JPS60192261A - 固相免疫検定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はりガントの検定およびこの検定に用いられる物
質に関する。さらに詳しくは、本発明は同相検定に関す
る。

免疫検定法は、一般に、検体中でその量が測定さハるべ
き特定の被検定物と、通常はラベルされた形の被検定物
゛またはその適当な類似物である既知量のトレーザーと
の迩合に基づき、この被検定物とトレーサーに対し特異
的であるバインダー上の限定された数の利用可能な結合
部位にこの被検定物とトレーサーを競合させることより
なる。

トレーサーとバインダーの濃度が一定で、変動するのは
被検定物の量のみであるならば、この検定システムにお
いて結合したトレーサーおよび／または遊離トレーサー
の量を測定することによシ破検定物の未知量を測定する
システム全確立することができる。この検定において測
定された値は同じ方法で処理された被検定物の既知量の
範囲により与えられた値と比較さ扛、この比較りこより
検体における被検定物の量を測定することができる。

このような方法の一つにおいて、バインダーは固体担体
（以下、担体とする）に支持されておシ、検定の結合成
分または遊〜ＩｔＥ成分はインキュベーション後検体と
相体とを分離することにより容易に分離される。

検定感ｊ及（検体における低レベル被検定物の測定能）
の向上をもたらし、および／または全操作を容易にする
ためにこの検定法の向上が必要とされる。

さらに、器械が］］定をすることなく肉眼での別品ｖ要
とされる。

本発明の１つの面によれば、検定で使用される被検定物
とトレーサーの少なくとも１つに対するバインダーが担
体表面に位置する検定区域に支持されておシ、との担体
の検定区域がバインダーを少なくとも１０μ？　／ａｎ
　２の濃度でこの区域に担持しうる物質で形成されるこ
とからなる被検宝物測定用の物質および方法金１是供す
るものである。この検定において使用されるトレーサー
ぽ粒子状ラベル剤で標識したりガントであシ、粒子状ラ
ベル剤は検出可能な標識物であるかまたはこの標識物を
含むものであり、リガント゛はバインダーまたは被検定
物の倒れか一方に結゛合する。

本発明の別の一面によれば、検定で使用されるべき被検
定物および１・し＝ザーの少なくとも１つに対するバイ
ンダーを担体の表向に位置する検定区域に支持させ、こ
こでバインダーは前記検定区域において、検定で使用さ
れるトレーサーが検定条件下でバインダーと結合するか
−またはバインダーと結合した被検定物と結合したとき
に、更に処理することなく担体上で肉眼判別（け下視覚
化という）できる濃度で支持されていることからなる被
検定物測定方法および物質を提供するものである。検定
で用いられるトレーサーは、バインダーまたはバインダ
ーと結合した被検定物と結合したとき更に処理すること
なく視覚化しうる粒子状ラベルで標識化されたりガント
であり、このリガンドはバインダー丑たは被検定物の何
れかに結合される。

ここで゛視覚化″とは器械を使用することなくラベルが
肉眼で見えることを意味する。

本発明のさらに別の面によれば、担体表面の検定区域（
試験区域）で視覚比しうるトレーサーを使用することに
よりこの試ｊ験区域で被検定物を検出することができ、
との担体（は試験区域においてバインダーを支持するの
に十分多孔性でありこのため被検定物が検体中に低濃度
で存在するとき検定に使用されるトレーサーが試験区域
で視覚化されることからなる低籏度で検体中に存在する
被検定物を６（す定する方法および物＠全提供するもの
である。トレーサーは粒子状ラベルで刷ｌｉｄ識したリ
ガンドであり、これはリガンドがバインダーまたは１皮
検定物の何れかに結合したとき視見化される。

検定に用いられる担体は通常はセルロースエーテルであ
シ、ニトロセルロースが非常に良好な結果をもたらす。

゛ニトロセルロース単独とはセルロースの硝酸エステル
を意味するもので、これはニトロセルロース単独、また
は硝酸と他の酸とくに炭素原子数１〜７の脂肪族カルボ
ン酸好ましくは酢１異との混合エステルでもよい。硝酸
単独゛または硝酸と他の酸例えば酢酸との混合・物でエ
ステル化されたセルロースから形成さ九る１ｕ体は、し
ばしばニトロセルロース紙と称される。

ニトロセルロースは１月体金作るのに好゛ましい材層）
であるが、必要な多孔性を有する他のイ」料も寸だこの
ような担体を作るのに使用されつるということも理解さ
れたい。

上述したように、検定で使用さ、れる担体は、少なくと
も］−０μＶ　／ｃｍ好ましくは少なくとも４０μ７／
ｃｍ２の濃度でバインダーを支持することができる程度
に多孔性を有するものである。

特に好ましい実施態様によれば、抗体の孔径は、トレー
ザー（粒子状ラベルで標識したりガント）がバインダー
またはバインダーと結合した被検定物と結合したとき担
体の表面に残る程度のものでアル。例えば孔’Ｎ０．２
〜０．４５μのニトロセルロース担体により特に好まし
い結果が得られる。

上述したように、担体に支持されたバ・１ンダーば、被
検定物とトレーザーの両方ともに対するバインダーであ
るか、寸たは彼ノ険定４勿およびトレーサーの少なくと
も一方にだけに対応するバインダーであるかの伺ｎかで
あり、使用されるバ・インダーの種類は被検定物測定に
用いられるべき検定により異なるものである。即ち、例
えば検定が競合型の場合には、担体に支持されるバ・イ
ンダーはトレーサーと被検定物の両方に対するバインダ
ーであり、これによりトレーザーと被検定物の両方とも
がパルイングーにおける限定された結合部位に対し競合
する。

検定がいわゆる゛サント゛イッチパ柳の場合に（ツ：、
担体に支持されるバインダーは被検定物にのみ対応する
バインダーである。このような検定においては、トレー
サーは被検定物に特異的なトレーザーであり、これによ
シトレーサーは支持されたバインダーに結合した被検定
物に結合する。

検定が上田型の場合には、支持されたノミインダーはｌ
・レーザーに対してのみ特異的で捗り、Ｉ・レーザーは
また被検定物にも特異的である。このような検定におい
ては、被検定物の存在により支持されたバインダーへの
トレーサーの結合が阻止される。

すなわち、トレーサーは担体に結合した場合、担体にお
けるバインダーに直接結合するか、又は担体上のバイン
ダーに結合した被・検定物に結合するかの何れかである
。

検定に使用されるバインダーの種類は検定されるべき被
検定物ならびに特定の検定手段に従う。

半業者に公知であるように、支持されるノミインダーは
抗体、抗原、結合されるべき物質に特異的なプロティン
または天然に生ずるバインダーである。

すなわち、例えば抗原または／’％ブテンの競合型検定
においては、バインダーは抗体またはそのトレーサおよ
びその抗原もしくはノ１ゾテンに特異的な天然物質であ
る。検定が抗体に対する場合、ノくインダーは例えば抗
原または検定されるべき抗体に特異的である抗体である
。被検定物が抗体であるサンドイッチ型検定においては
、支持されるバインダーは抗体に対する抗原かまたはプ
ロティン例えばある種の抗体のＦｃフラグメントに選択
的に結合するプロティンＡである。ザンドイツチ型検定
において被検定物が抗原（１つ以−にの測定部位を有す
る抗原）である場合、バインダーは抗体であるかまたは
検定される抗原に特異的である天然バイングーである。

固［・１（支持体に支持するために適当なバインダーを
選択することは本明細書で示したことから当業界で知ら
れていることの範囲であると思われる。

本発明の検定においてトレーサーとして使用するために
標識化したりガントもまた検定さ扛るべき被検定物なら
びに検定手段に従う。すなわち、例えば競合型検定全抗
原またはハプテン６１１ｊ定のために用いる場合、トレ
ーサーを作るのに用いるリガントゝは被検定物またはそ
の適当な類似物の何れかである（゛適当な類似物″′と
は被検定物の類似物が被検定物に対するバインダーによ
って結合されるということを意味する）。

