DE19858588A1 - Farbstoffmarkiertes Oligonukleotid zum Markieren eines Nukleinsäuremoleküls - Google Patents

Abstract

Ein Oligonukleotid (10) dient als Nukleinsäuresonde. Es besteht aus einem Schleifenabschnitt (18), der eine zu einer Zielsequenz eines Nukleinsäuremoleküls komplementäre Schleifensequenz aufweist, sowie aus beiden Enden des Schleifenabschnitts (18) angeordneten Stielabschnitten (14, 16), die miteinander hybridisieren können, um das Oligonukleotid (10) zu einer Schleife zu schließen. Nur einer der Stielabschnitte (14) ist mit einem Fluoreszenz-Farbstoff (12) markiert. Der andere Stielabschnitt (16) enthält Guanosin (6). Guanosin löscht die Fluoreszenz des Farbstoffs (12) durch photoinduzierten Elektronentransfer, sofern Farbstoff (12) und Guanosin (6) sich in hinreichender räumlicher Nähe befinden. Dies ist gegeben, wenn die Stielabschnitte (14, 16) miteinander hybridisieren und das Oligonukleotid (10) zu einer Schleife schließen. Hybridisiert dagegen der Schleifenabschnitt (18) mit dem Zielsequenzabschnitt, so öffnet sich das Oligonukleotid (10), was den Abstand zwischen Farbstoff (12) und Guanosin (6) vergrößert. Das Oligonukleotid kann dann durch seine Fluoreszenz nachgewiesen werden, deren Stärke ein spezifisches Maß für das Vorhandensein von Nukleinsäuremolekülen mit der Zielsequenz ist.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein farbstoffmarkiertes Oligonukleotid zum Markieren eines einen Zielsequenz-Ab­ schnitt aufweisenden Nukleinsäuremoleküls, wobei das farb­ stoffmarkierte Oligonukleotid folgende Komponenten auf­ weist: einen Schleifenabschnitt, der eine zur Zielsequenz im we­ sentlichen komplementäre Schleifensequenz aufweist; einen an einem Ende des Schleifenabschnitts angeordneten ersten Stielabschnitt mit mindestens drei Nukleosiden; einen am an­ deren Ende des Schleifenabschnitts angeordneten zweiten Stielabschnitt mit mindestens drei Nukleosiden, wobei die beiden Stielabschnitte intramolekular hybridisieren können; und einen Fluorophor, der an einer Position des ersten Stielabschnitts gebunden ist.

Die Erfindung bezieht sich ferner auf die Verwendung des farbstoffmarkierten Oligonukleotids zum Markieren eines einen Zielsequenz-Abschnitt aufweisenden Nukleinsäuremole­ küls in einer Lösung und auf zwei Verfahren zum Nachweisen eines einen Zielsequenz-Abschnitt aufweisenden Nukleinsäure­ moleküls in einer Lösung.

Die eingangs genannten farbstoffmarkierten Oligonukleo­ tide werden häufig "Nukleinsäuresonden" genannt. Sie spielen eine zentrale Rolle bei der schnellen und empfindlichen De­ tektion spezifischer, bekannter Nukleinsäuremoleküle (DNA oder RNA) in biologischen Proben in der Molekularbiologie und Biotechnologie. Zu speziellen Anwendungen gehören unter anderem die medizinische Früherkennung einer bakteriellen oder viralen Infektion, die Forensik, der Einsatz in der DNA/RNA-Amplifizierung durch PCR oder durch andere Techni­ ken, in der Frühdiagnose eines genetischen Fehlers sowie bei der Diskriminierung zwischen ähnlichen Organismen und Alle­ len.

Es sind verschiedene Verfahren zur Erkennung und Men­ genbestimmung von Nukleinsäuren bekannt. Das weit verbrei­ tete Southern-Blotting-Verfahren zeichnet sich durch zeit­ raubende Arbeitsschritte und eine schlechte Empfindlichkeit aus.

Ein neueres, elegantes Verfahren zum Nachweisen eines spezifischen Nukleinsäuremoleküls verwendet die sogenannten "Molecular Beacons" (Tyagi et al. 1996, Nature Biotechnology 14, 303-308; Kostrikis et al. 1998, Science 279, 1228-1229) Molecular Beacons sind farbstoffmarkierte Oligonukleotide, die die eingangs genannte Stiel-Schleifen-Struktur haben. An den beiden freien Enden der Stielabschnitte (dem 3'- und dem 5'-Ende) ist jeweils ein Fluorophor gekoppelt. Der eine Flu­ orophor dient als Fluoreszenz-Farbstoff und der andere als Quencher-Farbstoff, der die Fluoreszenz des Fluoreszenz-Farb­ stoffs bei hinreichender räumlicher Nähe durch Foerster-Energietransfer löscht.

