JPWO2019069931A1 - 細胞培養容器、細胞の取得方法、および細胞の培養方法 - Google Patents
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Abstract
流体を注入する注入口（２１）と、流体を排出する排出口（２２）と、前記注入口と前記排出口とを結び、且つ、加熱によって変性するゲル中に金微粒子（１３）を分散させてなる細胞培養基材（１４）を収納する流路（２３）と、を備える細胞培養容器。該細胞培養容器で培養された細胞から、取得する細胞を選択する工程と、前記選択された細胞の近傍の前記ゲルに光を照射する工程と、前記細胞培養容器の前記流路に液体を流す工程と、 前記細胞培養容器の前記排出口から細胞を回収する工程と、を含む細胞の取得方法。
Description
本発明は、細胞培養容器、細胞の取得方法、および細胞の培養方法に関する。
本願は、２０１７年１０月３日に、日本に出願された特願２０１７−１９３５８４号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
本願は、２０１７年１０月３日に、日本に出願された特願２０１７−１９３５８４号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
培養基材で培養された細胞をより効率的に回収するため、例えば、感温性高分子を含む 培養基材の上で細胞を培養し、温度変化を利用して細胞の回収を行う方法が提案されている（特許文献１参照）。
本発明の第１の態様によると、細胞培養容器は、流体を注入する注入口と、流体を排出する排出口と、前記注入口と前記排出口とを結び、且つ、加熱によって変性するゲル中に金微粒子を分散させてなる細胞培養基材を収納する流路と、を備える。
本発明の第２の態様によると、細胞の取得方法は、第１の態様の細胞培養容器で培養された細胞から、取得する細胞を選択する工程と、前記選択された細胞の近傍の前記ゲルに光を照射する工程と、前記細胞培養容器の前記流路に液体を流す工程と、前記細胞培養容器の前記排出口から細胞を回収する工程と、を含む。
本発明の第３の態様によると、細胞の培養方法は、第３の態様の細胞の取得方法により 取得した細胞を培養する。
本発明の第２の態様によると、細胞の取得方法は、第１の態様の細胞培養容器で培養された細胞から、取得する細胞を選択する工程と、前記選択された細胞の近傍の前記ゲルに光を照射する工程と、前記細胞培養容器の前記流路に液体を流す工程と、前記細胞培養容器の前記排出口から細胞を回収する工程と、を含む。
本発明の第３の態様によると、細胞の培養方法は、第３の態様の細胞の取得方法により 取得した細胞を培養する。
（第１の実施形態）
以下では、適宜図面を参照しながら、一実施形態の細胞培養容器、および細胞の取得方法等について説明する。
以下では、適宜図面を参照しながら、一実施形態の細胞培養容器、および細胞の取得方法等について説明する。
細胞培養基材の上で培養した細胞のうち、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）から分化誘導された細胞等、特定の細胞を効率的に剥離し、回収することがしばしば必要になる。
本発明者らは、細胞培養基材を流路内に配置し、外部からの光により、細胞培養基材に局所的な温度変化を加えて所望の細胞の細胞培養基材に対する接着性を弱めた後、流路に液体を流して、液体のせん断応力により細胞を剥離し、液体ごと細胞を回収することにより、効率的に所望の細胞のみを回収できることを見出した。
本実施形態の細胞培養容器は、流体を注入する注入口と、流体を排出する排出口を備え、該注入口と該排出口とを結ぶ流路に、細胞培養基材を収納することにより、該細胞培養容器に流体を流して剥離した細胞をまとめて回収することができる。
本発明者らは、細胞培養基材を流路内に配置し、外部からの光により、細胞培養基材に局所的な温度変化を加えて所望の細胞の細胞培養基材に対する接着性を弱めた後、流路に液体を流して、液体のせん断応力により細胞を剥離し、液体ごと細胞を回収することにより、効率的に所望の細胞のみを回収できることを見出した。
本実施形態の細胞培養容器は、流体を注入する注入口と、流体を排出する排出口を備え、該注入口と該排出口とを結ぶ流路に、細胞培養基材を収納することにより、該細胞培養容器に流体を流して剥離した細胞をまとめて回収することができる。
図１は、本実施形態の細胞培養容器１の断面図である。細胞培養容器１は、流体を注入する注入口２１と、流体を排出する排出口２２と、前記注入口と排出口を結ぶ流路２３と、を備える。流路２３には、加熱によって変性するゲル１５中に金微粒子を分散させてなる細胞培養用基材１４が収納されている。金微粒子１３は、ゲル１５の内部の微小体積要素１９を拡大して模式的に示した。
流体とは、液体又は気体をいう。液体としては、例えば、各種の培養液や緩衝液が細胞の種類に応じて選択して用いられ、気体としては、例えば、空気が用いられる。
流体とは、液体又は気体をいう。液体としては、例えば、各種の培養液や緩衝液が細胞の種類に応じて選択して用いられ、気体としては、例えば、空気が用いられる。
金微粒子１３は、光熱変換特性の高い大きさの粒子とすることができ、特に、表面プラズモン共鳴吸収（ＳＰＲ）が起こる大きさとしてもよい。レーザー回折式粒度分布測定装置を用いて測定された金微粒子１３の体積平均径は、例えば、１ｎｍ以上２００ｎｍ未満、１０ｎｍ以上１００ｎｍ未満、３０ｎｍ以上７０ｎｍ未満とすることができる。ゲル１５での金微粒子１３の濃度は、例えば、１００μＭ以上１０００μＭ未満、２５０μＭ以上５００μＭ以下としてもよい。金微粒子１３の濃度が低いと、金微粒子１３の発熱量が小さくなるため、細胞培養基材の熱変性が起こりにくくなり、細胞の剥離成功確率が下がる傾向がある。一方、金微粒子１３の濃度が高いと、局所での温度上昇が大きくなるため、温度制御が難しくなり、また細胞傷害性が高くなる傾向がある。
