DE69911007T2

DE69911007T2 - Nukleinsäuresequenzidentifizierung

Info

Publication number: DE69911007T2
Application number: DE69911007T
Authority: DE
Inventors: Mark David Rudheath WHITCOMBE; Duncan 295 Cathedral Street GRAHAM; Ewen William 295 Cathedral Street SMITH
Original assignee: University of Strathclyde
Current assignee: University of Strathclyde
Priority date: 1998-05-20
Filing date: 1999-05-20
Publication date: 2004-07-08
Anticipated expiration: 2019-05-21
Also published as: EP1080223A1; DE69911007D1; EP1080223B1; JP4444502B2; ATE248929T1; GB9810865D0; AU3946599A; WO1999060157A1; JP2002515590A; US7001721B1

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren und Materialien zum Detektieren oder Identifizieren bestimmter Nucleinsäuresequenzen unter Anwendung von Oberflächenverstärkter Resonanz-Raman-Streuung (Surface-Enhanced-Resonance-Raman-Scattering, „SERRS".
Stand der Technik
Es besteht derzeit ein großer Bedarf an Technologien, die entweder spezielle Sequenzen oder Punktmutationen oder Polymorphismen in einer Zielsequenz einer Nucleinsäure aus einer bestimmten Quelle detektiert. Aus solchen Verfahren hergeleitete Informationen können in zahlreichen Aspekten der genetischen Untersuchung verwendet werden.
Folglich kann die Identifizierung bestimmter Zielsequenzen bei der Diagnose und Detektion bestimmter Mittel verwendet werden, die diese Sequenz enthalten (z. B. invasive Pathogene, wie z. B. ein Virus), oder können verwendet werden, um größere, die Zielsequenz enthaltende Sequenzen zu isolieren.
Die Detektion von Nucleinsäurevarianten wird in Evolutions- und Populationsstruktur-Untersuchungen, in der forensischen Medizin und bei der Analyse und Diagnose genetischer Krankheiten verwendet. Variationen der DNA-Sequenz zwischen Individuen können verwendet werden, um Gene oder Untersequenzen zu identifizieren oder zu isolieren, die mit bestimmten Merkmalen verbunden sind, zum Beispiel Krankheitsmerkmalen in Organismen von Interesse, wie z. B. in Menschen.
Einige gegenwärtig zum Detektieren (feststellend oder bewertend) von Nucleinsäurevarianten verwendete Verfahren werden von Schafer und Hawkins, Nature Biotechnology 16, 33–39 (1998), besprochen.
Diese Verfahren umfassen Einzelstrang-Konformationspolymorphismus-Analyse (SSCP), Heteroduplexanalyse (HA), Elektrophorese im denaturierenden Gradientengel (DGGE), Duplexspaltung (z. B. unter Verwendung von RNase, Chemie oder Endonucleasen). Bewertende Verfahren umfassen Minisequenzierung, Nucleasetests oder standardmäßige Sanger-Sequenzierung.
Die meisten dieser Verfahren beruhen auf der spezifischen Bindung von Sonde oder Primer an die Sequenz, auf die abgezielt wird, gefolgt von der Detektion des Bindungsereignisses (z. B. durch Stabilität, Mobilität oder Gegenwart eines Markers). Wegen der Empfindlichkeit der Detektionsverfahren ist die Amplifikation der Probe (z. B. durch PCR) für gewöhnlich vor der Hybridisierung erforderlich. Dies ist wegen der Möglichkeit des Auftretens von Fehlern während des Amplifikationsprozesses, die zu falsch-positiven oder falsch-negativen Ergebnissen führen, unerwünscht.
Ein besonders empfindliches Verfahren zum Identifizieren markierter Nucleinsäuren wird von Graham et al., Anal. Chem. 69, 4703–4707 (1997), offenbart. Dieses beruht auf der Anwendung von Oberflächen-verstärkter Resonanz-Raman-Streuung (SERRS), die ihrerseits eine Entwicklung der Oberflächen-verstärkten Raman-Streuung (Surface-Enhanced-Raman-Scattering, SERS) ist.
Kurz gesagt entsteht ein Ramanspektrum, da auf den Analyten einfallendes Licht wegen der Anregung von Elektronen im Analyten gestreut wird. „Raman"-Streuung tritt auf, wenn ein angeregtes Elektron auf ein anderes Energieniveau zurückfällt, als das, von dem es hergekommen ist – dies resultiert in einer Veränderung der Wellenlänge des gestreuten Lichts und verursacht eine Reihe von Spektrallinien bei höheren sowie niedrigeren Frequenzen als jene des einfallenden Lichts. Das Streulicht kann orthogonal zum einfallenden Strahl detektiert werden.
Normale Ramanlinien sind relativ schwach, und die Ramanspektroskopie ist daher im Vergleich zu anderen verfügbaren Detektionsverfahren zu unempfindlich, um für die chemische Analyse von Nutzen zu sein. Ramanspektroskopie ist auch erfolglos für fluoreszierende Materialien, für die die breiten Fluoreszenzemissionsbanden (die ebenfalls orthogonal zum einfallenden Licht detektiert werden) dazu neigen, die schwächeren Ramanemissionen zu überdecken.
Jedoch erwies sich eine modifizierte Form der Ramanspektroskopie auf Basis von SERS als empfindlicher und ist daher von größerem allgemeinen Nutzen. Der Analyt, dessen Spektrum aufgezeichnet wird, steht in engem Kontakt mit einer aufgerauten Metalloberfläche. Dies bewirkt eine starke Erhöhung der Detektionsempfindlichkeit, wobei der Effekt umso ausgeprägter ist, je näher der Analyt an der „aktiven" Oberfläche sitzt (die optimale Position ist die erste Molekülschicht um die Oberfläche, d. h. innerhalb ungefähr 2 nm von der Oberfläche).
Die Theorie dieser Oberflächenverstärkung wird noch nicht völlig verstanden, es wird jedoch angenommen, dass sich die höherwertigen Elektronen des Analyten mit Elektronenpools (als „Plasmon" bekannt) in Vertiefungen an der Metalloberfläche vereinigen. Wenn einfallendes Licht die Elektronen des Analyten anregt, wird der Effekt auf die Plasmone übertragen, die viel größer als die den Analyten umgebende Elektronenwolke sind, und dies bewirkt die Verstärkung des Ausgangssignals.
Eine weitere Steigerung der Empfindlichkeit kann durch Arbeiten bei der Resonanzfrequenz des Analyten (in diesem Fall für gewöhnlich ein am Ziel von Interesse gebundener Farbstoff) erhalten werden. Die Verwendung einer kohärenten Lichtquelle, die auf das Absorptionsmaximum des Farbstoffs abgestimmt ist, bewirkt einen 10³- bis 10⁵fachen Anstieg der Empfindlichkeit. Dies wird als „Resonanz-Raman-Streuungs"-Spektroskopie bezeichnet. In bestimmten Ausführungsformen kann die Laseranregung auf das Maximum der Plasmon-Resonanz eingestellt werden. In bestimmten Fällen können Plasmon-Resonanz und Farbstoffmaxima zusammenfallen.
Wenn Oberflächenverstärkungswirkung und Resonanzwirkung kombiniert werden, um die SERRS zu ergeben, ist die resultierende Erhöhung der Empfindlichkeit und Robustheit stärker ausgeprägt als die Summe der Einzeleffekte. Darüber hinaus scheint die Empfindlichkeit nicht so entscheidend vom Winkel der Ausrichtung des Analyten zur Oberfläche abzuhängen, als dies mit SERS für sich alleine der Fall ist. Ein SERRS-Signal kann leichter von Verunreinigung und Hintergrund unterschieden werden und neigt dazu, mit den lokalen Bedingungen (z. B. Ionenstärke oder pH, wenn die Analyse in Lösung durchgeführt wird) weniger zu variieren. Fluoreszenz wird ebenfalls gelöscht, was sauberere Ramanspektren liefert und die Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen als detektierbare Analyten ermöglicht. Im Allgemeinen bedeutet die Signalverstärkung, dass eine viel größere Auswahl von Analyten als unter Anwendung normaler Ramanspektroskopie zweckdienlich detektiert werden kann. Außerdem bedeutet die Verstärkung, dass eine weniger leistungsfähige Lichtquelle erforderlich ist, um die Analytenmoleküle anzuregen.
Mit SERRS sind Detektionsgrenzen bis hinab zu einem Molekül für Verbindungen erzielt worden, die Licht im sichtbaren Wellenlängenbereich oder im elektromagnetischen Spektrum absorbieren (siehe Emory und Nie, Near-Field Surface-Enhanced Raman Spectroscopy on Single Silver Nanoparticles, Anal. Chem. 69, 2631– 2635 (1997)). Diese Technik ist daher empfindlicher als Fluoreszenz (siehe z. B. C. Rodger et al., J. Chem. Soc. Dalton Trans., S. 791–799 (1996)), und darüber hinaus enthalten die erhaltenen SERRS-Spektren molekulare Informationen, welche die Identifizierung und Unterscheidung von Verbindungen erlauben.
WO 97/05280 (University of Strathclyde) offenbart praktische Darstellungen der Verwendung von SE(R)RS bei der Nucleinsäuredetektion und -sequenzierung. Die darin offenbarten Verfahren bauen allgemein rund um die Verwendung einer markierten, abzielenden Spezies auf, die an die gegebenenfalls vorhandene Zielspezies bindet, um einen Komplex zu bilden. Der Komplex wird dann mit einer SER(R)S-Oberfläche verbunden und unter Verwendung einer geeigneten Apparatur detektiert.
US-Patent Nr. 5.721.102 (Vo Dinh et al.) beschreibt eine markierte SER-Gensonde, die verwendet wird, um an komplementäre Sequenzen zu hybridisieren (und diese zu markieren). Nicht hybridisiertes Material wird vom hybridisierten Material entfernt und das hybridisierte Material analysiert.
Es wird aus dem Obigen deutlich, dass neue Formate zum Detektieren oder Identifizieren bestimmter Nucleinsäuresequenzen in einer Probe, insbesondere jene, die einen oder mehrere Vorteile gegenüber jenen aufweisen, die derzeit in Verwendung stehen, einen Beitrag zum Fachgebiet der Erfindung leisten würden.
Offenbarung der Erfindung
Die Erfinder haben ein neues, auf SERS/SERRS beruhendes Verfahren zum Detektieren oder Identifizieren einer bestimmten Nucleinsäuresequenz in einer Probe erfunden. Dieses erfordert nicht nur keine Amplifikation der Probe vor der Detektion, sondern kann in bevorzugten Formaten des Verfahrens unter Verwendung einfacher Eintopf-Mischverfahren durchgeführt werden, um eine rasche, hochempfindliche Detektion der Zielsequenzen ohne der Notwendigkeit bereitzustellen, das ungebundene, markierte abzielende Mittel von markierten Zielkomplexen abzutrennen. Dies wird erzielt, indem die Funktionalität der SER(R)S-Oberfläche von der Anwesenheit der Zielprobe abhängig gemacht wird. Folglich wird das ungebundene markierte Ziel im Gegensatz zu gewissen bestehenden Techniken, die auf markierten Sonden basieren, kein falsches Ergebnis erzeugen, wenn es während der Detektion anwesend ist.
Die vorliegende Erfindung kann entweder im SERS- oder im SERRS-Format angewendet werden, und es wird hiernach die Abkürzung SER(R)S verwendet, um dies auszudrücken. Allgemein gesprochen wird SERRS wegen seiner Vorteile hinsichtlich der Empfindlichkeit bevorzugt.
Bei bekannten Nucleinsäuredetektionsformaten, wie z. B. jenen, die in WO 97/05280 (University of Strathclyde) beschrieben sind, wird ein Metallkolloid, das sorgfältig auf kontrollierte Weise aggregiert worden ist, zu markiertem Zielkomplex vor der Detektion gegeben. In der vorliegenden Erfindung ist die Aggregation der kolloidalen SER(R)S-Oberfläche mit den oben beschriebenen begleitenden Vorteilen sogar von der Gegenwart der Zielsequenz abhängig.
