CN104926976B - 糖胺聚糖类似物及其合成方法及其在体外胚胎干细胞增殖及定向神经分化中的应用方法 - Google Patents

Abstract

新型糖胺聚糖类似物及其合成方法及其在体外胚胎干细胞增殖及定向神经分化中的应用方法,其特征在于：将对苯乙烯磺酸钠单体或/和2‑甲基丙烯酰胺吡喃葡萄糖单体按照一定比例添加到混合溶剂中，所述混合溶剂为水与氮氮二甲基甲酰胺（N,N‑Dimethylformamide）的混合物，利用可逆加成‑断裂链转移聚合（RAFT）的方法聚合分别得到若干种不同比例的对苯乙烯磺酸钠单体或/和2‑甲基丙烯酰胺吡喃葡萄糖单体的聚合物。采用RAFT合成技术利用含磺酸基团单体以及含糖单体，通过控制其相对比例调节聚合物结构，获得了具有体外促进胚胎干细胞增殖并诱导其发生高效定向神经分化的高分子物质。

Description

糖胺聚糖类似物及其合成方法及其在体外胚胎干细胞增殖及 定向神经分化中的应用方法

技术领域

本发明属于聚合物合成及其在生物医学应用领域，具体涉及一种新型糖胺聚糖类似物的合成方法，采用RAFT合成技术利用含磺酸基团单体以及含糖单体，通过控制其相对比例调节聚合物结构，获得了具有体外促进胚胎干细胞增殖并诱导其发生高效定向神经分化的高分子物质。

背景技术

糖胺聚糖(glycosaminoglycan，GAG)是一类由生物体产生的多功能性活性分子，它在细胞黏附、增殖、分化以及抗凝血等生理过程中都发挥着十分关键的作用。近年来人们发现，糖胺聚糖物质在体外条件下可以诱导胚胎干细胞的定向神经分化，这些研究对神经系统疾病的发病机理以及相关治疗策略等方面都具有非常重要的意义。然而，生物体自身合成糖胺聚糖分子结构复杂且活性不稳定，因此，通过人工合成糖胺聚糖类似物应用于生物医用材料研究和疾病治疗具有重要的科学价值和社会意义。

目前，人们制备糖胺聚糖类似物的方法主要有以下几种：

(1)通过利用简单的含有磺酸基团的小分子单体的聚合作用合成带有多磺酸基团的高分子物质。该方法比较简便，但由于糖胺聚糖分子中所含有的独特功能的糖组分未被聚合在该物质结构中，因此所获得的产物活性及功能性受到很大的限制。

(2)通过将多糖物质进行磺化处理，合成具有类似糖胺聚糖分子的磺化多糖物质。该策略可得到既含有糖单元，也含有磺酸基团的产物，但由于磺酸基团在糖分子中的修饰位置及其相对比例难以控制，因此其所获得的产物活性的稳定性也有待于进一步提高。

(3)通过严格按照糖胺聚糖分子结构中组成单元的顺序性和磺酸基团修饰位点的特异性合成磺化寡糖分子。此类化合物具有特异的生物活性结构，因此具有较高的细胞和生理调节功能。然而该技术在操作过程中需要繁琐的合成和纯化步骤，并且产率有限，所以也未得到广泛的应用。

因此，开发和研究操作简单、易于调节分子中糖单元和磺酸基团的相对比例、且产物结构可控的糖胺聚糖类似物的合成方法，并将其利用于生物医学领域，特别是体外干细胞增殖以及定向神经分化，就具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型糖胺聚糖类似物的合成方法，通过调节聚合物中两种功能基团的比例以及控制分子结构，实现在体外条件下对胚胎干细胞增殖的促进作用以及定向神经分化的诱导作用。

为了实现上述目的，本发明的技术方案为：一种新型糖胺聚糖类似物，其特征在于：将对苯乙烯磺酸钠单体和2-甲基丙烯酰胺吡喃葡萄糖单体按照一定比例添加到混合溶剂中，所述混合溶剂为水与氮氮二甲基甲酰胺(N,N-Dimethylformamide)的混合物，利用可逆加成-断裂链转移聚合(RAFT)的方法聚合分别得到若干种不同比例的对苯乙烯磺酸钠单体和2-甲基丙烯酰胺吡喃葡萄糖单体的聚合物。

进一步,所述聚合物为对苯乙烯磺酸钠单体和2-甲基丙烯酰胺吡喃葡萄糖单体按照0.5-4:1的摩尔比聚合形成的共聚物(pSG)。

控制单体对苯乙烯磺酸钠(SS)及MAG在水与DMF混合溶剂中的比例，利用RAFT方法聚合分别得到共聚物pSG。

进一步,所述聚合物的分子式为：

本发明的另一种技术方案为:一种新型糖胺聚糖类似物的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)制备2-甲基丙烯酰胺吡喃葡萄糖单体：将盐酸葡萄糖胺与甲基丙烯酰氯在含碳酸钾的甲醇溶液中反应后，对沉淀物进行纯化得到2-甲基丙烯酰胺吡喃葡萄糖单体；