なお、金微粒子１３は、デンドリマーに内包させたり、ゲルに対して親和性を有する分子で修飾したりする等、保護剤を用いてゲル中でより安定化するようにしてもよい。
なお、金微粒子１３は、デンドリマーに内包させたり、ゲルに対して親和性を有する分子で修飾したりする等、保護剤を用いてゲル中でより安定化するようにしてもよい。
ゲル１５は、室温から所定の温度に上昇した場合に変性する。本実施形態で「変性」とは、ゲル１５が温度上昇により、細胞の容易な剥離をもたらす構造の変化を起こすことを意味する。ゲル１５がコラーゲンゲルまたはゼラチンゲルの場合、「変性」には、例えば、コラーゲンタンパク質の二次または三次構造の変化によりもたらされる状態であるゾル化や凝集化、低分子化等が含まれる。ゲル１５が変性する温度は、例えば６０℃以下、５０℃以下、４０℃以下である。ゲル１５の材料は、後述の剥離による細胞の取得を可能にするものであれば特に限定されないが、例えば、コラーゲンゲルまたはゼラチンゲルとしてもよい。二種類以上の高分子を混合して得たゲルを用いることもできる。
細胞培養容器１の底部３２及び上部３１の少なくとも一方は、光透過性を有する材料で形成される。細胞培養容器１は、本実施形態の細胞培養容器１の技術的特徴を損なわない限り任意の形状で構成され得る。
細胞培養容器１の底部３２及び上部３１の材質は、酸素透過性を有するものであってよい。例えば、アクリルやポリスチレン等の酸素透過性高分子樹脂等が挙げられる。酸素透過性を有することにより、外部から細胞５０の培養に必要な酸素を供給することができる。
細胞培養容器１の底部３２及び上部３１の材質は、酸素透過性を有するものであってよい。例えば、アクリルやポリスチレン等の酸素透過性高分子樹脂等が挙げられる。酸素透過性を有することにより、外部から細胞５０の培養に必要な酸素を供給することができる。
図２は、細胞培養容器を用いて細胞の取得を行う細胞回収システム１０００を示す概念図である。細胞取得システム１０００は、細胞培養容器１と、倒立顕微鏡７０とを備える。
細胞培養容器１には、細胞培養基材１４の搭載面１１上に細胞５０が培養液５１中で培養されている。
細胞培養容器１には、細胞培養基材１４の搭載面１１上に細胞５０が培養液５１中で培養されている。
細胞培養基材１４で培養されている細胞５０のうち、単離して取得したい細胞を選択細胞５００とし、その他の細胞を非選択細胞５０１とする。選択細胞５００はその態様は特に限定されないが、例えば、適切に遺伝子等が改変されレポーター遺伝子等の判別手段により特徴が現れている細胞や、初期化や適切な分化等が誘導されて構造上判別可能な特徴を有している細胞等が挙げられる。
なお、選択細胞５００は、上記のように単一の細胞５０でもよいし、複数の細胞５０または複数の細胞５０を含んで構成されるコロニーでもよい。
なお、選択細胞５００は、上記のように単一の細胞５０でもよいし、複数の細胞５０または複数の細胞５０を含んで構成されるコロニーでもよい。
倒立顕微鏡７０は、照射部７１と、ダイクロイックミラー７２と、レンズ系７３と、観察部７４と、支持台７５とを備える。
なお、正立顕微鏡を用いて細胞回収システム１０００を構築してもよい。
なお、正立顕微鏡を用いて細胞回収システム１０００を構築してもよい。
照射部７１は、レーザー光を出射する。照射部７１から出射されるレーザー光の波長は、金微粒子１３が光熱変換特性を発揮する波長域に設定される。特に表面プラズモン共鳴吸収（ＳＰＲ）が起こる波長域に設定してもよい。ゲル１５に照射されるレーザー光は、細胞に照射した場合に重大な損傷を与えない波長およびエネルギーを有するものであればよい。照射部７１から出射されるレーザー光の波長は、例えば、４００ｎｍ以上１２００ｎｍ未満、４５０ｎｍ以上９００ｎｍ未満、５３２ｎｍ等に設定される。細胞培養容器１へ入射するレーザー光の出力は、例えば０．１ｍＷ以上１０００ｍＷ未満、０．４ｍＷ以上１００ｍＷ未満とすることができる。レーザー光の波長およびエネルギーは、細胞に傷害を与えずにゲル１５に効率よく温度上昇および変性を起こすよう、適宜調整される。照射部７１から出射した光は、ダイクロイックミラー７２に入射する。
なお、選択細胞５００の近傍を選択的に照射することができれば、照射部７１の出射光は特にレーザー光に限定されず、コヒーレントでない単色光や一定の波長範囲の光からなる光でもよい。
なお、選択細胞５００の近傍を選択的に照射することができれば、照射部７１の出射光は特にレーザー光に限定されず、コヒーレントでない単色光や一定の波長範囲の光からなる光でもよい。
ダイクロイックミラー７２は、照射部７１からのレーザー光を反射するとともに、細胞培養容器１からの可視光を透過させて観察部７４へと出射する。ダイクロイックミラー７２で反射されたレーザー光は、不図示のガルバノミラー等により適切な位置にレーザー光が照射されるように光の向きが調節され、レンズ系７３を透過して細胞培養容器１に入射する。細胞培養容器１に入射したレーザー光は、細胞培養容器１の底部３２、細胞培養基材１４を透過した後、細胞培養基材１４において選択細胞５００の近傍の所定の位置で収束する。図２では、収束するレーザー光７を、一点鎖線を用いて模式的に示した。
なお、所望の位置にレーザー光７を収束することができれば、レーザー光７の照射光学系の構成は特に限定されない。
また、レーザー光の照射位置を固定し、支持台７５を移動することによって、選択細胞５００の近傍にレーザー光が収束する構成としてもよい。
なお、所望の位置にレーザー光７を収束することができれば、レーザー光７の照射光学系の構成は特に限定されない。