検定が抗体に対するサンドイッチ型検定である場合、ト
レーサーを作るのに用いられるリガンドは検定されるべ
き被検定物に特異的なリガンド、例えば検定されるべき
抗体または抗原により製造された抗体である。トレーサ
ーを作るために適当なりガントを選択することは本明細
書の記載から当業界で知られていることの範囲内である
と思われる。

上述したように、トレーサーを作るにあたってはリガン
ドは粒子状ラベルで標識化されておシ、このような粒子
状ラベルは実施される検定の方法により、視覚化されて
もされなくてもよい。しかしながら好ましい実施態様に
よれば粒子状ラベルは視覚化するものである。

好丑しい粒子状ラベルは韓（ｓａｃ）であり、この狐を
視覚性ラベルとして用いる場合、嚢は標識物として染料
または他の着色物質を含有する。そして検定で用いると
き、着色物質を放出するためこ本発明の好ましい実ｊ、
ＫＩｒ態様は、肉眼判読できる、すなわち検定の間に担
体に結合したトレーサーが視覚化する検定および物質を
示すものであるが、本発明はまた担体に結合したトレー
サーにさらに別の処理全施し担体に結合したトレーサー
の存在および／−または量を測定する検定および物質に
も適用されうる。このよう々実施態様においては、粒子
状ラベルは、例えば溶解によりｉが崩壊した後で測定さ
れる検定ｒｉｆ能な標識物を含む嚢である。

す々わち、例えば嚢はその内部に検定可能な標識物例え
ば放射性同位体、酵素、スピンンベル、螢光物質等を含
有している。しかしながら好ましい実施態様としては、
ラベルとして嚢を使うトレーサーは嚢全壊すことなく視
覚化するということは埋Ｆ＋イされたい。

トレーサーを作るためリガンドヲ標識化するのに用いら
れる嚢は７冊りな褒のどれでもよく、例えば赤血球イー
スト、リポソーム（−重膜（しばしば小胞と呼ばれる）
または多重膜）、重合体マイカ、−ｈ−７°市Ｉし／　
ａｔゆ１′イコ了セルヘー・ンヨンＣでｘｈ丑たけ界面
重合により作られたもの）等を含む。

勿論これに限定されるものではない。

赤血球ゴーストは当業界において公知であり、浸透圧モ
ル濃度が実質的に低い溶液中に赤血球細１１ｉ！２全ｉ
Ｍｉ　／蜀させることによＩ）調１促される。ゴースト
は標識物金含む水溶液中で’、、　：ｉ丁密閉（ｒｅｓ
ｅ　ａｌｅｄ）　”され、これによりゴーストはその内
一部に標識’４’！／Ｊ’に含有する。このような手段
は当業界で公知であり、適当な浸透圧モル濃度の再密閉
溶液は、標識物に加えてアルカリ金属ハライドおよびア
ルカリ土類金属ハライドならびに例えばアデノシン三リ
ン酸のような補酵素を一般に含有している。嚢としての
：ｆ−ストの調製は、例えばＤ’０ｒａｚｊＯらによる
”　Ａｎａｉｙｌ；ｉ、ｃａｌ　、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
”　Ｖｏｗ−，４，９，Ａ　１３．　Ｔ）−２０８３−
８６（１９７７年１１月）に記載されている。

重合体マイクロカプセルも当業界で公知の手順によＶ製
造される。但し、マイクロカプセルが形成される溶液も
寸だ標識物金含み、これにより重合体マイクロカプセル
の内部に標識物が含まれるということは知られていない
。マイクロカプセルの調製は、例えばＪａｎ　Ｅ、　Ｖ
ａｎａｅｇｇｅｒ著のＭｉ、ｃｒｏｅｎ−ｃａｐｓｕｌ
ａｔｉｏｎ　Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉ
、ｃａｔｉｏｎｓ　（ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ　］−９
７４，）にＢ己載されている。

当業界で公知のように、リポソームは様々な脂質例えば
リン脂質、グリコリピド、ステロイド、比較的長鎖のア
ルキルエステル例えばリン酸アルキル、脂肪酸エステル
例えばレシチン、脂肪アミン等の脂質から調製される。

脂肪物質の混合物例えば中性ステロイド、帯電した両親
媒性物およびリン脂質を組合わぜたものも使用できる。

リン脂質の代表的列としては、レシチン、スフィンゴミ
エリン、ジパルミトイルレシチン 的ステロイドトシテハコレステロール、コレスタノール
、ラノステロール等である。一般に炭素原子数１２〜３
０を含む帯電した両′Ｉμ媒性化合物の代表的例ば、モ
ノ−もしくはジアルキルリン酸エステルまたはアルキル
アミン例えばリン酸ジセチル、ステアリルアミン、ヘキ
ザデシルアミン、リン駿ジラウリル等である。

リポソーム嚢は標識物を含む水溶液中において調製され
、これにより嚢の内部に標識物が含−止れる。リポソー
ム嚢はこの溶液中で激しく攪拌し、続いて瑛の外側の標
識物を除くことにより容易にＶ周製される。

ＩＪ　、＋９ソームの調製に関する更に詳細な点は、米
国４１’′ｌ−ｒ−Ｐｉ　４，３　４　２，８　２６　
号オヨヒＰ　ＣＴ　Ｌｉｎｔｇ％公ｔｉｉＷ○８０１０
１５１５に記載されてお９、この両方とも全参考文献と
してここに記載する。

上述したように、嚢に含まれる標識物は、本発明にし５
たがって検定にトレーサーを使用したとき［株］を溶解
することなく視覚化する染料丑たは他の物質が好ましい
が、上述したように他の適当な標識物も徒だ使用できる
。

リガン１へ゛と粒子状ラベルとからなるトレーサーは、
疎水性染料または顔料の水性懸濁液またはとのような染
料もしくは顔料で被覆された重合体核（ｐｏｌｙｍｅｒ
　ｎｕｃｌｅｉ　）の水性懸濁液でリガンドを標識する
ことにより製造することもできる。このようなラベルは
、１９８３年２月１５日に発行された米国特許第４，３
７３，９３２号に更に詳，ｉｉｌｔｌに記載されている
。この特許で製造されるトレーザーは本発明のトレーサ
ーとしても使用できる。

上述の特許に示されているように、ラベルとして使用さ
れる着色有機化合物Ｈ／ｉ疎水性ゾルの形であり、この
疎水性有機染料丑たは顔′Ａ七寸水中で不溶であるかま
たは非常に僅かしか溶解しないものである。前記特許で
示されるように、疎水性染料もしくは顔料の水性分散液
捷たはこれら素泊１もしく（は顔，ｔ’ｌで被峻された
重合体核の水性分散液の粒子は、少なくとも５ｎｍ，好
ましくは１０〜５０（封１１ｎの粒径を有するものであ
る。

疎水性染料もしくは顔料脣た（はこれら素泊１もしくは
顔料で被覆された重合体核で標識されたｌ−　Ｖ−ザー
は、本発明による検定で使用されるとき視覚性ｌ・レー
ザーである。

本発明の検定に使用できる視覚性トレーサーを製造する
のに使用する他の粒子状ラベルの代表的例としては次の
よう一ｔものである：フエリチン（ｆｅｒｒｉｔｅｎ）
、フイコエリトリンｔ　Ｌは他のフィコビリ（ｐｈｙｃ
ｏｂｉ］．ｉ　）−プロティン；沈殿もしくは不溶性金
属もしくは合金；真菌類、藻類もしくは細菌の色素もし
くは誘導体例えば細菌クロロフィル；植物註材用もしく
は誘導体等。

リガンドは当業界で一般に公知の手段により本発明で使
用されるトレーサーを作るために粒子状ラベルで標識化
され、このとき用いられる手段は使用されるリガンドど
粒子状ラベルによる。このような技術には、吸着、共有
結合、誘導体比重たは活訃生化等が含まれる。リガンド
を嚢で標識化するトレーサーの製造においては、嚢はり
ガントで誘導体化された成分から製造さ扛、その除光は
製造されたときにリガンドで感作される。他の手段とし
ては標識物全含む舌金最初に形成し、続いて当業界で公
知の手段によりこの’ＩＡｋ’）ガントで感作する。

