JPS62218863A

JPS62218863A - 螢光光度計を用いた酵素免疫測定法

Info

Publication number: JPS62218863A
Application number: JP6085086A
Authority: JP
Inventors: Arinobu Fujimura; 藤村　有信
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1986-03-20
Filing date: 1986-03-20
Publication date: 1987-09-26

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は例えば甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）などの螢
光光度計を用いて測定される酵素免疫測定法の改良に関
するものである。

〔従来の技術〕

＃素免疫測定法は、各種抗原あるいは抗体を１１１１１
定する技術として既に実用化され、その手法も同相法、
二抗体法、ホモジニアス法、サンドイツチ法、抗酵素抗
体法など多岐にわたっている。噴出方法は酵素活性の測
定によって行なっているが、そのなかにＴＳＨ１α−フ
ェトプロティン、インシュリン、絨毛性ゴナンドトロピ
ンなど反応系に螢光物質を関与させて、酵素反応による
螢光の変化を測定して目的とする抗原あるいは抗体の量
を求める方法がある。

従来、この螢光光度計を用い、て測定される酵素免疫測
定法の固相にはポリアセタールビーズ等のビーズ類が一
般に使用されていた。

〔発明が解決しようとする問題点〕

螢光光度計を用いる方法は一般的に高感度であるが、反
応時間及び操作時間の短縮や省力化することがさらに望
まれていた。一般に、酵素免疫測定法は大量検体の測定
に利用されることが多く、また螢光物質は微量で不安定
なものが多いところからこの測定時間の短縮は特に重要
な問題であった。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明はこのような９間−照点を解決するべくなされた
ものであり、固相を利用した酵索免疫測定法において、
該固相にメンブレンを用いるとともに螢光物質が関与す
る酵素反応系を用い、酵素反応を螢光光度計で検出する
ようにしたことを特徴としている。

測定対象物は螢光光度計を検出手段に用いた酵素免疫測
定法で測定しうるものであれば特に制限はなく、血液あ
るいはその他の体液、さらには組織培養細胞、微生物、
動植物細胞に含まれている各種抗原、抗体を測定できる
。例えばＴＳＨ、Ｔ４．１７−α−ＯＨｆロダストロン
等のホルモン類は本発明の方法の測定対象物として特に
適している。

螢光物質は予め螢光性を有する物質を酵素基質等に結合
させて使用する場合のほか、酵素反応によりて螢光物質
を生成させる場合も含む。前者の例としてはウンベリフ
ェロン、ＮＡＤＨなどを、そして後者の例としてはペル
オキシダーゼによってパラヒドロキシフェニルアラニン
−Ｈ２０□酪合物を形成させる場合などを挙げることが
できる。

メンブレ／は抗体あるいは抗原を固定する担体として使
用されるものであり、蛋白質や核酸等の高結合性のもの
が好ましく使用される。このようなメンブレンの例とし
てはニド′ロセルロース膜（ミリ４フ社製ＨＡタイター
ニトロセルロース膜、バイオラド社製ニトロセルロース
膜なト）、ゼータプローブ膜（バイオラド社農）などを
挙げることができる。

メンブレンの利用方法としてはマイクログレート中や試
験管中で反応させるディスク法（笛１図参照）とマイク
ロタイタープレートの底部だメツブレンを保持して行な
うマイクログレート法（第２図参照）がある。図中、ｌ
はメンブレンを、２ハマイクロプレートのウェル又は試
験管をそして３はマイクロタイタープレートの壁部をそ
れぞれ示している。

これらを用いて実施される酵素免疫測定法の態様例を次
に述べる。

（１）ｇ３図（イ）に示すように、まずメンブレンに試
料を接触せしめて測定対象抗原を結合嘔せ、次いで１〜
１０％ＢＳＡ−ＰＢＳあるいは０．１％トウィーン２０
−　ＰＢＳで残余の部位をブロクキングする。

このメンブレンを洗浄後酵素標＠第１抗体と反応させる
。洗浄後基質を添加して反応させ、反応停止後反応液を
マイクロプレート等に移し、て螢光を測定する。

尚、図中、黒丸は試料の抗原を、黒星は酵素を、黒長丸
は抗体を、そして黒点は螢光性基質をそれぞれ示してい
る。。

（２）第３図（ロ）に示すようにまずメンブレンに承ｌ
抗体を結合させてから（１）と同様にして残余の部位を
ブロッキングする。試料を入れて反応させ、洗浄後（１
）と同様に酵素標ｉ＆第１抗体と反応させ、以下同様に
操作する。

（３）　　第３図（ハ）に示すように、試料を加えるま
では（２）と全く同様に操作し、酵素標識抗原を加えて
拮抗させ、洗浄後以下（２）と同様に操作する。

（４）　　（２）と（３）Ｋおける第１抗体反応以前に
メンブレンに第２抗体を結付させ、プロンキング後第１
抗体を反応させ、以下（２）と（３）の操作を行なう。

（５）辻、成瀬の変法。第３図に）に示すように、試料
の抗原と第１抗体を反応後ｒｌＰｌ検素抗原と拮抗させ
る。次に、ピースの代わりにメンブレンディスクあるい
はメンブレンプレートを用い、これを第２抗体を吸着結
合させてブロクキングしたものあるいはブロックしない
ものと接触させる。

