CN115386026B - 一种聚乙二醇衍生物及类肝素聚合物异质图案化表面及其制备方法与细胞图案化的应用 - Google Patents
一种聚乙二醇衍生物及类肝素聚合物异质图案化表面及其制备方法与细胞图案化的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种聚乙二醇衍生物及类肝素聚合物异质图案化表面及其制备方法与细胞图案化。在PDMS‑Br表面修饰聚乙二醇衍生物或者类肝素聚合物，得到修饰的PDMS表面；再将图案化金膜转印到修饰的PDMS表面，最后通过自组装将巯基类肝素聚合物或者巯基聚乙二醇衍生物组装在金膜表面，得到聚乙二醇衍生物及类肝素聚合物异质图案化表面。当pSS和pOEGMA异质图案化分布在同一表面上时，表面具有引导血管细胞图案化生长的趋势。随着时间推移，可观察到PS‑O和PO‑S表面对HUVECs的细胞图案化生长的引导效果减弱，而对HUVSMCs的细胞图案化生长的引导效果有所增强，最终在48 h得到了较好的HUVSMCs细胞图案化分布表面。
Description
技术领域
本发明属于生物材料表界面技术，具体涉及一种聚乙二醇衍生物及类肝素聚合物异质图案化表面及其制备方法与细胞图案化。
背景技术
生物材料表界面的性质，如表面浸润性、自由能、粗糙度、化学组成、表面形貌等都会影响生物材料的功能[ Yao X., Peng R., Ding J., Cell–material interactionsrevealed via material techniques of surface patterning[J]. Adv. Mater., 2013,25, 37, 5257-5286]。为保证材料的正常使用，研究者们需要对材料的物理、化学和生物特性进行调整。调节材料特性的一种策略是表面改性，即在材料表界面通过物理、化学手段，对材料表界面性质进行调整，从而赋予表面特定的生物功能。表面改性是在不改变材料本体性质的情况下，调控机体-材料相互作用和改善材料生物相容性的有效途径[Bauer S.,Schmuki P., von der Mark K., et al., Engineering biocompatible implantsurfaces: part I: materials and surfaces[J]. Prog. Mater Sci., 2013, 58, 3,261-326]。 细胞图案化是一种用具有特定性能的化学或生物组分或特殊形貌图案的表面来调控细胞行为，使细胞在二维平面或三维空间中选择性黏附生长的一种技术。细胞在体内处于物理化学信号高度交织的复杂环境，需要识别环境信号并对刺激作出响应性行为。细胞图案化有助于简化研究体系，明确细胞在较复杂信号环境中的行为机制。常规的细胞图案化策略是利用细胞对微环境差异的识别能力，对材料表面的化学组成或拓扑结构等性质进行改性，来分割基底材料的信号区域，以此来诱导细胞黏附行为，当细胞在特定区域黏附增殖到一定程度后便会得到预期的图案。通过一系列细胞图案化相关研究，可以进一步了解化学组成和表面拓扑形貌对细胞行为的影响，深入研究细胞-材料相互作用的机制。
发明内容
本发明构建了含磺酸基团类肝素聚合物pSS和聚乙二醇衍生物pOEGMA的异质图案化表面，引导细胞区域化生长，并对表面化学组成分布和图案对细胞行为的影响进行了研究。
本发明采用如下技术方案：
一种聚乙二醇衍生物及类肝素聚合物异质图案化表面的制备方法，包括以下步骤，在PDMS-Br表面修饰聚乙二醇衍生物或者类肝素聚合物，得到修饰的PDMS表面；再将图案化金膜转印到修饰的PDMS表面，最后通过自组装将巯基类肝素聚合物或者巯基聚乙二醇衍生物组装在金膜表面，得到聚乙二醇衍生物及类肝素聚合物异质图案化表面。
本发明中，类肝素聚合物为pSS，其分子量为0.8× 104～2× 104 g mol-1；聚乙二醇衍生物为pOEGMA，其分子量为0.5× 104～1.2× 104 g mol-1。
本发明中，含溴聚二甲基硅氧烷（PDMS-Br）表面为平整表面；图案化金膜为圆阵列阵图案化金膜。在制备聚二甲基硅氧烷（PDMS）的原料中加入10-十一烯-2-溴异丁酸酯，制备PDMS-Br，具体制备PDMS的原料以及制备方法为常规技术。
本发明中，修饰的PDMS表面带有的聚合物与自组装时采用的聚合物不同，如此得到异质图案化表面。具体的，在PDMS-Br表面修饰聚乙二醇衍生物，得到修饰的PDMS表面；再将图案化金膜转印到修饰的PDMS表面，最后通过自组装将巯基类肝素聚合物组装在金膜表面，得到聚乙二醇衍生物及类肝素聚合物异质图案化表面。在PDMS-Br表面修饰类肝素聚合物，得到修饰的PDMS表面；再将图案化金膜转印到修饰的PDMS表面，最后通过自组装将巯基聚乙二醇衍生物组装在金膜表面，得到聚乙二醇衍生物及类肝素聚合物异质图案化表面。
本发明中，先通过RAFT聚合制备带有二硫酯键的类肝素聚合物，再用乙醇胺将类肝素聚合物末端的二硫酯键还原为巯基，得到巯基类肝素聚合物。先通过RAFT聚合制备带有二硫酯键的聚乙二醇衍生物，再用乙醇胺将聚乙二醇衍生物末端的二硫酯键还原为巯基，得到巯基聚乙二醇衍生物。