Die Sequenzen der Stielabschnitte an beiden Enden der Molecular Beacons sind derart gewählt, daß dann, wenn sich der Molecular Beacon faltet, die Stielabschnitte ausschließ­ lich aneinander, nicht aber mit anderen Abschnitten des Oli­ gonukleotids hybridisieren. Im Zustand der hybridisierten Stielabschnitte ist der Abstand zwischen dem Fluoreszenz-Farb­ stoff und dem Quencher-Farbstoff hinreichend klein, so daß der Fluoreszenz-Farbstoff auch bei geeigneter Anregung mit Licht nicht fluoresziert.

Der Schleifenabschnitt weist eine Sequenz auf, die zur Sequenz des Zielsequenz-Abschnitts komplementär ist. Befin­ den sich die Molecular Beacons und die Zielsequenz aufwei­ sende DNA/RNA-Moleküle gemeinsam in einer Lösung, so können die Schleifenabschnitte und die Zielsequenz-Abschnitte hy­ bridisieren. Die Sequenzen und Längen der Stiel- und Schlei­ fenabschnitte sind derart gewählt, daß sich der Molecular Beacon unter Lösung der Hybridisierung der beiden Stiel­ abschnitte entfaltet. Infolge der Entfaltung wird der räum­ liche Abstand zwischen dem Fluoreszenz-Farbstoff und dem Quencher-Farbstoff stark vergrößert. Der Fluoreszenz-Farb­ stoff kann dann zur Fluoreszenz angeregt werden.

Beobachtet man kontinuierlich die Fluoreszenz-Intensi­ tät des Fluoreszenz-Farbstoffs, so kann ein Anstieg festge­ stellt werden, wenn die Molecular Beacons die Zielsequenz-Ab­ schnitte der Nukleinsäuremoleküle aufspüren und an diesen hybridisieren. Auf diese Weise können die Nukleinsäuremole­ küle quantitativ nachgewiesen werden.

Der Nachteil dieser Art von Molecular Beacons liegt in ihrer relativ aufwendigen Synthese, da das Oligonukleotid sowohl am 5'- als auch am 3'-Ende spezifisch mit dem Fluo­ reszenz- bzw. dem Quencher-Farbstoff markiert werden muß.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, den Nachweis eines Nukleinsäuremoleküls mit Hilfe eines farbstoffmarkier­ ten Oligonukleotids zu verbessern.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein farbstoff­ markiertes Oligonukleotid mit den Merkmalen des Anspruchs 1, durch die Verwendung des farbstoffmarkierten Oligonukleotids gemäß Anspruch 10 sowie durch ein Verfahren mit den Merk­ malen des Anspruchs 11 bzw. 12 gelöst.

Die Erfindung geht von der Erkenntnis aus, daß die Fluoreszenz verschiedener Fluorophore durch Nukleoside über einen photoinduzierten Elektronentransfer gelöscht werden kann (Sauer et al. 1995, J. Fluoresc. 5, 247-261; Seidel et al. 1996, J. Phys. Chem. 100, 5541-5553). Die Effizienz der Fluoreszenzlöschung durch photoinduzierten Elektronen­ transfer hängt stark vom Abstand zwischen dem Fluorophor und dem Nukleosid ab, d. h. nur bei einem geringen Abstand zwi­ schen Fluorophor und dem geeigneten Nukleosid (in einem Ein­ zel- oder Doppelstrang) tritt eine spürbare Fluoreszenz­ löschung auf. Es wurde festgestellt, das beispielsweise ein Guanosin, das mehr als 4 Basen von der Kopplungsstelle des Fluorophors entfernt ist, keinen merklichen Einfluß auf die Fluoreszenzfähigkeit des Fluorophors hat, sofern der Fluoro­ phor nur über einen sehr kurzen Spacer an das zugehörige Nu­ kleosid gebunden ist. Dies gilt sowohl für ein Guanosin im Strang des Fluorophors als auch für solche im gegenüberlie­ genden Strang.

Bei dem erfindungsgemäßen farbstoffmarkierten Oligonu­ kleotid weist der zweite Stielabschnitt mindestens ein Quen­ cher-Nukleosid auf, welches die Fluoreszenz des Fluorophors bei hinreichender räumlicher Nähe zwischen Fluorophor und Quencher-Nukleosid durch photoinduzierten Elektronentransfer löscht. Die Sequenz des ersten Stielabschnitts und die Posi­ tion des Fluorophors sind derart gewählt, daß im hybridi­ sierten Zustand der beiden Stielabschnitte eine für eine Fluoreszenzlöschung hinreichende räumliche Nähe zwischen dem Fluorophor und dem Quencher-Nukleosid vorliegt, und daß bei Hybridisierung des Schleifenabschnitts mit dem Zielsequenz-Ab­ schnitt und Auflösung der Hybridisierung der Stielab­ schnitte keine Fluoreszenzlöschung des Fluorophors auftritt.

Ein solches farbstoffmarkiertes Oligonukleotid (bzw. eine solche Nukleinsäuresonde) hat eine Reihe von Vorteilen. Es wird nur ein einziger Fluorophor benötigt. Dadurch ver­ einfacht sich die Synthese. Da der Mechanismus der Fluores­ zenzlöschung durch photoinduzierten Elektronentransfer genau verstanden ist, kann auch eine gezielte Optimierung der Fluoreszenzlöschung vorgenommen werden.

