JPH11349643A - 感温性高分子化合物およびその製造方法、感温性高分子組成物、細胞培養基材 - Google Patents
感温性高分子化合物およびその製造方法、感温性高分子組成物、細胞培養基材Info
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- JPH11349643A JPH11349643A JP10158225A JP15822598A JPH11349643A JP H11349643 A JPH11349643 A JP H11349643A JP 10158225 A JP10158225 A JP 10158225A JP 15822598 A JP15822598 A JP 15822598A JP H11349643 A JPH11349643 A JP H11349643A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ゼラチンが有する細胞接着性などの優れた特
性を活かせるとともに感温性にも優れた高分子化合物を
得る。 【解決手段】 ゼラチンにＮ−イソプロピルアクリルア
ミドポリマーがグラフト重合されてなる感温性高分子化
合物。
性を活かせるとともに感温性にも優れた高分子化合物を
得る。 【解決手段】 ゼラチンにＮ−イソプロピルアクリルア
ミドポリマーがグラフト重合されてなる感温性高分子化
合物。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、感温性高分子化合
物およびその製造方法、感温性高分子組成物、細胞培養
基材に関し、詳しくは、特定の温度を境界にして、その
上下の温度領域で表面性状などの特性が臨界的に変化す
る感温性高分子化合物と、このような感温性高分子化合
物を製造する方法と、感温性高分子化合物を含む組成物
と、感温性高分子化合物を用いて製造され各種動物細胞
やヒト細胞などを培養するための細胞培養基材とに関す
る。
物およびその製造方法、感温性高分子組成物、細胞培養
基材に関し、詳しくは、特定の温度を境界にして、その
上下の温度領域で表面性状などの特性が臨界的に変化す
る感温性高分子化合物と、このような感温性高分子化合
物を製造する方法と、感温性高分子化合物を含む組成物
と、感温性高分子化合物を用いて製造され各種動物細胞
やヒト細胞などを培養するための細胞培養基材とに関す
る。
【０００２】
【従来の技術】動物細胞やヒト細胞の細胞培養基材とし
てゼラチンは良く知られた材料である。ゼラチンは、動
物由来の材料であり、分子中に細胞接着性ペプチド（Ｒ
ＧＤ：Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）配列を有していて、動
物組織と類似した構造を有しているため、動物細胞やヒ
ト細胞の接着性に優れている。これらの細胞は、細胞膜
タンパク質であるインテグラン等を介してゼラチン分子
の細胞接着性ペプチド配列との間に生物的な結合が生じ
ることでゼラチンに対して強固に接着され、活発に伸展
・増殖することができる。
てゼラチンは良く知られた材料である。ゼラチンは、動
物由来の材料であり、分子中に細胞接着性ペプチド（Ｒ
ＧＤ：Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）配列を有していて、動
物組織と類似した構造を有しているため、動物細胞やヒ
ト細胞の接着性に優れている。これらの細胞は、細胞膜
タンパク質であるインテグラン等を介してゼラチン分子
の細胞接着性ペプチド配列との間に生物的な結合が生じ
ることでゼラチンに対して強固に接着され、活発に伸展
・増殖することができる。
【０００３】ゼラチン基材の表面に層状に増殖した細胞
層を回収するには、培養皿等にコーティングされたゼラ
チン基材に接着している細胞層を、ゼラチン基材あるい
は培養皿から分離しなければならない。前記した生物的
な結合で接着している細胞層を分離するには、ゼラチン
を分解する酵素であるコラゲナーゼなどの剥離剤を作用
させてゼラチンを分解することで、培養細胞をゼラチン
基材あるいは培養皿から剥離し回収していた。
層を回収するには、培養皿等にコーティングされたゼラ
チン基材に接着している細胞層を、ゼラチン基材あるい
は培養皿から分離しなければならない。前記した生物的
な結合で接着している細胞層を分離するには、ゼラチン
を分解する酵素であるコラゲナーゼなどの剥離剤を作用
させてゼラチンを分解することで、培養細胞をゼラチン
基材あるいは培養皿から剥離し回収していた。
【０００４】この方法では、コラゲナーゼ等の剥離剤
が、ゼラチンだけでなく培養細胞にも作用して悪影響を
与えるという欠点があった。特に、ゼラチン基材の表面
に形成された細胞層が、剥離剤によってバラバラに分解
されてしまうという問題がある。細胞培養基材としてポ
リイソプロピルアクリルアミド（以下、ＰＮＩＰＡＭと
略称する。）を用いる技術が提案されている。
が、ゼラチンだけでなく培養細胞にも作用して悪影響を
与えるという欠点があった。特に、ゼラチン基材の表面
に形成された細胞層が、剥離剤によってバラバラに分解
されてしまうという問題がある。細胞培養基材としてポ
リイソプロピルアクリルアミド（以下、ＰＮＩＰＡＭと
略称する。）を用いる技術が提案されている。
【０００５】ＰＮＩＰＡＭは、水溶液中において下限臨
界点温度（ＬＣＳＴ）３１℃の感温性高分子である。臨
界点温度以下の温度では分子表面が親水性あるいは水溶
性を呈して水に溶けるが、臨界点温度以上の温度では分
子表面が疎水性を示すので水中に析出するという、いわ
ゆる感温性の相分離特性を有している。しかも、臨界点
温度以上の温度環境では、表面が疎水性を有することで
細胞に対する接着性を発現する。
界点温度（ＬＣＳＴ）３１℃の感温性高分子である。臨
界点温度以下の温度では分子表面が親水性あるいは水溶
性を呈して水に溶けるが、臨界点温度以上の温度では分
子表面が疎水性を示すので水中に析出するという、いわ
ゆる感温性の相分離特性を有している。しかも、臨界点
温度以上の温度環境では、表面が疎水性を有することで
細胞に対する接着性を発現する。
【０００６】ＰＮＩＰＡＭを細胞培養基材として使用す
るには、培養皿の表面にＰＮＩＰＡＭをコーティングす
る。臨界点温度以上に維持されたＰＮＩＰＡＭ層の表面
には細胞が接着し増殖する。細胞培養が終了した後、Ｐ
ＮＩＰＡＭ層を臨界点温度以下の温度にすれば、ＰＮＩ
ＰＡＭ層の表面は親水性になって細胞が接着できなくな
り、ＰＮＩＰＡＭ層は水に溶解する。その結果、培養さ
れた細胞層は培養皿の表面から剥離して回収される。
るには、培養皿の表面にＰＮＩＰＡＭをコーティングす
る。臨界点温度以上に維持されたＰＮＩＰＡＭ層の表面
には細胞が接着し増殖する。細胞培養が終了した後、Ｐ
ＮＩＰＡＭ層を臨界点温度以下の温度にすれば、ＰＮＩ
ＰＡＭ層の表面は親水性になって細胞が接着できなくな
り、ＰＮＩＰＡＭ層は水に溶解する。その結果、培養さ
れた細胞層は培養皿の表面から剥離して回収される。
【０００７】この方法では、前記した剥離剤を使用しな
くてもよいため、培養細胞に与える悪影響が少ないとい
う利点がある。但し、細胞の接着性については、前記し
たゼラチンのほうが優れている。ＰＮＩＰＡＭには接着
が困難な細胞もある。これは、ＰＮＩＰＡＭ層の場合
は、表面が親水性になることで、疎水性であるガラスな
どからなる培養皿の表面に比べて細胞が付着し易くなる
というだけであるのに対し、細胞接着性ペプチド配列を
有するゼラチンの場合は、細胞膜タンパク質であるイン
テグラン等を介して細胞とゼラチンとの間に生物的な結
合を生じて強固に一体化し接着されるためである。
くてもよいため、培養細胞に与える悪影響が少ないとい
う利点がある。但し、細胞の接着性については、前記し
たゼラチンのほうが優れている。ＰＮＩＰＡＭには接着
が困難な細胞もある。これは、ＰＮＩＰＡＭ層の場合
は、表面が親水性になることで、疎水性であるガラスな
どからなる培養皿の表面に比べて細胞が付着し易くなる
というだけであるのに対し、細胞接着性ペプチド配列を
有するゼラチンの場合は、細胞膜タンパク質であるイン
テグラン等を介して細胞とゼラチンとの間に生物的な結
合を生じて強固に一体化し接着されるためである。
【０００８】特開平４−２７８０８３号公報には、ＰＮ
ＩＰＡＭ等の温度感応性高分子化合物とコラーゲンやゼ
ラチン等の細胞接着性物質とが混合された細胞培養基材
を用いる技術が開示され、細胞に対する接着性あるいは
培養の機能と、温度変化による剥離回収の機能との両方
が達成されると説明されている。
ＩＰＡＭ等の温度感応性高分子化合物とコラーゲンやゼ
ラチン等の細胞接着性物質とが混合された細胞培養基材
を用いる技術が開示され、細胞に対する接着性あるいは
培養の機能と、温度変化による剥離回収の機能との両方
が達成されると説明されている。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】前記先行技術のよう