本发明中，将PDMS-Br浸入含有类肝素聚合物单体、光引发剂的溶液中，然后光照反应，在PDMS-Br表面修饰类肝素聚合物。将PDMS-Br浸入含有聚乙二醇衍生物单体、光引发剂的溶液中，然后光照反应，在PDMS-Br表面修饰聚乙二醇衍生物。
本发明中，将转印了图案化金膜的PDMS浸入巯基类肝素聚合物或者巯基聚乙二醇衍生物的溶液中10～25小时，将巯基类肝素聚合物或者巯基聚乙二醇衍生物组装在金膜表面。图案化金膜及其转印为常规技术。
本发明聚乙二醇衍生物及类肝素聚合物异质图案化表面在调节血管细胞行为中的应用，或者本发明聚乙二醇衍生物及类肝素聚合物异质图案化表面在制备调节血管细胞行为材料中的应用。本发明pSS和pOEGMA异质图案化表面具有引导血管细胞图案化生长的趋势。当pSS和pOEGMA异质图案化分布在同一表面上时，表面具有引导血管细胞图案化生长的趋势。随着时间推移，可观察到PS-O和PO-S表面对HUVECs的细胞图案化生长的引导效果减弱，而对HUVSMCs的细胞图案化生长的引导效果有所增强，最终在48 h得到了较好的HUVSMCs细胞图案化分布表面。
本发明聚乙二醇衍生物及类肝素聚合物异质图案化表面在促进内皮细胞黏附增殖和抑制平滑肌细胞黏附增殖中的应用，或者本发明聚乙二醇衍生物及类肝素聚合物异质图案化表面在制备促进内皮细胞黏附增殖和抑制平滑肌细胞黏附增殖材料中的应用。
本发明聚乙二醇衍生物及类肝素聚合物异质图案化表面在提高血管细胞存活中的应用，或者本发明聚乙二醇衍生物及类肝素聚合物异质图案化表面在制备提高血管细胞存活材料中的应用。
本发明通过可见光引发接枝聚合法和金-硫键自组装法分别在PDMS和金膜区域上修饰含磺酸基团的类肝素聚合物pSS和聚乙二醇衍生物pOEGMA，以制得pSS和pOEGMA异质图案化分布的表面，并研究了血管细胞在异质图案化表面的黏附及生长行为。具体优点如下：
（1）与PS-S表面相比，PO-O表面对HUVECs和HUVSMCs的黏附及增殖具有明显的抑制作用。当PS-S表面HUVECs和HUVSMCs的黏附增殖数量随时间的延长而增加时，PO-O表面对HUVECs黏附及增殖的抑制作用会随着时间的延长而减弱，而对HUVSMCs黏附及增殖的抑制作用会随时间的延长而加强。随着时间的延长，PO-O表面呈现出一定的血管细胞选择性趋势。
（2）当pSS和pOEGMA异质图案化分布在同一表面上时，异质图案化表面具有引导血管细胞图案化生长的趋势。两种异质图案化表面对HUVECs的图案化引导效果在4 h较明显，但在48 h时，图案化效果减弱，在pSS和pOEGMA区域都可以观察到状态良好的HUVECs；而对HUVSMCs的图案化分布引导效果则是随时间的延长而更明显，最终在48 h具有较明显的HUVSMCs细胞图案化分布的趋势。
附图说明
图1为类肝素聚合物异质图案化表面PS-O的（a）制备示意图及（b）PS-S、PO-O、PS-O和PO-S样品表面的化学组分分布示意图。
图2为聚合物pSS-SH的（a）合成反应式，（b）红外光谱图，（c）紫外光谱图，（d）核磁共振谱图；聚合物pOEGMA-SH的（a`）合成反应式；（b`）红外光谱图；（c`）紫外光谱图；（d`）核磁共振谱图。
图3为聚乙二醇衍生物及类肝素聚合物的异质图案化表面（PS-O和PO-S）制备过程中的静态水接触角变化。
图4为PDMS-Br、PDMS-pSS和PDMS-pOEGMA表面的红外光谱图。
图5为PO-S样品表面的Si、Au、O、S元素EDS面扫描图。
图6为HUVECs在PS-S、PO-O、PS-O和PO-S表面培养4 h和48 h后的死活细胞荧光染色照片。
图7为HUVECs在PS-S、PO-O、PS-O和PO-S表面的细胞活性（平均值±标准偏差，n=6，*p＜0.05，***p＜0.001）。
图8为HUVECs在PS-S、PO-O、PS-O和PO-S表面培养4 h和48 h后的（a）形貌图和（b）细胞密度（平均值±标准偏差，n=6，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001）。
图9为 HUVECs在PS-S、PO-O、PS-O和PO-S表面培养4 h和48 h后的（a）铺展面积和（b）细胞纵横比（平均值±标准偏差，n=6，**p＜0.01，***p＜0.001）。
图10为HUVSMCs在PS-S、PO-O、PS-O和PO-S表面培养4 h和48 h后的死活细胞荧光染色照片。
图11为 HUVSMCs在在PS-S、PO-O、PS-O和PO-S表面的细胞活性（平均值±标准偏差，n=6，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001）。
图12为 HUVSMCs在PS-S、PO-O、PS-O和PO-S表面培养4 h和48 h后的（a）形貌图和（b）细胞密度（平均值±标准偏差，n=6，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001）。