また、レーザー光の照射位置を固定し、支持台７５を移動することによって、選択細胞５００の近傍にレーザー光が収束する構成としてもよい。
細胞培養基材１４におけるレーザー光７の収束位置は、例えば、選択細胞５００に傷害を与えずに選択細胞５００の下方のできるだけ近い位置とすることができ、レーザー光７のスポット径、ＰＳＦ（Ｐｏｉｎｔ Ｓｐｒｅａｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ）やＰＳＦに基づくパラメータ等に基づいて定められる。細胞培養基材１４におけるレーザー光７の収束位置は、例えば、選択細胞５００の直下であって、深さが１００μｍ未満の範囲、または選択細胞５００から半径１００μｍ未満の範囲とすることができる。また、細胞傷害性に問題が無ければ、選択細胞５００を収束位置としてもよい。
照射部７１からのレーザー光７を金微粒子１３が光熱変換し、レーザー光７の収束位置の近傍のゲルが変性すると、選択細胞５００の足場となっているゲルまたは周囲の環境の物理的または化学的特性が変化するため、選択細胞５００が搭載面１１との接着性が弱まる。従って、流路１５に液体を流すことにより、選択細胞５００のみをゲルから剥離させ、取り出すことができる。具体的には、例えば、液体の貯留槽と注入口２１とを直接的又は間接的にチューブ等で接続し、ポンプを使用して注入口２１から送液するか、排出口２２から吸引することにより、流路１５に液体を流すことができる。この液体のせん断応力によってゲルから剥離した選択細胞５００は液体によって排出口２２に押し流されるので、排出口２２から液体ごと回収することができる。
観察部７４は、接眼レンズ等を備え、不図示の照明により照らされた細胞培養容器１からの可視光をユーザにより観察可能にする。ユーザは、細胞培養容器１からの可視光を見て、支持台７５を移動させる等して細胞培養容器１を適切に位置合わせ等することができる。
なお、レーザー光７の照射光学系とは異なるレーザー光源およびガルバノミラーを用いてレーザー走査を行うことにより細胞培養容器１の画像を取得し、不図示の表示装置に表示する構成としてもよい。
なお、レーザー光７の照射光学系とは異なるレーザー光源およびガルバノミラーを用いてレーザー走査を行うことにより細胞培養容器１の画像を取得し、不図示の表示装置に表示する構成としてもよい。
支持台７５は、細胞培養容器１を支持する。支持台７５は不図示の移動機構によりＸＹＺの各方向に移動可能であり、これにより細胞培養容器１を任意の位置に調整することが可能である。支持台７５は、例えば、透明発熱体が形成されたガラスを含んで構成され、細胞培養容器１の底部３２へレーザー光７を透過させると共に、細胞培養容器１全体の温度を制御する。
なお、細胞培養容器１の大きさ、構造等に応じて、レーザー光７の光路となる部分に開口部が形成されている支持台７５を用いることもできる。
なお、細胞培養容器１の大きさ、構造等に応じて、レーザー光７の光路となる部分に開口部が形成されている支持台７５を用いることもできる。
本実施形態の細胞培養基材１４は、金微粒子の濃度の異なる複数のゲルが積層されたものであってもよい。例えば、細胞培養基材１４は、金微粒子を含むゲル１５の下に、金微粒子を含まないかゲル１５より低濃度で含むゲルの層を配置したものとすることができる。複数のゲルの層を備えることにより、発熱層であるゲル１５の厚さが面内で概ね均一となる。これにより、レーザー光７の照射条件の調整が容易となり、照射部位を変えた場合であっても細胞の単離が容易となる。
図３は、細胞培養容器１のＸＺ平面の断面図を示したものである。
本実施形態の細胞培養基材１４は、ゲル１５の厚さを、例えば０．４ｍｍ以上、０．５ｍｍ以上１．７ｍｍ以下、０．５ｍｍ以上１．２ｍｍ以下とすることができる。ゲル１５の厚さが薄すぎるとゲル１５を均一または平坦に作成することが難しくなる傾向がある。一方でゲル１５の厚さが厚すぎると、流路２３を満たす培養液の量が少なくなり、細胞の培養が難しくなる傾向がある。また、ゲル１５に到達する光が減弱し、細胞５０近傍での金微粒子１３の発熱量が減少することがあるため、細胞５０の取得が難しくなる可能性がある。
ここで、ゲル１５の厚さは、細胞培養容器１の底部３２の表面からの厚さの平均をいう。
本実施形態の細胞培養基材１４は、ゲル１５の厚さを、例えば０．４ｍｍ以上、０．５ｍｍ以上１．７ｍｍ以下、０．５ｍｍ以上１．２ｍｍ以下とすることができる。ゲル１５の厚さが薄すぎるとゲル１５を均一または平坦に作成することが難しくなる傾向がある。一方でゲル１５の厚さが厚すぎると、流路２３を満たす培養液の量が少なくなり、細胞の培養が難しくなる傾向がある。また、ゲル１５に到達する光が減弱し、細胞５０近傍での金微粒子１３の発熱量が減少することがあるため、細胞５０の取得が難しくなる可能性がある。
ここで、ゲル１５の厚さは、細胞培養容器１の底部３２の表面からの厚さの平均をいう。
細胞培養後、レーザー光７を照射する前に、ゲル１５を加温してもよい。これにより、ゲルを変性させるためにレーザー光を照射する時間を短くすることができ、選択細胞５００へのレーザー光による影響を低減することもできる。ゲル１５の加温方法の一例として、図４に示すように、注入口２１から流路２３に矢印の方向に沿って、ゲルに全体的な変性が起きる温度未満の温度、例えば、３７℃以上４０℃未満の温度の液体（例えば培養液）を注入する方法が挙げられる。注入口２１から流路２３にゲルに全体的な変性が起きる温度未満の液体５１を供給することにより、選択細胞５００の周囲の温度が上昇する。
ゲル１５の加温には、支持台７５の発熱体を用いてもよく、細胞培養容器１を温度制御可能なインキュベータに載置してもよく、またこれらの方法を二以上併用してもよい。