Für eine effiziente Löschung müssen Nukleosid und Fluo­ rophor aufeinander abgestimmt sein. Von den natürlich vor­ kommenden Nukleosiden hat Guanosin die stärkste löschende Wirkung auf Rhodamin-Farbstoffe. Die Löscheffizienz kann dadurch erhöht werden, daß 7-Deaza-Guanosin als Quencher-Nu­ kleosid verwendet wird. In beiden Fällen bietet es sich an, daß alle weiteren Nukleoside des zweiten Stielabschnitts Guanosine sind. Entsprechend können als Nukleoside des er­ sten Stielabschnitts Cytidine gewählt werden.

Die Sequenz des ersten Stielabschnitts kann derart ge­ wählt werden, daß der erste Stielabschnitt nicht mit einem an den Zielsequenz-Abschnitt angrenzenden Abschnitt des Nu­ kleinsäuremoleküls hybridisieren kann. Andernfalls könnte der Fluorophor des ersten Stielabschnitts in die Nähe eines als Quencher wirkenden Guanosins geraten.

Als weiteres Quencher-Nukleosid kann 7-Deaza-Adenosin verwendet werden. Durch Einsatz von 7-Deaza-Adenosin als Quencher wird der Löscheffekt auf den Fluorophor im Ver­ gleich zum unmodifizierten Guanosin drastisch gesteigert. Wenn 7-Deaza-Adenosin als Quencher-Nukleosid eingesetzt wird, wird das Fluorophor vorteilhafterweise an Thymidin (im Falle von DNA-Molekülen) oder an Uridin (im Falle von RNA-Molekülen) gekoppelt. Diese Nukleoside gehen bei einer Hy­ bridisierung der beiden Stielabschnitte eine Basenpaarung mit dem 7-Deaza-Adenosin ein.

Verwendet man 7-Deaza-Adenosin als Quencher-Nukleosid am zweiten Stielabschnitt und koppelt den Fluorophor an Thy­ midin oder Uridin, so liegt bei einer Hybridisierung des ersten Stielabschnitts mit einem Abschnitt des Nukleinsäure­ moleküls dem Fluorophor im Doppelstrang ein natürliches, un­ modifiziertes Adenosin gegenüber. Dieses läßt die Fluores­ zenz des Fluorophors im wesentlichen unbeeinflußt. Daher kann eine Hybridisierung des ersten Stielabschnitts mit ei­ nem an den Zielsequenz-Abschnitt angrenzenden Abschnitt des Nukleinsäuremoleküls zugelassen werden, sofern die Sequenzen des ersten Stielabschnitts und des Zielsequenz-Abschnitts derart gewählt werden, daß sich kein Guanosin in der Nähe des Fluorophors befindet. Durch die Hybridisierung des ersten Stielabschnitts an einem Abschnitt des Nukleinsäure­ moleküls befindet sich das Fluorophor in einer wohldefinier­ ten Umgebung. Unkontrollierbare Hybridisierungen mit anderen Nukleinsäuremolekülen in der Lösung werden dadurch vermie­ den.

Guanosin, 7-Deaza-Guanosin und 7-Deaza-Adenosin können auch gemischt im zweiten Stielabschnitt verwendet werden.

Eine besonders einfache Synthese des farbstoffmarkier­ ten Oligonukleotids kann dann erreicht werden, wenn der er­ ste Stielabschnitt am 5'-Ende des Schleifenabschnitts ange­ ordnet ist und der Fluorophor terminal am endständigen Nu­ kleosid gekoppelt ist.

Eine weitere vorteilhafte Möglichkeit eröffnet sich, wenn der erste Stielabschnitt am 3'-Ende des Schleifen­ abschnitts angeordnet ist, der Fluorophor terminal am end­ ständigen Nukleosid des ersten Stielabschnitts gekoppelt ist und das 5'-Ende des zweiten Stielabschnitts für eine Immobi­ lisierung funktionalisiert ist. Auf diese Weise können die Nukleinsäuresonden z. B. auf einem DNA-Chip immobilisiert werden. Letzterer kann eine Hybridisierung durch ein Fluo­ reszenzsignal anzeigen.

Das 5'-Ende des zweiten Stielabschnitts kann mit einem Acrylamid-Molekül funktionalisiert werden. Eine solcherart funktionalisierte Nukleinsäuresonde kann bei der Herstel­ lung eines Polyacrylamidgels durch Copolymerisation immobi­ lisiert werden. Dies kann an einer bestimmten Position in einem Plattengel oder einer Kapillare erfolgen. Eine zu untersuchende Probe, die Nukleinsäuremoleküle mit den unter­ schiedlichsten Sequenzen enthalten kann, wird dann unter nicht-denaturierenden Bedingungen im Gel aufgetrennt. Das Vorhandensein eines den Zielsequenz-Abschnitt aufweisenden Nukleinsäuremoleküls zeigt sich durch ein entsprechendes Signal an der Position der immobilisierten Nukleinsäuresonde in Gel. Anschließend kann das den Zielsequenz-Abschnitt auf­ weisende Nukleinsäuremoleküls z. B. durch Ausschneiden aus dem Plattengel gezielt isoliert werden.