图13为HUVSMCs在PS-S、PO-O、PS-O和PO-S表面培养4 h和48 h后的（a）铺展面积和（b）细胞纵横比（平均值±标准偏差，n=6，**p＜0.01，***p＜0.001）。
具体实施方式
本发明采用的原料都为市售产品，具体制备操作以及测试为常规技术。文中所有实验独立进行，每个实验中每个条件至少含有三个平行样本。实验结果均采用平均值±标准差表示，用T.TEST法比较实验组与对照组的显著性差异（*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001）。
其它试剂均购买于国药集团化学试剂有限公司，并且都经常规纯化后使用。
合成例
10-十一烯-2-溴异丁酸酯的合成。称取10-十一烯-1-醇（2.12 g，12.5 mmol）和三乙胺（1.38 g，13.7 mmol），置于50 mL圆底烧瓶中，在15 mL无水二氯甲烷中完全溶解。在氮气保护和冰浴条件下搅拌30分钟后，保持冰浴和常规搅拌，将BIBB（1.7 mL，13.7 mmol）滴加入烧瓶中。滴加完毕后，继续保持冰浴搅拌条件1 h，然后将反应体系移至室温条件，搅拌过夜。反应完成后，抽滤除去反应副产物三乙胺盐酸盐。将反应液转移至分液漏斗，加入饱和碳酸氢钾溶液，震荡以洗涤反应液。收集反应液，弃去废液层，并重复洗涤3次。最后一次洗涤收集时，应收集至干燥的容器中，加入无水硫酸镁静置干燥并旋干。用硅胶柱层析法纯化粗产物，展开剂为正己烷:乙酸乙酯=20:1（v/v），将纯化产物旋干，得到淡黄色液体，在真空干燥箱中常温干燥48 h。1H NMR（400 MHz，CD3OD），δ（ppm）: 5.79-5.87（m，1H，=CH），4.89-5.02（d，2H，=CH 2），4.19（t，2H，-CH 2O），2.06（m，2H，=CHCH 2），1.93（s，6H，-CH 3），1.70（m，2H，-CH 2CH2O），1.41（m，2H，-CH 2CH2CH2O），1.35（m，10H，-CH 2CH 2CH 2CH 2CH 2-）。
类肝素聚合物的合成。类肝素聚合物聚苯乙烯磺酸钠（pSS）通过可逆-加成断裂链转移聚合法（RAFT）制得。聚合中摩尔投料比为[单体]0:[链转移剂]0:[引发剂]0=300:2:1。将单体苯乙烯磺酸钠（SS）（370.5 mg，1.8 mmol）、链转移剂CPADB（3.35 mg，0.012 mmol）和引发剂AIBN（1 mg，0.006 mmol）溶解于5 mL溶液中（DMF:H2O=1:1，v/v）。通入氮气30 min后，将反应瓶转入手套箱中，在70 ℃油浴环境下反应12 h。反应结束后，将反应瓶取出，打开瓶塞，使反应液接触空气终止聚合。将产物转移入透析袋（截留分子量3500 Da）透析三天，然后置于冷冻干燥机中冻干，最终制得粉红色絮状产物pSS。
带有绿色荧光标记的pSS制备过程与上述过程类似，但需在加入反应试剂的同时加入5%的荧光素O-甲基丙烯酸酯，并全程在避光条件下进行。
类肝素聚合物的巯基化。取聚合物pSS溶于纯水中，常温搅拌下滴加乙醇胺并反应5 h，将聚合物末端的二硫酯键还原成巯基（-SH）。反应结束后，将产物转移入透析袋（截留分子量3500 Da）透析三天，然后置于冷冻干燥机中冻干，最终制得的白色絮状物为巯基化pSS（pSS-SH）。
pOEGMA通过可逆-加成断裂链转移聚合法（RAFT）制得。聚合中摩尔投料比为[单体]0:[链转移剂]0:[引发剂]0=100:2:1。将单体OEGMA（1.188 g，2.5 mmol），链转移剂CPADB（14 mg，0.05 mmol），引发剂AIBN（4.1 mg，0.025 mmol）溶解于8 mL溶液中（DMF:H2O=1:1，v/v）。通入氮气30 min完全除氧后，将反应瓶转入手套箱中，在70 ℃油浴环境下反应12 h。待反应结束后，将反应瓶取出，打开瓶塞使反应液接触空气终止聚合。将产物转移入透析袋（截留分子量3500 Da）透析三天，然后置于冷冻干燥机中冻干，最终制得粉红色粘稠液态产物pOEGMA。然后，取一定量的聚合物pOEGMA溶于少量超纯水中，常温搅拌下滴加乙醇胺并反应3-6 h，以将聚合物末端的二硫酯键还原成巯基（-SH）。反应结束后，将产物转移入透析袋（截留分子量3500 Da）透析三天，然后置于冷冻干燥机中冻干，最终制得的白色絮状物为巯基化pOEGMA（pOEGMA-SH）。
PDMS和PDMS-Br表面的制备，原料以及制备方法为常规技术。将Sylgard 184中的组分A（含预聚物和铂催化剂的混合物）和组分B（交联剂，含乙烯基和Si-H的聚二甲基硅氧烷预聚混合物）以质量比10:1的比例混合并充分搅拌。搅拌均匀后，将混合物在真空干燥箱内抽真空脱泡，然后浇筑在图案化硅模板（直径300 μm的圆阵列）上，再次用真空干燥箱脱泡后，置于60 ℃烘箱，固化8 h后取出，得到图案化PDMS，切割待用。对于平整PDMS，将混合物在真空干燥箱内抽真空脱泡后，浇筑在直径为9 cm的一次性培养皿中，再次用真空干燥箱脱泡后，置于60 ℃烘箱，固化8 h后取出，得到平整PDMS，切割待用。