(2)制备聚合物：控制对苯乙烯磺酸钠单体及2-甲基丙烯酰胺吡喃葡萄糖单体在混合溶剂中的比例，所述混合溶剂为水与氮氮二甲基甲酰胺的混合物，利用可逆加成-断裂链转移聚合方法聚合分别得到若干种不同比例的对苯乙烯磺酸钠单体和2-甲基丙烯酰胺吡喃葡萄糖单体的聚合物。

本发明的进一步的技术方案为:一种使用糖胺聚糖类似物的促进胚胎干细胞体外增殖或体外定向神经分化的应用方法，其特征在于，包括以下步骤：分别向种有胚胎干细胞的若干个培养板内各倒入一种含有所述聚合物的培养液，培养若干天。

进一步,所述培养板预先铺满明胶。

由于上述技术方案的应用，与现有技术相比，本发明具有以下突出特点：

1.本发明由于包含了较为自由的含糖基团的结构，因此具有更高的生物学活性。

2.本发明由于磺酸基团和糖单元的比例能较好地进行控制，因此可应用于不同的生物活性要求。

3.本发明所述的方法工艺简单，工艺过程容易控制。

附图说明

图1中为实施例一中所获得的糖胺聚糖类似物聚合物pSG的分子结构；

图2中为实施例一中所获得的糖胺聚糖类似物聚合物pSG的¹H-NMR谱图；

图3中为实施例一中所获得的糖胺聚糖类似物聚合物pSG的FT-IR谱图；

图4中为实施例二中利用高活性糖胺聚糖分子-肝素以及本方法合成的糖胺聚糖类似物对胚胎干细胞增殖的结果对比；

图5是实施例三中qPCR定量分析分别经过均聚物pSS、共聚物pSG与肝素培养的胚胎干细胞βIII-tubulin基因表达量；

图6是实施例三中分别经过聚合物培养的胚胎干细胞荧光染色图。

具体实施方式

以下实施例提供了新型糖胺聚糖类似物的合成方法，包括含磺酸基团单体以及含糖单体制备，聚合物的RAFT合成方法，以及单体相对比例和分子结构的调控，同时利用体外细胞增殖和神经分化检测技术验证了所获得的聚合物分子在胚胎干细胞增殖并其定向神经分化中的作用。

下面结合实施例和附图对本发明作进一步说明，但不限制本发明。

一种新型糖胺聚糖类似物的合成方法，包括以下步骤：

(1)选取含磺酸基团的分子SS与含糖基团的分子MAG作为单体，通过调节两者相对比例，利用RAFT方法制备具有不同功能基团的均聚物与共聚物(分子量在6000-20000范围内)。

(2)分别将所得聚合物加入到胚胎干细胞培养液中，对胚胎干细胞进行培养，一定时间后研究细胞在不同聚合物环境下增殖情况。

(3)分别将所得聚合物加入到胚胎干细胞培养液中，对胚胎干细胞进行培养，一定时间后研究细胞在不同聚合物环境下定向神经分化情况。

本发明的原理是：采用RAFT合成的方法，利用含磺酸基团单体以及含糖单体，通过控制其相对比例调节聚合物结构，合成分子中含有磺酸基团和糖单元两种糖胺聚糖功能组分的聚合物，并利用该聚合物在体外条件下促进胚胎干细胞的增殖以及定向神经分化。

一种新型糖胺聚糖类似物的合成方法，包括以下步骤：

(1)制备单体2-甲基丙烯酰胺吡喃葡萄糖(MAG)：盐酸葡萄糖胺与甲基丙烯酰氯在含碳酸钾的甲醇溶液中反应后，对沉淀物进行纯化得到单体MAG；

(2)制备聚合物：控制单体对苯乙烯磺酸钠(SS)及MAG在水与DMF混合溶剂中的比例，利用RAFT方法聚合分别得到均聚物pSS、pMAG及共聚物pSG。

实施例一

(1)制备单体2-甲基丙烯酰胺吡喃葡萄糖(MAG)：盐酸葡萄糖胺与甲基丙烯酰氯在含碳酸钾的甲醇溶液中冰浴条件下反应3至4小时，之后抽滤并旋蒸得到沉淀物，并对沉淀物进行提纯及干燥，得到单体MAG。

(2)选取SS与MAG为单体，在H2O/DMF(1/1)混合溶剂中进行RAFT聚合，调节单体初始投料比分别得到均聚物pSS、pMAG与共聚物pSG。

(3)通过核磁与红外对所得聚合物进行表征。

结果如图1-3所示，聚合物pSG的¹H-NMR谱图和FT-IR谱图。

将聚合物分子用于促进胚胎干细胞体外增殖，包括以下步骤：

(1)将胚胎干细胞种于预先铺满明胶的培养板上，并在分别含有三种聚合物的培养液中培养20天；

(2)对培养20天后的细胞进行MTT测试，表征在含不同聚合物的培养环境下细胞增殖情况，并对其进行比较。

实施例二

(1)将胚胎干细胞种于预先铺满明胶的培养板上，加入分别含有1μg/mL的三种聚合物或肝素的干细胞培养液环境中培养10天与20天。

(2)弃去培养物中溶液，用含有3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)的细胞培养液处理胚胎干细胞4小时，吸去MTT细胞培养液，加入二甲基亚砜(DMSO)，溶解活细胞中生成的甲瓒晶体。