Der Schleifenabschnitt muß lang genug sein, um bei Hy­ bridisierung mit dem Zielsequenz-Abschnitt die Hybridisie­ rung der beiden Stielabschnitte aufzulösen. Er muß anderer­ seits aber nur genau so lang sein, daß eine eindeutige Iden­ tifizierung des Zielsequenz-Abschnitts gegeben ist. Vorteil­ hafterweise umfaßt daher der Schleifenabschnitt 8 bis 50 Nu­ kleoside.

Die beiden Stielabschnitte müssen mindestens so lang sein, daß eine zuverlässige Hybridisierung auftreten kann. Andererseits sollte die Hybridisierung der beiden Stielab­ schnitte jedoch im Falle der Hybridisierung des Schleifenab­ schnitts mit dem Zielsequenz-Abschnitt aufgelöst werden. Die Stärke der Hybridisierung läßt sich durch die Länge der bei­ den Stielabschnitte beeinflussen. Vorteilhafterweise umfaßt daher der erste Stielabschnitt 3 bis 8 Nukleoside und der zweite Stielabschnitt mindestens so viele Nukleoside wie der erste Stielabschnitt.

Als Fluorophore eignen sich prinzipiell alle bekannten Farbstoffmoleküle, speziell aber Rhodamin- und Phenoxazin-Farb­ stoffe. Letztere sind gut koppelbar und photostabil. Ein weiterer Vorteil des Einsatzes von Rhodamin- oder Phenoxa­ zin-Farbstoffen besteht darin, daß als Anregungslichtquelle für eine Fluoreszenzdetektion kleine und billige Diodenlaser eingesetzt werden können.

Das erfindungsgemäße farbstoffmarkierte Oligonukleotid kann vorteilhaft zum Markieren eines einen Zielsequenz-Ab­ schnitt aufweisenden Nukleinsäuremoleküls in einer Lösung verwendet werden, wobei das farbstoffmarkierte Oligonukleo­ tid mit dem Nukleinsäuremolekül hybridisiert.

Das erfindungsgemäße farbstoffmarkierte Oligonukleotid ist außerdem besonders zum Nachweis eines einen Zielsequenz-Ab­ schnitt aufweisenden Nukleinsäuremoleküls in einer Lösung geeignet. Dazu wird das Nukleinsäuremolekül mit einem erfin­ dungsgemäßen farbstoffmarkierten Oligonukleotid markiert. Zur Stabilisierung des Doppelstrangs aus Sonde und Nuklein­ säuremolekül und zur Verbesserung der Löscheffizienz zwi­ schen Quencher und Fluorophor wird nach der Hybridisierung und vor der Aufnahme eines Nachweissignals der pH-Wert der Lösung auf Werte zwischen 2 und 4 eingestellt. Um zu vermei­ den, daß sich Intensitätsschwankungen, beispielsweise auf­ grund von Inhomogenitäten der Lösung, auf die Meßergebnisse auswirken, kann die Fluoreszenz des Fluorophors derart ange­ regt und detektiert werden, daß dessen Fluoreszenzabkling­ verhalten erfaßt wird.

Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung sind in den Unteransprüchen gekennzeichnet.

Im folgenden wird die Erfindung anhand von Ausführungs­ beispielen näher erläutert, die in den Figuren schematisch dargestellt sind. Gleiche Bezugsziffern in den einzelnen Fi­ guren bezeichnen dabei gleiche Elemente. Im einzelnen zei­ gen:

Fig. 1 ein farbstoffmarkiertes Oligonukleotid, bei dem die Stielabschnitte aneinander hybridisiert sind;

Fig. 2 das farbstoffmarkierte Oligonukleotid gemäß Fig. 1, wobei der Schleifenabschnitt an einem Nu­ kleinsäuremolekül hybridisiert ist;

Fig. 3 ein zweites Ausführungsbeispiel eines farbstoff­ markierten Oligonukleotids, bei dem die Stielab­ schnitte aneinander hybridisiert sind;

Fig. 4 das farbstoffmarkierte Oligonukleotid gemäß Fig. 3, wobei der Schleifenabschnitt an einem Nu­ kleinsäuremolekül hybridisiert ist; und

Fig. 5 ein drittes Ausführungsbeispiel eines farbstoff­ markierten Oligonukleotids, bei dem die Stielab­ schnitte aneinander hybridisiert sind;

Fig. 6 das farbstoffmarkierte Oligonukleotid gemäß Fig. 5, wobei der Schleifenabschnitt an einem Nu­ kleinsäuremolekül hybridisiert ist; und

Fig. 7 eine schematische Darstellung der möglichen Zu­ standsänderungen beim photoinduzierten Elektro­ nentransfer.

