JP5357746B2 - 末梢性の動脈疾患のためのバイオマーカーとしてのβ−2ミクログロブリン - Google Patents
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Description
本願は、2006年3月11日に出願された米国仮特許出願第60/781,403号および2006年11月1日に出願された米国仮特許出願第60/863,951号に対する優先権を主張するものであって、それらの出願の開示は、本明細書においてその全体が参考として援用される。
本発明は、全般的に臨床的診断に関するものである。
アテローム硬化は、脈管の内皮細胞の管腔壁への脂質フィブリンプラークの蓄積である。アテローム硬化型プラークの存在は、標的器官への脈管の流れをひどく減少させ得、病的状態および死を引き起こす。アテローム硬化型プラークは、冠状動脈において(狭心症および心臓発作をおこし得る冠状動脈疾患「CAD」)、頸動脈において(卒中を引き起こし得る頸動脈疾患)、および四肢の動脈(通常は脚の動脈に影響し、末梢性の動脈疾患「PAD」としても知られる)において、生じ得る。個人は、一つ以上のこれらの領域に狭窄を有し得る。米国では、おおよそ1500万人のCAD、800万人のPAD、そして約500万人の頸動脈疾患の人が存在する。頸動脈疾患および冠状動脈疾患は、通常は内科医により見分けられるが、PADの診断は通常、見のがされる。
Hirsch ATら、「Peripheral arterial disease detection,awareness,and treatment in primary care」JAMA,286:1317−24(2001) Criqui MHら、「The epidemiology of peripheral arterial disease:importance of identifying the population at risk」Vasc Med.,2:221−6(1997) Meijer WTら、「Peripheral arterial disease in the elderly:The Rotterdam Study」Arterioscler Thromb Vasc Biol.,18:185−92(1998)
一つの実施形態において、本発明は、被験体由来の生物学的サンプル中のβ2−ミクログロブリンを測定する行程を含む、被験体において末梢性の動脈疾患のリスクを認定するか、または評価するための方法を提供する。関連する実施形態において、(a)被験体由来の生物学的サンプル中のβ2−ミクログロブリンを測定し、そして(b)該測定または末梢性の動脈疾患での測定が非末梢性動脈疾患に対して相互に関連づけられる。別の関連する実施形態において、該サンプルは、血液サンプルまたは血液誘導体サンプルである。さらに、別の関連する実施形態において、β2−ミクログロブリンに加えて、サンプル中の一つ以上のバイオマーカーのレベルが測定される。別の関連する実施形態において、さらなる測定されるバイオマーカーは、シスタチンCまたはリゾチームまたは両方である。別の関連する実施形態において、β2−ミクログロブリン、シスタチンCまたはリゾチームの測定は、イムノアッセイにより達成される。
1. 導入
バイオマーカーは、有機体の生体分子であって、別の表現型状態(例えば、疾患を有しない)と比較したとき、一つの表現型状態(例えば、疾患を有する)の被験体から得たサンプル中に特異的に存在する。バイオマーカーは、異なる群におけるバイオマーカーの平均発現レベルまたは中央発現レベルが、統計的に有意であると計算されるならば、異なる表現型状態間で差示的に存在する。統計的な有意性に関する一般的な試験としては、中でも、t検定、ANOVA、クラスカル・ワリス、ウィルコクソン、マン−ホイットニー、およびオッズ比が挙げられる。単独または組み合わせにおいて、バイオマーカーは、一つの表現型状態または別のものに被験体が属す相対的リスクの測定値を提供する。したがって、バイオマーカーは、疾患(診断)のためのマーカー、薬物の治療上の有効性(theranostics)のためのマーカー、および薬物の毒性のマーカーとして有用である。
2.1 β2−ミクログロブリン
出願人らは、β2−ミクログロブリンが、末梢性の動脈疾患のためのバイオマーカーとして有用であることを発見した。β2−ミクログロブリンの質量は、国際公開第2005/121758A1号パンフレット(Fungら)に記載された末梢性の動脈疾患のための11.7K Daltonのバイオマーカーに対応する。β2−ミクログロブリンは、119アミノ酸の前駆体から得られる99アミノ酸のタンパク質である(GI:179318;SwissProt アクセッション番号P61769)。β2−ミクログロブリンは、例えば、Abcam(カタログAB759)(www.abcam.com,Cambridge,MA)から入手できる抗体により認識される。β2−ミクログロブリンバイオマーカーの詳細は、表1、票2、および図3に示される。表1で参照される画分は、実施例1において記載されるQHyper DFカラムから該バイオマーカーが溶出する画分である。
