DE112005002212T5

DE112005002212T5 - Externe Modifikation von organisch anorganischen Verbundnanoclustern

Info

Publication number: DE112005002212T5
Application number: DE112005002212T
Authority: DE
Inventors: Jingwu San Jose Zhang; Xing Cupertino SU; Sun Santa Clara Lei
Original assignee: Intel Corp
Current assignee: Intel Corp
Priority date: 2004-09-13
Filing date: 2005-09-02
Publication date: 2007-10-25
Also published as: GB2431235A; TW200619391A; WO2007018551A3; US7790286B2; US20060073336A1; US20090069481A1; TWI360657B; WO2007018551A2; US7361410B2; GB0702233D0

Abstract

Nanocluster aus Metallteilchen, die eine einzigartige Raman-Signatur aufweisen, wobei die einzigartige Raman-Signatur durch mindestens eine Raman-aktive organische Verbindung erzeugt wird, und wobei mindestens eine Raman-aktive organische Verbindung in den Nanocluster integriert ist, welcher auch eine Adsorptionsschicht auf der Oberfläche des Nanoclusters aufweist, umfassend ein Blockcopolymer, das einen hydrophoben Bereich und einen hydrophilen Bereich aufweist.

Description

ALLGEMEINER STAND DER TECHNIK
GEBIET DER ERFINDUNG
Die Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung betreffen im Allgemeinen die Modifikation und Funktionalisierung von metallischen Nanoclustern, die organische Verbindungen einbauen.
HINTERGRUNDINFORMATIONEN
Die Fähigkeit, Spurenmengen von Analyten nachzuweisen und zu identifizieren, ist in vielen wissenschaftlichen Disziplinen in zunehmendem Maße wichtig geworden, wobei der Bereich von ppb-Analysen von Schadstoffen in Untergrundwasser bis zur Analyse von Arzneistoffen und Metaboliten einer Behandlung im Blutserum reicht. Außerdem erhöht die Fähigkeit zur Durchführung von Tests auf multiplexartige Weise die Geschwindigkeit, mit der Information gesammelt werden können. Vorrichtungen und Verfahren, die die Verfahren zum Aufklären der Krankheitsursachen, zum Erzeugen vorhersagender und/oder diagnostischer Tests und zum Entwickeln von wirksamen therapeutischen Behandlungen beschleunigen, sind wertvolle wissenschaftliche Werkzeuge. Ein Hauptproblem ist die Entwicklung eines Identifikationssystems für einen großen Satz an Sonden, der unterscheidbare Komponenten für jede einzelne Sonde aufweist.
Unter den vielen analytischen Techniken, die für chemische Analysen verwendet werden können, hat sich die oberflächenverstärkte Raman-Spektroskopie (SERS) als ein empfindliches Verfahren erwiesen. Ein Raman-Spektrum besteht, ähnlich wie ein Infrarotspektrum, aus einer Wellenlängenverteilung von Banden, die molekularen Schwingungen entsprechen, welche für die Probe, die analysiert werden soll, (den Analyten) spezifisch sind. Die Raman-Spektroskopie untersucht die Schwingungsmoden eines Moleküls, und das resultierende Spektrum ist in seiner Art, ähnlich wie ein Infrarotspektrum, wie ein Fingerabdruck. Im Vergleich zu einem Fluoreszenzspektrum eines Moleküls, welches normalerweise einen einzigen Peak aufweist, der eine Halbwertsbreite von einigen Zehn Nanometern bis zu Hunderten von Nanometern aufweist, weist ein Raman-Spektrum mehrere, mit der Struktur verknüpfte Peaks mit Halbwertsbreiten von gerade einmal wenigen Nanometern auf.
Um ein Raman-Spektrum zu erhalten, wird typischerweise ein Strahl aus einer Lichtquelle, wie ein Laser, auf die Probe fokussiert, was unelastisch gestreute Strahlung erzeugt, welche optisch gesammelt und in ein wellenlängendispersives Spektrometer geleitet wird. Auch wenn die Raman-Streuung ein Ereignis mit verhältnismäßig niedriger Wahrscheinlichkeit ist, kann SERS verwendet werden, um die Signalintensität im resultierenden Schwingungsspektrum zu erhöhen. Verstärkungstechniken ermöglichen eine 10⁶- bis 10¹⁴-fache Verstärkung des Raman-Signals.
Eine Voraussetzung für multiplexartige Analysen bei einer komplexen Probe ist es, ein Kodierungssystem zu haben, das Identifikatoren für eine große Anzahl von Analyten in der Probe besitzt. Außerdem müssen die Identifikatoren oder Reporter zum Nachweis der Analyten in Abhängigkeit von einer vom Benutzer gewählten Anwendung unterschiedliche Eigenschaften besitzen, wie beispielsweise mechanische und/oder chemische Stabilität. In Abhängigkeit von der angestrebten Verwendung müssen Reporter chemisch mit verschiedenen Anwendungen, wie biochemischen Analysen, verträglich und in der Lage sein, über verschiedene Zustände stabil mit Sonden funktionalisiert zu werden, welche die Komplexierung des Identifikators mit einem Analyten in einer Probe ermöglichen.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
Die folgenden Zeichnungen sind enthalten, um ferner bestimmte Gesichtspunkte der offenbarten Ausführungsformen der Erfindung zu zeigen. Die Ausführungsformen können unter Bezug auf eine oder mehrere dieser Zeichnungen in Kombination mit der ausführlichen Beschreibung besser verstanden werden.
Die 1A und B zeigen Raman-Spektren, die an COINs erhalten wurden, die einen einzigen Typ von Raman-Label bzw. drei verschiedene Raman-Label einbauen. (Zeichenerklärung: 8-Aza-adenin (AA), 9-Aminoacridin (AN), Methylenblau (MB)). Auf repräsentative Peaks wird durch Pfeile hingewiesen; die Peakintensitäten wurden auf die jeweiligen Maxima normiert; die Werte auf der Y-Achse sind in willkürlichen Einheiten; die Spektren sind um 1 Einheit gegeneinander verschoben.
Die 2A und B zeigen Signaturen von COINs mit doppelten und dreifachen Raman-Labeln. Die 3 verwendeten Raman-Label waren 8-Aza-adenin (AA), 9-Aminoacridin (AN) und Methylenblau (MB). Auf die Positionen der Hauptpeaks wird durch Pfeile hingewiesen; die Peakhöhen (in willkürlichen Einheiten) wurden auf die jeweiligen Maxima normiert; die Spektren sind um 1 Einheit gegeneinander verschoben.
3 ist eine schematische Darstellung, die eine Verwendung von COINs als Reporter zum Nachweis von Analyten veranschaulicht.
4 stellt eine idealisierte schematische Darstellung eines funktionalisierten COIN bereit.
Die 5A bis C zeigen Diagramme mehrerer Beschichtungsschemata für COINs. 5A zeigt einen Nanocluster, der eine einzige Schutzschicht aufweist. 5B zeigt einen Nanocluster, der eine doppelte Schutzschicht aufweist. 5C zeigt einen Nanocluster, der eine dreifache Schutzschicht aufweist.
Die 6A und B zeigen Beispiele für an der Oberfläche funktionalisierte COINs. In 6A ist ein COIN mit einer Schicht aus Gold beschichtet und mit Thiolalkylsäure funktionalisiert. In 6B ist ein COIN mit einer Siliciumdioxidschicht beschichtet und mit Ethylamin funktionalisiert.
Die 7A bis D veranschaulichen mehrere Verfahren zum Erzeugen einer Adsorptionsschicht auf einem COIN.
8 ist eine schematische Darstellung, die ein Verfahren zum Beschichten von Silber-COINs mit Siliciumdioxid veranschaulicht.
9 veranschaulicht ein Verfahren zum Beschichten von COINs mit einem organischen Material. Eine mit Octylamin modifizierte Polyacrylsäure wird an einem Nanocluster adsorbiert und mit Lysin vernetzt. Eine Sonde wird dann durch Kuppeln mit der Carbonsäuregruppe der Polyacrylsäure an dem Nanoteilchen befestigt.
Die 10A bzw. B zeigen die Zeta-Potentialmessungen von Silberteilchen und die Entwicklung der Aggregatgröße (z-Mittelwert) in Gegenwart von 20 μM 8-Aza-adenin.
Die 11A und B zeigen Raman-Spektren von verkapselten COINs.
Die 12A, B und C zeigen eine Thermostabilitätsuntersuchung für verkapselte AAD-COINs und mit BSA beschichtete AAD-COINs.
13 zeigt eine Intensitäts-gewichtete Größenverteilung von verkapselten AMA-(9-Aminoacridin) COINs.
14 zeigt TEM-Bilder von verkapselten AMA-(9-Aminoacridin) COINs.
Die 15A bzw. B enthalten TEM-Bilder von mit Siliciumdioxid beschichteten Silberteilchen bzw. mit Siliciumdioxid beschichteten Goldteilchen.
16 enthält TEM-Bilder von mit Hämatit (α-Fe₂O₃) beschichteten Silberteilchen.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Wie hier vollständiger beschrieben, bestehen organisch-anorganische Verbundnanocluster (composite organic inorganic nanoclusters: COINs) aus einem Metall und mindestens einer organischen Raman-aktiven Verbindung. Wechselwirkungen zwischen dem Metall der Cluster und der (den) Raman-aktiven Verbindung(en) verstärken das Raman-Signal, das von der (den) Raman-aktiven Verbindung(en) erhalten wird, wenn das Nanoteilchen durch einen Laser angeregt wird. Somit können die COINs der vorliegenden Erfindung als empfindliche Reporter zur Verwendung beim Nachweis von Analyten fungieren. Da viele organische Raman-aktive Verbindungen in die Nanocluster eingebaut werden können, kann ein Satz von COINs erzeugt werden, bei dem jedes Mitglied des Satzes eine Raman-Signatur aufweist, die einzigartig im Satz ist. Somit können COINs auch als empfindliche Reporter beim hochgradig parallelen Nachweis von Analyten fungieren. Weiterhin sind nicht nur die intrinsischen verstärkten Raman-Signaturen der Nanoteilchen der vorliegenden Erfindung empfindliche Reporter, sondern die Empfindlichkeit kann auch weiter verstärkt werden, indem Tausende von Raman-Labeln in einen einzigen Nanocluster eingebaut und/oder mehrere Nanocluster an einem einzigen Analyten befestigt werden.
Es wurde gefunden, daß aggregierte Metallkolloide bei erhöhter Temperatur verschmolzen und daß organische Raman-Label in die koaleszierenden Metallteilchen eingebaut werden konnten. Diese koaleszierten Metallteilchen bilden stabile Cluster, wodurch intrinsisch verstärkte Raman-Streuungssignale für das eingebaute organische Label hervorgerufen werden. Somit erfordern die COINs der vorliegenden Erfindung keinen Verstärkungsschritt, um als empfindliche Reporter zum Nachweis von Analyten zu fungieren, da die Raman-Verstärkung dem Teilchen intrinsisch ist. Die Wechselwirkung zwischen den Molekülen des organischen Raman-Labels und den Metallkolloiden hat wechselseitige Vorzüge. Abgesehen davon, daß sie als Signalquellen dienen, induzieren die organischen Moleküle eine Assoziation der Metallteilchen, die die Verstärkung des elektromagnetischen Signals begünstigt. Außerdem stellt die innere Struktur der Nanocluster Räume bereit, wo Raman-Labelmoleküle gehalten werden, insbesondere an den Verbindungspunkten zwischen den Metallteilchen, aus denen der Cluster besteht. Tatsächlich wird angenommen, daß die größte Verstärkung von den organischen Molekülen erzielt wird, die sich an den Verbindungspunkten zwischen den Metallteilchen der Nanocluster befinden.
COINs können nicht nur mit verschiedenen Raman-Labeln synthetisiert werden, sondern COINs können auch derart erzeugt werden, daß sie verschiedene Gemische von Raman-Labeln und auch verschiedene Anteile von Raman-Labeln innerhalb der Gemische aufweisen. Nun Bezug nehmend auf die 1 und 2 zeigt 1A die Signaturen von COINs, die mit einer einzigen Raman-aktiven organischen Verbindung hergestellt wurden, wobei gezeigt wird, daß jede Raman-aktive organische Verbindung eine einzigartige Signatur erzeugte. 1B zeigt die Signaturen von COINs, die mit Gemischen aus drei Raman-Labeln bei Konzentrationen hergestellt wurden, die wie angezeigt Signaturen erzeugten: HLL bedeutet hohe Peakintensität für 8-Aza-adenin (AA) (H) und niedrige Peakintensität sowohl für 9-Aminoacridin (AN) (L) als auch Methylenblau (MB) (L); LHL bedeutet niedrige Peakintensität für AA (L), hohe Peakintensität für AN (H) und niedrige für MB (L); LLH bedeutet niedrige sowohl für AA (L) als auch AN (L) und hohe für MB (H). Die COINs in diesen Beispielen wurden mit einzelnen Raman-Labeln oder Gemischen davon bei Konzentrationen von 2,5 μM bis 20 μM in Abhängigkeit von der gewünschten Signatur hergestellt. Die Peakhöhen können durch Variieren der Labelkonzentrationen angepasst werden, aber sie könnten auf Grund der unterschiedlichen Absorptionsaffinitäten der Raman-Label für die Metalloberflächen nicht proportional zu den verwendeten Konzentrationen der Label sein. 2A zeigt Signaturen von COINs, die mit 2 Raman-Labeln (AA und MB) bei Konzentrationen hergestellt wurden, die zum Erreichen der folgenden relativen Peakhöhen entworfen wurden: AA = MB (HH), AA > MA (HL) und AA < MB (LH). 2B zeigt die Raman-Signaturen von COINs, die aus Gemischen der 3 Raman-Label bei Konzentrationen hergestellt wurden, die die folgenden Signaturen ergaben: HHL bedeutet hohe Peakintensitäten für AA (H) und AN (H) und niedrige Peakintensität für MB (L); HLH bedeutet hohe Peakintensität für AA (H), niedrige Peakintensität für AN (L) und hohe Peakintensität für MB (H); und LLH bedeutet niedrige Peakintensitäten für AA (L) und AN (L) und hohe Peakintensität für MB (H). Die COINs in diesen Beispielen wurden mit der Ofeninkubationsvorgehensweise mit Gemischen aus 2 oder 3 Raman-Labeln bei Konzentrationen von 2,5 bis 20 μM in Abhängigkeit von den gewünschten Signaturen hergestellt. Somit ist es möglich, eine große Zahl verschiedener molekularer Identifikatoren unter Verwendung der COINs der vorliegenden Erfindung zu erzeugen.
Unter Verwendung der COIN-Synthesechemie auf der Basis von OCAMF (organic compound assisted metal fusion: Metallschmelzen, unterstützt durch organische Verbindungen) ist es möglich, eine größere Zahl verschiedener COIN-Signaturen zu erzeugen, indem eine kleinere Zahl von Raman-Labeln gemischt wird. Somit sind COINs besonders geeignet zur Verwendung als Identifikatoren in gemultiplexten Tests. Um zu zeigen, daß mehrere Labels gemischt werden können, um COINs herzustellen, testeten wir die Kombinationen von 3 Raman-Labeln für die COIN-Synthese. Wie in den 1 und 2 gezeigt, waren die Ergebnisse für ein Label, zwei Label und drei Label alle wie erwartet. Diese spektralen Signaturen zeigten, daß dicht beieinander gelegene Peaks (15 cm^–1 zwischen AA und AN) visuell aufgelöst werden konnten. In praktischen Anwendungen können mathematische und statistische Verfahren zur Reorganisation der Signaturen verwendet werden. Theoretisch können über eine Million COIN-Signaturen innerhalb des Bereichs der Raman-Verschiebungen von 500 bis 2000 cm^–1 angelegt werden.
