JP2002541492A

JP2002541492A - ミラーコーティングされた光学導波管および流体セルの統合

Info

Publication number: JP2002541492A
Application number: JP2000611114A
Authority: JP
Inventors: フェルドスタイン、マーク、ジェイ．; ゴールデン、ジョエル、ピー．; リグラー、フランシス、エス．; ロー、クリス、エー．
Original assignee: US Government
Current assignee: US Government
Priority date: 1999-04-09
Filing date: 2000-03-22
Publication date: 2002-12-03
Also published as: KR20010113785A; US6192168B1; EP1183559A4; WO2000062105A9; CA2366490C; AU3906700A; KR100621947B1; IL145766A; WO2000062105A1; AU763236B2; EP1183559A1; IL145766A0; CA2366490A1

Abstract

(57)【要約】【解決手段】アッセイ用マルチモード導波管装置は、パターン化およびミラーコーティングされた表面（２２）を伴うマルチモード導波管（１２）を含む。このミラーコーティングされた導波管表面の露出部は、検体認識のためのものである。この導波管には、流体セル（１０）の１つまたは複数の流路（３０）がこの導波管表面の１つまたは複数の露出部と適合するよう、流体セル（１０）が取り付けられている。この１つまたは複数の流路（３０）は、この露出部または導波管表面の部分に、１つ以上の試料液体を導入する。蛍光アッセイ中の励起光および蛍光の損失と散乱は、前記ミラーコーティングにより最小化される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】

本発明は、導波型光波長変換によるアッセイに関し、より正確には、マルチモ
ード導波管で行われるアッセイに関する。

【０００２】

【従来の技術及び関連する技術】

この明細書を通して、この明細書で引用された全ての文献及び特許はあらゆる
目的での言及によりこの明細書に組み込まれるものとする。これまで、複数検体
センシングを目的として、アレー、およびこのアレーを制御する装置により、認
識分子を移動不能にする方法が多種報告されてきている。この用途に設計された
アレーバイオセンサーは、分子の固定方法および固定する分子のタイプにより、
２つのグループに分けられる。Ｆｏｄｏｒら（Ｆｏｄｏｒｅｔａｌ．，Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ，２５１７６７（１９９１））のアプローチでは、フォトリソグ
ラフの活性化により、ヌクレオチドまたはアミノ酸の１０２４素子高分子アレー
が構築される。これらの結合分子は比較的短く、あくまで半選択的である。この
ため、検出にはパターン認識が必要となる。このようなシステムは、多数の機能
または「適合件数」の同時検査が望まれる遺伝子検査や薬物検査で、広く使われ
るようになりつつある。第２のアプローチでは、抗体や比較的長い核酸ストラン
ドなどの完全に形成された分子を表面に付着させる（Ｒｏｗｅｅｔａｌ．，
Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７１：（２）４３３−４３９Ｊａｎ１５１９
９９；Ｃｏｎｒａｄｅｔａｌ．、ＵＳＰａｔｅｎｔ５，７３６，２５
７；Ｃｏｎｒａｄｅｔａｌ．，ＳＰＩＥ，２９７８，ｐ．１２（
１９９７）；Ｗａｄｋｉｎｓｅｔａｌ．，Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ &
Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ，１３，４０７（１９９８）；Ｍａｒｔｉ
ｎ et al., ＭｉｃｒｏＴｏｔａｌＡｎａｌｙｓｉｓＳｙｓｔｅｍｓ '
９８（ＫｌｕｗｅｒＡｃａｄｅｍｉｃＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｔｈｅ
ｒｌａｎｄｓ，１９９８）ｐ．２７）。結合が高度な特定性を持つため、単
一位置での検出イベントで識別が十分に可能となる。これらのシステムは、すで
に識別されている中程度の数（３−５００）の検体に関する検査を望むユーザに
とって、より関心が高いものである。

【０００３】これら２タイプのアレーを管理するための光学装置タイプもそれぞれ異なる。
多数の非常に小さい素子を分析するための計器は比較的高い解像度を必要とし、
通常、共焦点顕微鏡法に基づいている。多くの場合、これらの計器には、半選択
的素子応答を解釈するため、比較的高度な画像解析機能とパターン認識ソフトウ
ェアとが含まれている。これらの装置は研究室内での使用が想定されるため、サ
イズと重量は大きな問題ではない。ただし、第２タイプのアレーからの信号を検
出する計器は、可動性と低コストに重点が置かれる傾向にある（Ｗａｄｋｉｎｓ
ｅｔａｌ．，ｓｕｐｒａ；Ｌｉｇｌｅｒｅｔａｌ．，１９９８
；Ｈｅｒｒｏｎｅｔａｌ．，１９９６；Ｈｅｒｒｏｎｅｔａｌ．
，１９９７；Ｋａｔｅｒｋａｍｐ１９９７；Ｄｕｖｅｎｅｃｋｅｔ
ａｌ．，１９９５；ＤuｂｅｎｄｏｒｆｅｒａｎｄＫｕｎｚ１９９８
）。この場合は、装置より素子のサイズが強調される。ここで説明するアレーバ
イオセンサーは、むしろこの後者のカテゴリーに含まれ、ベッド側での臨床検査
や、屋外での環境モニターといった用途が想定される。

【０００４】光学的導波管は、可動的かつ低コストの計器において利点を持つ。このような
装置では、光学的導波管中を進む励起光は、導波管表面により定義されるインタ
フェースにおける全反射（ｔｏｔａｌｉｎｔｅｒｎａｌｒｅｆｌｅｃｔｉｏ
ｎ、略称ＴＩＲ）により導波管内に閉じ込められる。ＴＩＲは、限定された条件
下でのみ起り、波長、入射角、導波管の相対屈折率、周辺媒体など、複数の要因
に依存する（ＡＸＥＬＲＯＤＥＴＡＬ．，ＡＮＮ．ＲＥＶＢＩＯＰＨ
ＹＳ．ＢＩＯＥＮＧ．，１３，２４７（１９８４））。この周辺媒体は「
クラッディング（クラッディング）」と呼ばれ、ＴＩＲ実現のため、導波管より
低い屈折率を持たなければならない。

【０００５】機能的な観点から見たＴＩＲ周辺システムの設計は、このシステムの目標が導
波管内の単なる光閉じ込めにとどまらず、導波管表面の材料を調べる目的での、
インタフェースで発生する非放射性エバネッセント場の使用となった場合に、よ
り複雑になる。このタイプのセンサーの場合、透過深度ｄ_ｐの最大化により、エ
バネッセント場の強度を最適化することが非常に有益である。固定された屈折率
において、ある導波管およびクラッディングのペアが与えられた場合、エバネッ
セント場の透過深度は、光入射角が臨界角へ向かって低下するに伴い、増加する
。この関係はｄ_ｐ∝（（ｎ_２／ｎ_１）^２ｓｉｎ^２Φ−１）^−１／２により定義
される。ここで、Φは垂直面からの角度、ｎ_１およびｎ_２は、それぞれ周辺媒体
および導波管の屈折率で、ｎ_２>ｎ_１である（Ｌｏｖｅｅｔａｌ．，ＳＰ
ＩＥ，９９０，ｐ．１７５（１９８８））。ただし、ＴＩＲはスネルの法
則により臨界角を超えると起らない。ここで、ｓｉｎΦ_{ｃｒｉｔｉｃａｌ}＝ｎ_１／ｎ_２空気−ガラスインタフェースの臨界角は約４２°で、水−ガラスインタフ
ェースの臨界角は６７°である。

【０００６】このように、クラッディングを導波管に使用する場合、ＴＩＲによる光維持と
エバネッセント場の最大化には内在的な葛藤がある。これまでにも指摘されてい
るように、この葛藤は、導波管が光の閉じ込めだけでなく伝送にも使われる一方
、空気（ｎ＝１）または水（ｎ＝１．３３）などの低屈折率環境でエバネッセン
ト場の励起源またはセンサーとしても機能する場合に問題化する。空気〜水の範
囲の屈折率を持つ適切なクラッディング材料は現在知られていないため、空気中
でまたは水中でエバネッセント場を最大化し、かつＴＩＲによりクラッディング
で光を閉じ込めることは現時点で不可能である。

【０００７】この問題は、光学的閉じ込めとエバネッセント場透過深度との間に最適なバラ
ンスを得るよう設計された、テーパ導波管またはモノモード導波管の周囲にセン
サーを設けることにより、潜在的に解決される（Ａｎｄｅｒｓｏｎｅｔａｌ
．，Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ & Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ，８，ｐ
．２４９（１９９３）；Ａｎｄｅｒｓｏｎｅｔａｌ．，ＵＳＰ５，
４３０，８１３（１９９５）；Ｄｕｖｅｎｅｃｋｅｔａｌ．，Ｓｅｎｓ
ｏｒｓ & ＡｃｔｕａｔｏｒｓＢ，３８．３９，８８（１９９７））。
ただし、いくつかの理由により、センサーはマルチモード導波管に基づいて設計
することが望ましい。まず、マルチモード導波管は非常に単純かつ廉価で用意で
きる。例えば、本発明で使われる平面状の導波管は、質の高い汎用顕微鏡スライ
ドにもなりうる。一方、モノモード導波管は、典型的に真空蒸着などの精密フィ
ルム蒸着方法により形成される。このような処理を行う場合、特に許容誤差が数
十ナノメートルといった厳しい条件下では、導波管の作製は比較的高価になる。