サンプル中のタンパク質は、しばしば複数の異なる形態で存在する。これらの形態は、翻訳前修飾および翻訳後修飾のどちらか、または両方に起因し得る。翻訳前修飾形態としては、対立遺伝子改変体、スプライスバリアント、およびRNA編集形態(RNA editing form)が挙げられる。翻訳後修飾形態としては、タンパク質分解切断(例えば、親タンパク質のフラグメント)、グリコシル化、リン酸化、脂質化(lipidation)、酸化、メチル化、システイニル化(cysteinylation)、スルホン化、およびアセチル化に起因する形態が挙げられる。サンプル中のタンパク質を検出または測定する場合、タンパク質の異なる形態間で区別する能力は、相違の性質および検出または測定に用いられる方法に依存する。例えば、モノクローナル抗体(例えば、β2−ミクログロブリンのエピトープに結合するモノクローナル抗体)を用いるイムノアッセイは、そのエピトープを含有するタンパク質の全ての形態を検出するが、それらの間の区別はしない。しかしながら、タンパク質上の異なるエピトープに対して指向する二つの抗体を用いるサンドイッチイムノアッセイは、両方のエピトープを含有するタンパク質の全ての形態を検出し、そしてエピトープの一つだけを含有するそれらの形態を検出しない。診断上の分析において、使用される特定の方法により検出される該形態が、任意の特定の形態と同じように等しく良いバイオマーカーである場合、タンパク質の異なる形態を区別することに無力であることは、ほとんど影響がない。しかしながら、タンパク質の特定の形態(または特定の形態のサブセット)が、特定の方法により一緒に検出される異なる形態の集まりよりも、より良いバイオマーカーである場合、該分析の能力は低下し得る。この場合、タンパク質の形態間で区別し、そして望ましい形態または該タンパク質の形態を特異的に検出および測定する、分析方法を用いることは有用である。分析物の異なる形態を区別するか、または分析物の特定の形態を特異的に検出することは、分析物を「分析する」といわれる。
本発明での、β2−ミクログロブリンバイオマーカー、シスタチンCバイオマーカー、およびリゾチームバイオマーカーは、任意の適切な方法により検出され得る。検出の方法論は、光学的方法、電気化学的方法(ボルタメトリーおよびアンペロメトリー技法)、原子間力顕微鏡法、および無線周波数法(例えば、多極性の共鳴スペクトル)を含む。共焦点および非共焦点の両方の顕微鏡法に加えて、光学的な方法の実例は、蛍光、ルミネッセンス、ケミルミネッセンス、吸光度、反射率、透過率、および複屈折または屈折率の検出(例えば、表面プラズモン共鳴、偏光解析法、共鳴ミラー法、グレーティングカプラ導波管法、または干渉測定)である。
好ましい実施形態において、本発明のバイオマーカーは、気相イオンを検出するために質量分析計を用いる方法である質量分析法により検出される。質量分析計の例は、飛行時間型、扇形磁場、四重極フィルター、イオントラップ、イオンサイクロトロン共鳴、静電扇形分析器(electrostatic sector analyzer)、およびこれらの混成物がある。
本発明における使用のための好ましい質量分析技法は、例えば米国特許第5,719,060号明細書および同第6,225,047号明細書(両者ともHutchensおよびYipによる)に記載されたように、「表面増強レーザー脱離およびイオン化(Surface Enhanced Laser Desorption and Ionization)」または「SELDI」である。これは、分析物(ここでは一つ以上のバイオマーカー)がSELDI質量分析法プローブの表面に捕捉される、脱離/イオン化気相イオン分光測定法(例えば、質量分析法)の方法をいう。
レーザー脱離質量分析の別の方法は、表面増強ニート脱離(Surface−Enhanced Neat Desorption)(「SEND」)と呼ばれる。SENDは、プローブ表面に化学的に結合された、エネルギー吸収分子を含有するプローブ(「SENDプローブ」)の使用を含む。「エネルギー吸収分子」(EAM)という句は、レーザー脱離/イオン化源からのエネルギーを吸収可能で、そしてその後、その分子と接触している分析物分子の脱離およびイオン化に関与する分子を表す。EAMカテゴリーは、MALDIで用いられる分子を含み、しばしば「マトリックス」といわれ、例としては、桂皮酸誘導体、シナピン酸(SPA)、シアン化ヒドロキシ桂皮酸(CHCA)およびジヒドロキシ安息香酸、フェルラ酸、ならびにヒドロキシアセトフェノン誘導体が挙げられる。特定の実施形態において、エネルギー吸収分子は、線状ポリマーまたは架橋されたポリマー(例えば、ポリメタクリレート)中に組み込まれる。例えば、組成物は、α−シアノ−4−メタクリロイルオキシ桂皮酸およびアクリレートのコポリマーであり得る。別の実施形態において、組成物は、α−シアノ−4−メタクリロイルオキシ桂皮酸、アクリレート、および3−(トリ−エトキシ)シリルプロピルメタクリレートのコポリマーである。別の実施形態において、組成物は、α−シアノ−4−メタクリロイルオキシ桂皮酸およびオクタデシルメタクリレート(「C18 SEND」)のコポリマーである。SENDはさらに、米国特許第6,124,137号明細書および国際公開第03/64594号パンフレット(Kitagawa、「Monomers And Polymers Having Energy Absorbing Moieties Of Use In Desorption/Ionization Of Analytes」、2003年8月7日)に記載される。