Demnach wird in einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Bestimmen der An- oder Abwesenheit einer Ziel-Nucleinsäuresequenz in einer Proben-Nucleinsäure offenbart, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: (a) Aussetzen einer Probe gegenüber einem Nachweismittel, umfassend eine mit einer SER(R)S-aktiven Spezies (SAS) und mit zwei verschiedenen Zielbindungsspezies (TBS) assoziierten Metalloberfläche, (b) Beobachten des Proben/Mittel-Gemisches, um jegliche Oberflächenverstärkung des Markers zu detektieren.
Das Verfahren unterscheidet sich von jenen auf dem Gebiet der Erfindung dahingehend, dass die Metalloberfläche in der Form, in der sie im zugegebenen Mittel vorliegt, ihrerseits nicht zur Oberflächenverstärkung fähig ist. Folglich muss jegliches ungebundenes, nach der Exposition der Probe gegenüber dem Mittel im System vorhandenes Nachweismittel vor dem Beobachtungsschritt nicht entfernt werden. Folglich wird, wenn man bedenkt, dass das Nachweismittel im Allgemeinen im großen Überschuss gegenüber dem Zielmaterial vorhanden sein wird, ungebundenes Mittel während der Detektion im System vorhanden sein, wird jedoch wegen der Art des Verfahrens das Ergebnis nicht störend beeinflussen. Das Verfahren ist daher ein echtes „Eintopf"-Detektionssystem.
Das Ergebnis der Beobachtung wird mit der An- oder Abwesenheit der Zielsequenz, gegebenenfalls durch Vergleich mit Referenzdaten, korreliert.
Das Verfahren ist besonders geeignet, rasche Informationen darüber zu geben, ob eine bekannte oder zumindest vorbestimmte Zielsequenz in einer Nucleinsäurequelle vorkommt.
Das Nachweismittel kann in einer Reihe von gesonderten Schritten oder als eine Reihe von gesonderten Komponenten unter der Voraussetzung der Probe gegenüber ausgesetzt werden, dass letztendlich alle erforderlichen Komponenten im System vorhanden sind.
In Verfahren der Erfindung umfasst das Nachweismittel ein erstes Mittel und ein zweites Mittel, wobei beide eine unterschiedliche TBS aufweisen, wobei jede TBS zur Bindung an die Zielsequenz fähig ist und worin die Bindung der ersten und zweiten TBS an die Zielsequenz eine mit beiden TBS assoziierte Metalloberfläche nahe zueinander bringt, wodurch die Oberflächenverstärkung einer SAS bewirkt wird, die mit einer oder beiden der Metalloberflächen assoziiert ist.
Im Allgemeinen werden die erste und zweite TBS in Nachbarschaft zueinander binden, um ihre jeweiligen Metalloberflächen in Kontakt oder nahezu in Kontakt zu bringen.
Oligonucleotide sind früher verwendet worden, um Metallcluster (Goldkolloide) in Super-Gitter einzubauen (siehe Bethell und Schiffrin, Nature 382, 581 (1996), und ferner Mirkin et al., und Alivisatos et al. auf Seiten 607–609 und 609–611 derselben Ausgabe). Jedoch beschäftigten sich diese Veröffentlichungen allgemein mit der Produktion von makroskopischen Materialien aus Nanopartikeln (so genannte „Nanotechnologie"), wobei die Nucleinsäuren verwendet wurden, um den Einbauprozess zu unterstützen. Der Einbau wurde mittels kolorimetrischer Differenzierung detektiert. Eine weitere Publikation (Storhoff et al., One pot colorimetric differentiation of polynucleotides with single base imperfections using gold nanoparticle grobes, ). Am. Chem. Soc. 120, 1959–1964 (1998)) verwendete ebenfalls kolorimetrische Analyse zur Detektion ausgerichteter Gold-Nanopartikel-Sonden. Jedoch wurde an den zusammengesetzten Strukturen keine Schwingungsspektroskopie durchgeführt. Es wurde kein Vorschlag für die Anwendung der Technik auf dem Gebiet der Ramanspektroskopie gemacht.
Die vorliegende, auf SER(R)S basierende Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf einige der bevorzugten Ausführungsformen ausführlicher erläutert.
Die „Proben-Nucleinsäure" kann jede Nucleinsäure sein, einschließlich DNA (aus jeder Quelle, z. B. genomische DNA, cDNA, synthetische DNA usw.), RNA (z. B. mRNA, tRNA, rRNA, synthetische RNA usw.) oder Derivate davon. Im Allgemeinen ist sie zumindest 16 Nucleotide lang, vorzugsweise ist sie zumindest 24, 30, 40, 50, 100 oder 200 Nucleotide lang. Die Probe kann die gesamte oder einen Teil der in einer gegebenen Quelle vorhandenen Nucleinsäure verkörpern. Die Probe kann vor dem Testen hergestellt werden, um die darin enthaltene Proben-Nucleinsäure für den Testvorgang besser verfügbar zu machen. Zum Beispiel kann die Proben-Nucleinsäure vollständig oder teilweise gereinigt werden und/oder es können Fragmente produziert und getrennt werden. Als Alternative zur oder zusätzlich zur direkten Verwendung der Nucleinsäure in einer Probe können Kopien hergestellt und verwendet werden (z. B. unter Verwendung von PCR). Der Ausdruck „Proben-Nucleinsäure" deckt alle diese Möglichkeiten ab.
Im Allgemeinen wird die Proben-Nucleinsäure vor der Sequenzdetektion als Einzelstrang-Nucleinsäure hergestellt.
Wenn gewünscht, kann die Probe geblottet, angebunden oder anderweitig an einer Festphase immobilisiert werden, gegebenenfalls in Form einer Matrix (z. B. ein so genannter Nucleinsäure-Chip – siehe Marshall und Hodgson, Nature Biotechnology 16, 27–31 (1998)).
Die „Ziel"-Sequenz selbst kann jede Sequenz beliebiger Länge innerhalb der Probe sein, deren Untersuchung gewünscht ist. Somit kann sie eine beliebige Sequenz sein, die sich in einem/einer Genom, subgenomischer Nucleinsäure, Chromosom, extrachromosomalen Vektor oder Gen oder Motiv oder nicht kodierenden Sequenz oder Sequenz-markierten Stelle oder exprimierten Sequenz-Marker findet. Die Sequenz kann von einer beliebigen Quelle, z. B. publiziertem Material einer Datenbank, abgeleitet sein.
Die Sequenz kann innerhalb eines gegebenen Genoms einzigartig sein oder darin mehrfach auftreten (die Verfahren der vorliegenden Erfindung können verwendet werden, um ihre Häufigkeit des Auftretens zu bestimmen). Desgleichen kann die Sequenz für eine) bestimmtes) Individuum, Population oder Spezies, Gattung, Familie usw. einzigartig oder in mehr als einer dieser Gruppierungen vorhanden sein. Die Länge der Zielsequenz kann auf Basis ihrer statistischen Wahrscheinlichkeit des zufälligen Auftretens innerhalb einer gegebenen Genomgröße gewählt werden. Es ist zum Beispiel vorgeschlagen worden, dass eine Sequenz von bis zu 16 Basen in Hefe und einigen mehr in Menschen (z. B. 17–24) ausreichend sein kann, um eine einzigartige Sequenz in diesen Organismen anzuzeigen.
Insbesondere vorgesehen ist die Detektion von Nucleinsäure-„Varianten". Diese können Einzelnucleotidvarianten (Mutationen oder Polymorphismen) oder Tandemwiederholungen variabler Anzahl oder andere Satelliten- oder Mikrosatellitenwiederholungen umfassen. Folglich kann die Zielsequenz in diesen Fällen durch nur eine einzige Base oder Anzahlen von Basenpaaren innerhalb einer gegebenen längeren Sequenz charakterisiert werden.
Wie unten ausführlicher dargelegt ist, kann es wünschenswert sein, mehrere Zielsequenzen unter Anwendung geeigneter unterscheidender Agenzien gleichzeitig zu untersuchen.
Das „Einwirkenlassen" einer Probe mit dem Mittel kann jede Form annehmen, welche die beiden in ausreichende Nähe zueinander bringt, um die Bindung des Mittels an die Zielsequenz der Probe zu ermöglichen. Im Allgemeinen wird dies das Mischen von Lösungen dieser Komponenten sein.
Das „Nachweismittel" weist eine Reihe von wichtigen Merkmalen auf, obgleich betont wird, dass es eine Reihe einzelner Teile umfassen kann, die gleichzeitig oder sogar hintereinander zugegeben werden.
Die Metalloberfläche
Das Mittel umfasst eine Metalloberfläche. Wie oben erörtert liegt diese Oberfläche anfänglich in einer Form vor, die die Oberflächenverstärkung unter für den SER(R)S-Beobachtungsschritt gewählten Bedingungen minimiert, jedoch SER(R)S-aktiv wird, wenn die TBS an die Zielsequenz bindet.
Folglich nutzen die Verfahren der vorliegenden Erfindung die Tatsache aus, dass die Eigenschaften der Oberfläche, mit der ein Raman-aktiver Marker assoziiert ist, eine ausgeprägte Wirkung auf das Ausmaß der erzielbaren Oberflächenverstärkung aufweisen. Beispielsweise befindet sich unter Verwendung von nichtaggregiertem Silberkolloid die Oberflächenverstärkung bei einem Minimum und ergibt unerkennbare undeutliche Signale bei Wellenlängen, die üblicherweise in SER(R)S-Detektionsformaten verwendet werden. Im Gegensatz dazu sind, wenn einmal aggregiert, die erhaltenen SERRS-Signale von einem bestimmten Analyten stark, definierbar und charakteristisch. Diese Wirkung wird in Munro et al., Langmuir 11, 3712–3720 (1995) allgemein diskutiert. Im Wesentlichen zeigten diese Autoren, dass monodisperse kolloidale Silberteilchen (von ungefähr 27 nm Größe) eine maximale Absorptionswellenlänge von ungefähr 400 nm aufweisen, was mit der Anregung dipolarer Oberflächen-Plasmone im Einklang steht. Aggregiertes Kolloid (zum Beispiel aus zwei oder mehreren eng assoziierten Silberteilchen bestehend) zeigt eine eindeutige Verschiebung der Absorption zu höheren Wellenlängen mit einer viel höheren Absorption über 500 nm, als sie von den monodispersen Teilchen gezeigt wurde. Die sichtbaren Absorptionsspektren für aggregierte und nichtaggregierte Teilchen ist in 1 gezeigt. Es ist diese Region (z. B. 500 bis 600 nm), die für die Durchführung von SER(R)S sehr viel brauchbarer ist. SER(R)S-Oberflächen werden auch in Rodger et al., J. Chem. Soc. Dalton Trans., 791–799 (1996), diskutiert.
Die Oberfläche kann durch ein bloßes Metall bereitgestellt werden oder kann eine vollständige oder teilweise Beschichtung umfassen. Sie kann beispielsweise eine Metalloxidschicht oder eine organische Beschichtung, wie z. B. Citrat oder Borhydrid, umfassen.
Im Allgemeinen wird die Oberfläche durch nichtaggregierte kolloidale Metallteilchen bereitgestellt. Zum Beispiel Silber-, Gold- oder Kupferteilchen. Verfahren zum Herstellen solcher nichtaggregierter Kolloide sind nunmehr auf dem Gebiet der Erfindung wohlbekannt. Sie umfassen zum Beispiel die Reduktion eines Metallsalzes (z. B. Silbernitrat) mit einem Reduktionsmittel, wie z. B. Citrat, um eine stabile mikrokristalline Suspension zu bilden (siehe P. C. Lee und D. Meisel, J. Phys. Chem. 86, 3391 (1982)).
Die Kolloidteilchen sind vorzugsweise von monodispersem Charakter. Vorzugsweise haben sie einen Durchmesser von ungefähr 20–35 nm, obgleich dies von der Art des Metalls abhängt.
Vorzugsweise wird die Metalloberfläche durch einzelne Silberkolloidpartikel bereitgestellt, die vorzugsweise im Wesentlichen eine hexagonale Form und einen maximalen Durchmesser von ungefähr 35 nm aufweisen.
In Ausführungsformen, die Metallkolloid einsetzen, verursacht die Bindung der TBS an die Zielsequenz die Annäherung einzelner Metallkolloidteilchen, wodurch sie aggregiert werden oder zumindest die Wirkungen der Aggregation nachahmen, um zum Beispiel eine Oberflächenverstärkung einer SAS, die mit den „aggregierten" Teilchen assoziiert ist, zu bewirken, d. h. eine Verstärkung des Signals bei der gewählten Wellenlänge zu bewirken.
