CN104491871A

CN104491871A - 一种基于聚谷氨酸和胱胺的pH与还原敏感性的纳米微凝胶

Info

Publication number: CN104491871A
Application number: CN201410724506.7A
Authority: CN
Inventors: 倪才华; 吴鲁艳
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: NANTONG HUIYUAN PLASTIC Co.,Ltd.
Priority date: 2014-12-02
Filing date: 2014-12-02
Publication date: 2015-04-08
Anticipated expiration: 2034-12-02
Also published as: CN104491871B

Abstract

本发明提供了一种基于聚谷氨酸和胱胺的pH与还原敏感性的纳米微凝胶的制备方法及其在抗肿瘤方面的应用。该纳米微凝胶的合成是以聚谷氨酸和胱胺为原料，首先经过静电相互作用形成微凝胶模型，再添加催化剂进行酰胺化交联反应，从而制得粒径为212nm的稳定微凝胶,通过微凝胶中聚谷氨酸的羧酸根负离子与阿霉素中氨基正离子结合进行药物负载，获得17.8％的较高载药率；交联剂胱胺中的二硫键赋予纳米颗粒还原敏感性，该二硫键在含有较高浓度的还原型谷胱甘肽的癌细胞内断裂，因而纳米微凝胶具有肿瘤靶向性及控制释放功能。该纳米微凝胶的制备在水溶液中直接进行，不使用任何有机溶剂，保证了药物载体的安全性。

Description

一种基于聚谷氨酸和胱胺的pH与还原敏感性的纳米微凝胶

技术领域

一种基于聚谷氨酸和胱胺的具有pH和还原敏感性的纳米微凝胶的制备，属于生物材料的制备及药物释放领域。

背景技术

癌症被认为是仅次于心脑血管的致使人死亡的主要原因。目前，治疗癌症的方法主要有手术摘除、放疗和化疗。但目前这些方法都存在很多缺陷。例如许多抗癌药物都存在着难溶于水、稳定性差等缺点，且不仅对癌细胞有杀灭作用，对正常细胞的也有较大的毒副作用。且药物进入血液循环系统后，通常迅速被巨噬系统(MPS)摄取，到达网状内皮系统(RES)分布集中的肝、脾、肺、骨髓、淋巴等靶部位，最终被网状内皮系统进行清除，造成细胞吸收差，另外，由于抗癌药物在人体内的代谢速度过快、半衰期较短、容易排泄，且随着时间的增加，血液中药物的浓度会降低到最低有效治疗浓度以下，疗效有限。

纳米科学技术是20世纪80年代崛起的新科技，纳米技术与高分子药物控制释放结合使得纳米药物控制释放体系成为给药系统的研究热点，并使其产生了许多优越性，纳米药物控制释放体系的发展给癌症的治疗带来了新的希望。智能载药体系优点有增溶疏水性药物、消除生物屏障对药物作用的阻隔、增加药物的生物利用度和靶向性。事实上,与正常血管相比，肿瘤血管通常有更多的多孔结构，孔隙直径通常在100nm和780nm之间变化。基于此，纳米颗粒能够穿透细胞膜进入到癌细胞内。

纳米体系能够增强渗透性和停留(EPR)效应，提高药物的利用效率。通常智能纳米载药体系都具有亲水和疏水的部分，亲水区域能够增强生物相容性，并能躲过人体的网状内皮质系统的识别和捕获,起到“隐形”的作用，延长了载药系统在血液中的循环时间，提高了药物的生物利用度。另外，癌细胞与正常细胞的区别在于，癌细胞的pH较低，癌细胞内的还原型谷胱甘肽的含量较正常细胞高，癌细胞的细胞膜表面有过量产生的受体，如叶酸、转铁蛋白。利用这些区别可以制备各种智能纳米体系，从而使纳米体系具有一定的靶向性，并用于癌症的治疗，提高了癌症的治疗效果。聚氨基酸是一类有良好生物相容性的高分子，通常有良好的水溶性，具有许多优异的性能如粘合性,成膜性、成胶性、螯合性、分散性、絮凝性等。聚谷氨酸具有较好的生物相容性，聚谷氨酸材料进入生物体内后,可完全降解成单体,且为低毒、无刺激性物质。且聚谷氨酸在不同的微环境下有一定的构象的改变。聚谷氨酸在碱性介质中带有负电荷，容易与含正电荷的药物分子产生静电吸附作用，从而提高药物负载率。胱胺作为交联剂能显著提高纳米微凝胶的稳定性，且其中存在二硫键，能在还原二硫苏糖醇和还原型谷胱甘肽的作用下断裂，且随还原剂浓度的增大，效果更加显著。因而，能够利用肿瘤细胞内和正常细胞中谷胱甘肽的浓度梯度的差别，将抗癌药物释放到癌细胞内。从而赋予该纳米颗粒一定的靶向性。这将为该纳米颗粒用于抗肿瘤方面的应用奠定了基础。