すなわち、トレーサーはりガントと粒子状ラベル（固体
または固体様ラベル即ち非固体ラベル例えば放射性同位
元素、酵素および様々な螢光物質と異なるもの）とから
なシ、この粒子状ラベルは検定条件下で視覚化するトレ
ーサーをもたらし、これに」：り器械金柑いることなく
被検定物の存在および／または量を測定できる：例えば
粒子状ラベルとして染料を含有するリポソームが使用さ
れる。

検定に用いられる固体支持体はシート状が好ましく、シ
ー［・状の支持体は通常カード、試、験ストリップまた
は浸漬用の棒等の彫金している。しかしながら他の形状
もまた本発明の１範囲内である。

バインダーは、試験用支持体の限定された区域に例えば
スポット形状でバイングー溶液を施こずことにより固体
支持体に支持される。前記スポットは支持体に例えば角
形丑たは円形のようにマークされた区域に位置するもの
でもよい。バインダーを直径３〜５ｍη１のスポット状
に試験区域に施こすと特に良い結果が得られる。限定さ
れた試験区域に置かれるバインダーの濃度は、実施され
る検定に応じて変化するが、一般にはバインダーは少な
くとも１０μ？／ｃｍ２好ましくは少なくとも４０μ？
／ｃｍ　２の濃度で存在する。同様に、試験支持体は２
つ以上の試験区域を有していてもよく、各試験区域は異
なった親和力および／または異なった濃度を有するかま
たは同一の濃度および／または親和カケ有する同じバイ
ンダーを含有するか、または様々な試験区域は異なった
バインダーを含有していてよく、この場合には検定ば２
ａ以上の被検定物を測定するのに用いられる。バインダ
ーは吸着により試験支持体上に支持するために試験支持
体に適当に施こされてもよいが、ある場合には試験支持
体にバインダー全共有結合させることが必要であり々了
ましいこともある。

支持体上の１つ以上の試１験区域にノミインダーを施こ
した後、試験支持体の結合力の余剰分を、検定で使用さ
れる物質を特異的に結合しない１種以上のプロティンで
試験支持体を処理することにより飽和するかまたはブロ
ックする。すなわち、例えば支持体の残存結合力をウシ
血清アルブミンを使用することによりブロックして非特
異的結合全阻止する。非特異的結合を阻止する技術は当
業界におい−Ｃ一般に公知であり、このような技術は本
発明検定における非特異的結合全阻止するためにも通常
使用されうる。

上述したようにして支持体に支持されたバインダーは、
上述の適当なトレーサーを使用する被検定物の検定に用
いられる。すなわち、例えばハシテンまたは抗原を測定
するのに有効な１つの検定技術において、担体の適当な
試験区域に抗体を支持させ、特にニトロセルロースから
形成されたこの担体−と被検定物含有丑たは懸濁した検
体と接触させ適当な時間インキュベートする。好ましい
実施態様において、抗体は、検定条件下で被検定物の少
なくとも興味の対象である範囲において扛１体結合トレ
ーザーが視覚化する濃度で試験区域に支持されている。

続いて、担体全緩衝液で洗い、トレーサーと接触させる
。このトレーサーは粒子状ラベル好ましくは視覚性染料
を含有するリポソームと結合した被検定物−または適当
な類似物である。

支持された抗体に結合するようになるトレーサーの量は
、検体における被検定物の量と反比例する。

結合していないトレーサーを担体から軽く洗い流し、担
体と結合したままのトレーサーの存在およひ／斗７こば
１１１．を検体中にイｊ在−３−る被検定物の存在：ｌ
：＋」：　０：　寸／Ｃはニー１ｔのｄ用字のためにＲ
ｔｉ＋ｌ’ｌする。

Ｖ−Ｂ、’、　、二〇了ましい手段として、リポソーム
全溶解することなく試ｊ険ノド持体におけるｌ・レーザ
ーの存在お上ｏ：□　、、／寸／゛ζは濃度を視覚的に
測定することがでいる。リポソーム内の検出可能な標識
金リポノー１、を１１′涌イした後に判定するという先
行技術の方、去と５゛１１なり、本発明方法によれ（佳
リポソームを溶）＋Ｊイすることなく担体にＪ７−ける
ｌ・レーサーの測定か「ｉＪｉ！ｊ：Ｉ・ζなる。

Ｉ−１，已方法の変法としては、連続して検体およびト
レーザーを加える代りに支持された抗体を含有ず乙用体
を測定すべき被検定物およびトレーサーに１中１、！ｊ
に接触させてもよい。

本究明の一面１１Ｃよればリポソームを溶）屏すること
なく担体上のトレーザ〜の存在および／址たは？ノー”
！−１：ｔ：　（１，１）全測定することはできるが、
県１ゼソ＝７、を溶解し次いでトレーザーの存在および
７／または叶イｃ測定することが好ましい場合もありう
る。

検定の別な型として、被検宝物測定に゛サンドイッチ法
が使用される。この方法においては、上述したように適
当な濃度で担体に支持さ７またバインダーを、最初に被
検定物例えは抗原と接１・」！Ｉｉさせる。続いて担体
上のバインダーと結合した抗原を、トレーザー例えば粒
子状ラベルクｆ斗しくｄ、視覚注染４′４ｆ：含むリポ
ソームでラベルした被検定・勿に対する抗体と接触さぜ
る。被検定物を介して担１、）（上のバインダーと結合
したｌ・レーザーの量は細体中の被検定物の量と正比例
１−１検体に存在する被検定物の存在および／丑たは量
は被検定物を介して担体に結合するトレーサーの存在２
よび２″または量から測定される。上述したように、好
ましい実施態様においては、ラベルとして適当な染料金
倉むｈａｔ使用することにより、この７■を溶解するこ
となりトレーザーの量および／−または存在を視覚的に
測定することができる。

試験区域に置かれたバインダーの一ニー：；−を他の検
定／ぐラメ−ターに応じて調整して被検宝物全興味ある
範囲で測定することにより、本発明にしたがって様々な
被検定物に対する検定を直ちに行なうことかできる。例
えは、代表的被検シーに物としてジゴ・〜′／ンヱｊｌ
Ｉｌハる１つの検定法において、視覚性トレー”ルーｆ
’ｌ　＞ニーはローダインのような□’ｆＭ覚ｉｇｈ染
ｔＩイＣρ１゛むリホノ−１、と結合したジゴギシゲニ
ンを用いてノーｚギンンの視話的半足ｌｄ検定ケ行なう
−ことかでさる。！）冒ｌＣ、ニトロセルロース担体、
験カート゛筐た（・］ｌ、ストリップを２つの試１験区
域ケ有するように’Ｖイ１：ｉｉ　Ｌ、それぞれの区ｊ
ｉ、Ｑはジゴキシンに対する抗体金′Ｉ′＋（なつ／こ
希釈率だとえば］：］００とＪ：５０てイ］し、この希
・ｇり率と他の検定・ξラメータとを調・、ＶシーＣ１
／コ゛ギシン破倹定物か２．０　ｎ　ｆｌ　Ａｎｌ以下
の：１：てイ′ｆｌ′ｌ−するとき（佳、検定において
両区域で着ρ≧かＩＬｊＪ、められ（ずなわち、ジゴギ
シン濃度２．　Ｏｎ　ｉ７’　／ｍｌｍｌ−゛でＱ」、
−’＋ＩＴ色が認められないような量でトレーサーかバ
・イングーに結合するの全阻害するのに＋２′ｊ−で〕
朱二い）、ジコ゛ギノン被検定物が２．０　ｎｆ／７ｒ
ｓ、以上４、０　目！？　／ｍｅ　、！以下のｌｉｉ：
で存在する場合には希釈率１：１０（ｌの試、験区域で
ｔ」：何ら着色が認められず希釈率１：５（ｌの試験区
域で（は着色か６．Ｊめられ、ジゴキ／ン被検定物が４
．Ｏｎｑ１ｍｅＪＪ上で存在するときは両試１験区域で
色が認められないようにすることができる。