Wie hiernach verwendet beschreiben die Begriffe „Aggregation" oder „Aggregate", wenn der Kontext es nicht anders verlangt, diese Wirkung.
TBS
Die TBS des Mittels ist eine Nucleinsäure oder modifizierte Nucleinsäure oder ein Nucleinsäureanalogon, die/das zur gesamten oder zu einem Teil der Zielsequenz komplementär ist.
Unter gewissen Umständen (wenn die TBS beispielsweise nicht nach Anforderung synthetisiert wird) muss ihre Sequenz nicht notwendigerweise bekannt sein. Beispielsweise kann Nucleinsäure einer (bekannten) Quelle entnommen und gespalten werden, und die gespaltenen Teile können verwendet werden, um das Nachweismittel der vorliegenden Erfindung herzustellen. Folglich ist das Ziel (Ursprungsquelle) vorherbestimmt, auch wenn die Sequenz nicht ermittelt ist.
Mit „komplementär" ist die Fähigkeit der spezifischen Basenpaarung mit der Zielsequenz gemeint, wobei A das Komplement von T (und U) ist; G ist das Komplement von C. Im Allgemeinen laufen komplementäre Nucleinsäuren antiparallel, d. h. eine läuft 5' nach 3', während die andere 3' nach 5' läuft. Wo eine modifizierte Nucleinsäure oder ein Nucleinsäureanalogon verwendet wird, erfolgt die Basenpaarung in geeigneter Weise zwischen entsprechenden modifizierten oder analogen Basen und der komplementären Zielsequenz.
Es versteht sich und ist dem Fachkundigen klar, dass für eine gegebene Zielsequenz und Zielbindungsspezies 100% Komplementarität der vollen Länge der Sequenz nicht erforderlich ist, um die Hybridisierung zwischen den beiden zu gewährleisten (siehe z. B. Sambrook et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, oder spätere Ausgaben dieser Arbeit, zur Erörterung geeigneter Bedingungen, um Nucleinsäurehybridisierung zu erzielen). Folglich können Sequenzen, die nur im Wesentlichen komplementär sind, unter geeigneten Bedingungen ebenfalls hybridisieren, wodurch die oben erörterte, aggregierende Wirkung und daher Obenflächenverstärkung der SAS bewirkt wird.
Es ist bekannt, dass Nucleinsäurehybridisierungsbedingungen normalerweise die Gegenwart von Salz erfordern, um die Abstoßung der negativen Phosphatgerüste zu verhindern. Wenn jedoch Salz zu der kolloidalen Suspension gegeben wird, dann kann Aggregation auftreten, die ein falsches Ergebnis produziert. Dies kann durch Modifizierung der Nucleinsäure und/oder des Kolloids oder Verwenden eines Nucleinsäureanalogons verhindert werden.
Zum Beispiel ist bekannt, dass DNA-Formen, die neutral oder zumindest zwitterionisch sind, für das Auftreten der Hybridisierung keine hohen Salzkonzentrationen erfordern. Ein mögliches Beispiel dafür ist Propargylamino-modifizierte Base, wie sie von Cruickshank und Stockwell, Tetrahedron Letters 29, 5221–5224 (1988), und später von Graham et al., Anal. Chem. 69, 4703–4707 (1997), beschrieben ist. Von dieser speziellen Modifizierung wird angenommen, dass sie eine höhere Spezifität der Basenpaarung fördert (siehe Wagner et al., Science 260, 1510–1513 (1993)).
In einer weiteren Ausführungsform wird Peptid-Nucleinsäure (PNA) für Sonden verwendet, die das Kolloid aufbauen. PNAs erfordern wegen ihres neutralen Rückgrats kein Salz zur Hybridisierung und binden mit höherer Spezifität der Basenpaarung und dulden üblicherweise keine Fehlpaarungen. Weiters zeigt der anschließend gebildete Doppelstrang eine viel höhere Stabilität als ein DNA/RNA-Doppelstrang. Diese Eigenschaften bedeuten, dass ein PNA-Strang, der kürzer als die entsprechende DNA-Sonde ist, mit weit besserer Wirkung verwendet werden kann. Die Verwendung von PNA im Zusammenhang mit MALDI-TOF-Massenspektrometrie zur Sequenzidentifizierung wird kurz von Egholm, Nature Biotechnology 15, 1346 (1997), besprochen. In diesem Verfahren wird ein Amplifikationsschritt befürwortet. PNA in der Chip-Technologie wird von Marshall und Hodgson, Nature Biotechnology 16, 27–31 (1998), erörtert.
Wie oben erörtert, werden zwei verschiedene (zueinander nicht komplementäre) TBS verwendet, die fähig sind, nebeneinander oder zumindest nahe zueinander in der Zielsequenz zu binden (jedoch in Abwesenheit der Zielsequenz nicht zueinander gebracht werden).
Vorzugsweise sind erste und zweite TBS, wenn sie an die Zielsequenz gebunden werden, benachbart oder durch 1, 2, 3, 4, 5, weniger als 10, 20 oder 30 Basen getrennt, um Aggregation zu bewirken.
Es kann wünschenswert sein, mehrere TBS je Mittel (z. B. um ein Metallkolloidteilchen gruppiert), zum Beispiel mehr als 1, 2, 3, 4, 5, 10 oder 20 je Mittel verfügbar zu haben. Mittel dieser Art können in Gegenwart der Zielsequenz vernetzt sein. Dies kann größere Aggregate von Metalloberflächen mit einer entsprechenden Verschiebung der Plasmon-Resonanzwellenlänge erzeugen.
Assoziierung von TBS mit Metalloberfläche
Die Wechselwirkung zwischen SSG und der Metalloberfläche erfolgt typischerweise durch Chemisorption des Komplexes an die Oberfläche oder durch chemische Bindung des Komplexes mit einer Beschichtung der Oberfläche.
Die wird vorzugsweise mittels so genannter „Oberflächensuchgruppen" (SSGs) erzielt. Diese binden äußerst eng an die Metalloberfläche und sind in WO 97/05280 (University of Strathclyde) ausführlich beschrieben.
SSGs sind üblicherweise von Natur aus entweder komplexierend oder chelatisierend oder umfassen überbrückende Liganden oder Polymer-bildende Gruppen.
Natürlich wird die Wahl der SSG vom Charakter der Oberfläche (z. B. ihrer Ladung und der An- oder Abwesenheit einer Oxid- oder einer anderen Schicht) und von jeglichen Oberflächenbeschichtungen oder anderen mit ihnen assoziierten Spezies (wie z. B. Citrat-Reduktionsmittel) und auch vom Charakter der TBS abhängen. Für zweckdienlichste Oberflächen umfasst die funktionelle Gruppe vorzugsweise eine Lewis-Base. Idealerweise wird sie aktiv an die in Verwendung stehende Oberfläche angezogen. Für Goldoberflächen können Phosphor oder Schwefel enthaltende Gruppen besonders bevorzugt sein, wie in der oben zitierten Arbeit von Bethell und Schiffin erörtert wird.
Die geeigneten Gruppen, durch die das Mittel an die aktive Oberfläche gebunden werden kann, umfassen komplexierende Gruppen, wie z. B. Stickstoff-, Sauerstoff-, Schwefel- und Phosphor-Donoren; chelatisierende Gruppen; überbrückende Liganden und Polymer-bildende Liganden.
Einige beispielhafte SSGs sind in 2 gezeigt.
Die Triazolgruppe (Formel A1) ist reich an freien Stickstoff-Elektronenpaaren und scheint eine besondere Affinität für bestimmte Metallkolloide aufzuweisen. Folglich ist die Aufnahme dieser Gruppe in das Mittel insbesondere bevorzugt, da sie die Nähe des Markers zur Oberfläche und daher die Oberflächenverstärkungswirkung erhöhen kann, die auftritt, wenn die TBS an die Zielsequenz bindet.
Das Mittel enthält vorzugsweise die Benzotriazolgruppe (Formel A2), insbesondere wenn die Metalloberfläche auf Silber oder Kupfer basiert, die (besonders wenn deprotoniert) einen hohen Konjugationsgrad aufweist und folglich für SE(R)RS-Detektion, die auf Markerresonanz beruht, besonders zugänglich ist.
Benzotriazolderivate (wie z. B. jenes, das in Formel A3 gezeigt ist) können leicht erlangt werden und können mit bestehenden Markern (wie z. B. Azofarbstoffen) gekoppelt werden, um geeignet modifizierte Marken zu liefern.
In bevorzugten Formen wird die SSG so modifiziert, dass sie SE(R)RS-aktiv ist, und diese wird dazu verwendet, um die TBS an die Metalloberfläche zu konjugieren. Beispiele solcher Gruppen umfassen Azobenzotriazole, die typischerweise durch Kombinieren von Azosubstraten mit Benzotriazolderivaten bebildet werden. Beispiele von Azobenzotriazolen umfassen 9-(Carboxyethyl)-3-hydroxy-6-oxo-6H-benzotriazol, und an Benzotriazol gekoppelte, substituierte Benzoe- und Naphthoesäure-Azoderivate.
Eine Beispielstruktur zur Verwendung als ein Mittel der vorliegenden Erfindung ist das in Formel A4 gezeigte Azobenzotriazol. Die Verbindung umfasst ein Azo-Chromophor, das die Wellenlänge des Absorptionsmaximums des Markers erhöht.
In allen Beispielstrukturen, in denen es vorkommt, stellt R₉ die TBS (z. B. PNA), gegebenenfalls über einen Linker, dar. Der Linker kann verwendet werden, um den Abstand zwischen einzelnen Metalloberflächen nach erfolgreicher Bindung und die Festigkeit, mit der die Oberflächen festgehalten werden, zu beeinflussen. Im Allgemeinen wird ein Linker mit weniger als 5, 10 oder 15 Kohlenstoffatomen bevorzugt. Unterschiedliche R₉-Gruppen (z. B. unterschiedliche Linker) können ebenfalls die Mittel mit molekülspezifischen SE(R)RS-Spektren bereitstellen.
Geeignete Verbindungen zur Verwendung in den Mitteln von Markern der vorliegenden Erfindung sind durch die Formeln A5 und A6 umfasst, worin: In allen Fällen beinhaltet die TBS oder der Linker eine oder mehrere der R₁-R₆-Gruppen, die vorzugsweise aus den Gruppen R₁-R₅ gewählt sind. Die folgenden Bevorzugungen beziehen sich deshalb auf jene Gruppen aus R₁-R₆, die nicht TBS/Linker sind.
Folglich können die verbleibenden R₁-R₆ beliebige geeignete Gruppen darstellen (einschließlich Wasserstoff) und sind vorzugsweise aus jenen gewählt, die unter der Formel aufgezählt sind.
W, X, Y und Z sind unter den Formeln definiert. Eine bevorzugtere Untergruppe solcher Verbindungen ist jene, in der R₁, R₂, R₃, R₄ und R₆ unabhängig voneinander aus Wasserstoff, C₁-C₆-Alkyl, C₁-C₆-Alkoxy, sechsgliedrigen aromatischen Ringen, Halogen, -COOH, -SO₃H, -PO₄, -SH, -PO, -NR₇ und R₈ ausgewählt sind; R₅ kann wie R₁ sein oder alternativ dazu -NH₂ oder funktionalisiertes -COOH, wie z. B. -(CH₂)_n-COOH, wobei n eine ganze Zahl von 1 bis 6 ist; und R₇ und R₈ sind unabhängig voneinander aus Wasserstoff, C₁-C₆-Alkyl (lineare oder verzweigte Kette) und ungesättigten zyklischen Alkyl-Ringen gewählt.
Insbesondere bevorzugte Formen solcher Marken sind jene, in denen R₁ und R₂ beide Wasserstoff sind, R₃ und R₄ unabhängig voneinander aus Wasserstoff und Methoxy ausgewählt sind, R₅ entweder -OH oder -Amino und R₆ Wasserstoff ist.
Die in Beispielen 1 bis 3 hergestellten Mittel (siehe 6B und 6C) sind Beispiele, die in die Gruppe mit diesen Formeln fallen.
Formel A7 stellt eine Alternative zu den Mitteln auf Basis von Benzotriazol bereit.
Funktionelle Gruppen am Oberflächensuchabschnitt der Mittel können geladene polare Gruppen umfassen (z. B. Amin, Carboxyl, Phosphat, Thiol, Hydroxyl), die an die Oberfläche oder Oberflächenbeschichtung angezogen werden (z. B. zu freien Aminogruppen in einer Polyaminbeschichtung). Beispiele davon sind in Formel A8 gezeigt, worin R₉ aus dem oben diskutiertem besteht, und R₁₀ unabhängig aus den in der Figur aufgezählten Gruppen gewählt ist, wobei nicht mehr als 3 der R₁₀-Gruppen in der Formel Wasserstoff sind. Vorzugsweise sind die R₁₀-Gruppen in der Formel, die nicht H sind, alle dieselben, wie die Formeln A9 und A10 beispielhaft darstellen.
