
[0064] 酵素反応は、測定用試薬を添加した状態にある試料溶液の上記一部 10 μ Lを反 応チャンバに導入して測定溶液を得た後、反応チャンバ中で測定溶液を 7. 5分間保 持することにより進行させた。酵素反応の生成物の量は、反応チャンバ中の測定溶 液に電極群を浸し、 400mVの電圧を印加し、発生した電流値を計測することにより 測定した。
[0065] 図 7は、参考例および実施例から得た測定結果を示すグラフである。吸光度は、 49 5nmの測定で得られた値である。図 7に示すように、いずれの例においても、試料溶 液中の CRP濃度の相違を反映した吸光度および電流値が測定された。これにより、 測定溶液の溶媒として試料溶液を使用しても、緩衝液を使用した場合に匹敵する精 度で、免疫学的測定を実施できることがわかった。
産業上の利用可能性
[0066] 本発明は、測定対象物質の量を反映したシグナルを検出するための測定溶液を、 緩衝液を使用せずに得られる免疫学的測定法を提供するものとして、チップ上での 免疫学的測定法の実施が要求される各分野において多大な利用価値を有する。

Claims

請求の範囲
試料溶液に含まれる測定対象抗原の量を、チップを用いて測定する方法であって 前記チップは、反応チャンバ、溶媒保持チャンバ、廃液チャンバ、および前記試料 溶液が注入される注入孔を有し、
前記注入孔と前記反応チャンバとの間は第 1流路により接続されており、 前記注入孔と前記溶媒保持チャンバとの間は第 2流路により接続されており、 前記溶媒保持チャンバと前記反応チャンバとの間は第 3流路により接続されており 前記反応チャンバと前記廃液チャンバとの間は第 4流路により接続されており、 前記注入孔から、前記第 2流路、前記溶媒保持チャンバ、および前記第 3流路を経 由して前記反応チャンバまでの間に、測定用試薬が配置されており、
前記方法は、
前記注入孔から前記試料溶液を注入し、前記試料溶液を、前記第 1流路を通って 前記反応チャンバと、前記第 2流路を通って前記溶媒保持チャンバとに分ける工程、 前記反応チャンバにおいて、前記試料溶液に含まれる測定対象抗原と、前記測定 対象抗原に特異的に結合する抗体とを結合させ、抗原抗体複合体を得る工程、 前記反応チャンバ中の前記試料溶液を、前記第 4流路を介して前記廃液チャンバ に送ることにより、
i)前記抗原抗体複合体、および
ii)前記測定対象抗原と結合してレ、なレ、抗体、
力も選ばれる一方を前記反応チャンバに残すとともに、他方を前記廃液チャンバに 移動させて、前記抗原抗体複合体と、前記測定対象抗原と結合していない抗体と、 を分離する工程、
前記溶媒保持チャンバに保持されている前記試料溶液を、
A1)前記反応チャンバに前記第 3流路を介して、または
B1)前記廃液チャンバに前記第 3流路および前記第 4流路を介して、
前記測定用試薬と共に注入する工程、 前記抗原抗体複合体および前記測定対象抗原と結合していない抗体のうち、 A2)前記反応チャンバに残っている方の量、または
B2)前記廃液チャンバに移動させた方の量、
を測定する工程、および
前記測定する工程において測定された量から、前記試料溶液に含まれる前記測定 対象抗原の量を算出する工程、
をこの順に有する、方法。
[2] 前記反応チャンバに固相抗原が固定されており、前記測定対象抗原と結合してい ない抗体が、前記固相抗原に結合した状態にあり、前記分離する工程において、前 記測定対象抗原と結合していない抗体が前記反応チャンバに残され、前記抗原抗 体複合体が前記廃液チャンバに移動する、請求項 1に記載の方法。
[3] 前記反応チャンバに固相抗体が固定されており、前記抗原抗体複合体が、前記固 相抗体と前記測定対象抗原と前記抗体との結合体であり、前記分離する工程におい て、前記抗原抗体複合体が前記反応チャンバに残され、前記測定対象抗原と結合し ていない抗体が前記廃液チャンバに移動する、請求項 1に記載の方法。
[4] 試料溶液に含まれる測定対象抗原の量を、チップを用いて測定する方法であって 前記チップは、反応チャンバ、溶媒保持チャンバ、廃液チャンバ、および前記試料 溶液が注入される注入孔を有し、