In den Figuren bezeichnen die Buchstaben A, C, G und T die Nukleoside Adenosin, Cytidin, Guanosin und Thymidin.

Im folgenden sei der photoinduzierte Elektronentransfer anhand von Fig. 7 kurz erläutert. Dargestellt ist die Fluo­ reszenzlöschung eines angeregten Farbstoff-Moleküls F* durch eine Nukleosid N. Die schwarzen Kreise repräsentieren Elek­ tronen. Es sind jeweils das HOMO (highest occupied molecular orbital) und das LUMO (lowest unoccupied molecular orbital) eingezeichnet. Das HOMO ist das energetisch höchste, im elektronischen Grundzustand besetzte Molekülorbital. Das LUMO ist das energetisch niedrigste, im elektronischen Grundzustand unbesetzte Molekülorbital; es ist i.d.R. das Molekülorbital, das im ersten angeregten Zustand besetzt wird.

Prinzipiell gibt es zwei Möglichkeiten der Fluoreszenz­ löschung durch photoinduzierten Elektronentransfer. Im in Fig. 7 links dargestellten Fall wirkt das Nukleosid N als Elektronenspender (Donor). Nach Anregung des Fluorophors F* geht ein Elektron vom doppelt besetzten HOMO des Nukleosids zum nun einfach besetzen HOMO des Fluorophors F* über (1). Es kommt zu einer Reduktion des angeregten Fluorophors F* durch das Nukleosid N. Das Elektron im LUMO des Fluorophors kann anschließend zum nun einfach besetzten HOMO des Nukleo­ sid N übergehen (2). Dieser Fall tritt zwischen Guanosin und Rhodamin-Molekülen auf.

Im in Fig. 7 rechts dargestellten Fall wirkt das Nukleosid N als Elektronenakzeptor (Akzeptor). Aus dem ein­ fach besetzten LUMO des angeregten Fluorophors F* geht das dort befindliche Elektron zum unbesetzten LUMO des Nukleo­ sids N über (3) . Es kommt zu einer Oxidation des angeregten Fluorophors F* durch das Nukleosid N. Das Elektron im LUMO des Nukleosids kann anschließend zum HOMO des Fluorophors zurückkehren (4).

In beiden Fällen kann das Elektron nach dem Elektronen­ transfer nicht mehr aus dem LUMO des angeregten Fluorophors F* durch Aussenden eines Photons in das HOMO zurückkehren. Der erste angeregte Zustand wurde strahlungslos deaktiviert. Die Fluoreszenz ist gelöscht.

Fig. 1 zeigt ein Oligonukleotid 10, an dessen einem En­ de ein Fluorophor 12 gekoppelt ist. Das Oligonukleotid 10 besteht aus einem ersten Stielabschnitt 14, einem zweiten Stielabschnitt 16 und einem Schleifenabschnitt 18. Die Se­ quenz des ersten Stielabschnitts 14 besteht aus 6 Nukleosi­ den, die alle Cytidine sind. Die Sequenz des zweiten Stielabschnitts 16 besteht aus mindestens 6 Guanosinen.

Dadurch können der erste Stielabschnitt 14 und der zweite Stielabschnitt 16 aneinander hybridisieren und das Oligo­ nukleotid 10 in eine Stiel-Schleifen-Struktur falten. Die genaue Länge des zweiten Stielabschnitts ist unerheblich, sofern er mindestens so viele Nukleoside aufweist, wie der erste Stielabschnitt.

Im folgenden wird auf Fig. 2 Bezug genommen. Die Se­ quenz des Schleifenabschnitts 18 ist derart gewählt, daß das Oligonukleotid 10 als Sonde für ein spezifisches Nukleinsäu­ remolekül 20 dienen kann. In der Regel ist die Schleifense­ quenz komplementär zur Sequenz eines Zielabschnitts des Nu­ kleinsäuremoleküls 20. Werden das Oligonukleotid 10 und das Nukleinsäuremolekül 20 zusammen in eine Lösung gegeben, so hybridisiert der Schleifenabschnitt 18 am Zielsequenz-Ab­ schnitt des Nukleinsäuremoleküls 20. Dadurch löst sich die Hybridisierung zwischen den beiden Stielabschnitten 14, 16. Infolgedessen vergrößert sich der Abstand zwischen dem Fluo­ rophor 12 und den Guanosinen des zweiten Stielabschnitts 16. Letztere wirken nicht mehr fluoreszenzlöschend auf den Fluo­ rophor 12, dessen Fluoreszenz somit beobachtet werden kann. Ein Anstieg der Fluoreszenz des Fluorophors 12 erlaubt daher qualitative und quantitative Aussagen über das Vorliegen des Nukleinsäuremoleküls 20.

