CN107110868B - 采用ns3捕获肽的受试者抗hcv抗体检测测定 - Google Patents

Abstract

本发明提供了使用NS3捕获肽用于检测样品中的受试者抗HCV抗体的方法、试剂盒和组合物。在某些实施方案中，一起采用了至少两种NS3解旋酶（NS3h）捕获肽和至少两种缀合肽（例如NS3h缀合肽），其允许在一步式测定中的受试者抗体检测的宽动态范围。在其他实施方案中，提供了在不使用还原剂的情况下检测NS3特异性受试者抗体的方法。在一些实施方案中，NS3特异性受试者抗体用NS3缀合肽‘双击’进行检测（例如，在洗涤之前和之后均添加缀合肽至样品中）。

Description

采用NS3捕获肽的受试者抗HCV抗体检测测定

发明领域

本发明提供了使用NS3捕获肽用于检测样品中的受试者抗HCV抗体的方法、试剂盒和组合物。在某些实施方案中，至少两种NS3解旋酶（NS3h）捕获肽和至少两种缀合肽（例如NS3h缀合肽）一起采用，其允许在一步式测定中的受试者抗体检测的宽动态范围。在其他实施方案中，提供了在不使用还原剂的情况下检测NS3特异性受试者抗体的方法。在一些实施方案中，NS3特异性受试者抗体用NS3缀合肽‘双击（double shot）’进行检测（例如，在洗涤之前和之后均添加缀合肽至样品中）。

发明背景

根据WHO统计，全世界多达1.7亿人感染丙型肝炎病毒（HCV），这是肝脏病毒感染。75%至85%的感染HCV的人进展至慢性感染，这些病例中的约20%发展了慢性丙型肝炎并发症，包括在感染20年后的肝硬化或肝细胞癌。目前对HCV感染的推荐治疗是干扰素和利巴韦林药物的组合，然而，治疗并非在所有情况下都是有效的，并且在丙型肝炎相关终末期肝病中指明了肝移植。目前，不存在可用于预防HCV感染的疫苗，因此必须采取避免感染的所有预防措施。因此，灵敏的HCV检测测定对于公共安全是重要的。

发明概述

本发明提供了使用NS3捕获肽用于检测样品中的受试者抗HCV抗体的方法、试剂盒和组合物。在某些实施方案中，至少两种NS3解旋酶（NS3h）捕获肽和至少两种缀合肽（例如NS3h缀合肽）一起采用，其允许在一步式测定中的受试者抗体检测的宽动态范围。在其他实施方案中，提供了在不使用还原剂的情况下检测NS3特异性受试者抗体的方法。在一些实施方案中，NS3特异性受试者抗体用NS3缀合肽‘双击’进行检测（例如，在洗涤之前和之后均添加缀合肽至样品中）。

在一些实施方案中，本文提供的是检测受试者中的丙型肝炎病毒（HCV）感染的方法，其包括：a）使初始生物样品（例如血液、血浆、血清、精液等）与第一NS3h（NS3解旋酶）捕获肽和第二NS3h（NS3解旋酶）捕获肽以及第一可检测标记的缀合肽（例如，NS3h特异性缀合肽）和第二可检测标记的缀合肽（例如，NS3h特异性缀合肽）接触，以生成包含初始生物样品、第一NS3h捕获肽和第二NS3h捕获肽以及第一缀合肽和第二缀合肽的混合生物制品，其中第一NS3h捕获肽和第二NS3h捕获肽：i）各自包含编码至少一种HCV NS3解旋酶表位的氨基酸序列；和ii）具有不同的氨基酸序列（例如，具有至少一个氨基酸差异，例如长度或序列中的差异），其中所述初始生物样品被怀疑含有受试者抗体，并且其中所述受试者抗体在生物样品中不是纯化形式，b）在这样的条件下温育混合的生物样品，所述条件使得：第一NS3h捕获肽特异性结合受试者抗体中的至少一种，以形成第一捕获复合物，并且第一（或第二）缀合肽结合第一捕获复合物中的受试者抗体，以形成第一可检测复合物，并且第二NS3h捕获肽特异性结合受试者抗体中的至少一种，以形成第二捕获复合物，并且第二（或第一）缀合肽结合第二捕获复合物中的受试者抗体，以形成第二可检测复合物；c）洗涤混合的生物样品，以生成经洗涤的样品；并且d）检测第一可检测复合物和/或第二可检测复合物的存在，从而检测受试者中的过去或现在HCV感染的存在，其中与仅使用第一NS3h捕获肽或第二NS3h捕获肽相比，混合的生物样品中第一NS3h捕获肽和第二NS3h捕获肽两者的存在扩展了用于检测（例如，定性或定量）受试者抗体的动态范围。

在某些实施方案中，本发明提供了试剂盒或系统，其包含：a）第一NS3h捕获肽和第二NS3h捕获肽，其中所述第一NS3h捕获肽和第二NS3h捕获肽：i）各自包含编码至少一种HCVNS3解旋酶表位的氨基酸序列；ii）具有不同的氨基酸序列，iii）能够结合生物样品中的至少一种受试者抗体用于形成捕获复合物，和b）第一缀合肽和第二缀合肽，其中所述第一缀合肽和第二缀合肽能够结合捕获复合物中的受试者抗体。在某些实施方案中，试剂盒和系统进一步包含：c）含有受试者抗体的生物样品，其中所述受试者抗体在生物样品中不是纯化形式。

在进一步的实施方案中，本文提供的是包含下述的组合物：a）第一NS3h捕获肽和第二NS3h捕获肽，其中所述第一NS3h捕获肽和第二NS3h捕获肽：i）各自包含编码至少一种HCV NS3解旋酶表位的氨基酸序列；ii）具有不同的氨基酸序列，iii）能够结合生物样品中的至少一种受试者抗体用于形成捕获复合物，和b）第一缀合肽和第二缀合肽，其中所述第一缀合肽和第二缀合肽能够结合捕获复合物中的受试者抗体。在某些实施方案中，组合物进一步包含：c）含有受试者抗体的生物样品，其中所述受试者抗体在生物样品中不是纯化形式。在其他实施方案中，组合物不含洗涤剂或可检测地不含洗涤剂。

在特定实施方案中，本文提供的是检测受试者中的丙型肝炎病毒（HCV）感染的方法，其包括：a）使怀疑含有受试者抗体的样品与下述接触：i）第一NS3h捕获肽，其包含与HCVNS3解旋酶的结构域1和/或结构域2具有至少80%或90%序列同一性（例如，至少80% … 90%… 95% … 98% .. 99.5% …或100%序列同一性）的氨基酸序列，其中所述第一NS3h捕获肽长度不超过400或350或300个氨基酸（例如长度不超过400 … 375 … 325 … 300 … 275… 250 … 225 … 200 …或180个氨基酸）；ii）第二NS3h捕获肽，其包含与全长HCV NS3解旋酶具有至少85%或90%或95%（例如，至少85% … 90% … 94% … 97% … 99% … 99.5%… 99.9% …或100%）序列同一性的氨基酸序列，所述全长HCV NS3解旋酶包含HCV NS3解旋酶的结构域1、2和3，和b）在这样的条件下温育样品，所述条件使得第一NS3h捕获肽特异性结合受试者抗体中的至少一种，以形成第一复合物，并且所述第二NS3h捕获肽特异性结合受试者抗体中的至少一种，以形成第二复合物；和c）检测第一复合物和/或第二复合物的存在，从而检测受试者中的过去或现在HCV感染的存在。在特定实施方案中，与仅使用第二NS3h肽相比，第一NS3h捕获肽连同样品中第二NS3h捕获肽的存在扩展了用于定性检测受试者抗体的上限动态范围。

在某些实施方案中，本文提供的是包含下述的试剂盒和系统：a）第一NS3h捕获肽，其包含与HCV NS3解旋酶的结构域1和/或结构域2具有至少80%或90%序列同一性的氨基酸序列，其中所述第一NS3h肽长度不超过400或350或300或225个氨基酸；b）第二NS3h捕获肽，其包含与全长HCV NS3解旋酶具有至少85%或95%序列同一性的氨基酸序列，所述全长HCVNS3解旋酶包含HCV NS3解旋酶的结构域1、2和3。

在某些实施方案中，试剂盒和系统进一步包括第一容器，其中第一NS3h捕获肽和第二NS3h捕获肽在第一容器内。在其他实施方案中，第一容器不含洗涤剂或基本上不含洗涤剂。在其他实施方案中，试剂盒和系统进一步包含固体支持物（例如微粒）。在其他实施方案中，试剂盒和系统进一步包括第二容器，其中固体支持物在第二容器内。在进一步的实施方案中，试剂盒和系统进一步包含第一可检测标记的缀合肽（例如，其结合由第一NS3h捕获肽或第二NS3h捕获肽捕获的受试者抗体）。在某些实施方案中，第一可检测标记的缀合肽：i）包含与HCV NS3解旋酶的结构域1具有至少80%或90%序列同一性的氨基酸序列，ii）长度不超过250或200个氨基酸；和iii）包含可检测标记。在另外的实施方案中，试剂盒和系统进一步包含第二可检测标记的缀合肽（例如，其结合由第一NS3h捕获肽或第二NS3h捕获肽捕获的受试者抗体）。在某些实施方案中，第二可检测标记的缀合肽：i）包含与具有HCV NS3解旋酶的结构域1、2和3的全长HCV NS3解旋酶具有至少80%或90%序列同一性的氨基酸序列，和ii）包含可检测标记。在一些实施方案中，试剂盒和系统进一步包括第二（或第三）容器，其中第一NS3h缀合肽和第二NS3h缀合肽在第二（或第三）容器内。在特定实施方案中，第二容器不含洗涤剂或基本上不含洗涤剂。

在某些实施方案中，试剂盒和系统进一步包含第一抗HCV抗体。在一些实施方案中，第一抗HCV抗体是抗核心HCV抗体或抗NS3或NS4抗体。在其他实施方案中，第一抗HCV抗体包含固体-支持物结合部分。在进一步的实施方案中，试剂盒和系统进一步包含第二抗HCV抗体。在某些实施方案中，第二抗HCV抗体是抗核心HCV抗体。在一些实施方案中，试剂盒和系统进一步包含第二容器，其中第二抗HCV抗体在第二容器内。在某些实施方案中，试剂盒和系统进一步包含HCV核心捕获肽。在另外的实施方案中，HCV核心捕获肽包含固体-支持物结合部分。在其他实施方案中，试剂盒和系统进一步包含HCV可检测标记的缀合核心肽。

在某些实施方案中，本发明提供了组合物，其包含：a）第一NS3h捕获肽，其包含与HCV NS3解旋酶的结构域1和/或结构域2具有至少80%或90%（例如，80% … 90% … 95% …99% … 99.5%）序列同一性的氨基酸序列，其中所述第一NS3h肽长度不超过250或350个氨基酸（例如不超过250 … 300 …或350）；和b）第二NS3h捕获肽，其包含与全长HCV NS3解旋酶具有至少90%或95%序列同一性的氨基酸序列，所述全长HCV NS3解旋酶包含HCV NS3解旋酶的结构域1、2和3。在一些实施方案中，所述组合物进一步包含下述组分中的至少一种：c）固体支持物；d）第一可检测标记的缀合肽；e）第二可检测标记的缀合肽；f）第一抗HCV抗体；g）可检测标记的第二抗HCV抗体；h）HCV核心捕获肽；和i）可检测标记的HCV核心缀合肽。在特定实施方案中，组合物具有组分中的至少两种、三种、四种、五种、六种或所有七种。

在某些实施方案中，本文提供的是组合物，其包括包含SEQ ID NO:1-16中的任何一个的氨基酸序列或由SEQ ID NO:1-16中的任何一个的氨基酸序列组成的至少一种肽，或者与SEQ ID NO:1-16中的任何一个具有至少95%（例如，95% … 98% … 99% ..或99.5%）序列同一性的肽。

在一些实施方案中，本文提供的是检测受试者中的丙型肝炎病毒（HCV）感染的方法，其包括：a）使怀疑含有受试者抗体的样品与NS3捕获肽接触，其中所述NS3捕获肽包含编码至少一种HCV NS3表位的氨基酸序列，并且其中所述接触在这样的条件下进行，所述条件使得不将外源性还原剂（即，并非天然存在于样品中的还原剂）加入或存在于样品中，b）在这样的条件下温育样品，所述条件使得NS3捕获肽特异性结合受试者抗体中的至少一种，以形成第一复合物，其中所述温育在其中样品中不存在外源性还原剂的条件下进行；和c）检测第一复合物的存在，从而检测受试者中的过去或现在HCV感染的存在，其中在不存在外源性还原剂的条件下进行检测。

在某些实施方案中，本文提供的是包括下述的试剂盒、系统和组合物：包含生物样品、NS3捕获肽、可检测标记的缀合肽和多种受试者抗体的组合物，其中NS3捕获肽和缀合肽与至少一种受试者抗体结合，并且其中所述组合物不含外源性还原剂。