Tabelle 1 stellt Beispiele für die Typen an organischen Verbindungen bereit, die zum Aufbauen von COINS verwendet werden können. Im Allgemeinen bezieht sich Raman-aktive organische Verbindung auf ein organisches Molekül, das eine einzigartige SERS-Signatur als Antwort auf eine Anregung durch einen Laser erzeugt. In bestimmten Ausführungsformen sind Raman-aktive organische Verbindungen polycyclische aromatische oder heteroaromatische Verbindungen. Typischerweise weist die Raman-aktive Verbindung ein Molekulargewicht von weniger als etwa 500 Dalton auf. Außerdem können diese Verbindungen fluoreszente Verbindungen oder nicht fluoreszente Verbindungen einschließen. Beispielhafte Raman-aktive organische Verbindungen schließen Adenin, 4-Amino-pyrazolo(3,4-d)pyrimidin, 2-Fluoradenin, N6-Benzoyladenin, Kinetin, Dimethyl-allyl-amino-adenin, Zeatin, Bromadenin, 8-Aza-adenin, 8-Azaguanin, 6-Mercaptopurin, 4-Amino-6-mercaptopyrazolo(3,4-d)pyrimidin, 8-Mercaptoadenin, 9-Amino-acridin und dergleichen ein, sind aber nicht darauf begrenzt. Zusätzliche, nicht begrenzende Beispiele für Raman-aktive organische Verbindungen schließen TRIT (Tetramethylrhodaminisothiol), NBD (7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol), Texas-Red-Farbstoff, Phthalsäure, Terephthalsäure, Isophthalsäure, Cresyl-Echtviolett, Cresyl-Blauviolett, Cresyl-brilliantblau, para-Aminobenzoesäure, Erythrosin, Biotin, Digoxigenin, 5-Carboxy-4',5'-dichlor-2',7'-dimethoxyfluorescein, 5-Carboxy-2',4',5',7'-tetrachlorfluorescein, 5-Carboxyfluorescein, 5-Carboxyrhodamin, 6-Carboxyrhodamin, 6-Carboxytetramethylaminophthalocyanine, Azomethine, Cyanine, Xanthine, Succinylfluoresceine, Aminoacridin und dergleichen ein. Diese und andere Raman-aktive organische Verbindungen können von kommerziellen Quellen erhalten werden (wie beispielsweise Molecular Probes, Eugene, Oregon). In bestimmten Ausführungsformen ist die Raman-aktive Verbindung Adenin, 4-Aminopyrazolo(3,4-d)pyrimidin oder 2-Fluoradenin. TABELLE 1
Wenn fluoreszente Verbindungen in die hier beschriebenen Nanoteilchen eingebracht werden, umfassen die Verbindungen Farbstoffe, intrinsisch fluoreszente Proteine, Lanthanidphosphore und dergleichen, sind aber nicht darauf begrenzt. Farbstoffe umfassen beispielsweise Rhodamin und Derivate, wie Texas Red, ROX (6-Carboxy-X-rhodamin), Rhodamin-NHS, und TAMRA (5/6-Carboxytetramethylrhodamin-NHS); Fluorescein und Derivate, wie 5-Brommethylfluorescein und FAM (5'-Carboxyfluorescein-NHS), Lucifer Yellow, IAEDANS, 7-Me₂, N-Cumarin-4-acetat, 7-OH-4-CH₃-Cumarin-3-acetat, 7-NH₂-4-CH₃- Cumarin-3-acetat (AMCA), Monobrombiman, Pyrentrisulfonate, wie Cascade Blue, und Monobromtrimethyl-ammoniobiman.
Nun Bezug nehmend auf 3 stellt 3 ein Verfahren graphisch dar, das COINs als Reporter zum Nachweis von Analyten verwendet. In diesem Beispiel wird eine Lösung, die einen bekannten Analyten enthält, mit einer Substratoberfläche unter Bedingungen in Kontakt gebracht, die ermöglichen, daß der bekannte Analyt auf der Substratoberfläche immobilisiert wird durch Binden an einen Abfangantikörper, der für den Analyten spezifisch ist (ein Antikörper, der ein erstes Epitop des Analyten erkennt) und an der Substratoberfläche befestigt ist. Ein COIN, der eine daran befestigte Sonde, die spezifisch für den Analyten ist, aufweist, in diesem Fall ein Antikörper, der ein zweites Epitop des Analyten erkennt, wird dann mit der Substratoberfläche unter Bedingungen in Kontakt gebracht, die ermöglichen, daß das COIN-Antikörper-Konjugat an den Analyten bindet. Ungebundene COINs werden dann von der Substratoberfläche gewaschen. Der Nachweis der Raman-Signatur eines COIN auf der Substratoberfläche zeigt das Vorhandensein des Analyten in der Analyseprobe an. Diese Analyse kann auch auf eine gemultiplexte Weise durchgeführt werden. Ein Satz von COINs kann erzeugt werden, der einzigartige Signaturen und Sonden aufweist, die für zwei oder mehr bekannte Analyten in einer Probe spezifisch sind. In diesem Fall zeigt der Nachweis jedes einzigartigen COIN-Signals das Vorhandensein eines spezifischen bekannten Analyten in der Analyseprobe an.
Die Nanoteilchen werden leicht unter Verwendung von Standard-Metallkolloidchemie hergestellt. Erfindungsgemäße Teilchen sind weniger als 1 μm groß und werden durch Teilchenwachstum in Gegenwart von organischen Verbindungen erzeugt. Die Herstellung derartiger Nanoteilchen nutzt auch die Fähigkeit von Metallen aus, organische Verbindungen zu adsorbieren. Tatsächlich können, da Raman-aktive organische Verbindungen während der Erzeugung der metallischen Kolloide auf dem Metallcluster adsorbiert werden, viele Raman-aktive organische Verbindungen in ein Nanoteilchen eingebracht werden.
Im Allgemeinen können COINs hergestellt werden, indem kolloidale metallische Nanoteilchen in Gegenwart eines organischen Raman-Labels zum Aggregieren gebracht werden. Die kolloidalen Metallnanoteilchen können in der Größe variieren, werden aber gewählt, daß sie kleiner als die Größe der gewünschten resultierenden COINs ist. Bei einigen Anwendungen, bei spielsweise bei den Ofen- und Rückflußsyntheseverfahren, wurden Silberteilchen mit einem mittleren Durchmesser im Bereich von etwa 3 bis etwa 12 nm verwendet, um Silber-COINs zu erzeugen, und Goldnanoteilchen im Bereich von etwa 13 bis etwa 15 nm wurden verwendet, um Gold-COINs herzustellen. Bei einer anderen Anwendung wurden beispielsweise Silberteilchen mit einer breiten Größenverteilung von etwa 10 bis etwa 80 nm in einem kalten Syntheseverfahren verwendet. Außerdem können Multimetall-Nanoteilchen verwendet werden, wie beispielsweise Silbernanoteilchen mit Goldkernen. Zur Herstellung der kolloidalen Metallnanoteilchen wird eine wässrige Lösung hergestellt, die geeignete Metallkationen und ein Reduktionsmittel enthält. Die Komponenten der Lösung werden dann Bedingungen ausgesetzt, welche die metallischen Kationen reduzieren, um neutrale, kolloidale Metallteilchen zu bilden. Da die Erzeugung der metallischen Cluster in Gegenwart einer geeigneten Raman-aktiven organischen Verbindung geschieht, wird die Raman-aktive organische Verbindung leicht während der Kolloiderzeugung in den Metallnanocluster eingebracht. Es wird angenommen, daß die organischen Verbindungen, die an den Verbindungen zwischen den primären Metallteilchen eingefangen sind, für das stärkste Raman-Signal sorgen. COINs sind nicht üblicherweise kugelförmig und schließen oft Rillen und Vorsprünge ein und können typischerweise durch Membranfiltration isoliert werden. Außerdem können COINs verschiedener Größen durch Zentrifugation angereichert werden. Typische Metalle, die zur Verwendung bei der Erzeugung von Nanoteilchen in Betracht gezogen werden, umfassen beispielsweise Silber, Gold, Kupfer, Platin, Palladium, Aluminium, Gallium, Indium, Rhodium und dergleichen. In einer Ausführungsform ist das Metall Silber oder Gold.
Wie in den 4 und 5 zu sehen ist, können COINs im Allgemeinen mit einer Anzahl verschiedener Schichten und Kombinationen von Schichten stabilisiert und/oder funktionalisiert werden. Bezug nehmend auf die verallgemeinerte schematische Darstellung in 4 wird der Nanocluster als ein vereinfachter, geschwärzter Kreis gezeigt, der von einer Schutzschicht und einer funktionellen Schicht umgeben ist. Zwischen dem Nanoteilchen und der Schutzschicht ist gegebenenfalls eine Zwischenphase (Zwischenphase I), die aus einer kovalenten oder nicht kovalenten Verknüpfung zwischen dem Nanocluster und der Schutzschicht besteht. Gegebenenfalls liegt eine zweite Zwischenphase (Zwischenphase II) zwischen der Schutzschicht und der funktionellen Schicht vor, die aus einer Verknüpfung zwischen der Schutzschicht und der funktionellen Schicht besteht (wenn die zwei Schichten verschieden sind). Eine funktionelle Schicht kann eine Schicht zur chemischen Derivatisierung sein, die Stellen zur Befestigung von Linkern oder Sonden enthält (Sonden, wie beispielsweise Biomoleküle); die Zwischenphase-II-Schicht ist eine optionale Verknüpfung zwischen der Derivatisierungsschicht und der Schutzschicht (wenn sie verschieden sind); die Schutzschicht ist eine Schicht, die für chemische und/oder physikalische Stabilität sorgt; und die Zwischenphase-I-Schicht ist eine kovalente oder nicht kovalente Verknüpfung zwischen dem COIN und der Schutzschicht. Wie aus 5 zu sehen ist, werden unterschiedliche Schutzschemata, das heißt unterschiedliche Kombinationen von Schutzschichten und/oder funktionellen Schichten, verwendet; um COINs eine verbesserte chemische und kolloidale Stabilität und/oder eine Oberfläche, die eine verbesserte Funktionalität für analytische Anwendungen bereitstellt, zu verleihen.
Im Allgemeinen sollte für Anwendungen, die COINs als Reporter zum Nachweis von Analyten verwenden, der mittlere Durchmesser des resultierenden beschichteten COIN-Teilchens weniger als etwa 200 nm betragen. Typischerweise liegt bei Anwendungen zum Nachweis von Analyten der mittlere Durchmesser von COINs im Bereich von etwa 30 bis etwa 200 nm. Stärker bevorzugt liegt der mittlere Durchmesser von COINs im Bereich von etwa 40 bis etwa 200 nm und stärker bevorzugt etwa 50 bis etwa 200 nm, stärker bevorzugt etwa 50 bis etwa 150 nm und stärker bevorzugt etwa 50 bis etwa 100 nm. Die Dicke der Beschichtung ist in einem Gesichtspunkt durch das Gewicht des resultierenden Teilchens und seine Fähigkeit, in Lösung suspendiert zu bleiben, begrenzt. Beispielsweise können Beschichtungen, die leichter sind, wie Proteinbeschichtungen, dicker sein als schwerere Siliciumdioxid- und Metallbeschichtungen. Typischerweise ergeben Beschichtungen, die weniger als etwa 100 nm dick sind, COINs, die in Lösung suspendiert werden können. In Abhängigkeit von der gewünschten Anwendung können Beschichtungen gerade einmal eine Schicht von Molekülen dünn sein.
Typische Beschichtungen, die in Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung verwendbar sind, schließen Beschichtungen ein, wie Metallschichten, Adsorptionsschichten, Siliciumdioxidschichten, Hämatitschichten, organische Schichten und organisches Thiol enthaltende Schichten. Typischerweise ist die Metallschicht von dem zur Erzeugung des COIN verwendeten Metall verschieden. Außerdem kann typischerweise eine Metallschicht unter jeder der anderen Arten von Schichten angeordnet sein. Viele der Schichten, wie die Adsorptionsschichten und die organischen Schichten, stellen zusätzliche Mechanismen zur Befestigung von Sonden bereit. Beispielsweise ermöglichen Schichten, die funktionelle Carbonsäuregruppen darbieten, die kovalente Kupplung einer biologischen Sonde, wie ein Antikörper, durch eine Amingruppe an dem Antikörper.
In einer Ausführungsform der Erfindung schließen die Nanocluster ein zweites Metall ein, das vom ersten Metall verschieden ist, wobei das zweite Metall eine Schicht bildet, die über der Oberfläche des Nanoclusters liegt. In bestimmten Ausführungsformen wird die metallische Schicht, die über der Oberfläche des Nanoclusters liegt, als eine Schutzschicht bezeichnet. Diese Schutzschicht trägt zur wässrigen Stabilität der kolloidalen Nanocluster bei. Metalle, die verwendet werden können, umfassen beispielsweise Silber, Gold, Platin, Aluminium, Kupfer, Zink, Eisen und dergleichen. In einem Beispiel umfaßt der COIN Silber, und das Beschichtungsmetall ist Gold. Typischerweise liegt der mittlere Durchmesser der mit Metall beschichteten COINs im Bereich von etwa 20 bis etwa 200 nm, etwa 30 bis etwa 200 nm, etwa 40 bis etwa 200 nm, etwa 50 bis etwa 200 nm oder stärker bevorzugt etwa 50 bis etwa 150 nm. Typischerweise hängt die Dicke der Schicht von Variablen ab, wie der Größe des Nanoteilchens, auf das die Beschichtung aufgetragen wird, der Dicke der anderen Schichten, die hinzugefügt werden sollen, Änderungen an der Plasmaresonanzwellenlänge, die durch die Dicke der Beschichtung induziert werden, der Fähigkeit der Teilchen, in der Lösung suspendiert zu bleiben.
Um Nanoteilchen herzustellen, die mit einem zweiten Metall beschichtet sind, werden COINs in eine wässrige Lösung gegeben, die ein geeignetes zweites Metall (als ein Kation) und ein Reduktionsmittel enthält. Die Komponenten der Lösung werden dann Bedingungen ausgesetzt, welche die zweiten metallischen Kationen reduzieren, wodurch eine metallische Schicht erzeugt wird, die über der Oberfläche des Nanoteilchen liegt. Mit Metall beschichtete COINs können in der gleichen Weise wie unbeschichtete COINs isoliert und/oder angereichert werden.
Außerdem können COINs mit einer Schicht aus Gold mittels Wachstum durch Epitaxie beschichtet werden. Eine Vorgehensweise zum Wachsenlassen von Goldteilchen, die von Zsigmondy und Thiessen (Das Kolloide Gold (Leipzig, 1925)) entwickelt wurde, kann beispielsweise eingesetzt werden. Das Wachstumsmedium enthält Chlorogoldsäure und Hydroxylamin. Die Dicke der Goldbeschichtung kann durch die Konzentration der COIN-Teilchen gesteuert werden, die zu dem Wachstumsmedium gegeben werden.
Es sollte angemerkt werden, daß die Einführung einer Goldschicht in der Regel die Plasmaresonanzwellenlänge verändert. Somit kann die Dicke der Goldschicht gewählt werden, um die Plasmaresonanzwellenlänge einzustellen, daß sie besser der Wellenlänge der Anregungsquelle entspricht. Bei bestimmten Anwendungen wird die maximale Dicke der Goldschicht (oder jeder anderen Metallschicht) derart von der resultierenden Größe des COIN-Teilchens diktiert, daß, wenn das Teilchen zu schwer wird, es nicht länger in Lösung suspendiert bleibt.