LDIの別の型は、表面増強感光性付着および放出(Surface−Enhanced Photolabile Attachment and Release)(「SEPAR」)と呼ばれる。SEPARは、分析物を共有結合し得る表面に取り付けられた部分を有し、そしてその後、光への(例えば、レーザー光への(米国特許第5,719,060)号明細書を参照のこと)曝露後、該部分における感光性の結合の破壊をとおして該分析物を放出するプローブの使用を含む。SEPARおよびSELDIの他の型は、本発明に従って、バイオマーカーまたはバイオマーカーのプロフィールを検出するために容易に適応される。
MALDIは、タンパク質および核酸のような生体分子を分析するために用いられるレーザー脱離/イオン化の従来からの方法である。一つのMALDIの方法において、サンプルは、マトリックスと混合されMALDIチップ上に直接置かれる。しかしながら、血清または尿のような生物学的サンプルの複雑さによって、サンプルの前もっての分画なしには、この方法は最適ではない。したがって、特定の実施形態において、バイオマーカーは、樹脂(例えば、スピンカラム中の)のような固体支持体に結合された、生物特異的物質(例えば、抗体)またはクロマトグラフィー物質で、好ましくは最初に捕捉される。β2−ミクログロブリンを結合する特異的な親和性物質は、先に記載した。親和性物質上での精製後、バイオマーカーは、溶出され、そしてその後、MALDIにより検出される。
別の方法において、バイオマーカーは、LC−MSまたはLC−LC−MSにより検出される。これは、液体クロマトグラフィーを1回または2回通過させ、その後質量分析法の分析(典型的にはエレクトロスプレーイオン化)により、サンプル中のタンパク質を分析することを含む。
飛行時間型質量分析による分析物の分析は、飛行時間型スペクトルを生成する。最終的に分析される飛行時間型スペクトルは、典型的にはサンプルに対するイオン化エネルギーの1パルスからのシグナルを示さないが、しかしむしろ多数のパルスからのシグナルの総和を示す。これはノイズを減少させ、そしてダイナミックレンジを増加させる。この時間飛行のデータが、その後、データ処理に供される。CiphergenのProteinChip(登録商標)ソフトウェアにおいてデータ処理は、典型的には、質量スペクトルを生成するTOFからM/Zへの変換(TOF−to−M/Z transformation)、装置のオフセットを除去するためのベースラインのサブトラクション、および高周波数のノイズを減少させる高周波数ノイズフィルタリングを含む。
例えば、本発明のバイオマーカーの検出のための好ましい手順は、以下のとおりである。試験される生物学サンプル(例えば、血清)は、好ましくはSELDI分析前に前もっての分画にかけられる。これは、サンプルを単純化し、そして感度を向上させる。前もっての分画の好ましい方法は、サンプルを、Q HyperD(BioSepra,SA)のような陰イオン交換クロマトグラフィー物質と接触させることを含む。結合した物質は、その後、pH9、pH7、pH5、およびpH4の緩衝剤を用いる段階的pH溶出にかけられる。バイオマーカーが溶出される分画はまた、表1、表2(pHによる)、および図3にも示される。バイオマーカーを含む多様な分画が集められる。
本発明の別の実施形態において、本発明のバイオマーカーは、質量分析法以外の方法または該バイオマーカーの質量の測定に頼る方法以外の方法により測定される。質量に依存しない、一つのそのような実施形態において、β2−ミクログロブリンが、イムノアッセイにより測定される。イムノアッセイは、バイオマーカーを捕捉するために、抗体のような生物特異的な捕捉剤を必要とする。抗体は、当該分野で周知の方法により(例えば、該バイオマーカーで動物を免疫化することにより)、産生され得る。バイオマーカーは、バイオマーカーの結合特性に基づいてサンプルから単離され得る。あるいは、ポリペプチドバイオマーカーのアミノ酸配列が知られているならば、該ポリペプチドが合成され得、そして当該分野で周知の方法により抗体を生成するために用いられ得る。β2−ミクログロブリン抗体、および標準的な分析を用いてβ2−ミクログロブリンを検出するための方法が、当該分野で記載されている(例えば、Hilgertら(Folia Biol(Praha)(1984)30:369−76))。通常の患者と比較してPAD患者におけるβ2−ミクログロブリンの増加したレベルを検出する、これらの抗体の使用の例が、本明細書において提供される。リゾチームおよびシスタチンCのイムノアッセイ検出のための同様の方法がまた当該分野において公知である。
本発明のバイオマーカーは、被験体における末梢性の動脈疾患の状態を評価する(例えば、末梢性の動脈疾患を有する患者のリスクを評価する)診断上の試験において用いられ得る。「末梢性の動脈疾患」の句は、該疾患の任意の区別可能な徴候(非疾患を含む)を含む。例えば、末梢性の動脈疾患の状態は、疾患の存在または非存在(例えば、末梢性の動脈疾患対非末梢性の動脈疾患)、疾患発症のリスク、該疾患の段階、疾患の進行(例えば、長期間の疾患の進行または疾患の寛解)および疾患の処置への有効性または応答を含むが、限定はされない。
状態を正確に予測する診断上の試験の能力は、一般的に、分析の感度、分析の特異性、または受信者特性(「ROC」)曲線下の面積として測定される。感度は、陽性になる試験によって予測される真の陽性の割合であり、一方、特異性は陰性になる試験によって予測される真の陰性の割合である。ROC曲線は、1−特異性の関数としての試験の感度を提供する。ROC曲線下面積が大きいほど、試験の予測値はより強力である。試験の有意性の他の有用な測定は、陽性の予測値および陰性の予測値である。陽性の予測値は、実際に陽性である、試験が陽性の人の割合である。陰性の予測値は、実際に陰性である、試験が陰性の人の割合である。
