DE69630517T2

DE69630517T2 - Sonde zur Verwendung in der Nukleinsäurenanalyse und Detektionsverfahren auf der Basis von Excimer-Fluoreszenz

Info

Publication number: DE69630517T2
Application number: DE69630517T
Authority: DE
Inventors: Masayuki Hamamatsu-shi MASUKO; Katsuyoshi Ebata
Original assignee: Hamamatsu Photonics KK
Current assignee: Hamamatsu Photonics KK
Priority date: 1995-02-17
Filing date: 1996-02-13
Publication date: 2004-08-12
Anticipated expiration: 2016-02-14
Also published as: EP0810291B1; EP0810291A4; DE69630517D1; JP3992079B2; EP0810291A1; ATE253127T1; CA2213240A1

Description

TECHNISCHES GEBIET
Die Erfindung bezieht sich auf von Radioisotopen freie Sonden für die Nukleinsäureanalyse, die befähigt sind, Basensequenzen mit hoher Empfindlichkeit und hoher Selektivität zu erkennen, und auf ein Verfahren zum Nachweis unter Verwendung dieser Sonden.
TECHNISCHER HINTERGRUND
In der Gentechnologie wird eine als Nukleinsäure-Hybridisierung bezeichnete Erscheinung verwendet, um ein spezielles Gen oder eine Nukleinsäure aus einer Zelle oder einem Virus nachzuweisen. In Abhängigkeit von dem zu erreichenden Zweck, den Arten der nachzuweisenden Gene und den Nachweisverfahren wurden zahlreiche Hybridisierungsmethoden entwickelt.
Verschiedene Methoden wurden auch für Identifizierung und quantitative Bestimmung von Hybridisierungsprodukten entwickelt. Im allgemeinen wird bei diesen Methoden ein Polynukleotid als Sonde verwendet, welches mit einer nachzuweisenden komplementären Nukleinsäure hybridisiert, und es ist die teilweise Markierung des Polynukleotids erforderlich. So ist beispielsweise eine der empfindlichsten, allgemein angewendeten Methoden eine Methode unter Verwendung eines Radioisotops. Nicht-radioaktive Markierungsverfahren umfassen die Markierung mit einer fluoreszierenden Substanz, einem Enzym und Biotin und Substanzen die miteinander reagieren.
Die meisten der bisherigen üblichen Hybridisierungsmethoden verwenden eine einzige Nachweis-Sonde, die mit Substanzen, wie den obigen, markiert ist. Eine solche Sonde ist ein Polynukleotid, welches zu einer aufzufindenden Nukleinsäure (nachstehend als Ziel oder Zielpolynukleotid bezeichnet) komplementär ist. Die markierte Sonde wird für die Hybridisierung im Überschuß über die Menge ihrer Zielsubstanz verwendet. Vor dem Nachweis des so gebildeten Hybrids muß das überschüssige Sonden-Polynukleotid durch Waschen oder Elektrophorese und dergleichen entfernt werden. Diese Verfahrensweise ist kompliziert und zeitraubend.
In jüngerer Zeit besteht ein intensiver Bedarf nach der Entwicklung einer Nachweismethode, die praktische Empfindlichkeit (Nachweisgrenze), Leistungsfähigkeit und hohe Erkennungsleistung (Fähigkeit, einen Unterschied von einer Base zu erkennen) besitzt, ohne daß ein Radioisotop verwendet wird. Diese Methode sollte außerdem eine Erscheinung ausnutzen, die meßbar ist, ohne daß das Auswaschen der überschüssigen Sonde nach der Hybridisierung erforderlich ist. Einige bereits bekannte Methoden erfüllen diese Erfordernisse teilweise. So wird in der US-P-5,332,659 eine Methode beschrieben, welche den Nachweis ermöglicht, ohne das Entfernen der überschüssigen Sonde zu erfordern. Eine bei dieser Methode nachzuweisende Erscheinung beruht auf der Bildung eines Excimeren aus zwei Chromophoren als markierende Gruppen. Bei dieser Methode wird eine einzige Sonde zum Nachweis eines Polynukleotids, die vorher zwei oder mehr fluoreszierende Markierungsgruppen in der Sonde enthält, mit einer Zielnukleinsäure hybridisiert. Nach der Hybridisierung wird die Veränderung der Intensität der Excimeren-Fluoreszenz beobachtet, wodurch die Zielnukleinsäure nachgewiesen wird.
Es kann der Fall eintreten, in welchem eine lange Zielnukleinsäure durch Hybridisierung mit Hilfe eines Oligonukleotids als Sonde nachgewiesen wird. Um in einem solchen Fall eine gute Erkennung einer Differenz in einer Base (Erkennung einer Punktmutation) zu ermöglichen, während Erkennungsfehler unterdrückt werden, wird als Aufgabe der vorliegenden Erfindung es deutlich bevorzugt, ein Set aus zwei oder mehr Sonden für ein einziges Ziel statt einer einzigen Sonde zu verwenden.
OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Es ist eine auf diesem Prinzip beruhende Methode bekannt, bei der eine Erscheinung gemessen wird, die auftritt, wenn mehrere mit Markierungsgruppen konjugierte Sonden mit ihrer einzigen Zielnukleinsäure hybridisiert werden und dadurch die Zielnukleinsäure nachgewiesen wird. Die Markierungsgruppen sind ein Set aus einem Energiedonor (D) und einem Energieakzeptor (A), die gleichzeitig an verschiedene Oligonukleotide binden. Ein davon verschiedenes Set von Markierungsgruppen für den Energietransfer ist bekannt, in diesem ist jedoch eine Komponente Enzym-markiert.
Die EP0229943A2 beschreibt eine Markierungsmethode, bei der der Nachweis auf D/A beruht. Dessen spektrale Änderung beim Energietransfer von dem Donor zu dem Akzeptor ist jedoch im wesentlichen nicht empfindlich gegenüber der Lage von D und A. Außerdem überschneiden sich die Fluoreszenzspektren des Donors und des Akzeptors merklich. Dies läßt die genaue Erkennung eines Unterschieds in einer Base zu einer äußerst schwierigen Aufgabe werden. Der optimale Abstand zwischen den Fluorophoren beträgt 2–7 Nukleotideinheiten. Die EP0070685B1 beschreibt die Markierung mit einem Enzym, das im wesentlichen thermisch instabil ist. Diese Methode ist für die Hybridisierung, die häufig eine Wärmebehandlung erfordert, ungeeignet. Bei dieser Methode ist darüber hinaus der Energiedonor eine lumineszierende Substanz, wie Luminol, die nicht in der Sonde vorliegt, sondern als Substrat für den Enzym-Marker der Probelösung einverleibt ist. Diese Substanz diffundiert in der Lösung und ist somit nicht empfindlich genug, um zu ermöglichen, den Abstand zwischen dem Enzym und dem Akzeptor festzustellen. Daher ist diese Methode für die Hybridisierung ungeeignet, bei der es erforderlich ist, den Unterschied in einer Base genau zu erkennen.
Die vorliegende Erfindung wurde im Licht der oben beschriebenen Probleme der üblichen Methoden fertiggestellt. Erfindungsgemäß wird ein Nukleinsäure-Hybridisierungsmarker eingesetzt, der nicht radioaktiv ist, und es wird eine hochempfindliche Methode bereitgestellt, welches den Nachweis eines Unterschieds in einer Base ermöglicht. Mit Hilfe der Erfindung kann auch speziell ein Komplex der Nukleinsäure mit der Sonde erkannt werden, ohne daß ein Überschuß der Sonde, der zu einer Probelösung zugesetzt wird, ausgewaschen wird.
Das Kit gemäß der vorliegenden Erfindung umfaßt ein Set aus zwei oder mehr Oligonukleotid-Sonden, gemäß der Definition in Anspruch 1, welche vollständig mit der komplementären aufeinanderfolgenden Basensequenz der Zielnukleinsäure hybridisieren, wobei die benachbarten Enden (d. h. das 3'-Ende einer Sonde und das 5'-Ende der anderen Sonde) der Sonden mit einer chromophoren Gruppe markiert sind, welche die Fähigkeit hat, in der geeigneten räumlichen Konfiguration vorzuliegen, so daß ein Excimer gebildet werden kann, wenn die Sonden gleichzeitig an die Zielnukleinsäure hybridisieren.