PDMS-Br表面的制备与上述类似。将Sylgard 184的A组分和B组分与合成的C组分10-十一烯-2-溴异丁酸酯以质量比10:1:0.13的比例混合搅拌均匀作为混合物，抽真空脱泡后，浇筑在直径为9 cm的一次性培养皿中，在60 ℃烘箱固化8 h后取出，切割待用。
实施例一
类肝素聚合物在PDMS-Br表面的修饰。将SS（1.2372 g，6 mmol）溶解于12 mL溶剂（甲醇:水=1:2，v/v），避光加入光引发剂Mn2(CO)10（5 mg，0.0128 mmol），并向反应溶液中投入平整PDMS-Br样品，然后向反应体系中通氮气30min，将反应瓶密封，50 ℃下，可见光照射下反应1 h（I420nm = 0.2 mW/cm2）。反应结束后，用水和乙醇交替清洗样品三次，经真空干燥箱干燥得到pSS修饰的PDMS表面（PDMS-pSS）。
pOEGMA在PDMS-Br表面的修饰过程具体为：将OEGMA（2.1375 g，4.5 mmol）溶解于10 mL甲醇，再用1.5 mL超纯水稀释反应液。避光加入光引发剂Mn2(CO)10（5 mg，0.0128mmol），并向反应溶液中投入平整PDMS-Br样品。将反应瓶口密封后，向反应体系中通氮气直至将氧气除尽。将反应瓶密封，在室温条件可见光照射下反应20 min（I420nm=0.2 mW/cm2）。反应结束后，用水和乙醇交替清洗样品三次，经真空干燥箱干燥，得到pOEGMA修饰的PDMS表面（PDMS-pOEGMA）。
本发明中，类肝素聚合物为pSS，聚乙二醇衍生物为pOEGMA，在图案表面的化学结构式参见图1。
金膜的制备。在冰浴条件下，将1 g氯金酸加入20 mL超纯水中，常规搅拌下加水至50 mL，得到氯金酸溶液。称取碳酸氢钾（0.2 g，2 mmol）和葡萄糖（0.02 g，0.112 mmol）于离心管中，加入3 mL超纯水、上述氯金酸溶液并超声除气泡，再用NaOH溶液将混合溶液的pH调至9.5，然后除去混合溶液中的气泡，将平整PDMS或图案化PDMS浸入混合溶液，于37 ℃静置6 h。取出后得到平整金膜或图案化金膜模板，在超纯水中保存，取用时裁切成合适大小。
图案化金膜的转印。将聚合物改性的PDMS样品（PDMS-pSS、PDMS-pOEGMA）和图案化金膜模板正面朝上，置于6孔板中。用等离子体清洗机照射70 s，使表面羟基化。取出后将两种样品的被照射面贴合，用100 g砝码施加压力，在60 ℃烘箱中静置5 min。取出后，将紧贴的两个样品表面互相剥离，图案化金膜即可成功转印至各种改性PDMS样品表面。
将上述图案化金膜模板替换为平整金膜模板，其余一样，得到平整金膜改性PDMS样品。
巯基化聚合物的自组装。将上述制得的巯基化聚合物溶解于超纯水中，配成2 mg/mL的溶液。将转印了平整金膜或图案化金膜的改性PDMS样品浸泡在巯基化聚合物溶液中，室温下浸泡过夜。用超纯水清洗三次后真空干燥，从而在平整金膜或图案化金膜表面引入聚合物。
聚乙二醇衍生物及类肝素聚合物的异质图案化表面的构建，是通过在PDMS-Br表面的可见光引发接枝聚合，以及巯基化聚合物在沉积金膜表面的自组装来实现的。本实施例所选用的异质分布的聚合物为pSS和pOEGMA。如图1（a）所示，以PS-O的制备方法为例，首先，通过可见光引发接枝聚合法，在平整的PDMS-Br表面接枝pSS，制得PDMS-pSS表面。同时，通过氯金酸还原法，在图案化PDMS（直径300 μm的圆阵列）上沉积金膜，并将图案化金膜转印到PDMS-pSS表面。最后，通过金-硫键自组装将pOEGMA-SH组装到金膜覆盖的区域从而制备得到聚乙二醇衍生物和类肝素聚合物异质图案化分布的PS-O样品。
用上述类似方法，在PDMS区域修饰pOEGMA，在金膜区域修饰pSS即可得到PO-S样品。用同样的方法还可以获得在PDMS和金膜区域都修饰了pSS的表面（PS-S）和在PDMS和金膜区域都修饰了pOEGMA的表面（PO-O）。图1（b）为本实施例各样品表面PS-S、PO-O、PS-O和PO-S表面的化学组分分布示意图。
所有合成单体和聚合物都通过核磁共振氢谱（1H-NMR）进行表征。聚合物还通过傅里叶红外光谱仪、紫外光谱仪、GPC表征。聚合物在表面的修饰通过水接触角仪、傅里叶红外光谱仪、EDS表征。通过RAFT聚合制备带有二硫酯键的类肝素聚合物pSS和聚乙二醇衍生物pOEGMA。然后，用乙醇胺将末端的二硫酯键还原为巯基。
图2（a）为pSS-SH的合成步骤，pSS通过RAFT聚合法合成，然后被乙醇胺还原为pSS-SH。图2（b）为pSS-SH的FTIR谱图，1171 cm-1处为S=O的反拉伸振动峰，1625 cm-1处为苯基拉伸振动峰。图2（c）为紫外光谱图，pSS聚合物所带有的二硫酯键信号峰（310 nm左右）在巯基化聚合物的谱图中消失，说明二硫酯键被成功还原为巯基。图2（d）为pSS-SH的1H NMR谱图。其中，δ6.7和δ7.6的峰分别对应侧链苯环上的H（位置1和2）。δ1.7对应聚合物主链中亚甲基和次甲基上的H（位置3和4））。pSS-SH聚合物的分子量为15000，分子量分布为1.1（表1）。