また、流路２３内の液体５１は、レーザー光７を照射したときに、選択細胞５００の近傍でのゲル表面温度の上昇を抑制し、選択細胞の剥離の効率を下げる傾向がある。そのため、レーザー光７を照射する前に、注入口２１に空気を注入するか、排出口２２から液体を吸引することにより、液体５１を排出口２２より除去してもよい。液体５１の除去は完全でなくてもよく、一部の液体が流路２３に残っていてもよいが、残存する液体が多すぎると、選択細胞５００の近傍でのゲル表面温度の上昇が抑制されるため、選択細胞５００の取得効率を上げることが難しくなる。また、液体を除去しすぎると細胞５０に障害を与える可能性がある。例えば、液体が、ゲル１４の搭載面１１から０．１ｍｍ〜０．８ｍｍとなる程度に液体５１を除去してもよい。
なお、ここで液体を除去しておくと、レーザー照射後、流路２３に液体を流す際、気体と液体の界面がゲル１４の搭載面１１を通過するので、選択細胞５００により大きなせん断応力がかかり、剥離しやすいという効果も得られる。
ゲル１５の加温には、支持台７５の発熱体を用いてもよく、細胞培養容器１を温度制御可能なインキュベータに載置してもよく、またこれらの方法を二以上併用してもよい。
また、流路２３内の液体５１は、レーザー光７を照射したときに、選択細胞５００の近傍でのゲル表面温度の上昇を抑制し、選択細胞の剥離の効率を下げる傾向がある。そのため、レーザー光７を照射する前に、注入口２１に空気を注入するか、排出口２２から液体を吸引することにより、液体５１を排出口２２より除去してもよい。液体５１の除去は完全でなくてもよく、一部の液体が流路２３に残っていてもよいが、残存する液体が多すぎると、選択細胞５００の近傍でのゲル表面温度の上昇が抑制されるため、選択細胞５００の取得効率を上げることが難しくなる。また、液体を除去しすぎると細胞５０に障害を与える可能性がある。例えば、液体が、ゲル１４の搭載面１１から０．１ｍｍ〜０．８ｍｍとなる程度に液体５１を除去してもよい。
なお、ここで液体を除去しておくと、レーザー照射後、流路２３に液体を流す際、気体と液体の界面がゲル１４の搭載面１１を通過するので、選択細胞５００により大きなせん断応力がかかり、剥離しやすいという効果も得られる。
図５は、目的の細胞にレーザー光７を照射する操作を模式的に示した図である。液体５１を除去する場合はその後、選択細胞５００の近傍にレーザー光７を照射すると、ゲル１５中の金微粒子１３が光熱変換し、選択細胞５００の足場となっているゲルまたは周囲の環境の物理的または化学的特性が変化するため、選択細胞５００を搭載面１１に付着させている力が弱まり、流路に液体を流すと、せん断応力により選択細胞５００が搭載面１１から剥離する。
図６は、目的の細胞にレーザー光７を照射した後の操作を模式的に示した図である。レーザー光７により搭載面１１に対する接着性が弱くなった選択細胞５００は、流路１５に液体を流すことにより、液体のせん断応力によって搭載面１１から剥離し、液体によって排出口２２に押し流されるので、排出口２２から液体ごと回収することができる。
流路１５に液体を流す速さは、当業者が適宜決定することができる。
流路１５に液体を流す速さは、当業者が適宜決定することができる。
（細胞培養基材１の製造方法）
図７は、本実施形態の細胞培養容器１の製造方法の流れを示すフローチャートである。
ステップＳ１００１において、所定の体積平均径を有する金微粒子１３を含む溶液を調製する。例えば、特開２０１３−２３３１０１号公報に記載の方法のように、金イオンを含む溶液（ＨＡｕＣｌ４等）中で還元剤（アスコルビン酸、ヒドロキノン、クエン酸等）の存在下に、金からなる種核を成長させて得ることができる。ステップＳ１００１が終了したら、ステップＳ１００３に進む。
金微粒子１３の体積平均径は、調整した金微粒子１３をレーザー回折式粒度分布測定装置で測定することができる。粒度分布測定装置を用いず、簡易的に測定する場合は、透過型電子顕微鏡を用いて撮像し、解析ソフトウェア等を用いて測定して算出することができる。
図７は、本実施形態の細胞培養容器１の製造方法の流れを示すフローチャートである。
ステップＳ１００１において、所定の体積平均径を有する金微粒子１３を含む溶液を調製する。例えば、特開２０１３−２３３１０１号公報に記載の方法のように、金イオンを含む溶液（ＨＡｕＣｌ４等）中で還元剤（アスコルビン酸、ヒドロキノン、クエン酸等）の存在下に、金からなる種核を成長させて得ることができる。ステップＳ１００１が終了したら、ステップＳ１００３に進む。
金微粒子１３の体積平均径は、調整した金微粒子１３をレーザー回折式粒度分布測定装置で測定することができる。粒度分布測定装置を用いず、簡易的に測定する場合は、透過型電子顕微鏡を用いて撮像し、解析ソフトウェア等を用いて測定して算出することができる。
ステップＳ１００３において、ステップＳ１００１で調製された金微粒子１３を含む溶液を用いてコラーゲンと金微粒子１３とを含む混合溶液を調製し、細胞培養容器１の底板３２の上に加えて静置する。混合溶液が固まると、コラーゲンゲル中に金微粒子１３が分散され包埋される。ステップＳ１００３が終了したら、ステップ１００５に進む。
ステップＳ１００５において、細胞培養容器１の底板３２の上に形成されたゲル層の上に、流路２３が形成されるように上板３１を被せる。流路２３の高さは、ゲル層の厚さにより異なるが、例えば、ゲル表面から０．２ｍｍ以上２．０ｍｍ以下、０．５以上１．５ｍｍ以下、０．８ｍｍ以上１．２ｍｍ以下とすることができる。ステップＳ１００５が終了したら、処理を修了する。
図８は、本実施形態の細胞培養容器１を用いた細胞の取得方法および生産方法の流れを示すフローチャートである。ステップＳ２００１において、細胞培養基材１４の表面、すなわち搭載面１１の上で細胞を培養する。ステップＳ２００１が終了したら、ステップＳ２００３に進む。