Die vorstehend erwähnte Zusammensetzung der erfindungsgemäßen Sonde ist, wie nachstehend erläutert wird, aus den bekannten üblichen Methoden nicht herleitbar. Außerdem können die Wirkungen, die aus dieser Konstruktion resultieren, keinesfalls erwartet werden. Im einzelnen umfaßt die erfindungsgemäße Sonde ein Set von mehreren markierten Sonden, die so ausgebildet sind, daß sie selbst eine Differenz, die einer Base entspricht, erkennen. Darüber hinaus tritt zwischen den nachzuweisenden Markierungsgruppen die Erscheinung auf, daß durch die Hybridisierung eine hochwirksame Excimer-Fluoreszenz induziert wird, obwohl die Markierungsgruppen auf verschiedenen Sonden vorliegen. Diese Fluoreszenz kann leicht von der Emission des Monomeren unterschieden werden. Anders ausgedrückt, ist ein einziger Chromophor auf jeder der verschiedenen Sonden in einer solchen räumlichen Konfiguration, daß nur bei Hybridisierung an der Zielnukleinsäure der Chromophor zusammen mit einem Chromophor auf einer benachbarten Sonde wirksam die Excimer-Fluoreszenz erzeugt. Auf Basis der Excimer-Fluoreszenz kann die Zielnukleinsäure mit sehr hoher Erkennungsgenauigkeit nachgewiesen werden, weil die Excimer-Fluoreszenz gegenüber der entsprechenden Emissionsbanden der Monomeren merklich nach Rot verschoben ist. Diese Tatsachen sind völlig unerwartet.
Die vorstehende Ausbildung der vorliegenden Erfindung und die erfindungsgemäßen Wirkungen, die darauf beruhen, werden nachstehend beschrieben.
(1) Fehlerhafte Erkennung
Bei dem Nachweis einer Zielnukleinsäure mit Hilfe der bekannten Hybridisierungsmethoden gibt es den Fall, bei dem nur eine Sonde verwendet wird und die Zielnukleinsäure lang ist. In einem solchen Fall kann die Hybridisierung zwischen der Sonde und einer falschen Nukleinsäure eintreten, die zu der Zielnukleinsäure partiell oder in gewissem Ausmaß komplementär ist (Falsche Hybridisierung gemäß 1). Diese Art von Hybridisierung führt zu einer fehlerhaften Erkennung. Eine Möglichkeit zum Vermeiden einer solchen üblichen Schwierigkeit ist es, ein Set aus zwei oder mehr Sonden anstelle einer einzigen Sonde zu verwenden (2) und die Tatsache auszunutzen, daß nur dann, wenn die beiden Sonden richtig mit einer Zielnukleinsäure hybridisieren (Echte Hybridisierung gemäß 2) eine spezifische Erscheinung zwischen den beiden Markierungsgruppen auftritt. Die spezifische Erscheinung tritt nicht bei einer fehlerhaften Erkennung auf (Falsche Hybridisierung gemäß 2). Diese Methode ist nicht notwendigerweise auf die Verwendung von zwei Sonden beschränkt, sondern kann erforderlichenfalls gleichzeitig mehr als zwei Sonden verwenden ( 3). In diesem Fall wird der richtige Nachweis (Erkennung) nur dann erzielt, wenn spezifische Erscheinungen, die zwischen den benachbarten Markierungsgruppen auftreten, alle gleichzeitig beobachtet werden können. Somit kann die fehlerhafte Erkennung bemerkenswert vermieden werden.
(2) Große Vielfalt von Markierungsgruppen
Die Markierungsgruppen, die verwendet werden können, sollten so zahlreich wie möglich sein. Außerdem sollte die Markierungsgruppe nicht verhindern, daß die Sonde mit der Zielnukleinsäure hybridisiert. Es muß außerdem vermieden werden, daß die Markierungsgruppe durch eine hydrophobe Wechselwirkung mit Basen in den Doppelstrang von Nukleinsäurebasen eingeschlossen wird. Gemäß dem bekannten Stand der Technik, bei dem zwei oder mehr bekannte Markierungsgruppen in einem mittleren Bereich einer einfachsträngigen Sonde vorhanden sind, ist es äußerst schwierig, ein Moleküldesign herzustellen, welches diese Erfordernisse erfüllt. Die Sonde gemäß der vorliegenden Erfindung, die ein Set aus mehreren verschiedenen Sonden umfaßt, ist andererseits frei von solchen Beschränkungen. Das heißt, daß es ausreicht, zusätzlich eine Markierungsgruppe am Terminus jeder Sonde vorzusehen. Somit kann erfindungsgemäß eine Vielfalt von üblichen Verknüpfungen zugänglich sein. Es ist außerdem möglich, die zu messende spezifische Erscheinung weitgehend zu wählen. Es ist möglich, eine optimale chemische Struktur für die Messung der Erscheinung leicht vorzubestimmen. So kann beispielsweise die chemische Struktur des Linkerarms zwischen einem Chromophor und einem terminalen Nukleotid gewählt werden, die Länge des Linkers kann unter verschiedenen Möglichkeiten optimiert werden und die chemische Beständigkeit, Temperaturbeständigkeit und Lagerbeständigkeit der Markergruppe kann geregelt werden.
(3) Nachweisempfindlichkeit
Es ist ein allgemeines Erfordernis für Hybridisierungametho- den, daß das Hintergrundgeräusch minimal gehalten werden muß, um die Empfindlichkeit des Nachweises zu erhöhen. Wenn eine Sonde mit einer Markersubstanz verwendet wird, verursacht auch die nicht-hybridisierte Sonde selbst inhärent die zu messende Erscheinung. Der Grad, in dem dieses eintritt, schwankt in Abhängigkeit von dem Grad der Hybridisierung. Diese Tatsache stellt eine Grundlage für den Nachweis dar. Um das Geräusch zu vermindern ist es daher wünschenswert, daß die spezifische Erscheinung nur dann beobachtet werden kann, wenn die richtige Hybridisierung an der Zielnukleinsäure stattfindet. In diesem Zusammenhang wird die Methode bevorzugt, bei der die Hybridisierung unter Verwendung eines Sets von mehreren Sonden mit der Emission einer spezifischen Fluoreszenz verbunden ist.
Bei der Methode unter Verwendung eines Sets von mehreren Sonden können für jede Sonde stufenweise Hybridisierungen durchgeführt werden. Dadurch können die Verunreinigungen, die nicht-hybridisierte Zielnukleinsäure und der Überschuß an nicht-hybridisierten Sonden ausgewaschen werden, wobei das Hintergrundgeräusch bis zu dem Grenzwert vermindert wird.
(4) Erkennung eines Unterschieds in einer Base
Wenn gewünscht wird, Nukleinsäuresequenzen zu unterscheiden, die sich voneinander in nur einer Base in einer speziellen Position unterscheiden (Einbasen-Mutation) ist ein solcher spezifischer Nachweis durch Verwendung einer einsträngigen Sonde schwierig. Der Nachweis des Einbasen-Unterschieds ist andererseits mit Hilfe einer Methode möglich, bei der ein Set aus zwei Sonden die Hybridisierung eingeht, wobei die mutierte Nukleinsäurebase eingeschlossen wird und dann eine spezifische Erscheinung nur dann auftritt, wenn die benachbarten terminalen Markergruppen in enge Nachbarschaft kommen. Für den Nachweis dieser Basendifferenz wird die Excimer-Fluoreszenz, die bekanntlich eine spezifische Erscheinung in der Größenordnung von einigen Ångström identifiziert, bevorzugt. Die Anwendung der Erscheinung der Excimer-Fluoreszenz ermöglicht es, eine räumliche Differenz (mehrere Ångström) die so klein ist, daß sie einer Base entspricht, empfindlich zu erkennen.
Wenn dagegen der Energietransfer (A/D) oder die enzymatische Reaktion oder Chemilumineszenz angewendet werden, ist das Ausmaß, in welchem die räumliche Differenz erkannt werden kann, weit größer als bei der Excimer-Methode und erreicht mehrere 10 bis mehrere 100 Ångström.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird daher die Excimer-Bildung zum Nachweis benutzt, bei der eine Differenz von einer Base erkannt werden kann, was einen Gegenstand der vorliegenden Erfindung darstellt.