COINs und mit Metall beschichtete COINs können ferner durch Befestigen von organischen Molekülen an der Oberfläche funktionalisiert werden. Beispielsweise können Gold- und Silberoberflächen mit einem Thiol enthaltenden organischen Molekül funktionalisiert werden, wodurch eine organische Thiolschicht erzeugt wird. Wie in 6A gezeigt, wird ein organisches Molekül durch eine bekannte Gold-Thiol-Chemie befestigt. In dem Beispiel in 6A enthält das organische Molekül auch eine Carboxylgruppe an dem Ende, das distal zum Thiol liegt, zur weiteren Funktionalisierung oder Derivatisierung, wie z.B. einer Befestigung eines Linkermoleküls, einer Beschichtung oder Sonde. In 7A wird Sulfanylessigsäure an ein COIN mit einer Goldschicht adsorbiert. Die distale Carbonsäuregruppe, die in 7A gezeigt wird, kann weiter funktionalisiert werden, wie z.B. mit einem zusätzlichen organischen Molekül, einem Peptid, einem Protein, einer Nukleinsäure oder einer Sonde. In bestimmten Ausführungsformen ist das organische, Thiol enthaltende Molekül ein Molekül, das eine verzweigte oder gerade Kohlenstoffkette enthält, die 2 bis etwa 20 Kohlenstoffatome aufweist. In zusätzlichen Ausführungsformen ist das organische, Thiol enthaltende Molekül ein Polymer, wie beispielsweise ein Polyethylenglykol, ein Polysaccharid, ein Peptid, das Cystein enthält, oder ein Gemisch davon. In weiteren Ausführungsformen ist das organische, Thiol enthaltende Molekül in der Lage, ein einziges COIN über zwei oder mehr Thiolgruppen zu binden. In mehreren nicht begrenzenden Beispielen kann das Thiol 2,3-Disulfanyl-1-propanol, 3,4-Disulfanyl-1-butanol, 4,5-Disulfanyl-1-pentanol, 4-Amino-2-thiomethyl-butanthiol oder 5-Amino-2-thiomethyl-hexanthiol sein. Im Allgemeinen weisen verwendbare, Thiol enthaltende, organische Moleküle ein Molekulargewicht von weniger als etwa 9.000 auf. Jedoch kann im Fall von löslichen Polymeren mit Thiolgruppen, wie Polycystein, Peptide, die Cystein enthalten, Peptide, die Homocystein enthalten, Polysaccharide, die Thiolgruppen enthalten, oder Polyethylenglykolpolymere, die Thiolgruppe(n) enthalten, das Molekulargewicht etwa 10.000 oder weniger betragen. Das organische, Thiol enthaltende Molekül kann auch ein oder mehr zusätzliche funktionelle Gruppen enthalten, wie Gruppen, die das Kuppeln mit einer Sonde ermöglichen. Nützliche, zusätzliche, funktionelle Gruppen schließen beispielsweise Carboxylgruppen, Ester, Amine, photolabile Gruppen und Alkohole ein. Außerdem schließen geeignete funktionelle Gruppen Hydrazid, Amid, Chlormethyl, Epoxy, Tosyl und dergleichen ein, die an Moleküle, wie Sonden, durch Reaktionen, die üblicherweise im Fachgebiet verwendet werden, gekuppelt werden können, sind aber nicht darauf begrenzt. Photolabile Gruppen, womit eine funktionelle Gruppe gemeint ist, die durch Anwenden von elektromagnetischer Strahlung (üblicherweise nahes IR, Ultraviolett oder sichtbares Licht) bei einer spezifischen Wellenlänge aktiviert werden kann, schließen beispielsweise die Typen von Gruppen ein, die in M. Aslam und A. Dent, Bioconjugation: Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences, Grove's Dictionaries, Inc., 301-316 (1998), offenbart werden. Diese funktionellen Gruppen können auch nach der Befestigung an einem COIN weiter modifiziert werden, um reaktivere Spezies für das Kuppeln zu erzeugen, wie beispielsweise Oxidieren eines Alkohols zu einem Aldehyd. Verwendbare, Thiol enthaltende Moleküle schließen beispielsweise Sulfanylessigsäure, 3-Sulfanylpropansäure, 6-Sulfanylhexansäure, 5-Sulfanylhexansäure, 4-Sulfanylhexansäure, 3-Sulfanylpropylacetat, 3-Sulfanyl-1,2-propandiol (1-Thioglycerin), 4-Sulfanyl-2-butanol, 3-Sulfanyl-1-propanol (3-Mercapto-1-propanol), Ethyl-3-sulfanylpropanoat, Cystein, Homocystein, 2-Aminoethanthiol, 4-Aminobutanthiol, 4-Amino-2-ethyl-butanthiol und andere ähnliche organische Moleküle mit einem Molekulargewicht von etwa 9.000 oder weniger ein. Außerdem kann die organische Thiolschicht aus Gemischen von verschiedenen, organischen, Thiol enthaltenden Molekülen bestehen. Die Gemische von organischen, Thiol enthaltenden Molekülen können Thiole mit einer zusätzlichen funktionellen Gruppe, wie eine zur Befestigung einer Sonde, und Thiole ohne eine zusätzliche funktionelle Gruppe ebenso wie Gemische von Thiolen, die verschiedene funktionelle Gruppen enthalten oder aus verschiedenen organischen Molekülen bestehen, einschließen. In einer weiteren Ausführungsform ist die Thiol enthaltende organische Schicht an einem COIN, das aus Gold oder Silber besteht, oder einem COIN mit einer Gold- oder einer Silbermetallschicht befestigt. Die Synthese von organischen Thiolschichten kann mittels Standardtechniken erfolgen, wie Eingeben der COINs, die beschichtet werden sollen, in eine wässrige Lösung, die das organische Thiol enthält.
In weiteren Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden die COINs mit einer Adsorptionsschicht beschichtet. Die Adsorptionsschicht kann beispielsweise aus einem organischen Molekül oder einem Polymer, wie beispielsweise ein Blockcopolymer oder ein Biopolymer, wie beispielsweise ein Protein, Peptid oder ein Polysaccharid, bestehen. Die Adsorptionsschicht stabilisiert in einigen Fällen die COINs und erleichtert die Verringerung oder Verhinderung von weiterer Aggregation und Ausfällen aus der Lösung. Diese Schicht kann auch biokompatible funktionelle Oberflächen zur Befestigung von Sonden und zur Unterstützung bei der Verhinderung von nicht spezifischer Bindung an den COIN bereitstellen.
COINs können mit einer Adsorptionsschicht beschichtet werden, die aus einem amphiphilen Blockcopolymer besteht. Insbesondere können Blockcopolymere, die einen hydrophoben Bereich und einen hydrophilen Bereich aufweisen, an der Oberfläche eines COINs über hydrophobe Wechselwirkungen adsorbiert werden. Der hydrophile Bereich des Blockcopolymers hilft bei der Verbreitung des COINs in wässrigen Medien und kann eine Stelle zum Kuppeln zusätzlicher Moleküle, Schichten oder Sonden bereitstellen. Die einzelnen Blöcke, die ein Polymermolekül bilden, können identisch sein (Homopolymer) oder können verschieden sein (Heteropolymer). Hydrophile Heteropolymere können beispielsweise einige Blöcke, die geladen sind (beispielsweise anionisch), und einige Blöcke, die ungeladen sind, umfassen. Zumindestens sollte das Copolymer zwei verschiedene Typen von Blöcken enthalten, wie beispielsweise A_xB_y oder A_xB_yA_z, wobei A und B für die verschiedenen Hetero- oder Homopolymereinheiten (im Fall von Homopolymeren sind diese Einheiten Monomere) eines Blockcopolymers stehen und X, Y und Z natürliche Zahlen sind (ein Diblockcopolymer). Jedoch sind auch Polymere, die zusätzliche verschiedene Blöcke aufweisen, verwendbar, wie beispielsweise A_xC_yB_z, wobei A, B und C für verschiedene Hetero- oder Homopolymereinheiten (im Fall von Homopolymeren sind diese Einheiten Monomere) stehen, aus denen ein Blockcopolymer besteht, und X, Y und Z natürliche Zahlen sind (ein Triblockcopolymer). Die Zahl der sich wiederholenden Einheiten, die jeden der Blöcke des Blockcopolymers bilden kann gleich oder verschieden sein. Außerdem kann das Blockcopolymer auch funktionelle Gruppen zur weiteren Modifikation oder Befestigung von Sonden enthalten. Typischerweise befinden sich diese funktionellen Gruppen am oder nahe beim distalen Ende des hydrophilen Abschnitts des Blockcopolymers wegen der Einfachheit der weiteren Modifikation oder Befestigung von Sonden. Geeignete funktionelle Gruppen schließen Carbonsäure, Ester, Amine, Hydroxyl, Hydrazid, Amid, Chlormethyl, Aldehyd, Epoxy, Tosyl, Thiol und dergleichen ein, welche an Moleküle, wie Sonden, durch Reaktionen, die üblicherweise im Fachgebiet verwendet werden, gekuppelt werden können, sind aber nicht darauf begrenzt. Ferner kann eine Beschichtung ein Gemisch von nicht funktionalisierten und funktionalisierten Copolymeren umfassen, in Abhängigkeit von der Anwendung und dem Wunsch, die Zahl der Sonden oder anderen Moleküle, die an einer COIN-Oberfläche befestigt sind, anzupassen. Die Bereiche für Gemische von nicht funktionalisierten und funktionalisierten Blockcopolymeren schließen beispielsweise etwa 10⁶:1 bis etwa 1:10⁶ der Konzentration von nicht funktionalisiertem zu funktionalisiertem Blockcopolymer ein. Im Allgemeinen sollte das Blockcopolymer ein Molekulargewicht von etwa 1.000 bis etwa 1.000.000, vorzugsweise etwa 1.000 bis etwa 500.000 und stärker bevorzugt etwa 1.000 bis etwa 100.000 aufweisen. Geeignete hydrophobe Blöcke schließen Polyester, Polystyrole, Polyethylacrylat, Polybutylacrylat, Poly(propylenoxid) und Poly(ethylenoxid) ein, sind aber nicht darauf begrenzt. Geeignete hydrophile Blöcke schließen Polyacrylamid/Polyacrylsäure-Copolymere, Poly(L-aminosäure)n, Poly(2-methacryloxyethyltrimethylammoniumbromid), Polystyrolsulfonsäure und Polystyrol-Polystyrolsulfonsäure-Copolymere ein, sind aber nicht darauf begrenzt. Beispielsweise kann das Blockcopolymer ein Poly(L-aminosäure)-block-polyester-block, Polyglykol-block-poly(L-aminosäure)-block oder ein Polystyrol-block-polystyrolsulfonsäure-block sein. Zusätzliche Beispiele schließen Polystyrol-block-poly(4-vinylpyridin)-block; Polystyrol-block-poly(2-vinylpyridin)-block; Polystyrol-block-poly(4-vinylphenol)-block; Poly(4-vinylpyridin-block-poly(butylmethacrylat)-block; Polystyrol-block-poly(maleinsäure)-block; und Poly(viny-1-chlorid-co-vinylacetat)-block-poly(maleinsäure)-block ein, sind aber nicht darauf begrenzt. Eine Blockcopolymerschicht kann auf einem COIN adsorbiert oder ein COIN mit einer Metallschicht beschichtet sein, wie beispielsweise ein Silber-COIN, das mit einer Goldschutzschicht beschichtet ist. Eine Blockcopolymeradsorptionsschicht kann hergestellt werden, indem das Blockcopolymer in einer wässrigen Lösung, die die COINs enthält, gelöst wird und zugelassen wird, daß das Blockcopolymer sich mit der Oberfläche der COINs vereinigt.
In einer weiteren Ausführungsform wird der COIN oder der COIN mit einer Metallschicht mit einer adsorbierten Protein-Schicht beschichtet. Geeignete Proteine schließen nicht enzymatische, lösliche globuläre oder Faserproteine ein. Bei Anwendungen, bei denen ein molekularer Nachweis beteiligt ist, sollte das Protein derart gewählt werden, daß es den Nachweistest nicht stört, mit anderen Worten, die Proteine sollten nicht auch als konkurrierende oder störende Sonden in einem vom Benutzer definierten Test fungieren. Mit nicht enzymatischen Proteinen sind Moleküle gemeint, die normalerweise nicht als biologische Katalysatoren fungieren. Beispiele für geeignete Proteine schließen Avidin, Streptavidin, Rinderserumalbumin (BSA), Transferrin, Insulin, Sojabohnenprotein, Casein, Gelatine und dergleichen und Gemische davon ein. Nun Bezug nehmend auf 7B trägt beispielsweise eine Schicht von BSA nicht nur zur Stabilität des COINs bei, sondern sie stellt auch zusätzliche Mechanismen zur Befestigung von Sonden bereit. Die Rinderserumalbuminschicht bietet mehrere potentielle funktionelle Gruppen, wie Carbonsäuren, Amine und Thiole, zur weiteren Funktionalisierung oder Befestigung von Sonden. Gegebenenfalls kann die Proteinschicht mit EDC oder mit Glutaraldehyd, gefolgt von Reduktion mit Natriumborhydrid, vernetzt werden.
In zusätzlichen Ausführungsformen wird ein COIN oder ein mit Metall beschichteter COIN mit einer löslichen polymeren Adsorptionsschicht beschichtet. Im Allgemeinen sollte das lösliche Polymer ein Molekulargewicht von etwa 1.000 bis etwa 1.000.000, vorzugsweise etwa 1.000 bis etwa 500.000 und stärker bevorzugt etwa 1.000 bis etwa 100.000 aufweisen. Beispielsweise schließen geeignete polymere Adsorptionsschichten Polyacrylamid, teilweise hydrolysiertes Polyacrylamid, Polyacrylsäure, Polyacrylamid-Acrylsäure-Copolymere, Polybutadien-Maleinsäure-Copolymere, Polyglykol-poly(L-aminosäure)-Copolymere, Polyethylenimin (verzweigt oder unverzweigt), PEG-PE (Polyethylenglykol-Phosphoethanolamin), Poly(L-lysinhydrobromid), PGUA (Polygalacturonsäure) oder Alginsäure ein. Wie in 7C gezeigt, wird eine Polyacrylsäureschicht auf ein COIN adsorbiert und stellt eine funktionelle Carbonsäuregruppe zur weiteren Derivatisierung oder Befestigung von Sonden durch beispielsweise EDC-Kupplung bereit. 7D zeigt eine PEG-PE-Schicht, die auf den COIN adsorbiert ist. Eine Polymeradsorptionsschicht kann hergestellt werden, indem das Polymer in einer wässrigen Lösung, die COINs enthält, gelöst wird und zugelassen wird, daß das Polymer sich mit der Oberfläche der COINs vereinigt.
Als eine Alternative zu metallischen Schutzschichten oder zusätzlich zu metallischen Schutzschichten können COINs mit einer Schicht aus Siliciumdioxid beschichtet werden. Die Abscheidung von Siliciumdioxid wird aus einer übersättigten Siliciumdioxidlösung initiiert, gefolgt von Wachstum einer Siliciumdioxidschicht durch mit Ammoniak katalysierte Hydrolyse von Tetraethylorthosilicat (TEOS). Nun Bezug nehmend auf 6B können COINs mit Siliciumdioxid beschichtet und beispielsweise mit einer Gruppe, die ein organisches Amin enthält, funktionalisiert werden. Wie in 8 gezeigt, kann ein Silber-COIN oder mit Silber oder Gold beschichteter COIN mit einer Schicht aus Siliciumdioxid mittels der Vorgehensweise beschichtet werden, die in V. V. Hardikar und E. Matijevic, J. Colloid Interface Science, 221:133-136 (2000), beschrieben ist. Außerdem werden die mit Siliciumdioxid beschichteten COINs einfach unter Verwendung von Siliciumdioxidstandardchemie funktionalisiert. Beispielsweise kann ein mit Siliciumdioxid beschichteter COIN mit (3-Aminopropyl)triethoxysilan derivatisiert werden, wodurch sich ein mit Siliciumdioxid beschichteter COIN ergibt, der eine Amingruppe zur weiteren Beschichtung, Schichtenbildung, Modifikation oder Befestigung von Sonden liefert. Siehe beispielsweise C. Wong, J. Burgess, A. Ostafin, „Modifying the Surface Chemistry of Silica Nano-Shells for Immunoassays", Journal of Young Investigators, 6:1 (2002), und Z. Ye, M. Tan, G. Wang, J. Yuan, „Preparation, Characterization, and Time-Resolved Fluorometric Application of Silica-Coated Terbium(III) Fluorescent Nanoparticles", Anal. Chem., 76:513 (2004). Zusätzliche Schichten oder Beschichtungen, die auf eine Siliciumdioxidbeschichtung geschichtet werden können, schließen die Beschichtungen und Schichten ein, die hier veranschaulicht werden.
In alternativen Ausführungsformen können COINs oder mit Metall beschichtete COINs mit Hämatit (Fe₂O₃) beschichtet werden. Die Hämatitbeschichtung kann eine Beschichtung aus Eisenoxidteilchen umfassen. Positiv geladene Hämatitteilchen beschichten Silber-COLNs beispielsweise durch Coulomb-Wechselwirkungen. Mit Hämatit beschichtete COINs können weiter mit zusätzlichen Beschichtungen funktionalisiert werden. Beispielsweise neigen Beschichtungen, die funktionelle Carbonsäuregruppen aufweisen, dazu, sich an den Hämatitteilchen zu befestigen. Beispielsweise kann ein mit Hämatit beschichteter COIN weiter mit einer Beschichtung aus Polyacrylsäure, PGUA (Polygalacturonsäure) oder Alginsäure modifiziert werden.
In anderen Ausführungsformen können COINs eine organische Schicht umfassen. Diese organische Schicht kann über einer anderen Schicht liegen, wie z.B. einer Metallschicht, einer Siliciumdioxidschicht oder einer Hämatitschicht. Typischerweise werden diese Typen von Nanoclustern hergestellt, indem organische Verbindungen kovalent an der Oberfläche der Metallschicht befestigt werden. Die kovalente Befestigung einer organischen Schicht an der metallischen Schicht kann auf vielen Wegen erreicht werden, die dem Fachmann bekannt sind, wie beispielsweise durch Thiol-Metall-Bindungen. Eine organische Schicht kann auch verwendet werden, um kolloidale Stabilität und funktionelle Gruppen zur weiteren Modifikation bereitzustellen. Die organische Schicht ist gegebenenfalls vernetzt, um eine stärker vereinheitlichte Beschichtung zu bilden. Wie in 9 gezeigt, wird eine beispielhafte organische Schicht durch eine Adsorption einer mit Octylamin modifizierten Polyacrylsäure auf COINs hergestellt, wobei die Adsorption durch die positiv geladenen Amingruppen erleichtert wird. Die Carboxylgruppen des Polymers werden dann mit einem geeigneten Mittel, wie Lysin, (1,6)-Diaminoheptan oder dergleichen, vernetzt. Nicht umgesetzte Carboxylgruppen können zur weiteren Derivatisierung oder Befestigung von Sonden, wie z.B. durch EDC-Kupplung, verwendet werden.