尚、図中、黒三角は第２抗体を表わしている。

ディスク法とマイクロプレート法を比較するとディスク
法は装置がより簡単である点で優り、一方マイクロプレ
ート法は螢光物質を含む液を容易に他のプレートへ転送
できる点で優る。

螢光光度計は最近マイクロプレート方式及び試験管キー
ベット連続測定方式とも高感度かつ迅速に測定できるも
のが開発されているので（例えばコロナ電気ＭＴＰ−２
２、ＭＴＰ−Ｆ　、　ＦＰＭ−１１シリーズ、タイター
チック社フルオロスキャ７等）、それらを利用すること
が好ましい。これらのものは測定時間１〜１０分／１０
０サンプル程度、そして測定感度１０　〜ＩＯＭ（マイ
クロプレート方式）、１０−１２〜１０　　　Ｍ（試験
方式）程度である。

約３００本の試料の測定操作に要する時間は概そ次の通
υである。

反応試薬ピイッティ、グ　　１０〜２０分　　　６分以下　　　
６０〜９０分洗　浄　　　１０〜２０分　　　　６分　
　　　９０〜１２０分６１１１　　定　　　　　　３〜
１０分　　　　　６０〜１２０分〔実施例〕方法（１） ■　ＨＡタイターにＴＳＨ標準血液戸紙ディスク４Ｗｔ
ｍφ１個を入れ１５０　Ａｌ　Ｏ，０１ＭＰＢｐ）１７
．４−０．５Ｍ　ＮａＣ１で３２℃１時間抽出。

■　０．１　％　Ｔｗｅｅｎ　２０　ＰＢＳ　１　％　
ＢＳＡ　Ｉｏｏ　μｌで３７℃３０分〜１時間ブロッキ
ング。

■　上記の間バッファーで洗う ■　酵素標識抗体２５μｍ３７℃−夜反応。

■　０．１　％　Ｔｗｅｅｎ　２０　ＰＢＳ　−Ｉ　Ｓ
　ＢＳＡ　Ｉ００μｌで３回洗う ■　基質（４メチルウンベリフエリルがラクトピラノサ
イド）ｌＯＯμ１３７℃４０分〜１時間反応 ■　停止液１００〜２００μｌ（マイクロプレート用）
か２．５　ｍ　（試験管用）を加える。

■　別の容器に転送 ■　測定方法（２） ■　第１抗体ｌＯμｌをＨＡタイターで３７℃９０分反
応固相化。

■　４％ＢＳＡ　−０，０１ＭＰＲ（ｐＨ７，４）　−
０，５ＭＮａＣｔ２００μ！で３７℃１時間ブロッキン
グ化。

■　ＴＳＨ標準血液ｐ紙ディスク４ｆｉφ１個を入れ１
５０μｌのｐｕｓ中で３７℃１時間反応。

■　ＰＢＳで洗滌２００μｌづつ、吸引後戸紙除去■　
酵素標識抗体１５０μ１３７℃−夜反応。

■　　０．１　ｑ６Ｔｗｏｅｎ　２０％ＰＢＳ　２００
μｌ／回で３回洗う。吸引後 ■　基質１００μｌで３７℃４０〜１時間反応。

■　停止液１００〜２００μｌ加える。

■　転送［相］　測定方法（３） ■　Ｂｉｏ　Ｒａｄ社ニトロセルロース膜をＢｌｏ　Ｄ
ｏｔ装置につけ第１抗体１０μｌで３７℃１０分同相化
。

■　４俤ＢＳＡ　−ＰＢＳ　２００μｌで３７℃６０分
ブロッキング。

■　ＴＳＨ標準標準血液ディス２一時間ＰＢ８２００μｌ中で反応させ洗滌する。

■　酵素標識抗体２００μｍ３７℃１時間反応。

■　０．　１　％　Ｔｗｅｅｎ　２　０で２００μＪづ
つ３回洗う。

■　以下方法（１）　、　（２）と同様方法（４） ■　ＨＡメタイタ−中第１抗体１００μｌと一夜反応同
相化。

■　０．　１　％　Ｔｗａｅｎ　２　０　−　ＰＢＳ　
２００μ１３７℃１時間ブロッキング、吸引。

■　ＴＳＨ標準標準血液ディス２− ＰＢＳ中で３７℃１時間反応。

■　酵素標識ＴＳＨ２００μ１２５℃−夜反応。

■　０．　１％Ｔｗｅｅｎ　２　０　−　ＰＢＳ　２０
０　μｌづつ３日洗滌吸引。

■　以下前例と同様。

方法（５） ■　０　−　０．　６μＵのＴＳＨ標準血清１０μｌと
第１抗体１００μｌを３７℃−夜マイクログレート又は
試験管中で反応。

■　酵素環１１ＴｓＨ２００μｌと第２抗体で固相化シ
友ニトロセルロース膜又はゼーターゾロープ膜デ．イス
ク３ｍφ１個を′入れ３７℃４時間反応。

■　洗滌液０．　１　１４　Ｔｗｅｅｎ　２　０　−　
ＰＢＳ　２００　Ａｌｌで４回洗う ■　基質反応以下は前例と同じ。

方法（６） ■　ＨＡタイター（６ｓｓφ）又はＢｌｏ　Ｒｉｄ社Ｂ
ｉｏ　Ｄｏｔ　装ＲのニトロセルロースＭ（２１１１１
１φ）中テ第２抗体５０μｌで３７℃−夜固相化。