Es ist somit klar, daß die erfindungsgemäße Methode, die ein Set aus zwei Sonden, die jeweils eine Markergruppe aufweisen, anwendet und die eine spezifische Erscheinung nur bei richtiger Hybridisierung verursachen kann, die Nachteile der konventionellen Methoden völlig überwindet.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist eine Abbildung, welche die Hybridisierung einer einsträngigen Nukleinsäure-Nachweis-Sonde an einer richtigen Zielnukleinsäure oder einer falschen Zielnukleinsäure zeigt, die verdeutlicht, daß bei der falschen Hybridisierung eine irrtümliche Erkennung eintreten kann;
2 ist eine Abbildung, welche die Hybridisierung von Nukleinsäure-Nachweis-Sonden gemäß der vorliegenden Erfindung zeigt, die ein Set aus zwei Sonden und eine richtige Zielnukleinsäure oder eine falsche Zielnukleinsäure darstellt, aus der ersichtlich ist, daß bei der Hybridisierung einer der als Bestandteile vorliegenden Sonden an der falschen Zielnukleinsäure keine irrtümliche Erkennung stattfindet;
3 ist eine Ausführungsform, in der eine sehr lange Zielnukleinsäure mit Nukleinsäure-Nachweis-Sonden nachgewiesen wird, die ein Set aus drei oder mehr Sonden umfassen, um die Möglichkeit einer irrtümlichen Erkennung minimal zu halten;
4 ist eine Abbildung, die Änderungen der Fluoreszenzspektren von Lösungen zeigt, die verschiedene Konzentrationen eines Zieloligonukleotids und zwei Arten der Nachweis-Sonde enthalten;
5 ist eine Abbildung, welche Änderungen der Intensitäten der relativen Excimer-Fluoreszenz (bei 495 nm) in den Fluoreszenzspektren von Lösungen zeigt, die verschiedene Konzentrationen eines Zieloligonukleotids und zwei Arten der Nachweis-Sonde enthalten;
6 ist eine Abbildung, welche die Wirkung der Länge der Linkerarme zwischen einem Pyrenrest (Marker) und einer endständigen Zuckereinheit auf die Excimer-Bildung zwischen einem Ziel-32-mer und dem Paar der Pyrenbutansäure-induzierten 16-mer-Sonde (üblich) und einer der nachstehenden Pyrenalkyliodacetamid-induzierten 16-Mer-Sonden zeigt: PIA = N-(1-Pyren)-iodacetamid, PMIA = N-(1-Pyrenmethyl)-iodacetamid, PEIA = N-(1-Pyrenethyl)-iodacetamid und PPIA = N-(1-Pyrenpropyl)iodacetamid;
7 zeigt, daß eine Zielnukleinsäure, die aufgrund einer Punktmutation eine nicht-hybridisierbare Sequenz enthält, welche die Marker voneinander getrennt hält, mit der erfindungsgemäßen Sonde nachgewiesen werden kann, in der das 16-Mer mit eingeführtem Pyrenmethyl-iodacetamid und das 16-Mer mit eingeführtem Pyren-buttersäurehydrazid verwendet werden, und wobei das 32-Mer-Ziel eine kontinuierliche Sequenz hat;
8 zeigt daß die Excimer-Fluoreszenz merklich vermindert wird, wenn die beiden Sonden voneinander entfernt werden, um eine Sequenz einzusetzen, die keine Duplex bildet, was anzeigt, daß die Erfindung zum Nachweis einer Punkt-mutierten Nukleinsäure verwendet werden kann;
9 ist eine Abbildung, welche die Struktur der Verbindung 4 zeigt;
10 ist eine Abbildung, welche die Struktur der Verbindung 5 zeigt und
11 ist eine Abbildung, welche die Struktur der Verbindung 6 zeigt.
BESTE AUSFÜHRUNGSFORM DER ERFINDUNG
Ein Kit für die Nukleinsäureanalyse gemäß der Erfindung ist ein Paar von Sonden gemäß der Definition in Anspruch 1, d. h. Sonde 1 und Sonde 2, zum Nachweis eines einzigen Zielpolynukleotids mit einer Sequenz aus q Basen und die Basensequenz der ersten Sonde für die Nukleinsäureanalyse, Sonde 1, ist komplementär zu einer Sequenz aus r aufeinanderfolgenden Basen vom 5'-terminalen Ende des Zielpolynukleotids (r = eine ganze Zahl von 1 oder mehr, jedoch (q – 1) oder weniger) und hat eine chromogene Gruppe, die über einen Linkerarm an das 5'-terminale Ende der Sonde 1 gebunden ist, während die Basensequenz der zweiten Sonde für die Nukleinsäureanalyse, Sonde 2, zu einer Basensequenz, die eine Sequenz zwischen der Base (r + 1) und der Base q vom 5'-terminalen Ende des Zielpolynukleotids, das eine Sequenz von q Basen hat, komplementär ist, und eine chromogene Gruppe, die über einen Linkerarm mit dem 3'-terminalen Ende der Sonde verknüpft ist, aufweist. Die Zahl der Sonden in einem Set sollte nicht auf zwei beschränkt sein, sondern kann mehr als zwei sein. Selbst im letzteren Fall umfaßt das grundsätzliche System ein Set aus zwei Sonden und die Wirkungen und Effekte, die auf diesem System beruhen, sind die gleichen. In der folgenden Beschreibung wird daher ein Set aus zwei Sonden als Beispiel erläutert.
Es ist charakteristisch für die erfindungsgemäßen Sonden für die Nukleinsäureanalyse, daß sie ein Excimer bilden und Fluoreszenz in einem längeren Wellenlängenbereich emittieren, als die chromogene Gruppe der Sonde 1 und die chromogene Gruppe der Sonde 2, wenn diese Sonden gleichzeitig an das Zielpolynukleotid hybridisieren.
Die erfindungsgemäßen Sonden für die Nukleinsäureanalyse sind auch dadurch gekennzeichnet, daß die Fluoreszenz auf ein Excimer zurückzuführen ist, das aus der chromogenen Gruppe der Sonde 1 und der chromogenen Gruppe der Sonde 2 gebildet wird, wenn diese Sonden gleichzeitig an das Zielpolynukleotid hybridisieren.
Die erfindungsgemäßen Sonden für die Nukleinsäureanalyse können eine chromogene Gruppe enthalten, die aus der aus Pyren, Naphthalin, Anthracen, Perylen, Stilben, Benzol, Toluol, Phenylanthracen, Diphenylanthracen, Benzpyren, Benzanthracen, Tetracen, Phenanthren, Pentacen, Triphenylen und Chrysen bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Die Länge des Linkerarms zwischen dem 5'-terminalen Nukleotid der Sonde 1 für die Nukleinsäureanalyse und der chromogenen Gruppe und die Länge des Linkerarms zwischen dem 3'-terminalen Nukleotid der Sonde 2 für die Nukleinsäureanalyse und der chromogenen Gruppe kann zwischen 3 Ångström und 20 Ångström, vorzugsweise zwischen 5 Ångström und 20 Ångström liegen.
Der Linkerarm zwischen dem 5'-terminalen Nukleotid der Sonde 1 für die Nukleinsäureanalyse und der chromogenen Gruppe oder der Linkerarm zwischen dem 3'-terminalen Nukleotid der Sonde 2 für die Nukleinsäureanalyse und der chromogenen Gruppe kann ein Substituent der Formel -(CH₂)_n-(X)k-(CH₂)_m-Y- sein, worin X aus der aus CONH, NHCO, COO, OCO, O, S und NH bestehenden Gruppe ausgewählt ist, Y aus der aus O, S, NH und (PO₃-)S bestehenden Gruppe ausgewählt ist, n und m eine ganze Zahl von 0 bis 5 darstellen und k 0 oder 1 darstellt.