Ferner können die Metall- und organischen Beschichtungen in verschiedenen Kombinationen überlagert werden, wodurch den COINs die gewünschten Eigenschaften verliehen werden. Beispielsweise können Silber-COINs zuerst mit einer Goldschicht beschichtet werden, um das reaktivere Silber vor einem Auftragen einer Adsorptionsschicht oder Siliciumdioxid- oder organischen Beschichtung zu schützen. Selbst wenn die äußere Schicht porös ist, schirmt die innere Goldschicht die COINs vor einem chemischen Angriff durch verschiedene Verbindungen ab, die beispielsweise in einer Probe, die getestet wird, vorhanden sein können. Ein weiteres Beispiel ist es, eine Adsorptionsschicht auf eine Siliciumdioxid- oder Goldschicht aufzutragen, um für zusätzliche kolloidale Stabilität zu sorgen.
Die COINs der vorliegenden Erfindung können als empfindliche Reporter zur Verwendung in einem auf Fluid basierenden Nachweis von molekularen Analyten und auch beim hochgradig parallelen Nachweis von Analyten funktionieren. Ein Satz von COINs kann erzeugt werden, bei dem jedes Element des Satzes eine Raman-Signatur aufweist, die für den Satz einzigartig ist. Alle Typen von COINs, die vorstehend erläutert wurden, können zum Nachweis von Analyten verwendet werden. Im Allgemeinen bestehen COINs aus Clustern von Metallteilchen, die Raman-aktive Verbindungen umfassen. Beispielsweise kann der mittlere Durchmesser der COINs im Bereich von etwa 20 nm bis etwa 200 nm liegen. COINs können auch zu größeren Clustern aggregiert sein, deren mittlerer Durchmesser im Bereich von etwa 30 bis etwa 200 nm, etwa 40 bis etwa 200 nm oder 50 bis etwa 150 nm liegt.
COINs können durch eine Sonde, die an dem COIN befestigt ist, an den molekularen Analyten komplexiert werden. Eine organische Schicht an dem COIN ist zur kovalenten Befestigung von Sonden besonders nützlich. Im Allgemeinen ist eine Sonde ein Molekül, das in der Lage ist, einen Analyten spezifisch zu binden, und in bestimmten Ausführungsformen sind beispielhafte Sonden Antikörper, Antigene, Polynukleotide, Oligonukleotide, Kohlenhydrate, Proteine, Cofaktoren, Rezeptoren, Liganden, Peptide, Inhibitoren, Aktivatoren, Hormone, Cytokine und dergleichen. Beispielsweise kann der Analyt ein Protein sein, und der COIN wird an den Analyten durch einen Antikörper, der spezifisch den betreffenden Proteinanalyten erkennt, komplexiert.
In einigen Ausführungsformen ist eine Sonde ein Antikörper. Wie hier verwendet, wird der Begriff Antikörper in seinem weitesten Sinn verwendet, wobei er polyklonale und monoklonale Antikörper ebenso wie Antigen bindende Fragmente derartiger Antikörper einschließt. Ein Antikörper, der in der vorliegenden Erfindung verwendbar ist, oder ein Antigen bindendes Fragment davon ist dadurch gekennzeichnet, daß es beispielsweise eine spezifische bindende Aktivität für ein Epitop eines Analyten aufweist. Ein Antikörper schließt beispielsweise natürlich vorkommende Antikörper ebenso wie nicht natürlich vorkommende Antikörper ein, welche beispielsweise Einkettenantikörper, chimärische, bifunktionelle und humanisierte Antikörper ebenso wie Antigen bindende Fragmente davon einschließen. Solche nicht natürlich vorkommenden Antikörper können unter Verwendung der Festphasen-Peptidsynthese aufgebaut werden, können rekombinant hergestellt werden oder können beispielsweise durch Screening von kombinatorischen Bibliotheken, die variable schwere Ketten und variable leichte Ketten umfassen, erhalten werden. Diese und andere Verfahren zum Herstellen von beispielsweise chimärischen, humanisierten, CDR-grafted, Einketten- und bifunktionellen Antikörpern sind Fachleuten bekannt.
Der Begriff umfaßt spezifisch oder eine spezifische Bindungsaktivität, wenn er in Bezug auf einen Antikörper verwendet wird, bedeutet, daß eine Wechselwirkung des Antikörpers und eines speziellen Epitops eine Dissoziationskonstante von mindestens etwa 1 × 10^–6, im Allgemeinen mindestens etwa 1 × 10^–7, üblicherweise mindestens etwa 1 × 10^–8 und insbesondere von mindestens etwa 1 × 10^–9 oder 1 × 10^–10 oder weniger aufweist. Als solche werden Fab-, F(ab')2-, Fd- und Fv-Fragmente eines Antikörpers, die die spezifische Bindungsaktivität für ein Epitop eines Antigens beibehalten, innerhalb der Definition eines Antikörpers eingeschlossen.
Der Begriff Ligand impliziert einen natürlich vorkommenden, spezifischen Bindungspartner eines Rezeptors, einen synthetischen spezifischen Bindungspartner eines Rezeptors oder ein passendes Derivat der natürlichen oder synthetischen Liganden. Wie für den Fachmann klar ist, kann ein Molekül (oder makromolekularer Komplex) sowohl ein Rezeptor als auch ein Ligand sein. Im Allgemeinen wird der Bindungspartner mit einem kleineren Molekulargewicht als der Ligand bezeichnet, und der Bindungspartner mit einem größeren Molekulargewicht wird als ein Rezeptor bezeichnet.
Mit Analyt ist ein beliebiges Molekül oder Verbindung gemeint. Ein Analyt kann in der festen, flüssigen, gasförmigen oder Dampfphase sein. Mit gasförmigem oder Dampfphasenanalyt ist ein Molekül oder Verbindung gemeint, das beispielsweise im Headspace einer Flüssigkeit, in der Umgebungsluft, in einer Atemprobe, in einem Gas oder als eine Verunreinigung in beliebigen der vorstehenden vorhanden ist. Es ist klar, daß der physikalische Zustand der Gas- oder Dampfphase beispielsweise durch Druck, Temperatur ebenso wie durch Beeinflussen der Oberflächenspannung einer Flüssigkeit durch das Vorhandensein von oder die Zugabe von Salzen verändert werden kann.
Der Analyt kann aus einem Element eines spezifischen Bindungspaars (sbp) bestehen und kann ein Ligand sein, der einwertig (monoepitop) oder mehrwertig (polyepitop), üblicherweise Antigen oder Hapten ist, und ist eine einzige Verbindung oder mehrere Verbindungen, welche sich mindestens eine gemeinsame epitope oder determinante Stelle teilen. Der Analyt kann sich von einer Zelle, wie Bakterien, oder einer Zelle, die ein Blutgruppenantigen trägt, wie A, B, D usw., oder einem HLA-Antigen oder einem Mikroorganismus, beispielsweise Bakterium, Pilz, Protozoon, Prion oder Virus, ableiten. In bestimmten Gesichtspunkten der Erfindung ist der Analyt geladen. Ein biologischer Analyt kann beispielsweise ein Protein, ein Kohlenhydrat oder eine Nukleinsäure sein.
Ein Element eines spezifischen Bindungspaars (sbp-Mitglied) ist eines von zwei verschiedenen Molekülen, das eine Fläche an der Oberfläche oder in einem Hohlraum aufweist, welche spezifisch daran das andere Molekül bindet und dadurch als komplementär zu einer speziellen räumlichen und polaren Organisation des anderen Moleküls definiert ist. Die Elemente des spezifischen Bindungspaars werden als Ligand und Rezeptor (Antiligand) oder Analyt und Sonde bezeichnet. Deshalb ist eine Sonde ein Molekül, das spezifisch einen Analyten bindet. Diese sind üblicherweise Elemente eines immunologischen Paars, wie Antigen-Antikörper, auch wenn andere spezifische Bindungspaare, wie Biotin-Avidin, Hormone-Hormonrezeptoren, IgG-Protein A, Polynukleotidpaare, wie DNA-DNA, DNA-RNA und dergleichen keine immunologischen Paare sind, aber von der Erfindung und der Definition von sbp-Vertreter umfaßt sind.
Eine spezifische Bindung ist die spezifische Erkennung eines von zwei verschiedenen Molekülen durch das andere verglichen mit einer wesentlich geringeren Erkennung durch andere Moleküle. Im Allgemeinen weisen die Moleküle Flächen an ihren Oberflächen oder in Hohlräumen auf, die die spezifische Erkennung zwischen den zwei Molekülen bewirken. Beispielhaft für eine spezifische Bindung sind Antikörper-Antigen-Wechselwirkungen, Enzym-Substrat-Wechselwirkungen, Polynukleotidhybridisierungswechselwirkungen und so fort. Eine nicht spezifische Bindung ist eine nicht kovalente Bindung zwischen Molekülen, die von spezifischen Oberflächenstrukturen verhältnismäßig unabhängig ist. Eine nicht spezifische Bindung kann von mehreren Faktoren herrühren, schließlich hydrophober Wechselwirkungen zwischen Molekülen.
In einigen Ausführungsformen kann die organische Schicht eine Polynukleotidsonde umfassen. Eine COIN-markierte Oligonukleotidsonde kann bei einer Hybridisierungsreaktion verwendet werden, um ein Zielpolynukleotid nachzuweisen. Polynukleotid wird hier in weitem Sinne in der Bedeutung einer Sequenz von Desoxyribonukleotiden oder Ribonukleotiden, die über eine Phosphodiesterbindung miteinander verknüpft sind, verwendet. Im Allgemeinen ist ein Oligonukleotid, das als eine Sonde oder Primer verwendbar ist, die selektiv an einer gewählten Nukleotidsequenz hybridisiert, mindestens etwa 10 Nukleotide lang, üblicherweise mindestens etwa 15 Nukleotide lang, beispielsweise zwischen etwa 15 und etwa 50 Nukleotiden lang. Polynukleotidsonden sind besonders nützlich zum Nachweisen komplementärer Polynukleotide in einer biologischen Probe und können auch zum DNA-Sequenzieren durch Paaren einer bekannten Polynukleotidsonde und eines bekannten Raman-aktiven Signals verwendet werden, welches aus einer Kombination von Raman-aktiven organischen Verbindungen, wie hier beschrieben, gebildet ist.
Ein Polynukleotid kann RNA oder DNA sein und kann ein Gen oder ein Teil davon, eine cDNA, eine synthetische Polydesoxyribonukleinsäuresequenz oder dergleichen sein und kann einsträngig oder doppelsträngig sowie ein DNA/RNA-Hybrid sein. In verschiedenen Ausführungsformen kann ein Polynukleotid, das ein Oligonukleotid (beispielsweise eine Sonde oder einen Primer) umfaßt, Nukleosid- oder Nukleotidanaloga oder eine andere Grundgerüstbindung als eine Phosphodiesterbindung umfassen. Im Allgemeinen sind die Nukleotide, die ein Polynukleotid umfassen, natürlich vorkommende Desoxyribonukleotide, wie Adenin, Cytosin, Guanin oder Thymin, die mit 2'-Desoxyribose verknüpft sind, oder Ribonukleotiden, wie Adenin, Cytosin, Guanin oder Uracil, verknüpft mit Ribose. Jedoch kann ein Polynukleotid oder Oligonukleotid auch Nukleotidanaloga enthalten, einschließlich nicht natürlich vorkommender synthetischer Nukleotide oder modifizierter natürlich vorkommender Nukleotide. Ein Beispiel für eine oligomere Verbindung oder ein Oligonukleotidmimetikum, von dem gezeigt wurde, daß es gute Hybridisierungseigenschaften aufweist, wird als eine Peptidnukleinsäure (PNA) bezeichnet. Bei PNA-Verbindungen wird das Zuckergrundgerüst eines Oligonukleotids durch ein Amid enthaltendes Grundgerüst ersetzt, beispielsweise ein Aminoethylglycingrundgerüst. Bei diesem Beispiel werden die Nukleobasen erhalten und direkt oder indirekt an ein Aza-Stickstoffatom des Amidteils des Grundgerüsts gebunden. PNA-Verbindungen werden beispielsweise in Nielsen et al., Science, 254:1497-15 (1991) offenbart.
Die kovalente Bindung, die die Nukleotide eines Polynukleotids verknüpft, ist im Allgemeinen eine Phosphodiesterbindung. Jedoch kann die kovalente Bindung auch eine beliebige aus einer Anzahl anderer Typen von Bindungen sein, einschließlich einer Thiodiesterbindung, einer Phosphorothioatbindung, einer peptidartigen Amidbindung oder jeder anderen Bindung, die Fachleuten als verwendbar zum Verknüpfen von Nukleotiden bekannt sind, um synthetische Polynukleotide herzustellen. Das Integrieren von nicht natürlich vorkommenden Nukleotidanaloga oder -bindungen, die die Nukleotide oder Analoga verknüpfen, kann besonders nützlich sein, wo das Polynukleotid einer Umgebung ausgesetzt werden soll, die eine nukleolytische Aktivität enthalten kann, einschließlich beispielsweise eines Gewebekulturmediums oder bei Verabreichung an einen lebenden Patienten, da die modifizierten Polynukleotide weniger anfällig für eine Degradation sein können.
Die Nanoteilchen der vorliegenden Erfindung können verwendet werden, um das Vorhandensein eines speziellen Zielanalyten nachzuweisen, beispielsweise eines Proteins, Enzyms, Polynukleotids, Kohlenhydrats, Antikörpers oder Antigens. Die Nanoteilchen können auch verwendet werden, um biologische Wirkstoffe zu screenen, wie Kandidaten für Arzneistoffe, zum Binden an ein spezielles Ziel oder um Mittel, wie Schadstoffe, nachzuweisen. Wie vorstehend erläutert kann jeder Analyt, für den ein Sondenanteil wie ein Peptid, Protein oder Aptamer, entworfen werden kann, in Kombination mit den offenbarten Nanoteilchen verwendet werden.
Die mehrwertigen Ligandanalyten sind normalerweise Poly(aminosäuren), wie z.B. Polypeptide und Proteine, Polysaccharide, Nukleinsäuren und Kombinationen davon. Solche Kombinationen schließen Komponenten von Bakterien, Viren, Chromosomen, Genen, Mitochondrien, Zellkernen, Zellmembranen und dergleichen ein.
Größtenteils weisen die polyepitopischen Ligandanalyten, auf die die vorliegende Erfindung angewendet werden kann, ein Molekulargewicht von mindestens etwa 5.000, üblicher mindestens etwa 10.000 auf. In der Kategorie der Poly(aminosäuren) liegt das Molekulargewicht der betreffenden Poly(aminosäuren) im Allgemeinen bei etwa 5.000 bis 5.000.000, üblicher bei etwa 20.000 bis 1.000.000; unter den betreffenden Hormonen liegen die Molekulargewichte üblicherweise im Bereich von etwa 5.000 bis 60.000.
Molekulare Analyten schließen Antikörper, Antigene, Polynukleotide, Oligonukleotide, Proteine, Enzyme, Polypeptide, Polysaccharide, Cofaktoren, Rezeptoren, Liganden und dergleichen ein. Der Analyt kann ein Molekül sein, das sich direkt in einer Probe, wie z.B. ein Körperfluid von einem Wirt, findet. Die Probe kann direkt untersucht werden oder kann vorbehandelt werden, um den Analyten leichter nachweisbar zu machen. Weiterhin kann der betreffende Analyt bestimmt werden, indem ein Mittel, das als Beweis für den betreffenden Analyten dient, nachgewiesen wird, wie z.B. ein Element eines spezifischen Bindungspaars, das zu dem betreffenden Analyten komplementär ist, dessen Vorhandensein nur nachgewiesen wird, wenn der betreffende Analyt in einer Probe vorhanden ist. Somit wird das Mittel, das für den Analyten als Beweis dient, zum Analyten, der in einem Test nachgewiesen wird. Das Körperfluid kann beispielsweise Urin, Blut, Plasma, Serum, Speichel, Sperma, Stuhlgang, Sputum, Zerebrospinalfluid, Tränen, Mucus und dergleichen sein. Verfahren zum Nachweisen von Zielnukleinsäuren sind zum Nachweis von Infektionserregern in einer klinischen Probe, Nachweis eines Verstärkungsprodukts, das aus einer genomischen DNA oder RNA oder Boten-RNA abgeleitet ist, oder Nachweis eines Gen-(cDNA) einschubs in einem Klon verwendbar. Der Nachweis der spezifischen Raman-Label auf der eingefangenen, COIN-markierten Oligonukleotidsonde identifiziert die Nukleotidsequenz der Oligonukleotidsonde, welche wiederum Informationen bezüglich der Nukleotidsequenz des Zielpolynukleotids liefert.