纳米为凝胶的合成通常有：反相微乳液交联法、沉淀聚合法、分散聚合法、喷雾干燥法和微流控制交联法，但是每种方法均有一定的缺陷，而且都需要使用大量的有机溶剂。

为了避免在合成过程中使用有机溶剂，得到粒径分布均一的纳米微凝胶，本发明公开了一种新的纳米微凝胶的合成方法，以聚谷氨酸和胱胺为基本原料，利用聚谷氨酸中的羧基与胱胺中氨基的静电吸附作用，通过控制组分浓度和配比的方法，首先形成纳米微凝胶模型，然后添加1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，将静电相互作用转化成共价键，在水溶液中直接反应，形成稳定的单分散性的微凝胶。以抗癌药物阿霉素为模型药物，将其负载在该纳米微凝胶上，发现纳米微凝胶对阿霉素具有较高的负载率，药物释放过程具有对pH和还原敏感性。该纳米微凝胶有望在生物医药和组织工程领域得到应用。

发明内容

通过两步法在水溶液中直接反应合成得到了微凝胶，以聚谷氨酸和胱胺为基本原料，利用聚谷氨酸中的羧基与胱胺中氨基的静电吸附作用，通过控制组分浓度和配比的方法，首先形成纳米微凝胶模型，然后添加催化剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)使羧基与氨基的键型发生转化，形成稳定的共价键，最后得到单分散性的微凝胶，其粒径在212nm。利用聚谷氨酸中的羧基增大对阿霉素的负载率，利用纳米微凝胶中酸敏性的羧基进行pH控制释放，以及利用胱胺中的双硫键起到还原控制释放的效果。

本发明的有益效果

1)通过两步法在水溶液中直接反应合成得到了微凝胶，不使用任何有机溶剂和其他表面活性剂，无毒环保，增强了药物载体的安全性；

2)微凝胶模型的是通过羧基与氨基的离子相互作用形成，条件温和，节能省耗，粒径大小可以通过组分比例和浓度来调节；

3)聚谷氨酸材料进入生物体内后,可完全降解成单体,且为低毒、无刺激性物质，生物相容性好；

4)羧基所含的负电荷有利于抗癌药物阿霉素的负载，提高了药物的负载率；

5)微凝胶中含有羧基和双硫键，具有pH和还原敏感性，药物在碱性介质中稳定不释放，而在酸性和还原性环境中受刺激释放，有利于增加肿瘤细胞内药物浓度，有望作为抗癌药物载体的应用；

附图说明

图1聚谷氨酸与胱胺复合物转变成共价交联微凝胶示意图。PLG代表聚谷氨酸，CyS代表胱胺。

图2聚谷氨酸和胱胺形成微凝胶的红外谱图，样品中聚谷氨酸羧基和胱胺中氨基的摩尔比为1：1，聚谷氨酸的质量浓度为0.05wt％。

图3SEM和TEM照片：(左)空白纳米微凝胶；(中)载药纳米微凝胶；(右)解交联的纳米微凝胶。样品中聚谷氨酸羧基和胱胺中氨基的摩尔比为1：1，聚谷氨酸的质量浓度为0.05wt％。