Bei dem Verfahren für den Nukleinsäurenachweis gemäß der Erfindung wird ein Polynukleotid, das eine Sequenz von q Basen umfaßt, durch Hybridisierung an zwei Sonden, d. h. Sonde 1 und Sonde 2, mit Hilfe des in Anspruch 7 definierten Verfahrens nachgewiesen. Dieses Verfahren umfaßt eine Stufe, in der das Zielpolynukleotid, die erste Sonde für die Nukleinsäureanalyse, Sonde 1, und die zweite Sonde für die Nukleinsäureanalyse, Sonde 2, vermischt werden und die Sonde 1 komplementär zu einer Sequenz von r aufeinanderfolgenden Basen am 5'-Ende des Zielpolynukleotids (r = eine ganze Zahl von 1 oder mehr, jedoch (q – 1) oder weniger) ist, und eine chromogene Gruppe am 5'-terminalen Ende der Sonde 1, die über einen Linkerarm verknüpft ist, aufweist und die Sonde 2 komplementär zu einer Sequenz von Basen zwischen der Base (r + 1) und der Base q vom 5'-terminalen Ende des Zielpolynukleotids ist und eine über einen Linkerarm gebundene chromogene Gruppe am 3'-terminalen Ende der Sonde 2 aufweist, und eine Stufe, in der nach dem Vermischen die Fluoreszenz in einem Bereich von längeren Wellenlängen gemessen wird, als die der chromogenen Gruppe der Sonde 1 und der chromogenen Gruppe der Sonde 2.
Genauer gesagt, sind die erfindungsgemäßen Sonden zum Nukleinsäurenachweis Polynukleotide, welche die Basensequenz des Zielpolynukleotids exakt erkennen, indem sie an das Zielpolynukleotid, das Ziel des Nachweises, hybridisieren.
Außerdem haben die beiden erfindungsgemäßen Sonden-Polynukleotide eine ein Excimer bildende chromogene Gruppe, wie Pyren, am 5'-Terminus beziehungsweise am 3'-Terminus.
Durch Hybridisierung des Zielpolynukleotids an die Polynukleotide der erfindungsgemäßen Sonden kommen die chromogenen Gruppen in enge Nachbarschaft. Wenn die Monomer-Emission der chromogenen Gruppen abfällt, erhöht sich die Excimer-Emission in einem Bereich von höheren Wellenlängen.
Wenn die beiden chromogenen Gruppen eine für ein Excimer günstige räumliche Konfiguration annehmen, kann bei Bestrahlung ein potentes Excimer gebildet werden. Während die Monomer-Emission aus den chromogenen Gruppen merklich abfällt kann eine starke Excimer-Fluoreszenz in einem Bereich längerer Wellenlängen beobachtet werden.
Das Zielpolynukleotid kann durch Messen der zu Rot verschobenen Excimer-Fluoreszenz identifiziert und nachgewiesen werden. Die Identifizierung und der Nachweis werden auch dadurch möglich, daß die Verminderung der Intensität der Monomer-Fluoreszenz gemessen wird.
Die bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden nachstehend beschrieben.
[Zielnukleinsäure (Zielpolynukleotid)]
Die Zielnukleinsäuren, die mit Hilfe der erfindungsgemäßen Sonden für den Nukleinsäurenachweis nachgewiesen werden können, sind nicht beschränkt. Es können solche sein, die gewöhnlich mit Hilfe von bekannten Methoden hybridisiert werden. Zu bevorzugten Beispielen gehören DNA, RNA (tRNA, mRNA, rRNA), synthetische Oligonukleotide, synthetische Polynukleotide, synthetische Desoxyoligonukleotide, synthetische Desoxypolynukleotide und Heteropolymere von Desoxyribonukleotiden und Ribonukleotiden. Die Basensequenz der Zielnukleinsäure muß vorher identifiziert werden. Aufgrund dieser Information über die Basensequenz wird eine Sonde hergestellt und hybridisiert, die vollständig komplementär zu dieser Nukleinsäure ist.
Die Art der Aufklärung der Basensequenz der Zielnukleinsäure für den vorstehenden Zweck kann eine bekannte Methode der Basensequenz-Bestimmung sein (z. B. die Sanger-Methode (Kettenabbruch-Methode zur DNA-Sequenzierung unter Verwendung von Didesoxy-Verbindungen)).
[Nachweis-Sonde für Nukleinsäure]
Die Polynukleotide der erfindungsgemäßen Sonde für den Nukleinsäurenachweis umfassen ein Set aus zwei Polynukleotiden, welche vollständig an die komplementären Bereiche des Zielpolynukleotids, des Nachweisgegenstands, hybridisieren.
Das heißt, daß die erfindungsgemäß relevanten beiden Polynukleotide solche Basensequenzen haben, daß Sonde 1 und Sonde 2 gleichzeitig an die Basensequenz des Zielpolynukleotids hybridisieren, wie in 2 gezeigt ist.
Eine beliebige Anzahl von Basen vom 5'-terminalen Ende der Zielnukleinsäure kann auf Basis der Sequenz der Sonde 1 bestimmt werden. Demnach wird die Basensequenz der Sonde 2 automatisch bestimmt.
Wenn eine der Sonden eine zu geringe Anzahl von Basen hat, kann jedoch die Sonde nicht an das komplementäre Zielnukleotid hybridisieren, so daß die Zielsequenz nicht identifiziert werden kann. Die bevorzugte Anzahl von Basen liegt innerhalb eines bestimmten Bereiches, so daß die Anzahl der Basen in der Basensequenz der Sonde 2 oder der Sonde 1 in wünschenswerter Weise 8 oder mehr sein sollte.
Das Verfahren zur Synthese der für Sonde 1 oder Sonde 2 erforderlichen Basensequenz ist erfindungsgemäß nicht beschränkt. Es kann sich um eine übliche Methode zur Modifizierung von Nukleotiden handeln (z. B. die Methode, die in Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, 5th ed, 1992–1994, by R. P. Haugland, Molecular Probes, Inc. beschrieben ist), oder sie kann eine automatische Synthese sein (beispielsweise die in Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach, ed. By F. Eckstein, IRL Press beschrieben ist). Es können auch natürlich auftretende Oligonukleotide verwendet werden, nachdem sie mit einem Chromophor markiert wurden.
Das resultierende Polynukleotid kann beispielsweise durch Umkehrphasen-Hochleistungs-Flüssigchromatographie gereinigt werden.
[Linkerarm]
Die Polynukleotide der beiden erfindungsgemäßen Sonden werden mit einer Markergruppe (Molekül mit chromogener Gruppe, Chromophor, Fluorophor) über eine Linkerkette am 5'- beziehungsweise 3'-terminalen Ende der Sonden markiert.
Wenn diese zwei Polynukleotid-Sonden an das Zielpolynukleotid hybridisieren werden sie so angeordnet, daß die zwei chromogenen Gruppen der jeweiligen Polynukleotid-Sonden mit Hilfe der Linkerarme räumlich nahe aneinander gebracht werden.
Daher ist die Länge des Linkerarms zwischen dem 5'-terminalen Ende oder dem 3'-terminalen Ende und der chromogenen Gruppe erfindungsgemäß von äußerster Wichtigkeit und kann in Abhängigkeit von der Art und der Länge des Linkers eingestellt werden. Erfindungsgemäß wurde speziell durch die Feststellungen der Erfinder aufgeklärt, daß die Länge des Linkers die Nachweisempfindlichkeit stark beeinflußt.
6 zeigt, daß die Excimer-Bildung auf Basis der Pyren-Pyren-Wechselwirkung durch die Länge der Linker der Sonden merklich beeinflußt wird. Erfindungsgemäß ist daher die Länge des Linkers ein Maß für die Optimierung der Nachweismethode. Genauer bezieht sich die Länge der Linkerkette auf die Summe der Längen auf Basis der Anzahl der Bindungen, vorausgesetzt, daß die kovalenten Einfachbindungen, wie C-C, C-O, C-N, N-N, C-S und P-O vom endständigen Nukleotid der Sonde bis zu der chromogenen Gruppe die gleiche Länge haben (1,4 Ångström).
Wenn beispielsweise der 5'-Kohlenstoff des 5'-endständigen Nukleotids mit der chromogenen Gruppe über eine Linkerkette der Formel -O-P-S-CH₂-CONH-CH₂- verknüpft ist, wie in dem Molekül der chromogenen Gruppe (5'-C)-O-P-S-CH₂-CONH-CH₂- ist die Länge der Linkerkette 1,4 × 8 = 11,2 Ångström.
Auch wenn der 3'-Kohlenstoff des 3'-endständigen Nukleotids mit der chromogenen Gruppe über eine Substituentenkette (Linker) der Formel -NH-NH-CO-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-, wie in (3'-C)-NH-NH-CO- CH₂-CH₂-CH₂-CH₂- verknüpft ist, beträgt die Länge der Substituentenkette 1,4 × 8 = 11,2 Ångström.