【０００８】マルチモード導波管の第２の利点は、モノモード導波管と比べ、導波管への光
のカップリングが容易なことである。これを行うには、光ビームを導波管の開口
数内の角度で導波管の一端に入射すればよい。この条件下では、いったん光が導
波管に入ると、入射光はＴＩＲにより閉じ込められ、導かれる。さらに、マルチ
モード導波管が比較的大きな断面を持つことを考慮すれば、導波管端における入
射光の位置決めは、導波管へのカップリングを効率的に保ちながら、著しい可変
要素を持たせることができる。このように広い許容度を持つアラインメントは、
この分野で使われるシステムに理想的に適している。

【０００９】これと対照的に、モノモード導波管の場合は、最高でも数マイクロンの厚さし
かなく、導波管へ光を入射させる際、単純な導波管端からのカップリングは不可
能である。この場合のカップリングは、ダイオードレーザーの固有のマルチモー
ド出力により、さらに複雑になる。これは、マルチモードビームがモノモードレ
ーザービームのように細く絞れないためである。その代わり、モノモード導波管
へのカップリングは、一般に格子またはプリズムを使って行われる。しかし、ロ
バストで可動性のあるセンサーシステムを目指す場合、格子またはプリズム固有
の条件である角度アラインメントの精度が非常に要求され、モノモード導波管の
使用を困難にしている。

【００１０】導波管の２次元表面は、単一波長と励起源と蛍光プローブとだけを使った、複
数検体アレー素子の空間的パターン化および画像解析を可能にする。このアプロ
ーチは、単一素子内で異なる蛍光プローブの複数波長を解析するより、同時に測
定できる検体数の観点からも、複雑な光学の要件の観点からもより柔軟かつ単純
になる。この目的で、空間的にパターン化されたセンサー素子を形成する方法と
、多数の素子からの信号を測定する手段が開発された。

【００１１】解析装置のもう１つの望ましい機能である複数試料処理には、多数の液体接続
が必要であり、このコネクタのデザインはいくつか提案されている（Ｍｏｕｒｌ
ａｓｅｔａｌ．，ＭｉｃｒｏＴｏｔａｌＡｎａｌｙｓｉｓＳｙｓｔｅ
ｍｓ '９８（ＫｌｕｗｅｒＡｃａｄｅｍｉｃＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎ
ｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，１９９８）ｐ．２７）。まず、液体の操作、および
試料と試薬の導波管への導入は、センサーサイズを最小限度に押さえながら達成
しなければならない。また、ユーザがセンサー素子を取り替えて追加資料を分析
する場合にこの作業を容易にするには、迅速かつ単純に水密性の付着を実現する
必要がある。このため、マウンティングブラケットを導波管−フローセルの組合
せに取り付ける手段が開発された。

【００１２】導波管の選択は、多数のパターン化方法および流体工学方法に影響を及ぼすが
、システム開発は改善の繰り返し工程であり、流体工学に関する選択は導波管の
設計にフィードバックされる。具体的には、励起光閉じ込めに摂動を及ぼさず、
かつ空気中または水中のエバネッセント場を最適化しながら、流体セルを導波管
に取り付けるというのが、解決しなければならない課題である。

【００１３】

【発明が解決しようとする課題及び手段】

前記に基づき、本発明の目的は、流体セルが導波管内を進む光に及ぼす摂動が
皆無、無視できる程度、または最小限度であり、その結果、導波管表面で光学測
定を行えるアッセイシステムが実現され、流体セル（フローチャンバまたはフロ
ーセルとも呼ばれる）との組合せが可能なマルチモード導波管を提供することで
ある。

【００１４】本発明の他の目的は、導波管表面での複数検体および複数試料の同時アッセイ
に適用可能な、導波管ベースのアッセイシステムを提供することである。このシ
ステムが導波管内を進む光に及ぼす摂動は、皆無、無視できる程度、または最小
限度である。

【００１５】本発明のさらに異なる他の目的は、生物学的、化学的、および物理的な反応性
分子によりパターン化された導波管表面を有する、効率的な導波管ベースのアッ
セイシステムの製造技術を開発することである。

【００１６】本発明の前記目的および他の目的は、マルチモード導波管の表面にパターン化
されたミラーコーティングを提供することにより実現される。このパターン化に
より、光学的に露出した領域と反射性を持つ領域とを有する導波管表面が作られ
る。この光学的に露出した領域は、検体への反応性を持ち、後続的に呈示される
試料のうち少なくとも１つの検体と直接的または間接的に相互作用することがで
きるため、試料中の検体の存在に相関する検出可能な信号を提供できる。典型的
に、この検体反応性は、塩濃度の低い溶液を使うことにより、生体的、化学的、
または物理的な感度を持つ認識種を導波管表面に付着させることにより達成され
る。

【００１７】次に、この導波管は、光学的に露出した領域上に液体試料（気体または液体）
を流し込むための流路を少なくとも１つ含んだ流体セルと組み合わされる。この
導波管および流体セルは、別個の複数試料流路を介した複数資料分析用に設計が
可能である。また、光学的に露出した領域内で、この光学的に露出した領域によ
り、単一試料中の複数検体の認識を可能にする重複しない別個の複数エリア用に
も設計可能である（試料中の異なる検体同士を区別する必要がない場合、検体用
の検出エリアは重複が可能）。これらの２つのオプションを組み合わせれば、複
数試料処理と複数検体検出の両方を同時に実現することもできる。本明細書およ
び添付図で示し、説明する実施形態において、前記流体セルは、事前に反射性ク
ラッディングでコーティングされた導波管領域に、排他的にまたはほぼ排他的に
取り付けられる（これらの実施形態では、一部重複もありえる。これはステンシ
ルベースのパターン化技術の制限による）。

【００１８】

【発明の実施の形態】

本発明における導波管は、円柱形（ロッド形など）や平面形など、いかなる形
状も取ることができる。典型的に、本発明に使う導波管は平面状である。この導
波管は、励起波長と、１つまたは複数の信号波長との双方で光を伝送するもので
あれば、どのような材料で作られていてもよい。典型的に、この導波管は無機ガ
ラス、または高分子などの固体（ポリスチレンなどのプラスティック等）で作ら
れる。この導波管はマルチモードで、単一モードの導波管と比べ、一般に低コス
トで単純なカップリングを可能にする。

【００１９】ミラーコーティングは、励起波長で光を反射するものであれば、どのような材
料で作られていてもよい。典型的に、このミラーコーティングは、アルミニウム
、銀、金、クロム、プラチナ、ロジウム、またはこれらの混合物などの反射性金
属を含む。比較的一般的に使われる反射性金属材料は、アルミニウム、銀、また
は金である。また、このミラーコーティングは多層ダイクロイック（二色性）ミ
ラーであってもよい。導波管へのミラーコーティングの結合は、ミラーコーティ
ングに反射層を含む多層構造（前記の反射性金属またはダイクロイックミラーな
どが可能）を採用し、反射層と導波管との間に結合層を設けることでより強化さ
れる。この結合層は、導波管表面と反射層との間の直接結合の場合と比較して接
着性を増すよう選択される。この結合層は、励起光の散乱または吸収が最小限ま
たは皆無であるよう選択されることが好ましい。結合層に使われる典型的な材料
には、クロム、プラチナ、ロジウム、誘電体、シラン（特にチオールシラン）、
シアノアクリレート、高分子、またはこれらの混合物などがある。必要に応じ、
反射層を化学的または機械的な損傷から守るため、反射層の外面（それ自体また
は結合層とともに多層構造の一部として使用）に保護コーティングを使ってもよ
い。この保護コーティングに使われる典型的な材料には、クロム、プラチナ、ロ
ジウム、誘電体、高分子、またはこれらの混合物などがある。

【００２０】ミラーコーティングは、どのような方法で導波管表面に施されてもよい。ガラ
スまたはプラスティック基板上におけるパターン化金属または他のミラーコーテ
ィングに使われる典型的な方法には、ミラーコーティング用のマスクをかけた真
空蒸着、フォトリソグラフィ、化学蒸着などがある。多層構造としてのミラーコ
ーティングを提供するには、同一または同様の工程を使うことができる。

【００２１】パターン化された導波管表面の光学的に露出した領域は、光学的に露出した領
域と、少なくとも１つの分析対象検体との直接的または間接的な相互作用が、こ
の光学的に露出した領域を変化させるよう、少なくとも１つの分析対象検体に対
し感度（すなわち反応性）を持つ。この変化は、導波管へ向かう光波を生成する
エバネッセント場を生じさせることにより、直接的または間接的に検出できる。
例えば、導波管の光学的に露出した領域の表面は、検体への反応により吸収また
は発光の変化が生じる層でコーティングを行うことにより、少なくとも１つの分
析対象検体に対し感度を持つようにすることが可能である。あるいは、生体分子
認識種でのコーティングにより、光学的に露出した領域の表面に、１つの分析対
象検体に対する感度を持たせることもできる。