在一些实施方案中，本文提供的是检测受试者中的丙型肝炎病毒（HCV）感染的方法，其包括：a）使初始生物样品与第一NS3捕获肽和第一缀合肽接触，以生成包含初始生物样品、第一NS3捕获肽和第一缀合肽的混合生物制品，其中所述NS3捕获肽包含编码至少一种HCV NS3解旋酶表位的氨基酸序列；其中所述初始生物样品被怀疑含有受试者抗体，并且其中所述受试者抗体在所述生物样品中不是纯化形式，b）在这样的条件下温育所述混合的生物样品，使得所述NS3捕获肽特异性结合所述受试者抗体中的至少一种，以形成捕获复合物，并且所述缀合肽结合捕获复合物中的受试者抗体，以形成可检测复合物，和c）洗涤混合的生物样品，以生成经洗涤的样品；d）添加另外量的缀合肽或特异性结合捕获复合物中的受试者抗体的不同缀合肽；和e）检测可检测复合物的存在，从而检测受试者中的过去或现在HCV感染的存在。在进一步的实施方案中，缀合肽与NS3h（HCV的NS3h解旋酶）的至少一种表位结合。

在某些实施方案中，第二NS3h捕获肽的氨基酸序列比第一NS3h捕获肽长至少1.5或2倍（例如，至少1.5 … 3.0 … 4.0 … 5.0倍或更长）。在一些实施方案中，第一缀合表位和第二缀合表位对于NS3h表位是特异性的。在进一步的实施方案中，第一NS3h捕获肽与HCV NS3解旋酶结构域1具有至少80%或90%（例如，80% … 87% … 94% … 98% … 99% …或95.5%）序列同一性，并且长度不超过250个氨基酸。在进一步的实施方案中，第一NS3h捕获肽与HCV NS3解旋酶结构域2具有至少80或90%的序列同一性，并且长度不超过250个氨基酸（例如长度不超过250 … 225 … 200 …或180个氨基酸）。在另外的实施方案中，第二NS3h捕获肽与具有结构域1、2和3的全长NS3解旋酶具有至少90%或95%（例如，90% … 94%… 96% …或99%）序列同一性。在某些实施方案中，第二NS3h捕获肽包含具有结构域1、2和3的全长NS3解旋酶序列。在进一步的实施方案中，第二NS3h捕获肽的氨基酸序列与全长HCV解旋酶具有至少99%的序列同一性。在另外的实施方案中，第二NS3h捕获肽的氨基酸序列包含具有结构域1、2和3的全长NS3解旋酶序列。在进一步的实施方案中，第二NS3h捕获肽具有NS3解旋酶天然结构（即不是变性结构）。

在一些实施方案中，样品进一步被怀疑含有HCV颗粒或其片段，并且其中所述方法进一步包括使样品与第一抗HCV捕获抗体接触，使得形成第三复合物，其中所述第三复合物包含与HCV颗粒或其片段结合的第一抗HCV捕获抗体。在其他实施方案中，第一捕获抗HCV抗体是抗核心HCV抗体。在另外的实施方案中，第一抗HCV抗体包含固体-支持物结合部分。在另外的实施方案中，所述方法进一步包括使样品与结合第三复合物中的HCV颗粒或其片段的第二抗HCV抗体（例如缀合抗体）接触，其中所述第二抗HCV抗体是可检测标记的。在进一步的实施方案中，第二抗HCV抗体是抗核心HCV抗体。在一些实施方案中，所述方法进一步包括检测第三复合物。

在某些实施方案中，在通过缀合肽或缀合抗体检测之前，洗涤样品。在一些实施方案中，所述方法进一步包括使样品与第一HCV核心肽（例如核心捕获肽）接触，其中所述第一核心肽特异性结合受试者抗体中的至少一种，以形成第四复合物。在另外的实施方案中，第一HCV核心肽包含下述或由下述组成：SEQ ID NO:12中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:12具有95%或更高同一性的氨基酸序列。在进一步的实施方案中，第一HCV核心肽包含固体-支持物结合部分。

在另外的实施方案中，所提供的方法进一步包括使所述样品与第二HCV核心肽（例如缀合肽）接触，其中所述第二HCV核心肽是可检测标记的，并且其中所述第二HCV核心肽与作为第四复合物的部分的受试者抗体结合。在某些实施方案中，所述方法进一步包括检测第四复合物的存在。在另外的实施方案中，所述方法进一步包括使样品与固体支持物（例如，微珠等）接触。在进一步的实施方案中，固体支持物用抗生物素蛋白或其他结合分子包被。

在另外的实施方案中，所述方法进一步包括使样品与第一可检测标记的缀合肽接触，所述第一可检测标记的缀合肽与作为第一复合物的部分的受试者抗体结合，并且其中检测第一复合物的存在包括检测第一可检测标记的缀合肽。在进一步的实施方案中，第一可检测标记的缀合肽：i）包含与HCV NS3解旋酶的结构域1具有至少80% … 90% … or 99%序列同一性的氨基酸序列，ii）长度不超过300 … 200 …或180个氨基酸；和iii）包含可检测标记。

在某些实施方案中，所述方法进一步包括使所述样品与作为第二复合物的部分的所述受试者抗体结合的第二可检测标记的缀合肽接触，并且其中所述检测所述第二复合物的存在包括检测所述第二可检测标记的缀合肽。在其他实施方案中，第二可检测标记的缀合肽包含与全长HCV NS3解旋酶具有至少80% … 90% … 99%序列同一性的氨基酸序列。在另外的实施方案中，第一NS3h捕获肽长度不超过180个氨基酸。在进一步的实施方案中，第一NS3h捕获肽包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3中的氨基酸序列或者由SEQ ID NO:2或SEQID NO:3中的氨基酸序列组成，或者其中第一NS3肽与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3具有90%…或95%同一性。在另外的实施方案中，第一NS3h捕获肽包含下述或由下述组成：来自SEQID NO:2或SEQ ID NO:3的至少100个连续氨基酸（例如至少100 … 125 …或135个）。

在进一步的实施方案中，第二NS3h捕获肽与全长HCV NS3解旋酶具有至少90% …或95%的序列同一性。在某些实施方案中，第二NS3h捕获肽与全长HCV NS3解旋酶具有至少99%的序列同一性。在其他实施方案中，第二NS3h捕获肽包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7中的氨基酸序列或者由SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7中的氨基酸序列组成，或者其中第二NS3h捕获肽与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7具有90% …或95%的序列同一性。在另外的实施方案中，第二NS3h捕获肽包含下述或由下述组成：来自SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7的至少300… 350个连续氨基酸。

在进一步的实施方案中，第一缀合肽与HCV NS3解旋酶的结构域1具有至少90% …或95%的同一性。在其他实施方案中，第一缀合肽长度不超过180个氨基酸。在其他实施方案中，第一缀合肽包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3中的氨基酸序列或者由SEQ ID NO:2或SEQID NO:3中的氨基酸序列组成，或者其中第一缀合肽与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO: 3具有95%的同一性。在另外的实施方案中，第二缀合肽与全长HCV NS3解旋酶具有至少95%的序列同一性。在其他实施方案中，第二缀合肽与全长HCV NS3解旋酶具有至少99%的序列同一性。在某些实施方案中，第二缀合肽包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7中的氨基酸序列或者由SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7中的氨基酸序列组成，或者其中第二缀合肽与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO: 7具有95%的同一性。

在一些实施方案中，HCV NS3解旋酶的结构域1来自选自以下的HCV基因型：1a、1b、2a、2b、2c、2d、3a、3b、3c、3d、3e、3f、4a、4b、4c、4d、4e、4f、4g、4h、4i、4j、5a和6a。在进一步的实施方案中，全长HCV NS3解旋酶来自选自以下的HCV基因型：1a、1b、2a、2b、2c、2d、3a、3b、3c、3d、3e、3f、4a、4b、4c、4d、4e、4f、4g、4h、4i、4j、5a和6a。在其他实施方案中，受试者是人。在另外的实施方案中，固体-支持物结合部分包含生物素。在进一步的实施方案中，方法进一步包括向样品添加触发溶液，其中所述触发溶液触发来自可检测标记的信号。

附图描述

图1A和1B显示了称为NS3-D1的示例性肽的氨基酸序列，其包括根据标准编号的HCV的氨基酸1192-1356，其包括解旋酶结构域1（1207-1356）的全部和NS3蛋白酶（119201207）的一小部分。图1A具体显示了具有N-末端组氨酸标签（例如，用于蛋白质纯化）的NS3-D1捕获肽的氨基酸序列（SEQ ID NO:2），而图1B显示了NS3-D1的生物素化形式（例如，使得该肽可以与抗生物素蛋白包被的微珠结合）（SEQ ID NO:3）。图1C-e显示了称为“NS3-D1，DelN15”的示例性序列，其是氨基酸1205-1356。图1C具体显示了在C末端处具有生物素序列的示例性肽NS3-D1，delN15-Cbt（v2e）的氨基酸序列，SEQ ID NO:1。图1d具体显示了在C末端处具有“XC9”序列的示例性肽NS3-D1，delN15-XC9，SEQ ID NO:13的氨基酸序列，其被设计为结合吖啶化BSA用于标记目的。图1e提供了具有N末端组氨酸标签的NS3-D1，delN15的氨基酸序列（SEQ ID NO:14）。

图2显示了包括具有所有三个结构域的全长HCV NS3解旋酶的示例性NS3h肽NS3-（DeltaN15）（氨基酸1205-1658）的核酸序列和氨基酸序列。图2A具体显示了NS3h（deltaN15）的核酸序列（SEQ ID NO:4）。图2B显示了NS3h（deltaN15）的氨基酸序列（SEQ IDNO:5）。图2C显示了编码c末端生物素标签的NS3h（deltaN15）-Cbt（v2e）的核酸序列（SEQ IDNO:6）。图2D显示了NS3h（deltaN15）-Cbt（v2e）的氨基酸序列（SEQ ID NO:7），其包括c末端生物素标签。图2E显示了编码c末端XC9序列的NS3h（deltaN15）-XC9的核酸序列（SEQ IDNO:8）。图2F显示了NS3h（deltaN15）-XC9的氨基酸序列（SEQ ID NO:9），其编码设计为结合吖啶化BSA用于标记目的的XC9序列。

图3A显示了融合肽9NB45H的核酸序列（SEQ ID NO:10），并且图3B显示了融合肽9NB45H的氨基酸序列（SEQ ID NO:11），其是氨基酸1192-1457 （NS3区）、1-150（核心区）和GSGSHHHHHH（组氨酸标签）的融合物。该序列可用作例如校准物或对照序列。

图4显示了示例性核心肽的氨基酸序列（SEQ ID NO:12），其为氨基酸15-68，其中在位置34和48处具有缺失。

图5显示了图1-4中描述的序列与HCV的NS3区中的分离株P26664的序列比对。该比对显示了蛋白酶的一部分，以及HS3解旋酶的结构域1、2和3的位置。图6显示了33c（9NB49）（氨基酸1192-1457）的核酸序列（SEQ ID NO:15）和氨基酸序列（SEQ ID NO:16）。

定义：

如本文使用的，术语“样品”以其最广泛的含义使用。如本文使用的，“生物样品”包括但不限于任何数量的来自生物或以前生物的物质。这样的生物包括但不限于人、小鼠、大鼠、猴、犬、兔和其他动物。这种物质包括但不限于血液（例如全血或其组分）、血浆、血清、尿液、唾液、羊水、滑液、内皮细胞、白细胞、单核细胞、其他细胞、器官、组织、骨髓、淋巴结和脾。

术语“抗体”（Ab）和“抗体”（Abs）指单克隆抗体（mAb（单数）或mAbs（复数））、多克隆抗体（pAbs（复数））、多特异性抗体、人抗体、人源化抗体（完全或部分人源化的；包含人抗体经修饰的可变区的多肽，其中所述可变区的一部分已经被来自非人序列的相应序列取代，并且其中所述经修饰的可变区连接至所述人抗体的恒定区的至少一部分），动物抗体（例如但不限于鸟（例如鸭或鹅）、鲨鱼、鲸鱼和哺乳动物，包括非灵长类动物（例如牛、猪、骆驼、美洲驼、马、山羊、兔、绵羊、仓鼠、豚鼠、猫、犬、大鼠、小鼠等）或非人灵长类动物（例如猴、黑猩猩等）、重组抗体、嵌合抗体（cAb；包含与来自另一个宿主物种的抗体恒定区的至少一部分连接的来自一个宿主物种的抗体重链和轻链可变区的全部或部分）、单链抗体、单结构域抗体、Fab片段、F（ab'）片段、Fab' -SH片段、F（ab'）2片段、Fd片段、Fv片段、单链Fv片段（“scFv”）、二硫键连接的Fv片段（“sdFv”）、dAb片段、双抗体、经分离的互补决定区（CDR）和抗独特型（“抗Id”）抗体、双功能或双结构域抗体（例如，双重可变结构域抗体或DVD-IgG）和上述任一种的功能活性的表位结合片段（或抗原反应性片段）。特别地，抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性（或抗原反应性）片段，即含有如本文（n）中进一步描述的分析物结合位点的分子，以及如本文进一步描述的变体。免疫球蛋白分子可以是任何类型（例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY）、类别（例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2）或亚类。其亲和力（即，KD、kd或ka）经由筛选已使用生物展示制备的组合抗体文库已得到增加或改善的抗体被称为“亲和力成熟抗体”。为了简单起见，针对分析物的抗体在本文中通常被称为“抗分析物抗体”或简称为“分析物抗体”（例如抗HCV抗体或HCV抗体）。