Weitere alternative Oberflächensuchgruppen sind durch Formeln A11, A12 und A13 dargestellt.
Andere geeignete Oberflächensuchgruppen für das Mittel umfassen Calixerine und Mercaptobenzotriazole.
SER(R)S-aktive Spezies
Das Mittel umfasst eine SAS. Diese kann durch einen gesonderten Marken in Fällen bereitgestellt werden, wenn die TBS kein UV absorbiert. Geeignete Marken werden ausführlich in WO 97/05280 (University of Strathclyde) und ferner in der SER(R)S-Literatur diskutiert. Der Marken kann mit der Metalloberfläche entweder als Teil der TBS (gegebenenfalls als Teil einer SSG) oder völlig getrennt davon assoziiert sein.
In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung wird, wie unten ausführlicher erörtert, mehr als ein Molekül SAS je Mittel vorhanden sein. In der Tat wird die Anzahl vorzugsweise maximiert, so dass die maximale Anzahl von SAS-Molekülen, wenn sich eine aggregierte Metalloberfläche als Ergebnis eines Zielsequenz/TBS-Bindungsereignisses bildet, durch dieses Ereignis oberflächenverstärkt wird.
Vorzugsweise ist ein einziges Molekül der Zielsequenz zur Oberflächenverstärkung von mehr als 10, 20, 30, 40, 50, vorzugsweise mehr als 100, 150 oder 200 SAS-Molekülen fähig, die mit der Metalloberfläche des Mittels, das diese Zielsequenz über die TBS bindet, assoziiert sind.
Beispiele geeigneter SE(R)RS-aktiver Spezies umfassen Fluoresceinfarbstoffe, wie z. B. 5-(und 6-) Carboxy-4',5'-dichlor-2',7'-dimethoxyfluorescein, 5-Carboxy-2',4',5',7'-tetrachlorfluorescein und 5-Carboxyfluorescein; Rhodaminfarbstoffe, wie z. B. 5- (und 6-) Carboxyrhodamin, 6-Carboxytetramethylrhodamin und 6-Carboxyrhodamin X; Phthalocyanine, wie z. B. Methyl-, Nitrosyl-, Sulfonyl- und Aminophthalocyanine; Azofarbstoffe, wie z. B. jene, die in C. H. Munro et al., Analyst 120, 993 (1995), aufgezählt sind; Azomethine; Cyanine und Xanthine, wie z. B. die Methyl-, Nitro-, Sulfan- und Aminoderivate; und Succinylfluoresceine. Jeder/s von diesen kann auf beliebige herkömmliche Weise substituiert werden, was eine große Anzahl zweckdienlicher Marken zur Folge hat.
Die Wahl des Markers in jedem gegebenen Fall hängt üblicherweise von Faktoren, wie z. B. Resonanzfrequenz des Markers, der anderen vorhandenen Spezies, Verfügbarkeit, Wahl des Markers oder Laseranregungsgerät usw., ab. Im Speziellen kann er so gewählt werden, um zwischen SAS, die mit der Metalloberfläche assoziiert ist, die zur Oberflächenverstärkung unfähig ist, und jener, die mit der Metalloberfläche assoziiert ist, die zur Oberflächenverstärkung fähig (d. h. Teil eines Zielsequenz/TBS-Komplexes) ist, bestmöglich zu unterscheiden.
Es kann bevorzugt sein, dass die SAS eine Azogruppe ist, die sehr leicht derivatisiert werden kann. Dem geschulten Fachmann wird jedoch einsichtig sein, dass in der Erfindung auch andere SAS leicht eingesetzt werden können.
Der Farbstoff kann mit der Metalloberfläche entweder durch kovalente oder nichtkovalente Wechselwirkungen assoziieren. Insbesondere bevorzugt ist die Verwendung der oben beschriebenen SSGs.
SER(R)S-Detektion
Diese kann durch herkömmliche Verfahren erfolgen, wie sie z. B. in WO 97/05280 (University of Strathclyde) offenbart sind.
Folglich sind bei der SE(R)RS die primären Messungen die der Intensität des gestreuten Lichts und der Wellenlängen der Emissionen. Weder der Winkel des einfallenden Strahls, noch die Position des Detektors ist entscheidend. Mit ebenen Oberflächen wird ein einfallender Laserstrahl oft so positioniert, dass die Oberfläche in einem Winkel von 60°C getroffen wird, wobei die Detektion entweder 90° oder 180° zum Einfallsstrahl erfolgt. Mit kolloidalen Suspensionen kann die Detektion in jedem Winkel zum Einfallsstrahl erfolgen, wobei wiederum häufig 90° eingesetzt wird.
Verschiedene Instrumente sind zum Erfassen von SE(R)RS-Signalen geeignet, einschließlich Wellenlängen-selektive Spiegel, holographische optische Elemente für Streulichtdetektion und Faseroptik-Wellenleiter. Die Intensität eines SE(R)RS-Signals kann unter Verwendung eines ladungsgekoppelten Bauelements (CCD), einer Siliziumphotodiode oder von Photomultiplier-Röhren, die einzeln oder in Reihe zur Kaskadenverstärkung des Signals angeordnet sind, gemessen werden. Photonenzählende Elektronik kann für eine empfindliche Detektion verwendet werden. Die Wahl des Detektors hängt üblicherweise großteils von der Detektionsempfindlichkeit ab, die zur Durchführung eines bestimmten Tests notwendig ist.
Für mehrere, unterschiedliche Analyten wird üblicherweise ein komplexes SE(R)RS-Spektrum über einen Bereich von Wellenlängen erhalten. Obwohl die Analyse mit dem bloßen Auge möglich sein kann, werden Verfahren zum Erlangen und/oder Analysieren eines SE(R)RS-Spektrums vorzugsweise die Verwendung einer Art von Datenprozessor, wie z. B. einem Computer, umfassen.
Es ist zu beachten, dass die Verfahren der Erfindung entweder das Erlangen eines vollständigen SE(R)RS-Spektrums über einen Bereich von Wellenlängen oder das Auswählen eines Peaks und das Scannen nur bei der Wellenlänge dieses Peaks (d. h. Raman-„Imaging") umfassen kann.
Vorzugsweise wird der Anregungsstrahl so gewählt, dass er zwischen der SAS, die mit der Metalloberfläche assoziiert ist, die nicht zur Oberflächenverstärkung fähig ist, und jener, die mit der Metalloberfläche assoziiert ist, die zur Oberflächenverstärkung fähig (d. h. Teil eines Zielsequenz/TBS-Komplexes) ist, bestmöglich zu unterscheiden.
Wenn beispielsweise die Plasmon-Resonanz der Metalloberfläche (nach Aggregation) 600 nm beträgt und die SAS in dieser Region ebenfalls aktiv ist, dann wird der Anregungsstrahl so gewählt, dass er in diesem Bereich liegt, um die Oberflächenverstärkung und Resonanzwirkungen zu maximieren. Wenn viele unterschiedliche SAS-Gruppen verwendet werden, kann die Anregungswellenlänge so gewählt werden, dass sie mit den Absorptionsmaxima der SAS genau übereinstimmt, um scharfe Signale zu liefern und dadurch die Molekülspezifität zu verbessern.
Bevorzugte Formate
Bestimmte bevorzugte Formate sind unten erörtert. Natürlich wird der Fachkundige anerkennen, dass diese nicht bindend sind und dass andere Verfahren, welche die Vorteile der vorliegenden Erfindung erzielen und auf der Offenbarung hierin beruhen, gleichermaßen angewendet werden können, wenn sie bevorzugt sind.
Anordnungen von SER(R)S-Farbstoff, TBS und Metalloberfläche
Einige von diesen sind in 3 dargestellt.
Es werden zwei Mittel, die unterschiedliche TBS umfassen, verwendet – jede TBS kann an der Metalloberfläche (beispielsweise von hergestellten monodispersen, nichtaggregierten Kolloiden) gebunden werden, und zwar über einen Linker und eine SSG (z. B. auf Basis von Benzotriazol), die eine SAS (z. B. eine Azogruppe) beinhaltet. Die Komponenten der Mittel werden gemeinsam in situ bereitet oder werden vorgemischt und dann der Probe zugegeben. Raman-Imaging oder Ramanspektroskopie wird dann wie gewünscht durchgeführt.
Alternativ dazu können für jedes der beiden Mittel gesonderte TBS und SAS, die beide eine SSG beinhalten, in den gewünschten Verhältnissen vorgemischt und das Gemisch auf das Metallkolloid aufgetragen werden, um sie zu beschichten. Die beiden Mittel werden dann der Probe zugegeben und die Untersuchung auf Oberflächenverstärkung durchgeführt.
Das bevorzugte TBS : SAS-Verhältnis kann größer oder kleiner als 1 : 1 sein. Jedoch ist die SAS gegenüber TBS vorzugsweise im Überschuss vorhanden, beispielsweise ein mehr als 10-, 20-, 30-, 40- oder 50facher Überschuss. Das bevorzugte Verhältnis von TBS-SSG : SAS-SSG ist ungefähr 1 : 100. Wie oben erörtert wird, allgemein gesprochen, die Empfindlichkeit durch Maximieren der Anzahl von SAS-Molekülen verstärkt, die durch ein einziges Bindungsereignis (d. h. zwei TBS-Moleküle an ein Molekül der Zielsequenz) oberflächenverstärkt werden. Dies wird durch Maximieren der Anzahl von SAS-Molekülen erzielt, die an den durch das Bindungsereignis zusammengebrachten Metallkolloidteilchen vorhanden sind. Jedoch muss darauf geachtet werden (z. B. aus Kostengründen), zu gewährleisten, dass zumindest etwas TBS-SSG vorzugsweise gleichmäßig verteilt an jedem Metall/SAS-Komplex vorhanden ist, um ihm Funktionalität zu verleihen.
Multiplexverfahren
Ramansignale bestehen aus einer Reihe von einzelnen Spektrallinien variierender Intensität. Die Frequenzen und relativen Intensitäten der Linien sind für den detektierten Marken spezifisch, und das Ramanspektrum ist daher ein „Fingerabdruck" der SAS.
Wenn der Analysator verwendet wird, um die Detektion eines einzigen Markers (z. B. wie oben beschrieben) zu quantifizieren, dann ist es lediglich notwendig, die Signalintensität bei einer gewählten Spektrallinienfrequenz zu detektieren.
Es kann jedoch mehr als ein Nachweismittel gleichzeitig verwendet werden, um auf mehr als eine Zielsequenz unter Verwendung von Nachweismitteln zu untersuchen, die unterschiedliche, unterscheidbare SAS aufweisen.
Wenn der Analysator verwendet wird, um die Detektion mehrerer Marken zu quantifizieren, wovon jeder eine einzigartige Spektrallinie aufweist, dann ist es lediglich notwendig, die Signalintensität bei mehreren gewählten Spektrallinienfrequenzen zu detektieren. Andernfalls, falls ein SER(R)S-Analysator selektiv verwendet wird, um ein oder mehrere „gebundene" Mittel aus einem Gemisch zu detektieren, ist es notwendig, das gesamte „Fingerabdruck"-Spektrum zu Identifizierungszwecken zu detektieren.
In Fällen, wo die Zielsequenzen eine gewisse Sequenzidentität aufweisen (z. B. charakteristische Zielsequenzen, die einzelne Nucleotidpolymorphismen enthalten), kann ein gemeinsames erstes Mittel unter der Voraussetzung verwendet werden, dass das zweite Mittel in jedem Fall zwischen den verbleibenden Zielsequenzen unterscheiden kann und selbst von den anderen zweiten Mitteln durch Verwenden einer unterscheidenden SAS unterschieden werden kann.
Alternativ dazu können zum Detektieren mehrerer recht verschiedener Sequenzen mehrere Paare von Mitteln unter der Voraussetzung verwendet werden, dass sie nicht zu sich selbst komplementär sind.
Weitere Aspekte der Erfindung
Wie in der Einleitung erörtert ist, bieten die Verfahren zahlreiche Anwendungen in der Genomforschung, wodurch sie analog zu bestehenden Verfahren verwendet werden können, die einen Schritt einsetzen, in dem eine Nucleinsäuresequenz analysiert wird (siehe z. B. S. B. Primrose, Principles of Genome Analysis, Blackwell Science, Oxford, UK (1995)).
Einige spezielle Anwendungen sind die Folgenden. Allgemein gesprochen können alle davon unter Anwendung des Einzelzielsequenz- oder Multiplexverfahren-Ansatzes durchgeführt werden. Im letzteren Fall kann die Kombination verschiedener Ergebnisse verwendet werden, um eine Bestimmung durchzuführen:

(i) Detektion der Anwesenheit eines Organismus (z. B. Virus, Provirus, Virions, Prokaryoten (wie z. B. Bakterium), Eukaryoten (wie z. B. Protozoen)) in einer Probe, worin die Anwesenheit der Zielsequenz mit der Anwesenheit des Organismus assoziiert ist, zum Beispiel weil die Sequenz für diesen Organismus einzigartig ist. Sogar in Fällen, wo die untersuchte Sequenz für den Organismus eigentlich nicht einzigartig ist, kann ihre Anwesenheit (zusammen mit weiteren diagnostischen Informationen, z. B. immunologischen und Verhaltensinformationen) verwendet werden, um die Sicherheit einer Bestimmung seiner An- oder Abwesenheit zu erhöhen. Die Detektion kann durch vollständige Sequenzierung bestätigt werden, wo eine noch weitergehende Gewissheit erforderlich ist. Die Probe kann in diesem Fall irgendeine sein, von der vermutet wird, dass sie den z. B. eine einem anderen Organismus enthält, Organismus, einem Lebensmittel oder einer Umweltprobe (z. B. Bodenmaterial, Wasser usw.) entnommene Probe.
pathogenen (ii) Diagnose einer mit einem Organismus in Verbindung stehenden Krankheit, indem eine wie oben beschriebene Bestimmung durchgeführt wird. Die Probe kann eine In-vitro- oder In-vivo-Probe sein. Der Test kann zusammen mit anderen diagnostischen Techniken oder einer Bewertung von Symptomen usw. durchgeführt werden.
(iii) Diagnose einer mit DNA-Variation in Verbindung stehenden Krankheit, indem die Anwesenheit der DNA-Variante nachgewiesen wird, umfassend die Anwendung eines oben erörterten Verfahrens, worin die Zielsequenz der Sequenz entspricht, in der die Variation auftritt. Der Test kann zusammen mit anderen diagnostischen Techniken oder einer Bewertung von Symptomen usw. durchgeführt werden.
iv) Verfahren der Auswahl eines (Organismus, der ein bestimmtes phänotypisches Merkmal aufweist, demzufolge die Zielsequenz einer mit diesem Merkmal assoziierten Sequenz entspricht.
(v) Verfahren des Isolierens einer für ein bestimmtes Gen kodierenden Nucleinsäure, wodurch die Zielsequenz einer Sequenz entspricht, die mit dem Gen oder innerhalb des Gens assoziiert ist.
(vi) Verfahren phylogenetischer Klassifizierung, worin die Zielsequenz mit einem/r bestimmten Individuum, Population, Spezies, Gattung usw. assoziiert ist.
(vii) Verfahren zum Identifizieren eines Individuums, worin die Zielsequenz mit diesem Individuum assoziiert ist. Allgemein gesprochen kann dies das Bewerten einer Anzahl z. B. Weinzelner Polymorphismen erfordern (siehe O 96/01687 von Tully et al., für Sequenzen, die bei forensischem Typisieren und Übereinstimmen verwendet wurden).
(viii) Expressionsverfahren zur Profilierung einer Zelle oder eines Gewebes. In diesem Fall ist die Proben-Nucleinsäure mRNA oder ist von ihr hergeleitet (z. B. cDNA).