」−ハ己へＶの公訴はジゴ“ギシンを参考ＶＣｔｉｅ　
ＩＩ祝したか他の被検定物でも同様の検定に用いること
かできることは埋１９子されたい。

同様に、上：ｉ］ｌｉ　Ｌだ視覚性トレーサー例えは染
料含有リポソームでラベルしたりガント゛と試５験区域
にバイングー全支持したニトロセルロース担体とを用い
、とのバ・イングーの親、（１」力および希釈率ケ他の
検定パラメーターと調整することに」：す、カラーチャ
ー１・全使用して定量的検定を行なうことができる。例
え：ｉ、ある一定の被検宝物濃度においては結合が阻害
され（色が認められない）、そ扛より低濃度で１は試、
験区域における色の強さは検体中の被検定物ζノ二度に
よる。すなわち、濃度か高くなると色が弱くなるように
してもよい。被検定物の公知濃度で検定を行なうことに
より作られ／とカラーチャ−トヲ用い、このカラーチャ
ー１・と被検宝物未知量を含む検体を検定して得られる
色と全比較して検体中の被検定物１寸を読むことができ
別の型の検定において、例えば薬品の毒性レベルのよう
に一定濃度に被検定物が達した場合試験区域に色が認め
られないように検定パラメータを決めることによシ］有
１または「無」の応答が得られるようにしてもよい。こ
のような検定は、ある７腫の薬品たとえばジゴキシンの
毒性レベルがあるかないかを決めるだめの患者のスクリ
ーニングに用いられる。

本発明全添伺の図面を用いて更に詳しく説明する。図は
本発明による試験支持体の一例を示す碩略図である。

図において、１０は試験支持体であるシートであり、こ
れはニトロセルロースで形成される。シー１−１０は特
定された別々の試験区域１１，１２．１３を有し、各々
にはバインダーが施こされている。

試験の説明のために、バインダーは抗体とし被検定物は
ハシテン廿たは抗原とする。上述したように、この抗体
を試験区域１．１．１，２．１．３に施こし、試験スト
リップまたはシート１０の残りに適当な遮断剤全含有さ
せ、非特異的結合全阻止する。

試験区域１１．、１２．１３に（は被検定物に対し界な
った親和力を有する被検定物に対する抗体が与えられて
いる。すなわち、試験ＩＺ域１１は被検定物に対し高い
親和力を有し、試験区域１２は被検定物に対し中程度の
親和力を有し、試験区域１３は被）検定物に対し低い親
和力を有する。これに代つ−Ｃ１試験区域１１．１．２
．１３には被検定物に対し同一の親４目力金有する抗体
を施こし、試験ＩＸ域］］は抗体の濃度か高く、試験区
域１２は抗体濃度が中程度、試験区域１３は抗体濃度が
低いようにしてもよい。

図における検定；京案および手順は、試験区域１１、１
２．１３に位置する抗体の濃度および／丑１′ξは親和
力を他の検定パラメータ例えばトレー−リーー濃度等と
調整して競合結合型検定法となるようＶて計画され、従
って検体中の被検定物量が標−準以下（低い）のときは
試験区域１１．１２．１３のすべてに肉眼での判読が認
められ、被検定物１ｄが標べ（・酌量の場合には試験区
域１１のみまたは試験区域１１と］２の両方に肉眼での
判読が認められ、被検定物量が漂準以上（高い）のとき
は試験区域［１にのみ肉眼での判読が認められる。

試験ス）　ＩＪツブ１０を用いる場合には、最初にスト
ｌ）ツブ金被検定物を含有する検体と接触させ、適当に
洗浄した後、視覚性染料の形で検出可能なラベルを含む
リポソームと結合した被検定物またはその適当な類似物
である適当なトレーサーとこの試験スト’ＩＪツブ１０
とを接触させる。ストリップ１０から未結合のトレーサ
ーを洗った後、着色された試験区域１１．１２．１３　
ｋ調べることにより検体が高濃度、中濃度または低濃度
の被検定物を有しているかどうかを調べることができる
。

すなわち、本発明は、被検宝物測定ｒ簡単な視覚−にの
判ＲｆＣで行なう検体中の被検宝物測定手段として容易
に用いられうる試験ストリップ型検定に簡単に適合しう
る。

すなわち、例えば試験ストリップはＴ４の検定に用いら
れ、試験区域１１，１２．１３における抗体親和力およ
び／または濃度は、Ｔ４濃度が１２μｙ／ａＬ以上（甲
状腺機能先進）の場合にはトレーサーの結合が完全に阻
害され（試験区域１１，１２：ｉりよび１３の回れにも
色が認められない）、Ｔ、ｌ濃ハｙが８５７１９　／ｄ
、を以上１２μｙ　／ｄｔ未満（甲状腺機能正常）の場
合にはトレーサーの結合は試、一区域１２と１３で完全
に阻害され、試験区域１１で阻害されず（試験区域１１
にのみ着色が認められる）、Ｔ、Ｉ濃度が５１’？、／
ｄノ以上８．５１１ｆｊ、／ｄ、を未満（甲状腺機能正
常９の場合はトレーサーの結合が試験区域１３で完全に
阻害され試ｊ験区域１１と１２で阻害きれず（試験区域
１１と１２で色が認められる）、ｌｒ４濃度が５μｆ／
ａノ未満（甲状腺機能低下）の場合は）・レーサーの結
合が試、一区域＋　１．１２．　Ｉ　３の何れでも阻害
されずｉ見覚性色彩全阻止されない（試、一区域１１゜
１２、Ｊ３の各々に色が認められる）。

本発明は、検定されるべき検体中に通常低濃度で存在す
る被検定物の測定にも用いられる。ｊ、、！１１ち、例
えば本発明は、少なくとも１０”？／ｍｌの感度で肉眼
１′ｌＪ読（器イ戒σ用字全行なうことなく、卦よび／
またはラベルを処理することなく）ぞもたらす１莢定と
して使用されうる。すなわち、不発１叫の検定は、肉眼
判読の有利さを保ちながら非常に低濃度で興味の対象で
ある検体中に存在することが知られている被検定物（例
えば、ｈｃＧ、ジコ゛キシン、黄体形成ホルモン）の検
定として用いられる。

出願人は、上述した型の抗体と上述したトレーサーおよ
び他の条件と全組合わせて用いることにより、被検定物
がＩＱ−”ｉｊ’−／ｉ以下で存在するときでさえＩ・
レーザーと組合わせた担体中のバインダー全量およびバ
インダー濃度が担体に秒ける視覚性トレーサーの存在お
よび不存在’ｃ　ＩＺ別するのに」−分感受性の高い検
定全もたらずことからなる検定を提供しうろことを見い
出した。

本発明の他の一面によれば、次のものからなる被検定物
の検定全行々うための試薬キットまたは試薬−弐′ｆｆ
：提供するものである：　ｉＢ）少なくとも１つの試験
区域を有するものであって、前記試験区域は該区域に少
なくとも１０／’ｆ／ｃｒｎ２（好ましくは少なくとも
４０μ！ｉ’　／ａｎ　２）の濃度でバインダーがはか
れている物質から形成され、この少なくとも１つの試験
区域は被検定物および検定に用いられるトレーサーの少
なくとも１つ（て交りするバ、イングーを含み、該バイ
ンダーは酌記試７験区域に少なくとも１．　Ｏ／１ｆ／
　／ｌｙ？＋２の濃度で支持さｎている担体、および（
ｂ）粒子状ラベルで標識化されたＩＪ　、ｉｆンドであ
るトレーサーでめつ−Ｃ１このｌ・レーザーは被検定物
臂よびバ〜ｆングーの１つに結合している。好ましい実
施態様によれば、担体はシートｊし状であり、ニトロセ
ルロースから製造される。上述１〜だように、抗体は２
つ以上の試験区域を有し、これら虚数の試験区域（１口
同じバインダーを異なつグζ濃度で有するか、同じバイ
ンダーを異なった親・■］力で有するか寸たけ異なった
バインダーを有するようにしてもよい。好捷しい実施態
様によれば、１・し）−ザーは内部に検出町（↑ヒなラ
ベル全含有するり〜夕で標識ｒヒされており、ラベルは
１ｌｒＡｋ破壊することなく肉眼で検知されうる例えば
染料が好ましい。