前記注入孔と前記反応チャンバとの間は第 1流路により接続されており、 前記注入孔と前記溶媒保持チャンバとの間は第 2流路により接続されており、 前記溶媒保持チャンバと前記廃液チャンバとの間は第 3流路により接続されており 前記反応チャンバと前記廃液チャンバとの間は第 4流路により接続されており、 前記注入孔から、前記第 2流路、前記溶媒保持チャンバ、および前記第 3流路を経 由して前記廃液チャンバまでの間に、測定用試薬が配置されており、
前記方法は、
前記注入孔から前記試料溶液を注入し、前記試料溶液を、前記第 1流路を通って 前記反応チャンバと、前記第 2流路を通って前記溶媒保持チャンバとに分ける工程、 前記反応チャンバにおいて、前記試料溶液に含まれる測定対象抗原と、前記測定 対象抗原に特異的に結合する抗体とを結合させ、抗原抗体複合体を得る工程、 前記反応チャンバ中の前記試料溶液を、前記第 4流路を介して前記廃液チャンバ に送ることにより、
i)前記抗原抗体複合体、および
ii)前記測定対象抗原と結合してレ、なレ、抗体、
力も選ばれる一方を前記反応チャンバに残すとともに、他方を前記廃液チャンバに 移動させて、前記抗原抗体複合体と、前記測定対象抗原と結合していない抗体と、 を分離する工程、
前記廃液チャンバに、前記溶媒保持チャンバに保持されている前記試料溶液を、 前記第 3流路を介して前記測定用試薬と共に注入する工程、
前記抗原抗体複合体および前記測定対象抗原と結合していない抗体のうち、前記 廃液チャンバに移動させた方の量を測定する工程、および
前記測定する工程にぉレ、て測定された量から、前記試料溶液に含まれる前記測定 対象抗原の量を算出する工程、
をこの順に有する、方法。
[5] 前記反応チャンバに固相抗原が固定されており、前記測定対象抗原と結合してい ない抗体が、前記固相抗原に結合した状態にあり、前記分離する工程において、前 記測定対象抗原と結合していない抗体が前記反応チャンバに残され、前記抗原抗 体複合体が前記廃液チャンバに移動する、請求項 4に記載の方法。
[6] 前記反応チャンバに固相抗体が固定されており、前記抗原抗体複合体が、前記固 相抗体と前記測定対象抗原と前記抗体との結合体であり、前記分離する工程におい て、前記抗原抗体複合体が前記反応チャンバに残され、前記測定対象抗原と結合し ていない抗体が前記廃液チャンバに移動する、請求項 4に記載の方法。
[7] 試料溶液に含まれる測定対象抗原の量を測定する方法であって、
反応チャンバにおいて、前記測定対象抗原と、前記測定対象抗原に特異的に結 合する抗体とを結合させ、抗原抗体複合体を得る工程、 前記抗原抗体複合体と、前記測定対象抗原と結合していない抗体と、を分離する 工程、
前記抗原抗体複合体または前記測定対象抗原と結合していない抗体に、測定用 試薬を含有する前記試料溶液を添加することにより、測定溶液を得る工程、 前記測定溶液に含まれる前記抗原抗体複合体または前記測定対象抗原と結合し ていない抗体の量を測定する工程、および
前記測定する工程において測定された量から、前記試料溶液に含まれる前記測定 対象抗原の量を算出する工程、
を有する方法。
[8] 前記反応チャンバに固相抗原が固定されており、前記測定対象抗原と結合してい ない抗体が、前記固相抗原に結合した状態にある、請求項 7に記載の方法。
[9] 前記反応チャンバに固相抗体が固定されており、前記抗原抗体複合体が、前記固 相抗体と前記測定対象抗原と前記抗体との結合体である、請求項 7に記載の方法。
[10] 試料溶液に含まれる測定対象抗原の量を測定するためのチップであって、
前記チップは、反応チャンバ、溶媒保持チャンバ、廃液チャンバ、および前記試料 溶液が注入される注入孔を有し、
前記注入孔と前記反応チャンバとの間は第 1流路により接続されており、 前記注入孔と前記溶媒保持チャンバとの間は第 2流路により接続されており、 前記溶媒保持チャンバと前記反応チャンバとの間は第 3流路により接続されており 前記反応チャンバと前記廃液チャンバとの間は第 4流路により接続されており、 前記注入孔から注入された前記試料溶液は、前記第 1流路を通って前記反応チヤ ンバと、前記第 2流路を通って前記溶媒保持チャンバとに分かれ、