Außerdem kann das Nachweisziel jeder Typ von tierischer oder pflanzlicher Zelle oder einzellige Organismus sein. Beispielsweise kann eine tierische Zelle eine Säugetierzelle sein, wie eine Immunzelle, eine Krebszelle, eine Zelle, die ein Blutgruppenantigen, wie A, B, D usw. oder ein HLA-Antigen trägt, oder eine von Viren infizierte Zelle. Ferner kann die Zielzelle ein Mikroorganismus sein, beispielsweise ein Bakterium, Algen oder Protozoon. Das Molekül, das von der Sonde gebunden wird, ist auf der Oberfläche der Zelle vorhanden, und die Zelle wird durch das Vorhandensein eines bekannten Oberflächenmerkmals (Analyt) durch die Komplexierung eines COINs mit dem Zielzellen-Oberflächenmerkmal nachgewiesen. Im Allgemeinen können Zellen auf ein oder mehrere Oberflächenmerkmale hin durch die Komplexierung mindestens eines einzigartig markierten COINs mit einem bekannten Oberflächenmerkmal einer Zielzelle analysiert werden. Zusätzliche Oberflächenmerkmale können durch die Komplexierung eines anders markierten COINs mit einem zweiten bekannten Oberflächenmerkmal der Zielzelle oder die Komplexierung zweier anders markierter COINs mit einem zweiten und dritten Oberflächenmerkmal und so weiter nachgewiesen werden. Eine oder mehrere Zellen können auf das Vorhandensein eines Oberflächenmerkmals hin durch die Komplexierung eines einzigartig markierten COINs mit einem bekannten Oberflächenmerkmal einer Zielzelle analysiert werden.
Zellenoberflächenziele umfassen Moleküle, die sich befestigt an oder vorspringend von der Oberfläche einer Zelle finden, wie Proteine, einschließlich Rezeptoren, Antikörper und Glykoproteine, Lecithine, Antigene, Peptide, Fettsäuren und Kohlenhydrate. Der zelluläre Analyt kann sich beispielsweise direkt in einer Probe finden, wie z.B. Fluid aus einem Zielorganismus. Die Probe kann direkt untersucht werden oder kann vorbehandelt sein, um den Analyten leichter nachweisbar zu machen. Das Fluid kann beispielsweise Urin, Blut, Plasma, Serum, Speichel, Sperma, Stuhlgang, Sputum, Zerebrospinalfluid, Tränen, Mucus und dergleichen sein. Die Probe kann auch beispielsweise Gewebe aus einem Zielorganismus sein.
Im Allgemeinen können Sonden an mit Metall beschichteten COINs durch Adsorption der Sonde an der COIN-Oberfläche befestigt werden. Alternativ können COINs mit Sonden durch eine Biotin-Avidin-Kupplung gekuppelt werden. Beispielsweise kann Avidin oder Streptavidin (oder ein Analogon davon) an die Oberfläche des COINs adsorbiert und eine mit Biotin modifizierte Sonde mit der mit Avidin oder Streptavidin modifizierten Oberfläche in Kontakt gebracht werden, wodurch sich eine Biotin-Avidin-(oder Biotin-Streptavidin-)Verknüpfung bildet. Wie vorstehend erläutert, können gegebenenfalls Avidin oder Streptavidin in Kombination mit einem weiteren Protein, wie BSA, adsorbiert und/oder gegebenenfalls vernetzt werden. Außerdem können bei COINs, die eine funktionelle Schicht aufweisen, die eine funktionelle Carbonsäure- oder Amingruppe umfaßt, Sonden, die eine entsprechende funktionelle Amin- oder Carbonsäuregruppe aufweisen, durch wasserlösliche Carbodiimid-Kupplungsreagenzien, wie EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid), gekuppelt werden, das funktionelle Carbonsäuregruppen mit Amingruppen kuppelt. Ferner können funktionelle Schichten und Sonden bereitgestellt werden, die reaktive Gruppen, wie Ester, Hydroxyl, Hydrazid, Amid, Chlormethyl, Aldehyd, Epoxy, Tosyl, Thiol und dergleichen, besitzen, welche durch Verwendung von Kupplungsreaktionen, die normalerweise im Fachgebiet verwendet werden, verbunden werden können. Beispielsweise stellt M. Aslam und A. Dent, Bioconjugation: Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences, Grove's Dictionaries, Inc., (1998), zusätzliche Verfahren zum Kuppeln von Biomolekülen bereit, wie beispielsweise Thiol-Maleimid-Kupplungsreaktionen, Amin-Carbonsäure-Kupplungsreaktionen, Amin-Aldehyd-Kupplungsreaktionen, Biotin-Avidin-(und Derivate) Kupplungsreaktionen und Kupplungsreaktionen, an denen Amine und photoaktivierbare heterobifunktionelle Reagenzien beteiligt sind.
Nukleotide, die an einer Vielzahl von Tags befestigt sind, können kommerziell erhalten (beispielsweise von Molecular Probes, Eugene, OR; Quiagen (Operon), Valencia, CA; und IDT (Integrated DNA Technologies), Coralville, IA) und in Oligonukleotide oder Polynukleotide integriert werden. Oligonukleotide können unter Verwendung von im Handel erhältlichen Oligonukleotidsynthetisierern (beispielsweise Applied Biosystems, Foster City, CA) hergestellt werden. Außerdem können modifizierte Nukleotide unter Verwendung bekannter Reaktionen synthetisiert werden, wie beispielsweise diejenigen, die in P. Nelson, R. Sherman-Gold, und R. Leon, „A New and Versatile Reagent for Incorporating Multiple Primary Aliphatic Amines into Synthetic Oligonucleotides", Nucleic Acids Res., 17:7179-7186 (1989) und B. Connolly, P. Rider, „Chemical Synthesis of Oligonucleotides Containing a Free Sulfhydryl Group and Subsequent Attachment of Thiol Specific Probes", Nucleic Acids Res., 13:4485-4502 (1985) offenbart werden. Alternativ können Nukleotidvorstufen, die verschiedene reaktive Gruppen, wie Biotin-, Hydroxyl-, Sulfhydryl-, Amino- oder Carboxylgruppen, enthalten, gekauft werden. Nach der Oligonukleotidsynthese können COIN-Labels unter Verwendung von Standardchemie befestigt werden. Oligonukleotide mit jeder gewünschten Sequenz mit oder ohne reaktive Gruppen zur COIN-Befestigung können auch von einer breiten Vielzahl von Quellen gekauft werden (beispielsweise Midland Certified Reagents, Midland, TX).
Sonden, wie Polysaccharide, können an COINs beispielsweise durch Verfahren befestigt werden, die in M. Aslam und A. Dent, Bioconjugation: Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences, Grove's Dictionaries, Inc., 229, 254 (1998), offenbart werden. Solche Verfahren umfassen Periodat-Oxidationskupplungsreaktionen und Bis-succinimidester-Kupplungsreaktionen, sind aber nicht darauf begrenzt.
Nachweis des Raman-Signals
(0069] Eine Vielzahl von Techniken kann verwendet werden, um COINs zu analysieren. Solche Techniken schließen beispielsweise kernmagnetische Resonanzspektroskopie (NMR), Photonenkorrelationsspektroskopie (PCS), IR, Oberflächenplasmaresonanz (SPR), XPS, Rastersondenmikroskopie (SPM), SEM, TEM, Atomabsorptionsspektroskopie, Elementaranalyse, UV-Vis, Fluoreszenzspektroskopie und dergleichen ein.
Bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung kann das Raman-Spektrometer Teil einer Nachweiseinheit sein, die entworfen ist, um Nanoteilchen der vorliegenden Erfindung durch Raman-Spektroskopie nachzuweisen und zu quantifizieren. Verfahren zum Nachweis von Raman-markierten Analyten, wie beispielsweise Nukleotiden, unter Verwendung von Raman-Spektroskopie sind im Fachgebiet bekannt. (Siehe beispielsweise die US-Patentschriften Nrn. 5,306,403; 6,002,471; 6,174,677). Varianten der oberflächenverstärkten Raman-Spektroskopie (SERS), oberflächenverstärkten Resonanz-Raman-Spektroskopie (SERRS) und kohärenten Anti-Stokes-Raman-Spektroskopie (CARS) wurden offenbart.
Ein nicht begrenzendes Beispiel für eine Raman-Nachweiseinheit wird in der US-Patentschrift Nr. 6,002,471 offenbart. Ein Anregungsstrahl wird entweder mit einem frequenzverdoppelten Nd:YAG-Laser bei einer Wellenlänge von 532 nm oder einem frequenzverdoppelten Ti:Saphir-Laser bei einer Wellenlänge von 365 nm generiert. Gepulste Laserstrahlen oder kontinuierliche Laserstrahlen können verwendet werden. Der Anregungsstrahl durchläuft eine konfokale Optik und ein Mikroskopobjektiv und wird auf die Flußbahn und/oder die Durchflußzelle fokussiert. Das Raman-Emissionslicht von den markierten Nanoteilchen wird durch das Mikroskopobjektiv und die konfokalen Optiken gesammelt und zu einem Monochromator zur spektralen Trennung gekoppelt. Die konfokale Optik schließt eine Kombination aus dichroitischen Filtern, Sperrfiltern, konfokalen Lochblenden, Linsen und Spiegeln zum Verringern des Untergrundsignals ein. Sowohl eine Standardvollfeldoptik als auch eine konfokale Optik können verwendet werden. Das Raman-Emissionssignal wird von einem Raman-Detektor detektiert, welcher eine Avalanche-Photodiode umfaßt, die mit einem Computer zum Zählen und Digitalisieren des Signals verbunden ist.
Ein weiteres Beispiel für eine Raman-Detektionseinheit wird in der US-Patentschrift Nr. 5,306,403 offenbart, das ein Spex Modell 1403 Doppelgitterspektrophotometer mit einer Galliumarsenid-Photomultiplierröhre (RCA Model C31034 oder Burle Industries Model C3103402), das im Einzelphotonen-Zählmodus betrieben wird, einschließt. Die Anregungsquelle umfaßt einen 514,5 nm-Linien-Argon-Ionenlaser von SpectraPhysics, Modell 166, und eine 647,1 nm-Linie eines Krypton-Ionenlasers (Innova 70, Coherent).
Alternative Anregungsquellen umfassen einen Stickstofflaser (Laser Science Inc.) bei 337 nm und einen Helium-Cadmium-Laser (Liconox) bei 325 nm (US-Patentschrift Nr. 6,174,677), eine Leuchtdiode, einen Nd:YLF-Laser, und/oder verschiedene Ionenlaser und/oder Farbstofflaser. Der Anregungsstrahl kann mit einem Bandpassfilter (Corion) spektral gereinigt werden und kann auf die Flußbahn und/oder Durchflußzelle unter Verwendung einer 6X-Objektivlinse (Newport, Model L6X) fokussiert werden. Die Objektivlinse kann verwendet werden, um sowohl die Raman-aktiven organischen Verbindungen der COINs anzuregen als auch um das Raman-Signal zu sammeln, indem ein holographischer Strahlaufteiler (Kaiser Optical Systems, Inc., Model HB 647-26N18) verwendet wird, wodurch eine rechtwinklige Geometrie für den Anregungsstrahl und das emittierte Raman-Signal erzeugt wird. Ein holographischer Kerbfilter (Kaiser Optical Systems, Inc.) kann verwendet werden, um die Rayleigh-Streustrahlung zu verringern. Alternative Raman-Detektoren umfassen einen ISA HR-320 Spektrographen, der mit einem Nachweissystem mit rotverstärktem intensiviertem ladungsgekoppeltem Bauelement (RE-ICCD) (Princeton Instruments) ausgerüstet ist. Andere Typen von Detektoren können verwendet werden, wie Fourier-Transform-Spektrographen (basierend auf Michelson-Interferometeren), CID-Vorrichtungen (charged injection device), Photodiodenarrays, InGaAs-Detektoren, elektronen-vervielfachtes CCD, intensiviertes CCD und/oder Phototransistorarrays.
Jede geeignete Form oder Konfiguration der Raman-Spektroskopie oder verwandten Techniken, die im Fachgebiet bekannt sind, können zum Nachweis der Nanoteilchen der vorliegenden Erfindung verwendet werden, einschließlich von und nicht beschränkt auf normale Raman-Streuung, Resonanz-Raman-Streuung, oberflächenverstärkte Raman-Streuung, oberflächenverstärkte Resonanz-Raman-Streuung, kohärente Anti-Stokes-Raman-Spektroskopie (CARS), stimulierte Raman-Streuung, inverse Raman-Spektroskopie, stimulierte Verstärkungs-Raman-Spektroskopie, Hyper-Raman-Streuung, molekulare optische Laserprüfer (MOLE) oder Raman-Mikrosonde oder Raman-Mikroskopie oder konfokale Raman-Mikrospektrometrie, dreidimensionales oder Raster-Raman, Raman-Sättigungsspektroskopie, zeitaufgelöstes Resonanz-Raman, Raman-Entkopplungsspektroskopie oder UV-Raman-Mikroskopie.
BEISPIEL 1
Überlegungen zur Synthese
Chemische Reagenzien: Biologische Reagenzien, einschließlich Anti-IL-2- und Anti-IL-8-Antikörper wurden von BD Biosciences Inc. gekauft. Die Einfangantikörper waren monoklonale Antikörper, die von Mäusen erzeugt wurden. Die Nachweisantikörper waren polyklonale Antikörper, die von Mäusen erzeugt und mit Biotin konjugiert waren. Wässrige Salzlösungen und Puffer wurden von Ambion, Inc. (Austin, TX, USA) gekauft, einschließlich 5 M NaCl, 10 × PBS (1 × PBS 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na₂HPO₄ und 2 mM KH₂PO₄, pH-Wert 7,4). Sofern nicht anders angegeben, wurden alle anderen Chemikalien mit der höchsten verfügbaren Qualität von Sigma Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, USA) gekauft. Deionisiertes Wasser, das für die Experimente verwendet wurde, wies einen Widerstand von 18,2 × 10⁶ Ohm-cm auf und wurde mit einer Einheit zur Wasserreinigung (Nanopure Infinity, Barnstad, USA) erhalten.
Synthese der Silberimpfkristallteilchen: Stammlösungen (0,500 M) von Silbernitrat (AgNO₃) und Natriumcitrat (Na₃Citrat) wurden zweimal durch 0,2 μm-Polyamidmembranfilter (Schleicher and Schuell, NH, USA) filtriert, die vor der Verwendung gründlich gespült worden waren. Natriumborhydrat-Lösung (50 mM) wurde frisch hergestellt und innerhalb von 2 Stunden verwendet. Silberimpfkristallteilchen wurden durch rasche Zugabe von 50 mL Lösung A (die 8,00 mM Na₃Citrat, 0,60 mM Natriumborhydrat und 2,00 mM Natriumhydroxid enthält) in 50 mL Lösung B (die 4,00 mM Silbernitrat enthält) unter heftigem Rühren hergestellt. Die Zugabe von Lösung B in Lösung A führte zu einer stärker polydispersierten Suspension. Silberimpfkristallsuspensionen wurden im Dunkeln gelagert und innerhalb einer Woche verwendet. Vor der Verwendung wurde die Suspension durch Photonenkorrelationsspektroskopie (PCS, Zetasizer 3000 HS oder Nano-ZS, Malvern) analysiert, um zu gewährleisten, daß der intensitätsgemittelte Durchmesser (z-Mittelwert) zwischen 10 und 12 nm bei einem Polydispersitätsindex von weniger als 0,25 lag.
Synthese der Goldimpfkristallteilchen: Ein Haushalt-Mikrowellenofen (1350 W, Panasonic) wurde verwendet, um Goldnanoteilchen herzustellen. Typischerweise wurden 40 mL einer wässrigen Lösung, die 0,500 mM HAuCl₄ und 2,0 mM Natriumcitrat enthielt, in einer Glasflasche (100 mL) in der Mikrowelle unter Verwendung der maximalen Leistung zum Sieden erhitzt, gefolgt von einer niedrigeren Leistungseinstellung, um die Lösung 5 min lang sanft am Sieden zu halten. 2,0 g PTFE-Siedesteinchen (6 mm, Saint-Gobain A1069103, durch VWR) wurden zu der Lösung gegeben, um sanftes und effizientes Sieden zu fördern. Die resultierenden Lösungen wiesen eine rosig-rote Farbe auf. Messungen durch PCS zeigten, daß die Goldlösungen einen typischen z-Mittelwert von 13 nm bei einem Polydispersitätsindex von weniger als 0,04 aufwiesen.