キッド丑たは一式は他の４′１４成品たとえば被検宝物
標準液（公知濃度の破検定物金含む被検定物サンプル）
、公知緩衝液等を有していてよい。

本発明は様々な被検定物と測定するだめの手段および装
置に適用することができる。被検定物の代表的例として
は次のようなものがある：治療薬お」：び麻薬を含む医
薬品；ホルモン、ビタミン、プロティン（すべてのクラ
スの抗体も含む）、ペプチド；ステロイド−；細菌；真
菌；ウィルス丑たは寄生体；細菌、真菌、ウィルスまた
は寄生体の構成成分または産生物；あらゆる種類のアレ
ルゲン；正常または悪性腫瘍細胞の構成成分または産生
物等。特別な例としては、Ｔ４；Ｔ３；ジゴキシン；Ｉ
Ｉｃ（−７；インシュリン；テオフィリン；黄体形成ホ
ルモン；様々な疾病の原因−または関連する微生物たと
えばストレプトコッカス・ピロゲネス（ｓｔｒｅｐｔｃ
ｏＣｃｕｓ　ｐｙｒｏｇｅｎｅｓ）　（Ａ群）、単純庖
疹Ｔ型お・よび１１型、ザイトノガロウイルス、クラミ
ジア等である。

被検定物は様々な検体たとえば尿、血清等のような体液
中でｄ１１］定される。全面サンプルで被検定物？検出
することが可能な場合もある。

上述したように検定は粒子状標識でラベルされたリガン
ドからなるトレーサーで行なうこともできるが、粒子状
標識が嚢、最も好ましくはリポソームであり、リポソー
ムが視覚性染料を含んでおり、これにより検定が肉眼に
よる判読をもたらす場合に最も良い結果が得られる。」
二連したように、検定は定性（被検定物か特定レベルで
存在するかどうか）、または定量もしくは半定量的であ
る。

適当な標準液および／または標準カーブ（［標準カーノ
ー１とはカラーチャー＋−ｉ含む抱括的饋念で用いられ
る）は本明細書で示したことから当猶界で知られている
ことの範囲内である。

本発明（は、非常に感度の良い検定（例えばジコ゛ギシ
ンに対して）を、検定結果を肉眼で測定する（視覚的判
１ぜＶ）のに十分な信号で行なうことができるという点
で市−にイエ利である。また、カプセル化した標識物を
結果測定ｉ？ｉＪに遊離する必要がないので、これによ
シ一段階を省略して検定ヲｒ１ｊ′３単化するという別
の有利な点がある。更に、ただちに検定を行なうことが
できる。

最終使用者にとって検定が全体的に簡単であるため、未
訓練者が直ちにこの検定を行なうことができる。一度作
られ−た固相は長期間安定である。

加えられる検体量または加えられるトレーサー量におけ
る小さな誤差は検定結果に殆んど重大な影響を与えない
。ここで記載した検定は家庭における使用にも十分簡単
で信頼性があり、この場合には通常は簡単なテスト形式
で入手することのできない広範囲の種類の被検定物を検
出するのに十分な感度全有する。

これらのおよびこのほかの有利な点は本明細書に示した
事がら尚業者にとって明らかである。

また、粒子状ラベルは着色粒子例えば着色ポリスチレン
ビーズでもよいことは理解されたい。

本発明はさらに次の実施例について記載する；しかしな
がら、本発明はこれらに限定されない。

実施例　Ｉ リポソームの調製 １、　１００ｍ１の回転蒸発丸底フラスコへ次のものを
加える： ａ＋コレステロール、ｓｉｇｍａ　＋ｃｕ−ｓ　４８”
７ｇｂ・ジステアロイルホスファチジルコリン（Ｄｓｐ
ｃ）。

Ａｖａｎｔｉ　ｐｏｌａｒ　Ｌｉｐｊｄ８４ｔ８５０３
６５（２０７（〕ｇ／ｎノーｅ、ＣＨＣ／、　ｆ′４リ
　Ｉ−０４ｌｌｌ’ｊνＣ，架橋ハリ１−ジステアロイ
ルホスファチジルエタノールアミン−（ｐ−マレイミド
ゝフェニル〕フ′チラート（ＤＳＰＥ−ＭＰＢ）、自家
製、２〃ｌＩ／／′ｍｌ＋　ＣＨＣＺ３中、後記実施例
工Ａに記載）　３．７５ｍｆｉ ｄ、イソプロ上０ルエーテル、Ｆｉｓｈｅｒ　４０Ｇ　
−１４−１６，０ｙｄ２ｅ、メタノール、Ａｌｄｒｊ、
ｃｈ　４１５，４９０−：３　１．０〃＋Ａ２　渦巻状
に混ぜる。

３、　０．１Ｍスルホローダミン（Ｓｕｌｆｏｒｈｏｄ
ａｍｉｎｅ）Ｂ、　Ｅａｓｔｍａｎ　＋１．４３２１　
（０，１，Ｍ酢酸すトリウム／　Ｏ，］、　Ｍ　ＮａＧ
４　ｐＨ４，５緩１衝液中で調製）５、Ｏｍｅ分加える
。

４　渦巻状に混ぜる。

５、容器へＮ２全流す。

６　室温にて１０分間水浴超音波処理機で処理して乳化
する。

７　次のようにセットして回転蒸発器へ入れる：水浴’
ｆｊ情度　４４℃ 回転スピード ８　泡立ちが止まるまでゆっくり減圧にする（約３０−
／１０分）。

９　圧力を下げリポソームｔ３０分間４４℃でアニール
する。

１０　容器へ加ｆ！Ａ　（　５　０〜５２℃）０１Ｍス
ルホローグミンＢ　］、　Ｏ　ｍｌを加え、混合する。

月　温すボンーム調製′吻をパイオラドユニポアホリカ
ルボネート膜０．４ミクロン次いで０２ミクロン〔それ
ぞれバイオラド（Ｂｉ○ｒａｄ．）＝＃３］　３　−　
０　０　５　９および≠３１３−ｓｏ５ｃ＋）を通して
刊（し出す。

１２、リポソームを、酢酸すトリウム／食塩緩衝液（ｐ
Ｈ４．５）を用いて９　０　ｍｌ超遠心分離機の管中で
ｊ恣量約８０＋ｎｌ−まで希７訳する。

１３、３０分間７５，ＯＯｏＸ′？で遠心分流を行なう
。

１４、−＜レット化したリポソームを酢酸ナトリウム／
塩水緩衝液、（ｐＨ　４．５　）で再懸濁させて８０ｍ
ｌとする。

１５、１３と１４，次いで再び１３の操作を繰返す。

１６　−々レット化したリポソーム全トリス緩衝液（ｐ
Ｈ８．０）（５ＱｍＭ　＋ーリス、ｌ　Ｏ　Ｏ　ｍＭ　
Ｎａｐｔ。

ｉ　ｍＭ　ＥＤＴＡ，　３　］、　ＯｍＯｓ／１（ｒ）
　］、　Ｏ　ｍｌ中で再：笹濁化する。

１７　プロティンが反応するまで４℃に保つ。

実施例　ＩＡ ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン・マレ
イミドフェニルブチラードの調製ジステアロイルホスフ
ァチジルエタノールアミン（１１９．２７１１ｇ，０．
１５９３ミリモル、Ａｖａｎｔｉ　ＰｏｌａｒＬｉｐｉ
．ｄｓ　）’　ｆりｏｏホルム３　０　ｍｌ中でｊ’［
Ｋ濁し、すべての固形物が溶解する１で窒素雰囲気下で
還流加熱する。この溶液全室温捷で冷却し続いてトリエ
チルアミン（２２２μ．ｇ，　０　１５９３ミリモル、
Ａｌｄｒｉｃｈ　）とスクシンイミジル−４．　−　（
　ｐ−マレイミドフェニル）ブチラード（　７　９．４
．　５　ｍｇ、０．２２３０ミリモル、Ｐ］ｅｒｃｅ）
を加える。反応混合物を窒素雰囲気下で室温にて一晩攪
拌する。混合物を減圧下に濃縮すると淡黄色ワックス状
固形物Ｃ２７０．７ｍｇ＞が得られ、薄層りロマトグラ
フ分析（シリカ、６５　：　２５　：　４０Ｈ２ＧＡ２
：　ＯＨ：、ＯＨ：　Ｎ２０）では１つの大きなスポッ
トと数個の小さなスポットが現われる。このメン１ソソ
トを紫外線とモリノデン青噴霧試薬（ｓｉｇｍａ　）で
顕色化する：Ｒｆ０．５゜ 粗生成物を４個のシリカゲル調裂用薄）※板（Ｅ。