に、ＰＮＩＰＡＭとコラーゲン等とを混合しただけで
は、十分な性能は発揮できない。すなわち、培養細胞を
剥離する際に、感温性のＰＮＩＰＡＭは温度変化によっ
て水溶性に変化しても、感温性を有しないコラーゲン等
の細胞接着性物質が培養皿と培養細胞とを接着したまま
になると、培養細胞の剥離が良好に行えない。
に、ＰＮＩＰＡＭとコラーゲン等とを混合しただけで
は、十分な性能は発揮できない。すなわち、培養細胞を
剥離する際に、感温性のＰＮＩＰＡＭは温度変化によっ
て水溶性に変化しても、感温性を有しないコラーゲン等
の細胞接着性物質が培養皿と培養細胞とを接着したまま
になると、培養細胞の剥離が良好に行えない。
【００１０】また、ＰＮＩＰＡＭとゼラチンやコラーゲ
ンとは相溶性がないため、均一な混合塗膜が形成でき難
い。そのため、ＰＮＩＰＡＭとコーラゲンやゼラチンと
が均等に配置された状態の細胞培養基材を得ることが困
難である。細胞培養基材に組成の偏りが発生するため、
それぞれの成分が有する特性をバランス良く発揮させる
ことが困難である。
ンとは相溶性がないため、均一な混合塗膜が形成でき難
い。そのため、ＰＮＩＰＡＭとコーラゲンやゼラチンと
が均等に配置された状態の細胞培養基材を得ることが困
難である。細胞培養基材に組成の偏りが発生するため、
それぞれの成分が有する特性をバランス良く発揮させる
ことが困難である。
【００１１】本発明の課題は、ゼラチンが有する細胞接
着性などの優れた特性を活かし、且つ感温性を付与した
高分子化合物を得、これによって任意の形状を有する容
器等に塗布が可能であると同時に、ＰＮＩＰＡＭとの相
溶性が大幅に改善され、任意の接着力を有する基材を提
供できるようにすることである。
着性などの優れた特性を活かし、且つ感温性を付与した
高分子化合物を得、これによって任意の形状を有する容
器等に塗布が可能であると同時に、ＰＮＩＰＡＭとの相
溶性が大幅に改善され、任意の接着力を有する基材を提
供できるようにすることである。
【００１２】
【課題を解決するための手段】本発明の感温性高分子化
合物は、ゼラチン分子にＮ−イソプロピルアクリルアミ
ドポリマー（ＰＮＩＰＡＭ）がグラフト重合されてな
る。具体的構成について説明する。 〔ゼラチン〕通常のゼラチンが使用できる。ゼラチン
は、その製造方法および原料によって、様々な特性を備
えたものがあり、感温性高分子化合物の用途や要求性能
に合わせて、適切な特性を有するゼラチンを使用すれば
よい。例えば、ゼラチンの原料となるコラーゲンには、
タイプ１コラーゲン、タイプ２コラーゲン、タイプ３コ
ラーゲンなどがある。製造方法の違いによってアルカリ
ゼラチン、酸性ゼラチン、酵素処理ゼラチンなどがあ
る。 〔グラフト重合〕高分子化合物の製造技術におけるグラ
フト重合法およびグラフト化法が適用できる。
合物は、ゼラチン分子にＮ−イソプロピルアクリルアミ
ドポリマー（ＰＮＩＰＡＭ）がグラフト重合されてな
る。具体的構成について説明する。 〔ゼラチン〕通常のゼラチンが使用できる。ゼラチン
は、その製造方法および原料によって、様々な特性を備
えたものがあり、感温性高分子化合物の用途や要求性能
に合わせて、適切な特性を有するゼラチンを使用すれば
よい。例えば、ゼラチンの原料となるコラーゲンには、
タイプ１コラーゲン、タイプ２コラーゲン、タイプ３コ
ラーゲンなどがある。製造方法の違いによってアルカリ
ゼラチン、酸性ゼラチン、酵素処理ゼラチンなどがあ
る。 〔グラフト重合〕高分子化合物の製造技術におけるグラ
フト重合法およびグラフト化法が適用できる。
【００１３】グラフト重合は、ゼラチン分子にラジカル
重合開始剤を結合させる。通常、カルボキシル基あるい
は水酸基を有するアゾビスイソブチロニトリル系開始剤
を結合剤を用いてゼラチンのアミノ酸やカルボキシル基
に結合させて、ＮＩＰＡＭモノマー存在下で熱重合させ
る方法が採用される。この方法では、ほぼ等量のＮＩＰ
ＡＭのホモポリマーが形成されることが原理的に予想さ
れる。したがって、大量のホモポリマーを、グラフトゼ
ラチンと選別（透析）する工程が必要になる。
重合開始剤を結合させる。通常、カルボキシル基あるい
は水酸基を有するアゾビスイソブチロニトリル系開始剤
を結合剤を用いてゼラチンのアミノ酸やカルボキシル基
に結合させて、ＮＩＰＡＭモノマー存在下で熱重合させ
る方法が採用される。この方法では、ほぼ等量のＮＩＰ
ＡＭのホモポリマーが形成されることが原理的に予想さ
れる。したがって、大量のホモポリマーを、グラフトゼ
ラチンと選別（透析）する工程が必要になる。
【００１４】一方、後述するインファータ法と呼ばれる
方法は、光照射により重合開始し、リビング重合性が高
いため、照射時間によって容易にグラフト重合鎖を変え
られる利点がある。グラフト化法は、予めホモポリマー
を合成しておき、ポリマーの末端基に導入した官能基
（アミノ基、水酸基やホルボキシル基）とゼラチンの側
鎖の官能基との結合反応によってグラフトポリマーを得
る。上記のポリマーはラジカル重合の際に、アミノ基や
水酸基、カルボキシル基を有する連鎖移動剤であるアル
カンチオール（例えば、アミノエタンチオール）を用い
ることで、分子量が２，０００〜１０，０００で末端に
上記官能基が入ったポリマーが容易に得られる。
方法は、光照射により重合開始し、リビング重合性が高
いため、照射時間によって容易にグラフト重合鎖を変え
られる利点がある。グラフト化法は、予めホモポリマー
を合成しておき、ポリマーの末端基に導入した官能基
（アミノ基、水酸基やホルボキシル基）とゼラチンの側
鎖の官能基との結合反応によってグラフトポリマーを得
る。上記のポリマーはラジカル重合の際に、アミノ基や
水酸基、カルボキシル基を有する連鎖移動剤であるアル
カンチオール（例えば、アミノエタンチオール）を用い
ることで、分子量が２，０００〜１０，０００で末端に
上記官能基が入ったポリマーが容易に得られる。
【００１５】具体的には以下の２工程を含む方法が採用
できる。 (a) ゼラチンと４−（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミ
ル）安息香酸とを縮合剤の存在下で反応させて、ジチオ
カルバメート化ゼラチン分子を得る工程。 (b) 前記ジチオカルバメート化ゼラチンと感温性高分
子生成単量体との混合水溶液に紫外線を照射して、ゼラ
チンに前記単量体のホモポリマーがグラフト重合された
感温性高分子化合物を得る工程。
できる。 (a) ゼラチンと４−（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミ
ル）安息香酸とを縮合剤の存在下で反応させて、ジチオ
カルバメート化ゼラチン分子を得る工程。 (b) 前記ジチオカルバメート化ゼラチンと感温性高分
子生成単量体との混合水溶液に紫外線を照射して、ゼラ
チンに前記単量体のホモポリマーがグラフト重合された
感温性高分子化合物を得る工程。
【００１６】上記製造方法で、感温性高分子生成単量体
とは、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）
のように、ホモポリマー（例えば、ＰＮＩＰＡＭ）を生
成させたときに、特定の臨界温度で性状や特性に急激な
変化を生じるホモポリマーが得られる単量体である。Ｎ
ＩＰＡＭの代わりに、同様の特性を有する別の単量体を
用いることも可能である。
とは、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）
のように、ホモポリマー（例えば、ＰＮＩＰＡＭ）を生
成させたときに、特定の臨界温度で性状や特性に急激な
変化を生じるホモポリマーが得られる単量体である。Ｎ
ＩＰＡＭの代わりに、同様の特性を有する別の単量体を
用いることも可能である。
【００１７】グラフト重合の重合条件によって、ゼラチ
ン分子にグラフトされるＰＮＩＰＡＭの分子数やグラフ
ト鎖長が変わり、得られる感温性高分子化合物の特性を
調整することができる。ゼラチン分子１本当たり３本以
上のＰＮＩＰＡＭがグラフト重合されてなり、平均グラ
フト鎖長が２．１×１０3 以上である感温性高分子化合
物が、ゼラチンが有する特性とＰＮＩＰＡＭが有する感
温性とを適切に発揮できるので好ましい。
ン分子にグラフトされるＰＮＩＰＡＭの分子数やグラフ
ト鎖長が変わり、得られる感温性高分子化合物の特性を
調整することができる。ゼラチン分子１本当たり３本以
上のＰＮＩＰＡＭがグラフト重合されてなり、平均グラ
フト鎖長が２．１×１０3 以上である感温性高分子化合
物が、ゼラチンが有する特性とＰＮＩＰＡＭが有する感
温性とを適切に発揮できるので好ましい。
【００１８】〔感温性高分子化合物〕ＰＮＩＰＡＭがグ
ラフト重合されたゼラチンすなわちＰＮＩＰＡＭグラフ
トゼラチンの下限臨界点温度（ＬＣＳＴ）は、ＰＮＩＰ
ＡＭのグラフト分子数やグラフト鎖長などグラフト重合
の条件によって変更できる。通常、ＰＮＩＰＡＭのＬＣ
