CN103624268B - 抗癌荧光含糖银纳米团簇的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种新型抗癌荧光含糖银纳米团簇的制备方法，其特征在于：1）先利用活性自由基聚合的方法制得结构规整可控的含糖聚合物，所述含糖聚合物的基本结构式如下：其中m、n根据单体与链转移剂的比例而定，m、n的取值范围均是10～200；2）以步骤1）制得的含糖聚合物为稳定剂，与AgNO3溶液混合，再运用还原的方法得到荧光含糖银纳米团簇。本发明首次利用活性自由基聚合的方法，制备结构规整可控的含糖聚合物，再运用微波还原或还原剂还原的方法得到以含糖聚合物作为稳定剂的荧光含糖银纳米团簇，具有很好的水溶性，强的荧光性，对癌细胞有很好的杀灭作用。
Description
技术领域
本发明涉及一种抗癌荧光含糖银纳米团簇的制备方法。
背景技术
银纳米团簇(Silvernanoclusters)，大小接近费米电子波长，显示电子离散，电子跃迁等特性，从而表现出独特的光学，电学和化学性能，并且具有很强的荧光性可以用来做光感测试或者生物标识。另一方面，银纳米粒子作为一种广泛使用的杀菌剂，其对细胞的毒副作用也越来越受到重视，被细胞吞入后产生的银离子ROS也会导致细胞的死亡。糖(碳水化合物)是自然界中许多天然产物的组成单元，是生物中常见的能量来源，也是很重要的一种多价态配体(受体)。糖与凝集素(lectin)蛋白的特异性结合性是包括细胞识别、病原体感染、细胞附着和分化等许多生命过程的基础，是当前科学领域中非常重要的研究课题之一。从二十世纪90年代以来，科学工作者利用含糖聚合物的特点，在多个疾病的治疗中进行了积极的探索，比如流感，人类免疫缺陷病毒(艾滋病)，阿兹海默病(脑退化症)等。肿瘤细胞与正常细胞相比，一个显著的特点就是糖代谢率升高，肿瘤细胞表面常常过表达一些与糖有特异性作用的蛋白，比如葡萄糖转运蛋白(GlucoseTransporters，GLUT)是唯一的几乎存在于所有癌细胞系中的亚型，并已发现在许多人类肿瘤中均有高表达，利用这个特点，制备银与含糖分子的络合物对癌症进行检测和靶向治疗是一个很好地切入点。生物系统中通过糖簇效应(Clusterglycosideeffect)达到特异识别的高亲和力与选择性。侧链为糖分子的合成聚合物能够象自然界的糖蛋白一样与特异性蛋白发生多价态的配(受)体作用，因此含糖银纳米团簇是很有潜力的一种新型的细胞成像和靶向性癌症治疗的聚合物材料。银纳米团簇的合成目前主要以DNA、壳聚糖以及甲基丙烯酸作为稳定剂来制备银纳米团簇，主要应用在离子的检测等领域。而本发明用自由基聚合的方法制备了含糖的聚合物并以此为模板运用微波合成的方法制备了银纳米团簇，由于有糖的存在，可以提高和癌细胞的靶向性结合能力，因此在癌细胞的治疗等医学领域有很大的应用前景。
发明内容
本发明目的是：提供一种抗癌荧光含糖银纳米团簇的制备方法，其首次利用活性自由基聚合的方法，制备结构规整可控的含糖聚合物，再运用微波还原或还原剂还原的方法得到以含糖聚合物作为稳定剂的荧光含糖银纳米团簇，合成方法经济，便于大规模合成，且制备得到的荧光含糖银纳米团簇具有很好的水溶性，强的荧光性，对癌细胞有很好的杀灭作用。
本发明的技术方案是：一种抗癌荧光含糖银纳米团簇的制备方法，其特征在于：
1)先利用活性自由基聚合的方法制得结构规整可控的含糖聚合物，所述含糖聚合物的基本结构式如下：
其中m、n的取值范围均是10～200；
2)以步骤1)制得的含糖聚合物为稳定剂，与AgNO3溶液混合，再运用还原的方法得到所述荧光含糖银纳米团簇。
进一步的，本发明中所述步骤2)的具体流程如下：
a)将步骤1)得到的含糖聚合物溶解在水中，并向其中缓慢滴加(1～2滴/秒)NaOH溶液，控制溶液的pH＝7～9，且NaOH与含糖聚合物的摩尔比为115～130:1(加入NaOH的目的主要是为了和含糖聚合物中的羧酸基团反应，以便后续和Ag+结合，起到防止颗粒变大的作用；考虑加入其它的碱溶液可能会引入其它金属离子，影响Ag+的还原，而钠离子在该反应中不会有什么变化和影响)；