ステップＳ２００３において、支持台７５の温度を適宜調節し、細胞培養容器１をゲル１５の全体的な変性が起きる温度未満の温度に加熱する。レーザー光７の照射を行う前に細胞培養容器１の温度を上げることで、レーザー光７の照射時間を短くすることができ、選択細胞５００への細胞傷害性を低減することができる。ステップＳ２００３が終了してから、ステップＳ２００５に進んでもよく、ステップＳ２００３は、その後ステップＳ２００５からＳ２０１３のいずれかまで、継続して行ってもよい。
ステップＳ２００５において、ゲル１５の全体的な変性が起きる温度未満の温度に加温した液体（例えば培養液）５１を注入する。レーザー光７の照射を行う前に液体５１の温度を上げることで、レーザー光７の照射時間を短くすることができ、選択細胞５００への影響を低減することができる。ステップ２００５が終了したら、ステップ２００７に進む。なお、ステップＳ２００３とステップＳ２００５の順序は、適宜前後してもよく、平行して操作を行ってもよい。
ステップＳ２００７において、細胞培養容器１内の液体５１を流路２３から除去する。液体５１の除去は、細胞培養容器１の注入口２１から空気を注入するか、または排出口２２から液体５１を吸引することにより行う。ステップＳ２００７が終了したら、ステップＳ２００９に進む。ステップＳ２００９では、搭載面１１上で培養された細胞５０の中から、取得する細胞５０（選択細胞５００）を選択する。必要に応じて、蛍光蛋白質が発現している細胞５０や、構造的特徴を持った細胞５０が選択される。
なお、ステップＳ２００５からステップＳ２００９は順序を変えてもよい。例えば、加温した液体５１を注入し、細胞５０を選択してから、液体５１を除去してもよく、細胞５０を選択してから加温した液体５１を注入し、液体５１を除去してもよい。
なお、ステップＳ２００５からステップＳ２００９は順序を変えてもよい。例えば、加温した液体５１を注入し、細胞５０を選択してから、液体５１を除去してもよく、細胞５０を選択してから加温した液体５１を注入し、液体５１を除去してもよい。
ステップＳ２０１１において、ゲル１５における選択細胞５００の近傍の収束位置に向けてレーザー光７を照射する。ゲル１５の搭載面１１と反対の面側からレーザー光７を照射することで、細胞５０に直接光が当たり細胞傷害を引き起こすことを避けることができる。ゲルの変性により選択細胞５００と搭載面１１との結合が弱まる。ステップＳ２０１１が終了したら、ステップＳ２０１３に進む。まとめて回収する選択細胞５００が複数存在する場合、ステップＳ２００９とステップＳ２０１１を複数回繰り返し、すべての選択細胞５００に対してステップＳ２０１１を行ったら、ステップＳ２０１３に進む。また、細胞を選択するステップＳ２００９を、加温した培養液を注入するステップＳ２００５及び培養液を除去するステップＳ２００７の前に行う場合であって、選択細胞５００が複数存在する場合は、ステップＳ２００９を複数回繰り返してすべての細胞を選択してから、ステップＳ２００５及びステップＳ２００７を行い、その後ステップ２０１１を繰り返してすべての選択細胞５００にレーザーを照射するとよい。
ステップＳ２０１３において、細胞培養容器１の流路２３に液体を流すことにより、選択細胞５００は、液体のせん断応力によりゲル１５の搭載面１１から剥離し、排出口２２に流されるので、選択細胞５００を排出口２２から回収する。ステップ２０１５において、回収した選択細胞５００を、他の培地等に配置して培養を行うことができる。ステップＳ２０１５が終了したら、処理を終了する。なお、ステップＳ２０１３において、選択細胞５００を回収したら、ステップＳ２００３に戻って他の細胞５０を選択細胞５００として取得してもよい。また、回収した選択細胞は、そのまま臨床、研究、工業用等の様々な用途に使用してもよい。
上述の実施の形態によれば、次の作用効果が得られる。
（１）本実施形態の細胞培養容器１は、流体を注入する注入口と、流体を排出する排出口と、前記注入口と排出口を結び、且つ、加熱によって変性するゲル中に金微粒子を分散させてなる細胞培養基材を収納する流路と、を備える。これにより、前記流路に液体を流すことによって、選択した細胞のみをまとめて回収することができ、単位時間当たりの細胞回収数を多くすることができる。
（１）本実施形態の細胞培養容器１は、流体を注入する注入口と、流体を排出する排出口と、前記注入口と排出口を結び、且つ、加熱によって変性するゲル中に金微粒子を分散させてなる細胞培養基材を収納する流路と、を備える。これにより、前記流路に液体を流すことによって、選択した細胞のみをまとめて回収することができ、単位時間当たりの細胞回収数を多くすることができる。
（２）本実施形態の細胞の取得方法は、第１の態様の細胞培養容器で培養された細胞から、取得する細胞を選択する工程と、前記選択された細胞の近傍の前記ゲルに光を照射する工程と、前記細胞培養容器の前記流路に液体を流す工程と、前記細胞培養容器の前記排出口から細胞を回収する工程と、を含む。これにより、前記流路に生じた走流によって、選択した細胞を回収することができ、単位時間当たりの細胞回収数を多くすることができる。
本発明は上記実施形態の内容に限定されるものではない。本発明の技術的思想の範囲内で考えられるその他の態様も本発明の範囲内に含まれる。
（実施例）
ｉＰＳ細胞を用いてｉＰＳ細胞から分化誘導された心筋細胞を用いて本実施形態の細胞の取得を行った。
（試薬調製）
・カルシウム・マグネシウム不含有リン酸緩衝食塩水［ＰＢＳ（−）］
ＮａＣｌ（４．００３ ｇ）、ＫＣｌ（０．１００３ ｇ）、ＫＨ２ＰＯ４（０．１００６ ｇ）、ＮａＨ２ＰＯ４（０．５７５ ｇ）をイオン交換水（５００ ｍＬ）に溶かした後 、オートクレーブで滅菌してＰＢＳ（−）を調製した。