Der Zielsequenz-Abschnitt auf dem Nukleinsäuremolekül 20 wird bei diesem Ausführungsbeispiel derart gewählt, daß der erste Stielabschnitt 14 bei Hybridisierung des Schlei­ fenabschnitts 18 nicht mit dem Nukleinsäuremolekül 20 hybri­ disiert. Dadurch wird die Nähe zu irgendwelchen Guanosinen auf diesem Abschnitt des Nukleinsäuremoleküls 20 prinzipiell vermieden. In Fig. 2 erkennt man jedoch, daß der zweite Stielabschnitt 16 beispielsweise teilweise auf dem Nuklein­ säuremolekül hybridisieren kann.

Im folgenden wird auf Fig. 3 Bezug genommen. Fig. 3 zeigt ein zweites Ausführungsbeispiel eines farbstoffmar­ kierten Oligonukleotids 10, das im wesentlichen mit dem Oli­ gonukleotid gemäß Fig. 1 übereinstimmt. Das Oligonukleotid gemäß Fig. 3 weist jedoch im ersten Stielabschnitt 14 als fünftes Nukleosid - gezählt vom Ende her - ein Thymidin auf. Der zweite Stielabschnitt weist als neuntes Nukleosid - ebenfalls vom Ende her gezählt - ein Adenosin auf. Im hybri­ disierten Doppelstrang kommt es zwischen dem Adenosin und dem Thymidin zur Basenpaarung. Die Cytidine und Guanosine können dann nicht gegeneinander versetzt hybridisieren. Dadurch ist gewährleistet, daß an einem Ende ein Guanosin-Über­ stand resultiert, der die Löschung des Fluorophors begünstigt.

Fig. 4 zeigt das Oligonukleotid 10 gemäß Fig. 3 an einem Nukleinsäuremolekül 20 hybridisiert, das einen Ziel­ sequenz-Abschnitt aufweist, dessen Sequenz komplementär zur Schleifensequenz ist.

Im folgenden wird auf Fig. 5 Bezug genommen. Fig. 5 zeigt ein zweites Ausführungsbeispiel eines farbstoffmar­ kierten Oligonukleotids 22 mit einem ersten Stielabschnitt 24 und einem zweiten Stielabschnitt 26. Der zweite Stielab­ schnitt 26 weist genau 6 Nukleoside auf, von denen das end­ ständige Nukleosid ein modifiziertes Adenosin ist, genauer gesagt 7-Deaza-Adenosin. Dies ist in den Fig. 5 und 6 mit A' bezeichnet. Entsprechend befindet sich an der im hybridi­ sierten Zustand der beiden Stielabschnitte 24, 26 dem 7-Deaza-Adenosin gegenüberliegenden Stelle des ersten Stielab­ schnitts 24 ein Thymidin. An das Thymidin ist der Fluorophor 12 gekoppelt.

Fig. 6 zeigt das Nukleinsäuremolekül 20 gemäß Fig. 2, an welches das als Sonde dienende farbstoffmarkierte Oligo­ nukleotid 22 gemäß Fig. 5 hybridisiert ist. Die Fig. 2 und 6 unterscheiden sich nur dahingehend, daß die Stielabschnitte 14, 16 bzw. 24, 26 unterschiedliche Sequenzen aufweisen. Der erste Stielabschnitt 24 hat in den Fig. 5 und 6 eine Se­ quenz, die eine Hybridisierung des ersten Stielabschnitts 24 mit einem an den Zielsequenz-Abschnitt angrenzenden Ab­ schnitt des Nukleinsäuremoleküls 20 ermöglicht.

Der Zielsequenz-Abschnitt und die zugehörige Sequenz des Oligonukleotids 22 können in der folgenden Weise be­ stimmt werden:

• a) Auf dem Nukleinsäuremolekül 20 wird ein Adenosin ge­ sucht, bei dem sich unter den jeweils 4, links und rechts benachbarten Nukleosiden weder Cytidin noch Guanosin befin­ det.
• b) In Verlängerung dieses Adenosins z. B. in 5'-Richtung des Nukleinsäuremoleküls 20 um mindestens 9 Nukleoside wird eine Sequenz gesucht, die das Nukleinsäuremolekül 20 eindeu­ tig kennzeichnet.
• c) Die Oligonukleotidsequenz 22 wird zu dieser Sequenz komplementär gebildet. Dabei bilden die ersten 3 bis 6 Nu­ kleoside am 5'-Ende der Oligonukleotidsequenz die erste Stielsequenz 24.
• d) Die zweite Stielsequenz 26 wird auf die folgende Weise gewonnen: Es wird geprüft, ob es am 3'-Ende der Oligo­ nukleotidsequenz
  • da) 3 bis 6 intramolekular ausschließlich zur er­ sten Stielsequenz komplementäre Nukleoside gibt, und ob
  • db) das 3'-terminale Nukleosid Adenosin ist.

Ist dies der Fall, so bilden diese 6 Nukleoside die zweite Stielsequenz 26.