图2（a`）为pOEGMA-SH的合成步骤。图2（b`）为pOEGMA-SH的FTIR谱图，1727 cm-1处为C=O的伸缩振动峰。图2（c`）为紫外光谱图，pOEGMA聚合物所带有的二硫酯键信号峰（310nm左右）在pOEGMA-SH的谱图中消失，说明二硫酯键被成功还原为巯基。图2（d`）为pOEGMA-SH的1H NMR谱图，1（δ1.9）的峰为主链亚甲基H；2（δ0.9）的峰为主链甲基H ；3（δ4.1）和4（δ3.7）为侧链上的亚甲基H；5（δ3.7）的峰为侧链端基甲基H。
通过凝胶渗透色谱仪测得pSS-SH和pOEGMA-SH的分子量分别为1.5 × 104和1.0× 104，分子量分布分别为1.1和1.2（表1）。
以上数据表明pSS-SH和pOEGMA-SH聚合物制备成功。
实施例二 水接触角测试
聚乙二醇衍生物及类肝素聚合物的异质图案化表面的浸润性通过静态水接触角测试来表征。图3展示了样品表面制备过程中的水接触角变化。黑色折线图表示异质图案化PS-O表面制备过程中的水接触变化。PDMS-Br的水接触角为108°，经过第一步可见光引发接枝聚合在表面修饰pSS后，所得的PDMS-pSS表面的水接触角下降至22°，然后，通过转印步骤，向表面引入了图案化金膜，由于表面图案化结构的影响，表面的水接触角上升到了90°，最后，通过自组装将pOEGMA-SH修饰在图案化金膜区域上，最终得到的PS-O水接触角下降至63°。红色折线图表示异质图案化PO-S表面制备过程中的水接触变化。经过可见光引发接枝聚合后，PDMS-pOEGMA表面的水接触角为42°，图案化金膜的引入使表面水接触角上升至80°，自组装了pSS-SH后，最终得到的PO-S表面水接触角下降至70°。
实施例三红外光谱测试
如图4所示，与未修饰的PDMS-Br表面相比，PDMS-pSS表面在1186 cm-1出现S=O反对称拉伸振动峰，在1630 cm-1出现苯基拉伸振动峰；PDMS-pOEGMA表面在1728 cm-1出现C=O伸缩振动峰。FTIR数据表明，PDMS表面上成功修饰了不同的聚合物。
实施例四 EDS面扫描分析
通过EDS面扫描分析对异质图案化表面进行元素分布表征，获得了直观的元素分布数据。以PO-S样品为例，该样品在PDMS区域修饰了pOEGMA，在Au区域自组装修饰了pSS。Si元素为PDMS特征元素，O元素为pOEGMA特征元素，Au元素为金膜特征元素，S元素为pSS特征元素。如图5所示，Si和O信号分布整个表面，在300 μm圆内的区域（PDMS-pOEGMA）的Si和O信号更强。Au和S信号均匀分布在圆外的区域，而在圆内的区域信号相对弱很多，呈图案化分布状态，表明pSS成功自组装在了金膜覆盖区域。
实施例五 HUVECs在样品表面的活性
将HUVECs以25000 cells/cm2密度种在样品表面，在5% CO2的37 ℃恒温培养箱中孵育4 h和48 h。孵育完成后，吸出细胞培养基，用Calcein-AM（染活细胞显绿色荧光）和PI（染死细胞显红色荧光）混合染色液（用ECM稀释）处理样品表面，在37 ℃恒温培养箱中孵育20 min。吸出废液后立即用倒置荧光显微镜拍摄样品表面细胞死活染色荧光图。每组样品三个平行样，至少取10张照片，用Image J计算活细胞和死细胞的数量，并计算比例。将HUVECs种植在图案化的样品表面，孵育4 h和48 h后用Calcein-AM和PI的混合染色液对样品表面的死活细胞同时染色。通过对死活细胞进行计数，并利用公式计算细胞活性：细胞活性（%）= 活细胞数/（活细胞数 + 死细胞数）× 100%。
图6为HUVECs在PS-S、PO-O、PS-O和PO-S样品表面孵育4 h和48 h后的细胞死活染色情况。活细胞呈绿色荧光，死细胞呈红色荧光。图7为HUVECs在各样品表面孵育4 h和48 h后的细胞活性。通过对死活细胞进行计数，并利用公式计算细胞活性：细胞活性（%）= 活细胞数/（活细胞数 + 死细胞数）× 100%。
如图6所示，HUVECs在样品表面孵育4 h后，PS-S表面黏附的活细胞分布均匀，死细胞数量非常少，细胞活性为96%（图7）。与PS-S表面相比，PO-O表面HUVECs的分布依然均匀，但活细胞数量较少，表面的细胞活性与PS-S表面相比显著降低，为75%（图7）。在异质图案化的PS-O表面，活细胞主要分布在圆内的磺酸基团修饰区域，而异质图案化的PO-S表面的活细胞主要分布在圆外的磺酸基团修饰区域。PS-O和PO-S的HUVECs活性分别为94%和93%，略低于PS-S表面。
如图6所示，当孵育时间延长至48 h后，PS-S的活细胞数量增加，且分布均匀，表面的HUVECs活性上升至98%（图7）。与PS-S表面相比，PO-O表面的活细胞数量下降了29%（图7）。在聚合物异质图案化表面，PS-O表面的活细胞主要分布在pSS修饰区域，而PO-S表面的活细胞在两种聚合物修饰区域都有分布（图6）。PS-O和PO-S表面的HUVECs活性分别为95%和96%，略低于PS-S表面。
实施例六 HUVECs在样品表面的黏附、增殖和铺展