ＳＴは３１℃であり、ＰＮＩＰＡＭグラフトゼラチンの
場合はこれよりも少し高い温度になる。ＮＩＰＡＭの代
わりに別の感温性高分子生成単量体を用いる場合、得ら
れるグラフトゼラチンのＬＣＳＴが常温付近になるもの
が、後述する細胞培養基材などの用途に好ましいものと
なる。
ラフト重合されたゼラチンすなわちＰＮＩＰＡＭグラフ
トゼラチンの下限臨界点温度（ＬＣＳＴ）は、ＰＮＩＰ
ＡＭのグラフト分子数やグラフト鎖長などグラフト重合
の条件によって変更できる。通常、ＰＮＩＰＡＭのＬＣ
ＳＴは３１℃であり、ＰＮＩＰＡＭグラフトゼラチンの
場合はこれよりも少し高い温度になる。ＮＩＰＡＭの代
わりに別の感温性高分子生成単量体を用いる場合、得ら
れるグラフトゼラチンのＬＣＳＴが常温付近になるもの
が、後述する細胞培養基材などの用途に好ましいものと
なる。
【００１９】ＰＮＩＰＡＭグラフトゼラチンは水溶液の
状態で提供でき、コーティングによって膜を形成するこ
とができる。 〔感温性高分子組成物〕感温性高分子化合物は、単独で
使用することもできるが、他の高分子材料などと組み合
わせた組成物として利用することもできる。前記感温性
高分子化合物に、単体のＮ−イソプロピルアクリルアミ
ドポリマー（ＰＮＩＰＡＭ）を組み合わせた感温性高分
子組成物が用いられる。
状態で提供でき、コーティングによって膜を形成するこ
とができる。 〔感温性高分子組成物〕感温性高分子化合物は、単独で
使用することもできるが、他の高分子材料などと組み合
わせた組成物として利用することもできる。前記感温性
高分子化合物に、単体のＮ−イソプロピルアクリルアミ
ドポリマー（ＰＮＩＰＡＭ）を組み合わせた感温性高分
子組成物が用いられる。
【００２０】具体的には、感温性高分子化合物とＰＮＩ
ＰＡＭとの混合水溶液にすれば、コーティング処理など
の取り扱いが容易である。共通する構造を備えたＰＮＩ
ＰＡＭグラフトゼラチンとＰＮＩＰＡＭとは、均一かつ
安定した状態で混合しておくことができる。ＰＮＩＰＡ
Ｍとゼラチンとの組み合わせのような相溶性の問題は生
じない。
ＰＡＭとの混合水溶液にすれば、コーティング処理など
の取り扱いが容易である。共通する構造を備えたＰＮＩ
ＰＡＭグラフトゼラチンとＰＮＩＰＡＭとは、均一かつ
安定した状態で混合しておくことができる。ＰＮＩＰＡ
Ｍとゼラチンとの組み合わせのような相溶性の問題は生
じない。
【００２１】上記のような感温性高分子組成物は、ＰＮ
ＩＰＡＭグラフトゼラチンからなる感温性高分子化合物
を単独で使用する場合に比べて、ＰＮＩＰＡＭが有する
感温特性をより強力に発揮させることができる。例え
ば、細胞培養基材として用いたときに、剥離性が向上
し、剥離剤を全く使用しなくても、培養細胞の剥離回収
が良好に行えるようになる。
ＩＰＡＭグラフトゼラチンからなる感温性高分子化合物
を単独で使用する場合に比べて、ＰＮＩＰＡＭが有する
感温特性をより強力に発揮させることができる。例え
ば、細胞培養基材として用いたときに、剥離性が向上
し、剥離剤を全く使用しなくても、培養細胞の剥離回収
が良好に行えるようになる。
【００２２】感温性高分子化合物とＰＮＩＰＡＭとの混
合割合を変更することで、特性を変えることができる。
例えば、細胞培養基材として、細胞に対する接着性を変
えることができ、特定の細胞には強い接着性があり、別
の細胞にはあまり接着性を示さない細胞選択性のある細
胞培養基材が得られる。 〔細胞培養基材〕前記感温性高分子化合物を用いて、通
常の細胞培養基材と同様の製造手段で製造できる。例え
ば、感温性高分子化合物の水溶液を培養皿の表面に塗布
し乾燥させれば、面状あるいはシート状の細胞培養基材
が得られる。感温性高分子化合物溶液をスポット状、市
松模様状、格子状などのパターン形状でコートしておけ
ば、パターン形状にしたがって細胞を培養することがで
きる。感温性高分子化合物溶液を円筒などの立体面にコ
ートしておけば、立体形状を有する細胞培養基材を得る
こともできる。筒状に配置された細胞培養基材で血管細
胞を培養すれば、筒状の人工血管細胞を得ることができ
る。
合割合を変更することで、特性を変えることができる。
例えば、細胞培養基材として、細胞に対する接着性を変
えることができ、特定の細胞には強い接着性があり、別
の細胞にはあまり接着性を示さない細胞選択性のある細
胞培養基材が得られる。 〔細胞培養基材〕前記感温性高分子化合物を用いて、通
常の細胞培養基材と同様の製造手段で製造できる。例え
ば、感温性高分子化合物の水溶液を培養皿の表面に塗布
し乾燥させれば、面状あるいはシート状の細胞培養基材
が得られる。感温性高分子化合物溶液をスポット状、市
松模様状、格子状などのパターン形状でコートしておけ
ば、パターン形状にしたがって細胞を培養することがで
きる。感温性高分子化合物溶液を円筒などの立体面にコ
ートしておけば、立体形状を有する細胞培養基材を得る
こともできる。筒状に配置された細胞培養基材で血管細
胞を培養すれば、筒状の人工血管細胞を得ることができ
る。
【００２３】細胞培養基材で培養されたシート状あるい
は層状をなす細胞は、人工血管、人工皮膚、人工臓器な
どの人工生体材料として利用できる。細胞培養の処理方
法は、通常の細胞培養と同様の方法が採用できる。但
し、細胞培養は、感温性高分子化合物の臨界温度よりも
高い温度環境で行い、細胞培養の終了後に、臨界温度よ
りも低い温度環境にすることで、感温性高分子化合物が
培養細胞との接着性を失い、培養細胞が剥離回収できる
ようになる。
は層状をなす細胞は、人工血管、人工皮膚、人工臓器な
どの人工生体材料として利用できる。細胞培養の処理方
法は、通常の細胞培養と同様の方法が採用できる。但
し、細胞培養は、感温性高分子化合物の臨界温度よりも
高い温度環境で行い、細胞培養の終了後に、臨界温度よ
りも低い温度環境にすることで、感温性高分子化合物が
培養細胞との接着性を失い、培養細胞が剥離回収できる
ようになる。
【００２４】動物由来の材料であるゼラチンを基本成分
とするＰＮＩＰＡＭグラフトゼラチンは、生体に対する
安全性に優れているので、ＰＮＩＰＡＭグラフトゼラチ
ンからなる細胞培養基材と培養細胞とを一体化させたま
まで人工生体材料として利用することもできる。 〔その他の用途〕感温性高分子化合物は、臨界温度を境
界にして水溶性と不溶性とに可逆的に変化する機能が必
要とされる用途であれば、上記細胞培養基材以外の用途
にも利用できる。また、臨界温度においては、水溶性と
不溶性との変化以外にも、感温性高分子化合物の各種性
状が変化するので、これらの性状の可逆的変化を必要と
される用途にも利用することができる。
とするＰＮＩＰＡＭグラフトゼラチンは、生体に対する
安全性に優れているので、ＰＮＩＰＡＭグラフトゼラチ
ンからなる細胞培養基材と培養細胞とを一体化させたま
まで人工生体材料として利用することもできる。 〔その他の用途〕感温性高分子化合物は、臨界温度を境
界にして水溶性と不溶性とに可逆的に変化する機能が必
要とされる用途であれば、上記細胞培養基材以外の用途
にも利用できる。また、臨界温度においては、水溶性と
不溶性との変化以外にも、感温性高分子化合物の各種性
状が変化するので、これらの性状の可逆的変化を必要と
される用途にも利用することができる。
【００２５】
【発明の実施の形態】感温性高分子化合物を製造し、そ
の性能を評価した結果を説明する。 〔材 料〕溶媒（すべて特級試薬）は、和光純薬工業
（株）から入手したものであり、精製処理を行わずにそ
のまま用いた。Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩ
ＰＡＭ）（イーストマン・コダック社製）は、トルエン
およびｎ−ヘキサンから再結晶して精製した。ゼラチン
（分子量＝９５，０００、牛骨から抽出したもの）、
Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム３水和
物、過硫酸アンモニウム、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ
メチルエチレンジアミンおよび２，４，６−トリニトロ
ベンゼンスルホン酸ナトリウム２水和物（ＴＮＢＳ）は
和光純薬工業（株）から、４−（クロロメチル）安息香
酸はアルドリッチ化学社から、それぞれ購入した。水溶
性のカルボジイミドである１−エチルー３−（３−ジメ
チルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）
は同仁化学社から入手した。
の性能を評価した結果を説明する。 〔材 料〕溶媒（すべて特級試薬）は、和光純薬工業
（株）から入手したものであり、精製処理を行わずにそ
のまま用いた。Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩ
ＰＡＭ）（イーストマン・コダック社製）は、トルエン
およびｎ−ヘキサンから再結晶して精製した。ゼラチン
（分子量＝９５，０００、牛骨から抽出したもの）、
Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム３水和
物、過硫酸アンモニウム、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ
メチルエチレンジアミンおよび２，４，６−トリニトロ
ベンゼンスルホン酸ナトリウム２水和物（ＴＮＢＳ）は
和光純薬工業（株）から、４−（クロロメチル）安息香
酸はアルドリッチ化学社から、それぞれ購入した。水溶
性のカルボジイミドである１−エチルー３−（３−ジメ
チルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）
は同仁化学社から入手した。
【００２６】ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）
およびウシ胎仔血清（ＦＢＳ）は、ギブコ・ラボラトリ
ーズ・ライフ・テクノロジーズ社から購入した。抗生物
質（ペニシリン、ストレプトマイシンおよびアンホテリ
シンＢ）は、大日本製薬（株）から購入した。リン酸緩
衝塩水（ＰＢＳ）は、日水製薬（株）から入手した。透
析膜（カットオフ分子量＝１２，０００〜１４，００
０）は、ビスケースセールス社から購入した。ポリスチ
レン製細胞培養皿（３５ｍｍ組織培養皿および３５ｍｍ
未処理皿）は、岩城硝子（株）から入手した。
およびウシ胎仔血清（ＦＢＳ）は、ギブコ・ラボラトリ
ーズ・ライフ・テクノロジーズ社から購入した。抗生物
質（ペニシリン、ストレプトマイシンおよびアンホテリ
シンＢ）は、大日本製薬（株）から購入した。リン酸緩
衝塩水（ＰＢＳ）は、日水製薬（株）から入手した。透
析膜（カットオフ分子量＝１２，０００〜１４，００
０）は、ビスケースセールス社から購入した。ポリスチ
レン製細胞培養皿（３５ｍｍ組織培養皿および３５ｍｍ
未処理皿）は、岩城硝子（株）から入手した。
【００２７】〔ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミ
ド）（ＰＮＩＰＡＭ）の合成〕ＮＩＰＡＭ１０ｇを脱イ
オン水１００ｍｌに溶解した。単量体溶液を１０分間脱
気した後、過硫酸アンモニウム１００ｍｇとＮ，Ｎ，
Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン１．０ｍｌ
を添加した。重合反応を２５℃で１２時間行った。反応
溶液を６０℃に加熱して沈殿化処理することにより重合
体を得た後、それをメチルアルコール溶液からジエチル
エーテルへ繰り返し沈殿化処理することにより精製し、
さらに、１日間減圧乾燥することで、ＰＮＩＰＡＭが得
られた。
ド）（ＰＮＩＰＡＭ）の合成〕ＮＩＰＡＭ１０ｇを脱イ
オン水１００ｍｌに溶解した。単量体溶液を１０分間脱
気した後、過硫酸アンモニウム１００ｍｇとＮ，Ｎ，
Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン１．０ｍｌ
を添加した。重合反応を２５℃で１２時間行った。反応
溶液を６０℃に加熱して沈殿化処理することにより重合
体を得た後、それをメチルアルコール溶液からジエチル
エーテルへ繰り返し沈殿化処理することにより精製し、
さらに、１日間減圧乾燥することで、ＰＮＩＰＡＭが得
られた。
【００２８】展開液としてＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミ
ドを用い、α−５０００およびα−５０００シリーズの
カラム（東ソー社製）でゲルパーミエーションクロマト
グラフィー（ＧＰＣ）を４０℃で行った。標準ポリエチ
レングリコールの検量線を参照して溶出曲線からＰＮＩ
ＰＡＭの数平均分子量を求めた。 〔４−（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）安
息香酸の合成〕４−（クロロメチル）安息香酸を、phot
oiniferterであるＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミン酸
ナトリウムと反応させることにより、４−（Ｎ，Ｎ−ジ
エチルジチオカルバミルメチル）安息香酸を合成した。
ドを用い、α−５０００およびα−５０００シリーズの
カラム（東ソー社製）でゲルパーミエーションクロマト
グラフィー（ＧＰＣ）を４０℃で行った。標準ポリエチ
レングリコールの検量線を参照して溶出曲線からＰＮＩ
ＰＡＭの数平均分子量を求めた。 〔４−（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）安
息香酸の合成〕４−（クロロメチル）安息香酸を、phot
oiniferterであるＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミン酸
ナトリウムと反応させることにより、４−（Ｎ，Ｎ−ジ
エチルジチオカルバミルメチル）安息香酸を合成した。
【００２９】すなわち、磁気攪拌器および滴下ロートを
備えた３００ｍｌの３つ口フラスコに、Ｎ，Ｎ−ジエチ
ルジチオカルバミン酸ナトリウム３水和物１２．４ｇ
（０．０５５ｍｏｌ）およびエチルアルコール５０ｍｌ
を仕込んだ。エチルアルコールとトルエンとの混合物
（体積比５０／５０）１００ｍｌに４−（クロロメチ
ル）安息香酸７．８５ｇ（０．０４６ｍｏｌ）を溶解し
てなる溶液を室温で滴下した。よく攪拌しながら反応を
室温で１２時間続けた。その後、反応溶液を脱イオン水
３００ｍｌに注ぎ、ジエチルエーテルで抽出処理を行っ
た。得られた抽出物を脱イオン水で洗浄後、無水硫酸マ
グネシウム上で乾燥させた。
備えた３００ｍｌの３つ口フラスコに、Ｎ，Ｎ−ジエチ
ルジチオカルバミン酸ナトリウム３水和物１２．４ｇ
（０．０５５ｍｏｌ）およびエチルアルコール５０ｍｌ
を仕込んだ。エチルアルコールとトルエンとの混合物
（体積比５０／５０）１００ｍｌに４−（クロロメチ
ル）安息香酸７．８５ｇ（０．０４６ｍｏｌ）を溶解し
てなる溶液を室温で滴下した。よく攪拌しながら反応を
室温で１２時間続けた。その後、反応溶液を脱イオン水
３００ｍｌに注ぎ、ジエチルエーテルで抽出処理を行っ
た。得られた抽出物を脱イオン水で洗浄後、無水硫酸マ
グネシウム上で乾燥させた。
【００３０】得られた乾燥溶液を減圧下で濃縮した後、
残留物を 1Ｈ−ＮＭＲスペクトル分析器（機種名ＪＮＭ
−ＧＸ２７０、ＪＥＯＬ（株）製）で分析した結果、４
−（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）安息香
酸と同定された。収率１１．０ｇ（８４．６％）； 1Ｈ
−ＮＭＲ（溶媒ＤＭＳＯ−ｄ6 、化学シフト基準物質Ｓ
ｉ（ＣＨ3 ）4 ）化学シフトδ値：７．９１と７．５２
（ｄｄ、４Ｈ、Ｃ6 Ｈ 4 ）、４．６１（ｓ、２Ｈ、ＣＨ
2 Ｓ）、３．９９と３．７６（ｑｑ、４Ｈ、ＮＣ
Ｈ2 ）、１．２１（ｔ、６Ｈ、ＣＨ2 ＣＨ3 ）。
残留物を 1Ｈ−ＮＭＲスペクトル分析器（機種名ＪＮＭ
−ＧＸ２７０、ＪＥＯＬ（株）製）で分析した結果、４
−（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）安息香
酸と同定された。収率１１．０ｇ（８４．６％）； 1Ｈ
−ＮＭＲ（溶媒ＤＭＳＯ−ｄ6 、化学シフト基準物質Ｓ
ｉ（ＣＨ3 ）4 ）化学シフトδ値：７．９１と７．５２
（ｄｄ、４Ｈ、Ｃ6 Ｈ 4 ）、４．６１（ｓ、２Ｈ、ＣＨ
2 Ｓ）、３．９９と３．７６（ｑｑ、４Ｈ、ＮＣ
Ｈ2 ）、１．２１（ｔ、６Ｈ、ＣＨ2 ＣＨ3 ）。
【００３１】〔ＰＮＩＰＡＭグラフトゼラチンの合成〕
フォトインファータ（photoinferter ）を複数持つゼラ
チンを以下のようにして合成した。氷浴で冷却しながら
水酸化ナトリウム水溶液を添加することにより、ｐＨ９
の水２０ｍｌに４−（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミ
ルメチル）安息香酸（２．１８ｇ、７．６９ｍｍｏｌ）
を溶解した。ＰＢＳ（ｐＨ７．４）１２０ｍｌにＥＤＣ
（２．９４ｇ、１５．３ｍｍｏｌ）を溶解してなる溶液
を上記で得られた溶液に、攪拌下かつ氷浴での冷却下で
添加した。攪拌下で反応を１時間続けた後、ＰＢＳ（ｐ
Ｈ７．４）４０ｍｌにゼラチン（４．０ｇ）を溶解して
なる溶液を反応混合物に攪拌下、室温で添加した。得ら
れた反応混合物を連続的に攪拌しながら一晩放置した。
透析膜を用い、水中、約４０℃で３日間拡張透析（exte
nsivedialysis）を行った。
フォトインファータ（photoinferter ）を複数持つゼラ
チンを以下のようにして合成した。氷浴で冷却しながら
水酸化ナトリウム水溶液を添加することにより、ｐＨ９
の水２０ｍｌに４−（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミ
ルメチル）安息香酸（２．１８ｇ、７．６９ｍｍｏｌ）
を溶解した。ＰＢＳ（ｐＨ７．４）１２０ｍｌにＥＤＣ