■　ＨＡタイターの場合は１０チＢ５Ａ２００μ１３７
℃ー夜プロッキング化ＰＢＳ２００μ１３回洗滌しかし
Ｂｉｏ　Ｒａｄの場合は径が小さいからブロック化の必
要なし。

■　第１抗体１００ｐｌとＴＳ）Ｉ標準血液戸紙ディス
ク４層φ１個３７℃−夜反応。

■　酵素標識ＴＳＨ２００μ１３７℃４時間反応。

■　洗滌ＰＢ８２００μｌで３〜４回。

■　基質反応以下同様反応装置には第４図に示すものを用いた。この装置ハ最
上段に底部にニトロセルロースメンブレン１を配設した
マイクロタイタープレート２（例えばＨＡタイター）が
設置され、その下に洗浄容器３に設置されて最下段から
吸引できるようになりでいる。

ニトロセルロース膜（Ｂｌｏ　Ｒａｄ社）（２日径）の
非特異性部位を保護するためのブロック剤の検討を行な
った。まずブロック剤でブロック後に非ブロツク部位を
酵素標識ＴＳＨ＠　１抗体で反応結合させその活性の大
小でもって、ブロック効果を検討したのが表である。表
中の数値は５００ｖのときの螢光強度を示している。

ウンベリフェロンの濃度と螢光強度との関係をｇ５図に
示す。同図中、黒三角はコロナ電気マイクログレート用
螢光々度計を、他は試験管キュベツト式度計を示す。実
線は７５０ｖの場合を、点線は５５０Ｖの場合をそして
鎖線は４００Ｖの場合をそれぞれ示している。

方法（６）を用いて行ったＴＳＨ濃度と螢光強度との関
係を第６図に示す。図中（Δ）白三角はＨＡタイター（
メンブレン径６　ｍ　）を用い１０チＢ５Ａ２００μｊ
でブロッキングし念場合を、（★）黒星印は従来例を示
している。また（・）黒丸印はＢｉｏ　Ｒａｄ社メンブ
レン（径２　ｔｙｍ　）を示す。そして（園）黒四角印
はＨＡタイターでブロックしないときを示している。こ
の結果ブロック後のＨＡタイターは従来法に匹敵した。

そして旧ｏ　Ｒａｄ膜はＴＳＨ１０ａＵ／ｍｌのときの
Ｂ／Ｂ０が５０４と低くＣｕｔ　ｏｆｆ値の設定に好都
合で大変良い方法である。

〔発明の効果〕

本発明の方法は反応時間及び操作時間を短縮して短時間
に大量の検体を測定することができる。

試薬の使用量を大幅に減少させることができる。

特にマイクロプレート法では反応後のメンブレンの洗浄
及び反応液の転送を多数サンｆルについて一時に行なう
ことができ、洗浄が容易に行なえ、洗浄残液を生じる問
題もない。一方、ディスク法では非標識抗体を省略する
ことができるという利点を有する。

【図面の簡単な説明】

第１図はマイクロプレートのウェル又は試ｊ倹管にディ
スク状メンブレンを入れた状態の側面図を、そして第２
図はマイクロタイタープレートの底にメンブレンを設け
た状態の側面断面図をそれぞれ示す。第３図は本発明の
方法を利用して実施される酵素免疫測定法の態様例を示
す模式図である。第４図は第２図のマイクロタイターグレートの下部に洗
浄容器を配設した状態を示す側面図である。第５図は本発明の方法によ、リウンベリフェロンの濃度
と螢光強度との関係を測定した結果を示すものであり、
＠６図はＴＳＨ濃度と螢光強度との関係を示すものであ
る。第１図　　　第２図第３図（イ）　　　　　　　　’　　　　（０）　　　　　　
　　　　　　Ｃノ＼）　　　　　　　　　　（ニ）ｏ　
ｌ　　舎　転送　　Ｕ　醍アコ　Ｗコ　Ｖヨ第４図ウシＭ’）クエロシ　　（Ｍ）手続補正間（自発）昭和６１年４月２３日

Claims

【特許請求の範囲】

固相を利用した酵素免疫測定法において、該固相に蛋白
質結合性のメンブレンに抗原又は抗体を結合したものを
用いるとともに螢光物質が関与する酵素反応系を用い、
酵素反応を螢光光度計で検出するようにしたことを特徴
とする酵素免疫測定法