将HUVECs以25000 cells/cm2密度种在样品表面，在5% CO2的37 ℃恒温培养箱中孵育4 h和48 h。孵育完成后，用磷酸盐缓冲溶液（PBS）短时间浸泡样品一次。用4%多聚甲醛固定细胞15 min后，用PBS清洗残留的多聚甲醛三次。加入0.1% Triton X-100静置5 min以对细胞进行破膜处理，用PBS清洗三次。然后，用3% BSA的PBS溶液处理样品表面40 min。用Phalloidin-FITC避光染色40 min，用PBS清洗三次，再用DAPI避光染色5 min，用PBS短时间清洗样品两次后，再用PBS浸泡样品10 min彻底清洗样品，最后将PBS吸干。将样品正面朝下置于载玻片上，用倒置荧光显微镜拍摄样品表面细胞的荧光图。每组样品三个平行样，至少取10张照片，用Image J计算细胞密度、铺展面积和纵横比。
将HUVECs种植在PS-S、PO-O、PS-O和PO-S样品表面，研究了HUVECs在表面的黏附和增殖情况。图8展示了细胞在各样品表面培养4 h和48 h后的细胞生长形貌和密度。图9展示了各样品表面细胞的铺展面积和细胞纵横比。
如图8（a）所示，HUVECs在各样品表面孵育4 h后，HUVECs细胞在PS-S表面均匀黏附，呈多边形状态，细胞黏附密度为122 cells/mm2（图8（b））。与之对比，PO-O表面的HUVECs黏附量极低，且都呈收缩状态，细胞密度为5 cells/mm2，表明PO-O具有显著的抑制HUVECs细胞黏附的能力。对于聚合物异质图案化表面，在PS-O表面的HUVECs趋向于黏附在圆内的pSS修饰区域，而在圆外的pOEGMA区域黏附较少，细胞主要呈现多边形或梭形。在PO-S表面上，HUVECs几乎都黏附在圆外的pSS修饰区域，细胞多呈球形，相较于PS-O表面呈收缩状态。PS-O和PO-S的HUVECs黏附密度分别为144 cells/mm2和169 cells/mm2，PS-O的HUVECs黏附密度显著低于PO-S表面。此外，PS-O和PO-S的HUVECs黏附密度均高于均质图案化表面，说明pSS和pOEGMA异质图案化分布的表面更利于材料表面早期的HUVECs黏附。
如图8（a）所示，当HUVECs在样品表面孵育时间达到48 h时，PS-S表面的HUVECs分布均匀，呈多边形铺展状态，在金膜区域生长的部分细胞呈略微卷曲的状态。与4 h的细胞数量相比，PS-S在孵育48 h后的HUVECs密度明显增加，达到199 cells/mm2。PO-O表面的HUVECs多呈略微铺展和卷曲状态，细胞密度为56 cells/mm2，表明PO-O表面对HUVECs的增殖具有一定抑制作用。Shi等人的研究中，与未修饰表面相比， pOEGMA修饰的光滑表面对肝细胞的黏附具有很强的抑制作用，细胞密度降低了92.8%，而具有一定粗糙度的pOEGMA修饰表面虽然对细胞也呈现出一定抑制作用，但是细胞数量的下降量仅为51.1%，说明特定形貌的存在会减弱pOEGMA修饰表面对细胞的排斥作用。该结果与本实验现象一致。而在异质图案化的 PS-O和PO-S表面上，HUVECs大多集中在修饰了pSS的区域或靠近pSS修饰的区域生长，在pOEGMA区域的细胞数量则相对较少，且细胞呈多边形或梭形铺展状态。PS-O和PO-S的HUVECs密度分别为198 cells/mm2和154 cells/mm2（图8（b））。此时的PS-O表面的HUVECs密度显著高于PO-S表面，且细胞密度的差值高于4 h时两者之间的差异。表明当pSS和pOEGMA异质分布时，pSS分布在PDMS区域时（PS-O）比分布在金膜区域时（PO-S）更利于HUVECs的增殖。
如图9（a）所示，在4 h的培养中，HUVECs在PS-S表面的铺展面积为1151 μm2，细胞纵横比达到2.2（图9（b）），细胞有纵向铺展的趋势。而PO-O的HUVECs铺展面积与PS-S表面的相比明显减小，为369 μm2，细胞纵横比为1.1，表明该表面的HUVECs纵向拉伸和横向铺展的长度基本相等（图9（b）），呈圆球收缩状态。对于异质图案化的PS-O和PO-S表面，其HUVECs铺展面积分别为980 μm2和640 μm2，其细胞纵横比分别为2.1和1.6（图9（b）），两者的HUVECs铺展面积和细胞纵横比都有显著差异。此时，HUVECs在PS-O表面的铺展拉伸状态优于PO-S表面，表明PS-O表面的HUVECs铺展面积更大，有纵向铺展趋势；而PO-S表面的HUVECs相对于PS-S和PS-O表面的细胞呈收缩状态。这与图8（a）中各表面的HUVECs形态一致。而PS-O表面黏附的HUVECs的生长状态更好，也利于HUVECs增殖生长。
如图9（a）所示，在48 h培养中，各样品表面的HUVECs铺展面积与4 h相比都有明显增加。PS-S表面细胞的铺展面积达到6809 μm2，细胞纵横比为2.1，表明PS-S表面的HUVECs在纵横向都有明显的铺展，并且纵向铺展更为显著。PO-O表面的HUVECs铺展面积为814 μm2，细胞纵横比为1.3，表明细胞有略微铺展，但仍然基本呈球状。异质图案化的PS-O和PO-S表面的HUVECs铺展面积分别为4648 μm2和5166 μm2，细胞纵横比分别为2.4和2.8。表明PS-O和PO-S样品表面的细胞具有纵向拉伸的趋势，呈梭形铺展。这与图8（a）中各表面的HUVECs形态一致。