・１０倍無機塩培地
イオン交換水（１０ｍＬ）へＣａＣｌ２ 無水物（２０．２ｍｇ）、ＭｇＣｌ・６Ｈ２Ｏ （２３．５ｍｇ）、ＫＣｌ（４０．４ｍｇ）、ＮａＣｌ（６３９．７ｍｇ）、ＮａＨ２ＰＯ４ ・２Ｈ２Ｏ（１４．１ｍｇ）を加えて溶解させて１０倍無機塩培地を調製した。
・再構成溶液
ＮａＯＨ（０．０５Ｍ，１０ｍＬ）へＮａＨＣＯ３（２１９．７ｍｇ）、ＨＥＰＥＳ（４７７．１２ ｍｇ）を加えて溶解させて再構成溶液を調製した。
・希塩酸
０．０５ＭのＨＣｌ水溶液をｐＨメーター（堀場製作所社製、ｐＨ／ＣＯＮＤＭＥＴＥＲ Ｄ−５４）を用いてｐＨ３．０に調整することで希塩酸（ｐＨ３．０）を作製した。ここで、１０倍無機塩培地、再構成溶液、希塩酸（ｐＨ３．０）はそれぞれフィルター（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製、孔径０．２０μｍ）を用いてフィルター滅菌した。
・濃縮金ナノ粒子（ＡｕＮＰ）溶液
４ｍＬ（２ｍＬ×２）の、金ナノ粒子を成長させた溶液であるＧｒｏｗｔｈ溶液（Ｓ.Ｙａｇｉ, ｅｔ ａｌ, ＪＥｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍ Ｓｏｃ, １５９, Ｈ６６８ （２０１２）参照）を遠心管に入れ２５℃、回転数３０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。上澄み溶液（１．８ｍＬ×２）を除去し、超純水（１．８ｍＬ×２）を添加し、再度同じ条件で遠心分離した。その後、上澄み溶液（１．８ｍＬ×２）を除去し、超純水（０．２ｍＬ×２）を添加し還元剤濃度を希釈した濃縮ＡｕＮＰ溶液（Ａｕ５００μＭ）を作製した。金ナノ粒子の体積平均径は、調整した金ナノ粒子を透過型電子顕微鏡（日本電子社製，ＪＥＭ−２０００Ｆ，加速電圧２００ｋＶ）を用いて撮像し、解析ソフトウェア（ケニス社製，Ｐｈｏｔｏｍｅａｓｕｒｅ（登録商標））を用いて測定して算出した。
・カルシウム・マグネシウム不含有リン酸緩衝食塩水［ＰＢＳ（−）］
ＮａＣｌ（４．００３ ｇ）、ＫＣｌ（０．１００３ ｇ）、ＫＨ２ＰＯ４（０．１００６ ｇ）、ＮａＨ２ＰＯ４（０．５７５ ｇ）をイオン交換水（５００ ｍＬ）に溶かした後 、オートクレーブで滅菌してＰＢＳ（−）を調製した。
・１０倍無機塩培地
イオン交換水（１０ｍＬ）へＣａＣｌ２ 無水物（２０．２ｍｇ）、ＭｇＣｌ・６Ｈ２Ｏ （２３．５ｍｇ）、ＫＣｌ（４０．４ｍｇ）、ＮａＣｌ（６３９．７ｍｇ）、ＮａＨ２ＰＯ４ ・２Ｈ２Ｏ（１４．１ｍｇ）を加えて溶解させて１０倍無機塩培地を調製した。
・再構成溶液
ＮａＯＨ（０．０５Ｍ，１０ｍＬ）へＮａＨＣＯ３（２１９．７ｍｇ）、ＨＥＰＥＳ（４７７．１２ ｍｇ）を加えて溶解させて再構成溶液を調製した。
・希塩酸
０．０５ＭのＨＣｌ水溶液をｐＨメーター（堀場製作所社製、ｐＨ／ＣＯＮＤＭＥＴＥＲ Ｄ−５４）を用いてｐＨ３．０に調整することで希塩酸（ｐＨ３．０）を作製した。ここで、１０倍無機塩培地、再構成溶液、希塩酸（ｐＨ３．０）はそれぞれフィルター（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製、孔径０．２０μｍ）を用いてフィルター滅菌した。
・濃縮金ナノ粒子（ＡｕＮＰ）溶液
４ｍＬ（２ｍＬ×２）の、金ナノ粒子を成長させた溶液であるＧｒｏｗｔｈ溶液（Ｓ.Ｙａｇｉ, ｅｔ ａｌ, ＪＥｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍ Ｓｏｃ, １５９, Ｈ６６８ （２０１２）参照）を遠心管に入れ２５℃、回転数３０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。上澄み溶液（１．８ｍＬ×２）を除去し、超純水（１．８ｍＬ×２）を添加し、再度同じ条件で遠心分離した。その後、上澄み溶液（１．８ｍＬ×２）を除去し、超純水（０．２ｍＬ×２）を添加し還元剤濃度を希釈した濃縮ＡｕＮＰ溶液（Ａｕ５００μＭ）を作製した。金ナノ粒子の体積平均径は、調整した金ナノ粒子を透過型電子顕微鏡（日本電子社製，ＪＥＭ−２０００Ｆ，加速電圧２００ｋＶ）を用いて撮像し、解析ソフトウェア（ケニス社製，Ｐｈｏｔｏｍｅａｓｕｒｅ（登録商標））を用いて測定して算出した。
（ゲル作製）
クリーンベンチ（昭和科学社製，Ｓ−１００１ＰＲＶ）内で、細胞培養用基材（新田ゼラチン社製，Ｃｅｌｌｍａｔｒｉｘ（登録商標）Ｉ−Ａ，コラーゲン濃度０．３ｗｔ%，ｐＨ３．０，０．５６ｍＬ）へ希塩酸（０．４２ｍＬ）、濃縮金ナノ粒子（ＡｕＮＰ）溶液（０．７０ｍＬ）、１０倍無機塩培地（０．２０ｍＬ）、再構成溶液（０．２０ｍＬ）を氷冷下で、この順番で加えてコラーゲンゲル溶液（２．１ｍＬ）を調製した。これを、氷冷下で、９６穴プレート（Ｎｕｎｃ社製）に入れた後、ダイレクトヒートＣＯ２インキュベータ内で３７℃下、３０分間インキュベーションし、金ナノ粒子包埋コラーゲンゲルを作製した。その後、３７℃下でゲル上へＰＢＳ（−）を１００μＬ／ｗｅｌｌ加え、６時間インキュベーションすることでゲルを洗浄した。
クリーンベンチ（昭和科学社製，Ｓ−１００１ＰＲＶ）内で、細胞培養用基材（新田ゼラチン社製，Ｃｅｌｌｍａｔｒｉｘ（登録商標）Ｉ−Ａ，コラーゲン濃度０．３ｗｔ%，ｐＨ３．０，０．５６ｍＬ）へ希塩酸（０．４２ｍＬ）、濃縮金ナノ粒子（ＡｕＮＰ）溶液（０．７０ｍＬ）、１０倍無機塩培地（０．２０ｍＬ）、再構成溶液（０．２０ｍＬ）を氷冷下で、この順番で加えてコラーゲンゲル溶液（２．１ｍＬ）を調製した。これを、氷冷下で、９６穴プレート（Ｎｕｎｃ社製）に入れた後、ダイレクトヒートＣＯ２インキュベータ内で３７℃下、３０分間インキュベーションし、金ナノ粒子包埋コラーゲンゲルを作製した。その後、３７℃下でゲル上へＰＢＳ（−）を１００μＬ／ｗｅｌｌ加え、６時間インキュベーションすることでゲルを洗浄した。