個々のバイオマーカーは、有用な診断上のバイオマーカーであるが、バイオマーカーの組み合わせが、一つのバイオマーカー単独よりも特定の状態のより高い予測値を提供し得ることが見い出された。特に、サンプル中の複数のバイオマーカーの検出は、試験の感度および/または特異性を増大させ得る。少なくとも二つのバイオマーカーの組み合わせが、しばしば「バイオマーカープロフィール」または「バイオマーカーフィンガープリント」として言及される。したがって、β2−ミクログロブリンは、診断上の試験の感度および/または特異性を改善するため、末梢性の動脈疾患のための他のバイオマーカーと組み合わされ得る。PADのスクリーニングために有用な他のバイオマーカーの例は、2005年5月26日に出願されたPCT出願第US2005/018728号(国際公開第2005/121758号パンフレット)において見い出される。
末梢性の動脈疾患の状態を決定することは、典型的には、診断上の試験の結果に基づいて、個体を二つ以上の群(状態)の一つに分類することを含む。本明細書中に記載される診断上の試験は、多数の異なる状態間で分類するために用いられ得る。「PAD状態」の句は、区別すること(とりわけ、PAD対非PAD(例えば、正常)および/またはPAD対「長期跛行性者」PAD(LC PAD))を含む。長期跛行性者は、他の患者よりも制限を受けていないPADの個体である(すなわち、長期跛行性者は、スキナー−ガードナープロトコル(Skinner−Gardner protocol)を用いてトレッドミル上で12分間以上歩行できる)。この状態に基づいて、さらなる診断上の試験または治療上の手順もしくはレジメンを含む、さらなる手順が示され得る。
1つの実施形態において、本発明は、被験体において末梢性の動脈疾患のリスク(状態:末梢性の動脈疾患 対 非末梢性動脈疾患)を評価するための方法を提供する。末梢性の動脈疾患のリスクは、関連バイオマーカーを測定し、次いで、その測定を分類アルゴリズムに提示するか、あるいはその測定を特定のリスクレベルと関連するバイオマーカーの参照量および/またはパターンと比較するかのいずれかによって、決定される。
1つの実施形態において、本発明は、被験体において末梢性の動脈疾患を発症するリスク(状態:低リスク 対 高リスク)を決定するための方法を提供する。バイオマーカーの量またはパターンは、種々のリスク状態(例えば、高い、中程度または低い)に特徴的である。疾患を発症するリスクは、関連バイオマーカーを測定し、次いで、その測定を分類アルゴリズムに提示するか、あるいはその測定を特定のリスクレベルと関連するバイオマーカーの参照量および/またはパターンと比較するかのいずれかによって、決定される。
1つの実施形態において、本発明は、被験体において疾患の病期を決定するための方法を提供する。疾患の各病期は、バイオマーカーの特徴的な量またはバイオマーカーのセットの相対量(パターン)を有する。疾患の病期は、関連バイオマーカー(例えば、β2−ミクログロブリン)を測定し、次いで、その測定を分類アルゴリズムに提示するか、あるいはその測定を特定の特定の病期と関連するバイオマーカーの参照量および/またはパターンと比較するかのいずれかによって、決定される。例えば、初期の末梢性の動脈疾患と非末梢性動脈疾患との間を分類することができる
(5.3.4.疾患の経過(進行/寛解)の決定)
1つの実施形態において、本発明は、被験体において疾患の経過を決定するための方法を提供する。疾患の経過とは、疾患の進行(悪化)および疾患の退行(改善)を含む経時的な疾患状態の変化をいう。時間とともに、上記バイオマーカーの量または相対量(例えば、パターン)は、変化する。例えば、高いβ2−ミクログロブリンレベル、および/または高いリゾチームレベルおよび/または高いシスタチンCレベルは、PADと関連づけられる。したがって、罹患または非罹患に関して経時的に増加するかまたは減少するかのいずれかであるこれらのマーカーの傾向は、その疾患の経過をモニタリングするために使用され得る。したがって、本方法は、少なくとも2つの異なる時点(例えば、第1の時間および第2の時間)について被験体における1種以上のバイオマーカーを測定すること、および存在する場合、量の変化を比較することを包含する。疾患の経過は、これらの比較に基づいて決定される。
本発明のさらなる実施形態は、アッセイ結果または診断あるいはその両方を例えば、技術者、医師または患者に連絡することに関する。特定の実施形態において、コンピューターは、アッセイ結果または診断あるいはその両方を、目的とするパートナー(例えば、医師およびそれらの患者)に連絡するために使用される。いくつかの実施形態において、上記アッセイは、結果または診断が連絡される国家または管区とは異なる国家または管区において行われるか、あるいは上記アッセイ結果は、結果または診断が連絡される国家または管区とは異なる国家または管区において分析される。