在本说明书中，测定“组分（component）”、“组分（components）”和“至少一种组分”指例如捕获抗体、捕获肽（例如第一NS3h捕获抗体和第二NS3h捕获抗体）、检测或缀合抗体、对照、校准物、一系列校准物、灵敏度实验对象组（sensitivity panel）、容器、缓冲液、稀释剂、盐、酶、酶的辅因子、检测试剂、预处理试剂/溶液、底物（例如，作为溶液）、终止溶液等等，其可以包括在试剂盒中，用于根据本文所述的方法以及本领域已知的其他方法测定测试样品（例如患者尿液、血清或血浆样品）。因此，在本发明的上下文中，“至少一种组分”、“组分（component）”和“组分（components）”可以包括如本文所述的多肽，其任选固定在固体支持物上。一些组分可以在溶液中或冻干用于重构用于测定中。

在进行本发明的测定中，使用对照可能是有用的。“对照”指已知不含抗HCV抗体（“阴性对照”）或含有抗HCV抗体（“阳性对照”）的组合物。阳性对照可以包含已知浓度的抗HCV抗体。“对照”、“阳性对照”和“校准物”在本文中可以互换使用，以指包含已知浓度的抗HCV抗体的组合物。“阳性对照”可以用于建立测定性能特征，并且是试剂（例如分析物）的完整性的有用指示剂。

“表位（epitope）”、“表位（epitopes）”和“目标表位”指被识别并且可以结合特异性结合配偶体（例如抗体或其抗原反应性片段）上的互补位点的任何分子（例如本文所述的NS3抗原）上的位点。表位由已知与特异性结合配偶体上的互补位点结合的抗原（或其片段）区域的精确氨基酸残基组成。抗原片段可以含有超过一种表位。

在本文所述的测定、试剂盒和组合物中，测定的一种或其他组分可以包含可检测标记。术语“标记”和“可检测标记”意指附着到特异性结合配偶体（例如抗体或分析物）的部分，以致使特异性结合对成员（例如抗体和分析物）之间的反应可检测，并且如此标记的特异性结合配偶体，例如抗体或分析物被称为“可检测标记的”。标记可以产生可通过视觉或仪器手段检测的信号。各种标记包括信号产生物质，如色原体、荧光化合物、化学发光化合物、放射性化合物等等。标记的代表性实例包括产生光的部分，例如吖啶鎓化合物，以及产生荧光的部分，例如荧光素。其他标记在本文中描述。在这方面，部分本身可能并非可检测标记的，但在与另外一部分反应后可以变得可检测。“可检测标记”的使用预期涵盖后一类型的可检测标记。

“连接序列”指连接到一个或多个目标多肽序列（例如，全长、片段等）的天然或人工多肽序列。术语“连接的”指连接序列与目标多肽序列的连接。这样的多肽序列优选通过一个或多个肽键连接。连接序列可以具有约4至约50个氨基酸的长度。优选地，连接序列的长度为约6至约30个氨基酸。可以通过氨基酸取代、添加或缺失修饰天然连接序列，以产生人工连接序列。示例性连接序列包括但不限于：（i）组氨酸残基（His标签），例如含有6个组氨酸残基的6xHis标签，可用作连接序列，以促进目标多肽和抗体的分离和纯化。（ii）肠激酶切割位点，如His标签，用于分离和纯化目标蛋白质和抗体。通常，肠激酶切割位点与His标签一起用于分离和纯化目标蛋白质和抗体。各种肠激酶切割位点是本领域已知的。（iii）混杂的序列可以用于连接或联接单链可变区片段的轻链和/或重链可变区。其他连接序列的实例可以在Bird等人，Science 242: 423-426 (1988)；Huston等人，PNAS USA 85:5879-5883 (1988)；和McCafferty等人，Nature 348: 552-554 (1990)中找到。还可以修饰连接序列用于另外的功能，例如附着药物或附着至固体支持物。在本发明的上下文中，例如，mAb可以含有连接序列，例如His标签、肠激酶切割位点或两者。

“患者”和“受试者”在本文中可以互换使用，以指动物，例如鸟（例如鸭或鹅）、鲨鱼、鲸鱼和哺乳动物，包括非灵长类动物（例如牛、猪、骆驼、美洲驼、马、山羊、兔、绵羊、仓鼠、豚鼠、猫、犬、大鼠和小鼠）和灵长类动物（例如猴、黑猩猩和人）。优选地，患者或受试者是人，例如处于HCV感染危险中的人或感染有HCV的人。

在本文描述的免疫测定结果的分析中，包括某些水平的检测作为截止水平可能是有用的。“预定截止值”和“预定水平”一般指通过将测定结果针对预定截止值/水平比较来评价诊断/预后/治疗功效结果的测定截止值，其中所述预定截止值/水平已与各种临床参数（例如，疾病的严重性、进展/非进展/改善等）相联系或关联。虽然本发明可以提供示例性的预定水平，但众所周知的是，截止值可以根据免疫测定的性质（例如所采用的抗体等）而变。基于本发明，本文的公开内容适用于其他免疫测定以获得用于其他免疫测定的免疫测定特异性截止值进一步完全在本领域技术人员的普通技术内。尽管预定截止值/水平的精确值可以在测定之间变化，但如本文所描述的相关性一般应该是适用的。

如下所述，在一些实施方案中可能期望提供测试样品的预处理。如本文所述的诊断测定中使用的，“预处理试剂”，例如裂解、沉淀和/或增溶试剂，是裂解任何细胞和/或溶解测试样品中存在的任何分析物的试剂。预处理并非对于所有样品必需的，如本文进一步描述的。除其他之外，溶解分析物（即抗HCV抗体）需要从样品中存在的任何内源性结合蛋白中释放分析物。预处理试剂可以是均相的（不需要分离步骤）或异相（需要分离步骤）。使用异相预处理试剂，在进行到测定的下一个步骤之前，从测试样品中去除任何沉淀的分析物结合蛋白。预处理试剂任选可以包括：（a）一种或多种溶剂和盐，（b）一种或多种溶剂、盐和洗涤剂，（c）洗涤剂，（d）洗涤剂和盐，或（e）适合于细胞裂解和/或溶解分析物的任何试剂或试剂组合。

测定也可以经受严格的质量控制。在本文描述的免疫测定和试剂盒的上下文中的“质量控制试剂”包括但不限于校准物、对照和灵敏度实验对象组。通常使用“校准物”或“标准”（例如一个或更多个，例如多个），以便建立校准（标准）曲线，用于内插分析物（例如抗体或分析物）的浓度。可选地，可以使用接近预定的正/负截止的单个校准物。多个校准物（即，超过一个校准物或不同量的校准物）可以结合使用，以便包括“灵敏度实验对象组”。

术语“样品”、“测试样品”和“患者样品”可以在本文中互换使用。例如尿液、血清、血浆、羊水、脑脊髓液、胎盘细胞或组织、内皮细胞、白细胞或单核细胞的样品可以如从患者获得的直接使用或可以例如通过过滤、蒸馏、提取、浓缩、离心、干扰组分的失活、试剂添加等等进行预处理，以如本文讨论的或如本领域已知的其他方式修饰样品的特征。优选地，样品是尿液、血清或血浆。

在一些测定中，可能期望提供测定的校准。“校准组合物系列”指包含已知浓度的抗HCV抗体的多种组合物，其中组合物各自通过抗HCV抗体的浓度不同于系列中的其他组合物。

在本说明书自始至终，注意到NS3h抗原和/或其他试剂可以结合固体支持物或固相，这两个术语可互换使用。术语“固相”指任何不溶性或可以通过后续反应使其不溶的材料。可以选择固相的固有能力来吸引和固定捕获试剂。可选地，固相可以附着有具有吸引和固定捕获试剂的能力的连接试剂。连接试剂可以例如包括相对于捕获试剂本身相对荷电的荷电物质或与捕获试剂缀合的荷电物质。一般而言，连接试剂可以是固定在（附着至）固相上并且具有通过结合反应固定捕获试剂的能力的任何结合配偶体（优选特异性的）。连接试剂允许在测定执行之前或在测定执行期间（例如，在飞型测定上捕获），捕获试剂与固相材料的间接结合。固相可以是例如塑料、衍生化塑料、磁性或非磁性金属、玻璃或硅，包括例如试管、微量滴定孔、片、珠、微粒、芯片和本领域普通技术人员已知的其他配置。

在本文所述的测定、试剂盒和组合物的某些描述中，将NS3、NS4或核心抗原或HCV抗体称为特异性结合配偶体可以是有用的。“特异性结合配偶体”是特异性结合对的成员。特异性结合对包含两种不同的分子，其通过化学或物理手段彼此特异性结合。因此，除常见免疫测定的抗原和抗体特异性结合对之外，其他特异性结合对可以包括生物素和抗生物素蛋白（或链霉抗生物素蛋白）、碳水化合物和凝集素、互补核苷酸序列、效应子和受体分子、辅因子和酶、酶抑制剂和酶等等。此外，特异性结合对可以包括其为原始特异性结合成员的类似物的成员，例如分析物-类似物。免疫反应性特异性结合成员包括抗原、抗原片段和抗体，包括单克隆和多克隆抗体以及其复合物、片段和变体（包括变体的片段），无论是分离的还是重组产生的。特异性结合对成员（例如，抗原（或其片段）和抗体（或其抗原反应性片段））之间的相互作用的上下文中的术语“特异性的”和“特异性”）指相互作用的选择性反应性。短语“特异性结合”和类似短语指抗体（或其抗原反应性片段）特异性结合给定抗原（或其片段）并且不特异性结合其他实体的能力。

发明详述

本发明提供了使用NS3捕获肽用于检测样品中的受试者抗HCV抗体的方法、试剂盒和组合物。在某些实施方案中，至少两种NS3解旋酶（NS3h）捕获肽和至少两种缀合肽（例如NS3h缀合肽）一起采用，其允许在一步式测定中的受试者抗体检测的宽动态范围。在其他实施方案中，提供了在不使用还原剂的情况下检测NS3特异性受试者抗体的方法。在一些实施方案中，NS3特异性受试者抗体用NS3缀合肽‘双击’进行检测（例如，在洗涤之前和之后均添加缀合肽至样品中）。

在某些实施方案中，第一NS3h捕获肽基本上仅由肝炎病毒（例如，HCV）NS3解旋酶蛋白的结构域1（例如，氨基酸1192-1356或1205-1356）组成，而第二NS3h捕获肽基本上由NS3解旋酶蛋白的所有三个结构域（例如氨基酸1207-1654）组成。然后可以在1步免疫测定形式中以适合的水平将这两种类型的蛋白质加入样品中（在任何洗涤之前在捕获肽和缀合肽两者加入样品中时或大约同时），使得含有高滴度HCV抗NS3抗体的样品通过结构域1 NS3捕获蛋白检测到，并且低滴度Ab通过全长NS3解旋酶肽检测到。在一些实施方案中，第一NS3h捕获肽和第二NS3h捕获肽在c末端处含有生物素（例如，结合抗生物素蛋白包被的珠），并且第二组相似或相同的蛋白质用作缀合蛋白以检测捕获的抗体。这样的缀合肽可以与吖啶化BSA缀合。在某些实施方案中，这四种肽（两种捕获和两种缀合物）在一步式免疫测定中，使用用于检测针对HCV NS3蛋白的抗体。

如下文的实施例1所示，当两种NS3h捕获蛋白一同使用时，两类NS3h捕获肽的使用允许扩展用于抗体检测的1步免疫测定的动态范围。例如，NS3h结构域1蛋白质检测含有较高浓度抗体的样品，并且全长解旋酶蛋白质检测含有较低浓度抗体的样品。

一般而言，1步免疫测定趋于具有比2步测定更好的灵敏度和精确度，但1步形式的缺点是“钩状效应”。患者样品中含有高浓度分析物的样品克服了导致测定应答降低的捕获和检测分子的输入，给出不准确的低结果。在定性测定中，降低的结果可以低于截止值，导致假阴性结果。在某些实施方案中，本发明解决了用于检测抗体的1步测定中的“钩状效应”问题。本发明例如通过添加低分子量的第二蛋白质来扩展抗体检测的上限动态范围来改善了已知的情况。在特定实施方案中，这也简化了测定配置，改善了HCV Ag/Ab组合形式中的稳定性。