（培養チップの作製）
レーザー加工機を用い、アクリル板に、高さ１．０ｍｍの流路が形成されるようにアクリル板をＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン；厚さ１００μｍ）シートを用いて貼りあわせた。この流路に、上記で作製した金ナノ粒子包埋コラーゲンゲルをゲルの高さが０．５ｍｍとなるまで加え、ダイレクトヒートＣＯ２インキュベータ内で３７℃下、３０分間インキュベーションした。次に、ゲル表面から上板の底面までの高さが０．５ｍｍとなるように加工したアクリル板の上板をＰＤＭＳシートを用いて接着し、培養チップを作製した。作製した培養チップの上面図と断面図を図９に示す。
レーザー加工機を用い、アクリル板に、高さ１．０ｍｍの流路が形成されるようにアクリル板をＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン；厚さ１００μｍ）シートを用いて貼りあわせた。この流路に、上記で作製した金ナノ粒子包埋コラーゲンゲルをゲルの高さが０．５ｍｍとなるまで加え、ダイレクトヒートＣＯ２インキュベータ内で３７℃下、３０分間インキュベーションした。次に、ゲル表面から上板の底面までの高さが０．５ｍｍとなるように加工したアクリル板の上板をＰＤＭＳシートを用いて接着し、培養チップを作製した。作製した培養チップの上面図と断面図を図９に示す。
（細胞播種および剥離）
文献（Biochem Biophys Res Commun, 425;321:2012）にしたがって、バイオリアクターを用いた浮遊培養系で、ヒトiPS細胞を心筋細胞に分化させた。
浮遊培養系においてヒトiPS細胞はバイオリアクターの内表面に接着することなく細胞同士が相互に接着し、球状の細胞凝集塊（胚様体）を形成しながら増殖する。その胚様体の中で上述の心筋細胞分化は進行し、自立拍動心筋細胞を含んだ胚様体が出現する。この浮遊培養バイオリアクターを用い心筋細胞分化を17日間行った。分化17日後の胚様体を分散させシングル細胞を得るために酵素等処理を行った。心筋細胞の障害を避けるためマイルドな処理方法（通常細胞の継代時に使用する濃度の5分の1の濃度のトリプシン/EDTAで処理）を用いシングル細胞を獲得した。この方法を用いることで毎回再現性良くシングル細胞を得ることができた。
作製した培養チップに通常動物細胞用培地ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（１０％牛胎児血清および１％ペニシリン−ストレプトマイシン含有）で分散させた前記心筋細胞（６０００ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ）を注入口から流路に流し込み、３７℃で４日間培養した。
培養終了後、培養チップを３７℃に保温した保温チャンバー（細胞培養用コンパクトチャンバーＣ−１５０ＡＷ；○○社製）に移した。次に、培養チップの注入口と排出口にチューブを設置した後、シリンジを用いて４０℃に加温した培養液を注入した。次に、空気を注入して、排出口から培養液を除去した。続いて、上記保温チャンバーを顕微鏡の支持台に設置し、拍動する心筋を顕微鏡下で検出し、その心筋細胞へスポット径が最小となるように設定し光照射し、空気置換細胞剥離チップを得た。
対照として、空気を注入せずに、培養液を残したまま、光照射する以外は上記と同様にして、空気無置換細胞剥離チップを得た。
文献（Biochem Biophys Res Commun, 425;321:2012）にしたがって、バイオリアクターを用いた浮遊培養系で、ヒトiPS細胞を心筋細胞に分化させた。
浮遊培養系においてヒトiPS細胞はバイオリアクターの内表面に接着することなく細胞同士が相互に接着し、球状の細胞凝集塊（胚様体）を形成しながら増殖する。その胚様体の中で上述の心筋細胞分化は進行し、自立拍動心筋細胞を含んだ胚様体が出現する。この浮遊培養バイオリアクターを用い心筋細胞分化を17日間行った。分化17日後の胚様体を分散させシングル細胞を得るために酵素等処理を行った。心筋細胞の障害を避けるためマイルドな処理方法（通常細胞の継代時に使用する濃度の5分の1の濃度のトリプシン/EDTAで処理）を用いシングル細胞を獲得した。この方法を用いることで毎回再現性良くシングル細胞を得ることができた。
作製した培養チップに通常動物細胞用培地ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（１０％牛胎児血清および１％ペニシリン−ストレプトマイシン含有）で分散させた前記心筋細胞（６０００ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ）を注入口から流路に流し込み、３７℃で４日間培養した。
培養終了後、培養チップを３７℃に保温した保温チャンバー（細胞培養用コンパクトチャンバーＣ−１５０ＡＷ；○○社製）に移した。次に、培養チップの注入口と排出口にチューブを設置した後、シリンジを用いて４０℃に加温した培養液を注入した。次に、空気を注入して、排出口から培養液を除去した。続いて、上記保温チャンバーを顕微鏡の支持台に設置し、拍動する心筋を顕微鏡下で検出し、その心筋細胞へスポット径が最小となるように設定し光照射し、空気置換細胞剥離チップを得た。
対照として、空気を注入せずに、培養液を残したまま、光照射する以外は上記と同様にして、空気無置換細胞剥離チップを得た。