图4纳米微凝胶放置28天后，纳米微凝胶颗粒的大小和分布的变化；样品中聚谷氨酸的羧基和胱胺中氨基的摩尔比为1：1，聚谷氨酸的质量浓度为0.05wt％。

图5纳米微凝胶在pH 5.0下粒径大小及分布的变化。样品中聚谷氨酸的羧基和胱胺中氨基的摩尔比为1：1，聚谷氨酸的质量浓度为0.05wt％。

图6纳米微凝胶在不同浓度的还原剂二硫苏糖醇作用下荧光强度的变化：(A)在10mM二硫苏糖醇溶液中；(B)在5mM二硫苏糖醇溶液中。样品中聚谷氨酸的羧基和胱胺中氨基的摩尔比为1：1，聚谷氨酸的质量浓度为0.05wt％。

图7载药纳米微凝胶在pH 7.4和不同浓度的二硫苏糖醇及不同浓度还原型谷胱甘肽的条件下的释放。样品中聚谷氨酸的羧基和胱胺中氨基的摩尔比为1：1，聚谷氨酸的质量浓度为0.05wt％。

图8载药纳米微凝胶在pH 5.0和不同浓度的二硫苏糖醇及不同浓度还原型谷胱甘肽的条件下的释放。样品中聚谷氨酸的羧基和胱胺中氨基的摩尔比为1：1，聚谷氨酸的质量浓度为0.05wt％。

图9样品的细胞毒性测试结果。

具体实施方式：

实施例1：

聚谷氨酸的纯化，称取10g重均分子量为320,000的聚谷氨酸溶于1000mL的0.5MNaOH溶液中，搅拌均匀。将溶解于氢氧化钠中的聚谷氨酸溶液在磁力搅拌下缓慢滴入1.0M HCl溶液中，滴加完继续搅拌2h，过滤出沉淀，用超纯水洗涤，重复过滤和洗涤沉淀直至滤液呈中性，最后将沉淀置于真空干燥箱中干燥至恒重，得到聚谷氨酸研磨成粉末置于干燥器中备用。

实施例2：

pH和还原敏感性纳米微凝胶的制备。将提纯后的聚谷氨酸溶于0.83wt％的碳酸钠溶液，配制重量浓度为0.01wt％至0.25wt％的聚谷氨酸钠水溶液，按照聚谷氨酸钠和胱胺盐酸盐的羧基与氨基摩尔比为3:2至1:4添加胱胺盐酸盐到溶液中，室温搅拌24h，将溶液装入截留分子量为3500的透析袋，在去离子水中透析72h除去无机离子，待到溶液逐渐泛蓝色，检验出现丁达尔现象，用纳米粒度仪测试，据此判断形成了纳米微凝胶的模型；

将透析袋中溶液转入反应瓶，按照与聚谷氨酸钠中羧基等摩尔数的比例加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，在25℃下搅拌反应24h后，通过透析除去小分子催化剂，得到共价交联的纳米微凝胶，通过冷冻干燥得到干燥态白色粉末纳米微凝胶。

实施例3：

载药纳米微凝胶的制备：将干燥态纳米微凝胶溶于蒸馏水，配成浓度为0.05～0.2w％的溶液，用0.5M的碳酸氢钠调节溶液的pH值到7.4，按照干燥态纳米微凝胶重量的0.8倍加入盐酸阿霉素，磁力搅拌24h，将溶液转入透析袋(截留分子量为3500)在蒸馏水中透析，每隔四小时换新鲜蒸馏水，用电导仪监测透析液中氯化钠盐浓度，直至透析液中氯化钠盐浓度小于0.05w％。

实施例4：

载药纳米微凝胶在不同pH和不同浓度的二硫苏糖醇(DTT)和谷胱甘肽(GSH)溶液中累积释放率的测定：取3mL经透析完毕的载药纳米微凝胶溶液装入透析袋内，分别置于表1所列的介质溶液中，在恒温震荡器中37±0.5℃恒温慢速回旋震荡，隔一段时间取4mL样品测试透析液的吸光度A₄₈₃，同时补充相同体积的新鲜介质以维持透析介质体积不变。利用紫外分光光度计计算药物的释放量。