【００２２】生体分子認識種の付着またはコーティングにより、導波管表面の光学的に露出
した領域が検体に対し感度を持つ場合、典型的な生体分子認識種は、タンパク質
（抗体、抗生物質、抗体検体に対する抗原ターゲット、細胞レセプタタンパク質
など）、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡなど）、細胞、または細胞片である。

【００２３】光学的に露出した領域に検体反応性を持たせるには、生体分子認識種を付着さ
せる以外の手段も使える。例えば、表面の光学的に露出したエリアを、検体、ま
たは１つ以上の追加ラベルと組み合わせた検体への露出時に光応答差を呈するド
ープ高分子、非ドープ高分子、ドープゾルゲル、または非ドープゾルゲルでコー
ティングすることもできる。このような非生体分子認識種の一例は、ＭａｃＣｒ
ａｉｔｈ，ＢＤ，ＳｅｎｓｏｒｓａｎｄＡｃｔｕａｔｏｒｓＢ．，
２９：（１−３）５１−５７Ｏｃｔ１９９５に提供されている。

【００２４】検体反応性の実現方法にかかわらず、このラベルは典型的に発光性ラベル（蛍
光性ラベルや燐光性ラベルなど）である。サンドイッチアッセイが望ましい場合
、ラベルされた２次分子種は、結合された検体、または固定された生体分子認識
種／固定された検体の複合体で、分子結合サイトを認識するものであれば、どの
ラベルされた種でも使用できる。

【００２５】光学的に露出した領域の表面が生体分子認識種でコーティングされている場合
は、競合アッセイ（ラベルされた検体と、ラベルされていない検体とが、オープ
ンな結合サイトを求めて競合する）、置換アッセイ（ラベルされていない試料検
体が、事前に結合およびラベルされた検体で飽和された導波管上の、結合および
ラベルされた検体または生体分子認識種を分離する）、またはサンドイッチアッ
セイ（導波管表面で、試料検体が生体分子の１次認識種と、固定された検体、ま
たは固定された検体／１次分子種の複合体に結合するラベルされた２次分子種と
に結合する）のいずれか、あるいは他の任意タイプの生体親和力アッセイまたは
化学的アッセイを採用することができる。

【００２６】一般に、全体的な厚みを軽減し、非反射層からの潜在的な散乱を最小化するに
は、ミラーコーティングと、導波管と任意の複合ミラーコーティング反射層との
間のすべての構成層と、その副構成要素（導波管と反射層との結合（結合層）、
励起光の反射（反射層））とを、コーティング（導波管に結合されたミラーコー
ティング）全体に意図された目的に必要な最低限の厚さに保つことが最適である
。ミラーコーティングと流体セルとの間の２つの接着層の厚さと、保護層の厚さ
とは光学的に重要ではないため、これらの層には有用な任意の厚さを採用して構
わない。

【００２７】生体親和力アッセイ用の導波管が望ましい場合、生体分子認識種の付着前にミ
ラーコーティングが施されるのであれば、特定の処置を行うことにより、ミラー
コーティング部分の強度を維持できる条件下で、導波管表面の光学的に露出した
導波管領域に、確実に生体分子認識種を固定することができる。生体分子認識種
を表面へ付着させる典型的な方法には、共有結合、物理吸着、ビオチン−アビジ
ン結合（Ｒｏｗｅ，ｓｕｐｒａを参照）、またはチオールを末端に持つシラン
またはヘテロ二官能価のクロスリンカーでの表面変性（Ｅｉｇｌｅｒｅｔａ
ｌ．（ｓｉｃ），ＵＳＰ５，０７７，２１０、１９９１年１２月３１日発行
）などがある。

【００２８】前記のように、導波管表面に分子認識サイトを取り付けるためのプロトコルは
、すべて層間剥離その他のミラーコーティングの破壊的変性を回避するものでな
ければならない。ビオチン−アビジン方法およびチオールシラン方法では、ミラ
ーコーティングの層間剥離および破壊的変性を防止するため、生体分子認識種の
付着中、ミラーコーティングに接触させる溶液の塩濃度は、典型的にすべて生理
食塩濃度を著しく下回るものでなければならない（生理食塩濃度は典型的に約１
５０ｍＭである）。通常、導波管の光学的に露出した１つまたは複数の領域への
生体分子認識種の付着に使われる塩濃度は、生理食塩濃度の約半分未満である（
すなわち、約７５ｍＭ未満）。より一般的には、導波管の光学的に露出した１つ
または複数の領域への生体分子認識種の付着に使われる塩濃度は、生理食塩濃度
の約１３分の１〜約半分である（すなわち、約５ｍＭ〜約７５ｍＭ）。さらによ
り一般的には、導波管の光学的に露出した１つまたは複数の領域への生体分子認
識種の付着に使われる塩濃度は、生理食塩濃度の約１３分の１〜約８分の１であ
る（すなわち、約５ｍＭ〜約１９ｍＭ）。塩濃度が高すぎると、層間剥離が起る
。塩濃度が低すぎると、分子結合種がその機能性を失う場合がある。与えられた
任意の塩濃度において、層間剥離の度合いは、付着の化学変化を低温（言うまで
もなく、凍結温度以上）で行うことにより、軽減できる可能性がある。ただし、
化学的付着を低温で行うと、それだけ生体分子認識種が導波管表面へ結合するた
めに必要な時間も長くなる。結合時間が長くなると、結果的にミラーコーティン
グされた表面がより長時間バッファ溶液に露出されることになるため、ある程度
を超えると低温の利点が相殺されてしまう。典型的に、生体分子認識種の導波管
表面への結合は、その大部分が室温〜約４℃の範囲で行われている。

【００２９】分子種を導波管表面へ付着させるためにミラーコーティングがバッファ溶液に
晒される時間は、導波管表面上に有益な検出媒体を提供するために必要最低限の
長さでなければならない。究極的に、生体分子認識種の機能性を維持するに十分
な塩濃度を保った状態での、有益な付着に十分な時間と層間剥離防止（すなわち
、塩分への露出制限）とのバランスは、前記のガイドラインと以下の例とに基づ
いて、経験的に決定することができる。

【００３０】上記で説明した、パターン化された導波管へ認識種を付着させる技術において
、前記認識種は、副次的な結果として、ミラーコーティングへ付着される場合も
ある。しかし、ミラーコーティングは流体セルで覆われ、光学的に何の機能も持
たないため、この付着は一般に何ら問題を生じない。特に認識種が高価であるな
ど一部の場合には、導波管表面の光学的に露出した領域だけに分子認識分子を付
着させるため、スタンピングやインクジェット印刷など、他の分子パターン化技
術を採用することが有益なこともある。金属層をバッファ塩へ露出しないパター
ン化技術を利用する場合は、露出時間およびバッファ塩濃度の修正が不要になる
。

【００３１】流体セルは、液体試料と適合するいかなる材料で作製してもよい。典型的に、
流体セルはポリメタクリル酸メチル、ポリカーボネート、またはポリスチレンな
どの高分子で作られる。流体セルは、導波管のミラーコーティングされた部分と
の間に水密性の密着部を形成できる必要がある。その際、接着剤は使用してもし
なくてもよい。流体セルは、剛性体、弾性体のどちらでも、また単一材料、複合
構造、多層構造のいずれでできていてもよい。接着剤を使わず、圧力により導波
管に付着する流体セルの場合、導波管のミラーコーティングされた部分に接触す
る流体セルの表面は、水密性の密着部の形成を促す観点から、弾性を持っていた
方が有利である。流体セルが接着剤で導波管のミラーコーティングに付着する場
合、その接着剤は流体セル、ミラーコーティング、および液体試料とそれぞれ適
合する必要がある。また、接着剤は、導波管の光学的に露出した部分にコーティ
ングされるすべての認識種と適合する溶剤を持ち、そのような認識種と不適合な
処理（加熱など）が不要なものを選択することが有益である。

【００３２】本発明では、導波管の光伝播特性に光学的に著しい摂動を及ぼすことなく、導
波型光波長変換によるアッセイに使われる、他の構成要素（光学素子（光源、検
出器、レンズ、フィルタなど）、機械素子（搭載機器、ポンプ、バルブなど）、
および電子素子（トランジスタ、集積回路、ディスプレイなど））を導波管に取
り付けることが可能である。このような構成要素、またはこのような構成要素の
１つ以上の搭載機器を、反射性を持つクラッディングを施した領域、または導波
管表面の領域に取り付けることにより（搭載機器または他の構成要素を接着剤で
取り付けるなど）、取り付けられた構成要素による追加機能性が得られる一方、
導波管の光学特性は実質的に摂動を受けずに済む。これらの追加構成要素は、流
体セルおよび導波管、またはそのいずれかに取り付けることができる。