在某些实施方案中，本说明书的方法、试剂盒和组合物至少采用第一NS3h捕获抗体和/或第二NS3h捕获抗体。在一些实施方案中，NS3h捕获肽具有包含图1-2和5所示的氨基酸序列或由图1-2和5所示的氨基酸序列组成。也可以采用这些肽的变体，其包括这种氨基酸序列的更长、更短或突变的形式（例如，与这些图中的序列具有75% … 85% … 95% …或99%序列同一性的序列或其变体）。在某些实施方案中，第一NS3h捕获肽主要仅由HCV NS3h结构域1或结构域2或结构域1和2两者组成。注意到HCV NS3解旋酶的普遍公认的边界如下：NS3解旋酶结构域1 - 大约1207-1356（181-330）；NS3解旋酶域2 - 大约1357-1507（331-481）；和NS3解旋酶域3 - 大约1508-1654（482-626）。在某些实施方案中，另外的NS3肽或其变体在名称为“HCV Antigen-Antibody Combination Assay and Methods andCompositions for use therein”的美国公开20140272933，以及名称为“HCV NS3Recombinant Antigens and Mutants Thereof for Improved Antibody Detection”的美国公开20140272932中提供，所述两个美国公开特别通过引用全文并入本文，包括其中公开的NS3肽序列。

在某些实施方案中，本文所述的测定进一步检测针对核心抗原的抗体的存在。可以使用的一些示例性核心抗原包括衍生自核心蛋白质的DNA结合结构域（氨基酸1-125）的抗原。另外其他优选的核心抗原衍生自位于核心蛋白质的氨基酸残基134-171（MGYIPLVGAPLGGAARALAHGVRVLEDGVNYATGNLPG；SEQ ID NO:17）处的核心的脂质结合结构域或衍生自位置15-68，无或没有缺失或其他变化（参见SEQ ID NO:12，其在34和48处具有缺失）。因此，可以将核心抗原包被在固相支持物上和/或在溶液相中使用，以捕获存在于人血清或血浆中的针对HCV核心区的抗体。优选地，这种核心抗原可以逃避用于检测HCV组合免疫测定中存在于测试样品中的核心抗原的缀合抗体的检测。因此，可以执行组合免疫测定，其在检测抗核心抗体的同时检测测试样品中存在的核心抗原，所述抗核心抗体也将预期在测试样品中并且在相同的HCV组合测定形式中鉴定。

如本文自始至终注意到的，本发明的方法一般是免疫测定方法。在示例性实施方案中，这些方法包括用于分离目标分子（例如存在于测试样品中的特异性抗体或可能存在于测试样品中的特异性抗原）的方法。为了促进这种分离，例如，目标分子包含与标签结合配偶体接触的纯化标签或被吸引到与标签结合配偶体接触的纯化标签。纯化标签和标签结合配偶体的结合因此可以用于从分子混合物中分离目标分子。纯化标签可以包含具有相同或相似结构的部分。在某些实施方案中，亲和标签的加标签部分可以直接通过单键或经由线性、支化或环状排列的稳定化学键的连接与功能标签结合，任选地包括单键、双键、三键、芳族碳-碳键、以及碳-氮键、氮-氮键、碳-氧键、碳-硫键、磷-氧键、磷-氮键及其任何组合。在某些实施方案中，加标签部分和功能标签之间的结合包含醚、硫醚、甲酰胺、磺酰胺、脲或氨基甲酸酯部分。在某些实施方案中，连接包含聚亚烷基链，即碳-碳键的线性或支化排列。在其他实施方案中，连接包含聚亚烷基氧化物链，包括聚乙二醇部分。亲和标签的实例包括但不限于生物素、地高辛（Dig）、二硝基苯酚（DNP）、锌指、氟化聚合物和多肽序列如多组氨酸基序。

在一些实施方案中，亲和标签有利地用于通过依赖于亲和标签以及吸引或结合亲和标签的官能团的结合或吸引来分离目标分子。在一些实施方案中，固体底物具有对于标签的亲和力是因为固体底物用标签结合配偶体衍生化。在一些实施方案中，结合配偶体可以被固定在亲和底物上。术语“亲和底物”可以指与结合配偶体结合的固定基质或支持物，所述结合配偶体能够与分子的纯化标签形成强且优选的可逆相互作用。亲和底物可以包括树脂、珠、颗粒、膜、凝胶。结合配偶体特异性识别或结合纯化标签。特异性结合配偶体将取决于亲和标签，但包括荷电部分和结合对的一个成员，例如受体-配体、抗体-抗原、碳水化合物-凝集素和生物素-链霉抗生物素蛋白（或抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白或抗生物素抗体）。

在特定实施方案中，免疫测定中使用的任何或所有抗原的C末端或N末端可以是生物素化的，或者可以包含生物素结合部分（例如，抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白或中性抗生物素蛋白或抗生物素）作为亲和标签。这些肽是生物素化的或抗生物素蛋白/链霉抗生物素蛋白缀合的肽，并且将充当捕获抗原。同样地，抗原也可以可选地用检测标记进行标记，在这种情况下，它们将充当检测抗原。检测和捕获抗原可以具有相同的潜在氨基酸序列，或可选地，可以具有不同的序列。在示例性实施方案中，捕获抗原在C或N末端处是生物素化的，以促进其与具有生物素结合配偶体（即抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白）的固体支持物的结合。为了示例性的生产目的，生物素化肽经由IPTG诱导系统在25℃下在大肠杆菌（E. coli）BL2L（DE3）细胞中重组表达。通过用表达所需肽的HCV表达质粒和含有来自大肠杆菌的BirA基因的第二质粒共转化BL21（DE3）细胞，来实现在C末端或N末端处的原位生物素化（Weiss等人(1994) Protein Expression & Purif, 14:751-755；Schatz等人(1993) Biotechnology, 11:1138-1143）。使用二价阳离子螯合剂执行重组蛋白质的纯化，所述二价阳离子螯合剂显示预防蛋白质的金属催化氧化和聚集。当将EDTA或相关的二价阳离子螯合剂加入在纯化期间使用的缓冲液中以及免疫测定中使用的一种或多种最终贮存缓冲液中时，蛋白质稳定性显著改善。

在某些实施方案中，除了确定样品中受试者抗体的存在之外，所述测定还确定样品中一种或多种HCV抗原的存在。在这样的实施方案中，期望使用单克隆抗HCV抗体捕获来自测试样品的抗原，然后使用进一步的缀合抗体来检测已被捕获的抗原的存在。存在可以在这个尝试中使用的众多商业上可获得的抗体。具体地，这种抗体优选确定测试样品中核心抗原的存在。针对核心抗原的抗体是本领域技术人员已知的，包括例如美国专利公开号20120009196和20140272931中描述的那些，所述美国专利公开通过引用全文并入本文。

在具体的示例性实施方案中，组合免疫测定中使用的抗体是设计为检测测试样品中的HCV核心蛋白或其片段的抗体。这样的抗体可以检测DNA结合结构域、脂质结合结构域或完整的核心蛋白。在一些实施方案中，用于免疫测定中的检测抗体针对核心肽的脂质结合结构域。在另外其他实施方案中，组合测定中使用的抗HCV核心抗体可以是例如C11-3、C11-7、C11-9和C11-14（如美国专利6,727,092；Morota等人，J. Virol. Meth., 2009,157:8-14中所述）。

在本发明的具体测定中，免疫测定至少检测测试样品中的NS3h特异性受试者抗体、核心抗原、以及检测核心抗体。在这样的实施方案中，尽管不是必须，期望确保被设计为捕获抗核心的捕获抗原优选地包含在特定单克隆抗体的已知表位结合区域中的某些缺失或取代，使得用于HCV核心抗原检测的单克隆抗体将不能检测到这些经修饰的核心抗原，但仍将近侧来自测试样品的完整的核心抗原。用作捕获抗体的示例性抗核抗体包括如美国专利6,727,092以及Morota等人，J. Virol. Meth., 2009, 157:8-14中描述的抗体AOT3、C11-3、C11-7、C11-9和C11-14。

在特定实施方案中，本文所述的抗原和抗体被考虑用作用于组合免疫测定中的免疫诊断试剂，所述组合免疫测定被设计用于检测怀疑已感染有HCV的测试样品中发现的多种HCV组分。免疫诊断试剂（无论它们是抗体还是抗原）将由本文所述的抗原多肽和抗体（通常为组合）组成，使得它们可以用于设计用于检测HCV抗原的组合免疫测定中，所述HCV抗原包括但不限于HCV 的NS3区域、HCV的核心抗原、HCV的NS4区域或其组合、以及针对这些区域中的一个或多个的抗HCV抗体。为了捕获的目的，免疫诊断试剂包含的抗原和/或抗体可以包被在固体支持物上，例如微粒（例如磁性颗粒）、珠、试管、微量滴定板、比色杯、薄膜、支架分子、薄膜、滤纸、盘或芯片。在这方面，当免疫诊断试剂包含抗原组合（例如，针对不同HCV蛋白或相同HCV蛋白的不同片段）时，抗原可以共包被在相同的固体支持物上，或者可以在分开的固体支持物上。同样地，当免疫诊断试剂包含将用于捕获来自测试样品的一种或多种抗原的一种或多种抗体时，这种抗体可以共包被在相同的固体支持物上，或者可以在分开的固体支持物上。

值得注意的是，免疫诊断试剂可以用可检测标记进行标记或用允许捕获或检测的特异性配偶体进行标记。例如，标记可以是可检测标记，例如荧光团、放射性部分、酶、生物素/抗生物素标记、发色团、化学发光标记等等。这样的标记将在下文进一步详细描述。

再进一步地，本发明考虑了包含本文所述的免疫诊断试剂的HCV诊断试剂盒的制备，并且可以进一步包括在用于确定测试样品中HCV的存在的免疫测定中使用免疫诊断试剂的说明书。例如，试剂盒可以包含通过免疫测定用于测定抗HCV抗体（例如，测试样品中的抗NS3h抗体）的测试样品的说明书。虽然某些实施方案采用化学发光微粒免疫测定用于测定测试样品，但应当理解，本发明的免疫测定中使用的抗原和抗体可以以本领域技术人员已知的用于确定检测样品中的HCV存在的任何其他免疫测定形式使用。说明书可以是纸质形式或计算机可读形式，例如磁盘、CD、DVD等等。可选地或另外地，试剂盒可以包含校准物或对照，例如纯化的和任选冻干的抗HCV抗体或抗原，和/或用于进行测定的至少一个容器（例如，可以已经包被有组合免疫测定的一种或多种捕获组分（抗原和/或抗体）的管、微量滴定板或条）和/或缓冲液，例如测定缓冲液或洗涤缓冲液，其中任一种可以作为浓缩溶液、用于可检测标记（例如酶标记）的底物溶液或终止溶液提供。优选地，试剂盒包含执行测定所必需的所有组分，即试剂、标准品、缓冲液、稀释剂等。在特定实施方案中，优选将所有组分个别存在于试剂盒中，使得免疫测定可以作为运行中捕获（capture-on-the-fly）型免疫测定进行，其中固体支持物用允许捕获部分（例如，生物素化抗原或生物素化抗体）结合的试剂包被，并且试剂盒进一步包含在一个容器中个别捕获和检测抗原对中的每一个和生物素化捕获抗体，并且第二容器提供检测抗体缀合物。用于进行测定的说明书还可以包括用于生成标准曲线或用于定量抗HCV抗体目的的参考标准的说明书。

在本文的试剂盒或系统中提供的任何抗体，例如抗IgG抗体和抗IgM抗体，也可以掺入可检测标记，例如荧光团、放射性部分、酶、生物素/抗生物素蛋白标签、发色团、化学发光标签等，或者试剂盒可以包括用于标记抗体的试剂或用于检测抗体的试剂（例如检测抗体）和/或用于标记用于检测分析物的分析物或试剂。抗体、校准物和/或对照可以在分开的容器中提供，或者预先分配到适当的测定形式中例如微量滴定板内。在一个实施方案中，提供了两个容器。在第一容器中提供的是至少第一、第二和/或第三对抗原，其中每对中的第一抗原是被生物素化的来自给定的HCV蛋白（例如，NS3h）的捕获抗原，并且每对中的第二抗原是来自与第一抗原相同蛋白质的检测抗原，但是用可检测标记进行标记（例如，其被吖啶化），以及设计用于检测来自测试样品的一种或多种HCV抗原的一种或多种生物素化抗体；并且在第二容器中提供的是形成用于检测来自第一容器的由生物素化抗体捕获的抗原的缀合配偶体的抗体。考虑当第一容器中存在多种生物素化抗体时，形成缀合配偶体的多种抗体可以存在于单一容器中或用于每种不同抗原检测缀合抗体的个别容器中。

在某些实施方案中，试剂盒包括质量控制组分（例如，灵敏度实验对象组、校准物和阳性对照）。质量控制试剂的制备在本领域中是众所周知的，并且在各种免疫诊断产品的插页上描述。灵敏度实验对象组成员任选地用于建立测定性能特征，并且进一步任选是免疫测定试剂盒试剂的完整性的有用指示剂以及测定的标准化。

试剂盒还可以包括进行诊断测定或促进质量控制评估所需的其他试剂，例如缓冲液、盐、酶、酶辅因子、底物、检测试剂等等。试剂盒中还可以包括其他组分，如用于分离和/或处理测试样品的缓冲液和溶液（如预处理试剂）。该试剂盒可以另外包括一个或多个其他对照。试剂盒的一种或多种组分可以被冻干，在这种情况下，试剂盒可以进一步包含适于重构冻干组分的试剂。