末梢性の動脈疾患状態を定量または評価する方法の特定の実施形態において、その方法は、その状態に基づいて被験体の処置を管理することをさらに含む。このような管理は、末梢性の動脈疾患状態を決定することに続く医師または臨床家の行為を包含する。例えば、医師が末梢性の動脈疾患の診断を行う場合、処置の特定のレジメンが後に続き得る。処置の適切なレジメンとしては、管理された自動運動プログラム;血圧、糖摂取、および/または脂質レベルの制御;任意の必要なカウンセリングまたはニコチンの置換を含む喫煙の中止;ならびにアスピリンの投与(ジピリダモールを伴うかまたは伴わない)、クロピドグレルの投与、シロスタゾールの投与、および/またはペントキシフィリンの投与を含む薬物療法が挙げられ得るが、これらに限定されない。あるいは、PADの診断は、患者がPADの特定の形態に罹患しているか否か、または患者が関連する疾患(例えば、冠状動脈疾患)に罹患しているか否かを決定するためのその後のさらなる検査を含み得る。また、診断検査がPAD状態において不確定な結果を与える場合、さらなる検査が、要求され得る。
いくつかの実施形態において、「既知のサンプル」などのサンプルを使用してもたらされるスペクトル(例えば、質量スペクトルまたは飛行時間型スペクトル)に由来するデータは、次いで、分類モデルを「トレーニング」するために使用され得る。「既知のサンプル」は、予め分類されているサンプルである。上記スペクトルに由来し、そして上記分類モデルを形成するために使用されるデータは、「トレーニングデータセット」と称され得る。一旦トレーニングされると、上記分類モデルは、未知のサンプルを使用してもたらされるスペクトルに由来するデータにおいてパターンを認識し得る。次いで、上記分類モデルは、上記未知のサンプルをクラスに分類するために使用され得る。これは、例えば、特定の生物学的サンプルが特定の生物学的状態(例えば、罹患 対 非罹患)に関連するか否かを予想することにおいて有用であり得る。
別の局面において、本発明は、本発明のバイオマーカー(例えば、β2−ミクログロブリン、リゾチーム、シスタチンCおよび表1、表2および図3に列挙される他のバイオマーカー)に基づく材料の組成物を提供する。
別の局面において、本発明は、末梢性の動脈疾患状態を定量するためのキットを提供し、そのキットは、本発明に従うバイオマーカーを検出するために使用される。1つの実施形態において、上記キットは、固体支持体(例えば、チップ、マイクロタイタープレートまたはビーズもしくは樹脂)を備え、その固体支持体に捕捉剤が付着しており、その捕捉剤は、本発明のバイオマーカーに結合する。したがって、例えば、本発明のキットは、SELDIのための質量分析プローブ(例えば、ProteinChip(登録商標)アレイ)を備え得る。生物特異的捕捉剤の場合において、上記キットは、反応性の表面を有する固体支持体、および生物特異的捕捉剤(例えば、β2−ミクログロブリンに対する抗体)を含む容器を備え得る。
別の実施形態において、本発明は、薬学的薬物の治療効力を決定するための方法を提供する。これらの方法は、薬物の臨床試験を行うこと、およびその薬物に対する患者の経過をモニタリングすることにおいて有用である。治療または臨床試験は、薬物を特定のレジメンにおいて投与することを包含する。上記レジメンは、単回用量の薬物または経時的な複数回用量の薬物を含み得る。医師または臨床研究者は、患者または被験体に対する薬物の効果を、投与の経過にわたってモニタリングする。薬物が上記状態に対して薬理学的影響を有する場合、β2−ミクログロブリン(またはリゾチームおよび/もしくはシスタチンC)の量または相対量(例えば、パターンまたはプロフィール)は、非疾患プロフィールへと変化する。例えば、β2−ミクログロブリンは、PADを有する患者において増加する。したがって、PADを有する被験体における処置の効果(および他のバイオマーカー)を処置の経過の間に追跡できる。したがって、この方法は、薬物治療を受ける被験体において1種以上のバイオマーカーを測定すること、およびそのバイオマーカーの量とその被験体の疾患状態とを関連づけることを包含する。この方法の1つの実施形態は、薬物治療の経過の間の少なくとも2つの異なる時点(例えば、第1回および第2回)についての上記バイオマーカーのレベルを決定すること、および存在する場合、そのバイオマーカーの量の変化を比較することを包含する。例えば、上記バイオマーカーは、薬物投与の前後または薬物投与の間における2つの異なる時点で測定され得る。治療の効果は、これらの比較に基づいて決定される。処置が有効である場合、上記バイオマーカーは、正常へと向かうが、処置が有効ではない場合、上記バイオマーカーは、疾患適応へと向かう。処置が有効である場合、上記バイオマーカーは、正常へと向かうが、処置が有効ではない場合、上記バイオマーカーは、疾患適応へと向かう。
本発明の方法は、同様に他の用途も有する。例えば、上記バイオマーカーは、インビトロまたはインビボにおけるそのバイオマーカーの発現を調節する化合物(次いで、この化合物は、患者において末梢性の動脈疾患を処置または予防することに有用であり得る)についてスクリーニングするために使用され得る。別の例において、上記バイオマーカーは、末梢性の動脈疾患についての処置に対する応答をモニタリングするために使用され得る。なお別の例において、上記バイオマーカーは、被験体が末梢性の動脈疾患を発症するリスクを有するか否かを決定するための家系学研究において使用され得る。
なお別の実施形態において、本発明の方法は、切断されたβ2−ミクログロブリンのレベルの増大に関連する疾患(例えば、末梢性の動脈疾患)の進行または可能性を処置または低減させるための方法を提供する。例えば、完全長β2−ミクログロブリンを切断する1種以上のタンパク質が同定された後、コンビナトリアルライブラリーは、同定されたタンパク質の切断活性を阻害する化合物についてスクリーニングされ得る。化学ライブラリーをこのような化合物についてスクリーニングする方法は、当該分野において周知である。例えば、Lopez−Otinら(2002)を参照のこと。あるいは、阻害性化合物は、β2−ミクログロブリンの構造に基づいてデータ処理可能に(intelligently)設計され得る。