【００３３】図ｌａは、流体セル１０を従来の導波管１２へ取り付けたことによる摂動効果
を、導波管から流体セル１０への励起光１６のカップリング（出）１４として示
している。このカップリング（出）１４がさらに及ぼす悪影響は、図ｌｂに示す
ように、導波管表面で光学測定を行うために利用可能な励起強度が著しく損失さ
れることである。具体的には、励起光１６は、いったん流体セル１０に入ると、
図ｌｂの矢印のように検出器素子方向を含む全方向へ散乱するため、画像アレー
１８における光学的背景およびノイズを増やす結果を招く。この光学的背景とノ
イズの増加により、導波管の表面１２で行われる全測定の最終的な感度が制限さ
れる。

【００３４】図２は、パターン化されたミラーコーティングを有する導波管に取り付けられ
た流体セル１０の、実際の縮尺とは異なる断面図である。導波管２０は、その上
面にパターン化されたミラーコーティング２２を含み、残りが光学的に露出した
領域２４となる。流体セル１０の底面２６の内部には、凹部２８が形成されてい
る。これらの凹部は、液体流路３０を形成している導波管２０上面の光学的に露
出した領域２４により、部分的に拘束されている。各液体流路３０は試料導入ポ
ート３２を持つ（図５）。各液体流路３０は互いに独立であるため（液体流路３
０間では、流体セル１０の底面２６がミラーコーティング２２、または底面２６
とミラーコーティング２２との間の接着剤と密閉部を形成する）、複数の試料を
同時に分析できる。

【００３５】図３は、本発明に係る装置の側面図（実際の縮尺とは異なる）で、本発明がど
のようにエバネッセント波励起を使ったアッセイを改善しているか示している。
流体セル１０の取付け後、励起光１６は導波管１０内で維持されるようになる。
これは、流体セル１０の接触点と適合するようパターン化されたミラーコーティ
ング２２が、流体セル１０への光のカップリング（出）を取り除くためである。
この方法を使うと、流体セル１０を導波管へ取り付けたのち、流体セル１０内の
流路を通じて流し込んだ試料への露出前、露出中、露出後の光学測定が可能にな
る。

【００３６】図４は、本発明に係る装置の、実際の縮尺とは異なる側面図であり、図２に示
したミラーコーティング２２（本明細書では、一部で反射性クラッディングとも
呼ばれる）の典型的な実施形態をより詳細に示している。この実施形態では、ミ
ラーコーティング２２は、結合層１００と、反射層１０２と、保護層１０４とを
含む多層構造をなしている。

【００３７】図５（これも実際の縮尺とは異なる）は、図１に示した組立て済み装置断面の
上面図である。分子認識分子の縞４０〜５０は、導波管の表面１２の幅に沿って
延び、ミラーコーティングされた領域および光学的に露出した領域にまたがる。
縞４０〜５０は、同じ検体用の生体分子認識種の縞であっても、異なる検体用の
分子種の縞であってもよい。縞４０〜５０が異なる抗体用の分子種の縞である場
合、本発明は異なる検体の同時アッセイを可能にする。取り付けられた流体セル
１０は、パターン化されたミラーコーティング（流体セル１０の背面に位置し、
図中では見えない）を覆っている。導波管１２の露出した領域２４とともに、流
体セル１０は流路３０を形成する。各流路３０は別個の試料導入ポート６５を含
むことができる。このようにして、図５の実施形態では、異なる検体が６つある
場合に、６つの異なる試料を同時にアッセイにかけることができる。

【００３８】図１は、流体セルではなく装置８０を取り付けることにより、ミラーコーティ
ングが導波管中の光の摂動を防ぐ働きをする、本発明の実施形態を示したもので
ある。この実施形態では、導波管８４上のミラーコーティング８２に装置８０が
取り付けられ、導波管８４中を進む光への摂動を防いでいる。装置８０は、機械
素子の搭載機器（搭載機器（取付け穴８６付き）、ポンプ、バルブなど）、光学
素子（光源、検出器、レンズ、フィルタなど）、電子素子（トランジスタ、集積
回路、ディスプレイなど）のいずれであっても、またはその組合せであってもよ
い。装置８０は、流体セルと併用しても、流体セルの代りに使用してもよい。

【００３９】上記の説明を受け、以降では、本発明の最良の形態を含む本発明の具体的な応
用例を説明する。ただし、これらの具体例は、本発明の範囲および要旨をこれら
の応用例に限定するものではない。

【００４０】

【実施例】

Ｉ．計測と方法Ａ．流体工学１．物理的に孤立したパターン化（ＰｈｙｓｉｃａｌｌｙＩｓｏｌａｔｅｄ
Ｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ、略称ＰＩＰ）物理的に孤立したパターン化（ＰＩＰ）法は、認識素子のアレーを生成するた
めに開発および使用されてきている。各認識素子は約１ｍｍ^２で、平面状導波管
複数検体センサー１００上に配列される。図７ａおよび図７ｂは、ＰＩＰ工程の
基本ステップを示している。まず、複数流路パターン化フローセル１０２が、上
記の説明どおりに機能化された導波管１００の表面上に置かれる（Ｒｏｗｅｅ
ｔａｌ．，ｓｕｐｒａ）。次に、認識種（この場合、抗体）が適切な流路１
０４へ導入される。この際、各流路１０４は別個の認識分子を含む。インキュベ
ーション期間の経過後、適切な洗浄を経て、垂直に配置された異なる認識種の列
１０６が導波管１００の表面にパターン化された（図７ｂ）。パターン化された
素子１０６と垂直に配列された複数流路アッセイセル１０８と組み合わせて使う
ことにより（図８ａ）、センサー表面は直方形認識素子の２次元アレーになる（
図８ｂ）。

【００４１】ＰＩＰ法の開発および実施では、０．７５ｍｍ〜１．５ｍｍの幅を持つ６つ以
上の並列流路（Ｒｏｗｅｅｔａｌ．，ｓｕｐｒａ）からなるカスタム設計
およびカスタム成形されたフローセルが採用されている。これらのセルは、成形
能力と３次元構造再現性で知られているエラストマーである、ポリジメチルシロ
キサン（ＰＤＭＳ）（ＮｕＳｉｌＳｉｌｉｃｏｎｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）
から作られている。ＰＤＭＳは、いったん硬化すると高度に不活性にもなる。抗
体と抗原は、ＰＤＭＳへの露出中、劣化しない（Ｌｅｓｌｉｅｅｔａｌ．，
ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，（１
９９８投稿））。さらに、ＰＤＭＳの弾性と疎水性により、中程度の圧力を加え
るだけで、水密性の密着部が一時的に形成される。

【００４２】２．アッセイフローセル複数試料機能を複数検体認識素子に加えるため、６〜８個の試料流路を持つア
ッセイフローセルが導波管表面に取り付けられた。図８ｂに示すように、アッセ
イフローセル１０８は、垂直に配置された認識素子の列１０６に垂直に配列され
る。この結果、各アッセイ流路で独立した複数検体アッセイを行うためグループ
化された、認識素子の２次元アレーが形成される。

【００４３】この装置の常駐アッセイフローセルは、厚さ６．４ｍｍのＰＭＭＡから作られ
ている。これらのセルは、６つの独立した試料用に６つの独立した流路を含んで
おり、ＣＮＣミリング工程を使って機械加工されている。圧力に感度を持つ薄い
（２５０μｍ）接着層（３Ｍ、＃９４７３）がセルの底面に組み込まれており、
パターン化されたガラス導波管とアッセイ液体流路との間に永久的な密着部を形
成する目的で使われている。ＭａｓｔｅｒｂｏｎｄＥＰ３ＯやＥＰ２ＩＬＶな
ど、他の接着剤も、フローセルを導波管に密着させるために使われている。注入
ポートと排出ポートはフローセルの上面にフライス加工されており、各流路が独
立に試料および試薬に接続できるようになっている。

【００４４】これらの例で使われるバルブおよびポンプは、既成の市販用構成部品で、コン
ピュータインタフェースを通じてアッセイプロトコルを自動操作する。このシス
テム構成は、その概略が示されている図９のように、モジュラマルチポジション
バルブ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＶＰ）と８流路蠕動ポンプ（Ｉｓｍａｔｉｃ，
ＩＰＣ−８）とを利用している。このシステムは、精密なタイミング制御を可
能にする高レベルのプログラミング環境を使い、ホストコンピュータから直接操
作するよう開発されている（ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｌ
ａｂＷｉｎｄｏｗｓ(「Ｗｉｎｄｏｗｓ」は登録商標)）。この制御ソフトウェア
は、画像取得およびデータ分析用プログラミングに、完全に統合することができ
る。さらに、プログラミングの修正と調節は、必要に合わせてユーザ側で行うこ
とが可能である。この柔軟性により、このシステムは多数の流体工学的手続きを
、個々のニーズに即対応可能にしている。