试剂盒的各种组分可以根据需要在合适的容器中，例如微量滴定板提供。试剂盒可以进一步包括用于容纳或贮存样品的容器（例如，用于样品的容器或药液筒）。适当时，试剂盒任选还可以含有反应容器、混合容器和促进试剂或测试样品的制备的其他组分。试剂盒还可以包括用于辅助获得测试样品的一种或多种仪器，例如注射器、移液管、镊子、量匙等等。

在某些实施方案中，可检测标记是至少一种吖啶鎓化合物。在这样的实施方案中，试剂盒可以包含至少一种吖啶鎓-9-甲酰胺、至少一种吖啶鎓-9-羧酸芳基酯或其任何组合。如果可检测标记是至少一种吖啶鎓化合物，试剂盒还可以包含过氧化氢源，例如缓冲液、溶液和/或至少一种碱性溶液。应当理解在免疫诊断试剂中，用于抗体检测的抗原可以被可检测地标记，并且试剂盒中提供的用于与这些试剂一起使用的任何抗体也可以被可检测地标记。

在某些实施方案中，试剂盒可以含有固体支持相，例如磁性颗粒、珠、试管、微量滴定板、比色杯、膜、支架分子、薄膜、滤纸、盘或芯片。

本发明提供了用于测定测试样品中抗HCV抗体或抗HCV抗体和HCV抗原的存在、量或浓度的免疫测定方法。本领域已知的任何合适的测定都可以用于这种方法，只要这种测定使用一种或多种抗原来检测HCV抗体。这样的测定的实例包括但不限于免疫测定，例如夹心免疫测定（例如，单克隆多克隆夹心免疫测定，包括放射性同位素检测（放射免疫测定（RIA））和酶检测（酶免疫测定（EIA）或酶联免疫吸附测定（ELISA）（例如，Quantikine ELISA测定，R＆D Systems，Minneapolis，Minn.））、竞争性抑制免疫测定（例如正向和反向）、荧光偏振免疫测定（FPIA）、酶增殖免疫测定技术（EMIT）、生物发光共振能量转移（BRET）和均相化学发光测定等。

在特定实施方案中，重组抗原（例如，NS3h抗原）可以用作捕获试剂（例如，通过使用其中抗原的氨基或羧基末端包含生物素标签的这种抗原），或用作其中抗原直接或间接用吖啶鎓标记的检测（缀合）试剂。间接标记可以采用经由SMCC型接头与蛋白质内的未配对半胱氨酸残基的游离巯基共价偶联的吖啶化BSA。为了促进这种间接标记，在本发明的免疫测定中使用的某些抗原可以容易地进一步修饰，以在C末端处包括另外的半胱氨酸残基。

通常，以1步或2步形式执行免疫测定。用于捕获在1步测定的溶液中形成的免疫复合物的固相试剂包括例如抗生物素单克隆抗体、链霉抗生物素蛋白或中性抗生物素蛋白，以捕获生物素化部分（例如用于捕获HCV抗体的生物素化抗原）。

在基于SELDI的免疫测定中，将特异性结合抗HCV抗体或HCV抗原的捕获试剂附着到质谱法探针例如预活化蛋白芯片阵列的表面。然后将抗HCV抗体或抗原特异性捕获在生物芯片上，并且通过质谱法检测捕获的部分。可选地，可以从捕获试剂洗脱抗HCV抗体，并且通过传统的MALDI（基质辅助激光解吸/电离）或SELDI进行检测。化学发光微粒免疫测定，特别是采用ARCHITECT®自动分析仪（Abbott Laboratories，Abbott Park，Ill.）的化学发光微粒免疫测定是特定免疫测定的实例，其中可以容易地采用多种抗原（优选两种或更多种NS3h抗原）的组合。还可以使用凝集测定，例如被动血凝测定。在凝集测定中，通过凝集或结块检测抗原-抗体反应。在被动血凝试验中，用抗原包被红细胞，并且将包被的红细胞用于凝集测定中。

在本发明的实践中使用了用于收集、处理和加工尿液、血液、血浆和血浆以及其他体液的本领域众所周知的方法，例如当免疫诊断试剂包含多种抗原和/或在抗HCV抗体免疫测定试剂盒中时。除目标多肽之外，测试样品还可以包含进一步的部分，例如抗体、抗原、半抗原、激素、药物、酶、受体、蛋白质、肽、多肽、寡核苷酸或多核苷酸。例如，样品可以是从受试者获得的全血样品。在如本文所述的免疫测定之前，例如用预处理试剂处理测试样品，特别是全血可以是必需或需要的。即使在其中不需要预处理的情况下（例如，大多数尿样），预处理任选地可以仅为了方便而完成（例如，作为在商业平台上的方案的部分）。

预处理试剂可以是适用于本文所述的免疫测定和试剂盒的任何试剂。预处理任选地包括：（a）一种或多种溶剂（例如甲醇和乙二醇）和盐，（b）一种或多种溶剂、盐和洗涤剂，（c）洗涤剂或（d）洗涤剂和盐。预处理试剂是本领域已知的，并且可以使用这种预处理，例如如用于Abbott TDx、AxSYM®和ARCHITECT®分析仪（Abbott Laboratories，Abbott Park，Ill.）上的测定，如文献中所述（参见例如Yatscoff等人，Abbott TDx MonoclonalAntibody Assay Evaluated for Measuring Cyclosporine in Whole Blood, Clin.Chem. 36: 1969-1973 (1990)，以及Wallemacq等人，Evaluation of the New AxSYMCyclosporine Assay: Comparison with TDx Monoclonal Whole Blood and EMITCyclosporine Assays, Clin. Chem. 45: 432-435 (1999)）和/或如商购可得的。另外，预处理可以如Abbott的美国专利号5,135,875、欧洲专利公开号0 471 293、于2006年12月29日提交的美国临时专利申请60/878,017和美国专利申请公开号2008/0020401（关于其有关预处理的教导通过引用全文并入）中所述的完成。预处理试剂可以是非均相试剂或均相试剂。

使用非均相的预处理试剂，预处理试剂沉淀分析物结合蛋白（例如可以结合抗HCV抗体的蛋白质或可以结合样品中存在的抗HCV抗体的抗原）。这样的预处理步骤包括通过从沉淀的分析物结合蛋白中分离经由向样品中加入预处理剂形成的混合物的上清液来去除任何分析物结合蛋白。在这种测定中，在测定中使用不含任何结合蛋白的混合物的上清液，直接进行至抗体捕获步骤。

使用均相的预处理试剂，不存在这样的分离步骤。将测试样品和预处理试剂的整个混合物与用于抗HCV抗体的标记的特异性结合配偶体（例如抗原）或用于HCV抗原的标记的特异性结合配偶体（例如抗体）接触。用于这种测定的预处理试剂通常在预处理的测试样品混合物中稀释，在通过第一特异性结合配偶体捕获之前或期间。尽管如此稀释，但在捕获期间，一定量的预处理试剂（例如，5 M甲醇和/或0.6亚甲基二醇）仍然存在（或残留）在测试样品混合物中。

以异相形式，在从受试者获得测试样品后，制备第一混合物。该混合物含待评价抗HCV抗体的测试样品和第一特异性捕获结合配偶体，其中第一特异性捕获结合配偶体和测试样品中包含的任何抗HCV抗体形成第一特异性捕获结合配偶体-抗HCV抗体复合物。第一特异性捕获结合配偶体可以是NS3抗原。同样地，在本文提供的测定中还可以含有第二特异性捕获结合配偶体和第三特异性捕获结合配偶体，并且这些第二特异性捕获结合配偶体和第三特异性捕获结合配偶体与测试样品中存在的抗HCV抗体形成第二特异性捕获结合配偶体-抗HCV抗体复合物和第三特异性捕获结合配偶体-抗HCV抗体复合物。这样的第二抗原、第三抗原和第四抗原可以是选自核心抗原、NS3、NS4、NS5及其部分的至少一种HCV抗原中的一种或多种。

另外，除包括至少一种NS3h捕获抗原之外，免疫测定还可以包括至少一种抗HCV捕获抗体，其将与测试样品中发现的特异性结合配偶体形成特异性复合物（即在测试样品中发现的抗原或HCV蛋白），以便与测试样品中存在的抗原形成抗HCV抗体-第三特异性结合配偶体复合物或第四特异性结合配偶体复合物。在某些实施方案中，该特异性结合对是检测测试样品中的核心抗原的结合对，并且因此结合对是用于检测测试样品中的抗原（核心）的抗核心抗体。

其中测试样品和各种特异性结合配偶体加入以形成混合物的顺序可以不同。在一些实施方案中，将第一、第二、第三等特异性捕获结合配偶体（即抗原）和任何抗HCV捕获抗体固定在固相上。在另外的其他实施方案中，这些组分无一是固定的，而是相反全部同时加入测试样品中，以实现在固相上的捕获。在免疫测定中使用的固相可以是本领域已知的任何固相，例如但不限于磁性颗粒、珠、试管、微量滴定板、比色杯、膜、支架分子、薄膜、滤纸、盘和芯片。

在特异性捕获结合配偶体和测试样品中发现的它们各自的抗HCV抗体，以及任何抗HCV捕获抗体（例如，抗核心）及其在测试样品中发现的各自的HCV抗原或HCV蛋白质之间形成免疫复合物后，使用本领域已知的任何技术，从复合物中去除任何未结合的抗HCV抗体或HCV抗原/蛋白质。例如，可以通过洗涤去除未结合的抗HCV抗体或抗原。然而，期望的是，特异性结合配偶体和任何抗HCV抗体以分别超过测试样品中存在的任何抗HCV抗体和抗原存在，使得测试样品中存在的所有抗HCV抗体和抗原分别被特异性结合配偶体和任何抗HCV捕获抗体结合。

在去除任何未结合的抗HCV抗体和抗原后，通过向混合物中加入第一特异性检测结合配偶体（例如缀合物），以形成第一特异性捕获结合配偶体-抗HCV抗体-第一特异性检测结合配偶体复合物来实现检测。第一特异性检测结合配偶体可以是标记的抗原（例如，NS3h抗原）或抗IgG抗体或抗IgM抗体。此外，如上所述，第一特异性检测结合配偶体可以用可检测标记进行标记或含有可检测标记。

如本领域已知的任何合适的可检测标记可以用作任何一种或多种可检测标记。例如，可检测标记可以是放射性标记（例如3H、125I、35S、14C、32P和33P）、酶促标记（例如辣根过氧化物酶、碱性过氧化物酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶等等）、化学发光标记（例如吖啶酯类、硫酯类或磺酰胺类；鲁米诺、异鲁米诺、菲啶鎓酯类等等）、荧光标记（例如荧光素（例如5-荧光素、6-羧基荧光素、3'6-羧基荧光素、5（6）-羧基荧光素、6-六氯荧光素、6-四氯荧光素、异硫氰酸荧光素等等））、罗丹明、藻胆蛋白、R-藻红蛋白、量子点（例如硫化锌封端的硒化镉）、测温标记或免疫聚合酶链反应标记。在Polak和Van Noorden，Introduction toImmunocytochemistry，第2版，Springer Verlag, N.Y. (1997)和Haugland, Handbook ofFluorescent Probes and Research Chemicals (1996)中找到了标记、标记程序和标记检测的介绍，所述参考文献是由Molecular Probes，Inc.，Eugene，Oreg出版的组合手册和目录。荧光标记可以用于FPIA中（参见例如美国专利号5,593,896、5,573,904、5,496,925、5,359,093和5,352,803，其通过引用全文并入本文）。吖啶鎓化合物可以在均相化学发光测定中用作可检测标记（参见例如，Adamczyk等人，Bioorg. Med. Chem. Lett. 16: 1324-1328(2006)；Adamczyk等人，Bioorg. Med. Chem. Lett. 4: 2313-2317 (2004)；Adamczyk等人，Biorg. Med. Chem. Lett. 14: 3917-3921 (2004)；和Adamczyk等人，Org. Lett. 5:3779-3782 (2003)）。

示例性吖啶鎓化合物是吖啶鎓-9-甲酰胺。用于制备吖啶鎓9-甲酰胺的方法在下述中描述：Mattingly, J. Biolumin. Chemilumin. 6: 107-114 (1991)；Adamczyk等人，J. Org. Chem. 63: 5636-5639 (1998)；Adamczyk等人，Tetrahedron 55: 10899-10914(1999)；Adamczyk等人，Org. Lett. 1: 779-781 (1999)；Adamczyk等人，BioconjugateChem. 11: 714-724 (2000)；Mattingly等人，In Luminescence Biotechnology:Instruments and Applications；Dyke, K. V. Ed.；CRC Press: Boca Raton, pp. 77-105 (2002)；Adamczyk等人，Org. Lett. 5: 3779-3782 (2003)；以及美国专利号5,468,646、5,543,524和5,783,699（所述参考文献各自关于其有关的教导通过引用全文并入本文）。