Ｍｅｒｃｋ、　２．０＋＋＋ｎ＋）でりｏマドグラフィ
にかけ、ＣＨ２Ｃ４２：　ＣＨ３０Ｈ：　Ｎ２０６５　
：　２５　：　４で展開する。２つのモリノデン青活性
帯のうち上部の帯を単離し、生成物金５０係ＣＨ２Ｃｌ
２：Ｃ２Ｈ５０Ｈで抽出する。溶媒を蒸発すると白色固
形物（６５，７５Ｉｎ！／）として生成物が得られる。

工Ｆ（純粋）：　２９１ｏ（＋ｓ）、２８４５（Ｓ）、
１７３４（ｓ）、１．７１５（ｓ）、１５１．０（＋ｎ
）、１４６０（ｍ）。

１３９０（ｍ）、１３７０（ｍｗ）、１２４２（ｍ）、
１２３０（ｍ）、］１０１００（，１０６０（＋ｎ）、
９０５（ｍ）、８２０（ｍ）、　６８５ｃ７ｎ　（ｍ） この方法で得られたリポソームはローダミン染料を有し
、当業界で公知の手段によりリガンドで感作して本発明
で使用するトレーサーを生ずる。

次の実施例口ではリポソーム全抗体で感作してトレーサ
ーを調製することについて述べる。

実施例　１１ 】　プロティンへの積装した抗体８〜へ、酢酸ナトリウ
ム／食塩水緩衝液（ｐＨ４，５）中の］Ｍジチオスレイ
トール０４ｍ１ｆ加える。

２　渦巻状に攪拌し、暗所で；３０分間室温にて反応さ
せる。

３　トリスｒ＋Ｈ８，０緩衝液（５０ｍｌφトリス、１
００ｍＭ食塩水、１　ｍＭ　ＥＤＴＡ’、　３１０ｍ０
ｅ／％）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム上
に反応物容吐を通過させてジチオスレイトールを除去す
る。

４０、Ｄ、２８０でモニターし、先に流出する−１ぜイ
ドのフラクションを集める。

５　この溶液を新しく調製したばかりのす７１２ノ−ム
１０ゴと？昆合する。

６、Ｎ２ｆ流してからシールする。

７　室温で一晩反応させる。

８　これらプロティン−ラベルされたリポソームを標準
１．　ＩＪス緩衝液を用いて遠心分餅ｆ（てより２度洗
う。

９、最後に洗浄した後、ｌ−１）ス液４０ｍ１中にはレ
ノｌ−全４与ｊ額ン蜀化させる。

１．０．　／１℃で保存する。

実施例　ＩＩ？ １（ＣＧＫついてのニトロセルロースディスク免疫検定
法 反応り吻 １　吸着緩衝液５　：　ＢＤ、カタログ（Ｃａ、ｔａｌ
ｏｇ　）＋　６１．４３　：３５ ２、ＨＯＧのα鎖に幻するＨｃＧ抗体 ３、ニ　ト　ロ　セルロースｉｆ；２　：　５ｃｈｌｉ
ｅｅｈｅｒ＆５ｃｈｕｊ１１．。

ＭＥ２５．孔径０．４．５１ｔＪｎ ４　ウシ血清アルノミン：　Ｓｉｇｍａ、カタログ≠Ａ
７９０６ ５　尿対照物：　ＢＤ工、カタログ＋２５５８１５６ト
レーサー二実施例Ｉの方法で調コ（され、実確例ＩＩの
方法でＨＣＧの鎖への抗体で感作されたリポソーム 手順 １　ニトロセルロース紙を］ＣＴｎのディスクに切る。

２　ディスクの中央へＨＣＧ抗体の］：５０希釈液（Ａ
Ｂｓで花釈）３１Ｉｔをピペットでのせる。

３　室温にて１５分間乾燥する。

４、ＢＳＡの５％ＡＢ！ｄｆｆｌ（使用前に０．４５ミ
クロンのフィルターで７濾過する）３００μ、ｌ−ｆｃ
ピペット５　ディスクを１時間；３７℃でインキュベ−
１・する。

６　液体金デカントする。

７　尿対照液または尿２００１１ｔをピペットでのせる
。

８　１時間室品でインキュベートする。

９　対照液寸たは尿をデカン［・する。

１０、１．　５　ｙｄ　Ａ　Ｂ　５でディスクを２回洗
う。

１Ｊトレーザー１：１２希釈液（ＡＢ５で希釈）３００
μを全ヒペットでディスクへのせル。

１２、室温で１時間インキュベートする。

］Ｃ３トレーサー全デカントする。

Ｊ、４．　ＡＢ５１．５ｍｌで２回洗う。

−六一 尿定性険査の放射線免疫検定（Ｒ工Ａ）結果とニトロセ
ルロースディスク試、験結果の対比１１１週　十　＋ ２　１０週　十　＋ ３　７％週　十　＋ ４　８！Ａ週　十　」− ５＋１！／う週　十　＋ ６　１１３Ａ週　モ　＋ ７　９週　十　＋ ８　我週　十　＋ ９　１０週　十　＋ １．０　８％週〜１２週　十　＋ １１　なし　士　− １２なし　−− １３なし　− １４なし　− 表中、＋・は陽性、−は陰性、士は不明瞭（ボーダーラ
イン）を表わす、Ｒ工ＡはＢＤ　ＨＣＧ　１１２５キツ
ｌ−を用いて行なわれた。尿は診療・機関から入手した
。

実施例　１＼ｌ この実施例においては、リポソームに代って染色したプ
ラスチックラテックス粒子を用いる。

破傷風免疫グロブリン（ヒト、Ｗｙｅｔｈ　Ｌａｂｏｒ
ａｔ−ｏ　ｒ　：ｉ、ｅ　ｓ社）を０．０６　Ｍ　１ｉ
ａＣ／−含有０．１Ｍホウ酸緩１曲液（ｐＨ９）で１０
単位／ｍＩＶ、に希釈する。この抗体溶液５７１ｔ７．
、ニトロセルロース紙（Ｓｃｈｉｅｃｈｅｒ　ａｎｄ３
ｃｈｉ１．ｌ）、ＢＡ８５１５、孔径０．４５　／−１
の小円形（直径１　ｎｎまで）表面にスポットし、３０
分間乾燥する。このティスフを、ウシ血）青アルブミン
のＡＲ工Ａ吸着緩イ・ｊｊ液−１５（ＢＤＡＩ、ユタ州
ツルトレイクシティ、カタログ≠６１．４３３５　）中
の２％溶液に約３０分間浸漬し乾燥する。

対照紙を、破傷風免疫グロブリンを除いた以外は上と同
様にして調製する。

染色された赤色ポリスチレンラテックス粒子（Ｐｏコ、
ｙｓｃ：；ｅｎｃｅｓ　Ｉｎｃ、カタログ＋４５７０８
．Ｌｏｔｌ、２４６０．０．５５μ径）を、０．１Ｍホ
ウ酸塩、０．０６ＭＮａ　ｃｚ緩衝液で遠心分離（１３
０００ＸＰ、５分間）により数回洗い、０１Ｍホウ酸緩
衝液中の破傷ｊ虱廚素（Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ　
Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆＨｅａｌｔｈから入手）　
６００　Ｌｆ／ｄ２で４℃にて４日間感作する。感作紋 された次子を緩衝液で数回洗い、１重量襲溶液として保
存する。