COIN-Synthese:
Im Allgemeinen wurden die Raman-Label in die COIN-Syntheselösung pipettiert, wodurch sich Endkonzentrationen der Label in der Syntheselösung von etwa 1 bis etwa 50 μM ergaben. In einigen Fällen wurden Säure oder organische Lösemittel verwendet, um die Löslichkeit der Label zu erhöhen. Beispielsweise wurden 8-Aza-adenin und N-Benzoyladenin in die COIN-Erzeugungsreaktion als 1,00 mM-Lösungen in 1 mM HCl pipettiert, 2-Mercaptobenzimidazol wurde aus einer 1,0 mM-Lösung in Ethanol zugegeben und 4-Aminopyrazolo[3,4-d]pyrimidin und Zeatin wurden aus einer 0,25 mM-Lösung in 1 mM HNO₃ zugegeben.
Rückflußverfahren: Um COIN-Teilchen mit Silberimpfkristallen herzustellen, wurde typischerweise 50 mL Silberimpfkristallsuspension (äquivalent zu 2,0 mM Ag⁺) in einem Rückflußsystem zum Sieden erhitzt, bevor die Raman-Label eingebracht wurden. Silbernitratstammlösung (0,50 M) wurde dann tropfenweise oder in kleinen Aliquoten (50 bis 100 μL) zugegeben, um das Wachstum und die Aggregation von Silberimpfkristallteilchen zu induzieren. Bis zu insgesamt 2,5 mM Silbernitrat konnten zugegeben werden. Die Lösung wurde am Sieden gehalten, bis die Suspension sehr trübe und dunkelbraun in der Farbe wurde. An diesem Punkt wurde die Temperatur schnell abgesenkt, indem die Kolloidlösung in eine Glasflasche überführt wurde. Die Lösung wurde dann bei Raumtemperatur gelagert. Die optimale Erhitzungsdauer hing von der Art der Raman-Label und den zugegebenen Mengen an Silbernitrat ab. Es wurde hilfreich gefunden, durch PCS oder UV-Vis-Spektroskopie zu überprüfen, daß die Teilchen einen gewünschten Größenbereich (80 bis 100 nm im Mittel) erreicht hatten, bevor das Erhitzen angehalten wurde. Normalerweise war eine dunkelbraune Farbe ein Anzeichen für die Clusterbildung und damit verbundene Raman-Aktivität.
Um COIN-Teilchen mit Goldimpfkristallen herzustellen, wurden typischerweise zuerst Goldimpfkristalle aus 0,25 mM HAuCl₄ in Gegenwart eines Raman-Labels (beispielsweise 20 μM 8-Aza-adenin) hergestellt. Nach dem Erhitzen der Goldimpfkristalllösung zum Sieden wurden Silbernitrat- und Natriumcitratstammlösungen (0,50 M) getrennt derart zugegeben, daß die Endgoldsuspension 1,0 mM AgNO₃ und 1,0 mM Natriumcitrat enthielt. Unmittelbar nach der Silbernitratzugabe konnte sich ein Silberchloridniederschlag bilden, der aber bald beim Erhitzen verschwand. Nach dem Sieden entwickelte und stabilisierte sich eine orange-braune Farbe. Ein zusätzliches Aliquot (50 bis 100 μL) der Silbernitrat- und Natriumcitratstammlösungen (jeweils 0,50 M) wurde zugegeben, um die Entwicklung einer grünen Farbe zu induzieren, die das Anzeichen für die Clusterbildung war und mit Raman-Aktivität verbunden war.
Man beachte, daß die zwei Vorgehensweisen COINs mit verschiedenen Farben ergaben, in erster Linie auf Grund der Unterschiede in der Größe der Primärteilchen vor der Clusterbildung.
Ofenverfahren: COINs konnten auch bequem unter Verwendung eines Konvektionsofens hergestellt werden. Die Silberimpfkristallsuspension wurde mit Natriumcitrat- und Silbernitratlösungen in einem 20-mL-Glasfläschchen gemischt. Das Endvolumen des Gemischs betrug typischerweise 10 mL, welches Silberteilchen (äquivalent zu 0,5 mM Ag⁺), 1,0 mM Silbernitrat und 2,0 mM Natriumcitrat enthielt (einschließlich des Anteils aus der Impfkristallsuspension). Die Glasfläschchen wurden in dem Ofen, der auf 95°C eingestellt war, 60 min. lang inkubiert, bevor sie bei Raumtemperatur gelagert wurden. Ein Bereich von Labelkonzentrationen konnte gleichzeitig getestet werden. Chargen, die eine bräunliche Farbe mit Trübheit zeigten, wurden auf Raman-Aktivität und kolloidale Stabilität getestet. Chargen mit deutlicher Sedimentation (welche auftrat, wenn die Labelkonzentrationen zu hoch waren) wurden verworfen. Gelegentlich konnten Chargen, die keine ausreichende Trübheit zeigten, eine ausgedehnte Zeitdauer lang (bis zu 3 Tage) bei Raumtemperatur gehalten werden, um die Clusterbildung zu ermöglichen. In vielen Fällen wurden die Suspensionen im Verlauf der Zeit auf Grund von Aggregation trüber, und es entwickelte sich eine starke Raman-Aktivität innerhalb von 24 Stunden. Ein Stabilisierungsmittel, wie Rinderserumalbumin (BSA), konnte verwendet werden, um die Aggregation zu stoppen und die COIN-Suspension zu stabilisieren.
Ein ähnlicher Ansatz wurde verwendet, um COINs mit Goldkernen herzustellen. Kurz gesagt wurden 3 mL Goldsuspensionen (0,50 mM Au+++), die in Gegenwart von Raman-Labeln hergestellt wurden, mit 7 mL Silbercitratlösung (die vor dem Mischen 5,0 mM Silbernitrat und 5,0 mM Natriumcitrat enthielt) in einem 20-mL-Glasfläschchen gemischt. Das Fläschchen wurde in einen Konvektionsofen gestellt und 1 Stunde lang auf 95°C erhitzt. Verschiedene Konzentrationen von markierten Goldimpfkristallen konnten gleichzeitig verwendet werden, um Chargen mit ausreichenden Raman-Aktivitäten herzustellen.
Kaltes Verfahren: 100 mL Silberteilchen (1 mM Silberatome) wurden mit 1 mL Raman-Label-Lösung (typischerweise 1 mM) gemischt. Dann wurden 5 bis 10 mL 0,5 M LiCl-Lösung zugegeben, um die Silberaggregation zu induzieren. Sobald die Suspension sichtbar dunkler wurde (auf Grund von Aggregation), wurden 0,5% BSA zugegeben, wodurch das Aggregationsverfahren gehemmt wurde. Danach wurde die Suspension 15 Minuten lang bei 4500 g zentrifugiert. Nach Entfernen der überstehenden Lösung (zumeist einzelne Teilchen) wurde das Pellet erneut in 1 mM Natriumcitratlösung suspendiert. Die Waschvorgehensweise wurde insgesamt dreimal wiederholt. Nach dem letzten Waschen wurden die erneut suspendierten pellets durch 0,2-μM-Membranfilter filtriert, um große Aggregate zu entfernen. Das Filtrat wurde als COIN-Suspension gesammelt. Die Konzentrationen an COINs wurden mit 1 mM Natriumcitrat auf 1,0 oder 1,5 mM eingestellt, indem das Absorptionsvermögen bei 400 nm mit 1 mM Silberkolloiden für SERS verglichen wurde.
Es sollte angemerkt werden, daß eine COIN-Probe im Hinblick auf Größe und Raman-Aktivität heterogen sein kann. Wir verwendeten typischerweise Zentrifugation (5 bis 10 min. lang 200 bis 2.000 × g) oder Filtration (300 kDa, 1000 kDa oder 0,2-μm-Filter, Pall Life Sciences durch VWR), um Teilchen im Bereich von 50 bis 100 nm anzureichern. Es wird empfohlen; die COIN-Teilchen mit einem Schutzmittel (beispielsweise BSA, Antikörper) vor der Anreicherung zu beschichten. Einige Partien von COINs, die wir herstellten (ohne weitere Behandlung nach der Synthese), waren mehr als 3 Monate lang bei Raumtemperatur ohne merkliche Änderungen der physikalischen und chemischen Eigenschaften stabil.
Messung der Teilchengröße: Die Größen sowohl der Silber- und Goldimpfkristallteilchen als auch der COINs wurden unter Verwendung von Photonenkorrelationsspektroskopie (PCS, Zetasizer3 3000 HS oder Nano-ZS, Malvern) bestimmt. Alle Messungen wurden bei 25°C unter Verwendung eines He-Ne-Lasers bei 633 nm durchgeführt. Die Proben wurden mit DI-Wasser verdünnt, falls notwendig. Einige der COIN-Proben (mit einer Gesamtsilberkonzentration von 1,5 mM) wurden vor der Messung zehnmal mit 1 mM Natriumcitrat verdünnt. Die 10A bzw. B zeigen die Zeta-Potential-Messungen der Silberteilchen der anfänglichen z-Mittelwertsgröße von 47 nm (0,10 M) mit einem Suspendiermedium von 1,00 mM Natriumcitrat und die Entwicklung der Aggregatgröße (z-Mittelwert) in Gegenwart von 20 μM 8-Aza-adenin.
Raman-Spektralanalyse: bei allen SERS- und COIN-Tests in Lösung wurde ein Raman-Mikroskop (Renishaw, UK), das mit einem 514-nm-Argon-Ionenlaser (25 mW) ausgerüstet war, verwendet. Typischerweise wurde ein Tropfen (50 bis 200 μL) einer Probe auf eine Aluminiumoberfläche gebracht. Der Laserstrahl wurde dann auf die obere Oberfläche des Probenmeniskus fokussiert, und etwa 10 bis 20 Sekunden lang wurden Photonen gesammelt. Das Raman-System generierte normalerweise etwa 600 Zählwerte aus Methanol bei 1040 cm^–1 bei 10 Sekunden Sammeldauer. Zum Nachweis eines Analyten, der auf einer Oberfläche immobilisiert war, durch Raman-Spektroskopie wurden Raman-Spektren unter Verwendung eines Raman-Mikroskops aufgezeichnet, das firmenintern gebaut worden war. Dieses Raman-Mikroskop bestand aus einem wassergekühlten Argon-Ionenlaser, der im kontinuierlichen Modus betrieben wird, einem dichroitischen Reflektor, einem holographischen Kerbfilter, einem Czerny-Turner-Spektrometer und einer mit flüssigem Stickstoff gekühlten CCD-(charge-coupled device) Kamera. Die Spektroskopiekomponenten wurden derart mit einem Mikroskop gekoppelt, daß das Mikroskopobjektiv den Laserstrahl auf eine Probe fokussiert und die zurück gestreute Raman-Emission sammelte. Die Laserleistung an der Probe betrug etwa 60 mW. Alle Raman-Spektren wurden bei einer Anregungswellenlänge von 514 nm gesammelt.
Beschichtung mit Antikörpern
Eine 500 μL Lösung, die 2 ng biotinylierten Antihuman-Antikörper (Anti-IL-2 oder Anti-IL-8) in 1 mM Natriumcitrat (pH-Wert 9) enthielt, wurde mit 500 μL COIN-Lösung (hergestellt mit 8-Aza-adenin oder N-Benzoyl-adenin) gemischt; die resultierende Lösung wurde 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert, gefolgt von der Zugabe von 100 μL PEG-400 (Polyethylenglykol-400). Die Lösung wurde weitere 30 min. lang bei Raumtemperatur inkubiert, dann wurden 200 μL 1% Tween^TM-20 zu der Lösung gegeben. Die Lösung wurde 10 min. lang bei 2000 × g zentrifugiert. Nach dem Entfernen der überstehenden Lösung wurde das Pellet erneut in 1 mL Lösung (BSAT) suspendiert, die 0,5% BSA, 0,1% Tween-20 und 1 mM Natriumcitrat enthielt. Die Lösung wurde dann 10 min. lang bei 1000 × g zentrifugiert. Die Waschprozedur mit BSAT wurde insgesamt dreimal wiederholt. Das endgültige Pellet wurde erneut in 700 μL Verdünnungslösung (0,5% BSA, 1 × PBS, 0,05% Tween^TM-20) suspendiert. Die Raman-Aktivität der COINs wurde gemessen und auf eine spezifische Aktivität von etwa 500 Photonzählwerten pro μl pro 10 Sekunden eingestellt, wobei ein Raman-Spektroskop verwendet wurde, das etwa 600 Zählwerte von Methanol bei 1040 cm^–1 bei 10 Sekunden Sammeldauer generierte.
Bestätigung der Antikörper-COIN-Konjugation: Um eine Standardkurve zu erhalten, wurden – Sandwichimmunoassay-Experimente gemäß den Anleitungen des Herstellers durchgeführt (BD Biosciences), wobei immobilisierte Abfangantikörper, eine feste Analytkonzentration (5 ng/mL IL-2-Protein) und eine Verdünnungsreihe des Nachweisantikörpers (0, 0,01, 0,1, 1 und 10 μg/mL) verwendet wurden. Nach dem Nachweis einer Antikörperbindung, wurde dann Streptavidin-HRP (Meerrettichperoxidase) mit den biotinylierten Antikörpern umgesetzt und TMB-(Tetramethylbenzidin) Substrat wurde angewendet, gefolgt von einer UV-Absorptionsmessung. Eine Standardkurve wurde durch Auftragen von Absorptionswerten gegen Antikörperkonzentrationen generiert.
BEISPIEL 2
Synthese von COINs, die mit BSA beschichtet sind
Beschichten von Teilchen mit BSA: COIN-Teilchen wurden mit einer Adsorptionsschicht von BSA beschichtet, indem 0,2% BSA zu der COIN-Syntheselösung gegeben wurde, als die gewünschte COIN-Größe erreicht war. Die Zugabe von BSA hemmte die weitere Aggregation.
Vernetzen der BSA-Beschichtung: Die BSA-Adsorptionsschicht wurde mit Glutaraldehyd vernetzt, gefolgt von einer Reduktion mit NaBH₄. Das Vernetzen wurde durch Überführen von 12 mL mit BSA beschichteten COINs (mit einer Gesamtsilberkonzentration von etwa 1,5 mM) in ein 15-mL-Zentrifugenrohr und Zugeben von 0,36 g 70% Glutaraldehyd und 213 μL 1 mM Natriumcitrat erreicht. Die Lösung wurde gut gemischt und konnte sich etwa 10 min. bei Raumtemperatur setzen, bevor sie in einen Kühlschrank bei 4°C gestellt wurde. Die Lösung blieb mindestens 4 Stunden lang bei 4°C, und dann wurden 275 μL frisch hergestelltes NaBH₄ (1 M) zugegeben. Die Lösung wurde gemischt und 30 min. lang bei Raumtemperatur gelassen. Die Lösung wurde dann 60 min. lang bei 5000 Upm zentrifugiert. Die überstehende Lösung wurde mit einer Pipette entfernt, wobei etwa 1.2 mL Flüssigkeit und das Pellet in der Zentrifügenröhre zurückblieben. Die COINs wurden erneut durch Zugeben von 0,8 mL 1 mM Natriumcitrat suspendiert, wodurch sich ein Endvolumen von 2,0 mL ergab.
FPLC-Reinigung von verkapselten COINS: Die beschichteten COINs wurden durch FPLC (schnelle Proteinflüssigchromatographie) an einer vernetzten Agarose-Größenausschluß-Säule gereinigt. Die konzentrierte COIN-Reaktionsgemischsuspension (2,0 mL) wurde mit einer Superose 6 FPLC-Säule an einem AKTA Purifier gereinigt. Das COIN-Gemisch wurde in 0,5-ml-Chargen injiziert und ein isokratischer Fluß von 1 mM Natriumcitrat bei 1 ml/min wurde an die Säule angelegt. Die Extinktion bei 215 nm, 280 nm und 500 nm wurde zur Peaksammlung überwacht. Die verkapselten COINs eluierten bei etwa 7 bis 9 min., während die BSA/vernetztes BSA-Fraktion bei etwa 9 bis 11 min. eluierte. Glutaraldehyd, Natriumborhydrid und Raman-Label eluierten nach etwa 20 min. Fraktionen aus mehreren FPLC-Durchläufen wurden kombiniert.