（２．９４ｇ、１５．３ｍｍｏｌ）を溶解してなる溶液
を上記で得られた溶液に、攪拌下かつ氷浴での冷却下で
添加した。攪拌下で反応を１時間続けた後、ＰＢＳ（ｐ
Ｈ７．４）４０ｍｌにゼラチン（４．０ｇ）を溶解して
なる溶液を反応混合物に攪拌下、室温で添加した。得ら
れた反応混合物を連続的に攪拌しながら一晩放置した。
透析膜を用い、水中、約４０℃で３日間拡張透析（exte
nsivedialysis）を行った。
【００３２】生成物を真空凍結乾燥した後、エチルアル
コール、アセトンおよびジエチルエーテルで洗浄した。
ジチオカルバミルゼラチンを濾過して集め、１日間減圧
乾燥した。得られたジチオカルバミルゼラチン中のフォ
トインファータ含有率は、波長２８１．５ｎｍの光に対
するＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミン酸塩の吸光係数
ε281.5 ＝１３，３００Ｍ-1ｃｍ-1を用いた吸光度から
求めた。
コール、アセトンおよびジエチルエーテルで洗浄した。
ジチオカルバミルゼラチンを濾過して集め、１日間減圧
乾燥した。得られたジチオカルバミルゼラチン中のフォ
トインファータ含有率は、波長２８１．５ｎｍの光に対
するＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミン酸塩の吸光係数
ε281.5 ＝１３，３００Ｍ-1ｃｍ-1を用いた吸光度から
求めた。
【００３３】ジチオカルバミルゼラチンとＮＩＰＡＭ
を、各々の濃度が１．０ｗ／ｖ％、１０ｗ／ｖ％になる
ように蒸留水に溶解した後、乾燥窒素ガス流をガス導入
口から混合溶液中へ１０分間導入した。この混合溶液を
直径１７．５ｍｍの水晶ガラス管に入れ、窒素雰囲気
中、２５０ＷのＨｇランプ（スポットキュア、ウシオ社
製）から紫外線を照射して光重合を行った。光の強度
は、光度計（ＵＶＲ−２５、トップコン社製）で測定し
て５ｍＷ／ｃｍ2 に調節した。室温で１５分間または３
０分間重合を行った後、透析膜を用い、水中、約４０℃
で３日間拡張透析（extensive dialysis）を行った。透
析した重合体を真空凍結乾燥することにより、白色固体
からなるＰＮＩＰＡＭグラフトゼラチンを得た。
を、各々の濃度が１．０ｗ／ｖ％、１０ｗ／ｖ％になる
ように蒸留水に溶解した後、乾燥窒素ガス流をガス導入
口から混合溶液中へ１０分間導入した。この混合溶液を
直径１７．５ｍｍの水晶ガラス管に入れ、窒素雰囲気
中、２５０ＷのＨｇランプ（スポットキュア、ウシオ社
製）から紫外線を照射して光重合を行った。光の強度
は、光度計（ＵＶＲ−２５、トップコン社製）で測定し
て５ｍＷ／ｃｍ2 に調節した。室温で１５分間または３
０分間重合を行った後、透析膜を用い、水中、約４０℃
で３日間拡張透析（extensive dialysis）を行った。透
析した重合体を真空凍結乾燥することにより、白色固体
からなるＰＮＩＰＡＭグラフトゼラチンを得た。
【００３４】フィールズにより報告されたＴＮＢＳ法に
より、得られた重合体中のアミノ基含有率を求めた。手
短に述べると、濃度が１．０〜１０ｍｇ／ｍｌになるよ
うに重合体を水に溶解した。Ｎａ2 Ｂ4 Ｏ7 を０．１Ｍ
含む０．１Ｍ−ＮａＯＨ溶液（０．５ｍｌ）に上記で得
られた重合体溶液（０．５ｍｌ）を添加した後、１．１
Ｍ−ＴＮＢＳ水溶液（０．０２ｍｌ）を添加した。５分
間培養した後、Ｎａ2ＳＯ3 を１．５ｍＭ含有する０．
１Ｍ−ＮａＨ2 ＰＯ4 水溶液（２ｍｌ）を添加すること
により、反応を停止させた。得られた反応溶液の吸光度
（波長４２０ｎｍ）を１ｃｍの吸光セルで測定し、アミ
ノ基濃度を、トリニトロフェニル−α−アミノ基共役の
吸光係数ε420 ＝２２，０００Ｍ-1ｃｍ-1から求めた。
より、得られた重合体中のアミノ基含有率を求めた。手
短に述べると、濃度が１．０〜１０ｍｇ／ｍｌになるよ
うに重合体を水に溶解した。Ｎａ2 Ｂ4 Ｏ7 を０．１Ｍ
含む０．１Ｍ−ＮａＯＨ溶液（０．５ｍｌ）に上記で得
られた重合体溶液（０．５ｍｌ）を添加した後、１．１
Ｍ−ＴＮＢＳ水溶液（０．０２ｍｌ）を添加した。５分
間培養した後、Ｎａ2ＳＯ3 を１．５ｍＭ含有する０．
１Ｍ−ＮａＨ2 ＰＯ4 水溶液（２ｍｌ）を添加すること
により、反応を停止させた。得られた反応溶液の吸光度
（波長４２０ｎｍ）を１ｃｍの吸光セルで測定し、アミ
ノ基濃度を、トリニトロフェニル−α−アミノ基共役の
吸光係数ε420 ＝２２，０００Ｍ-1ｃｍ-1から求めた。
【００３５】ジチオカルバミルゼラチンの分子量を以下
のようにして計算した。ゼラチン中のリシン残基のモル
数は変性の有無に関わらず一定のままなので、以下の関
係が成り立つ。 ＭＷd ×（〔アミノ〕d ＋〔ジチオカルバミル〕d ） ＝ＭＷg ×〔アミノ〕g …（１） ここで、ＭＷd はジチオカルバミルゼラチンの分子量、
ＭＷg はゼラチンの分子量（＝９５，０００）、〔アミ
ノ〕d はジチオカルバミルゼラチン中のアミノ基含有率
（ｍｏｌ／ｇ）、〔ジチオカルバミル〕d はジチオカル
バミルゼラチン中のジチオカルバミル基含有率（ｍｏｌ
／ｇ）、〔アミノ〕g はゼラチン中のアミノ基含有率
（ｍｏｌ／ｇ）である。
のようにして計算した。ゼラチン中のリシン残基のモル
数は変性の有無に関わらず一定のままなので、以下の関
係が成り立つ。 ＭＷd ×（〔アミノ〕d ＋〔ジチオカルバミル〕d ） ＝ＭＷg ×〔アミノ〕g …（１） ここで、ＭＷd はジチオカルバミルゼラチンの分子量、
ＭＷg はゼラチンの分子量（＝９５，０００）、〔アミ
ノ〕d はジチオカルバミルゼラチン中のアミノ基含有率
（ｍｏｌ／ｇ）、〔ジチオカルバミル〕d はジチオカル
バミルゼラチン中のジチオカルバミル基含有率（ｍｏｌ
／ｇ）、〔アミノ〕g はゼラチン中のアミノ基含有率
（ｍｏｌ／ｇ）である。
【００３６】ＰＰＮＩＰＡＭ−グラフトゼラチンの分子
量も以下のようにして計算した。ジチオカルバミン酸塩
誘導体化ゼラチン中の遊離アミノ基のモル数は光グラフ
ト重合の有無に関わらず一定のままなので、以下の関係
が成り立つ。 ＭＷn ×〔アミノ〕n ＝ＭＷd ×〔アミノ〕d …（２） ここで、ＭＷn はＰＰＮＩＰＡＭ−グラフトゼラチンの
分子量、〔アミノ〕n はＰＰＮＩＰＡＭ−グラフトゼラ
チン中のアミノ基含有率（ｍｏｌ／ｇ）である。
量も以下のようにして計算した。ジチオカルバミン酸塩
誘導体化ゼラチン中の遊離アミノ基のモル数は光グラフ
ト重合の有無に関わらず一定のままなので、以下の関係
が成り立つ。 ＭＷn ×〔アミノ〕n ＝ＭＷd ×〔アミノ〕d …（２） ここで、ＭＷn はＰＰＮＩＰＡＭ−グラフトゼラチンの
分子量、〔アミノ〕n はＰＰＮＩＰＡＭ−グラフトゼラ
チン中のアミノ基含有率（ｍｏｌ／ｇ）である。
【００３７】〔下限臨界点温度（ＬＣＳＴ）の測定〕Ｐ
ＮＩＰＡＭまたはＰＮＩＰＡＭグラフトゼラチンを、そ
の濃度が１．０ｍｇ／ｍｌになるように脱イオン水に溶
解し、ＵＶ−ＶＩＳ分光光度計（Ｕｂｅｓｔ−３０、Ｊ
ＡＳＣＯ社製）を用い、１０℃／時の速度で昇温しなが
ら、波長６００ｎｍの光に対する各溶液の透過率を測定
した。この透過率が１００％から９０％に低下した温度
を重合体のＬＣＳＴとした。
ＮＩＰＡＭまたはＰＮＩＰＡＭグラフトゼラチンを、そ
の濃度が１．０ｍｇ／ｍｌになるように脱イオン水に溶
解し、ＵＶ−ＶＩＳ分光光度計（Ｕｂｅｓｔ−３０、Ｊ
ＡＳＣＯ社製）を用い、１０℃／時の速度で昇温しなが
ら、波長６００ｎｍの光に対する各溶液の透過率を測定
した。この透過率が１００％から９０％に低下した温度
を重合体のＬＣＳＴとした。
【００３８】〔ＰＮＩＰＡＭおよびＰＮＩＰＡＭ−グラ
フトゼラチンの具体例〕ゼラチンは、アミノ基含有率
３．１６×１０-4ｍｏｌ／ｇ、分子量９．５×１０4 の
ものを用いた。フォトインファータすなわち４−（Ｎ，
Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）安息香酸は、前
項で説明した方法に従って合成し、ＮＭＲスペクトル測
定により同定した。アミノ基含有率０．３９３×１０-4
ｍｏｌ／ｇ、ジチオカルバミル基含有率２．５４×１０
-4ｎｏｌ／ｇ、前記算出式で計算した分子量１．０×１
０5 であった。
フトゼラチンの具体例〕ゼラチンは、アミノ基含有率
３．１６×１０-4ｍｏｌ／ｇ、分子量９．５×１０4 の
ものを用いた。フォトインファータすなわち４−（Ｎ，
Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）安息香酸は、前
項で説明した方法に従って合成し、ＮＭＲスペクトル測
定により同定した。アミノ基含有率０．３９３×１０-4
ｍｏｌ／ｇ、ジチオカルバミル基含有率２．５４×１０
-4ｎｏｌ／ｇ、前記算出式で計算した分子量１．０×１
０5 であった。
【００３９】ＰＮＩＰＡＭグラフトゼラチンは以下のよ
うにして調製した。まず、縮合剤を用い、ゼラチンのリ
シン残基中のアミノ基とフォトインファータ中のカルボ
キシル基とを水溶液中で縮合反応させることにより、ゼ