免疫活性を測定する試験は次のようにして行なわＩ″１
．る：対照ディスクおよび抗体被覆紙ディスクを、Ｆａ
］、ｃｏｎ■３０４７２４−凹部組織培養プレートの個
々の凹部に置く。貯蔵しておいた感作ラテツクス粒子２
００μｔへ０．１Ｍホウ酸緩衝液４００μｔを加え、こ
の＠濁液３００μｔを前記調製ニトロセルロースを入れ
た凹部へ加える。プレートを室温で１時間インキュベー
トし、その後に一パーディスクを取シ出し、緩衝液で手
早く洗う。特定の抗体を含有するディスクは着色ラテッ
クス粒子の肉眼ではっきり見えるスポットを示すが、対
照ペーパーにはこのような免疫反応が生じたことを示す
スポットが見られない。これらの結果は走査電子顕１歳
鏡で確認された。

実施例　Ｖ ジステアロイルホスファチジルエタノールアミンージゴ
キシゲニンの調製 ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（４０
０，０ｍ？、０．５３４６ミリモル、Ａｖａｎｔｉ　Ｐ
ｏ１ａｒＬｉｐｉｄ）　をＣＨＣｔ３　：　ＣＨ３０Ｈ
（９：　１　）　５０　ｍｌ　ＩＣ！Ｗ：蜀させ、すべ
ての固形物が溶解する寸で窒素雰ｊｐＩ」気下で還流加
熱する。溶液全冷却し、続いて３−ケトジゴ゛キンゲ＝
、／　（２０７，７ｍ１ｉ’、　０．５３１１．６ミリ
モル）と＝ＩＡシーブ（Ｓｉｇｍａ）　２．０！ｉ′と
を加える。反応混合物金窒素雰囲気丁に３時間６０℃で
攪拌し、この時点でナトリウムシアノポロハイドライド
（３，６，９５１１’１ｇ、　０．５８８１ミリモ／ｌ
／、　Ｓｉｇｍａ　）　？ｅ加える。

混合物全室温で一晩攪拌する。反応物をｆ過し減圧下に
濃縮すると白色発と包体（５７９，６ｍｌ）が得られ、
これをＴＬＣ分析（シリカ、２０％ＣＨ３０Ｈ：ＣＨ２
Ｃｔ２）にかけると１つの大きなスポットと数個の小さ
なスＨソットとが生じる。このスポットをリン−モリブ
デン酸噴霧剤（Ｓｉｇｍａ）で発色させる（ＲｆＯ，３
）。

粗生成物を低圧力ラムクロマトグラフィ（シリカケル、
］　Ｏ％　ＣＨ３０Ｈ−ＣＨ２ｃｔ２）　テ精Ｍ　スル
（！：　白色固形物（１＋、ｓｓ３＋＋＋ｇ）が生成物
として得られる。この生成物は２３０ｎｍにセットされ
た可変波長紫外線検出器で検出される。

実施例　■ ジゴキンゲニンで感作されたローダミン染料含有リポソ
ーム（トレーサー）の調製 ホスファチジルコリン、ジパルミトイル（ｄｐｐｃ）、
コレステロール（ｃｈｏｌ）、ホスファチジルエタノー
ルアミン、ジステアロイルーシコキシゲニン（ｄｓｐｅ
−ａｊｇ）　（実施例■）およびホスファチジルグリセ
ロール、ジパルミトイル（ｄｐｐＧ）　’ｅ、ｃｈｏｌ
　５０モル係、ｄｐｐｃ　４　Ｑモル係、ｄｐｐｇ　］
、　Ｏモル係の割合でクロロホルム／メタノール（２０
：Ｉ）に溶がし、ｄｅｐｅ−ｄｉｇ　（７）微量（たと
えば２００μ２）を加える。

脂質全回転エバ７１セレーターの丸底フラスコの内側で
減圧下に乾燥し、続いて一晩凍結乾燥機へ入れて残存微
量溶媒のすべてを除く。スルホローダミンＢのＯ，１Ｍ
水溶液をこのフラスコへ加え（ｉｏｒｎｌ）フラスコを
激しく振とうする。所望により音波処理を手早く行なっ
てもよい。この操作は６０℃にて行なわれる。当業界で
知られているようにこの条件下でＩＪ　、、Ｏソームは
自然に形成し、カプセルに密閉されたローダミン染料約
０１Ｍを含む。検出可能なジゴキシダニンはリポソーム
の表面に露出する。リポソームをカプセルに密閉された
染料と同じ浸透圧モル濃度（約３１．０ｍＯｓ／Ｋｇ）
の緩衝液で数回洗い、浸透圧による溶Ｍを防止する。調
製物を０４μと０２μのフィルターを通してｒ過して大
きなリポソームを除く。リポソーム全緩衝液で希釈して
緩衝液］、　ｍｌにつきリン脂質１−　／Ｚモルを含有
するようにする。

実施例　■ ジゴキシンの調製 ズー・３−スポツティングの順序 ］、　スポット用ニトロセルロースペーパー（ＭＥ＝２
５）に、ＢＳＡｏ、１％含有トリス緩衝液〔トリス塩基
６．００５　ｇｍ、　ＥＤＴＡ三ナト三ツトリウム０８
ｇｍ。

Ｎａ１ｌ　６．）３３　ｇｍ、　ＮａＮ３０．２　ｇｍ
、　ＢＳＡ　１　ｇｍにＨＰＬＧ水十分水分分量１ｔと
し、ＨＣｔでｐ）（ｓ、ｏとする。

４　Ｍ　ＮａＣｔ（１１，６８８ｇｍ／ｄｔ）　を用い
て３１０　ｍｏ　ｓ／％に調節する〕中のウサギ抗ジゴ
キシゲニン抗体５μｔを、阻害を示す様々な濃度で斑点
を付ける。３０分間空気乾燥を行なう。

２、Ｂ５Ａ３％５ｌトリス緩衝液〔トリス塩基６．０５
５ｇｍ、ＥＤＴＡ三ナト三ツトリウム０５８　ｇｍ、　
ＮａＣｌ２．８３ｇｍ、　ＮａＮ３０．２ｇｍ、　ＢＳ
Ａ　３０ｇｍにＨＰＬＣ水十分水金分量１ｔとし、ＨＧ
ｔでｐＨ８，０にする。

４Ｍ］寸ａ０．４（］、　ｉ、、　６８８　ｇｍ／ａｔ
）ｋ用いて３　］、　Ｏｍｏ８７に？ＫＺ３Ｆ＋−ｊる
〕３００／４ｔｔニトロセルローススＲ−パーの斑点で
覆うようにのせる。これにより斑点を３０分〜】時間捷
たけ斑点が完全に飽和する寸でＢＳＡ中に浸漬する。飽
和後、デカントｔたは吸引の何れかによＪＢＳＡを除く
。

検定順序 １、予め処理した斑点全ジゴキシン標準液［Ｏｎｇ／ｍ
ｌ：　０．５　ｎｇ／ｍｇ：　１．Ｏｎｇ／ｍｌ：　２
．５　ｎｇ虐１および／または患者の血清で覆うように
のせる。これにより、斑点を標準液および／または血清
中に１０分間浸漬する。デカントまたは吸引の倒れかに
より標準液および／または患者の血清を除く。標準液お
よび／−！たは患者の血清を除去後、トリス緩衝液〔ト
リス塩基６．００５ｇｍ、　ＥＤＴＡ三ナト三ツトリウ
ム０５８　ｇｍ、　ＮａＣｔ６．８３　ｇｍ、　ＮａＮ
３０．２　ｇｍにＨＰＬＣ水適量全適量て１ｔとし、Ｈ
ＣｔでｐＨ８，Ｑとする。