【００４５】現システムにおける自動供給システムと常駐フローセル３００との間の液体接
続は、圧入式適合部３０４のマニホールド３０２と、ネオプレンガスケットとを
使って、液体と、フローセル３００内の注入ポート（３０６）および排出ポート
（３０８）との間にそれぞれ密閉部を形成することにより実現される。この形式
は、センサーサイズを著しく増加させない迅速簡易な接続方法である。６流路分
析ユニットを置き換える際に必要なステップは、フローセル３００のボルト穴３
１２へ差し込まれる４つの並目ネジボルト３１０を調節し、液体クイックコネク
タ３１４を９０°回転させることだけである。

【００４６】Ｂ．導波管クラッディング１．導波管の絶縁導波管表面へのフローセル取付けは、観測される信号の強度を著しく弱め、実
質的に装置のパフォーマンスと感度を損なってしまう。感度の低下を起こす2つ
の要因は、前記の説明の通り、図１ａと図１ｂにその概略が示されている。

【００４７】複数流路フローセルを導波管に取り付け、かつ前記の効果を最小化するため、
励起光を閉じ込め、導くためのＴＩＲの代替案が追求された。具体的には、導波
管表面上の領域を選択するため、反射性金属鏡を適用した表面反射が使われた。
これにより、光は完全に導波管内に閉じ込められ、流体学的構成要素が取り付け
られたインタフェースにおいて入射角に独立となる。

【００４８】この光学的絶縁を達成するために使われる銀ベースのクラッディングは、背面
反射鏡デザインに基づいており、３層からなる（ＯｐｔｉｃｏａｔＡｓｓｏｃ
ｉａｔｅｓ，ＰｒｏｔｅｃｔｅｄＳｉｌｖｅｒ）。まず、透明な誘電体フィ
ルムが導波管表面に適用されることにより、第２層である銀フィルムの接着を強
化する。銀自体のガラスへの接着力は非常に小さく、容易に層間剥離が起こって
しまう。最外層である第３層は薄いクロムフィルムで、これは銀反射体^注釈１（
注釈１：前面鏡の場合、これらの層の順序は一般に逆転し、接着を強化するには
クロムが使われる。ただし、クロムの下地層は導波管の光学的スループットを著
しく減少させ、この応用には適さなかった。）の保護層として機能する。

【００４９】銀クラッディングのパターンは、６流路フローセルが導波管と接触するエリア
を覆う。コーティングされていない残りの導波管表面は、光波長変換による免疫
アッセイ（図５）に適している。ここでは、３層クラッディングの真空蒸着中、
平面状導波管表面の下に置くと、導波管表面に部分的に影を作り、選択されたエ
リアのみ蒸着材料でコーティングして、ステンシルのように機能する物理的マス
クが構築された。

【００５０】固定工程中の安定性ここで重要になる要因は、導波管の光学的表面をセンサー素子に作り変えるた
めに必要な、クラッディングと処理条件の適合性である。例えば、表面は、シラ
ン、クロスリンカー、アビジン、および各種タンパク質を含む種で誘電体化され
ている。高度な反射性を持つ銀クラッディングおよびアルミニウムクラッディン
グは、効果的な光学的クラッディング材料であることが知られているが、リン酸
でバッファされた生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒｅｄｓａｌ
ｉｎｅ、略称ＰＢＳ）やトリスでバッファされた生理食塩水（ｔｒｉｓｂｕｆ
ｆｅｒｅｄｓａｌｉｎｅ、略称ＴＢＳ）など、認識分子のパターン化に使われ
る標準的生物バッファでは不安定であった。

【００５１】抗体固定プロトコル（Ｒｏｗｅｅｔａｌ．，ｓｕｐｒａ）は、導波管上
に抗体の活性アレーを生成しつつ、クラッディング層^注釈２（注釈２：導波管へ
の固定は、反射性クラッディングと適合性を保ちつつ、その層間剥離を起こさな
いよう、修正した標準プロトコルを使って、すでに公開された手続き（Ｒｏｗｅ
ｅｔａｌ．ｓｕｐｒａ；Ｂｈａｔｉａｅｔａｌ．ｓｕｐｒａ）と
比較しながら行われた。具体的には、銀−クラッド導波管を無水トルエン中の２
パーセント３−メルカトプロピルトリメトキシシランに１時間露出することによ
り、ガラス表面上にチオールシラン層が作成された。これは、より長いインキュ
ベーションを必要とする公開済みプロトコルと対照的である。ヘテロ二官能価の
クロスリンカー、ＧＭＢＳ（０．２９ｍｇ／ｍＩ）のエタノール溶液が、シラン
処理済の導波管で３０分間インキュベートされた。最後に、ＧＭＢＳ処理された
導波管を１時間１０ｍＭＮａリン酸塩、１０ｍＭＮａＣＩ（ｐＨ７．０）
中の１００μｇ／ｍｌＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎでインキュベートすることによ
り、ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎが共有結合で表面に固定された。この１時間のイン
キュベーション期間と低塩濃度は、ＰＢＳで一晩インキュベーションを必要とす
る公開済みプロトコルと対照的である。ビオチンでラベルされたラビット坑ＳＥ
ＢＩｇＧは、１０ｍＭリン酸ナトリウム／１０ｍＭＮａＣｌ／Ｏ．０５％
Ｔｗｅｅｎ２０中の２０μｇ／ｍｌ溶液を使って、一晩のパターン化工程によ
り、ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎでコーティングされた表面上にパターン化された。
このステップおよびＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎの付着に使われたバッファは、標準
ＰＢＳベースのバッファを必要とする公開済みプロトコルを修正したものである
。

【００５２】前記の説明に従い、アッセイが抗体によりパターン化された導波管で行われた
（Ｒｏｗｅｅｔａｌ．，ｓｕｐｒａ）。まず、センサー表面が０．０５％
Ｔｗｅｅｎ２０と１ｍｇ／ｍｌＢＳＡ（ＰＢＳＴＢ）を含む１ｍｌのＰＢ
Ｓで洗浄された。次に、ＰＢＳＴＢ中の濃度１００ｎｇ／ｍｌおよび５００ｎｇ
／ｍｌを含む試料に、導波管が１０分間露出された。スライドの洗浄後、蛍光的
にラベルされた坑ＳＥＢ（ＰＢＳＴＢ中２０μｇ／ｍｌ）で導波管が３分間イン
キュベートされ、その後最終洗浄が行われた。）の層間剥離を起こさないよう、
変更された。具体的には、免疫アッセイ前に行われるすべての処理ステップにお
いて、低イオン強度のバッファが使われた。また、さらにクラッディング層の層
間剥離を防ぐため、これらの処理ステップは、１／２〜１／１４の割合で時間的
に短縮された。

【００５３】Ｃ．光学システム１．導波管の励起導波管表面は、導波管へのカップリングを最適化し、導波管中の励起均一性を
最大化するために調整された出力を持つダイオードレーザーを使って、光学的に
調べられた。図１０に示すように、６３５ｎｍダイオードレーザー４００からの
ビームは、広げられて導波管３１０（標準的な顕微鏡用スライド）の端へ入射さ
れ、導波管３１０の横幅全体を一様に照射している。単純なラインジェネレータ
（図示せず）が均一な横方向の励起を提供し、２０パーセント内で横方向の均一
性をもたらしている。円柱形レンズ５０２（図１１）は、導波管内の伝播および
分布領域５０４と併合されて、センサー領域５０６で均一な縦方向の励起を提供
した。図１１に示すように、この均一性は、光学的ビームが最も近い導波管端に
入射されたのち発散し、センサー領域に達する前に導波管内で広がった結果生じ
たものである。この方法による、導波管内で均一に分布した光の生成は、これま
での方法に比べ、円柱形レンズと内部伝播領域を応用したユニークな例である（
Ｈｅｒｒｏｎ，ｅｔａｌ．（１９９７））。

【００５４】Ｄ．画像化システム検出アッセイから得られた蛍光パターンを調べるため、小型画像化システムに
より蛍光アレー素子の空間的配向が記録された（図１０）。具体的には、エバネ
ッセント状に励起された蛍光パターンが、熱電的に冷却された大面積の電荷結合
素子（ＣＣＤ）画像アレー４０２上に画像化された（ＳｐｅｃｔｒａＳｏｕｒ
ｃｅ，Ｔｅｌｅｒｉｓ）。冷却されたこの画像化システムは、室温画像化シス
テムより低く安定した電子背景を持つ。６７０ｎｍバンドパスフィルタ（Ｃｏｒ
ｉｏｎ）および６６５ｎｍロングパスフィルタ（ＳｃｈｏｔｔＧｌａｓｓ）が
、効率的に散乱励起光を落している。非反転２次元グレーテッドインデックス型
（ＧＲＩＮ）レンズアレー（ニッポン板硝子）４０４は、蛍光画像をＣＣＤに１
：１で焦点合わせしている（Ｇｏｌｄｅｎ，ＵＳＰ５，８２７，７４８（１
９９８））。