b)制备AgNO3溶液，并向其中滴加步骤a)得到的含糖聚合物的NaOH溶液，并不断搅拌使其混合均匀，所述AgNO3和含糖聚合物的摩尔比为115～140：1(Ag+的作用是和含糖聚合物中的羧酸基团结合，所以Ag+的摩尔量可以略大于羧酸基团的量)；
c)通过微波还原或还原剂还原的方法制得所述荧光含糖银纳米团簇，其中：
微波还原是指：将步骤b)最后得到的溶液放入微波合成仪中，调节反应功率为60W-100W，反应时间为60s-120s，获得所需产物；
还原剂还原是指：在冰浴和避光条件下，向步骤b)最后得到的溶液中加入还原剂，搅拌使之反应3～5h，获得所需产物，其中还原剂和AgNO3的摩尔比为1.2-1.5，且还原剂选自硼氢化钠、三乙胺和柠檬酸钠之一。
进一步的，本发明中所述步骤1)中含糖聚合物的制备方法为：称取带有丰富羧基基团的有机单体A和靶向细胞亲和性好的有机单体B，和一定量的RAFT链转移剂和引发剂，溶于溶剂中，在60℃-80℃无氧的条件下反应20h-24h，冷却后在甲醇中聚沉，得到红色沉淀，抽滤，干燥；
所述有机单体A和有机单体B的摩尔比例为10:1～6，同时A和B单体的总量与RAFT链转移剂的摩尔比为10～200:1，而RAFT链转移剂和引发剂的摩尔比为1:0.1～0.25，其中：
所述有机单体A选自MAA、聚(N-异丙基丙烯酰胺)-丙烯酸-2-羟乙酯、多臂星形聚甘油-聚(丙烯酸)嵌段共聚物之一，所述MAA为甲基丙烯酸；
所述有机单体B选自半乳糖、葡萄糖、甘露糖之一；
所述引发剂选自AIBN偶氮二异丁腈、BPO过氧化二苯甲酰、ACPA4,4'-偶氮-(4-氰基戊酸)之一；
且如采用了油溶性的引发剂和RAFT链转移剂时，所述溶剂使用DMF(N,N-二甲基甲酰胺)、DMAc(二甲基乙酰胺)、DMSO(二甲基亚砜)之一的两亲性溶剂，如采用了水溶性的引发剂和RAFT链转移剂时，所述溶剂为水。
更为优选的，本发明中所述有机单体B为MAG，即2-(甲基丙烯酰胺基)吡喃葡萄糖。
更为优选的，本发明中所述RAFT链转移剂为硫代酯类RAFT链转移剂。
最为优选的，本发明中所述RAFT链转移剂为CPDN，即二硫代萘甲酸异丁腈酯。
进一步的，本发明中所述步骤2)最后制得的荧光含糖银纳米团簇在不同波长的光的激发下所发射荧光的波长在480nm-530nm波段。
进一步的，本发明中所述步骤2)最后制得的荧光含糖银纳米团簇的平均粒径为30nm-50nm。
本发明的优点是：
1.本发明首次利用活性自由基聚合的方法，制备结构规整可控的含糖聚合物，再运用微波还原或还原剂还原的方法得到以含糖聚合物作为稳定剂的荧光含糖银纳米团簇，合成方法经济，便于大规模合成。
2.本发明制备得到的以含糖聚合物作为稳定剂的荧光含糖银纳米团簇，具有很好的水溶性，强的荧光性，对癌细胞有很好的杀灭作用。
附图说明
下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：
图1为典型含糖聚合物分子量的GPC测量曲线图；
图2为微波处理前后的含糖聚合物的紫外可见吸收光谱对比曲线图；
图3为微波处理后的荧光含糖银纳米团簇在520nm激发波长照射下的荧光图谱；
图4为荧光含糖银纳米团簇的浓度和细胞存活率关系柱状示意图。
具体实施方式
实施例1：一种抗癌荧光含糖银纳米团簇的制备方法，其包括下述步骤：
1)先利用活性自由基聚合的方法制得结构规整可控的含糖聚合物：
具体方法如下：称取MAA、MAG和一定量的“RAFT”试剂和引发剂，溶于3ml的溶剂中，在70℃无氧的条件下反应24h，冷却后在甲醇中聚沉，得到红色沉淀，抽滤，干燥；
本实施例中所述MAA为甲基丙烯酸溶液，MAG为2-(甲基丙烯酰胺基)吡喃葡萄糖。所述引发剂为AIBN，即偶氮二异丁腈；所述RAFT链转移剂为CPDN，即二硫代萘甲酸异丁腈酯，所述溶剂为DMF。
并且MAA：MAG：RAFT链转移剂的摩尔比100:40:1，而RAFT链转移剂和引发剂的摩尔比为1:0.25。
制得的含糖聚合物PMAA-MAG的基本结构式如下：
其中：m:n＝100:40。