電動Ti-E顕微鏡に光刺激装置（Ti-LAPP FRAPモジュール）を取り付けた。光刺激装置にレーザーをファイバによって導入し、XYZ 軸方向に観察光学系とは独立して駆動させることが出来る構成とした。また精密な温度管理をするために、保温箱で顕微鏡を覆い、さらにチップの周辺を小型インキュベータ（C150-HA 株式会社ブラスト）で覆った2 重の保温構造とした。チップへの培養液の導入は、50mL 遠沈管に入れた培養液をダイアフラムポンプでチューブを通じてブロックヒーターへ送り、予熱してから行った。予熱しない場合、細胞剥離時に培養液の温度が低下してレーザー照射で熱変性した金ナノ粒子包埋コラーゲンゲルが熱変性前の状態に戻ってしまうことがあるからである。ブロックヒーターの後は、チューブを流量計/温度計（SLI-2000 センシリオン（株））に接続し、流量と培養液の温度をモニターした。チューブは、流量計/温度計の後、チップに接続され、チップの後は回収/廃液容器に接続した。空気の注入はチップと流量計/温度計の間にあるチューブに針を刺し、そこからシリンジで空気を入れた。観察は４倍、１０倍の対物レンズ（ニコン社製，Ｐｌａｎ−Ｆｌｕｏｒ）を用いて行った。
光照射は、１．０秒の間隔で２．０秒間５回行った。
細胞剥離の手順は以下のようにした。まず、ターゲットとなる心筋細胞を10 倍位相差観察によって目視検出する。次に、空気を50〜100μL 程度（流路が空気で満たされる程度）注入して、流路から培養液を除去した。そして、フィルターをレーザー照射用に変え、レーザーを2 秒〜20秒程度照射した。照射時間はレーザーパワーによって調整する。レーザー照射後、排出口から吸引するか、注入口から培養液を送液することにより、流路に培養液を流して心筋細胞に外力を加え剥離した。
光照射は、１．０秒の間隔で２．０秒間５回行った。
細胞剥離の手順は以下のようにした。まず、ターゲットとなる心筋細胞を10 倍位相差観察によって目視検出する。次に、空気を50〜100μL 程度（流路が空気で満たされる程度）注入して、流路から培養液を除去した。そして、フィルターをレーザー照射用に変え、レーザーを2 秒〜20秒程度照射した。照射時間はレーザーパワーによって調整する。レーザー照射後、排出口から吸引するか、注入口から培養液を送液することにより、流路に培養液を流して心筋細胞に外力を加え剥離した。
（細胞回収）
光照射後、４０℃に保温した培養液を、シリンジを用いて培養チップの注入口から５ｍｌ／分の流速で注入し、排出口に設置したチューブから剥離した細胞を回収した。
光照射後、４０℃に保温した培養液を、シリンジを用いて培養チップの注入口から５ｍｌ／分の流速で注入し、排出口に設置したチューブから剥離した細胞を回収した。
（結果）
回収した培養液から取得した心筋細胞は拍動を有し、本発明の方法によれば細胞に障害を与えることなく回収できることが確認できた。
光照射する前に、培養液除去した場合は、除去しなかった場合に比較して、目的の細胞を剥離・回収できる確率が高い傾向が見られた。
この結果、光照射する前に空気を置換することにより培養液を除去することで、選択した細胞の取得の効率を上げることができることが判明した。
回収した培養液から取得した心筋細胞は拍動を有し、本発明の方法によれば細胞に障害を与えることなく回収できることが確認できた。
光照射する前に、培養液除去した場合は、除去しなかった場合に比較して、目的の細胞を剥離・回収できる確率が高い傾向が見られた。
この結果、光照射する前に空気を置換することにより培養液を除去することで、選択した細胞の取得の効率を上げることができることが判明した。
１…細胞培養容器、７…レーザー光、１０…第１の層、１１…搭載面、１３…金微粒子、１４…細胞培養基材、１５…ゲル、２１…注入口、２２…排出口、２４…流路、５０…細胞、５１…培養液、７０…顕微鏡、５００…選択細胞、１０００…細胞取得システム
Claims (8)
- 流体を注入する注入口と、
流体を排出する排出口と、
前記注入口と前記排出口とを結び、且つ、加熱によって変性するゲル中に金微粒子を分散させてなる細胞培養基材を収納する流路と、
を備える細胞培養容器。 - 前記ゲルが、コラーゲンゲルまたはゼラチンゲルである、請求項１に記載の細胞培養容器。
- 前記流路の高さが、前記ゲルの表面から０．２ｍｍ以上２．０ｍｍ以下である、請求項１又は２に記載の細胞培養容器。
- 請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞培養容器で培養された細胞から、取得する細胞を選択する工程と、
前記選択された細胞の近傍の前記ゲルに光を照射する工程と、
前記細胞培養容器の前記流路に液体を流す工程と、
前記細胞培養容器の前記排出口から細胞を回収する工程と、
を含む、細胞の取得方法。 - 前記ゲルに光を照射する工程の前に、前記細胞培養容器の前記流路に３７℃以上４０℃未満の液体を注入する工程を含む、請求項４に記載の細胞の取得方法。
- 前記ゲルに光を照射する工程の直前に、前記流路から液体の全部又は一部を除去する工程を含む、請求項４又は５に記載の細胞の取得方法。
- 前記液体を除去する工程が、前記細胞培養容器の前記注入口から気体を注入するか、前記細胞培養容器の前記排出口から液体を吸引する工程である、請求項６に記載の細胞の取得方法。
- 請求項４〜７のいずれか一項に記載の細胞の取得方法により取得した細胞を培養する細胞の培養方法。
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-
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- 2018-10-02 US US16/652,660 patent/US20200318053A1/en not_active Abandoned
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