【００５５】光学的マウンティングシステムにより、導波管インストールと、励起アライン
メントと、画像取得とが容易になった。焦点を容易に調整および固定（アンカー
）するため、ＧＲＩＮレンズアレー４０４および放射フィルタ４０６が、調整可
能なアラインメント支持部の内部に搭載された（図示せず）。この支持部のアル
ミニウム製上部プレートは、導波管と同形状で、表面に機械加工された１ｍｍの
凹部を持ち、この凹部の一端に、蛍光アレーの画像化用に設けられた１インチ平
方の開口部を持つ。これらの導波管は、この凹部に容易に挿入でき、またこの凹
部から容易に取り外せる。ダイオードレーザー４００は、励起ビームが高い再現
性で導波管へ入射および画像化されるよう、前記支持部に比べて永久的に取り付
けられている。前記上部プレートおよびＧＲＩＮレンズアレー４０４支持部がい
ったん固定（アンカー）されると、センサー表面の画像化前の光学的調整が不要
になった。

【００５６】ＩＩ．結果および考察Ａ．流体工学１.アッセイフローセル常駐フローセルの主な利点は、複数試料の同時処理機能だけでなく、センサー
素子を独立した単一ユニットとして使えることである。一度フローセルを取り付
けると、ユーザ操作またはアラインメントは不要になる。また、パターン化され
た表面がフローセルにより保護されるため、保管中の汚染および損傷を防ぐこと
ができる。フローセルは永久的に密着されるため、ＣＣＤデータ取得システムで
画像処理を行っている間も容易にアッセイを行うことができる。このシステムに
より、アッセイ前およびアッセイ中に、正確で空間的に分解された背景を記録す
ることができる。最後に、大部分のアッセイでは、単一ユニットは連続的である
。他のアッセイ（サンドイッチアッセイなど）では、単一ユニットは正の試料結
果が検出されるまで使用される。

【００５７】Ｂ．導波管クラッディング修正された固定条件を採用したため、銀またはアルミニウムのクラッディング
の層間剥離を起こさずに、抗体を導波管へ付着させ、生物的構成要素の活動へも
弊害が生じることなく光学的免疫アッセイを行うことが可能になった。さらに、
クラッディングおよび生化学的レセプタがまったく損傷を受けないため、蛍光免
疫アッセイの信号損失が無視できる範囲内で、フローセルを導波管表面へ取り付
けることができた。

【００５８】銀クラッディングは可視光の完全な反射体ではないため、導波管内の一部の光
は吸収または散乱により失われる。このような導波管を、同一の励起および検出
条件下で、同様だがクラッドなしの導波管と光学的スループットについて比較し
たところ、銀クラッディングの蒸着後には、励起強度との相対損失が約２５パー
セントになることがわかった（本明細書ではこのデータは示さず）。ただし以下
の説明のように、クラッディングを利用することにより、フローセル取付けによ
る蛍光免疫アッセイでの信号損失に関する、クラッド付き導波管とクラッドなし
導波管の違いが明らかに示された。さらに、銀クラッディングは、他の金属クラ
ッディングより光学的スループットが高いため、比較的有利である。例えば、ア
ルミニウムクラッディングでは、励起光の５０パーセントが失われている。プラ
チナは標準的な免疫化学処理条件に耐えうるが、２５パーセント以下の励起光し
か伝送しなかったため、接着性が高いにもかかわらず、光学的クラッディング材
料としての適切さがやや落ちる。

【００５９】クラッド付き表面とクラッドなし表面にパターン化されたアッセイ素子におけ
る、フローセル取付けによる信号損失の違いは、非常に際立っている。具体的に
は、図１２に示すように、１００ｎｇ／ｍｌと５００ｎｇ／ｍｌの濃度を持った
、一般的な食中毒物質であるスタフィロコッカスアウレウスエンテロトキシンＢ
（ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓＥｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎＢ
、略称ＳＥＢ）を検体として使った、蛍光サンドイッチアッセイの結果、ガラス
（クラッドなし）導波管では、フローセルの取付け後に著しい信号損失が見られ
ることが示された。実際、維持された信号はわずか１０％であった。それと比較
し、銀クラッドの導波管では、同じアッセイでフローセルを取り付けた後、８５
〜９０％の信号が維持された。

【００６０】反射性クラッディングの総合的利点でもある、もう１つの利点は、フローセル
および反射性クラッディングを伴う導波管からの信号と、フローセルはあるがク
ラッディングはない導波管からの信号との比率に関するものである。前記の５０
０ｎｇ／ｍｌおよび１００ｎｇ／ｍｌのＳＥＢアッセイによると、この比率はク
ラッディングを使用した場合の正味増幅率がほぼ２．５倍であることを示してい
る。この増幅率は、部分的にではあるが、背景より大きい最低限の検出限界を直
接決定する点で、非常に重要である（検出限界はシステム感度に寄与する主な要
因である）。反射性クラッディングを使ったこれらの結果は、導波型光波長変換
による、導波管表面での生化学的アッセイを行うための、光学的導波管とフロー
セルの独自な統合を可能にしている。

【００６１】Ｃ．導波管の励起光学導波管の励起は本発明の主な目的ではないが、文脈の前後関係により、その考
察を簡単に行う。縦方向の励起光を均一化するため、円柱形レンズおよび内部伝
播領域を使ったシステムは、マルチモード導波管にカップリングされた標準的な
平行ビームと比較できる（図１３）。均一化された励起を使った信号の変動（図
１３の黒丸）は、最低限の信号と最大信号の差として測定されたもので、１４％
であった。非均一性がこのように比較的小さいのは、散乱などによる導波管内の
光損失による励起強度の自然減衰により説明できる可能性がある。均一化方法を
採用しない場合には、最低限の信号と最大信号とには４６％の差がある（図１３
の白抜き丸）。この大きな変動は、信号強度の定期的な変調にも示されているよ
うに、局所領域の個別励起（別名「ホットスポット」）による直接的な結果であ
る。励起ビームの伝播に従い（図では右から左）、この変調の深さが減少するこ
とは興味深い。この変化は、ダイオードレーザー出力固有のわずかな発散と、導
波管内伝播に伴う励起ビームの均一化の開始とによるものである。本質的に、こ
の線形状は、図１１に図示された、均一化工程の初期段階を表している。

【００６２】円柱形レンズを使用することの、もう１つの重要な利点は、カップリングが強
化され、アラインメントの許容誤差が改善されることである。これらの要因は可
動装置でより重要になる。具体的には、導波管の厚さが１０００μｍであるのに
対し、ビームは約２５０μｍにまで焦点が絞られる。そして伝播および分布領域
により、最終的に測定される信号は、最も近い導波管端における励起ビーム位置
に無関係になる。これにより、最高＋／−１５０％のアラインメント変動は完全
に許容される。

【００６３】結論導波管上にパターン化された反射性クラッディングは、平面状導波管とそれに
取り付けられた複数流路フローセルとの直接的な統合を独自な方法で可能にし、
複数検体と複数試料の同時処理および同時光学的分析とを実現する。

【００６４】明らかに、本発明は上記の説明に照らして種々の変形が可能である。したがっ
て、本発明は、本発明の精神と添付した請求項に述べる範囲で他の形態でも実施
可能であることは言うまでもない。

【図面の簡単な説明】

本発明は、発明の実施の形態の項の説明及び添付した図面を参照することで、
より明確な理解が迅速に得られる。なお、異なる図面中で使われる同様な参照符
号は、同一の構造または要素を表す。

【図１】図１ａ及び図１ｂは、光エネルギーが従来の方法（すなわち、導波管への直接
入射）で、流体セルを伴う導波管へ入射された場合に起る、光のカップリング効
果を示す図。

【図２】本発明の実施形態に係る、流体セルが取り付けられたミラーコーティングされ
たマルチモード導波管の、実際の縮尺とは異なる断面図。

【図３】本発明がどのように励起光および蛍光の強度を維持し、散乱背景信号を最小化
するかを示す、本発明の実施形態の実際の縮尺とは異なる横断面図。

【図４】本発明に係る、前記ミラーコーティングが多層コーティングである実施形態の
、実際の縮尺とは異なる横断面図。

【図５】本発明に係る装置の、実際の縮尺とは異なる上断面図。

【図６】フローセルでなく装置が導波管内を進む光に及ぼす摂動を前記ミラーコーティ
ングが防止する、本発明に係る装置を示した（実際の縮尺とは異なる）図。

【図７】図７ａ及び図７ｂは、物理的に孤立したパターン化（Ｐｈｙｓｉｃａｌｌｙ
ＩｓｏｌａｔｅｄＰａｔｔｅｒｎｉｎｇ、略称ＰＩＰ）が、どのように導波管
上の認識抗体の列生成に使われたかを示す、実際の縮尺とは異なる概略図。

【図８】図８ａ及び図８ｂは、複数試料機能と複数検体機能とを併合するため、図７ａ
および図７ｂの工程を使って、認識抗体が表面上にパターン化された導波管へ、
複数流路アッセイ流体セルが取り付けられた様子を示す、実際の縮尺とは異なる
概略図。