表1 pH和还原控制释放所用的介质溶液

实施例5：

纳米微凝胶的生物相容性实验测定：首先进行3T3小鼠成纤维细胞的培养，在温度为37℃的水浴锅中，迅速解冻-80℃冻存的3T3细胞，将其移入到含有RPMI(RoswellPark Memorial Institute)-1640培养液7mL中的离心管中，800rpm离心，用含有10％小牛血清的RPMI-1640培养液吹打细胞制成单细胞悬液，将其移入到50mL的培养瓶中，在37℃，5％CO₂孵箱中培养。以纳米微凝胶为研究对象,采用MTT法对其形成的交联纳米粒子的细胞毒性进行测试，以约1.2×10⁵/mL将小鼠成纤维细胞接种于96孔板,每孔100μL，培养24h，吸出每孔中的原培养液，每孔加入100μL的阴性对照液(10％小牛血清的RPMI-1640培养液)、阳性对照液(0.64％苯酚培养基)、样品组，继续置于37℃、5％CO₂培养箱中培养，分别培养24h、48h。每组设4个平行孔。取出培养板后通过倒置显微镜观察、评价细胞生长状况。后加入MTT 20μL，继续培养4h后，将培养板中的小孔内的液体吸尽后，加入二甲基亚砜，用酶标仪于570nm处测其吸光度值(A)，计算细胞存活率。

实施例6：

图2是聚谷氨酸和胱胺形成干凝胶的红外谱图。聚谷氨酸的特征吸收宽峰为3310cm^-1，而在聚谷氨酸和胱胺形成的复合物中σ_N-H一般位于3500～3100cm^-1；酰胺中的C＝O的伸缩振动峰在1680cm^-1波长处；酰胺中的N-H的变形振动δ_N-H为酰胺的第Ⅱ谱带，在1570cm^-1波长处出峰，强度较大。酰胺中的C-H的变形振动δ_C-H为酰胺的第Ⅲ谱带，出峰位置在1240cm^-1波长处。说明聚谷氨酸的羧基与胱胺中的氨基之间通过共价键作用结合形成了复合物。

实施例7：

图3从左到右依次是空白纳米微凝胶、载药纳米微凝胶和载药纳米粒子的解交联的的SEM和TEM照片。聚谷氨酸和胱胺纳米粒子的形貌为粒径大小在100nm左右，粒径分布较为均一，分散性良好，纳米微凝胶成较规整的球形；载药后粒径为110nm，粒径分布较为均一，分散性良好，纳米微凝胶成较规整的球形；另外，可以看出纳米微凝胶在还原剂二硫苏糖醇的作用下可以解交联。纳米粒子成不规则的形貌，粒径分布变宽。

实施例8：

图4是纳米微凝胶放置28天后，纳米微凝胶的粒径大小和分布的变化。可以说明，制备的纳米微凝胶稳定性高。

实施例9：

图5是纳米微凝胶在pH 5.0下粒径大小和分布的变化。可以看出pH 5.0时，纳米微凝胶的粒径有变化，说明纳米微凝胶具有pH敏感性。

实施例10：

图6是纳米微凝胶在不同浓度的还原剂二硫苏糖醇作用下荧光强度的变化。可以看出交联的纳米微凝胶可以在还原剂二硫苏糖醇作用下解交联，且还原剂二硫苏糖醇的浓度越大，解交联程度越大，荧光强度越弱。说明纳米微凝胶具有还原敏感性。

实施例11：

图7和图8分别是载药纳米微凝胶在pH 7.4和不同浓度的二硫苏糖醇及不同浓度还原型谷胱甘肽的条件下的释放及pH 5.0和不同浓度的二硫苏糖醇及不同浓度还原型谷胱甘肽的条件下的释放。可以看出载药纳米微凝胶在酸性条件下较在微碱性条件下释放快，说明该载药纳米微凝胶具有酸敏感性。同时，在含较大浓度还原剂二硫苏糖醇作用下，释放更快，释放量也较大，说明其具有还原敏感性，且在还原型谷胱甘肽的作用下，释放量更大，原因是一是GSH的还原性；二是GSH中氨基替代了阿霉素的氨基与载体的羧基发生的静电作用；两者的协同效应使还原型谷胱甘肽对药物的释放量更大。该释放有望利用正常细胞和癌细胞的谷胱甘肽浓度的不同对癌细胞进行治疗。