实施例七 HUVSMCs在样品表面的活性
HUVSMCs的死活染色过程与HUVECs类似，不同的是培养过程中使用的培养基和用于稀释染色液的溶剂为SMCM。图10为HUVSMCs在PS-S、PO-O、PS-O和PO-S样品表面孵育4 h和48 h后的细胞死活染色情况。活细胞呈绿色荧光，死细胞呈红色荧光。图11为HUVSMCs在各样品表面孵育4 h和48 h后的细胞活性。通过对死活细胞进行计数，并利用公式计算细胞活性：细胞活性（%）= 活细胞数/（活细胞数 + 死细胞数）×100%。
如图10所示，HUVSMCs在样品表面孵育4 h后，活细胞在PS-S表面的分布较均匀，死细胞数量较少，细胞活性为92%（图11）。与PS-S表面相比，PO-O表面的HUVSMCs数量很少，细胞活性也较低，为47%。而对于异质图案化表面，PS-O表面的HUVSMCs分布均匀，PO-S表面的HUVSMCs则趋向于分布在pSS修饰区域（图10）。PS-O和PO-S样品表面的HUVSMCs活性分别为67%和59%。
当孵育时间延长至48 h后，可以在PS-S表面观察到HUVSMCs形态有明显的拉伸，且分布均匀，而PO-O表面的HUVSMCs数量较PS-S表面有明显减少（图10）。PS-S和PO-O的HUVSMCs活性均为72%（图11）。而对于聚合物异质图案化表面，从荧光染色照片中可以观察到PS-O和PO-S表面的活细胞均趋向于向pSS修饰区域生长，呈现图案化生长趋势。值得一提的是，PS-O表面的HUVSMCs呈明显的拉伸形态，生长状态较PO-S表面更好，细胞趋向于生长并延伸到pOEGMA和pSS交界的区域附近。如图11所示，PS-O和PO-S表面的HUVSMCs活性分别为82%和80%，高于均质表面。
实施例八 HUVSMCs在样品表面的的黏附、增殖和铺展
HUVSMCs的培养过程与HUVECs类似，培养过程中使用的培养基为SMCM。将HUVSMCs种植在PS-S、PO-O、PS-O和PO-S样品表面，研究了HUVSMCs在表面的黏附和增殖情况。图12展示了细胞在各样品表面培养4 h和48 h后的细胞生长形貌和密度。图13展示了各样品表面细胞的纵横比和铺展面积。
如图12（a）所示，HUVSMCs在各表面孵育4 h后，PS-S表面的HUVSMCs大多呈球状或略微的拉伸状，表面细胞黏附分布得较均匀，细胞密度为138 cells/mm2（图12（b））。而在PO-O表面的HUVSMCs呈未铺展的球状，细胞密度为14 cells/mm2（图12（b））。对于异质图案化表面，PS-O表面的HUVSMCs在表面的分布未出现明显的图案化趋势；而PO-S表面的HUVSMCs表面出现了明显的图案化黏附，细胞趋向于黏附在圆外修饰pSS的区域，而避开pOEGMA修饰区域。此时，PS-O和PO-S的HUVSMCs密度分别为69 cells/mm2和93 cells/mm2，介于PS-S和PM-M表面之间（图12（b））。
细胞培养时间延长至48 h后，PS-S表面HUVSMCs分布均匀，且有明显的铺展和纵向延伸（图12（a）），其细胞密度为147 cells/mm2（图12（b））。而PO-O表面几乎没有细胞存在，表明PO-O表面对HUVSMCs增殖行为有显著的抑制作用。对于异质图案化的PS-O和PO-S表面，HUVSMCs均出现了纵向拉伸和铺展状态；并且两种表面的HUVSMCs基本都在pSS修饰区域生长，呈现出明显的图案化分布的趋势。其中，PS-O的HUVSMCs密度为144 cells/mm2，与PS-S表面接近，而PO-S的HUVSMCs密度为167 cells/mm2，显著高于均质PS-S表面。在HUVSMCs黏附及增殖的过程中，PO-S表面的细胞密度始终显著高于PS-O表面的细胞密度。由文献报道可知，当聚乙二醇衍生物和肝素分子同时存在并均匀分布在表面时，样品表面对平滑肌细胞具有一定的表型收缩作用，表现出一定的抑制平滑肌细胞增殖的能力。与之不同，本发明采用图案化方法引入异质分布的聚乙二醇衍生物pOEGMA和类肝素聚合物pSS后，PO-S较PS-O表面显示出更强的HUVSMCs促进作用，进一步说明类肝素聚合物在材料表面的异质图案化对细胞黏附及生长行为的巨大作用。
如图13所示，培养4 h后，HUVSMCs在PS-S和PO-O的铺展面积分别为913 μm2和442μm2，细胞纵横比均为1.5，表明HUVSMCs在这两个表面呈接近圆球状。对于异质图案化的PS-O和PO-S表面，其HUVSMCs铺展面积分别为1753 μm2和2502 μm2，细胞纵横比为2.1和1.9，细胞略微铺展延伸。细胞培养时间延长至48 h后，PS-S、PS-O、PO-S表面的HUVSMCs铺展面积与4 h相比都有大幅增加，分别为6521 μm2、2787 μm2和4538 μm2。与PS-S相比，PS-O和PO-S表面的HUVSMCs铺展面积有所收缩，而PS-O表面HUVSMCs的收缩程度更大。由图13（b）的细胞纵横比数据可知，经过48 h培养后，PS-O和PO-S样品表面HUVSMCs的细胞纵横比分别为5.5和4.5，略高于PS-S表面的细胞纵横比4.1，细胞在PS-O表面的纵向的拉伸与PO-S比更加明显。