【図９】常駐素子と、交換可能なサブシステムと、使い捨てユニットとからなる流体工
学システムを示す、実際の縮尺とは異なる図。この常駐素子は、液体を６流路蠕
動ポンプへ導入するための、空気（Ａ）、バッファ（Ｂ）、または蛍光的にラベ
ルされた抗体（Ｃ）のいずれかを選択した自動切換えバルブ（ａｕｔｏｍａｔｅ
ｄｓｗｉｔｃｈｉｎｇｖａｌｖｅ、略称ＡＳＶ）と、ガスケット層付き出力
マニホールド（ｏｕｔｐｕｔｍａｎｉｆｏｌｄｗｉｔｈａｇａｓｋｅｔ
ｌａｙｅｒ、略称０ＭＧ）とを含む（図示せず）。この交換可能なサブシステ
ムは、切替えバルブにより試料瓶（ｓａｍｐｌｅｖｉａｌ、略称ＳＶ）または
試薬から試料を取り出す、試料−試薬マニホールド（ｓａｍｐｌｅ−ｒｅａｇｅ
ｎｔｍａｎｉｆｏｌｄ、略称ＳＲＭ）からなる。この試料試薬マニホールドの
出力を、導波管（ｗａｖｅｇｕｉｄｅ、略称ＷＧ）に永久的に取り付けられた複
数流路フローセル（ＦＣ）からなる前記使い捨てユニットへ導くため、ガスケッ
ト層（ｇａｓｋｅｔｌａｙｅｒ、略称ＩＭＧ）を採用した入力マニホールドが
使われている。流体クイックコネクタ（ｆｌｕｉｄｉｃｓｑｕｉｃｋｃｏｎ
ｎｅｃｔｅｒ、略称ＱＣ）は、ＡＳＶを交換可能なサブシステムに取り付けるた
めに使われている。

【図１０】本発明に使われる光学システムを示す、実際の縮尺とは異なる図。

【図１１】励起ビームの焦点を導波管へ当てるために円柱形レンズを使うことと、センサ
ー領域以前にビームを伝播および分布させることとにより、どのように均一な縦
方向の励起が実現されるかを示す、実際の縮尺とは異なる図。

【図１２】フローセルを導波管に取りつけたのち導波管内で維持された蛍光信号をパーセ
ントで表した、フローセル取付けの効果を示すグラフ。ここでは、銀クラッディ
ングまたはクラッディングなしのガラス導波管で標準的なサンドイッチ免疫アッ
セイ形式を使って、１００ｎｇ／ｍｌおよび５００ｎｇ／ｍｌのＳＥＢを含む試
料が分析された。スライドは、アッセイ現像直後、および常駐フローセルの取付
け後に画像処理された。図では、フローセル取付け後に維持された信号のパーセ
ントが示されている。平均強度から背景を差し引いた値として得られた初期信号
は、４つの条件下でそれぞれ２２６２、１６６０、１１３１１、および５８１６
単位であった。

【図１３】励起の均一性を示すグラフ。均一にパターン化されたサンドイッチ免疫アッセ
イからの蛍光強度（平均値について規格化済み）が、縦方向の位置の関数として
示されている。導波管へのダイオードレーザーの直接カップリングは、「ホット
スポット」（別称オープンサークル）とも呼ばれる、蛍光強度が実質的に変調さ
れる結果を生じている。円柱形レンズと伝播領域とを使った場合には、均一な励
起が実現された（フィルドサークル）。各データ点は、縦線の全幅にわたり測定
された２０ピクセルの平均を表す。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１２年９月２２日（２０００．９．２２）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００３５

【補正方法】変更

【補正の内容】

【００３５】図３は、本発明に係る装置の側面図（実際の縮尺とは異なる）で、本発明がど
のようにエバネッセント波励起を使ったアッセイを改善しているか示している。
流体セル１０の取付け後、励起光１６は導波管１２内で維持されるようになる。
これは、流体セル１０の接触点と適合するようパターン化されたミラーコーティ
ング２２が、流体セル１０への光のカップリング（出）を取り除くためである。
この方法を使うと、流体セル１０を導波管へ取り付けたのち、流体セル１０内の
流路を通じて流し込んだ試料への露出前、露出中、露出後の光学測定が可能にな
る。

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００３８

【補正方法】変更

【補正の内容】

【００３８】図６は、流体セルではなく装置８０を取り付けることにより、ミラーコーティ
ングが導波管中の光の摂動を防ぐ働きをする、本発明の実施形態を示したもので
ある。この実施形態では、導波管８４上のミラーコーティング８２に装置８０が
取り付けられ、導波管８４中を進む光への摂動を防いでいる。装置８０は、機械
素子の搭載機器（搭載機器（取付け穴８６付き）、ポンプ、バルブなど）、光学
素子（光源、検出器、レンズ、フィルタなど）、電子素子（トランジスタ、集積
回路、ディスプレイなど）のいずれであっても、またはその組合せであってもよ
い。装置８０は、流体セルと併用しても、流体セルの代りに使用してもよい。

【手続補正書】

【提出日】平成１４年３月１１日（２００２．３．１１）

【手続補正１】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】全図

【補正方法】変更

【補正の内容】

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者リグラー、フランシス、エス．アメリカ合衆国、20854 メリーランド州、ポトマック、ビオールマウンテンロード、12400 (72)発明者ロー、クリス、エー．アメリカ合衆国、22304 バージニア州、アレクサンドリア、ヨーカムパークウェイ 300 Ｎｏ．806 Ｆターム(参考） 2G043 BA16 CA04 DA02 DA05 EA01 HA01 JA02 KA02 KA05 KA09 LA03 2G057 AA04 AB04 AC01 BA05 BB06