结合图1所示，上述用于制备银纳米团簇的典型含糖聚合物的分子量为23000，分子量分布1.2左右。
2)以步骤1)制得的含糖聚合物为稳定剂，与AgNO3溶液混合，再运用微波还原的方法得到“荧光含糖银纳米团簇”，具体步骤如下：
a)取0.04g步骤1)最后制得的含糖聚合物PMAA-MAG溶于5ml水中，然后向其中缓慢滴加200ul浓度为1mol/L的NaOH水溶液；
其中NaOH：PMAA-MAG的摩尔比＝115：1；
b)取0.034gAgNO3完全溶解于50ml水中，取10ml所述AgNO3水溶液，在其中慢慢加入1ml步骤a)得到的含糖聚合物的碱溶液，并不断搅拌使其混合均匀，放入微波合成仪中，调节功率为80W反应时间为70s，反应结束后获得产物“荧光含糖银纳米团簇”，冷却避光保存。
本实施例中AgNO3：PMAA-MAG的摩尔比为115:1。
结合图2所示，在步骤b)的微波处理之前500nm左右没有明显的吸收峰，微波处理后的纳米银团簇在500nm左右有一个明显的吸收峰，说明有纳米银团簇的形成。再结合图3所示，在激发波长为520nm激发波长照射下，在620nm有一个明显的吸收峰，这也是银纳米团簇的荧光特征吸收峰。
所述步骤2)最后制得的荧光含糖银纳米团簇的平均粒径为30nm。
且如图4所示，步骤2)制备得到的荧光含糖银纳米团簇浓度(即图中横坐标)达到0.6μg/ml的时候K562细胞的存活率(即图中纵坐标)就只有50％左右。
实施例2：步骤1)同实施例1，步骤2)是以步骤1)制得的含糖聚合物为稳定剂，与AgNO3溶液混合，再运用还原剂还原的方法得到“荧光含糖银纳米团簇”，具体步骤如下：
a)取0.04g步骤1)最后制得的含糖聚合物PMAA-MAG溶于5ml水中，然而向其中缓慢滴加200ul浓度为1mol/L的NaOH水溶液(滴加速度约为1-2滴/秒)；
其中NaOH：PMAA-MAG的摩尔比＝115:1；
b)取0.03gAgNO3完全溶解于60ml水中，取10ml所述AgNO3水溶液，在其中慢慢加入0.7ml步骤a)得到的含糖聚合物的碱溶液(滴加速度约为1-2滴/秒)，并不断搅拌使其混合均匀；
其中AgNO3：PMAA-MAG的摩尔比＝121:1；
c)在冰浴/避光的条件下，向步骤b)制得的含糖聚合物的碱溶液中滴加18mL2.0mM的硼氢化钠溶液(滴加速度约为1-2滴/秒)，搅拌反应4h，反应结束后冷却避光保存。其中硼氢化钠：AgNO3：含糖聚合物PMAA-MAG的摩尔比＝170:121:1。
实施例3：步骤1)同实施例1，步骤2)是以步骤1)制得的含糖聚合物为稳定剂，与AgNO3溶液混合，再运用还原剂还原的方法得到“荧光含糖银纳米团簇”，具体步骤如下：
a)取0.04g步骤1)最后制得的含糖聚合物PMAA-MAG溶于5ml水中，然而向其中缓慢滴加210ul浓度为1mol/L的NaOH水溶液(滴加速度约为1-2滴/秒)；
其中NaOH:PMAA-MAG的摩尔比＝120:1；
b)取0.025gAgNO3完全溶解于60ml水中，取10ml所述AgNO3水溶液，在其中慢慢加入0.6ml步骤a)得到的含糖聚合物的碱溶液(滴加速度约为1-2滴/秒)，并不断搅拌使其混合均匀；
其中AgNO3：PMAA-MAG的摩尔比＝121:1；
c)在避光的条件下，向步骤b)制得的含糖聚合物的碱溶液中滴加18mL2.0mM的三乙胺溶液(滴加速度约为1-2滴/秒)，搅拌反应4h，反应结束后冷却避光保存。其中三乙胺：AgNO3：含糖聚合物PMAA-MAG的摩尔比＝170:121:1。
实施例4：步骤1)同实施例1，步骤2)是以步骤1)制得的含糖聚合物为稳定剂，与AgNO3溶液混合，再运用还原剂还原的方法得到“荧光含糖银纳米团簇”，具体步骤如下：
a)取0.04g步骤1)最后制得的含糖聚合物PMAA-MAG溶于5ml水中，然而向其中缓慢滴加220ul浓度为1mol/L的NaOH水溶液(滴加速度约为1-2滴/秒)；
其中NaOH:PMAA-MAG的摩尔比＝126:1；