ＮａＣｔ（１１，６８８ｇｍ／ｄｔ）　’ｃ用いて３　
］、　００ｍＯｓに７に調節する〕でこの斑点を２度洗
う。

水適量を加えて１ｔとし、ＨＣｌ　Ｔ　ｐＨｓ、ｏとす
る。

４Ｍ　ＮａＧｔ（１１，６８８ｇｍ／ｄｔ）　’ｌ：用
いて３ｌ０ｍＯｓ／に９に調節する〕中で抑制を示す希
釈率に希釈された実施例■のＰＥ−ジゴキシゲニン１０
０〜４．００１１’／を含有する感作されたリポソーム
５００μｔで斑点全被覆する。こうして斑点をリポソー
ム中に１５分間浸漬する。デカントまたは吸引の何れか
によりリポソームを除く。リポソームを除いた後、トリ
ス緩衝液〔トリス塩基６．０５５ｆｌ！、ｍ、ＥＤＴＡ
三ナト三ツトリウム０８　ｇｍ、　ＮａＣ／＝　６．８
３　ｇｍ、　ＮａＮ３０，２　ｇｍにＨＰＬＣ水適量ヲ
加え”’Ｃ１４とし、ＨＧｌ−テｐＨ８，０とする。４
　Ｍ　ＮａＧＡ　（］、　１．６８８　ｇｍ／ｄ−５）
　を用いて３　］、　Ｏｍｏｓ７物に調節する〕で斑点
を２回洗う。

検定解釈 この研究の目的のために、使用された抗体希釈率は、Ｉ
　：　２００．　］　：１２００および１　：　２２０
０である。これらの希釈率は必要に応じて変化させても
よい。結果は次の通りである： 希釈率１：２００においてはすべての標準液濃度におい
てピンク色の斑点が得られた。この希釈率は説明のため
のみ示すものである。

希釈率１　：　１２００においては標準液濃度ｏ　ｎｇ
、／ｒｎｊ２゜０．５　ｎｇ／ｍ７！および１．０　ｎ
ｇＡｌｌでピンク色の斑点が得られた。標準液濃度２．
５　ｎ　ｇ／／ｍｌではピンク色の斑点は認められない
。これはジゴキシン２．５　ｎ６７ｍ１またはそれり、
上存在するときは着色が認められないということを示す
。

希釈率１　：　２２００においては標準液濃度ｏ　ｎｇ
／ｍｌ。

０．５ｎｇ／ｍｌでピンク色の斑点が得られた。標準液
濃度］、、Ｏｎｇルおよび２．　ｓ　ｎｇ／ｍＡではヒ
０ンク色の斑点は認められない。これはジゴ゛キシン］
、、Ｏｎｇまたはそれ以上存在する場合には色が認めら
れないということを示す。

患者の血清１０本を予め記載したように準備し、結果を
次の点に関して比較する： 希釈率］　：　２００　患者の血清が２５　患者の血清
が２．５ｎｇ／ｍｌ以下である　ｎｇ、／ｍｅ以上であ
るかどうか　かどうか 希釈率］　：　２２００　患者の血清が」Ｏ患者の血清
が］Ｏｎｇ／ｍｉ以下である　ｎ６７ｍ１以上であるか
どうか　かどうか との基準を用いて、患者の血清１０本のうち９本におい
て値の範囲（すなわち２．５　ｎ　６７ｍ１以上；１０
〜２５ｎｇ、／ｍｌの範囲内；　］、、ＯｎＦ！、７ｍ
ｌ以下）が正確に測定された。

【図面の簡単な説明】

図は本発明による試験支持体の一例を示す概略図である
。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）　被検定物質および下記バインダーの何れか一方
   に結合性を有するリガンドを肉眼判別可１ヒな粒状ラベ
   ル剤で標識してなるトレーサーを下記接触条件下で肉眼
   判別可能に結合さぜうる量の下記物質および前記トレー
   サーに対して結合性を有するバインダーを支持させ、該
   バインダーを被検定物質と前記トレーザーとに接触させ
   ることによってＢ！Ｊ　ｔｅ　トレーサー全前記担体上
   のバインダーおよび１）ＩＪ記担体上のバ、イングーに
   結合した被検定物質の何れか一方に結合させ、しかるの
   ち、前記抗体の検定区域に結合したトレーザーの有無を
   サンプル中の被検定物質の有無もしくは量の指標とじて
   （２）被検定物質とトレーサーを連続的に固体担体上の
   バインダーと接触させる特許請求の範囲１項記載の方法
   。 （３）被検定物質とトレーサーを同時に固体ｊＵ鉢体上
   バインダーと接触させる特１′Ｉ：請求の範囲第１項な
   いし第２項の何れかに記載の方法。 （４）トレーサーのラベル剤がその内部に肉眼で判別可
   能な染料を含有する嚢状物である特Ｓ′１一請求の範囲
   第１項ないし第３項の何れかに記載の方法。 （５）嚢状物がリポソームである時Ｆ”Ｆ請求の範囲第
   ４項記載の方法。 （６）結合したトレーサーの肉眼判別をリ・１セソーム
   の溶ｊｉｂ子無しに実施する特許請求の範し１１第５項
   記載の方法。 （７）ｌＩｌｌ，′１体支持体がシート状である特１イ
   ｌ’ｊ’Ｉｆ求の範囲第１項ないし第６項の何れかに記
   載の方法。 （８）バインダーが抗体である特許請求の範囲第１項な
   いし第７項の何れかに記載の方法。 （９）トレーサーが被検定物質の標識された状態のもの
   である特；ｉ′ｌ−請求の範囲第１項ないし第８項の何
   れかに記載の方法。 （１０）トレーサーが被検定物質に対する抗体の標識さ
   れた状態のものである特ｒｌ：請求の範囲第１項ないし
   第８項の何れかに記載の方法。 （１１）被検定物質がジゴキシンである特ｉ１！「請求
   の範囲第１項ないし第８項の伺扛かに記載の方法。 （１２）被検定物質がｈＣＧである特許請求の範囲第１
   項ないし第８項の何ｎかに記載の方法。 ０３）粒状ラベル剤が着色粒子である特許請求の範囲第
   １項ないし第３項の何れかに記載の方法。 （１４）検定区域がニトロセルロースにより形成され、
   バインダーが該検定区域に検定条ｒト下でトレーサーを
   担体上で肉眼判別可能に結合させうる量で支持されてい
   る特許請求の範囲第１項ないし第１３項の何れかに記載
   の方法。 （１５）被検定物質がサンプル１吋で１０　’？／ｍｌ
   を越えぬ濃度で存在する特許請求の範囲第１項ないし第
   １４項の何れかに記載の方法。 （■６）担体が検定区域′ｆｒ：複数有する特許請求の
   範囲第１頃ないし第１５頃の何れかに記載の方法。 （１７）　バインダーが少なくとも４０μ？　／ｃｎｚ
   ２の濃度で支持されている特許請求の範囲第１頃ないし
   第１６項の何れかに記載の方法。 （１８１バ、イングーが検定区域に直径３〜５　ｍｍの
   スフビット状で存在する％Ｈ′ｌ：請求の範囲第１頃な
   いし第１７項の何れかに記載の方法。 ０９）粒状ラベル剤がローダミンを含有するリポソーム
   である特許請求の範囲第１項ないし第１８項の何れかに
   記載の方法。 （２０）固体担体上の検定区域にバインダーを有する固
   体担体およびトレーサーよりなる試薬キットであって、 前記バインダーは被検定物質または被検定物質および前
   記トレーザーに対して結合性を有し、該トレーサーは肉
   眼で判別可能な粒状ラベル剤で標識されたりガント゛よ
   りなり、、該リガンドは該担体上のバインダーおよび検
   定の間に該担体上のバ、イングーに結合した被検定物質
   の何れか一方に結合性を有し、前記検定区域は前記ｌ・
   レーサーを検定条件下で肉眼判別可能に結合させうる量
   の前記バインダーを支持しうる表面を持つ材料よりなる
   、サンプル中の被検定物質を測定するだめの試薬キット
   。