本発明のバイオマーカー(β2−ミクログロブリン、リゾチームおよびシスタチンCを含む)は、最初、Ciphergen Biosystems,Inc.(Fremont,CA)(“Ciphergen”)からのProteinChipアレイを利用するSELDI技術を使用するスクリーニング研究において、PADについてのバイオマーカーとして同定された。この研究の組(set)は、PADを有する45人の患者およびPADを有さない43人の患者から構成された。PAD群に配置した被験体は、0.9以下の足首関節指数を有する被験体であった。これらの群に関連のある特性を、図1にまとめ、比較する。PAD群の患者は、僅かに年長であり、一般的に高頻度の心臓血管の危険因子を有していた。
陰イオン交換分別のための緩衝液のリスト:
U1(1M尿素、0.22% CHAPS、50mM Tris−HCl pH9)
50mM Tris−HCl(0.1% OGP含有)pH9(洗浄緩衝液1)
50mM Hepes(0.1% OGP含有)pH7(洗浄緩衝液2)
100mM 酢酸Na(0.1% OGP含有)pH5(洗浄緩衝液3)
100mM 酢酸Na(0.1% OGP含有)pH4(洗浄緩衝液4)
33.3%イソプロパノール/16.7%アセトニトリル/0.1%トリフルオロ酢酸(trifluoracetic acid)(洗浄緩衝液5)。
フィルタープレート
5つのv−ウェル 96ウェルディッシュ、F1〜F5と標識。
5ベッド容積(bed volume)の50mM Tris−HCl pH9で3回、Hyper Q DF樹脂(BioSepra,Cergy,France)を洗浄することによって樹脂を調製する。次に、50%懸濁物で50mM Tris−HCl pH9中に保存する。
125μLのHyper Q DFをフィルタープレートの各ウェルに添加する。
フィルターを緩衝液で処理する。
150μLのU1を各ウェルに添加する。
フィルターを緩衝液で処理する。
150μLのU1を各ウェルに添加する。
フィルターを緩衝液で処理する。
150μLのU1を各ウェルに添加する。
フィルターを緩衝液で処理する。
各管から150μLのサンプルをフィルタープレートの適切なウェルにピペットで入れる(pipet)。
4°で30分間ボルテックスする。
v−ウェル 96ウェルプレートF1をフィルタープレートの下に置く。
フロースルー(flow−through)をプレートF1に収集する。
100μLの洗浄緩衝液1をフィルタープレートの各ウェルに添加する。
室温(RT)で10分間ボルテックスする。
pH9溶出物をプレートF1に収集する。
画分1はフロースルーおよびpH9溶出物を含む。
100μLの洗浄緩衝液2をフィルタープレートの各ウェルに添加する。
室温(RT)で10分間ボルテックスする。
v−ウェル 96ウェルプレートF2をフィルタープレートの下に置く。
画分2をプレートF2に収集する。
100μLの洗浄緩衝液2をフィルタープレートの各ウェルに添加する。
室温(RT)で10分間ボルテックスする。
画分2の残りをプレートF2に収集する。
画分2はpH7溶出物を含む。
100μLの洗浄緩衝液3をフィルタープレートの各ウェルに添加する。
室温(RT)で10分間ボルテックスする。
v−ウェル 96ウェルプレートF3をフィルタープレートの下に置く。
画分3をプレートF3に収集する。
100μLの洗浄緩衝液3をフィルタープレートの各ウェルに添加する。
室温(RT)で10分間ボルテックスする。
画分3の残りをプレートF3に収集する。
画分3はpH5溶出物を含む。
100μLの洗浄緩衝液4をフィルタープレートの各ウェルに添加する。
室温(RT)で10分間ボルテックスする。
v−ウェル 96ウェルプレートF4をフィルタープレートの下に置く。
画分4をプレートF4に収集する。
100μLの洗浄緩衝液4をフィルタープレートの各ウェルに添加する。
室温(RT)で10分間ボルテックスする。
画分4の残りをプレートF4に収集する。
画分4はpH4溶出物を含む。
100μLの洗浄緩衝液5をフィルタープレートの各ウェルに添加する。
室温(RT)で10分間ボルテックスする。
v−ウェル 96ウェルプレートF5をフィルタープレートの下に置く。
画分5をプレートF5に収集する。
100μLの洗浄緩衝液5をフィルタープレートの各ウェルに添加する。
室温(RT)で10分間ボルテックスする。
画分5の残りをプレートF5に収集する。
画分5は、有機溶媒溶出物を含む。
チップ結合プロトコールを進めるまで凍結する。
チップ洗浄緩衝液のリスト:
IMAC30アレイ(Ciphergen Biosystems,Inc.):適切な洗浄液(wash)(500mM NaClを補充した50mM Tris pH8.0が挙げられるが、これに限定されない)
CM10アレイ(Ciphergen Biosystems,Inc.):適切な洗浄液(100mM 酢酸アンモニウム pH4.0が挙げられるが、これに限定されない)。
アレイをバイオプロセッサー(bioprocessor)に置く。
50μlのCuSO4をIMAC30アレイの各スポットに入れる。
室温(RT)で15分間ボルテックスする。
CuSO4を除去し、繰り返す。
水ですすぐ。
アレイに適した100μlのチップ洗浄緩衝液を各ウェルに添加する。