b)取0.035gAgNO3完全溶解于60ml水中，取10ml所述AgNO3水溶液，在其中慢慢加入0.7ml步骤a)得到的含糖聚合物的碱溶液(滴加速度约为1-2滴/秒)，并不断搅拌使其混合均匀；
c)在冰浴/避光的条件下，向步骤b)制得的含糖聚合物的碱溶液中滴加18mL2.0mM的柠檬酸钠溶液(滴加速度约为1-2滴/秒)，搅拌反应4h，反应结束后冷却避光保存。其中柠檬酸钠：AgNO3：含糖聚合物PMAA-MAG的摩尔比＝170:140:1。
当然上述实施例只是为说明本发明的技术构思及特点所作的例举而非穷举，其目的在于让熟悉此项技术的人能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明主要技术方案的精神实质所做的修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种抗癌荧光含糖银纳米团簇的制备方法，其特征在于：
1)先利用活性自由基聚合的方法制得结构规整可控的含糖聚合物，所述含糖聚合物的基本结构式如下：
其中m、n的取值范围均是10～200；
2)以步骤1)制得的含糖聚合物为稳定剂，与AgNO3溶液混合，再运用还原的方法得到所述荧光含糖银纳米团簇。
2.根据权利要求1所述的抗癌荧光含糖银纳米团簇的制备方法，其特征在于：所述步骤2)的具体流程如下：
a)将步骤1)得到的含糖聚合物溶解在水中，并向其中缓慢滴加NaOH溶液，控制溶液的pH＝7～9，且NaOH与含糖聚合物的摩尔比为115～130:1；
b)制备AgNO3溶液，并向其中滴加步骤a)得到的含糖聚合物的NaOH溶液，并不断搅拌使其混合均匀，所述AgNO3和含糖聚合物的摩尔比为115～140：1；
c)通过微波还原或还原剂还原的方法制得所述荧光含糖银纳米团簇，其中：
微波还原是指：将步骤b)最后得到的溶液放入微波合成仪中，调节反应功率为60W-100W，反应时间为60s-120s，获得所需产物；
还原剂还原是指：在冰浴和避光条件下，向步骤b)最后得到的溶液中加入还原剂，搅拌使之反应3～5h，获得所需产物，其中还原剂和AgNO3的摩尔比为1.2-1.5，且还原剂选自硼氢化钠、三乙胺和柠檬酸钠之一。
3.根据权利要求1所述的抗癌荧光含糖银纳米团簇的制备方法，其特征在于步骤1)中含糖聚合物的制备方法为：称取带有丰富羧基基团的有机单体A和靶向细胞亲和性好的有机单体B，和一定量的RAFT链转移剂和引发剂，溶于溶剂中，在60℃-80℃无氧的条件下反应20h-24h，冷却后在甲醇中聚沉，得到红色沉淀，抽滤，干燥；
所述有机单体A和有机单体B的摩尔比例为10:1～6，同时A和B单体的总量与RAFT链转移剂的摩尔比为10～200:1，而RAFT链转移剂和引发剂的摩尔比为1:0.1～0.25，其中：
所述有机单体A选自MAA、聚(N-异丙基丙烯酰胺)-丙烯酸-2-羟乙酯、多臂星形聚甘油-聚(丙烯酸)嵌段共聚物之一；
所述有机单体B选自半乳糖、葡萄糖、甘露糖之一；
所述引发剂选自AIBN、BPO、ACPA之一；
且如采用了油溶性的引发剂和RAFT链转移剂时，所述溶剂使用DMF、DMAc、DMSO之一的两亲性溶剂，如采用了水溶性的引发剂和RAFT链转移剂时，所述溶剂为水。
4.根据权利要求3所述的抗癌荧光含糖银纳米团簇的制备方法，其特征在于所述有机单体B为MAG。
5.根据权利要求3所述的抗癌荧光含糖银纳米团簇的制备方法，其特征在于所述RAFT链转移剂为硫代酯类RAFT链转移剂。
6.根据权利要求5所述的抗癌荧光含糖银纳米团簇的制备方法，其特征在于所述RAFT链转移剂为CPDN，即二硫代萘甲酸异丁腈酯。
7.根据权利要求1所述的抗癌荧光含糖银纳米团簇的制备方法，其特征在于：所述步骤2)最后制得的荧光含糖银纳米团簇在不同波长的光的激发下所发射荧光的波长在480nm-530nm波段。
8.根据权利要求1所述的抗癌荧光含糖银纳米团簇的制备方法，其特征在于：所述步骤2)最后制得的荧光含糖银纳米团簇的平均粒径为30nm-50nm。
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