另一种示例性的吖啶鎓化合物是吖啶鎓-9-羧酸芳基酯。式II的吖啶鎓-9-羧酸芳基酯的实例是10-甲基-9-（苯氧基羰基）吖啶鎓氟磺酸盐（可得自Cayman Chemical，AnnArbor，Mich.）。用于制备吖啶鎓-9-羧酸芳基酯的方法在McCapra等人，Photochem.Photobiol. 4: 1111-21 (1965)；Razavi等人，Luminescence 15: 245-249 (2000)；Razavi等人，Luminescence 15: 239-244 (2000)；以及美国专利号5,241,070（所述参考文献各自关于其有关的教导通过引用全文并入本文）中描述。这种吖啶鎓-9-羧酸芳基酯是在信号强度和/或信号的快速性方面通过至少一种氧化酶氧化分析物中产生的过氧化氢的有效化学发光指示剂。吖啶鎓-9-羧酸芳基酯的化学发光发射过程快速完成，即在1秒内，而吖啶鎓-9-甲酰胺化学发光发射延长超过2秒。然而，吖啶鎓-9-羧酸芳基酯在蛋白质的存在下丧失其化学发光性质。因此，它的使用需要在信号生成和检测期间不存在蛋白质。用于分离或去除样品中蛋白质的方法是本领域技术人员众所周知的，并且包括但不限于超滤、提取、沉淀、透析、色谱和/或消化（参见例如Wells，High Throughput Bioanalytical SamplePreparation. Methods and Automation Strategies, Elsevier (2003)）。从测试样品中去除或分离的蛋白质的量可以是约40%、约45%、约50%、约55%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%或约95%。关于吖啶鎓-9-羧酸芳基酯及其用途的进一步细节在美国专利申请序列号11/697,835中阐述，所述美国专利申请于2007年4月9日提交，并且于2008年10月9日作为美国专利申请公开号2008/0248493公开。吖啶鎓-9-羧酸芳基酯可以溶于任何合适的溶剂，例如脱气的无水N,N-二甲基甲酰胺（DMF）或水性胆酸钠中。

化学发光测定可以按照Adamczyk等人，Anal. Chim. Acta 579(1): 61-67(2006)中所述的方法执行。尽管可以使用任何合适的测定形式，但微孔板化学发光计（Mithras LB-940，Berthold Technologies U.S.A.，LLC，Oak Ridge，Tenn.）使得能够快速测定小量的多个样品。化学发光计可以配备有使用96孔黑色聚苯乙烯微孔板（Costar＃3792）的多个试剂注射器。每个样品可以加入分开的孔中，随后为如通过所采用的测定类型确定的其他试剂的同时/序贯加入。期望地，例如通过酸化避免在采用吖啶鎓芳基酯的中性或碱性溶液中形成假碱。然后逐孔记录化学发光应答。在这方面，用于记录化学发光应答的时间部分取决于试剂的加入之间的延迟和所采用的特定吖啶。

过氧化氢可以在混合物中原位生成，或在加入上述吖啶鎓化合物之前、同时或之后提供或供应给混合物。过氧化氢可以以例如对于本领域技术人员显而易见的多种方式原位生成。可选地，可以简单地向混合物中加入过氧化氢源。例如，过氧化氢源可以是已知含有过氧化氢的一种或多种缓冲液或其他溶液。在这方面，可以简单地加入过氧化氢溶液。在向样品中同时或随后添加至少一种碱性溶液后，生成可检测信号，即化学发光信号，指示抗HCV抗体（其中用抗原捕获）或抗原（其中用抗体捕获）的存在。碱性溶液含有至少一种碱，并且具有大于或等于10，优选大于或等于12的pH。碱性溶液的实例包括但不限于氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化铵、氢氧化镁、碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钙、碳酸钙和碳酸氢钙。加入样品中的碱性溶液的量取决于碱性溶液的浓度。基于所使用的碱性溶液的浓度，本领域技术人员可以容易地确定加入样品中的碱性溶液的量。

可以使用本领域技术人员已知的常规技术检测生成的化学发光信号。基于生成的信号的强度，可以定量样品中抗HCV抗体和/或抗原的量。具体地，抗HCV抗体和/或样品中的量与生成的信号的强度成比例。通过比较所生成的光量与关于抗HCV抗体和/或抗原的标准曲线或通过与参考标准进行比较，可以定量存在的抗HCV抗体和/或抗原的量。标准曲线可以使用已知浓度的抗HCV抗体的系列稀释液或溶液通过质谱法、重量分析方法和本领域已知的其他技术来生成。

抗HCV抗体和/或抗原免疫测定可以使用本领域已知的任何合适的形式进行。一般而言，在某些实施方案中，待测试（例如怀疑含有）抗HCV抗体的样品可以接触捕获抗原和至少一种检测缀合肽或缀合抗体（其可以是第二检测抗体或第三检测抗体），例如标记的抗-IgG和抗-IgM抗体，同时或序贯地且以任何顺序。类似地，抗原存在的测试可以与结合测试样品中抗原的捕获抗体接触，然后可以通过检测抗体来检测结合的抗原。

例如，测试样品可以首先与至少两种NS3h捕获抗原接触，然后（序贯地）与至少一种检测抗体接触。可选地，测试样品可以首先与至少一种检测抗体接触，然后（序贯地）与至少两种NS3h捕获抗原接触。在另外一个替代方案中，测试样品可以与捕获抗原和检测抗体同时接触。在夹心测定形式中，在允许形成第一捕获抗原/抗HCV抗体复合物和第二抗原/抗HCV抗体复合物的条件下，怀疑含有抗HCV抗体（或其片段）的样品首先与至少两种NS3h捕获抗原接触。在某些测定中，这对于第二捕获抗原、第三捕获抗原或更多种捕获抗原重复或同时进行。在夹心测定中，抗原）优选地，至少两种NS3h捕获抗原以摩尔过量的测试样品中预期的抗HCV抗体的最大量使用。例如，可以使用约5 ug至约1 mg的抗原/mL缓冲液（例如微粒包被缓冲液）。

通常用于测量小分析物的竞争性抑制免疫测定包含序贯和常规形式。在序贯竞争性抑制免疫测定中，将至少一种或至少两种NS3h捕获抗原包被在微量滴定板的孔中。当将含有一种或多种目标抗体的样品加入孔中时，目标抗体与捕获抗原结合。在洗涤后，向孔中加入已知量的标记的（例如，生物素或辣根过氧化物酶（HRP））抗体。用于酶标记的底物是生成信号所必需的。用于HRP的合适底物的实例是3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）。在洗涤后，测量通过标记的抗体生成的信号，并且与样品中抗体的量成反比。在常规竞争性抑制免疫测定中，关于目标抗体的抗原被包被到微量滴定板的孔上。然而，与序贯竞争性抑制免疫测定不同，将含有目标抗体（即抗HCV抗体）的样品和标记抗体同时加入孔中。样品中的任何抗体与标记的抗体竞争结合捕获抗原。在洗涤后，测量由标记的分析物生成的信号，并且与样品中分析物的量成反比。

在其他实施方案中，在使测试样品与至少一种或至少两种NS3h捕获抗原接触之前，捕获抗原可以结合固体支持物，其促进从测试样品中分离第一抗原和第二抗原/抗HCV抗体复合物。捕获抗原与之结合的底物可以是促进从样品中分离捕获抗原-抗HCV抗体复合物的任何合适的固体支持物或固相。实例包括板例如微量滴定板的孔、试管、多孔凝胶（例如硅胶、琼脂糖、葡聚糖或明胶）、聚合物薄膜（例如聚丙烯酰胺）、珠（例如聚苯乙烯珠或磁珠）、过滤器/膜（例如硝化纤维素或尼龙）的条、微粒（例如胶乳颗粒、可磁化微粒（例如，具有氧化铁或氧化铬核心和均聚物或异聚物涂层和约1-10微米的半径的微粒）。底物可以包含合适的多孔材料，其具有合适的表面亲和力以结合抗原和足够的孔隙率以允许检测抗体进入。微孔材料一般是优选的，尽管可以使用水合状态的凝胶状材料。这样的多孔底物优选为具有约0.01至约0.5 mm，优选约0.1 mm的厚度的片的形式。虽然孔径可能有很大变化，但优选地孔径为约0.025至约15微米，更优选约0.15至约15微米。这种底物的表面可以通过化学过程来活化，所述化学过程促使抗体与底物的共价连接。导致一般通过经由疏水力将抗原吸附至底物的不可逆结合；可选地，化学偶联剂或其他手段可以用于将抗原共价结合到底物，条件是这种结合并不干扰抗原结合抗HCV抗体的能力。

在其他实施方案中，来自测试样品的抗HCV抗体可以与先前用抗原包被的微粒结合。需要时，一种或多种捕获试剂，例如如本文所述的一种或多种或者两种或更多种NS3h抗原，其各自可以被抗HCV抗体结合，可以附着到不同物理或可寻址位置中的固相（例如，例如在生物芯片配置中（参见例如美国专利号6,225,047，国际专利申请公开号WO 99/51773；美国专利号6,329,209；国际专利申请公开号WO 00/56934和美国专利号5,242,828）。如果捕获试剂附着到作为固体支持物的质谱法探针，则与探针结合的抗HCV抗体的量可以通过激光解吸电离质谱法进行检测。可选地，可以用不同的珠填充单个柱，所述珠用一种或多种捕获试剂衍生化，从而在单一位置中捕获抗HCV抗体（参见抗体衍生化，基于珠的技术，例如，Luminex（Austin，Tex.）的xMAP技术）。

在某些实施方案中，在测定抗HCV抗体的测试样品与至少一种或至少两种NS3h抗原接触后，将混合物温育以允许第一抗原和第二抗原抗-HCV抗体复合物的形成。温育可以例如在约4.5至约10.0的pH下，在约2℃至约45℃的温度下，以及至少约一（1）分钟至约十八（18）小时、或约1至约24分钟、或约4至约18分钟的时期进行。

在某些实施方案中，采用至少一种检测抗体并且含有可检测标记。可检测标记可以在形成（第一或多重）捕获抗原/抗HCV抗体/（第二或多重）检测抗体复合物之前、同时或之后与至少一种检测抗体结合。可以使用本领域已知的任何可检测标记（参见上述讨论，包括Polak和Van Noorden（1997）以及Haugland（1996））。可检测标记可以直接或通过偶联剂与抗体（或可以包含可检测标记的抗原）结合。可以使用的偶联剂的实例是EDAC（1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺，盐酸盐），其从Sigma-Aldrich，St.Louis，Mo商购可得。可以使用的其他偶联剂是本领域已知的。将可检测标记与抗体结合的方法是本领域已知的。另外，可以购买或合成许多可检测标记，其已经含有促进可检测标记与抗体偶联的端基，例如CPSP-吖啶酯酯（即9- [N-甲苯磺酰基-N-（3-羧丙基）-10-（3-磺丙基）吖啶鎓甲酰胺）或SPSP-吖啶鎓酯（即N10-（3-磺丙基）-N-（3-磺丙基）-吖啶鎓-9-甲酰胺）。

在定量标记之前，第一和第二（或更多种）捕获抗原/抗HCV抗体/标记的缀合抗原复合物可以是但无须与测试样品的其余部分分离。例如，如果捕获抗原结合到固体支持物例如孔或珠，则可以通过去除（测试样品的）流体与固体支持物的接触来实现分离。可选地，如果捕获抗原与固体支持物结合，则其可以与含抗HCV抗体的样品和标记的缀合肽同时接触以形成复合物，随后从与固体支持物的接触去除流体（测试样品）。如果捕获抗原不与固体支持物结合，则复合物不必从测试样品中去除用于定量标记的量。

在形成检测复合物（例如捕获抗原/受试者抗体/标记的缀合抗原）后，可以使用本领域已知的技术来定量复合物中的标记量。例如，如果使用酶促标记，则标记的复合物与标记的底物反应，这给出可定量的反应，例如颜色的发展。如果标记是放射性标记，则使用闪烁计数器来定量标记。如果标记是荧光标记，则通过用一种颜色的光（其被称为“激发波长”）刺激标记，并且检测由标记响应刺激而发射的另一种颜色（其被称为“发射波长”）来定量标记。如果标记是化学发光标记，则通过视觉上或经由使用发光计、X射线胶片、高速摄影胶片、CCD照相机等检测发出的光来定量标记。一旦复合物中的标记量已定量，例如，通过使用已使用已知浓度的抗HCV抗体或抗原的连续稀释生成的标准曲线来确定测试样品中的抗HCV抗体或抗原浓度。除使用抗HCV抗体或HCV抗原的连续稀释外，标准曲线可以重量分析地、通过质谱法和本领域已知的其他技术生成。

在采用ARCHITECT®分析仪的化学发光微粒测定中，缀合物稀释剂pH一般应为约6.0+/-0.2，微粒涂层缓冲液应维持在室温（即约17至约27℃）下，微粒涂层缓冲液pH应为约6.5+/-0.2，并且微粒稀释剂pH应为约6.5+/-0.2。固体优选小于约0.2%，例如小于约0.15%、小于约0.14%、小于约0.13%、小于约0.12%、或小于约0.11%，例如约0.10%。