前記反応チャンバ内では、前記測定対象抗原と、前記測定対象抗原に特異的に 結合する抗体とを結合させ、抗原抗体複合体が得られ、
前記反応チャンバ中の前記試料溶液が、前記第 4流路を通って前記廃液チャンバ に流れることにより、
i)前記抗原抗体複合体、および ii)前記測定対象抗原と結合してレ、なレヽ抗体、
力 選ばれる一方が前記反応チャンバに残されるとともに、他方が前記廃液チャン バに移動して、前記抗原抗体複合体と、前記測定対象抗原と結合していない抗体と 、が分離され、
前記注入孔から、前記第 2流路、前記溶媒保持チャンバ、および前記第 3流路を経 由して前記反応チャンバまでの間に、測定用試薬が配置されており、
前記分離の後で、前記反応チャンバに、前記溶媒保持チャンバに保持されている 前記試料溶液が、前記第 3流路を通って前記測定用試薬と共に注入される、 チップ。
[11] 前記反応チャンバに固相抗原が固定されており、前記測定対象抗原と結合してい ない抗体が、前記固相抗原に結合した状態にあり、前記分離において、前記測定対 象抗原と結合していない抗体が前記反応チャンバに残され、前記抗原抗体複合体 が前記廃液チャンバに移動する、請求項 10に記載のチップ。
[12] 前記反応チャンバに固相抗体が固定されており、前記抗原抗体複合体が、前記固 相抗体と前記測定対象抗原と前記抗体との結合体であり、前記分離において、前記 抗原抗体複合体が前記反応チャンバに残され、前記測定対象抗原と結合していな い抗体が前記廃液チャンバに移動する、請求項 10に記載のチップ。
[13] 試料溶液に含まれる測定対象抗原の量を測定するためのチップであって、
前記チップは、反応チャンバ、溶媒保持チャンバ、廃液チャンバ、および前記試料 溶液が注入される注入孔を有し、
前記注入孔と前記反応チャンバとの間は第 1流路により接続されており、 前記注入孔と前記溶媒保持チャンバとの間は第 2流路により接続されており、 前記溶媒保持チャンバと前記廃液チャンバとの間は第 3流路により接続されており 前記反応チャンバと前記廃液チャンバとの間は第 4流路により接続されており、 前記注入孔から注入された前記試料溶液は、前記第 1流路を通って前記反応チヤ ンバと、前記第 2流路を通って前記溶媒保持チャンバとに分かれ、
前記反応チャンバ内では、前記測定対象抗原と、前記測定対象抗原に特異的に 結合する抗体とを結合させ、抗原抗体複合体が得られ、
前記反応チャンバ中の前記試料溶液が、前記第 4流路を通って前記廃液チャンバ に流れることにより、
i)前記抗原抗体複合体、および
ii)前記測定対象抗原と結合してレ、なレ、抗体、
力も選ばれる一方が前記反応チャンバに残されるとともに、他方が前記廃液チャン バに移動して、前記抗原抗体複合体と、前記測定対象抗原と結合していない抗体と 、が分離され、
前記注入孔から、前記第 2流路、前記溶媒保持チャンバ、および前記第 3流路を経 由して前記廃液チャンバまでの間に、測定用試薬が配置されており、
前記分離の後で、前記廃液チャンバに、前記溶媒保持チャンバに保持されている 前記試料溶液が、前記第 3流路を通って前記測定用試薬と共に注入される、 チップ。
前記反応チャンバに固相抗原が固定されており、前記測定対象抗原と結合してい ない抗体が、前記固相抗原に結合した状態にあり、前記分離において、前記測定対 象抗原と結合していない抗体が前記反応チャンバに残され、前記抗原抗体複合体 が前記廃液チャンバに移動する、請求項 13に記載のチップ。
前記反応チャンバに固相抗体が固定されており、前記抗原抗体複合体が、前記固 相抗体と前記測定対象抗原と前記抗体との結合体であり、前記分離において、前記 抗原抗体複合体が前記反応チャンバに残され、前記測定対象抗原と結合していな い抗体が前記廃液チャンバに移動する、請求項 13に記載のチップ。
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