Wie bereits in 6 gezeigt wurde, können die Linker, wenn sie zu kurz oder zu lang sind, eine räumliche Konfiguration bilden, die unwirksam ist um die chromogenen Gruppen in nahe Nachbarschaft zu bringen um ein Excimer zu bilden.
Erfindungsgemäß wurde festgestellt, daß bei Verwendung einer Pyrenylgruppe als chromogene Gruppe diese vorzugsweise in einem Abstand von mindestens 3 Ångström, stärker bevorzugt nicht weniger als 5 Ångström, jedoch nicht mehr als 20 Ångström von dem 5'- oder 3'-Kohlenstoff des endständigen Nukleotids angeordnet ist.
Wenn die Linkerkette 3 Ångström oder weniger lang ist, ist es unmöglich, daß sich die Moleküle der chromogenen Gruppen einander nähern. In diesem Fall ist es im wesentlichen unmöglich, daß ein Excimer oder dergleichen oder Excimer-Fluoreszenz oder dergleichen gebildet wird.
Die Untersuchung unter Verwendung des CPK-Molekülmodells hat sich als wirksam erwiesen, die vorschlägt, daß die Menge der Linkerkette vorzugsweise nicht weniger als 3 Ångström, jedoch stärker bevorzugt, nicht mehr als 20 Ångström beträgt. Eine noch stärker bevorzugte Länge ist 5 Ångström oder mehr, jedoch 15 Ångström oder weniger. Ausführlicher angegeben haben die Erfinder auf Basis der Messung der Excimer-Fluoreszenz gefunden, daß dann, wenn eine Pyrenylgruppe als chromogene Gruppe vorliegt, ein bevorzugter Bereich 5 bis 10 Ångström ist. Anders ausgedrückt, wird die Konjugation einer Pyrenylmethylgruppe an den 5'- oder 3'-Kohlenstoff über eine Etherbindung (4,2 Ångström) nicht bevorzugt.
Erfindungsgemäß unterliegt die Art und das Syntheseverfahren für den Linker keiner Beschränkung, solange die vorstehende Länge des Linkers erreicht wird. Bevorzugte Beispiele sind eine Methylengruppe, eine Amidgruppe, eine Estergruppe, eine Ethergruppe, eine Thiophosphorsäureestergruppe oder mehrere dieser. Die Entscheidung über eine geeignete Art der Linkerkonjugation ist für den Fachmann aufgrund der Gesamtbetrachtung der chemischen Beständigkeit, thermischen Beständigkeit und der bevorzugten Markergruppe eine einfache Wahl.
[Chromogene Gruppe, Markergruppe, Chromophor, Fluorophor]
Die erfindungsgemäß geeignete chromogene Gruppe (oder Markergruppe) ist eine Gruppe, die in einem Teil ein Chromophor enthält. Eine solche chromogene Gruppe ist nicht auf spezifische Gruppen beschränkt, ausgenommen daß sie ein Excimer bildet. Verschiedene chromogene Gruppen können mit Hilfe einer üblichen Synthesemethode in Nukleotide eingeführt werden.
Das Chromophor wird aus der aus Pyren, Naphthalin, Anthracen, Perylen, Stilben, Benzol, Toluol, Phenylanthracen, Diphenylanthracen, Benzpyren, Benzanthracen, Tetracen, Phenanthren, Pentacen, Triphenylen und Chrysen bestehenden Gruppe ausgewählt. Vorzugsweise eignen sich aromatische Chromophore und stärker bevorzugte Beispiele sind chromogene Gruppen, die einen Pyrenring haben.
Erfindungsgemäß wird bevorzugt, daß die chromogenen Gruppen in den beiden Sonden die gleichen sind. Das bedeutet, daß die chromogenen Gruppen nicht zu dem Donor/Akzeptor-System des Fluoreszenzresonanz-Energietransfers gehören.
Die Fluoreszenz, die erfindungsgemäß in Richtung eines Bereiches längerer Wellenlängen verschoben wird, gehört nicht dem Elektronenübertragungs-Typ an, wie später beschrieben wird. Das heißt, erfindungsgemäß wird ermöglicht, die Excimer-Fluoreszenz zu beobachten, die aus den gleichen chromogenen Gruppen emittiert wird. Diese Fluoreszenz wird als Ergebnis der räumlichen Annäherung der beiden chromogenen Gruppen durch die vorher erläuterte Hybridisierung erzeugt. Daher können nur die Sonden nachgewiesen werden, die korrekt an die Zielnukleinsäure hybridisiert sind.
Selbst wenn ein Überschuß an nicht-hybridisierter Sonde vorliegt, können nur die hybridisierten Sonden nachgewiesen werden, ohne daß Störungen durch Monomer-Fluoreszenz aufgrund der unhybridisierten Sonde stattfinden.
[Hybridisierung]
Das Verfahren für die Hybridisierung des Zielpolynukleotids an die Polynukleotide der beiden Sonden für den Nukleinsäurenachweis gemäß der Erfindung unterliegt keiner Beschränkung.
Erfindungsgemäß können vorzugsweise die üblichen Bedingungen für die Hybridisierung angewendet werden (beispielsweise die Methode, die in Molecular Cloning, A Laboratory manual, 2nd. ed., J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 beschrieben ist).
So können beispielsweise die beiden Sonden und die Zielnukleinsäure vorzugsweise hybridisiert werden, indem sie bei 25°C in einer Lösung vermischt werden. Alternativ können sie hybridisiert werden, indem sie bei einer höheren Temperatur (z. B. einer Temperatur, die 10°C niedriger als die Schmelztemperatur der Hybriddissoziierung ist) umgesetzt werden, wonach getempert wird, um sie auf Raumtemperatur zurückzubringen.
Erfindungsgemäß kann darüber hinaus das Zielpolynukleotid identifiziert oder quantitativ bestimmt werden, ohne daß nach der Hybridisierung Waschen oder andere Maßnahmen angewendet werden.
Die Nachweismethode unterliegt keiner Beschränkung, solange es sich um eine Maßnahme der Fluoreszenzmessung handelt. Beispielsweise kann die Fluoreszenz vorteilhaft unter Verwendung eines handelsüblichen Fluoreszenzmeßgeräts gemessen werden.
Wie in 4 gezeigt ist, ist es möglich, nicht nur die Fluoreszenz der chromogenen Gruppen per se (in diesem Fall Pyren) (Wellenlängenmaximum 380 nm), sondern auch die zum Bereich längerer Wellenlängen verschobene Excimer-Fluoreszenz (Wellenlängenmaximum etwa 500 nm) zu messen. Natürlich wird dieses Excimer-Maximum vor der Hybridisierung keinesfalls beobachtet. Eine quantitative Bestimmung der hybridisierten Zielsubstanz ist daher äußerst leicht. Durch die Aufzeichnung einer genauen Kalibrierungskurve wird es möglich, durch Messung der Fluoreszenzintensität die Konzentration der Zielnukleinsäure zu bestimmen, wie in 5 gezeigt ist. Die experimentellen Daten der 5, die unter Verwendung eines üblichen Fluorometers erhalten wurden, zeigen die Nachweisgrenzen der vorliegenden Erfindung nicht an. Eine Verbesserung der Empfindlichkeit des Fluorometers würde den Nachweis mit höherer Empfindlichkeit ermöglichen. Für den Fachmann auf dem Gebiet ist es leicht, durch geeignete Wahl das Meßsystem zu optimieren. 6 zeigt jedoch, daß mindestens einige nM nachgewiesen werden können.
Insbesondere kann auch die erfindungsgemäße Sonde für die Analyse im Überschuß angewendet werden und das vorstehend be schriebene Verfahren kann durchgeführt werden, ohne daß eine Interferenz durch Monomer-Fluoreszenz durch die chromogene Gruppe der überschüssigen Sonde, die nicht hybridisiert wurde, auftritt.