由上述HUVECs和HUVSMCs实验数据可知，以pSS均质修饰表面PS-S和聚乙二醇衍生物均质修饰表面PO-O为参照，通过化学组分的异质图案化修饰基本得到了细胞图案化表面。结果表明，pOEGMA和pSS在表面异质图案化分布时，血管细胞受表面化学组成的引导，呈现出细胞图案化生长趋势。通过对比HUVECs和HUVSMCs的数据，发现本实验制备的PO-O表面对HUVECs黏附及增殖的抑制作用会随时间延长减弱，且可以观察到细胞在表面有所铺展；而该表面对HUVSMCs黏附及增殖的抑制作用会随时间的延长而加强，在48 h几乎没有细胞黏附。当pOEGMA与pSS组分异质图案化分布时，pOEGMA区域对HUVECs的抑制作用随着时间的延长而减弱，因此在PS-O和PO-S表面的pOEGMA区域也可以观察到较多的HUVECs细胞生长；而pOEGMA区域对HUVSMCs的抑制作用随时间的延长有所增强，因此在PS-O和PO-S表面的pOEGMA区域的HUVSMCs细胞数量较少。在PS-O和PO-S表面上的HUVSMCs细胞图案化趋势比HUVECs更加明显。
本发明主要研究了类肝素聚合物和聚乙二醇衍生物在材料表面均质或异质分布时对血管细胞行为的影响，将类肝素聚合物和聚乙二醇衍生物的化学组成及其在材料表面的图案化分布方式这两个因素结合起来，进一步丰富了类肝素化聚合物和聚乙二醇衍生物修饰的材料表面与细胞相互作用这一基础研究理论，也为通过类肝素聚合物和聚乙二醇衍生物调控血管细胞行为提供了新的策略和思路。本发明公开了聚乙二醇衍生物及类肝素聚合物异质图案化表面的制备及细胞图案化。利用聚甲基丙烯酸寡聚乙二醇酯（pOEGMA）和聚苯乙烯磺酸钠（pSS）对图案化金膜基底的不同区域进行修饰，使得两种聚合物在图案化金膜表面异质分布。一系列表面表征测试证明两种聚合物在表面异质图案化修饰成功。细胞实验结果表明，当pOEGMA和pSS异质分布在同一表面上时，血管细胞会趋向于在更利于细胞黏附及增殖的pSS修饰区域生长，并避开pOEGMA修饰区域，呈现出图案化生长的趋势，并且随着细胞在表面培养时间的延长，人脐静脉平滑肌细胞（HUVSMCs）的图案化效果变好。
Claims (7)
1. 一种聚乙二醇衍生物及类肝素聚合物异质图案化表面的制备方法，其特征在于，包括以下步骤，在含溴聚二甲基硅氧烷表面修饰聚乙二醇衍生物，得到修饰的聚二甲基硅氧烷表面，再将图案化金膜转印到修饰的聚二甲基硅氧烷表面，最后通过自组装将巯基类肝素聚合物组装在金膜表面，得到聚乙二醇衍生物及类肝素聚合物异质图案化表面；或者在含溴聚二甲基硅氧烷表面修饰类肝素聚合物，得到修饰的聚二甲基硅氧烷表面，再将图案化金膜转印到修饰的聚二甲基硅氧烷表面，最后通过自组装将巯基聚乙二醇衍生物组装在金膜表面，得到聚乙二醇衍生物及类肝素聚合物异质图案化表面；所述类肝素聚合物为pSS，其分子量为0.8×104～2×104 g mol-1；所述聚乙二醇衍生物为pOEGMA，其分子量为0.5×104～1.2×104 g mol-1。
2.根据权利要求1所述聚乙二醇衍生物及类肝素聚合物异质图案化表面的制备方法，其特征在于，含溴聚二甲基硅氧烷表面为平整表面；图案化金膜为圆阵列阵图案化金膜。
3.根据权利要求1所述聚乙二醇衍生物及类肝素聚合物异质图案化表面的制备方法，其特征在于，先聚合制备带有二硫酯键的类肝素聚合物，再用乙醇胺将类肝素聚合物末端的二硫酯键还原为巯基，得到巯基类肝素聚合物；先通过RAFT聚合制备带有二硫酯键的聚乙二醇衍生物，再用乙醇胺将聚乙二醇衍生物末端的二硫酯键还原为巯基，得到巯基聚乙二醇衍生物；将含溴聚二甲基硅氧烷浸入含有类肝素聚合物单体、光引发剂的溶液中，然后光照反应，在含溴聚二甲基硅氧烷表面修饰类肝素聚合物；将含溴聚二甲基硅氧烷浸入含有聚乙二醇衍生物单体、光引发剂的溶液中，然后光照反应，在含溴聚二甲基硅氧烷表面修饰聚乙二醇衍生物。
4.根据权利要求1所述聚乙二醇衍生物及类肝素聚合物异质图案化表面的制备方法，其特征在于，将转印了图案化金膜的聚二甲基硅氧烷表面浸入巯基类肝素聚合物或者巯基聚乙二醇衍生物的溶液中10～25小时，将巯基类肝素聚合物或者巯基聚乙二醇衍生物组装在金膜表面。
5.根据权利要求1所述聚乙二醇衍生物及类肝素聚合物异质图案化表面的制备方法制备的聚乙二醇衍生物及类肝素聚合物异质图案化表面。
6.权利要求5所述聚乙二醇衍生物及类肝素聚合物异质图案化表面在制备调节血管细胞行为材料中的应用。
7.权利要求5所述聚乙二醇衍生物及类肝素聚合物异质图案化表面在制备促进内皮细胞黏附增殖和抑制平滑肌细胞黏附增殖材料中的应用；或者在制备提高血管细胞存活材料中的应用。
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