商购可得的抗HCV抗体以及抗IgG和抗IgM抗体可以用于测定方法及其试剂盒中。商购可得的抗体包括可从Abnova（Walnut，Calif.和Taiwan）和GenWay Biotech，Inc.（SanDiego，Calif.）获得的抗体。关于抗HCV抗体的制备，还参见欧洲专利申请EP2099825 A2。任何合适的对照组合物可以用于抗HCV抗体和HCV抗原免疫测定中。对照组合物一般包含抗HCV抗体和已知抗原以及任何期望的添加剂。

一般地，可以采用预定水平作为针对其评价在测定测试样品的抗HCV抗体后获得的结果的基准。一般地，在作出这样的比较时，通过将特定测定中运行足够次数并且在适当条件下获得预定水平，使得可以作出分析物存在、量或浓度与疾病、病症或状况（例如先兆子痫或心血管疾病）的特定阶段或终点或者特定适应症的联系或相关。通常，用参考受试者（或受试者群体）的测定获得预定水平。

特别地，关于如用于监测疾病进展和/或治疗的预定水平，抗HCV抗体的量或浓度可以是“不变的”、“有利的”（或“有利地改变的”）或“不利的”（或“不利地改变的”）。“升高的”或“增加的”指测试样品中的量或浓度高于通常或正常水平或范围（例如，预定水平），或高于另一个参考水平或范围（例如较早或基线样品）。术语“降低的”或“减少的”指测试样品中的量或浓度低于通常或正常水平或范围（例如，预定水平），或低于另一个参考水平或范围（例如较早或基线样品）。术语“改变的”指样品中的量或浓度改变（增加或减少）超过通常或正常水平或范围（例如，预定水平），或超过另一个参考水平或范围（例如较早或基线样品）。

抗HCV抗体或HCV抗原的通常或正常水平或范围根据标准实践来定义。因为抗HCV抗体和/或HCV抗原的水平在一些情况下将非常低，所以当与通常或正常水平或范围、或者参考水平或范围相比存在任何净变化（其不能通过实验误差或样品变化来解释）时，所谓的改变水平或改变可被视为已发生。因此，将在特定样品中测量的水平与来自所谓的正常受试者的类似样品中测定的水平或范围进行比较。在这个背景下，例如，“正常受试者”是不具有可检测的肝炎的个体，并且例如，“正常”（有时称为“对照”）患者或群体是显示出不可检测的肝炎的患者或群体。此外，考虑到抗HCV抗体和HCV抗原在大多数人群中不是常规地以高水平发现，所以“正常受试者”可以被视为没有实质可检测到的增加或升高量或浓度的抗-HCV抗体或HCV抗原的个体，并且“正常”（有时称为“对照”）患者或群体是显示出基本不可检测到的增加或升高量或浓度的抗HCV抗体的患者或群体。“明显正常的受试者”是其中抗HCV抗体或HCV抗原尚未被评估或正在评估中的受试者。当分析物通常不可检测（例如，正常水平为零，或在正常人群的约25至约75百分位数的范围内），但在测试样品中检测到时，以及当分析物以高于正常水平存在于测试样品中时，分析物的水平被说成是“升高的”。因此，尤其地，本发明提供了筛选患有肝炎或处于患有肝炎的危险中的受试者的方法，例如如本文定义的。

相应地，本文所述的方法也可以用于确定受试者是否患有肝炎或处于发展肝炎的危险中。具体地，这种方法可以包括以下步骤：（a）测定来自受试者的测试样品中抗HCV抗体的浓度或量（例如，使用本文所述的方法）；（b）将步骤（a）中测定的抗HCV抗体的浓度或量与预定水平进行比较，其中如果在步骤（a）中测定的抗HCV抗体和/或HCV抗原的浓度或量相对于预定水平是有利的，则确定受试者不患有肝炎或处于肝炎的危险中。然而，如果步骤（a）中抗HCV抗体的浓度或量相对于预定水平是不利的，则确定受试者患有肝炎或处于肝炎的危险中。

在某些实施方案中，本文所述的方法可以用于监测接受用一种或多种药物组合物的治疗的受试者中的治疗。具体地，这些方法涉及在受试者已施用一种或多种药物组合物之前提供来自受试者的第一测试样品。接下来，测定（例如，使用本文所述的至少一种或至少两种NS3h捕获肽方法）来自受试者的第一测试样品中抗HCV抗体（和任选的HCV抗原）的浓度或量。在测定抗HCV抗体的浓度或量后，任选地将抗HCV抗体的浓度或量与预定水平进行比较。如果如第一测试样品中测定的抗HCV抗体的浓度或量低于预定水平，则不用一种或多种药物组合物治疗受试者。然而，如果如第一测试样品中测定的抗HCV抗体的浓度或量高于预定水平，则受试者用一种或多种药物组合物治疗一段时间。受试者用一种或多种药物组合物治疗的时间段可以由本领域技术人员确定（例如，该时间段可以为约七（7）天至约两年，优选约十四（14）天至约一（1）年）。

在用一种或多种药物组合物治疗的过程期间，然后从受试者获得第二测试样品和后续测试样品。测试样品的数目和其中从受试者获得所述测试样品的时间并非关键。例如，可以在受试者首次施用一种或多种药物组合物后七（7）天获得第二测试样品，可以在受试者首次施用一种或多种药物组合物后两（2）周获得第三测试样品，可以在受试者首次施用一种或多种药物组合物后三（3）周获得第四测试样品，可以在受试者首次施用一种或多种药物组合物后四（4）周获得第五测试样品等。

在从受试者获得每个第二测试样品或后续测试样品后，测定第二测试样品或后续测试样品中抗HCV抗体（和任选的HCV抗原）的浓度或量。然后将如第二测试样品或后续测试样品各自中测定的抗HCV抗体和/或HCV抗原的浓度或量与如第一测试样品（例如，最初任选与预定水平进行比较的测试样品）中测定的抗HCV抗体和/或HCV抗原的浓度或量进行比较。如果与如步骤（a）中测定的抗HCV抗体和/或HCV抗原的浓度或量进行比较时，如步骤（c）中测定的抗HCV抗体和/或HCV抗原的浓度或量是有利的，则确定受试者的疾病已经停止、消退或改善，并且受试者应该继续施用步骤（b）的一种或多种药物组合物。然而，如果与如步骤（a）中测定的抗HCV抗体和/或HCV抗原的浓度或量进行比较时，步骤（c）中确定的浓度或量不变或不利，则受试者的疾病为被确定为继续、进展或恶化，并且该受试者应用步骤（b）中施用于该受试者的一种或多种药物组合物的较高浓度进行治疗，或者该受试者应当用与步骤（b）中施用于该受试者的一种或多种药物组合物不同的一种或多种不同的药物组合物进行治疗。具体地，可以用与受试者先前已接受的一种或多种药物组合物不同的一种或多种药物组合物治疗受试者，以减少或降低所述受试者的抗HCV抗体和/或HCV抗原水平。

一般地，对于其中可以完成重复测试（例如监测疾病进展和/或对治疗的应答）的测定，在已从受试者获得第一测试样品之后的一段时间获得第二测试样品或后续测试样品。具体地，在已从受试者获得第一测试样品后的数分钟、数小时、数天、数周或数年可以从受试者获得第二测试样品。例如，可以在从受试者获得第一测试样品之后约1分钟、约5分钟、约10分钟、约15分钟、约30分钟、约45分钟、约60分钟、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时、约24小时、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约2周、约3周、约4周、约5周、约6周、约7周、约8周、约9周、约10周、约11周、约12周、约13周、约14周、约15周、约16周、约17周、约18周、约19周、约20周、约21周、约22周、约23周、约24周、约25周、约26周、约27周、约28周、约29周、约30周、约31周、约32周、约33周、约34周、约35周、约36周、约37周、约38周、约39周、约40周、约41周、约42周、约43周、约44周、约45周、约46周、约47周、约48周、约49周、约50周、约51周、约52周、约1.5年、约2年、约2.5年、约3.0年、约3.5年、约4.0年、约4.5年、约5.0年、约5.5.年、约6.0年、约6.5年、约7.0年、约7.5年、约8.0年、约8.5年、约9.0年、约9.5年或约10.0年的时间段，从受试者获得第二测试样品。当用于监测疾病进展时，上述测定可以用于监测患有急性状况的受试者中的疾病进展。急性状况，也称为重症监护状况，指急性、危及生命的疾病或者涉及例如心血管系统或排泄系统的其他重症医学状况。通常，重症监护状况指需要基于医院的环境（包括但不限于急诊室、重症监护病房、创伤中心或其他紧急护理环境）中的急性医疗干预，或者由护理人员或其他野外医务人员的施用。对于重症监护状况，重复监测一般在更短的时间范围内完成，即数分钟、数小时或数天（例如约1分钟、约5分钟、约10分钟、约15分钟、约30分钟、约45分钟、约60分钟、约2小时、约3小时、约4小时、4 约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时、约24小时、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天或约7天），并且初始测定同样地一般在更短的时间范围内完成，例如疾病或状况发作的约数分钟、数小时或数天。

测定也可以用于监测患有慢性或非急性状况的受试者中的疾病进展。非重症监护或非急性状况指除急性、危及生命的疾病或者涉及例如心血管系统和/或排泄系统的其他重症医学状况外的疾病。通常，非急性状况包括长期或慢性持续的状况。对于非急性状况，重复监测一般用更长的时间范围完成，例如，数小时、数天、数周、数月或数年（例如约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约13小时、约14小时、约15小时、约16小时、约17小时、约18小时、约19小时、约20小时、约21小时、约22小时、约23小时、约24小时、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约2周、约3周、约4周、约5周、约6周、约7周、约8周、约9周、约10周、约11周、约12周、约13周、约14周、约15周、约16周、约17周、约18周、约19周、约20周、约21周、约22周、约23周、约24周、约25周、约26周、约27周、约28周、约29周、约30周、约31周、约32周、约33周、约34周、约35周、约36周、约37周、约38周、约39周、约40周、约41周、约42周、约43周、约44周、约45周、约46周、约47周、约48周、约49周、约50周、约51周、约52周、约1.5年、约2年、约2.5年、约3.0年、约3.5年、约4.0年、约4.5年、约5.0年、约5.5.年、约6.0年、约6.5年、约7.0年、约7.5年、约8.0年、约8.5年、约9.0年、约9.5年或约10.0年），并且初始测定同样地一般在更长的时间范围内完成，例如疾病或状况发作的约数小时、数天、数月或数年。

此外，本文所述的测定可以使用从受试者获得的第一测试样品执行，其中第一测试样品从一个来源获得，例如尿液、血清或血浆。任选地，可以使用从受试者获得的第二测试样品重复上述测定，其中第二测试样品从另一个来源获得。例如，如果第一测试样品从尿液获得，则第二测试样品可以从血清或血浆获得。可以比较使用第一测试样品和第二测试样品由测定获得的结果。该比较可以用于评价受试者中的疾病或状况的状态。

此外，本发明还涉及确定倾向于或患有肝炎的受试者是否将受益于治疗的方法。特别地，本发明涉及HCV伴随诊断方法和产品。因此，如本文所述的“监测受试者中的疾病治疗”的方法进一步最佳地还可以包括选择或鉴定用于治疗的候选者。因此，在特定实施方案中，本发明还提供了确定患有肝炎或处于肝炎的危险中的受试者是否是治疗的候选者的方法。一般地，该受试者是已经历肝炎的一些症状，或实际上已被诊断为患有肝炎或处于肝炎的危险中，和/或证实不利浓度或量的抗HCV抗体或其片段和/或HCV抗原的受试者，如本文所述。

试剂盒和系统（或其组分）以及通过本文所述的免疫测定来确定测试样品中的抗HCV抗体和/或HCV抗原浓度的方法可以适用于各种自动化和半自动化系统（包括其中固相包含微粒的系统）中，如例如在美国专利号5,089,424和5,006,309中所述，以及如由AbbottLaboratories（Abbott Park，Ill.）作为ARCHITECT®商业销售的。与非自动化系统（例如ELISA）相比，自动化或半自动化系统之间的一些差异包括第一特异性结合配偶体（例如，抗原）与之附着的底物（其可以影响夹心形成和分析物反应性），以及捕获、检测和/或任何任选的洗涤步骤的长度和时机。虽然非自动化形式例如ELISA可能需要与样品和捕获试剂相对较长的温育时间（例如约2小时），但自动化或半自动化的形式（例如，ARCHITECT®，Abbott Laboratories）可能具有相对的较短的温育时间（例如对于ARCHITECT®大约18分钟）。类似地，尽管非自动化形式例如ELISA可以温育检测抗体如缀合物试剂相对较长的温育时间（例如约2小时），但自动化或半自动化形式（例如ARCHITECT®）可以具有相对较短的温育时间（例如对于ARCHITECT®大约4分钟）。可得自Abbott Laboratories的其他平台包括但不限于AxSYM®、IMx®（参见例如美国专利5,294,404，其通过引用全文并入本文）、PRISM®、EIA（珠）和Quantum.TM. II、以及其他平台。另外，测定、试剂盒和试剂盒组分可以以其他形式采用，例如在电化学或其他手持或定点测定系统（point-of-care assaysystem）上。本发明例如适用于执行夹心免疫测定的商业Abbott Point of Care（i-STAT®，Abbott Laboratories）电化学免疫测定系统。在一次性使用的测试装置中的免疫传感器及其制造和操作方法在例如下述中描述：美国专利号5,063,081、美国专利申请公开号2003/0170881、美国专利申请公开号2004/0018577、美国专利申请公开号2005/0054078和美国专利申请公开号2006/0160164，所述专利关于其的教导通过引用全文并入。