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】第１の液体試料中の第１の検体を高表面感度で光学検出するた
めの導波管装置であって、表面にパターン化されたミラーコーティングを有するマルチモード導波管で
あって、このパターン化されたミラーコーティングが、この表面におけるミラー
コーティングされた領域と、第１の光学的に露出した領域とを明確に定義する、
マルチモード導波管と、前記第１の光学的に露出した領域であって、この第１の光学的に露出した領
域は前記第１の光学的に露出した領域が変化することにより前記試料中の前記第
１の検体の存在を示せるよう前記第１の検体に対する感度を有しており、前記変
化は、光波を前記導波管へ入射させ、前記パターン化された表面にエバネッセン
ト波を生成した後、前記第１の光学的に露出した領域とこのエバネッセント波と
の相互作用を検出することにより検出可能である、前記第１の光学的に露出した
領域、を有する。
【請求項２】請求項１記載の導波管装置において、前記第１の光学的に露出
した領域は第１のエリアと第２のエリアとを含み、この第１のエリアは、この第
１のエリアに変化が生じるよう前記第１の検体に対し感度を有し、この第２のエ
リアは、この第２のエリアに変化が生じるよう前記第２の検体に対し感度を有す
る。
【請求項３】請求項１記載の導波管装置において、前記第１の光学的に露出
した領域は、物理的または化学的に前記第１の検体と相互作用する。
【請求項４】請求項３記載の導波管装置において、前記第１の光学的に露出
した領域は検体反応性材料でコーティングされており、この検体反応性材料はド
ープ高分子と、非ドープ高分子と、ドープゾルゲルと、非ドープゾルゲルと、こ
れらの混合物とからなるグループから選択され、この材料は、前記第１の検体へ
の露出時、または前記第１の検体と、前記第１の光学的に露出した領域上でこの
材料に結合された前記第１の検体を認識する、光学的にラベルされた分子とへの
露出時に光応答差を呈する。
【請求項５】請求項１記載の導波管装置において、前記第１の光学的に露出
した領域は、その領域に取り付けられた生体分子認識種を有する。
【請求項６】請求項５記載の導波管装置において、前記生体分子認識種は、
前記第１の検体を認識する、タンパク質、細胞、細胞片、または核酸である。
【請求項７】請求項６記載の導波管装置において、前記タンパク質は抗体で
ある。
【請求項８】請求項１記載の導波管装置は、第１の光学的に露出した領域に
おいてエバネッセント波を生じるよう、光学的に前記導波管へカップリングされ
た光源をさらに有する。
【請求項９】請求項８記載の導波管装置において、前記ミラーコーティング
は、銀、アルミニウム、プラチナ、ロジウム、誘電体、クロム、またはこれらの
混合物を有する反射層を有する。
【請求項１０】請求項９記載の導波管装置において、前記反射層は、前記誘
電体を含むダイクロイック多層反射体である。
【請求項１１】請求項８記載の導波管装置において、前記ミラーコーティン
グは、前記反射層と前記導波管との間に反射層と接着層とを有する。
【請求項１２】請求項１１記載の導波管において、前記接着層は、クロム、
プラチナ、ロジウム、誘電体、チオールシラン、シアノアクリレート、高分子、
またはこれらの混合物である。
【請求項１３】請求項８記載の導波管において、前記ミラーコーティングは
、前記反射層の外面に反射層と保護層とを有する。
【請求項１４】請求項１３記載の導波管において、前記保護層はクロム、プ
ラチナ、ロジウム、誘電体、高分子、またはこれらの混合物を有する。
【請求項１５】請求項８記載の導波管装置は、前記エバネッセント波に応答
して前記第１の光学的に露出した領域により生成される第１の信号を検出する検
出器をさらに有する。
【請求項１６】請求項１記載の導波管装置は、前記導波管の前記表面の前記
ミラーコーティングされた領域に取り付けられた、機械的、光学的、または電子
的な構成部品をさらに有する。
【請求項１７】請求項１記載の導波管装置であって、流体セルであって、第１の表面であって、前記ミラーコーティングされた領域に密着した部分
を有し、第１の凹部を含み、この第１の凹部は、前記第１の光学的に露出した領
域により少なくとも部分的に境界線をなす第１の流路を明確に定義する、第１の
表面と、前記第１の流路へ試料を入れるための、第１の試料導入ポートとを含む流体セルをさらに有する。
【請求項１８】請求項１７記載の導波管装置において、この導波管の前記パ
ターン化された表面は、平面形状をなす。
【請求項１９】請求項１７記載の導波管装置において、前記パターン化され
たミラーコーティングは、前記第１の検体に対し感度を持つ第２の光学的に露出
した領域を含み、前記第１の表面は、この第１の表面内に設けられた第２の凹部であって、前記パターン化された
ミラーコーティングの前記第２の光学的に露出した領域により少なくとも部分的
に境界線をなす第２の流路を定義する、第２の凹部と、前記第２の流路へ試料を入れるための、第２の試料導入ポートを含む。
【請求項２０】請求項１記載の導波管装置において、この導波管の前記パタ
ーン化された表面は、平面形状をなす。
【請求項２１】アッセイ用に導波管を準備するための方法であって、マルチモード導波管であって、表面にパターン化されたミラーコーティング
を有し、このパターン化されたミラーコーティングは、ミラーコーティングされ
た領域と、第１の光学的に露出した領域とを前記表面上に明確に定義する、マル
チモード導波管を提供する工程と、前記第１の光学的に露出した領域の前記第１のエリアに、第１の生体分子認
識種を含む沈着液を物理的に接触させることにより、前記第１のエリアに前記第
１の生体分子認識種を付着させる工程であって、この沈着液は、前記ミラーコー
ティングに著しい層間剥離を起こさない時間内で、前記第１の生体分子認識種が
、前記第１の光学的に露出した領域の前記第１のエリアに十分な時間付着するよ
う、約７５ｍＭ以下の塩分濃度を有する、前記第１のエリアに前記第１の生体分
子認識種を付着させる工程とを有する。
【請求項２２】請求項２１記載の方法であって、前記第１の光学的に露出し
た領域の前記第２のエリアに、第２の生体分子認識種を含む沈着液を物理的に接
触させることにより、前記第２のエリアに第２の生体分子認識種を付着させる工
程をさらに有し、この沈着液は、前記ミラーコーティングに著しい層間剥離を起
こさない時間内で、前記第２の生体分子認識種が、前記第１の光学的に露出した
領域の前記第２のエリアに十分な時間付着するよう、約７５ｍＭ以下の塩分濃度
を有する。
【請求項２３】請求項２２記載の方法は、前記ミラーコーティングに著しい層間剥離を起こさない時間内で、前記第１
の生体分子認識種を、前記第２の光学的に露出した領域の前記第１のエリアに付
着させるために十分な時間だけ、前記第２の光学的に露出した領域の第１のエリ
アに、前記第１の生体分子認識種を含む前記沈着液を物理的に接触させ、前記ミラーコーティングに著しい層間剥離を起こさない時間内で、前記第２
の生体分子認識種を、前記第２の光学的に露出した領域の前記第２のエリアに付
着させるために十分な時間だけ、前記第２の光学的に露出した領域の第２のエリ
アに、前記第２の生体分子認識種を含む前記沈着液を物理的に接触させることにより、前記第１の生体分子認識種と前記第２の生体分子認識種とを、第
２の光学的に露出した領域に付着させる工程をさらに有する。
【請求項２４】アッセイを実施する方法であって、表面にパターン化されたミラーコーティングを有するマルチモード導波管を
提供する工程であって、このパターン化されたミラーコーティングは、ミラーコ
ーティングされた領域と、第１の光学的に露出した領域の第１のエリアとを、前
記表面上に明確に定義し、この第１の光学的に露出した領域のこの第１のエリア
は、前記表面におけるエバネッセント波に応答して、前記試料中における前記第
１の検体の存在を示す光学的信号を生成する、表面にパターン化されたミラーコ
ーティングを有するマルチモード導波管を提供する工程と、流体セルを前記マルチモード導波管に固定する工程であって、この流体セル
は、第１の表面であって、前記ミラーコーティングされた領域に密着した部分
を有し、第１の凹部を含み、この第１の凹部は、前記第１の光学的に露出した領
域により少なくとも部分的に境界線をなす第１の流路を明確に定義する、第１の
表面と、前記第１の流路へ試料を入れるための、第１の試料導入ポートとを含む、流体セルを前記マルチモード導波管に固定する工程と、前記第１の試料が前記第１の光学的に露出した領域に物理的に接触するよう
、前記第１の試料導入ポートを介して前記試料を前記第１の流路へ入れる工程と
、前記第１の試料と物理的に接触した前記第１の光学的に露出した領域におい
て、エバネッセント波が生ずるよう、前記導波管へ光を光学的にカップリングさ
せる工程と、前記エバネッセント波に応答して、前記第１の光学的に露出した領域の前記
第１のエリアで生成された、第１の信号を検出する工程であって、この第１の信
号は、前記試料中における前記第１の検体の存在に相関する、第１の信号を検出
する工程とを有する。
【請求項２５】請求項２４記載の方法において、前記第１の光学的に露出し
た領域は、第１の検体反応性材料でコーティングされており、この第１の検体反
応性材料はドープ高分子と、非ドープ高分子と、ドープゾルゲルと、非ドープゾ
ルゲルと、これらの混合物とからなるグループから選択され、この材料は、前記
第１の検体への露出時、または前記第１の検体と、前記第１の光学的に露出した
領域上でこの材料に結合された前記第１の検体を認識する、光学的にラベルされ
た分子とへの露出時に光応答差を呈する。
【請求項２６】請求項２５記載の方法であって、前記第１の光学的に露出し
た領域は、第２の検体反応性材料でコーティングされており、この第２の検体反
応性材料はドープ高分子と、非ドープ高分子と、ドープゾルゲルと、非ドープゾ
ルゲルと、これらの混合物とからなるグループから選択され、この材料は、前記
第２の検体への露出時、または前記第２の検体と、前記第１の光学的に露出した
領域上でこの材料に結合された前記第２の検体を認識する、光学的にラベルされ
た分子とへの露出時に光応答差を呈する、請求項２５記載の方法は、前記エバネッセント波に応答して、前記第２の検体反応性材料により生成さ
れた、第２の信号を検出する工程であって、この第２の信号は、前記試料中にお
ける前記第２の検体の存在に相関する、第２の信号を検出する工程とをさらに有する。
【請求項２７】請求項２４記載の方法は、前記第１の光学的に露出した領域の前記第１のエリアに、第１の生体分子認
識種を含む沈着液を物理的に接触させることにより、前記第１のエリアに第１の
検体用の前記第１の生体分子認識種を付着させる工程であって、この沈着液は、
前記ミラーコーティングに著しい層間剥離を起こさない時間内で、前記第１の生
体分子認識種が、前記第１の光学的に露出した領域の前記第１のエリアに十分な
時間付着するよう、約７５ｍＭ以下の塩分濃度を有する、前記第１のエリアに前
記第１の生体分子認識種を付着させる工程をさらに有する。
【請求項２８】請求項２７記載の方法は、前記第１の光学的に露出した領域の前記第２のエリアに、第２の生体分子認
識種を含む沈着液を物理的に接触させることにより、前記第２のエリアに第２の
検体用の第２の生体分子認識種を付着させる工程をさらに有し、この沈着液は、
前記ミラーコーティングに著しい層間剥離を起こさない時間内で、前記第２の生
体分子認識種が、前記第１の光学的に露出した領域の前記第２のエリアに十分な
時間付着するよう、約７５ｍＭ以下の塩分濃度を有する、前記マルチモード導波
管を準備する工程と、前記エバネッセント波に応答して、前記第１の光学的に露出した領域の前記
第２のエリアで生成された、第２の信号を検出する工程であって、この第２の信
号は、前記試料中における前記第２の検体の存在に相関する、第２の信号を検出
する工程とをさらに有する。
【請求項２９】請求項２７記載の方法において、前記第１の生体分子認識種
と前記第２の生体分子認識種とは、互いに異なり、これらは前記第１の検体また
は前記第２の検体を認識する、タンパク質と、細胞と、細胞片と、核酸とからな
るグループから選択される。
【請求項３０】請求項２４記載の方法において、前記第１の試料は、光学的
にラベルされた、前記第１の検体の類似物質を含む。
【請求項３１】請求項２４記載の方法において、前記試料を前記第１の流路
へ入れる工程は、結果として前記第１の試料中のいかなる前記第１の検体も、前
記第１の光学的に露出した領域に結合させ、第１の検体が前記第１の光学的に露
出した領域に結合した後、この第１の検体を認識する、光学的にラベルされた分
子を、前記第１の試料導入ポートへ入れる工程をさらに有する。