ラチン上にフォトインファータを誘導体化した。その
後、フォトインファータ誘導体化ゼラチン（アミノ基を
滴定して求めたフォトインファータ含有率＝２．５４ｍ
ｏｌ／ｇ、アミノ基１個当たりの誘導体化度＝８７．６
％）へのＮＩＰＡＭの光グラフト重合を水溶液中で行っ
た。重合時間は、１５分および３０分に設定した。得ら
れた重合体は、１５分間の重合で得られたものをＰＮＩ
ＰＡＭグラフトゼラチン（Ｉ）と称し、３０分間の重合
で得られたものをＰＮＩＰＡＭグラフトゼラチン（II）
と称した。ＰＮＩＰＡＭはレドックス重合により調製し
た。
うにして調製した。まず、縮合剤を用い、ゼラチンのリ
シン残基中のアミノ基とフォトインファータ中のカルボ
キシル基とを水溶液中で縮合反応させることにより、ゼ
ラチン上にフォトインファータを誘導体化した。その
後、フォトインファータ誘導体化ゼラチン（アミノ基を
滴定して求めたフォトインファータ含有率＝２．５４ｍ
ｏｌ／ｇ、アミノ基１個当たりの誘導体化度＝８７．６
％）へのＮＩＰＡＭの光グラフト重合を水溶液中で行っ
た。重合時間は、１５分および３０分に設定した。得ら
れた重合体は、１５分間の重合で得られたものをＰＮＩ
ＰＡＭグラフトゼラチン（Ｉ）と称し、３０分間の重合
で得られたものをＰＮＩＰＡＭグラフトゼラチン（II）
と称した。ＰＮＩＰＡＭはレドックス重合により調製し
た。
【００４０】得られた各物質の性状を表１に示す。
【００４１】
【表１】 ────────────────────────────────── 実施例１ 実施例２ 比較例 ────────────────────────────────── 重合体 PNIPAM- PNIPAM- PNIPAM ゼラチン(I) ゼラチン(II) ＬＣＳＴ（℃） 34.4 33.4 33.1 アミノ酸含量(x10-4mol/g) 0.284 0.105 − 分子量 ※１ 1.4x105 3.8x105 4.8x105 グラフト鎖分子量 ※２ 1.5x103 1.1x104 − ────────────────────────────────── ※１：ＰＮＩＰＡＭ−ゼラチン（Ｉ）、（II）の分子量
は前記方法で計算した値であり、ＰＮＩＰＡＭの分子量
は、ＤＭＦ中、４０℃でＧＰＣ法により測定された数平
均分子量である。
は前記方法で計算した値であり、ＰＮＩＰＡＭの分子量
は、ＤＭＦ中、４０℃でＧＰＣ法により測定された数平
均分子量である。
【００４２】※２：誘導体化されたジチオカルバミル基
がすべてグラフト重合を開始したと仮定した場合のグラ
フト鎖の数平均分子量を表す。 〔ＬＣＳＴの測定〕ＰＮＩＰＡＭおよびＰＮＩＰＡＭグ
ラフトゼラチンの各水溶液の光透過率の変化を図１に示
す。
がすべてグラフト重合を開始したと仮定した場合のグラ
フト鎖の数平均分子量を表す。 〔ＬＣＳＴの測定〕ＰＮＩＰＡＭおよびＰＮＩＰＡＭグ
ラフトゼラチンの各水溶液の光透過率の変化を図１に示
す。
【００４３】ＰＮＩＰＡＭ水溶液の光透過率は、溶液温
度が生理温度まで上昇すると急激に低下してゼロにな
り、他方、前記２種のＰＮＩＰＡＭ−グラフトゼラチン
水溶液の光透過率は、いずれも、温度上昇とともに徐々
に低下し、生理温度では一定（ＰＮＩＰＡＭグラフトゼ
ラチン（Ｉ）は約６０％、ＰＮＩＰＡＭグラフトゼラチ
ン（II）は３５％）になった。
度が生理温度まで上昇すると急激に低下してゼロにな
り、他方、前記２種のＰＮＩＰＡＭ−グラフトゼラチン
水溶液の光透過率は、いずれも、温度上昇とともに徐々
に低下し、生理温度では一定（ＰＮＩＰＡＭグラフトゼ
ラチン（Ｉ）は約６０％、ＰＮＩＰＡＭグラフトゼラチ
ン（II）は３５％）になった。
【００４４】光透過率９０％で測定したＬＣＳＴは、以
下の通りであった。ＰＮＩＰＡＭは３３．１℃、ＰＮＩ
ＰＡＭグラフトゼラチン（II）は３３．４℃、ＰＮＩＰ
ＡＭグラフトゼラチン（Ｉ）は３４．３℃。これらは、
ゼラチンにＰＮＩＰＡＭをグラフトした結果、前記２種
のＰＮＩＰＡＭグラフトゼラチンのＬＣＳＴが、ＰＮＩ
ＰＡＭのＬＣＳＴより少し高い温度へシフトしたことを
示す。より高い分子量のグラフト鎖（ＰＮＩＰＡＭ−グ
ラフトゼラチン（Ｉ））は、ＰＮＩＰＡＡＭにより近い
ＬＣＳＴを与えると思われる。
下の通りであった。ＰＮＩＰＡＭは３３．１℃、ＰＮＩ
ＰＡＭグラフトゼラチン（II）は３３．４℃、ＰＮＩＰ
ＡＭグラフトゼラチン（Ｉ）は３４．３℃。これらは、
ゼラチンにＰＮＩＰＡＭをグラフトした結果、前記２種
のＰＮＩＰＡＭグラフトゼラチンのＬＣＳＴが、ＰＮＩ
ＰＡＭのＬＣＳＴより少し高い温度へシフトしたことを
示す。より高い分子量のグラフト鎖（ＰＮＩＰＡＭ−グ
ラフトゼラチン（Ｉ））は、ＰＮＩＰＡＡＭにより近い
ＬＣＳＴを与えると思われる。
【００４５】〔細胞培養基材〕ＰＮＩＰＡＭ（比較例）
およびＰＮＩＰＡＭグラフトゼラチン（実施例２）を脱
イオン水に溶解した後、孔径０．２２μｍのマイクロフ
ィルター（ミリポアー社製）で濾過して無菌化した。Ｐ
ＮＩＰＡＭおよびＰＮＩＰＡＭグラフトゼラチンの溶液
を約４℃で均一に混合した後、得られた混合溶液０．４
ｍｌを３５ｍｍの未処理ディシュ（９．６２ｃｍ2 ）に
注いでその表面を均一に被覆し、さらに、清浄なベンチ
中で７時間風乾した。
およびＰＮＩＰＡＭグラフトゼラチン（実施例２）を脱
イオン水に溶解した後、孔径０．２２μｍのマイクロフ
ィルター（ミリポアー社製）で濾過して無菌化した。Ｐ
ＮＩＰＡＭおよびＰＮＩＰＡＭグラフトゼラチンの溶液
を約４℃で均一に混合した後、得られた混合溶液０．４
ｍｌを３５ｍｍの未処理ディシュ（９．６２ｃｍ2 ）に
注いでその表面を均一に被覆し、さらに、清浄なベンチ
中で７時間風乾した。
【００４６】コラゲナーゼ消化法によりウシ胸部大動脈
から採取した内皮細胞（ＥＣ）を、ＦＢＳ１５％、ペニ
シリン５０ＩＵ／ｍｌ、ストレプトマイシン５０μｇ／
ｍｌおよびアンホテリシンＢ２．５μｇ／ｍｌを補充し
たＤＭＥＭ中で、５％ＣＯ2／９５％空気からなる相対
湿度１００％の雰囲気下、３７℃で培養した。前記ポリ
マーがコートされた培養皿にＥＣを播種密度１×１０5
個／ｃｍ2 で播種した後、５％ＣＯ2 ／９５％空気から
なる相対湿度１００％の雰囲気下、３７℃で培養した。
コントロール（照査実験）として、３５ｍｍ組織培養皿
（９．６２ｃｍ2 ）上でも同様の条件下でＥＣを培養し
た。
から採取した内皮細胞（ＥＣ）を、ＦＢＳ１５％、ペニ
シリン５０ＩＵ／ｍｌ、ストレプトマイシン５０μｇ／
ｍｌおよびアンホテリシンＢ２．５μｇ／ｍｌを補充し
たＤＭＥＭ中で、５％ＣＯ2／９５％空気からなる相対
湿度１００％の雰囲気下、３７℃で培養した。前記ポリ
マーがコートされた培養皿にＥＣを播種密度１×１０5
個／ｃｍ2 で播種した後、５％ＣＯ2 ／９５％空気から
なる相対湿度１００％の雰囲気下、３７℃で培養した。
コントロール（照査実験）として、３５ｍｍ組織培養皿
（９．６２ｃｍ2 ）上でも同様の条件下でＥＣを培養し
た。
【００４７】１日間培養後、培養皿を３７℃から、ＬＣ
ＳＴよりも低い雰囲気温度（２０℃）下に移すと、重合
体被覆培養皿からシート状をなす細胞の塊が離脱した。
得られた細胞シートを集め、トリプシンで処理した後、
位相差顕微鏡（ＯＰＴＩＰＨＯＴ２−ＰＯＬ、ニコン社
製）を用いて細胞の数を測定した。試験条件によって、
細胞が培養皿から離脱せずに接着したままになった場合
もある。そこで、それぞれの試験で、培養皿から離脱し
なかった細胞の数も、前記同様の操作で測定した。
ＳＴよりも低い雰囲気温度（２０℃）下に移すと、重合
体被覆培養皿からシート状をなす細胞の塊が離脱した。
得られた細胞シートを集め、トリプシンで処理した後、
位相差顕微鏡（ＯＰＴＩＰＨＯＴ２−ＰＯＬ、ニコン社
製）を用いて細胞の数を測定した。試験条件によって、
細胞が培養皿から離脱せずに接着したままになった場合
もある。そこで、それぞれの試験で、培養皿から離脱し
なかった細胞の数も、前記同様の操作で測定した。
【００４８】図２は、混合溶液中のＰＮＩＰＡＭグラフ
トゼラチンの配合割合を変えて、上記試験を行った結果
を示している。また、培養細胞として、前記ＥＣの代わ
りに、平滑筋細胞（ＳＭＣ）を用いて同様の試験を行
い、その結果を示している。上記試験の結果、ＰＮＩＰ
ＡＭのみでは、細胞培養基材に細胞が接着せず培養がで
きなかった。ＰＮＩＰＡＭグラフトゼラチンの配合割合
が一定以上であれば、培養細胞は細胞培養基材に良好に
接着して培養が行えた。培養細胞の種類によって、好ま
しい配合割合の条件は異なる。ＰＮＩＰＡＭグラフトゼ
ラチンが１００％の場合、細胞培養は良好に行えたが、
温度の変化だけでは細胞の剥離が完全には行えなかっ
た。少量の剥離剤を併用すれば細胞の剥離回収は可能で
あり、この場合、剥離剤のみで剥離させる場合に比べ
て、細胞に対する悪影響を低減することができる。細胞
の剥離回収をより確実に行い、良質の細胞を得るには、
ＰＮＩＰＡＭグラフトゼラチンとＰＮＩＰＡＭとを、適
切な配合割合で併用することが好ましい。