[Nachweis einer Nukleinsäure mit Punktmutation]
Das erfindungsgemäße Nachweisprinzip besteht, wie vorstehend erläutert wurde, darin, daß die beiden Sonden korrekt an die Zielnukleinsäure hybridisieren, und eine starke Excimer-Fluoreszenz erzeugen, deren Messung zu dem Nachweis und der quantitativen Bestimmung der Zielnukleinsäure führt. Selbst wenn daher Nukleinsäurebasen, die kein Basenpaar (Duplex) bilden können, zwischen den terminalen Enden der beiden mit den Markergruppen konjugierten Sonden vorhanden sind, können die Sonden so ausgebildet werden, daß diese Basen aus der Basensequenz der Sonden entfernt sind. Die so ausgebildeten Sonden können für den hochempfindlichen, hochselektiven Nachweis einer Zielnukleinsäure verwendet werden, die nur in einer solchen Basensequenz verschieden ist, das heißt in einer Nukleinsäure mit Punktmutation. Diese Möglichkeit wird in 7 gezeigt. In Gegenwart von etwa einer oder zwei Nukleinsäurebasen zwischen den beiden Sonden tritt erfindungsgemäß ein merklicher Abfall der Intensität der Excimer-Fluoreszenz auf. Durch diese Ergebnisse kann eine Punktmutation identifiziert werden (8).
Die Erfindung wird nachstehend ausführlicher unter Bezugnahme auf spezifische Beispiele beschrieben, welche die Erfindung nicht einschränken.
Das 3'-terminale Nukleotid der Sonde 2 (Verbindung 3) in der folgenden Beschreibung war ein Ribonukleotid, mit der Ausnahme, daß in anderen Verbindungen Desoxyribonukleotid verwendet wurde.
[Synthese eines Oligonukleotids]
Oligonukleotid-32-mer, das als nachzuweisendes Modell verwendet wurde, hatte die Sequenz:
5'-AGAGGGCACGGATACCGCGAGGTGGRGCGAAT-3' (Verbindung 1).
Als Nukleinsäure-Nachweis-Sonde 1 wurde ein Nukleotid verwendet, das zu der Basensequenz vom 5'-terminalen Ende bis zu der 16ten Base des Ziels komplementär war:
3'-TCTCCCGTGCCTATGG-5' (Verbindung 2).
Außerdem wurde als Nukleinsäure-Nachweis-Sonde 2 ein Nukleotid verwendet, das zu der Basensequenz von der 17ten zur 32ten Base vom 5'-terminalen Ende des Oligonukleotid-32-mer (Verbindung 1) komplementär war:
3'-(C)GCTCCACCTCGCTTA-5' (Verbindung 3) (jedoch nur das Nukleotid mit (C) ist Ribonukleotid).
Alle diese Nukleotide wurden durch die Festphasen-Phosphoramidit-Methode unter Verwendung einer automatischen Synthesevorrichtung (Millipore Limited) synthetisiert.
Das Oligonukleotid-32-mer (Verbindung 1) und die beiden als Sonden verwendeten Oligonukleotid-l6-mere (Verbindung 2, Verbindung 3) wurden jeweils abgetrennt und durch Umkehrphasen-Hochleistungs-Flüssigchromatographie gereinigt (Säule, PepRPCTM 4m HR5/5, Pharmacia Fine Chemicals, Elutionslösungsmittelsystem, Acetonitril/0,1 m Ammoniumacetat, Mischlösungsgradient, Nachweiswellenlänge, 260 nm).
Alle Verbindungen wurden durch Gelfiltration entsalzt und für die Kondensation gefriergetrocknet.
[Einführung einer chromogenen Pyrengruppe in das 5'-terminale Ende der Nukleinsäure-Nachweis-Sonde 1 (3'-TCTCCCGTGCCTATGG-5')(Verbindung 2)].
In die Oligonukleotid-Sonde 1 (Verbindung 2, Molekulargewicht 4904,21, Extinktionskoeffizient ε 139,9 mmol^–1·Liter·cm^–1), die vorstehend erhalten wurde, wurde nach der Methode von Czworkowski et al. (Czworkowski J. et al., Biochemistry, 30, Seite 4821, 1991) eine Pyrengruppe gemäß der folgenden Verfahrensweise eingeführt:

(i) 2 mg der Verbindung 2 wurden mit 2,5 ml einer Lösung vermischt, die 140 mM Tris-HCL (pH 7,6) enthaltend 20 mM MgCl₂ und 0,2 mol KCl, 2,135 ml Wasser, 0,05 ml 500 mM Dithiothreitol, 0,5 ml 100 mM Adenosin-5'-0-(3'-thiotriphosphat) (Lithiumsalz, Boehringer Mannheim) und 0,04 ml einer T₄-Polynukleotidkinase-Lösung (Takara) enthielt. Das Gemisch wurde 3 Stunden bei 36°C unter Lichtausschluß stehengelassen.
(ii) Außerdem wurden 2,5 ml 2 m NaCl und 2,5 ml Wasser zugesetzt und danach wurden ein Gemisch aus Chloroform und Methanol im Volumenverhältnis 1 : 1 zugefügt. Das Gemisch wurde zentrifugiert und die wässerige Phase gewonnen.
iii) Zu der resultierenden wässerigen Phase wurden 10 ml Chloroform zugesetzt und das Gemisch wurde zentrifugiert, um die wässerige Phase zu gewinnen. Nach der Fällung mit Ethanol wurde das resultierende Desoxyoligonukleotid konzentriert und Lösungsmittelaustausch wurde unter Verwendung einer Sephadex G-25-Kolonne (Pharmacia Fine Chemicals), die mit 25 mM HEPES/NaOH (pH 7,4), das 0,5 mM NaCl und 10 mM Mercaptoethanol enthielt, äquilibriert war, durchgeführt.
(iv) Nachdem das Desoxyoligonukleotid durch Ausfällen mit Ethanol und zentrifugale Abtrennung zur Trockene verfestigt war, wurden die folgenden Lösungsmittel in der angegebenen Reihenfolge zugesetzt: 4 ml 50 mM Bicin/KOH (pH 8,4), 5 ml Dimethylformamid (DMF) und 1,0 ml einer Lösung von (N-(1-Pyrenylmethyl)-iodacetamid (Molekülsonde) in DMF und das Gemisch wurde 4 Stunden bei Raumtemperatur gerührt.
(v) Der Überschuß des Reaktionsgemisches wurde durch Fällung mit Ethanol entfernt und der Rückstand wurde durch Zentrifugieren konzentriert, wobei Verbindung 4 erhalten wurde. Deren Struktur ist in 9 gezeigt.
(vi) Zur weiteren Reinigung wurde ODS (Octadecylsilan)-Umkehrphasen-Hochleistungs-Flüssigchromatographie verwendet. Die verwendete Säule war eine Säule von 21,5 mm × 15 cm mit TSKgel OligoDNA RP (TOSOH). Ein Gemisch aus Acetonitril und 0,1 m Ammoniumacetat wurde für die Elution verwendet und die Säule wurde mit dem folgenden Konzentrationsgradienten eluiert (Elutionsrate 1 ml/min, Raumtemperatur): 5 : 95 während der ersten 5 Minuten, abgeändert in 40 : 60 während der darauffolgenden 175 Minuten.
(vii) Die resultierende Probe wurde bei Raumtemperatur durch Zentrifugieren konzentriert. Das Endprodukt wurde in 0,01 m Tris-HCl-Puffer (pH 7,5), der 3,0 mM EDTA und 0,1 m NaCl enthielt, eluiert und in gefrorenem Zustand bei –85°C aufbewahrt.

[Einführen einer chromogenen Pyren-Gruppe in das 3'-terminale Ende der Sonde 2 für den Nukleinsäurenachweis (3'-(C)GCTCCACCTCGCTTA-5')(Verbindung 3), Teil 1]
In die Oligonukleotid-Sonde 2 (Verbindung 3, Molekulargewicht 4849,18, Extinktionskoeffizient ε 136,4 mmol^–1·Liter·cm^–1), die nach der vorstehend beschriebenen Methode synthetisiert worden war, wurde eine Pyrengruppe mit Hilfe einer Modifikation der Methode von Reins, Cantor et al. (Koenig, P., Reins, S. A., Cantor, C. R. (1977), "Pyrene Derivatives as Fluorescent Probes of Conformation Near the 3'-Termini of Polyribonucleotides", Biopolymers 16, 2231–2242) nach der folgenden Verfahrensweise eingeführt:

(i) 45,5 Mikrogramm des Oligonukleotids (Verbindung 3) wurden in 0,5 ml 0,05 m Acetatpuffer (pH 5,6) gelöst.
(ii) 2,0 Milliliter eines 0,05 m Acetatpuffers (pH 5,6), der 110 mg NalO₉ enthielt und 7,5 m Harnstoff wurden zugesetzt und das Gemisch wurde 45 Minuten bei Raumtemperatur unter Lichtausschluß stehengelassen.