RTで5分間ボルテックスする。
ボルテックス後、緩衝液を除去する。
アレイに適した100μlのチップ洗浄緩衝液を各ウェルに添加する。
RTで5分間ボルテックスする。
ボルテックス後、緩衝液を除去する。
アレイに適した60μlのチップ洗浄緩衝液を各ウェルに添加する。
20μlの血漿画分を添加する。
RTで30分間ボルテックスする。
サンプルおよび緩衝液を除去する。
アレイに適した100μlのチップ洗浄緩衝液を各ウェルに添加する。
RTで5分間ボルテックスする。
ボルテックス後、緩衝液を除去する。
アレイに適した100μlのチップ洗浄緩衝液を各ウェルに添加する。
RTで5分間ボルテックスする。
ボルテックス後、緩衝液を除去する。
アレイに適した100μlのチップ洗浄緩衝液を各ウェルに添加する。
RTで5分間ボルテックスする。
ボルテックス後、緩衝液を除去する。
水で2回すすぐ。
バイオプロセッサーの頂部とガスケットを除去する。
アレイを乾燥させる。
SPA:
0.8μlの50% SPA(シナピン酸)を50%アセトニトリルおよび0.5% TFAに添加する。
空気乾燥。
0.8μlの50% SPAを添加する。
空気乾燥。
CHCA
50%アセトニトリル+0.5%に溶解させた0.8μlの20% CHCAを添加する。
空気乾燥。
0.8μlの20% CHCAを添加する。
空気乾燥。
エネルギー吸収分子:50% SPA
高質量を100000ダルトンに設定し、最適化質量を2000ダルトン〜100000ダルトンに設定する。
開始レーザー強度を200に設定する。
開始検出器感度を8に設定する。
8000ダルトンでの質量に集中させる。
質量デフレクター(Mass Deflector)を1000ダルトンに設定する。
データ収集法をSeldi定量(quantitation)に設定する。
Seldi収集パラメータ20を設定する。デルタ(delta)を4に、トランジエント(transients per)を10に、エンドポジション(ending position)を80に設定する。
強度225での2ショット(shot)をもちいてウォーミングポジション(warming position)を設定する(ウォーミングショットを含まない)。
サンプルを処理する。
Significance Analysis for Microarraysソフトウェア(「SAM」)を使用して、有意なピークの組を同定した。SAMは、Tusherら(PNAS(2001)98:5116〜5121)に詳細に記載されている。SAM分析の結果は図2に示される。図2は、1619個のバイオマーカーのうち11個が、PAD群と非PAD群との間で有意に異なるとして同定されたことを示す。
ウェスタンブロットおよび抗−β2ミクログロブリン抗体を使用して、より高いβ2−ミクログロブリン濃度は、4人の対照被験体由来のサンプルと比較して、PADを有する4人の患者由来のサンプルで観察された。この結果を図4に示す。pH5で分別された血漿を使用した場合または分別されていない全血漿を使用した場合、この知見は一貫している。
観察された相関が他の患者特性(例えば、他の心臓血管の危険因子、腎機能など)によって揺るがないことを確認するために、確認研究を実施した。この確認研究に関して、血漿を、PADを有する20人の患者および20人の対照被験体(PADについても冠性疾患(coronary disease)についても臨床上の証拠を有さない)から取得した。図5は、2つの群における患者をまとめる表を示す。2つの比較群における患者は、年齢および性において類似していた。しかしながら、予想したように、PAD群は、より高頻度の心臓血管の危険因子およびより低い糸球体濾過率になる傾向を有した。
既知のPAD状態を有さない冠動脈造影を受けている患者(n=237)において、血清β2mはPADを有する患者において高かった。包括的な臨床上の特徴づけ(人口統計学(demographics)、民俗学(ethnicity)、クオリティオブライフ、機能的能力(functional capacity);血漿、血清およびゲノムDNAについての静脈穿刺;ならびに冠動脈造影を聞き出すための質問票を含んだ)の前にABIを決定した。PADを有する患者は、安静時に0.90未満のABIを有したか、または非圧縮性の足根関節動脈を有する患者において、0.60未満の足指−上腕(toe−brachial)指数を有した。糸球体濾過率(GFR)を、腎疾患研究における食事の改変(Modification of Diet in Renal Disease Study)(MDRD)法 14によって見積もった。β2−ミクログロブリンレベルは、多変量回帰分析によって他の血管危険因子およびGFRとは独立してABIと相関した(表3)。
指数ABIの予測因子についての多変量回帰(n=273)
従属変数:足首関節指数
独立した有意な相関を太字にした。
Claims (26)
- 被験体における末梢性の動脈疾患の状態を認定するための方法であって、以下:
(a) 該被験体由来の生物学的サンプル中のβ2−ミクログロブリンを測定する工程;および
(b) 末梢性の動脈疾患の測定値を、末梢性の動脈疾患ではない測定値に対して、関連付ける工程、
を含む方法。 - 請求項1に記載の方法であって、β2−ミクログロブリンに加えて前記生物学的サンプル中の複数のバイオマーカーを測定することを含む、方法。
- 請求項2に記載の方法であって、ここで前記複数のバイオマーカーが、バイオマーカーであるリゾチームおよびシスタチンCからなる群より選択される少なくとも一つのバイオマーカーを含む、方法。