トゼラチンの配合割合を変えて、上記試験を行った結果
を示している。また、培養細胞として、前記ＥＣの代わ
りに、平滑筋細胞（ＳＭＣ）を用いて同様の試験を行
い、その結果を示している。上記試験の結果、ＰＮＩＰ
ＡＭのみでは、細胞培養基材に細胞が接着せず培養がで
きなかった。ＰＮＩＰＡＭグラフトゼラチンの配合割合
が一定以上であれば、培養細胞は細胞培養基材に良好に
接着して培養が行えた。培養細胞の種類によって、好ま
しい配合割合の条件は異なる。ＰＮＩＰＡＭグラフトゼ
ラチンが１００％の場合、細胞培養は良好に行えたが、
温度の変化だけでは細胞の剥離が完全には行えなかっ
た。少量の剥離剤を併用すれば細胞の剥離回収は可能で
あり、この場合、剥離剤のみで剥離させる場合に比べ
て、細胞に対する悪影響を低減することができる。細胞
の剥離回収をより確実に行い、良質の細胞を得るには、
ＰＮＩＰＡＭグラフトゼラチンとＰＮＩＰＡＭとを、適
切な配合割合で併用することが好ましい。
【００４９】〔細胞の選別（cell sorting）〕異なる細
胞に対する接着性の違い（differential cell adhesive
ness）を利用して、細胞の選別を行うことができる。図
２に例示するように、細胞培養基材におけるＰＮＩＰＡ
Ｍグラフトゼラチンの配合割合を変えたときに、細胞が
ＥＣの場合とＳＭＣの場合とでは、細胞培養の結果に大
きな違いが生じている。ＰＮＩＰＡＭグラフトゼラチン
とＰＮＩＰＡＭとが特定の配合割合からなる細胞培養基
材では、ＳＭＣに比べてＥＣのほうが極端に高い接着性
を示している。
胞に対する接着性の違い（differential cell adhesive
ness）を利用して、細胞の選別を行うことができる。図
２に例示するように、細胞培養基材におけるＰＮＩＰＡ
Ｍグラフトゼラチンの配合割合を変えたときに、細胞が
ＥＣの場合とＳＭＣの場合とでは、細胞培養の結果に大
きな違いが生じている。ＰＮＩＰＡＭグラフトゼラチン
とＰＮＩＰＡＭとが特定の配合割合からなる細胞培養基
材では、ＳＭＣに比べてＥＣのほうが極端に高い接着性
を示している。
【００５０】例えば、ＰＮＩＰＡＭグラフトゼラチンと
ＰＮＩＰＡＭとが特定の配合割合のときに、接着性が１
０倍異なる細胞の組み合わせでは、前記した細胞培養操
作を３回繰り返すことによって、選択的に取得したい細
胞（接着性が良好）に対して排除したい細胞（接着性が
劣る）細胞は１／１０００にも濃度が希釈されることに
なる。
ＰＮＩＰＡＭとが特定の配合割合のときに、接着性が１
０倍異なる細胞の組み合わせでは、前記した細胞培養操
作を３回繰り返すことによって、選択的に取得したい細
胞（接着性が良好）に対して排除したい細胞（接着性が
劣る）細胞は１／１０００にも濃度が希釈されることに
なる。
【００５１】具体的には、培養細胞としてＥＣとＳＭＣ
との両方を播種する以外は、前記実施形態と同様にして
細胞培養試験を行った。試験の結果、ＰＮＩＰＡＭグラ
フトゼラチンの配合割合が２．９〜５重量％の範囲で、
ＥＣのみを選択的に培養して回収することができた。こ
の結果から、生体から採取された組織のように、複数の
細胞が混在している試料を用いても、目的の細胞のみを
選択的に培養して回収できることが判る。
との両方を播種する以外は、前記実施形態と同様にして
細胞培養試験を行った。試験の結果、ＰＮＩＰＡＭグラ
フトゼラチンの配合割合が２．９〜５重量％の範囲で、
ＥＣのみを選択的に培養して回収することができた。こ
の結果から、生体から採取された組織のように、複数の
細胞が混在している試料を用いても、目的の細胞のみを
選択的に培養して回収できることが判る。
【００５２】この技術は、細胞の選別操作あるいはモノ
クロナール選別に適用することができる。 〔モノクロナール選別〕図３に示す実施形態は、組織塊
から得られた細胞を、シャーレ等に前記細胞培養基材を
介して接着させた後、任意の場所にある特定の単一細胞
あるいはコロニーのみを回収する。
クロナール選別に適用することができる。 〔モノクロナール選別〕図３に示す実施形態は、組織塊
から得られた細胞を、シャーレ等に前記細胞培養基材を
介して接着させた後、任意の場所にある特定の単一細胞
あるいはコロニーのみを回収する。
【００５３】図３(a) に示すように、ガラス等からなる
培養皿２０の内底に、ＰＮＩＰＡＭグラフトゼラチンと
ＰＮＩＰＡＭとを含む細胞培養基材の層２２を介して、
単一細胞または細胞のコロニー（以下、細胞コロニーと
総称する）１０、１２、１４を接着させる。基材層２２
をＬＣＳＴよりも高い温度に維持しておけば、細胞コロ
ニー１０、１２、１４は確実に接着された状態となる。
培養皿２０には培養液２４が満たされている。
培養皿２０の内底に、ＰＮＩＰＡＭグラフトゼラチンと
ＰＮＩＰＡＭとを含む細胞培養基材の層２２を介して、
単一細胞または細胞のコロニー（以下、細胞コロニーと
総称する）１０、１２、１４を接着させる。基材層２２
をＬＣＳＴよりも高い温度に維持しておけば、細胞コロ
ニー１０、１２、１４は確実に接着された状態となる。
培養皿２０には培養液２４が満たされている。
【００５４】図３(b) に示すように、培養皿２０の底部
裏側に、棒状のガラス等からなり、低温（例えば、−７
０℃程度）に冷却された冷却体３０を押し当てる。冷却
体３０の接触個所付近が急速に冷却される。培養皿２０
の内底面に配置された細胞培養基材２２のうち、冷却体
３０の接触個所に近い部分がＬＣＳＴよりも低い温度ま
で冷却されると、その部分の細胞培養基材２２のみが接
着性を失って、接着されていた細胞コロニー１２が剥が
れる。そのとき、冷却体３０よりも遠い個所では、まだ
ＬＣＳＴを超える温度が維持されているので、その部分
の細胞培養基材２２は細胞コロニー１０、１４を接着し
続ける。目的の細胞コロニー１２が培養皿２０から剥離
されれば、直ちに冷却体３０を培養皿２０から引き離
す。
裏側に、棒状のガラス等からなり、低温（例えば、−７
０℃程度）に冷却された冷却体３０を押し当てる。冷却
体３０の接触個所付近が急速に冷却される。培養皿２０
の内底面に配置された細胞培養基材２２のうち、冷却体
３０の接触個所に近い部分がＬＣＳＴよりも低い温度ま
で冷却されると、その部分の細胞培養基材２２のみが接
着性を失って、接着されていた細胞コロニー１２が剥が
れる。そのとき、冷却体３０よりも遠い個所では、まだ
ＬＣＳＴを超える温度が維持されているので、その部分
の細胞培養基材２２は細胞コロニー１０、１４を接着し
続ける。目的の細胞コロニー１２が培養皿２０から剥離
されれば、直ちに冷却体３０を培養皿２０から引き離
す。
【００５５】培養皿２０の内底面から剥がれた細胞コロ
ニー１２は、顕微鏡下でピペットなどを用いて吸い上げ
て回収する。その結果、多数の細胞コロニー１０〜１４
の中から目的の細胞コロニー１２だけを選択的に取り出
すことができる。
ニー１２は、顕微鏡下でピペットなどを用いて吸い上げ
て回収する。その結果、多数の細胞コロニー１０〜１４
の中から目的の細胞コロニー１２だけを選択的に取り出
すことができる。
【００５６】
【発明の効果】本発明の感温性高分子化合物は、ゼラチ
ンにＰＮＩＰＡＭがグラフト重合しているので、ゼラチ
ンが有する各種の優れた機能と、ＰＮＩＰＡＭが有する
優れた感温性との両方を確実に発揮することが可能にな
る。細胞培養基材として使用したときには、細胞の接着
性が高く細胞培養が良好に行えるとともに、温度を変え
るだけで培養された細胞を容易に剥離して回収すること
ができる。
ンにＰＮＩＰＡＭがグラフト重合しているので、ゼラチ
ンが有する各種の優れた機能と、ＰＮＩＰＡＭが有する
優れた感温性との両方を確実に発揮することが可能にな
る。細胞培養基材として使用したときには、細胞の接着
性が高く細胞培養が良好に行えるとともに、温度を変え
るだけで培養された細胞を容易に剥離して回収すること
ができる。
【図１】本発明の感温性高分子化合物のＬＣＳＴ測定結
果を示すグラフ図
果を示すグラフ図
【図２】細胞培養試験の結果を示すグラフ図
【図３】モノクロナール選別の実施工程を段階的に表す
断面図
断面図
１０〜１４ 細胞コロニー ２０ 培養皿 ２２ 細胞培養基材層 ３０ 冷却体
Claims (5)
- 【請求項１】ゼラチンにＮ−イソプロピルアクリルアミ
ドポリマーがグラフト重合されてなる感温性高分子化合
物。 - 【請求項２】前記ゼラチン分子１本当たり３本以上の前
記Ｎ−イソプロピルアクリルアミドポリマーがグラフト
重合されてなり、平均グラフト鎖長が２．１×１０3 以
上である請求項１に記載の感温性高分子化合物。 - 【請求項３】ゼラチンと４−（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオ
カルバミル）安息香酸とを縮合剤の存在下で反応させ
て、ジチオカルバメート化ゼラチン分子を得る工程と、 前記ジチオカルバメート化ゼラチンと感温性高分子生成
単量体との混合水溶液に紫外線を照射して、ゼラチンに