In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren der Produktion eines Nachweismittels offenbart, das Folgendes umfasst: Kombinieren nichtaggregierter Metallteilchen mit einer SER(R)S-aktiven Spezies (SAS) und Zielbindungsspezies (TBS), wodurch SAS und TBS mit dem Metallteilchen über eine Oberflächensuchgruppe kombinieren.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Nachweismittel offenbart, das Folgendes umfasst: ein nichtaggregiertes Metallteilchen, das mit einer SER(R)S-aktiven Spezies (SAS) und mit Zielbindungsspezies (TBS) assoziiert ist.
Die verschiedenen Komponenten des Mittels können beliebige der oben erörterten sein. Im Speziellen werden die SAS und TBS vorzugsweise über eine SSG, gegebenenfalls in Form eines einzigen Moleküls, an das Metallteilchen gebunden. Vorzugsweise sind die TBS und SSG einzelne Moleküle. Vorzugsweise ist die TBS PNA oder Propargylaminomodifizierte DNA. Vorzugsweise ist die SAS eine Azogruppe und die SSG Benzotriazol.
Im Verfahren der Erfindung umfasst das Mittel ein erstes Mittel und ein zweites Mittel, wobei beide eine andere TBS aufweisen.
In einem weiteren Aspekt wird eine Zusammensetzung offenbart, die zwei oder mehr oben beschriebene Nachweismittel umfasst, wobei jedes eine unterscheidende TBS umfasst.
Die Mittel und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung werden im Allgemeinen als Lösungen bereitgestellt.
In einem weiteren Aspekt wird ein Set offenbart, das die Mittel oder Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung plus ein oder mehrere zusätzliche Materialien zum Ausüben der Verfahren der vorliegenden Erfindung, insbesondere eine Zielnucleinsäure für Kontrollexperimente, umfasst.
In einem weiteren Aspekt wird ein System offenbart, das ein Mittel oder eine Zusammensetzung wie oben beschrieben plus eine Nucleinsäureprobe umfasst, die vorzugsweise eine DNA- oder RNA-Probe ist, die insbesondere bevorzugt aus einer Zelle extrahiert ist, die einem Organismus entnommen wurde oder einen Organismus darstellt.
Ein solches System kann insbesondere Folgendes umfassen:

(i) ein Reaktionsgefäß,
(ii) ein wie oben beschriebenes Mittel,
(iii) eine Nucleinsäure.

Vorzugsweise in einem homogenen Format.
In einem weiteren Aspekt wird ein Apparat offenbart, der einen SERRS-Analysator plus ein Mittel, eine Zusammensetzung oder ein System wie oben beschrieben umfasst, sowie Verfahren der Verwendung eines solchen Apparats, welche (zum Beispiel) die Schritte des Herstellens und Überwachens (z. B. zwischen 500 und 600 nm) eines homogenen Systems umfassen, um ein SER(R)S-Signal zu detektieren.
Die Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf die folgenden nicht einschränkenden Figuren und Beispiele näher erklärt. Andere Ausführungsformen, die im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung liegen, werden den Fachkundigen angesichts dieser in den Sinn kommen.
Figuren
1: Diese zeigt die sichtbaren Absorptionsspektren für ein mit (a) Salpetersäure und (b) Poly(L-Lysin) und Ascorbinsäure aggregiertes Citratkolloid. Die punktierte Linie stellt das Spektrum des nichtaggregierten, monodispersen Citratsilberkolloids vor der Aggregation dar.
2: Diese zeigt Formeln A1–A13, die verschiedene SSGs darstellen, die in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können.
3: Diese zeigt verschiedene unterschiedliche Formate zur Ausführung der vorliegenden Erfindung.
In (a) (i) wird ein Mittel verwendet, das selbst zwei Arten von Silberkolloidteilchen umfasst. Jedes Teilchen trägt eine andere PNA-Sonde (die TBS), die als X bzw. Y bezeichnet sind. Diese sind mit der Metalloberfläche über verschiedene, mit A und B bezeichnete Farbstoffe (die SAS) assoziiert, die mit der Metalloberfläche über Linker und Oberflächensuchgruppen (nicht gezeigt) wechselwirken. Wenn sie mit geeignetem genomischen Material mit einer Zielsequenz X'-Y' (zu X und Y komplementäre Abschnitte enthaltend) kombiniert werden, werden die Silberkolloidteilchen aggregiert, und diese Aggregation kann über einen oder beide der Farbstoffe A und B beobachtet werden (wovon einer weggelassen werden könnte, wenn er nicht benötigt wird).
In (b) ist ein alternatives Mittel gezeigt. In diesem Fall sind der Farbstoff (A) und PNA-Sonde (X) getrennt mit der Metalloberfläche assoziiert, beide über einen Linker und Oberflächensuchgruppe (nicht gezeigt).
In (c) ist ein Verfahren zur Unterscheidung und Bewertung von Polymorphismen gezeigt. In diesem Fall sind die möglichen Zielsequenzen X'-Y' und X'-Y2'. Diese können durch Verwenden einer zusätzlichen Kolloidteilchenart unterschieden werden, die eine geeignete PNA-Sonde (Y2 genannt) und einen Farbstoff aufweist, der von B unterscheidbar ist (C genannt). Durch Beobachten, welcher von B oder C oberflächenverstärkt wird, kann die Zielsequenz ermittelt werden. Es kann wünschenswert sein, das Kolloidteilchen gemeinsamer Sequenz (X) mit Farbstoff A als Kontrolle zu markieren, da dieser üblicherweise für beide Polymorphismen detektierbar ist.
In (d) ist ein Verfahren zum Untersuchen einzelnener Stellen gezeigt. Dieses ist (c) ähnlich, jedoch gibt es keine gemeinsame Sequenz zwischen den Zielsequenzen, und daher werden vier verschiedene Arten von Kolloidteilchen verwendet. Die Detektion des Farbstoffs D zeigt die Gegenwart der Zielsequenz V'-W' an.
4: Diese zeigt einen Weg für das Herstellen eines Aminoderivats des Benzotriazol-Farbstoffs [N¹-[4-(5-Azobenzotriazoyl)phenyl]ethan-1,2-diamin-Verbindung (1)] und eines Carbonsäurederivats davon, [N¹-[4-(5-Azobenzotriazoyl)phenylaminoethyl]-succinamidsäure-Verbindung (2)]. Das Carbonsäurederivat kann an DNA gebunden werden (Schema 1) oder verwendet werden, um einen aktiven Ester (Schema 2) für nachfolgende Bindung herzustellen.
5: Diese zeigt ein SERRS-Spektrum eines Benzotriazol-Farbstoff-markierten 26-Mer-DNA-Oligonucleotids.
6: Diese zeigt ein SERRS-Spektrum von Benzotriazol-Farbstoff-markierten PNA-Oligonucleotiden in An- und Abwesenheit von aggregierendem Mittel.
7: Diese zeigt ein SERRS-Spektrum von Benzotriazol-Farbstoff-markierten PNA-Oligonucleotiden in An- und Abwesenheit komplementärer Zielsequenzen.
Beispiele
Beispiel 1 – Überblick über die Synthese markierter PNA-Sonden und anschließende Verwendung.
Die grundlegende Synthese umfasst die Addition einer Carbonsäure oder einer aktiven Esterform eines Benzotriazol-Farbstoffs an den Aminoterminus einer PNA-Sonde, gegebenenfalls während sich die PNA an einem für deren Synthese verwendeten festen Träger befindet. Die Sonde besteht aus acht oder mehr Basen, die zum Abschnitt einer Zielsequenz komplementär sind, die sich in genomischer DNA findet. Folglich werden die Basen nach wie vor geschützt sein, jedoch ist das primäre Amin frei für die Reaktion.
a) Synthese von Benzotriazol-Carbonsäure oder aktivem Ester
Ein aminoalkyliertes aromatisches Amin, wie z. B. N-(1-Napthyl)ethylendiamindihydrochlorid, wird an Aminobenzotriazol über eine Diazoniumkopplung gekoppelt, um einen Monoazofarbstoff herzustellen. Das freie Amin reagiert dann mit Bernsteinsäureanhydrid, um eine Carbonsäure bereitzustellen (siehe 4).
Ausführlicher wurde, um N¹-[4-(5-Azobenzotriazoyl)phenyl]ethan-1,2-diamin (= Verbindung 1) bereitzustellen, 5-Aminobenzotriazol (0,854 g, 1,1 Äquivalente, 6,37 mmol) in HCl (5 ml, 50% v/v) gelöst und durch tropfenweise Zugabe von Natriumnitrit (0,484 g, 1,2 Äquivalente, in 5 ml H₂O) bei 0°C diazotiert. Ein Überschuss an Natriumnitrit wurde mittels Stärkeiodidpapier nachgewiesen. Eine dunkelblaue Farbe zeigte überschüssige salpetrige Säure an, woraus sich die Bildung des Diazoniumsalzes schließen lässt. Getrennt davon wurde N-(1-Naphthyl)ethylendiamindihydrochlorid (1,500 g, 5,79 mmol) in Natriumacetatpuffer (1,0 M, 60 ml, pH 6,0) und Aceton (80 ml) gelöst. Diazotiertes Aminobenzotriazol (1,1 Äquivalente) wurde dieser Lösung tropfenweise bei 0°C unter Rühren über 1 Stunde zugegeben, worauf die Lösung durch Zugabe von Natriumhydroxid (2 M) neutralisiert wurde. Das feste Produkt wurde durch Filtration isoliert und mit gesättigtem KCl (3 × 50 ml) vor Reinigung durch Trituration mittels Methanol und Diethylether gewaschen, um die gegenständliche Verbindung als orangefarbenen Feststoff in 66% Ausbeute herzustellen. R_f (EtOAc/CH₃OH/NH₃ 5/1/1) 0,14; d_H (270 MHz, CD₃OD) 3,00 (2H, t, CH₂) 3,48 (2H, t, CH₂) 6,69 (1H, dd, arH) 7,51 (1H, t, arH) 7,63 (1H, t, arH) 7,87 (1H, d, arH) 7,94 (2H, m, arHs) 8,13 (1H, d, arH) 8,34 (1H, s, arH) 9,02 (1H, d, arH); d_c (270 MHz, CD₃OD) 41,40 (CH₂) 47,01 (CH₂) 104,26 (CH) 114,93 (CH) 115,13 (CH) 116,67 (CH) 117,47 (CH) 122,20 (CH) 124,26 (C) 124,73 (CH) 126,03 (CH) 127,91 (CH) 134,62 (C) 139,91 (C) 146,12 (C) 146,76 (C) 148,98 (C) 151,28 (C); FAB-MS m/z 332,1621 [C₁₈H,₁₈N₇ (M + 1) < 0,1 ppm].
Um N¹-[4-(5-Azobenzotriazoyl)phenylaminoethyl]succinamidsäure (= Verbindung 2) bereitzustellen, wurde Verbindung (1) (1,000 g, 3,02 mmol) in DMF (100 ml) gelöst und rühren gelassen. In Aceton (10 ml) gelöstes Bernsteinsäureanhydrid (0,363 g, 1,2 Äquivalente, 3,63 mmol) wurde dann tropfenweise über eine Stunde zugegeben. Nach 18 Stunden wurde das Lösungsmittel im Vakuum entfernt und das Produkt durch Säulenchromatographie (auf Na₂SO₄ vorabsorbiert) isoliert, wobei mit Ethylacetat, Methanol und Ammoniak (5/1/1) eluiert wurde, um einen orangefarbenen Feststoff herzustellen, der durch Trituration aus Diethylether weiter gereinigt wurde, um 0,856 g (66% Ausbeute) des reinen Produkts zu liefern. R_f (Ethylacetat/Methanol/Ammoniak 5/1/1) 0,11; d_H (400 MHz, DMSO-d6) 2,40 (2H, dd, CH₂) 2,44 (2H, dd, CH₂) 3,42 (4H, m, 2 × CH₂) 6,66 (1H, brs, NH) 6,76 (1H, d, arH) 7,32 (1H, m, arH) 7,54 (1H, t, arN) 7,67 (1H, t, arH) 7,90 (1H, d, arH) 7,99 (1H, dd, arH) 8,25 (1H, d, arH) 8,29 (1H, s, arH) 8,98 (1H, d, arH).
Wenn ein aktiver Ester erwünscht ist, dann kann die Succinylform aus der Carbonsäure durch Aktivieren mit Hydroxysuccinimid wie in 4 (Schema 2) gezeigt hergestellt werden.
Es wird betont, dass jede Länge oder Art von Linker verwendet werden kann.
b) Addition von Oberflächensuchgruppe an Nucleinsäure
Die Carbonsäureform des Benzotriazol-Farbstoffs wird an die Nucleinsäure am festen Träger mittels Standardverfahren gekoppelt, die üblicherweise für solche Kopplungen angewendet werden. Entfernung der Schutzgruppen und vom festen Träger, gefolgt von Reinigung liefert das gewünschte Produkt.
Ausführlicher wurde zum Koppeln der Verbindung (2) an DNA die gewünschte DNA-Sequenz gemäß standardmäßiger Festphasen-Phosphoramidit-Chemie unter Verwendung von Monomeren, die rasch Schutzgruppen abspalten („Expedite fast deprotection monomers"), im 0,2 mmol-Maßstab synthetisiert. Ein Amino-Linker (standardmäßiges Monomethoxytritylaminohexyl-Phosphoramidit) wurde am 5'-Terminus des Oligonucleotids addiert und die Schutzgruppe an der Säule abgespalten, um ein freies Amin für die Reaktion bereitzustellen. Die Säule wurde dann aus dem Synthesegerät entfernt und die manuelle Kopplung von Verbindung (2) durchgeführt. Verbindung (2) (54,7 mg, 0,12 mmol) wurde in DMF (2 ml) gelöst und N,N-Carbonyldiimidazol (30,4 mg, 1,56 Äquivalente, 0,187 mmol) zugegeben. Das Gemisch wurde bei 40°C für fünf Minuten gerührt, bevor es auf Raumtemperatur abgekühlt und über zwei Spritzen in einem Standardverfahren durch eine Oligonucleotid-Synthesesäule geschickt wurde. Die Lösung wurde für 2 Stunden reagiert, bevor sie entfernt und mit Ammoniak (1 ml) versetzt wurde, um die Spaltung und Entfernung der Schutzgruppen zu erleichtern. Nach 2 Stunden wurde der Ammoniak entfernt und der Rückstand mittels Anionenaustausch-HPLC gereinigt.
Die gereinigte Probe wurde dann vor Gefriertrocknung zur Entsalzung durch eine Sephadex G25-Säule geschickt. Auflösen in Wasser lieferte eine 30,5 mM Lösung.
Das obige Verfahren wurde auch verwendet, um Benzotriazol-Carbonsäure am 5'-Terminus des 26-Mer-Zieloligonucleotids zu addieren, um eine 55,4 mM Lösung herzustellen.
Um Verbindung (2) an PNA zu addieren, wurde eine Lösung von Verbindung (2) (0,18 M) dem Anschluss 6 des Synthesegeräts zugegeben und ein spezieller Kopplungsschritt für diesen Anschluss in den Standard-PNA-Zyklus eingefügt. Der Schritt erweiterte die Kopplungszeit für die neue Base von 15 Minuten auf 30 Minuten. Die gewünschte 8-Mer-Sequenz wurde mittels Standard-PNA-Chemie im 2 mmol-Maßstab synthetisiert. Ein Amino-Linker wurde dann am N-Terminus addiert, gefolgt vom modifizierten Benzotriazol-Farbstoff unter Anwendung des modifizierten Zyklus. Entfernung der Schutzgruppen mittels Trifluoressigsäure, gefolgt von Reinigung mittels Umkehrphasen-HPLC und anschließender Gefriertrocknung lieferte die gewünschten Verbindungen. Die folgenden Lösungen wurden durch Auflösen der lyophilisierten Feststoffe in Wasser erhalten:
wobei: 6 = N¹-[4-(5-Azobenzotriazoyl)phenylaminoethyl]succinamidsäure (= Verbindung 2), O = Amino-Linker
c) Anbindung an das Kolloid
Eine wässrige Lösung der markierten, z. B. PNA-, Sonde wird mit einer geeigneten Menge Kolloid gemischt. Die Menge verwendeter Sonde ist gerade noch weniger als die für einschichtige Belegung der vorhandenen kolloidalen Teilchen erforderlich ist.
Beispiel 2 – Durchführen der Detektion
(a) Markierte DNA
Ein SERRS-Spektrum des Benzotriazol-Farbstoff-markierten 26-Mer-DNA-Oligonucleotids ist erhalten worden und ist in 5 gezeigt.
Die SERRS-Signale waren erst dann sichtbar, wenn ein aggregierendes Mittel (Spermin) zugegeben worden ist, was bestätigt, dass Benzotriazol-Farbstoff-markierte DNA zum Kolloid gegeben werden konnte, ohne irgendwelche Signale zu produzieren, und dass eine hybridisierungsgebundene Aggregation eine detektierbare Änderung erzeugen konnte.
(b) Markierte PNA
Wie oben beschrieben werden die beiden nicht komplementären Sequenzen der PNA über einen N-Terminus-SERRS-Marken an getrennte kolloidale Silberteilchen unter Verwendung von Monoazobenzotriazol-Verbindungen gebunden, um für eine praktisch irreversible Bindung der PNA an die Oberfläche zu sorgen. Dies stellt ein System bereit, das üblicherweise nacheinander an eine komplementäre Sequenz am Elternstrang hybridisiert.
Wenn die beiden kolloidalen Gemische, welche die angebundenen spezifischen Nucleinsäure- oder Nucleinsäureanalogon-Sequenzen enthalten, zusammengemischt und dann bestrahlt werden, wird infolge der nichtaggregierten Natur der Metalloberfläche kein SERRS-Signal beobachtet.
Eine wässrige Lösung der Testsequenz wird dem obigen Gemisch aus PNA-markiertem Kolloid zugegeben, und nach einer geeigneten Zeitspanne zur Hybridisierung und daher Aggregation liefert Bestrahlung die den beiden Markern entsprechenden Signale, die an herkömmlichen SER(R)S-Anlagen detektiert werden. Aggregation tritt nur in Gegenwart der korrekten komplementären Sequenz auf. Wenn daher ein Signal beobachtet wird, wird die Gegenwart der einer Prüfung unterzogenen Sequenz bestätigt (siehe 3(a)).
Wegen der Empfindlichkeit des Prozesses ist keine Amplifikation der Ziel-DNA erforderlich. Ferner wird der Zeitraum von der Probennahme, Isolation der gewünschten Ziel-Nucleinsäure bis zum anschließenden Durchführen des Tests im Vergleich zu vielen gegenwärtig eingesetzten Verfahren üblicherweise stark vermindert.
In einem der Experimente wurden markierte PNA-Sequenzen, wie in Beispiel 2 ausführlich dargestellt, auf SERRS-Aktivität untersucht.
Anfänglich wurde eine geschätzte Oberflächenbedeckung von 600 Molekülen je kolloidem Teilchen untersucht. In diesen Experimenten wurde gefunden, dass markierte 727- sowie markierte 728-Sequenzen äußerst intensive und unverwechselbare Spektren auf dieser Ebene ohne die Verwendung irgendeines äußeren Aggregierungsmittels lieferten (Spektren erhalten unter Verwendung von 3 × 10^–11 Mol für eine Sekunde bei 514,9 nm, Ergebnisse nicht gezeigt). Es wurde angenommen, dass dieser Befund von der Verwendung von Trifluoressigsäure herrührte, um das Auflösen der endgültigen gereinigten PNA zu unterstützen, was das Kolloid aggregiert haben könnte, wodurch Signale geliefert wurden.
Um sich an diesen Effekt zu wenden, wurde ein weiteres Konzentrationsniveau versucht. Das versuchte Niveau war annähernd äquivalent zu 12 PNA-Oligomeren je Kolloidteilchen, was die Verwendung von 6 × 10^–13 Mol bedeutete. Die Spektren wurden für 5 Sekunden kumuliert und produzierten keinerlei Signale in Abwesenheit eines aggregierenden Mittels. Um zu beweisen, dass Signale produziert werden können, wurden 20 μl einer 5% Natriumchloridlösung (ein wohlbekanntes kolloidales Aggregationsmittel) zugegeben. Es wurde unverwechselbare Signale produziert, was darauf hinweist, dass auf dieses Niveau SERRS durch Aggregation erhalten werden kann. Das Spektrum ist in 6 gezeigt.
Um eine hybridisierungsgebundene Wirkung zu zeigen, wurden zwei verschiedene markierte PNA-Oligomere zunächst gemischt, um zu ermitteln, ob ein Signal produziert wird. 7 (PNA) zeigt, dass, wenn dies geschieht, einige schwache Signale über 5 Sekunden beobachtet werden können. Dieses Gemisch wurde dann vier verschiedenen komplementären Oligonucleotiden ausgesetzt, um festzustellen, ob eine Aggregation auftritt.
Die verwendeten Oligos waren: (20 ml einer 1 × 10^–6 M Lösung für jedes, um einen Überschuss bereitzustellen)