(3)将溶解有甲瓒晶体的DMSO溶液转移至新的培养板中，在酶标仪上于490nm读取各孔吸光值。

结果如图4所示，胚胎干细胞分别在含有所得聚合物的培养液环境中培养10天及20天后增殖行为情况。

将聚合物分子用于促进胚胎干细胞体外定向神经分化，包括以下步骤：

(1)将胚胎干细胞种于预先铺满明胶的培养板上，并在分别含有三种聚合物的培养液中培养20天；

(2)对培养20天后的细胞进行βIII-tubulin免疫荧光染色实验，通过图像定性比较在含不同聚合物的培养环境下细胞神经定向分化情况。

(3)对培养20天后的细胞进行荧光定量PCR实验，定量比较在含不同聚合物的培养环境下细胞神经定向分化情况。

实施例三

(1)将胚胎干细胞种于预先铺满明胶的培养板上，加入分别含有1μg/mL的聚合物的干细胞培养液环境中培养20天。

(2)吸除原培养液，用4％多聚甲醛溶液、0.1％Triton X-100/PBS溶液及3％牛血清白蛋白(BSA)溶液依次对细胞进行固定、破膜及封闭处理，之后，利用含有神经分化标志物βIII-tubulin的特异性抗体对细胞进行免疫荧光染色处理。利用DAPI试剂对细胞核进行染色。利用荧光显微镜观察细胞分化情况。

(3)利用RNA全提取试剂盒提取培养20天后的细胞中全部RNA，并逆转录为互补DNA。利用steponeplus实时PCR系统对其进行qPCR实验。

结果如图3所示。

如图5和图6所示，胚胎干细胞在分别含有三种聚合物或肝素的培养液环境中培养20天后的神经分化情况。

图5是qPCR定量分析分别经过聚合物pSS、pSG与肝素培养的胚胎干细胞βIII-tubulin基因表达量；

图6是分别经过聚合物培养的胚胎干细胞荧光染色图(绿色：βIII-tubulin；蓝色：DAPI)(标尺：25μm)；图中蓝色代表细胞核，绿色代表神经分化标记蛋白β3-tubulin的表达情况，图中绿色区域越多，表明β3-tubulin蛋白的表达量越大，神经分化程度越高。从局部放大图C中可以看出，培养基中含共聚物pSG的细胞出现了神经丝，表明pSG对胚胎干细胞神经分化的良好促进作用，这种作用比肝素还高。

Claims (5)

1.一种糖胺聚糖类似物，其特征在于：将对苯乙烯磺酸钠单体和2-甲基丙烯酰胺吡喃葡萄糖单体按照一定比例添加到混合溶剂中，所述混合溶剂为水与氮氮二甲基甲酰胺的混合物，利用可逆加成-断裂链转移聚合的方法聚合分别得到若干种不同比例的对苯乙烯磺酸钠单体和2-甲基丙烯酰胺吡喃葡萄糖单体的聚合物；

所述聚合物的分子式为：其中聚合物 的分子量在6000-20000范围内。

2.根据权利要求1所述的糖胺聚糖类似物，其特征在于：所述聚合物为对苯乙烯磺酸钠单体和2-甲基丙烯酰胺吡喃葡萄糖单体按照0.5-4:1的摩尔比聚合形成的共聚物。

3.一种如权利要求1或2所述糖胺聚糖类似物的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)制备2-甲基丙烯酰胺吡喃葡萄糖单体：将盐酸葡萄糖胺与甲基丙烯酰氯在含碳酸钾的甲醇溶液中反应后，对沉淀物进行纯化得到2-甲基丙烯酰胺吡喃葡萄糖单体；

(2)制备聚合物：控制对苯乙烯磺酸钠单体及2-甲基丙烯酰胺吡喃葡萄糖单体在混合溶剂中的比例，所述混合溶剂为水与氮氮二甲基甲酰胺的混合物，利用可逆加成-断裂链转移聚合方法聚合分别得到若干种不同比例的对苯乙烯磺酸钠单体和2-甲基丙烯酰胺吡喃葡萄糖单体的聚合物。

4.一种使用如权利要求2所述的糖胺聚糖类似物的促进胚胎干细胞体外增殖或体外定向神经分化的应用方法，其特征在于，包括以下步骤：分别向种有胚胎干细胞的若干个培养板内各倒入一种含有所述聚合物的培养液，培养若干天。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述培养板预先铺满明胶。