前記単量体のホモポリマーがグラフト重合された感温性
高分子化合物を得る工程とを含む感温性高分子化合物の
製造方法。 - 【請求項４】請求項１または２に記載の感温性高分子化
合物と、 単体のＮ−イソプロピルアクリルアミドポリマーとを含
む感温性高分子組成物。 - 【請求項５】請求項１または２に記載の感温性高分子化
合物を含む細胞培養基材。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10158225A JPH11349643A (ja) | 1998-06-05 | 1998-06-05 | 感温性高分子化合物およびその製造方法、感温性高分子組成物、細胞培養基材 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10158225A JPH11349643A (ja) | 1998-06-05 | 1998-06-05 | 感温性高分子化合物およびその製造方法、感温性高分子組成物、細胞培養基材 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11349643A true JPH11349643A (ja) | 1999-12-21 |
Family
ID=15667022
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10158225A Pending JPH11349643A (ja) | 1998-06-05 | 1998-06-05 | 感温性高分子化合物およびその製造方法、感温性高分子組成物、細胞培養基材 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH11349643A (ja) |
Cited By (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007319534A (ja) * | 2006-06-02 | 2007-12-13 | National Cardiovascular Center | ヘパリンコーティング剤及び医療用具 |
| EP1970439A2 (en) | 2007-03-15 | 2008-09-17 | Dai Nippon Printing Co., Ltd. | Cell culture support and manufacture thereof |
| WO2011125615A1 (ja) | 2010-04-02 | 2011-10-13 | 独立行政法人産業技術総合研究所 | 細胞分別方法、細胞培養基材、および細胞分別装置 |
| CN107163882A (zh) * | 2017-06-10 | 2017-09-15 | 马可足 | 一种可热剥离型临时固定粘合剂及其制备方法 |
| WO2018131661A1 (ja) | 2017-01-12 | 2018-07-19 | 株式会社ニコン | 細胞培養基材、培養容器、細胞培養容器の製造方法、細胞の取得方法、細胞の培養方法 |
| WO2019069931A1 (ja) * | 2017-10-03 | 2019-04-11 | 公立大学法人大阪府立大学 | 細胞培養容器、細胞の取得方法、および細胞の培養方法 |
| CN109734851A (zh) * | 2018-12-28 | 2019-05-10 | 华南理工大学 | 一种温敏聚合物及其合成方法与温敏可注射水凝胶 |
| JP2019129797A (ja) * | 2018-02-02 | 2019-08-08 | 大日本印刷株式会社 | 細胞構造体を剥離するための治具、並びに細胞構造体の作製装置及び細胞構造体の作製方法 |
| WO2019163877A1 (ja) | 2018-02-21 | 2019-08-29 | 公立大学法人大阪 | 細胞培養容器、細胞培養容器の製造方法、細胞回収システムおよび細胞の取得方法 |
| CN114920972A (zh) * | 2022-05-25 | 2022-08-19 | 广州热泉科技有限公司 | 一种温敏性培养皿的制备方法 |
| CN116239720A (zh) * | 2023-02-06 | 2023-06-09 | 四川大学 | 具有双重碱基面识别Hg2+的温敏性线性高分子材料及其制备方法 |
-
1998
- 1998-06-05 JP JP10158225A patent/JPH11349643A/ja active Pending
Cited By (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007319534A (ja) * | 2006-06-02 | 2007-12-13 | National Cardiovascular Center | ヘパリンコーティング剤及び医療用具 |
| EP1970439A2 (en) | 2007-03-15 | 2008-09-17 | Dai Nippon Printing Co., Ltd. | Cell culture support and manufacture thereof |
| EP2135940A1 (en) | 2007-03-15 | 2009-12-23 | Dai Nippon Printing Co., Ltd. | Cell culture support and manufacture thereof |
| US8557583B2 (en) | 2007-03-15 | 2013-10-15 | Dai Nippon Printing Co., Ltd. | Cell culture support and manufacture thereof |
| WO2011125615A1 (ja) | 2010-04-02 | 2011-10-13 | 独立行政法人産業技術総合研究所 | 細胞分別方法、細胞培養基材、および細胞分別装置 |
| US9434936B2 (en) | 2010-04-02 | 2016-09-06 | National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology | Method for removing cells |
| US11697791B2 (en) | 2017-01-12 | 2023-07-11 | Nikon Corporation | Cell culture substrate, culture vessel, method for producing cell culture vessel, method for acquiring cells and method for culturing cells |
| WO2018131661A1 (ja) | 2017-01-12 | 2018-07-19 | 株式会社ニコン | 細胞培養基材、培養容器、細胞培養容器の製造方法、細胞の取得方法、細胞の培養方法 |
| CN107163882A (zh) * | 2017-06-10 | 2017-09-15 | 马可足 | 一种可热剥离型临时固定粘合剂及其制备方法 |
| WO2019069931A1 (ja) * | 2017-10-03 | 2019-04-11 | 公立大学法人大阪府立大学 | 細胞培養容器、細胞の取得方法、および細胞の培養方法 |
| JPWO2019069931A1 (ja) * | 2017-10-03 | 2020-10-22 | 公立大学法人大阪 | 細胞培養容器、細胞の取得方法、および細胞の培養方法 |
| JP2019129797A (ja) * | 2018-02-02 | 2019-08-08 | 大日本印刷株式会社 | 細胞構造体を剥離するための治具、並びに細胞構造体の作製装置及び細胞構造体の作製方法 |
| WO2019163877A1 (ja) | 2018-02-21 | 2019-08-29 | 公立大学法人大阪 | 細胞培養容器、細胞培養容器の製造方法、細胞回収システムおよび細胞の取得方法 |
| CN109734851A (zh) * | 2018-12-28 | 2019-05-10 | 华南理工大学 | 一种温敏聚合物及其合成方法与温敏可注射水凝胶 |
| CN114920972A (zh) * | 2022-05-25 | 2022-08-19 | 广州热泉科技有限公司 | 一种温敏性培养皿的制备方法 |
| CN116239720A (zh) * | 2023-02-06 | 2023-06-09 | 四川大学 | 具有双重碱基面识别Hg2+的温敏性线性高分子材料及其制备方法 |
| CN116239720B (zh) * | 2023-02-06 | 2024-05-31 | 四川大学 | 具有双重碱基面识别Hg2+的温敏性线性高分子材料及其制备方法 |
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