TCA AAT GTG ACC ATG T 727/728-Komplement

TCA AAT GTC CCG ACC ATG T 727/728-3C-Komplement

GAC CAT GTT CAA ATG T 728/727-Komplement

GAC CAT GTC CCT CAA ATG T 728/727-3C-Komplement
Die Spektren nach 30 Minuten sind unten in 7 gezeigt. Akkumulationszeit = 5 Sekunden.
Die obigen Spektren zeigen, dass Aggregation auftritt, wenn die Oligonucleotide zugegeben werden, obgleich die Signalintensität ungefähr die Hälfte derjenigen ist, die bei Verwendung von Natriumchlorid beobachtet wird, was möglicherweise auf ineffiziente Aggregation oder Hybridisierung schließen lässt, die ihrerseits auf die im Beispiel verwendete Konzentration von Trifluoressigsäure zurückzuführen sein könnte. Trotzdem zeigen diese Ergebnisse eindeutig, dass die Bindung einer TBS an eine Zielsequenz verwendet werden kann, um das Ausmaß der Oberflächenverstärkung der im System vorhandenen SAS zu erhöhen.
Beispiel 3 – Verwendung getrennter SAS und TBS
Es besteht keine Notwendigkeit des Einbaus der SAS (z. B. Farbstoff) und TAB (z. B. PNA) in ein einziges Molekül. Sie können getrennt mit der Metalloberfläche assoziiert werden.
Beispielsweise kann Benzotriazol mit dem N-Terminus von PNA oder dem 5'-Terminus von DNA assoziiert werden (letzteres gegebenenfalls über einen Amino-Linker während des Gebundenseins an Glas mit eingestellter Porengröße („Controlled Pore Glass") analog zu standardmäßigen Verlängerungstechniken). Eine gesonderte SAS-Farbstoffgruppe kann an Benzotriazol konjugiert werden (um z. B. eine Azobenzotriazolgruppe zu bilden).
Allgemein gesprochen wird ein Überschuss an Farbstoff gegenüber PNA benötigt (siehe 3(b)). Unter der Annahme, dass ein Kolloidteilchen annähernd eine Kugel mit einem Radius von 20 nm ist, hat es eine Oberfläche von ungefähr 1 × 10^–15 m².
Unter Verwendung von Benzotriazol als SSG (für Farbstoff sowie PNA) kann die Größe dieses Moleküls als Quadrat von 10 × 10^–10 m mal 10 × 10^–10 m angenommen werden. Dies ergibt eine Fläche von 1 × 10^–18 m² je Molekül. Daher beträgt die Anzahl von Molekülen für eine einschichtige Belegung ungefähr 1200.
Wenn die Bildung von vernetzten Aggregaten erwünscht ist, dann kann (unter Annahme kubisch-flächenzentrierter Packung) jedes Teilchen theoretisch von 12 anderen umgeben sein. Dies bedeutet, dass wegen der Größe der PNA im Vergleich zum Kolloid nur die in der Nähe oder in Nachbarschaft des Teilchens gebundene PNA wirksam sein wird, für eine Aggregation zu sorgen. Folglich kann ein Verhältnis von 100 Farbstoffmolekülen zu einer PNA wünschenswert sein.
Beispiel 4 – Polymorphismen und Multiplexverfahren
Durch Markieren spezifischer Sequenzen (oder damit assoziierter Metalloberflächen) mit spezifischen Markern kann eine Reihe von Sequenzpermutationen in einem Experiment untersucht werden. Es ist folglich möglich, lange Stränge und sogar vollständige Genen denaturierter DNA auf spezifische Sequenzen zu untersuchen (siehe 3(c) und 3(d)).
Beispiel 5 – Ausführlicher Test auf Polymorphismus
Wahl vorher hergestellter markierter kolloidaler Suspensionen für gewünschten Test (5 Minuten) Die kolloidalen Chargen können bis zu fünf verschiedene markierte Sequenzen enthalten. Eine für den von der Mutation entfernten Strang und vier für jede der möglichen Mutationen. Unter Umständen, wo angenommen wird, dass weniger als vier mögliche Basenidentitäten bestehen oder wo nicht die Bewertung des Polymorphismus, sondern nur die Bestätigung erwünscht ist, dass es nicht sich nicht um eine festgelegte Base handelt, kann eine geringere Anzahl markierter Sequenzen verwendet werden.
Vorbereitung des Tests (2 Minuten)
Ein Aliquot (10 μl) von jedem der gewünschten markierten Kolloide wird in einem Eppendorfgefäß zusammengemischt. Ein kleiner Teil dieses Gemisches (20 μl) wird als Kontrolle beiseite gelegt.
Vorbereitung der Nucleinsäure (30 Minuten)
Die zu analysierende Nucleinsäureprobe wird aus der ursprünglichen Probe (z. B. einer Blutprobe) mittels herkömmlicher Verfahren isoliert (siehe z. B. Sambrook et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) oder spätere Auflagen dieser Arbeit) und vor dem Auflösen in Wasser (20 μl) entsalzt.
Detektion von Sequenz- oder Punktmutationen (5 Minuten)
Die Proben-Nucleinsäure wird dem Kolloidgemisch zugegeben und die Hybridisierung der korrekten Stränge ermöglicht. Nach der Hybridisierung wird die Suspension in ein Kapillarröhrchen (d = 1 mm, Länge = 5 mm) zur Detektion mittels SERRS überführt.
Alternativ dazu können die verschiedenen Komponenten des Tests in einem einzigen Gefäß vorbereitet und durchgeführt werden, das auch für die Spektroskopie verwendet wird, um ein einfacheres, einheitlicheres Protokoll bereitzustellen.
Analyse der erhaltenen Signale (5 Minuten)
Computervergleiche der erhaltenen Signale mit jenen, die für die einzelnen Marker gespeichert sind, ermöglichen die genaue Identifizierung des verwendeten Kolloids und daher der in der Probe vorhandenen Sequenz- oder Punktmutation. Die Quantifizierung der vorhandenen Materialmenge und Häufigkeit einer bestimmten Sequenz- oder Punktmutation kann ebenfalls durchgeführt werden. Die Detektionsgrenzen können wie folgt abgeschätzt werden: veröffentlichte Arbeiten zeigen, dass Marker in Konzentrationen von 8 × 10^–13 M (oder sogar niedriger) detektierbar sind. Für die Detektion in einem Zylinder mit einem Volumen von 4 μl entspricht dies 2000000 Molekülen. Da 100 oder mehr Farbstoffmoleküle je TBS vorhanden sein können, entspricht dies einer Ziel-Menge von nur 20000 Molekülen (3 × 10^–20 Mol). Die Empfindlichkeit kann für spezielle Farbstoffe sogar höher sein.
LITERATURNACHWEIS

(1) Graham, D.; MacLaughlin, C.; McAnally, G.; Smith, W. E.; Jones, J.; White, P. C. Chemical Communications (1998) 11, 1187–1188.
(2) Mirkin, C. A.; Letsinger, R. L.; Mucic, R. C.; Storhoff, J. J. Nature (1996) 382, 607–609.
(3) Alivisatos, A. P.; Johnsson, K. P.; Peng, X.; Wilson, T. E.; Loweth, C. J.; Bruchez, M. P.; Schultz, P. G. Nature (1996) 382, 609–611.
(4) Munro, C. H.; Smith, W. E.; White, P. C. Analyst (1995) 120, 993–1003.
(5) Graham, D.; Smith, W. E.; Linacre, A. M. T.; Munro, C. H.; Watson, N. D.; White, P. C. Analytical Chemistry (1997) 69, 22, 4703–4707.

Claims

Verfahren zum Nachweis der Gegenwart oder Abwesenheit einer Ziel-Nucleinsäuresequenz in einer Proben-Nucleinsäure, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: (a) das Einwirkenlassen eines Nachweismittels auf die Probe, das eine Metalloberfläche umfasst, die mit einer Surface-Enhanced- (Resonance-) Raman-Scattering-(SER(R)S-) aktiven Spezies (SAS) und mit einer Zielbindungsspezies (TBS) assoziiert ist, wobei die TBS eine Nucleinsäure oder ein Nucleinsäureanalog umfasst, die bzw. das zur gesamten oder zu einem Teil der Zielsequenz komplementär ist, worin das Nachweismittel ein erstes Mittel und ein zweites Mittel umfasst, die jeweils eine unterschiedliche TBS aufweisen, wobei jede TBS zur Bindung an die Zielsequenz fähig ist, und worin die Bindung der ersten und der zweiten TBS an die Zielsequenz eine mit jeder TBS assoziierte Metalloberfläche in die Nähe bringt, wodurch eine erhöhte Oberflächenverstärkung einer SAS bewirkt wird, die mit einer der oder beiden Metalloberflächen assoziiert ist, (b) das Beobachten des Probe/Mittel-Gemischs unter Einsatz von SER(R)S, um jegliche Oberflächenverstärkung der Markierung zu detektieren.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Metalloberfläche nicht selbst zur Oberflächenverstärkung fähig ist, wenn sie im Nachweismittel aus Schritt (a) enthalten ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin das Nachweismittel der Probe in Schritt (a) in Form von zwei oder mehreren getrennten Komponenten ausgesetzt wird.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin das Nachweismittel monodisperse, nichtaggregierte, kolloidale Metallteilchen umfasst.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin die TBS Propargylamino-modifizierte Nucleinsäure oder Peptid-Nucleinsäure umfasst.
Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, worin mehr als 1, 2, 3, 4, 5, 10 oder 20 TBS pro Metallkolloidteilchen vorhanden sind.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin eine Oberflächensuchgruppe (SSG) verwendet wird, um die Chemisorption der SAS und/oder der TBS an die Metalloberfläche zu fördern.
Verfahren nach Anspruch 7, worin die SSG die Triazolgruppe, mehr bevorzugt die Benzotriazolgruppe, umfasst.
Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, worin die SSG mit einem Farbstoff modifiziert ist, der eine SAS ist.
Verfahren nach Anspruch 9, worin die modifizierte SSG ein Azobenzotriazol ist.
Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, worin die modifizierte SSG verwendet wird, um die TBS an die Metalloberfläche zu assoziieren.
Verfahren nach Anspruch 11, worin die modifizierte SSG über eine Linkergruppe an die TBS konjugiert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, worin die SAS in einem mehr als 2-, 5-, 10-, 20-, 30-, 40-, 50- oder 100fachen Überschuss gegenüber TBS vorliegt.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin mehr als eine Zielsequenz unter Einsatz mehrerer Nachweismittel mit unterscheidbarer SAS bestimmt wird.
Verfahren nach Anspruch 14, worin die Zielsequenzen Sequenzidentität aufweisen und worin ein gemeinsames erstes Mittel in Verbindung mit spezifischen unter scheidbaren zweiten Mitteln verwendet wird, die zwischen den übrigen Zielsequenzen unterscheiden können.
Verfahren zum Nachweis der Gegenwart oder zum Selektieren oder Identifizieren oder phylogentischen Klassifizieren eines Organismus, wobei das Verfahren ein Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche ist, worin die Ziel-Nucleinsäuresequenz mit diesem Organismus assoziiert ist.
Verfahren zum Diagnostizieren einer Erkrankung, wobei das Verfahren ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15 in vitro ist, worin die Ziel-Nucleinsäuresequenz mit der Erkrankung in Verbindung steht.
Verfahren zur Herstellung eines Nachweismittels, wobei das Nachweismittel ein erstes Mittel und ein zweites Mittel umfasst, die jeweils eine unterschiedliche Zielbindungsspezies (TBS) aufweisen, wobei jede TBS zur Bindung einer gesamten oder eines Teils einer Zielsequenz fähig ist, wobei das Verfahren den Schritt des Kombinierens nichtaggregierter Metallteilchen mit einer Surface-Enhanced- (Resonance-) Raman-Scattering- (SER(R)S-) aktiven Spezies (SAS) und einer TBS umfasst, worin jede TBS eine Nucleinsäure oder ein Nucleinsäureanalog umfasst, das zur gesamten oder zu einem Teil der Zielsequenz komplementär ist, wodurch die SAS und die TBS mit den Metallteilchen über eine Oberflächensuchgruppe (SSG) assoziieren, die verwendet wird, um die Chemisorption an die Metalloberfläche zu fördern.
Nachweismittel, umfassend: ein nichtaggregiertes Metallteilchen, das mit einer SER(R)S-aktiven Spezies (SAS) und mit einer Zielbindungsspezies (TBS) assoziiert ist, wobei die TBS eine Nucleinsäure oder ein Nucleinsäureanalog umfasst, das zur gesamten oder zu einem Teil der Zielsequenz komplementär ist, worin das Nachweismittel ein erstes Mittel und ein zweites Mittel umfasst, die jeweils eine andere TBS aufweisen, wodurch die SAS und die TBS mit den Metallteilchen über eine Oberflächensuchgruppe (SSG) assoziiert sind, die verwendet wird, um Chemisorption an die Metalloberfläche zu fördern.
Zusammensetzung, die zwei oder mehr Nachweismittel nach Anspruch 19 umfasst, die jeweils eine unterscheidbare SAS aufweisen.
System, umfassend ein Mittel oder eine Zusammensetzung nach Anspruch 19 oder 20 plus eine Nucleinsäureprobe.
Vorrichtung, umfassend einen SERRS-Analysator plus ein Mittel, eine Zusammensetzung oder ein System nach einem der Ansprüche 19 bis 21.
Verwendung einer Vorrichtung nach Anspruch 22 in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17.
Set, umfassend ein Mittel oder eine Zusammensetzung nach Anspruch 19 oder 20 plus Ziel-Nucleinsäure zur Verwendung in Vergleichsversuchen.