- 請求項2に記載の方法であって、ここで少なくともβ2−ミクログロブリンおよびリゾチームが測定される、方法。
- 請求項2に記載の方法であって、ここで少なくともβ2−ミクログロブリンおよびシスタチンCが測定される、方法。
- 請求項2に記載の方法であって、ここで少なくともβ2−ミクログロブリン、シスタチンC、およびリゾチームが測定される、方法。
- 請求項2に記載の方法であって、ここで三つのバイオマーカーが測定され、そしてここで、該三つのバイオマーカーが、β2−ミクログロブリン、シスタチンC、およびリゾチームである、方法。
- 請求項1に記載の方法であって、ここでβ2−ミクログロブリンが、質量分析法により測定される、方法。
- 請求項8に記載の方法であって、ここで質量分析法が、SELDI−MSである、方法。
- 請求項1に記載の方法であって、ここでβ2−ミクログロブリンが、質量分析法以外の方法により測定される、方法。
- 請求項1に記載の方法であって、ここでβ2−ミクログロブリンが、イムノアッセイにより測定される、方法。
- 請求項2〜7のいずれかに記載の方法であって、ここでβ2−ミクログロブリン、シスタチンC、およびリゾチームからなる群より選択される少なくとも一つの前記バイオマーカーが、イムノアッセイにより測定される、方法。
- 請求項1に記載の方法であって、ここで前記サンプルが、血液または血液誘導体である、方法。
- 請求項1に記載の方法であって、ここで前記関連付ける工程が、ソフトウェアの分類アルゴリズムを実行することにより実行される、方法。
- 請求項1に記載の方法であって、さらに以下:(c)被験体に前記状態を報告する工程を含む、方法。
- 請求項1に記載の方法であって、さらに以下:(c)有形の媒体上に前記状態を記録する工程を含む、方法。
- 末梢性の動脈疾患の経過を決定するための方法であって、以下:
(a) 最初に、被験体由来の生物学的サンプル中のβ2−ミクログロブリンを測定する工程;
(b) 第二番目に該被験体由来の生物学的サンプル中のβ2−ミクログロブリンを測定する工程;そして
(c) 該最初の測定値および該第二の測定値を比較する工程;
を含み、ここで比較した測定値が、該末梢性の動脈疾患の経過を決定する、方法。 - 末梢性の動脈疾患の状態の認定の指標としてβ2−ミクログロブリンを使用するためのキットであって、以下:
(a) 固体支持体に取り付けられた少なくとも一つの捕捉剤を含む固体支持体であって、ここで該捕捉剤が、β2−ミクログロブリンに結合する、固体支持体;および
(b) β2−ミクログロブリンを検出するために、該固体支持体を用いるための使用説明書
を含む、キット。 - 請求項18に記載のキットであって、ここで捕捉剤を含む前記固体支持体が、SELDIプローブである、キット。
- 請求項18に記載のキットであって、さらにβ2−ミクログロブリンの標準対照を含む、キット。
- ソフトウェアであって、以下:
a. サンプルに属するデータにアクセスするコードであって、該データが該サンプルにおける少なくとも一つのバイオマーカーの測定値を含み、ここで少なくとも一つのバイオマーカーが、β2−ミクログロブリンである、コード;および
b. 該サンプルの末梢性の動脈疾患の状態を、該測定値の関数として分類する分類アルゴリズムを実行するコード、
を含むソフトウェア。 - 被験体における末梢性の動脈疾患の状態を認定するための方法であって、以下:
(a) 該被験体由来の生物学的サンプル中のβ2−ミクログロブリンを測定する工程;および
(b) 該被験体の一つ以上の次に示す基準:C反応タンパク質レベル、総コレステロールレベル、トリグリセリドレベル、低密度脂質タンパク質レベル、高密度脂質タンパク質レベル、ホモシステインレベル、インターロイキンレベル、フィブリノーゲンレベル、リポタンパク質Aレベル、8−イソ−プロスタグランジンF2α(8−イソ−PGF2α)レベル、および可溶性Fasレベルをさらに測定する工程、そして
(c) 末梢性の動脈疾患の該測定値(a)および(b)を、末梢性の動脈疾患ではない測定値に対して、関連付ける工程、
を含む方法。 - 末梢性の動脈疾患を処置するための治療上のレジメンに対する被験体の応答を予測するためのデータを収集する方法であって、以下:
(a) 該被験体由来の生物学的サンプル中のβ2−ミクログロブリンを最初に測定する工程;そして
(b) 該最初の測定工程後の末梢性の動脈疾患を処置するための治療上のレジメンにおける最初の処置の後に、β2−ミクログロブリンの二回目の測定を行う工程;そして
(c) 該最初の測定値と二回目の測定値を比較する工程であって、ここで該β2−ミクログロブリンのレベルの減少が、該治療上のレジメンに対する被験体の応答の増加した可能性と相関する工程、を含む、
方法。 - 前記生物学的サンプル中で、β2−ミクログロブリンに加えて少なくとも1つのバイオマーカーを測定する工程を包含し、該少なくとも1つのバイオマーカーは、リゾチームおよびシスタチンCからなる群より選択される、請求項22または23に記載の方法。
- 請求項22または23に記載の方法であって、ここでβ2−ミクログロブリンの前記測定が、イムノアッセイを用いて実行される、方法。
- 請求項24に記載の方法であって、β2−ミクログロブリンおよび前記バイオマーカーの前記測定が、イムノアッセイを用いて実行される、方法。
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