Die 11A und B zeigen Raman-Spektren, die von mit AIC bzw. BZA verkapselten COINs erhalten wurden. Die COINs wurden mit vernetztem BSA verkapselt, wie in diesem Beispiel beschrieben ist. Raman-Spektren wurden aus einer wässrigen Lösung von COINs mit einer Konzentration von etwa 0,1 mM (gesamtes Silber) an einem Raman-Mikroskop (Renishaw, UK) erhalten und wurden unter Verwendung des Raman-Signals von Methanol normalisiert.
Thermostabilisierungstest von beschichteten COINs: Die thermische Stabilität von vernetzten, mit BSA beschichteten COINs wurde gemessen, indem 20 mL AAD-COIN-Lösung, die aus der FPLC-Reinigung erhalten wurde, verwendet und 10-fach mit 1 mM Natriumcitrat verdünnt wurde. Die Lösung wurde dann gleichmäßig zwischen zwei PCR-Röhrchen verteilt. Eines der Röhrchen wurde 5 min. lang auf 70°C erhitzt, gefolgt von der Zugabe von 5 μL 0,5 M LiCl, wodurch sich eine Endkonzentration von 25 mM ergab. Das andere Röhrchen wurde als eine Kontrolle verwendet und bei Raumtemperatur gehalten. Die Raman-Signale aus beiden Proben wurden gemessen, und die Signalintensitäten der Hauptpeaks wurden verglichen. Die 12A und B zeigen Raman-Spektren, die als ein Ergebnis der Thermostabilisierungstests erhalten wurden. 12A zeigt das Raman-Spektrum, das von einem COIN, das eine BSA-Beschichtung aufweist, vor dem Erhitzen und der LiCl-Zugabe erhalten wurde. 12B zeigt das Spektrum der beschichteten AAD-COINs nach dem Erhitzen und der LiCl-Zugabe. 12C zeigt ein Diagramm, das die Signalstärke (bei 1346 cm^–1) vergleicht, als die Konzentration von LiCl erhöht wurde. Die oberen Daten stammen von den verkapselten (vernetzten BSA-)COINs, und die unteren Daten stammen von den mit BSA beschichteten COINs. Wie zu sehen ist, kann das Vernetzen von BSA die COIN-Stabilität erhöhen. Raman-Spektren wurden aus einer wässrigen Lösung von COINs mit einer Konzentration von etwa 0,1 mM (gesamtes Silber) an einem Raman-Mikroskop (Renishaw, UK), das mit einem 514-nm-Argon-Ionenlaser ausgerüstet war, erhalten und wurden unter Verwendung des Raman-Signals von Methanol normalisiert.
Größenstabilitätstest: Die kolloidale Stabilität von verkapselten COINs (COINs, die mit vernetztem BSA beschichtet sind) wurde bestimmt, indem die Größenverteilung einer Probe über einen Zeitraum von 10 bis 12 Tagen gemessen wurde. 13 zeigt die Größenverteilung für eine Probe von AMA-COINs, die mit Photonenkorrelationsspektroskopie (PCS Zetasizer3 3000 HS oder Nano-ZS, Malvern) gemessen wurde. Typischerweise zeigen COINs eine bimodale Größenverteilung, wie in 13 zu sehen ist. In diesem Fall sind die Population der Teilchen mit kleinerer Größe in erster Linie Silberteilchen (wie durch TEM bestätigt), und die Population der Teilchen größerer Größe (etwa 60 bis etwa 120 nm) sind COIN-Teilchen. Der z-Mittelwertsdurchmesser, die Polydispersität und die mittlere COIN-Größe, die durch den Hauptpeak wiedergegeben wird, sind in Tabelle 2 angegeben. Tabelle 2: Größenstabilität von verkapselten COINs mit den eingebrachten Labels, wie angegeben
Wie aus Tabelle 2 zusehen ist, sind die Änderungen der mittleren Größe (z-Mittelwert) über einen Zeitraum von 11 Tagen fast alle weniger als 15%. Jedoch war im Falle der THN-COINs eine Abnahme von 15% an der Hauptpeakposition zusehen. Es wird angenommen, daß dies der Unsicherheit zugeschrieben werden kann, die bei Größenmessungen von Proben mit Polydispersitäten von großer Größe vorhanden ist.
TEM von verkapselten COINs: Verkapselte COINs wurden mit TEM untersucht. Die Proben wurden wie folgt hergestellt: Mit Kohlenstoff beschichtete Kupfergitter (200 mesh) wurden mit einem kationischen Polymer vorbehandelt. 10 μL 0,1% Poly-L-lysin wurden in eine Kunststoffpetrischale (eine hydrophobe Oberfläche) gegeben. Das Kupfergitter wurde oben auf dem Tropfen angeordnet. Das Polymer konnte 10 min. lang auf dem Kupfergitter absorbieren. Das Gitter wurde dann gewaschen, indem zugelassen wurde, daß es zweimal mit einem Tropfen von deionisiertem Wasser (100 μL auf einer Kunststoffoberfläche) in Berührung kam. Die überschüssige Lösung wurde in einem Strom aus Stickstoff weggeblasen. Das Gitter konnte dann 15 min. lang trocknen. Das behandelte Gitter wurde dann auf eine Kunststoffoberfläche gelegt und 5 μL COIN-Suspension (etwa 6 μM an Gesamtsilberkonzentration) wurde auf das Gitter gebracht. Die Kolloidteilchen konnten 10 min. lang auf dem Gitter absorbieren. Das Gitter wurde dann durch Blasen von Stickstoff getrocknet. 14 zeigt TEM-Bilder von verkapselten AMA-COINs. Wie zu sehen ist, enthalten diese COIN-Suspensionen einzelne Teilchen und Cluster verschiedener Größen. Das Vorhandensein von kleinen einzelnen Teilchen wurde durch PCS-Messungen bestätigt. Es wird angenommen, daß die unregelmäßige Gestalt und Größenvariation der COINs auf das Aggregationsverfahren während der COIN-Synthese zurückzuführen sind.
Antikörperkonjugation: Um eine Antikörpersonde an den verkapselten COINs zu befestigen, wurden 500 μL der verkapselten COIN-Lösung mit 1/5 Volumen an 10 mM EDC in Wasser (EDC: 1,92 mg, Wasser: 1 mL) gemischt, wodurch sich eine EDC-Endkonzentration von 2 mM ergab. Die COIN-EDC-Reaktion konnte 15 min. lang bei Raumtemperatur ablaufen. Dann wurden 500 μL Wasser zugegeben, und die Lösung wurde 10 min. lang bei 5000 g zentrifugiert. Die überstehende Lösung wurde entfernt, und der Rückstand wurde erneut in 1 mL Wasser und 50 μL 1% Tween-20 suspendiert. Die Lösung wurde wieder 10 min. lang bei 5000 g zentrifugiert, und die überstehende Lösung wurde entfernt. 150 μL Wasser und 10 μL 500 μg/mL Nachweisantikörper (bis zu einer Endkonz. von etwa 0,2 μM) wurden zugegeben, und die Konjugation konnte 30 min. lang unter Schütteln bei Raumtemperatur ablaufen, wobei alle 10 min. 20 μL PEG-400 zu dem Reaktionsgemisch gegeben wurden. Nach 10 min. wurden 500 μL COIN-Waschlösung (1 mM Citrat, 0,5% BSA, 0,05% Tween-20) zugegeben. Nach weiteren 10 min. wurde das Gemisch 10 min. lang bei 2000 g zentrifugiert, die überstehende Lösung wurde entfernt, und das Pellet wurde weitere 2 Male mit COIN-Waschlösung gewaschen. Das COIN-ab-Endprodukt wurde erneut in 50 μL 1 mM Citrat suspendiert, und das Raman-Signal wurde gemessen. Das Produkt wurde bei 4°C gelagert, bis ein Bindungsaktivitäts- und Proteintest durchgeführt wurden (üblicherweise innerhalb einer Woche).
Bestätigung der Antikörper-COIN-Konjugation
Präparation der Oberfläche: 400 μL DI-Wasser, 200 μL 1 × PBS und 12 μL 500 μg/mL Mäuse-Anti-Human-IL2-Antikörper wurden gemischt. Die resultierende Lösung wurde in 100 μL Inkrementen in 6 Vertiefungen einer Platte mit 96 Vertiefungen pipettiert und 2 h lang bei 37°C oder über Nacht bei 4°C inkubiert. Um die Oberfläche zu blockieren, wurde die Antikörperlösung entfernt, und 200 μL 1% BSA-Lösung wurde zu jeder Vertiefung gegeben und 1 Stunde lang bei 37°C inkubiert. Die Vertiefungen wurden 4-mal mit 200 μL Waschlösung (1 × PBS, 0,05% Tween-20) nach dem Blockieren gewaschen. Dann wurden 10 ng/mL IL2-Proteinlösung in Verdünnungslösung (1 × PBS, 0,05% Tween-20, 0,5% BSA) hergestellt, und 100 μL wurde zu jeder der 6 Antikörpervertiefungen gegeben und 30 min. lang bei 37°C inkubiert. Die Vertiefungen wurden dann 4-mal mit 200 μL Waschlösung (0,05% Tween-20, 1 × PBS) gewaschen.
Nachweisantikörperbindung: Die Lösung des COIN-Bt-A-IL2-Konjugats (COIN, das mit einem biotinylierten Anti-IL2-Antikörper konjugiert ist) und die Bt-A-IL2-Lösung wurden gemäß Tabelle 3 in die Vertiefungen eingeführt. Die COIN-ab-Lösung war schwach gelb, ergab ein Raman-Signal von etwa 1000 bis 5000 Zählwerten. Die Vertiefungen wurden eine halbe Stunde lang bei 37°C inkubiert, die Konjugatlösung wurde entfernt, und die Vertiefungen wurden 4-mal mit 200 μL Waschlösung gewaschen. Tabelle 3
Substratvisualisierung: Ein Streptavidin-Meerrettichperoxidase-Konjugat (Katalognr. DY998, R&D Systems) wurde auf seine im Voraus ermittelte optimale Konzentration (1:200) in einer Verdünnungslösung verdünnt. 100 μl wurden zu jeder Vertiefung gegeben. Die Platte wurde versiegelt und 20 min. lang bei 37°C inkubiert. Die Vertiefungen wurden mindestens 5 mal mit 0,05% Tween-20 in 1 × PBS gewaschen. Eine Substratlösung eines 1:1-Gemischs aus Farbreagens A (H₂O₂) und Farbreagens B (Tetramethylbenzidin (R&D systems, Katalognr. DY999)) wurde hergestellt und innerhalb von 20 min. nach der Herstellung verwendet. 100 μl Substratlösung wurden zu jeder Vertiefung gegeben und 20 bis 30 min. lang bei Raumtemperatur zur Farbentwicklung inkubiert. Direktes Licht wurde vermieden. Dann wurden 50 μL Stopplösung (1 mM H₂SO₄) zu jeder Vertiefung gegeben, und die optische Dichte (OD) bei 450 nm wurden mit einem UV-Vis-Spektrophotometer für jede Vertiefung ausgelesen. Das COIN-Bt-A-IL2 zeigte Antigen-Bindungsaktivitäten, die freiem Bt-A-IL2-Nachweisantikörper ähnlich waren.
BEISPIEL 3
Synthese von Silber- und Goldteilchen, die mit Siliciumdioxid beschichtet sind
Silber-COINs werden mit Siliciumdioxid beschichtet, indem 100 μL TEOS zu einer gerührten Lösung von 75 mL 100% Ethanol und 20 mL verdünnter COIN-Suspension, die durch Zugeben von etwa 1 bis etwa 10 mL 1 mM COIN-Lösung zu deionisiertem Wasser erzeugt wurde, gegeben werden. Dann werden 5 μL 28% NH₃-Lösung zugegeben, und die Lösung wird 19 Stunden lang unter vorsichtigem Rühren bei Raumtemperatur gehalten. Die endgültige molare Zusammensetzung der Beschichtungslösung ist 4,6 mM TEOS und 0,82 M NH₃. Am Ende der 19 Stunden wird die Lösung 4-mal mit deionisiertem Wasser verdünnt und 15 min. lang bei 5000 Upm zentrifugiert, um das organische Lösungsmittel zu entfernen. Die Suspendierlösung wird durch 1 mM Natriumcitrat ersetzt.
11A zeigt TEM-Bilder von mit Siliciumdioxid beschichteten Silberimpfkristallteilchen, die gemäß der vorstehenden Prozedur beschichtet wurden. Die Dicke der resultierenden Beschichtung betrug etwa 50 nm. Die Dicke kann verringert werden, indem (a) mehr Silberteilchen zugegeben werden, (b) die TEOS-Konzentration verringert wird oder (c) die Beschichtungsdauer verringert wird.
Die vorstehende Beschichtungsprozedur wurde auch verwendet, um Goldteilchen zu beschichten. 11B zeigt TEM-Bilder von Goldteilchen, die mit Siliciumdioxid beschichtet wurden. Unsere Ergebnisse zeigen an, daß eine Vorbehandlung mit Kupplungsreagenzien, die auf Silan basieren, nicht notwendig ist, um die Bildung einer Siliciumdioxidbeschichtung zu fördern.
BEISPIEL 4
Synthese von COINs, die mit Hämatit beschichtet sind
Eine 100 μL Suspension von Silber-COINs wird mit 0,9 mL Hämatitlösung (1 mM Fe₂O₃, 8 nm Teilchen) gemischt. Das resultierende Gemisch wird 15 min. lang bei 10.000 Upm zentrifugiert. 0,95 mL überstehende Lösung werden abgezogen, und 1,00 mL 1 mM HCl werden zugegeben, um das Pellet erneut zu suspendieren. Die resultierende Suspension wird dann wiederum 15 min lang bei 10.000 Upm zentrifugiert, und 0,95 mL überstehende Lösung werden abgezogen. 1,00 mL 1 mM HCl werden zugegeben, um das Pellet erneut zu suspendieren. Die resultierenden COINs sind mit einer Schicht aus Hämatitteilchen beschichtet.
12 zeigt ein TEM-Bild von Silberimpfkristallteilchen, die gemäß der vorstehenden Prozedur mit Hämatit beschichtet wurden. Wie in dem Bild zu sehen ist, beschichteten die kleinen, positiv geladenen Hämatitteilchen die Silberteilchen. Es wird angenommen, daß die Hämatitteilchen die Silberteilchen auf Grund von Coulomb-Wechselwirkung beschichteten.
Zusammenfassung
Es werden modifizierte und funktionalisierte metallische Nanocluster bereitgestellt, die dazu geeignet sind, ein verstärktes Raman-Signal von einem organischen Raman-aktiven Molekül zu liefern, das darin integriert ist. Beispielsweise umfassen Modifizierungen Beschichtungen und Schichten, wie beispielsweise Adsorptionsschichten, Metallbeschichtungen, Siliziumdioxidbeschichtungen und organische Schichten. Die Nanocluster werden allgemein als COINs (composite organic inorganic nanoparticles) bezeichnet und sind dazu geeignet, als empfindliche Reporter für einen Analytennachweis zu wirken. Ein Metall, das das Raman-Signal von der organischen Raman-aktiven Verbindung verstärkt, ist im Nanocluster inhärent. Eine Vielzahl von organischen Raman-aktiven Verbindungen und Mischungen aus Verbindungen kann in den Nanocluster integriert werden.

Claims

Nanocluster aus Metallteilchen, die eine einzigartige Raman-Signatur aufweisen, wobei die einzigartige Raman-Signatur durch mindestens eine Raman-aktive organische Verbindung erzeugt wird, und wobei mindestens eine Raman-aktive organische Verbindung in den Nanocluster integriert ist, welcher auch eine Adsorptionsschicht auf der Oberfläche des Nanoclusters aufweist, umfassend ein Blockcopolymer, das einen hydrophoben Bereich und einen hydrophilen Bereich aufweist.
Nanocluster nach Anspruch 1, wobei die Metallteilchen ein Metall aufweisen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Silber, Gold, Kupfer, Palladium, Platin und Aluminium.
Nanocluster nach Anspruch 1, wobei die Metallteilchen Silber oder Gold umfassen.
Nanocluster nach Anspruch 1, wobei der Nanocluster einen mittleren Durchmesser von etwa 20 nm bis etwa 200 nm aufweist.
Nanocluster nach Anspruch 1, wobei der Nanocluster einen mittleren Durchmesser von etwa 40 bis etwa 200 nm aufweist.
Nanocluster nach Anspruch 1, wobei der Nanocluster einen mittleren Durchmesser von etwa 50 nm bis 150 nm aufweist.