Ist dies nicht der Fall, so wird die Oligonukleotidse­ quenz um 3 bis 6 Nukleoside derart verlängert, daß sich 3 bis 6 intramolekular ausschließlich zur ersten Stielsequenz komplementäre Nukleoside mit 3'-terminalem Adenosin ergeben. (Sollte dies nicht möglich sein, da sich z. B. die Sequenz des ersten Stielabschnitts innerhalb der Zielsequenz wieder­ holt, muß ein anderes Adenosin gemäß Schritt a) gesucht wer­ den.)

Das 3'-terminale Adenosin wird bei der Synthese des Oligonukleotids durch 7-Deaza-Adenosin ersetzt.

(Die minimale Zahl von 9 Nukleosiden in Schritt b) er­ gibt sich aus der minimalen Länge der Oligonukleotidsequenz bestehend aus 3 Nukleosiden für die beiden Stielsequenzen 24, 26 und mindestens 4 Nukleosiden für den Faltungsab­ schnitt des Oligonukleotids.)

Man sieht an diesem Beispiel, daß sich die Schleifen- und Stielabschnitte auch überlappen können, und daß das farbstoffmarkierte Oligonukleotid 22 auch vollständig auf dem Nukleinsäuremolekül 20 hybridisieren kann.

Prinzipiell kann der Farbstoff sowohl an das 3'-Ende als auch an das 5'-Ende des Oligonukleotids gekoppelt wer­ den. Hierzu stehen die folgenden Möglichkeiten zur Verfü­ gung:

• (a) bekannte Modifikation eines Endes des Oligonukleo­ tids mit einer Aminfunktion, z. B. durch einen C6-Amino­ linker, und anschließende Ankopplung des Farbstoffs an das modifizierte Ende über eine aktivierte Carboxylfunktion.
• (b) synthetischer Einbau eines aminomodifizierten Nukleotids beim Aufbau des Oligonukleotids, z. B. in einem Synthesizer, und anschließende Ankopplung des Farbstoffs an das aminomodifizierte Nukleotid über eine aktivierte Car­ boxylfunktion.
• (c) synthetischer Einbau des Farbstoffs als Phosphor­ amidit während der Oligonukleotid-Synthese.

Zur Optimierung der Löscheffizienz muß einerseits der durch die Hybridisierung gebildete Doppelstrang möglichst stabil sein. Dies wird in bekannter Weise durch Einstellen geeigneter Salzkonzentrationen erreicht. Andererseits kann aber auch der pH-Wert einen drastischen Einfluß auf die Löscheffizienz haben, etwa bei Verwendung eines Rhodamin-Farb­ stoffs, der eine freie Carboxylgruppe trägt, z. B. Tetra­ methylrhodamin. Durch die Protonierung der freien Carboxyl­ funktion im sauren Medium wird die Abstoßung zwischen dem Farbstoff und den Phosphatgruppen der Nukleotide verringert. Letzteres führt zu einem geringeren Abstand zwischen Farb­ stoff und Nukleotiden bzw. Nukleosiden und damit zu einer stärkeren Fluoreszenzlöschung. Bei Verwendung geeigneter Farbstoffe wird daher der pH-Wert vor Aufnahme eines Nach­ weissignals auf ca. 3 eingestellt.

Zum Nachweis des Nukleinsäuremoleküls wird die Fluores­ zenz des Fluorophors vorzugsweise mit zeitkorreliertem Ein­ zelphotonenzählen nachgewiesen (D.V. O'Connor und D. Phil­ lips, "Time-correlated single photon counting", Adacemic Press, London, 1984) . Neben der besonders hohen Empfindlich­ keit bietet diese spektroskopische Technik den Vorteil, daß mit ihrer Hilfe das Fluoreszenzabklingverhalten des Fluoro­ phors 12 beobachtet werden kann. Dieses hat sich als verläß­ licheres Kriterium zum Nachweis der Fluoreszenz des Fluoro­ phors 12 und damit des Nukleinsäuremoleküls 20 erwiesen als eine einfache Intensitätsmessung. Intensitätsschwankungen, beispielsweise aufgrund von Inhomogenitäten der Lösung, wir­ ken sich dadurch nicht auf die Meßergebnisse aus.

Im Rahmen der Erfindung sind zahlreiche Abwandlungen und Weiterbildungen der beschriebenen Ausführungsbeispiele ver­ wirklichbar. So muß beispielsweise der Fluorophor 12 nicht unmittelbar an demjenigen Nukleosid gekoppelt sein, das dem Quencher-Nukleosid im hybridisierten Zustand gegenüberliegt. Der Abstand zum erstgenannten Nukleosid muß nur hinreichend klein sein, um eine brauchbare Fluoreszenzlöschung durch das Quencher-Nukleosid hervorzurufen. Auch müssen der Schleifen­ abschnitt 18 und die Stielabschnitte 14, 16, 24, 26 nicht unmittelbar aneinander grenzen. Sie können durch weitere, kurze Sequenzabschnitte voneinander getrennt sein. Die Se­ quenz des Zielabschnitts und damit die komplementäre Sequenz des Schleifenabschnitts 18 sind prinzipiell beliebig. Außer­ dem kann das Nukleinsäuremolekül 20 ausschließlich aus dem Zielsequenz-Abschnitt bestehen.