实施例

实施例1

用于改变HCV抗体滴度检测的单一相对于多重NS3肽HCV测定

本实施例描述了采用单一NS3肽（具有不同大小和数目的结构域）的HCV测定以及采用全长NS3解旋酶肽和仅结构域1的NS3肽的组合HCV测定之间的不同HCV抗体滴度检测的比较。这项工作的结果显示于下表1中。

表1

在上表1的第2列中，如下进行ARCHITECT抗HCV测定。在第一步中，将10 uL人样品，90 uL测定特异性稀释剂和50 uL用HCV NS3、核心和NS4抗原包被的微粒加入反应容器中，涡旋并温育18分钟。在该温育之后，使用磁体将微粒隔离在反应容器的一侧，同时去除反应上清液。随后用水/洗涤剂溶液洗涤微粒。在该第一步期间，形成HCV抗原-抗体复合物并捕获在微粒上。在第二步中，在洗涤后立即将50 ul含有吖啶化抗人IgG和IgM抗体的试剂加入反应容器中，涡旋并且允许温育4分钟。在该步骤期间，吖啶啶鎓:抗人IgG和IgM缀合物进一步与第一步中形成的HCV抗原-抗体复合物结合。在温育后，使用磁体将微粒隔离在反应容器的一侧，并且去除反应上清液。随后用水/洗涤剂溶液洗涤微粒。将经洗涤的颗粒悬浮于含碱性过氧化氢的溶液中，以激活吖啶鎓并伴随光输出（以相对光单位或RLU）的同时测量，所述光输出与结合到微粒上的缀合物的量成比例。结果在上表1中报告，其显示从表的顶部向下逐渐升高的S/CO，对应于患者样品中较高的抗体滴度。

在上表2的第3列中，如下进行ARCHITECT单一标记物核心Ag测定。在第一步中，将110 uL人样品、25 uL测定特异性稀释剂、50 ul含有链霉抗生物素蛋白包被的微粒的试剂和25 uL含有生物素化抗核心MAb（C11-7）的试剂加入反应容器中，涡旋并且温育18分钟。在该第一步期间，生物素:抗核心MAb:核心Ag复合物在微粒上形成并且捕获。在该温育之后，使用磁体将微粒隔离在反应容器的一侧，同时去除反应上清液。随后用水/洗涤剂溶液洗涤微粒。在第二步中，在洗涤后立即将50 ul含有吖啶化抗核心MAb（C11-9和C11-14）的试剂加入反应容器中，涡旋并且允许温育4分钟。在该步骤期间，吖啶鎓:抗核心MAb缀合物进一步结合在第一步中形成的生物素:抗核心MAb:核心Ag复合物。在温育后，使用磁体将微粒隔离在反应容器的一侧，并且去除反应上清液。随后用水/洗涤剂溶液洗涤微粒。将经洗涤的颗粒悬浮于含碱性过氧化氢的溶液中，以激活吖啶鎓并伴随光输出（以相对光单位或RLU）的同时测量，所述光输出与结合到微粒上的缀合物的量成比例。结果在上表1中报告，其显示在这3个样品中不存在可检测的核心Ag水平。

在上表1中的第4-7列中，如下进行ARCHITECT单一标记物抗体测定。在第一步中，向反应容器中加入110 uL人样品、25 uL含有吖啶化HCV抗原（NS3h-D1（1192-1356）、NS3h-DelN15（1205-1658）、9NB49（1192-1457）或核心肽（15- 68，在34和48处具有缺失））的试剂、50 uL含有链霉抗生物素蛋白包被的微粒的试剂和25 uL含有生物素化HCV抗原（NS3h-D1（1192-1356）、NS3h-DelN15（1205-1658）、9NB49（1192-1457）或核心肽（15-68，在34和48处具有缺失））的试剂，涡旋并且温育18分钟。在该第一步期间，生物素:抗原-HCV抗体-吖啶鎓:抗原复合物在微粒上形成并且捕获。在该温育之后，使用磁体将微粒隔离在反应容器的一侧，同时去除反应上清液。随后用水/洗涤剂溶液洗涤微粒。在第二步中，在洗涤后立即将50 ul含有洗涤溶液的试剂加入反应容器中，涡旋并且允许温育4分钟。在温育后，使用磁体将微粒隔离在反应容器的一侧，并且去除反应上清液。随后用水/洗涤剂溶液洗涤微粒。将经洗涤的颗粒悬浮于含碱性过氧化氢的溶液中，以激活吖啶鎓并伴随光输出（以相对光单位或RLU）的同时测量，所述光输出与结合到微粒上的缀合物的量成比例。结果在上表1中报告，其显示了利用NS3h-DelN15（1205-1658）蛋白质的测定可以检测最低抗体滴度的前2个样品，而使用NS3h-D1,9NB49和核心肽的测定则不能。通过使用NS3h-DelN15蛋白质或核心肽的测定不能检测到最高抗体滴度的最后一个样品，但可以通过使用9NB49和NS3h-D1蛋白质的测定来检测。此外，NS3h-D1蛋白质对于最后一个样品显示比9NB49蛋白更大的反应性。

在上表1的最后一列中，进行了HCV Ag/Ab组合测定。重要的是，该测定使用两种不同类型的NS3抗原，包括含有所有三个解旋酶结构域的抗原（例如，用于定量或定性（具有一定的截止）检测低滴度抗体样品），以及仅含有解旋酶的结构域1的抗原（例如，用于定量或定性检测高滴度抗体样品）。在第一步中，向反应容器中加入110 ul人样品，25 ul含有吖啶化HCV NS3抗原（NS3h-D1（1192-1356）和NS3h-DelN15（1205-1658））的试剂和核心抗原（15-68，在34和48处具有缺失））的试剂，50 uL含有链霉抗生物素蛋白包被的微粒的试剂，以及25 uL含有生物素化的抗核心MAb（C11-7）、生物素化的HCV NS3抗原（NS3h-D1（1192-1356）和NS3h- DelN15（1205-1658））和生物素化的核心抗原（15-68，在34和48处具有缺失）的试剂，涡旋并且温育18分钟。在该第一步骤中，生物素:抗原-HCV抗体-吖啶鎓:抗原复合物以及生物素:抗HCV MAb-HCV核心Ag复合物在微粒上形成并且被捕获。在该温育之后，使用磁体将微粒隔离在反应容器的一侧，同时去除反应上清液。随后用水/洗涤剂溶液洗涤微粒。在第二步中，在洗涤后立即将50 ul含有吖啶化抗核心MAb（C11-9和C11-14）的试剂加入反应容器中，涡旋并且允许温育4分钟。在该步骤期间，吖啶鎓:抗核心MAb缀合物进一步结合在第一步中形成的生物素:抗原-HCV抗体-吖啶鎓:抗原复合物。在温育后，使用磁体将微粒隔离在反应容器的一侧，并且去除反应上清液。随后用水/洗涤剂溶液洗涤微粒。将经洗涤的颗粒悬浮于含碱性过氧化氢的溶液中，以激活吖啶鎓并伴随光输出（以相对光单位或RLU）的同时测量，所述光输出与结合到微粒上的缀合物的量成比例。结果在上表1中报告，其显示当将NS3h-DelN15和NS3h-D1蛋白质组合到组合测定内时，与使用单独的单一NS3蛋白质相比，检测到所有3个样品（其允许更大范围的样品抗体浓度）。

在进一步的工作中，跨越使用2种NS3蛋白质的两种不同的1步抗HCV NS3测定，测试了6种高滴度HCV Ab阳性样品的连续稀释系列。下表2所示的NS3h测定利用具有所有三个NS3解旋酶结构域的NS3h-DelN15（1205-1658）蛋白质。下表2所示的NS3h-D1测定使用NS3h-D1（1192-1356），其仅包含NS3解旋酶的结构域1。该测试的结果显示于下表2中。

表2

如表2所示，由单个NS3结构域（D1）组成的1步测定检测到较高浓度的Ab而不是较低的浓度。对于由检测较低抗体浓度而不是高抗体滴度的全长NS3h蛋白质组成的测定结果相反。

本申请中提及的所有出版物和专利通过引用并入本文。本发明的所述方法和组合物的各种修改和变化对于本领域技术人员将是显而易见的，而不背离本发明的范围和精神。虽然本发明已结合具体的优选实施例进行描述，但应当理解，所要求保护的本发明不应被不适当地限于这些具体实施例。实际上，对于相关领域的技术人员显而易见的用于进行本发明的所述模式的各种修改预期在下述权利要求的范围内。

Claims (6)

1.一种包含第一NS3h捕获肽和第二NS3h捕获肽以及第一可检测标记的缀合肽和第二可检测标记的缀合肽的组合物在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测受试者中的丙型肝炎病毒（HCV）感染，其包括：

（a）使怀疑含有受试者抗体的初始生物样品与第一NS3h捕获肽和第二NS3h捕获肽以及第一可检测标记的缀合肽和第二可检测标记的缀合肽接触，以生成包含所述初始生物样品、所述第一NS3h捕获肽和第二NS3h捕获肽以及所述第一可检测标记的缀合肽和第二可检测标记的缀合肽的混合的生物样品，

其中

（i）第一NS3h捕获肽由SEQ ID NO: 2的氨基酸序列组成，

（ii）第二NS3h捕获肽由SEQ ID NO: 5的氨基酸序列组成，并且

（iii）所述受试者抗体在所述生物样品中不是纯化形式，

（b）在这样的条件下温育所述混合的生物样品，所述条件使得：

（i）所述第一NS3h捕获肽特异性结合所述受试者抗体中的至少一种，以形成第一捕获复合物，并且所述第一可检测标记的缀合肽结合所述第一捕获复合物中的所述受试者抗体，以形成第一可检测复合物，和

（ii）所述第二NS3h捕获肽特异性结合所述受试者抗体中的至少一种，以形成第二捕获复合物，并且所述第二可检测标记的缀合肽结合所述第二捕获复合物中的所述受试者抗体，以形成第二可检测复合物；

（c）洗涤所述混合的生物样品，以生成经洗涤的样品；和

（d）检测所述第一可检测复合物和/或第二可检测复合物的存在，从而检测所述受试者中的HCV感染，

其中与仅使用所述第一NS3h捕获肽或第二NS3h捕获肽相比，在所述混合的生物样品中所述第一NS3h捕获肽和第二NS3h捕获肽两者的存在扩展了用于定性检测所述受试者抗体的动态范围。

2.权利要求1的用途，其中所述样品怀疑含有HCV颗粒或其片段，并且所述用途进一步包括（i）使所述样品与第一抗HCV抗体接触，以形成第三复合物，所述第三复合物包含与HCV颗粒或其片段结合的所述第一抗HCV抗体，（ii）使所述样品与可检测标记的第二抗HCV抗体接触，所述可检测标记的第二抗HCV抗体结合所述第三复合物中的所述HCV颗粒或其片段，和（iii）检测所述第三复合物。

3.权利要求2的用途，其进一步包括

（a）使所述样品与第一HCV核心肽接触，其中所述第一HCV核心肽特异性结合所述受试者抗体中的至少一种，以形成第四复合物；和

（b）使所述样品与第二HCV核心肽接触，其中所述第二HCV核心肽是可检测标记的，并且其中所述第二HCV核心肽结合作为所述第四复合物的部分的所述受试者抗体。

4.权利要求1-3中任一项的用途，其中所述受试者是人。

5.一种试剂盒，其包括：

（a）第一NS3h捕获肽和第二NS3h捕获肽，其结合生物样品中的至少一种受试者抗体以形成捕获复合物，其中

（i）第一NS3h捕获肽由SEQ ID NO: 2的氨基酸序列组成，和

（ii）第二NS3h捕获肽由SEQ ID NO: 5的氨基酸序列组成，

（b）第一缀合肽和第二缀合肽，其中所述第一缀合肽和第二缀合肽能够结合所述捕获复合物中的所述受试者抗体，和

（c）使用说明书。

6.一种组合物，其包含：

（a）第一NS3h捕获肽和第二NS3h捕获肽，其结合生物样品中的至少一种受试者抗体以形成捕获复合物，其中

（i）第一NS3h捕获肽由SEQ ID NO: 2的氨基酸序列组成，和

（ii）第二NS3h捕获肽由SEQ ID NO: 5的氨基酸序列组成，和

（b）第一缀合肽和第二缀合肽，其中所述第一缀合肽和第二缀合肽能够结合所述捕获复合物中的所述受试者抗体。

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