(iii) Außerdem wurde 0,5 ml KCl zugesetzt und das Gemisch wurde bei 4°C stehengelassen, um überschüssiges NaIO₄ auszufällen.
(iv) Nach dem Entfernen des Niederschlags durch Zentrifugieren wurde das Oligonukleotid durch Fällung mit Ethanol ausgefällt.
(v) Der Niederschlag wurde in einer kleinen Menge 0,05 m Acetatpuffer (pH 5,6), der 3 mM EDTA enthielt, gelöst, wonach die Lösung durch eine mit dem gleichen Puffer äquilibrierte Sephadex G-25-Säule entsalzt wurde.
(vi) Die Oligonukleotidfraktionen wurden unter Verwendung der Absorption bei 280 nm als Meßgröße gewonnen. Sie wurden kombiniert und durch Fällung mit Ethanol konzentriert.
(vii) Zu dem Niederschlag wurden 3,0 ml 0,05 m Acetatpuffer (pH 5,6) zugesetzt, wonach 3,0 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) zugegeben wurden, worin 3 mg 1-Pyrenbuttersäure-hydrazid gelöst waren. Das Gemisch wurde 2 Stunden bei 37°C unter Lichtausschluß stehengelassen.
(viii) Dann wurde 0,3 ml 2 m KCl zugesetzt, wonach überschüssiges Ethanol zugefügt wurde, um das Oligonukleotid auszufällen.
(ix) Nach dem Zentrifugieren wurden 1,0 ml 0,01 m Tris-HCl-Puffer (pH 7,5) mit einem Gehalt an 3,0 mM EDTA-Natriumsalz und 0,1 m KCl zu dem Niederschlag zugefügt, um ihn wieder zu lösen.
(x) Schließlich wurde NaBH₃CN (Natriumcyanborhydrid) zugefügt und die Reduktionsreaktion wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur
durchgeführt. Die Menge des zugesetzten NaBH₃CN betrug etwa 320 mol pro mol der Sonde.
(xi) Dann wurde mehrere Male die Fällung mit Ethanol durchgeführt, bis bestätigt wurde, daß in dem Überstand nach dem Zentrifugieren die von Pyren emittierte Fluoreszenz vollständig verschwunden war. Dann wurde der endgültige Niederschlag durch Zentrifugieren zur Trockne verfestigt, wobei Verbindung 5 erhalten wurde. 10 zeigt die Struktur der Verbindung 5.
(xii) Die Reinigung wurde mit Hilfe von ODS-Umkehrphasen-Hochleistungs-Flüssigchromatographie durchgeführt. Die verwendete Säule war eine 21,5 mm × 15 cm-Säule von TSKgel OligoDNA RP (TOSOH). Als Lösungsmittel wurde ein Gradient aus einem Gemisch von Acetonitril und 0,1 m Ammoniumacetat verwendet.
(xiii) Die resultierende Verbindung 5 wurde bei Raumtemperatur durch Zentrifugieren konzentriert. Das Produkt wurde in 0,01 m Tris-HCl-Puffer (pH 7,6), der 3,0 mM EDTA-Natriumsalz und 0,1 m NaCl enthielt, gelöst und im gefrorenen Zustand bei –85°C aufbewahrt.

[Einführung einer chromogenen Pyrengruppe in das 3'-terminale Ende der Sonde 2 für den Nukleinsäurenachweis (3'-(C)GCTCCACCTCGCTTA-5')(Verbindung 3), Teil 2]
Um eine chromogene Pyrengruppe in das 3'-terminale Ende der Sonde 2 für den Nukleinsäurenachweis (Verbindung 3) einzuführen, wurde auch die nachstehend beschriebene Methode verwendet. Diese Methode war eine teilweise modifizierte Form der Methode von B. P. Gottikh et al. (Gottikh, B. P., Krayevsky, A. A., Tarussova, N. B., Tsilevich, T. L., Tetrahedron, 26, 4419–4433(1970)) und wird nachstehend als CDI (Carbonyldiimidazol)-Methode bezeichnet.

(i) Eine 1,2 m CDI-Lösung in DMF(Dimethylformamid) wurde hergestellt.
(ii) Zu 0,1 ml dieser Lösung wurde 0,1 ml einer DMF-Lösung von 0,4 m 1-Pyrenbutansäure zugesetzt und das Gemisch wurde etwa 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt.
(iii) Zu der resultierenden Lösung wurde eine wässerige Lösung des 16-Meren in einer Konzentration von 400 nnmol/0,5 ml zugegeben und das Gemisch wurde 3 Stunden bei Raumtemperatur im Dunklen inkubiert.
(iv) Das Lösungsmittel wurde durch Zentrifugal-Verdampfen entfernt.
(v) Zu dem Rückstand wurden nacheinander Wasser und Chloroform zur Lösungsmittelextraktion zugesetzt.
(vi) Die wässerige Fraktion wurde gewonnen und Chloroform wurde erneut zur Lösungsmittelextraktion zugegeben.
(vii) Von den gewonnenen wässerigen Fraktionen wurde das Lösungsmittel durch Abpipettieren entfernt und dann durch Zentrifugal-Verdampfung kondensiert.
(viii) Die Reinigung wurde durchgeführt, indem eine kleine Wassermenge zugesetzt wurde und das Gemisch der ODS-Umkehrphasen-Hochleistungs-Flüssigchromatographie unterworfen wurde. Die verwendete Säule war eine 21,5 mm × 15 cm-Säule mit TSKgel OligoDNA RP (TOSOH). Die Elution wurde unter Verwendung eines Gemisches aus Acetonitril und 0,1 m Ammoniumacetat mit Hilfe des folgenden Konzentrationsgradienten durchgeführt (Elutionsrate 1 ml/min, Raumtemperatur): 5 : 95 während der ersten 5 Minuten, geändert in 40 : 60 während der nachfolgenden Dauer von 175 Minuten.
(ix) Die resultierende Probe (16-Mer, in das Pyrenbutansäure eingeführt ist) (Verbindung 6) wurde in 0,1 m Phosphatpuffer (pH 7) gelöst und bei –85°C aufbewahrt. 11 zeigt die Struktur der Verbindung 6.

[Grundsätzliches Verfahren für die Hybridisierung]
Etwa 66 nM des Zieloligonukleotids (Verbindung 1) und etwa 66 nM der Oligonukleotid-Sonden (Verbindung 4, Verbindung 5) wurden zu einer 10 mM Phosphatpuffer-Lösung (pH 7,0) gegeben, die 20% (Vol/Vol) Dimethylformamid (DMF) und 0,2 m NaCl enthielt. Das Gemisch wurde bei 25°C inkubiert. Durch Überwachen der Absorption (A260) der Nukleinsäure gegenüber der Temperatur dieser Lösung, d. h. des hyperchromen Effekts, wurde festgestellt, daß die Hybridisierung vollständig war, wenn die Temperatur 25°C oder weniger betrug.
[Bestätigung der Excimer-Bildung]
Fluoreszenzspektren wurden unter den vorstehend erwähnten grundsätzlichen Hybridisierungsbedingungen gemessen. Wie in 4 gezeigt ist, wurde die für das Pyren-Monomere charakteristische Fluoreszenz in einem Wellenlängenbereich bei etwa 400 nm beobachtet und gleichzeitig wurde eine breite Fluoreszenzbande bei etwa 500 nm beobachtet. Eine solche breite Fluoreszenzbande bei etwa 500 nm wird nur in Gegenwart der vorstehend beschriebenen drei Oligonukleotide beobachtet und gleicht den Fluoreszenzspektren von bekannten Pyren-Excimeren. Somit geht die Fluoreszenzbande auf die Excimer-Fluoreszenz zurück (Birks, J. B., Christophorous, L. G. (1963), Spectrochim, Acta 19, 401–410).
Wenn die obige Fluoreszenzbande bei 495 nm auf die Excimer-Fluoreszenz zurückzuführen ist, sollten ihre Intensitäten durch entsprechende Verminderungen der Intensität der Fluoreszenz des Pyren-Monomeren begleitet sein. Tatsächlich wurde festgestellt, daß bei einem Anstieg der Konzentration des Zieloligonukleotids das Intensitätsverhältnis von Excimer zu Monomer anstieg (4).