实施例12：

图9中为细胞毒性实验结果，细胞存活率大于100％，可以看出该纳米微凝胶是无毒的。

Claims

1.一种基于聚谷氨酸和胱胺的pH与还原敏感性的纳米微凝胶，其特征是以聚谷氨酸和胱胺为原料，首先经过聚谷氨酸和胱胺的静电相互作用制备成纳米微凝胶模型，再添加1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC.HCl)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)为催化剂，直接在水溶液中进行酰胺化交联反应，将静电相互作用转化成共价键，最后经过透析制得稳定微凝胶，其粒径为212nm，ζ电位为-16.4mV，由此维持纳米微凝胶在水中的稳定性，通过冷冻干燥可得到干燥态白色粉末纳米微凝胶。

2.一种基于聚谷氨酸和胱胺的pH与还原敏感性的纳米微凝胶的制备方法，其特征是制备过程经历了两步法：

(1)将重均分子量为320,000的聚谷氨酸溶于0.83wt％的碳酸钠溶液，配制0.01wt％至0.25wt％的聚谷氨酸钠水溶液，按照聚谷氨酸钠和胱胺盐酸盐的羧基与氨基摩尔比为3:2至1:4添加胱胺盐酸盐到溶液中，室温搅拌24h，将溶液装入截留分子量为3500的透析袋中，在蒸馏水中透析72h除去无机离子，待到溶液逐渐泛蓝色，检验出现丁达尔现象，用纳米粒度仪测试粒径，据此判断形成了纳米微凝胶的模型；

(2)将透析袋中溶液转入反应瓶，按照与聚谷氨酸钠中羧基等摩尔数的比例加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC.HCl)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，在25℃下搅拌反应24h后，将溶液装入截留分子量为3500的透析袋中，在蒸馏水中透析除去小分子催化剂，得到共价交联的纳米微凝胶，通过冷冻干燥得到干燥态白色粉末纳米微凝胶。

3.根据权利要求1所述的纳米微凝胶对阿霉素的负载及其pH控制释放的应用，其特征是：将干燥态纳米微凝胶溶于蒸馏水，配成浓度为0.05～0.2w％的溶液，用0.5M的碳酸氢钠调节溶液的pH值到7.4，按照干燥态纳米微凝胶重量的0.8倍加入盐酸阿霉素，磁力搅拌24h，将溶液转入透析袋(截留分子量为3500)在蒸馏水中透析，每隔四小时换新鲜蒸馏水，用电导仪监测透析液中氯化钠盐浓度，直至透析液中氯化钠盐浓度小于0.05w％时，将透析袋转入pH分别为7.4和5.0的缓冲溶液内进行控制释放实验，观察在不同pH介质中药物累积释放率。

4.根据权利要求1所述纳米微凝胶的还原敏感性作为药物载体的应用，其特征是：将干燥态纳米微凝胶溶于蒸馏水，配成浓度为0.05～0.2w％的溶液，用0.5M的碳酸氢钠调节溶液的pH值到7.4，按照干燥态纳米微凝胶重量的0.8倍加入盐酸阿霉素，磁力搅拌24h，将溶液转入透析袋(截留分子量为3500)在蒸馏水中透析，每隔四小时换新鲜蒸馏水，用电导仪监测透析液中氯化钠盐浓度，直至透析液中氯化钠盐浓度小于0.05w％时，分别转入不同二硫苏糖醇(DTT)浓度和谷胱甘肽(GSH)浓度的溶液内进行控制释放，这几种溶液分别为：(1)pH＝7.4，DTT浓度＝10mM；(2)pH＝7.4，DTT浓度＝5mM；(3)pH＝7.4，DTT浓度＝0mM；(4)pH＝5.0，DTT浓度＝10mM；(5)pH＝5.0，DTT浓度＝5mM；(6)pH＝5.0，DTT浓度＝0mM；(7)pH＝7.4，GSH浓度＝10mM；(8)pH＝7.4，GSH浓度＝5mM；(9)pH＝5.0，GSH浓度＝10mM；(10)pH＝5.0，GSH浓度＝5mM。