Claims (12)

1. Farbstoffmarkiertes Oligonukleotid zum Markieren eines einen Zielsequenz-Abschnitt aufweisenden Nukleinsäure­ moleküls, wobei das farbstoffmarkierte Oligonukleotid fol­ gende Komponenten aufweist:

• - einen Schleifenabschnitt, der eine zur Zielsequenz im wesentlichen komplementäre Schleifensequenz aufweist;
• - einen an einem Ende des Schleifenabschnitts angeordne­ ten ersten Stielabschnitt mit mindestens drei Nukleosiden;
• - einen am anderen Ende des Schleifenabschnitts angeord­ neten zweiten Stielabschnitt mit mindestens drei Nukleo­ siden, wobei die beiden Stielabschnitte aneinander hybridi­ sieren können; und
• - einen Fluorophor, der an einer Position des ersten Stielabschnitts gebunden ist;
  dadurch gekennzeichnet,
  daß der zweite Stielabschnitt mindestens ein Quencher-Nukleosid aufweist, welches die Fluoreszenz des Fluorophors bei hinreichender räumlicher Nähe zwischen Fluorophor und Quencher-Nukleosid durch photoinduzierten Elektronentransfer löscht;
  wobei die Sequenz des ersten Stielabschnitts und die Position des Fluorophors derart gewählt sind, daß im hybridisierten Zustand der beiden Stiel­ abschnitte eine für eine Fluoreszenzlöschung hinreichende räumliche Nähe zwischen dem Fluorophor und dem Quencher-Nukleosid vorliegt, und
  daß bei Hybridisierung des Schleifenabschnitts mit dem Zielsequenz-Abschnitt und Auflösung der Hybridisierung der Stielabschnitte keine Fluoreszenzlöschung des Fluoro­ phors auftritt.

2. Farbstoffmarkiertes Oligonukleotid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein Quencher-Nukleo­ sid Guanosin oder 7-Deaza-Guanosin oder 7-Deaza-Adenosin ist.

3. Farbstoffmarkiertes Oligonukleotid nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der erste Stielabschnitt derart gewählt ist, daß bei Hybridisierung des Schleifen­ abschnitts mit dem Zielsequenz-Abschnitt des Nukleinsäure­ moleküls auch der erste Stielabschnitt mit einem Abschnitt des Nukleinsäuremoleküls hybridisiert.

4. Farbstoffmarkiertes Oligonukleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet,
daß der erste Stielabschnitt am 5'-Ende des Schleifen­ abschnitts angeordnet ist; und
daß der Fluorophor terminal am endständigen Nukleosid des ersten Stielabschnitts gekoppelt ist.

5. Farbstoffmarkiertes Oligonukleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet,
daß der erste Stielabschnitt am 3'-Ende des Schleifen­ abschnitts angeordnet ist;
daß der Fluorophor terminal am endständigen Nukleosid des ersten Stielabschnitts gekoppelt ist; und
daß das 5'-Ende des zweiten Stielabschnitts für eine Immobilisierung funktionalisiert ist.

6. Farbstoffmarkiertes Oligonukleotid nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das 5'-Ende des zweiten Stiel­ abschnitts mit einem Acrylamid-Molekül funktionalisiert ist.

7. Farbstoffmarkiertes Oligonukleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Schlei­ fenabschnitt 8 bis 50 Nukleoside umfaßt.

8. Farbstoffmarkiertes Oligonukleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß der erste Stielabschnitt maximal 8 Nukleoside umfaßt.

9. Farbstoffmarkiertes Oligonukleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Fluoro­ phor ein Rhodamin- oder Phenoxazin-Farbstoffmolekül auf­ weist.

10. Verwendung des farbstoffmarkierten Oligonukleotids nach einem der Ansprüche 1 bis 9 zum Markieren eines einen Zielsequenz-Abschnitt aufweisenden Nukleinsäuremoleküls in einer Lösung, wobei das farbstoffmarkierte Oligonukleotid mit dem Nukleinsäuremolekül hybridisiert.

11. Verfahren zum Nachweisen eines einen Zielsequenz-Ab­ schnitt aufweisenden Nukleinsäuremoleküls in einer Lösung,
wobei zum Markieren des Nukleinsäuremoleküls das Verfah­ ren nach Anspruch 10 ausgeführt wird; und
wobei nach der Hybridisierung und vor der Aufnahme eines Nachweissignals der pH-Wert der Lösung auf Werte zwischen 2 und 4 eingestellt wird.

12. Verfahren zum Nachweisen eines einen Zielsequenz-Ab­ schnitt aufweisenden Nukleinsäuremoleküls in einer Lösung,
wobei zum Markieren des Nukleinsäuremoleküls das Verfah­ ren nach Anspruch 10 ausgeführt wird; und
wobei danach die Fluoreszenz des Fluorophors derart angeregt und detektiert wird, daß dessen Fluoreszenzabkling­ verhalten erfaßt wird.