Diese Feststellungen ließen darauf schließen, daß die Fluoreszenzbande bei etwa 500 nm die Excimer-Fluoreszenz darstellte.
[Möglichkeit für die quantitative Analyse der Zielnukleinsäure]
5 zeigt die relativen Intensitäten der Fluoreszenzbanden bei etwa 500 nm, die erhalten werden, wenn verschiedene Konzentrationen der Zieloligonukleotide zu einer Lösung gegeben werden, die gleiche Mengen der Sonden für den Nukleinsäurenachweis enthält (Verbindung 4, Verbindung 5), die jeweils im Überschuß vorhanden sind. Die Verwendung der in 5 gezeigten Kalibrierungskurve ermöglicht es, das Zieloligonukleotid quantitativ zu bestimmen.
[Abhängigkeit der Intensität der Excimer-Fluoreszenz von der Länge des Linkerarms]
6 zeigt die Fluoreszenzspektren von Hybriden, die aus dem Zielnukleinsäure-32-meren und äquimolaren Konzentrationen der 16-Mer-Sonde, in Pyrenbuttersäure eingeführt wurde und der 16-Mer-Sonde, in die Pyrenalkyl-iodacetamid eingeführt wurde, bestehen. Das hier angegebene Pyrenalkyl-iodacetamid hat eine Länge des Linkerarms, die verschieden von der von Pyrenmethyliodacetamid ist (das heißt dem Teil der Alkylkette). Die Synthesemethode ist jedoch genau die gleiche wie für die 16-Mer-Sonde in die Pyrenmethyl-iodacetamid eingeführt ist.
Wie in 6 gezeigt ist übt selbst dann, wenn eine der Sonden identisch ist (16-Mer mit eingeführter Pyrenbutansäure) eine Veränderung der Länge des Linkerarms der anderen Sonde durch nur eine Methylengruppe einen wesentlichen Einfluß auf die Quantenausbeute der Excimer-Fluoreszenz aus. Unter diesen Versuchsbedingungen zeigt das 16-Mer mit einer Pyrenmethyliodacetamidgruppe die höchste Quantenausbeute und ein Linker, der länger oder kürzer ist als der des 16-Meren mit eingeführ ter Pyrenmethyl-iodacetamidgruppe führt zu schlechteren Ergebnissen.
Diese Tatsachen führen zu der Annahme, daß eine Länge von 11,4 Ångström vom 5'-Kohlenstoff der terminalen Desoxyribose die optimale Länge des Linkers ist. Die Länge des Linkerarms ist 9,8 Ångström für PIA und 12,6 Ångström für PPIA.
[Nachweis einer Zielnukleinsäure mit Punktmutation]
Die Erfinder haben außerdem eine Hybridisierung untersucht, bei der die Basensequenzen der vorstehend angegebenen zwei Sonden gemäß der Erfindung nicht vollständig kontinuierlich im Hinblick auf die Zielsequenz sind. Wie in 7 gezeigt, wurde die Excimer-Bildung merklich unterdrückt, wenn die beiden Sonden auf dem Hybrid nach der Hybridisierung 1 oder 2 Nukleotide voneinander entfernt waren (8). Diese Erkenntnis zeigt, daß die kontinuierliche Anordnung der beiden Sonden in dem Hybrid eine Voraussetzung für eine intensive Excimer-Emission ist.
Diese Tatsachen bedeuten, daß dann, wenn die Hybridisierung so ausgebildet ist, daß benachbarte terminale Enden von zwei Sonden auf dem Hybrid voneinander durch einen Abstand getrennt sind, der einer Ein- oder Zwei-Basensequenz entspricht (Region mit Punktmutation, siehe 8) ein Gen des Wildtyps und ein punktmutiertes Gen in einer homogenen Lösung unterschieden und identifiziert werden können.
In den Modellversuchen der Anmelder (7) ist die Zielnukleinsäure die vorstehend angegebene Sequenz (das heißt ein 33-Mer oder 34-Mer) die durch Insertion von einem oder zwei Thymin-desoxyribonukleotiden in die Mitte des 32-Mer gebildet ist. Es kann daher ein großer Abstand zwischen den benachbarten terminalen Enden (5'-Terminus einer Sonde und 3'-Terminus der anderen Sonde) nach der Hybridisierung auf dem Hybrid vor handen sein (siehe 8). Infolgedessen kann keine optimale Konfiguration für die Excimer-Bildung erzielt werden.
Industrielle Anwendbarkeit
Erfindungsgemäß werden Sonden für den Nukleinsäurenachweis bereitgestellt, die nicht radioaktiv sind und auf der Hybridisierung beruhen. Es wird außerdem eine hochempfindliche Methode geschaffen, die zum Erkennen einer Einbasen-Differenz zwischen Nukleinsäuresequenzen befähigt ist. Erfindungsgemäß kann auch spezifisch ein Komplex aus der Zielnukleinsäure und der Sonde nachgewiesen werden, ohne daß der dem Reaktionsgemisch zugesetzte Überschuß der Sonde nach der Hybridisierungsreaktion ausgewaschen werden muß.

Claims

Kit für die Nukleinsäureanalyse, welcher eine erste Sonde 1 und eine zweite Sonde 2 zum-Nachweisen eines Zielpolynukleotids einer Sequenz aus q Basen enthält, wobei die Sonde 1 eine Basensequenz, die einer Sequenz aus r aufeinander folgenden Basen vom 5'-terminalen Ende des Zielpolynukleotids komplementär ist, wobei r eine ganze Zahl zwischen 1 und (q – 1) ist, und eine chromogene Gruppe hat, die mit dem 5'-terminalen Nukleotid über einen Linkerarm verknüpft ist, und wobei die zweite Sonde 2 eine Basensequenz, die einer Sequenz zwischen der Base (r + 1) und der Base q vom 5'-terminalen Ende des Zielpolynukleotids komplementär ist, und eine chromogene Gruppe hat, die mit dem 3'-terminalen Nukleotid über einen Linkerarm verknüpft ist, so daß, wenn die Sonden 1 und 2 an das Zielpolynukleotid hybridisieren, die chromogene Gruppe der Sonde 1 und die chromogene Gruppe der Sonde 2 benachbart sind und ein Excimer bilden, das bei einer längeren Wellenlänge fluoresziert als die chromogene Gruppe der Sonde 1 und die chromogene Gruppe der Sonde 2.
Kit nach Anspruch 1, worin die chromogene Gruppe, die mit der Sonde 1 oder der Sonde 2 verknüpft ist, unter Pyrin, Naphthalin, Anthracen, Perylen, Stilben, Benzol, Toluol, Phenylanthracen, Diphenylanthracen, Benzpyren, Benzanthracen, Tetracen, Phenanthren, Pentacen, Triphenylen und Chrysen ausgewählt ist.
Kit nach Anspruch 2, worin die chromogene Gruppe Pyren ist.
Kit nach einem der Ansprüche 1 bis 3 , wobei die Länge des Linkerarms, der mit der Sonde 1 oder der Sonde 2 verknüpft ist, 0,3 bis 2 nm (3 bis 20 Å) ist.
Kit nach Anspruch 4, wobei die Länge des Linkerarms 0,5 bis 2 nm (5 bis 20 Å) ist.
Kit nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der Linkerarm, der mit der Sonde 1 verknüpft ist, oder der Linkerarm, der mit der Sonde 2 verknüpft ist, die Formel -CH₂)n-(X)k-(CH₂)m-Y hat, worin X unter CONH, NHCO, COO, OCO, O, S und NH ausgewählt ist, Y unter O, S, NH und (PO₃ ^–)S ausgewählt ist, n und m jeweils 0 oder eine ganze Zahl von 1 bis 5 sind und k 0 oder 1 ist.
Verfahren zum Nachweisen eines Zielpolynukleotids mit einer Sequenz aus q Basen durch Hybridisieren an erste und zweite Nukleinsäuresonden 1 und 2, wobei das Verfahren die Stufen umfaßt, bei denen das Zielpolynukleotid mit den ersten und zweiten Nukleinsäureproben 1 und 2 nach einem der Ansprüche 1 bis 6 gemischt wird, die Proben an das Zielpolynukleotid hybridisiert werden und deren Fluoreszenz bei einer längeren Wellenlänge als derjenigen, bei der die chromogenen Gruppen der Sonden fluoreszieren, gemessen wird.