Nanocluster nach Anspruch 1, wobei das Blockcopolymer ein Molekulargewicht von etwa 1.000 bis etwa 500.000 aufweist.
Nanocluster nach Anspruch 1, wobei das Blockcopolymer ein Molekulargewicht von etwa 1.000 bis etwa 50.000 aufweist.
Nanocluster nach Anspruch 1, wobei das Blockcopolymer drei verschiedene, sich wiederholende polymere Einheiten umfaßt.
Nanocluster nach Anspruch 1 oder 3, wobei das Blockcopolymer aus der Gruppe bestehend aus Poly(L-aminosäure)-block-poly(ester)-block, Polyglykol-block-poly(L-aminosäure)-block, Polystyrol-block-polystyrolsulfonsäure-block, Polystyrol-block-poly(4-vinylpyridin)-block, Polystyrol-block-poly(2-vinylpyridin)-block, Polystyrol-block-poly(4-vinylphenol)-block; und Polystyrol-block-poly(maleinsäure)-block und Gemischen davon gewählt wird.
Nanocluster nach Anspruch 1 oder 3, wobei der Nanocluster weiter mit einer Sonde, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Antikörpern, Antigenen, Polynukleotiden, Oligonukleotiden, Rezeptoren, Kohlenhydraten, Cofaktoren und Liganden, funktionalisiert ist.
Nanocluster nach Anspruch 1, wobei der Nanocluster mit einer Schicht aus Gold beschichtet ist und das Blockcopolymer darauf adsorbiert ist.
Nanocluster nach Anspruch 1, wobei der Nanocluster darin integriert zwei verschiedene organische Verbindungen umfaßt, die in der Lage sind, durch Raman-Spektroskopie nachgewiesen zu werden.
Nanocluster nach Anspruch 1, wobei der Nanocluster darin integriert drei verschiedene organische Verbindungen umfaßt, die in der Lage sind, durch Raman-Spektroskopie nachgewiesen zu werden.
Nanocluster aus Metallteilchen, die eine einzigartige Raman-Signatur aufweisen, wobei die einzigartige Raman-Signatur durch mindestens eine Raman-aktive organische Verbindung erzeugt wird, und wobei mindestens eine Raman-aktive organische Verbindung in den Nanocluster integriert ist, welcher auch eine Proteinadsorptionsschicht auf der Oberfläche des Nanoclusters umfaßt, aufweisend ein nicht enzymatisches globuläres oder Faserprotein.
Nanocluster nach Anspruch 15, wobei die Metallteilchen ein Metall umfassen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Silber, Gold, Kupfer, Palladium, Platin und Aluminium.
Nanocluster nach Anspruch 15, wobei die Metallteilchen Silber oder Gold umfassen.
Nanocluster nach Anspruch 15, wobei der Nanocluster einen mittleren Durchmesser von etwa 20 nm bis etwa 200 nm aufweist.
Nanocluster nach Anspruch 15, wobei der Nanocluster einen mittleren Durchmesser von etwa 40 bis etwa 200 nm aufweist.
Nanocluster nach Anspruch 15, wobei der Nanocluster einen mittleren Durchmesser von etwa 50 nm bis 150 nm aufweist.
Nanocluster nach Anspruch 16 oder 19, wobei die Proteinschicht ein Protein aufweist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Avidin, Streptavidin, Rinderserumalbumin, Transferrin, Insulin, Sojabohnenprotein, Casein, Gelatine und Gemischen davon.
Nanocluster nach Anspruch 16 oder 19, wobei die Proteinschicht mit Glutaraldehyd vernetzt ist und ein Protein aufweist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Avidin, Streptavidin, Rinderserumalbumin, Insulin, Sojabohnenprotein, Casein, Gelatine und Gemischen davon.
Nanocluster nach Anspruch 15, wobei der Nanocluster, der eine Proteinbeschichtung aufweist, ferner eine Sonde umfaßt, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Antikörpern, Antigenen, Polynukleotiden, Oligonukleotiden, Rezeptoren, Cofaktoren, Kohlenhydraten und Liganden.
Nanocluster nach Anspruch 15, wobei die Metallteilchen Silber aufweisen, der Nanocluster mit einer Schicht aus Gold beschichtet ist und die Proteinschicht darauf adsorbiert ist.
Nanocluster nach Anspruch 15, wobei der Nanocluster darin integriert zwei verschiedene organische Verbindungen umfaßt, die in der Lage sind, durch Raman-Spektroskopie nachgewiesen zu werden.
Nanocluster nach Anspruch 15, wobei der Nanocluster darin integriert drei verschiedene organische Verbindungen umfaßt, die in der Lage sind, durch Raman-Spektroskopie nachgewiesen zu werden.
Nanocluster aus Metallteilchen, die eine einzigartige Raman-Signatur aufweisen, wobei die einzigartige Raman-Signatur durch mindestens eine Raman-aktive organische Verbindung erzeugt wird, und wobei mindestens eine Raman-aktive organische Verbindung in den Nanocluster integriert ist, welcher auch eine Adsorptionsschicht auf der Oberfläche des Nanoclusters umfaßt, aufweised ein lösliches Polymer.
Nanocluster nach Anspruch 27, wobei die Metallteilchen ein Metall aufweisen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Silber, Gold, Kupfer, Palladium, Platin und Aluminium.
Nanocluster nach Anspruch 27, wobei die Metallteilchen Silber oder Gold umfassen.
Nanocluster nach Anspruch 27, wobei der Nanocluster einen mittleren Durchmesser von etwa 40 bis etwa 200 nm aufweist.
Nanocluster nach Anspruch 27, wobei der Nanocluster einen mittleren Durchmesser von etwa 50 nm bis 150 nm aufweist.
Nanocluster nach Anspruch 28, wobei die Adsorptionsschicht aus löslichem Polymer ein Polymer umfaßt, das ein Molekulargewicht von etwa 1.000 bis etwa 500.000 aufweist.
Nanocluster nach Anspruch 28, wobei die Adsorptionsschicht aus löslichem Polymer ein Polymer umfaßt, das ein Molekulargewicht von etwa 1.000 bis etwa 50.000 aufweist.
Nanocluster nach Anspruch 28, wobei die Adsorptionsschicht aus löslichem Polymer ein Polymer umfaßt, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Polyacrylamid, teilweise hydrolysiertem Polyacrylamid, Polyacrylsäure, Polyacrylamid-Acrylsäure-Copolymeren, Polybutadien-Maleinsäure-Copolymeren, Polyglykol-poly(L-aminosäure)-Copolymeren, Polyethylenimin Polyethylenglykolphosphoethanolamin, Poly(L-lysinhydrobromid), Polygalacturonsäure und Alginsäure.
Nanocluster nach Anspruch 28, wobei der Nanocluster ferner eine Sonde umfaßt, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Antikörpern, Antigenen, Polynukleotiden, Oligonukleotiden, Rezeptoren, Kohlenhydraten, Cofaktoren und Liganden.
Nanocluster nach Anspruch 27, wobei der Nanocluster darin integriert zwei verschiedene organische Verbindungen umfaßt, die in der Lage sind, durch Raman-Spektroskopie nachgewiesen zu werden.
Nanocluster nach Anspruch 27, wobei der Nanocluster mit einer Schicht aus Gold beschichtet ist und die Proteinadsorptionsschicht darauf adsorbiert ist.
Nanocluster aus Metallteilchen, die eine einzigartige Raman-Signatur aufweisen, wobei die einzigartige Raman-Signatur durch mindestens eine Raman-aktive organische Verbindung erzeugt wird, und wobei mindestens eine Raman-aktive organische Verbindung in den Nanocluster integriert ist, welcher auch eine organische Thiolschicht umfaßt, die an einer Gold- oder Silberoberfläche befestigt ist.
Nanocluster nach Anspruch 38, wobei die Metallteilchen ein Metall umfassen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Kupfer, Palladium, Platin und Aluminium, und der Nanocluster mit einer Schicht, umfassend Gold oder Silber, beschichtet ist.
Nanocluster nach Anspruch 38, wobei die Metallteilchen Silber oder Gold ausweisen.
Nanocluster nach Anspruch 38, wobei der Nanocluster einen mittleren Durchmesser von etwa 40 bis etwa 200 nm aufweist.
Nanocluster nach Anspruch 38, wobei der Nanocluster einen mittleren Durchmesser von etwa 50 nm bis 150 nm aufweist.
Nanocluster nach Anspruch 38, wobei die organische Thiolschicht eine organische Verbindung, die ein Molekulargewicht von weniger als etwa 9.000 aufweist, oder ein Polymer, das ein Molekulargewicht von weniger als etwa 10.000 aufweist, umfaßt.
Nanocluster nach Anspruch 38, wobei die organische Thiolschicht aus der Gruppe bestehend aus Sulfanylessigsäure, 3-Sulfanylpropansäure, 6-Sulfanylhexansäure, 5-Sulfanylhexansäure, 4-Sulfanylhexansäure, 3-Sulfanylpropylacetat, 3-Sulfanyl-1,2-propandiol, 4-Sulfanyl-2-butanol, 3-Sulfanyl-1-propanol, Ethyl-3-sulfanylpropanoat, Cystein, Homocystein, 2-Aminoethanthiol, 4-Aminobutanthiol, 4-Amino-2-ethyl-butanthiol, thioliertem Polyethylenglykol, thiolierten Polysacchariden, Peptiden, die Cystein enthalten, Peptiden, die Homocystein enthalten, 2,3-Disulfanyl-1-propanol, 3,4-Disulfanyl-1-butanol, 4,5-Disulfanyl-1-pentanol, 4-Amino-2-thiomethyl-butanthiol, 5-Amino-2-thiomethyl-hexanthiol und Gemischen davon gewählt wird.
Nanocluster nach Anspruch 38, wobei der Nanocluster ferner eine Sonde umfaßt, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Antikörpern, Antigenen, Polynukleotiden, Oligonukleotiden, Rezeptoren, Kohlenhydraten und Liganden.
Nanocluster nach Anspruch 38, wobei der Nanocluster darin integriert zwei verschiedene organische Verbindungen umfaßt, die in der Lage sind, durch Raman-Spektroskopie nachgewiesen zu werden.
Nanocluster aus Metallteilchen, die eine einzigartige Raman-Signatur aufweisen, wobei die einzigartige Raman-Signatur durch mindestens eine Raman-aktive organische Verbindung erzeugt wird, und wobei mindestens eine Raman-aktive organische Verbindung in den Nanocluster integriert ist, welcher auch eine Schicht auf der Oberfläche des Nanoclusters aufweist, die Siliciumdioxid umfaßt.
Nanocluster nach Anspruch 47, wobei der Nanocluster einen mittleren Durchmesser von etwa 40 nm bis etwa 200 nm aufweist.
Nanocluster nach Anspruch 47, wobei der Nanocluster einen mittleren Durchmesser von etwa 50 nm bis etwa 150 nm aufweist.
Nanocluster nach Anspruch 47, wobei der Nanocluster ferner eine Sonde umfaßt, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Antikörpern, Antigenen, Polynukleotiden, Oligonukleotiden, Rezeptoren, Kohlenhydraten, Cofaktoren und Liganden.
Nanocluster nach Anspruch 47, wobei das Kolloid darin integriert zwei verschiedene organische Verbindungen umfaßt, die in der Lage sind, durch Raman-Spektroskopie nachgewiesen zu werden.
Nanocluster nach Anspruch 47, wobei der Nanocluster mit einer Schicht aus Gold beschichtet ist und sich die Siliciumdioxidschicht darauf befindet.
Nanocluster aus Metallteilchen, die eine einzigartige Raman-Signatur aufweisen, wobei die einzigartige Raman-Signatur durch mindestens eine Raman-aktive organische Verbindung erzeugt wird, und wobei mindestens eine Raman-aktive organische Verbindung in den Nanocluster integriert ist, welcher auch eine Schicht aufweist, die Hämatitteilchen umfaßt.
Nanocluster nach Anspruch 53, wobei der Nanocluster einen mittleren Durchmesser von etwa 40 nm bis etwa 200 nm aufweist.
Nanocluster nach Anspruch 53, wobei der Nanocluster weiter mit einer Sonde, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Antikörpern, Antigenen, Polynukleotiden, Oligonukleotiden, Rezeptoren, Kohlenhydraten und Liganden, funktionalisiert ist.
Nanocluster nach Anspruch 53, wobei das Kolloid darin integriert zwei verschiedene organische Verbindungen umfaßt, die in der Lage sind, durch Raman-Spektroskopie nachgewiesen zu werden.
Nanocluster nach Anspruch 53, wobei der Nanocluster mit einer Schicht aus Gold beschichtet ist und sich die Hämatitschicht darauf befindet.
Nanocluster aus Metallteilchen, die eine einzigartige Raman-Signatur aufweisen, wobei die einzigartige Raman-Signatur durch mindestens eine Raman-aktive organische Verbindung erzeugt wird, die in den Nanocluster integriert ist, welcher auch eine organische Schicht aufweist, die mit Octylamin modifizierte Polyacrylsäure umfaßt.
Nanocluster nach Anspruch 58, wobei die mit Octylamin modifizierte Polyacrylsäure mit Lysin oder (1,6)-Diaminoheptan vernetzt ist.
Nanocluster nach Anspruch 59, wobei der Nanocluster weiter mit einer Sonde, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Antikörpern, Antigenen, Polynukleotiden, Oligonukleotiden, Rezeptoren, Kohlenhydraten und Liganden, funktionalisiert ist.
Nanocluster nach Anspruch 59, wobei der Nanocluster mit einer Schicht aus Gold beschichtet ist und sich die Schicht aus mit Octylamin modifizierter Polyacrylsäure darauf befindet.
Nanocluster aus Metallteilchen, die eine einzigartige Raman-Signatur aufweisen, wobei die einzigartige Raman-Signatur durch mindestens eine Raman-aktive organische Verbindung erzeugt wird, und wobei mindestens eine Raman-aktive organische Verbindung in den Nanocluster integriert ist, welcher auch eine Metallschicht aufweist.
Nanocluster nach Anspruch 62, wobei die Metallschicht aus einem Metall besteht, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Silber, Gold, Platin, Aluminium und Kupfer.
Nanocluster nach Anspruch 62, wobei der Nanocluster darin integriert zwei verschiedene organische Verbindungen umfaßt, die in der Lage sind, durch Raman-Spektroskopie nachgewiesen zu werden.
Nanocluster nach Anspruch 62, wobei der Nanocluster, der die Metallschicht aufweist, weiter mit einer Sonde, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Antikörpern, Antigenen, Polynukleotiden, Oligonukleotiden, Rezeptoren, Kohlenhydraten, Cofaktoren und Liganden, funktionalisiert ist.
Verfahren zum Herstellen eines Nanoclusters, der eine Raman-Signatur aufweist, umfassend, Erhitzen eines flüssigen Gemischs, umfassend mindestens eine Raman-aktive Verbindung und Nanoteilchen eines Metalls bei erhöhter Temperatur für eine Dauer, die ausreicht, um Cluster aus Nanoteilchen zu erzeugen, in die die Raman-aktive Verbindung integriert ist und die einen mittleren Durchmesser von etwa 50 bis etwa 150 nm aufweisen, Trennen der resultierenden Nanocluster von jeglicher nicht integrierter Raman-aktiver Verbindung oder Metallnanoteilchen, und Beschichten der Nanocluster mit einer Siliciumdioxidbeschichtung.
Verfahren nach Anspruch 66, wobei die Nanoteilchen eines Metalls Silber oder Gold umfassen.
Verfahren zum Herstellen eines Nanoclusters, der eine Raman-Signatur aufweist, umfassend, Erhitzen eines flüssigen Gemischs, umfassend mindestens eine Raman-aktive Verbindung und Nanoteilchen eines Metalls bei erhöhter Temperatur für eine Dauer, die ausreicht, um Cluster aus Nanoteilchen zu erzeugen, in die die Raman-aktive Verbindung integriert ist und die einen mittleren Durchmesser von etwa 50 bis etwa 150 nm aufweisen, Zugeben eines Proteins zu der Lösung, um die resultierenden Nanocluster zu beschichten, Trennen der beschichteten Nanocluster von jeglicher nicht integrierter Raman-aktiver Verbindung, Metallnanoteilchen und Protein, Vernetzen des Proteins, das auf der Nanoclusteroberfläche adsorbiert ist.
Verfahren nach Anspruch 68, wobei die Nanoteilchen eines Metalls Silber oder Gold umfassen.
Verfahren nach Anspruch 68, wobei das Protein aus der Gruppe bestehend aus Avidin, Streptavidin, Rinderserumalbumin, Transferrin, Insulin, Sojabohnenprotein, Casein, Gelatine und Gemischen davon gewählt ist.