JP7252539B2 - 細胞取得システム及び細胞の取得方法 - Google Patents
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Description
本発明の第2の態様によると、細胞培養容器の製造方法は、前記細胞培養容器内に、第1のゲル層を形成する工程と、前記第1のゲル層の上に、金微粒子が分散された第2のゲル層を形成する工程と、を含み、前記第1のゲル層は、金微粒子を含まないか、または前記第2のゲル層より低い濃度で金微粒子を含む。
本発明の第3の態様によると、細胞の取得方法は、金微粒子が分散された第1のゲル層と、前記金微粒子が存在しないか、または前記第1のゲル層より低い濃度で存在する第2のゲル層とを備える細胞培養基材において、前記第1のゲル層上で細胞を培養することと、前記第1のゲル層のうち、少なくとも1つの細胞の近傍の部分に光を照射することと、前記少なくとも1つの細胞を取得することと、を備える。
本発明の第4の態様によると、細胞の培養方法は、第3の態様の細胞の取得方法により取得した細胞を培養する。
以下では、適宜図面を参照しながら、一実施形態の細胞培養基材、培養容器、および細胞の取得方法等について説明する。
通常、細胞培養基材は、培養容器の壁面との表面エネルギーの差によって、壁面との界面がメニスカス構造となり、培養容器の壁面を濡れ上がる形で平衡状態になる。そのため、細胞培養基材の厚さは、中心部において薄く、周辺部において厚い不均一な構造となる。この厚さの不均一は、培養容器の直径が小さく培養基材の量が少ないほど、相対的に大きくなる。
培養容器内で細胞培養基材から細胞の単離を行う際に、この不均一な構造(細胞培養基材の厚さの不均一)が存在すると、光ビーム照射による細胞培養基材の温度変化の制御が困難となり、個々の細胞の単離が困難となることを本発明者らは見出した。
本実施形態の細胞培養基材は、複数のゲルの層を備えることにより、後述する第1の層10の厚さが、培養容器の面内で概ね均一となり、温度条件の調整等を適切に行うことを実現する。
本実施形態では、培養容器100および細胞培養基材1は略円筒形状で、いわゆるウェルプレートを構成するものの一部であるが、これらの形状は特に限定されない。
なお、金微粒子13は、デンドリマーに内包させたり、ゲルに対して親和性を有する分子で修飾させたりする等、保護剤を用いてゲル中でより安定化するようにしてもよい。
なお、本実施形態の細胞培養基材1は第1ゲル14と第2ゲル24の2層を含んで構成したが、さらに多くの層を含んで構成してもよい。
なお、第1の層10に対し搭載面11の側からレーザー光を照射するように後述の細胞取得システム1000を構成する場合、培養容器100の底部33および第2ゲル24は光透過性を有しなくともよい。
なお、選択細胞500は、上記のように単一の細胞50でもよいし、複数の細胞50または複数の細胞50を含んで構成されるコロニーでもよい。
なお、照射光が直接細胞50に当たることによる悪影響等が問題にならなければ、正立顕微鏡を用いて細胞取得システム1000を構築してもよい。
なお、選択細胞500の近傍を選択的に照射することができれば、照射部71の出射光は特にレーザー光に限定されず、コヒーレントでない単色光や一定の波長範囲の光からなる光でもよい。
なお、所望の位置にレーザー光7を収束することができれば、レーザー光7の照射光学系の構成は特に限定されない。
なお、細胞を物理的に取得する方法に関しては特に限定されず、ピペット60以外にも、搭載面11上の緩衝液51を灌流させて取り出すこと等もできる。
なお、レーザー光7の照射光学系とは異なるレーザー光源およびガルバノミラーを用いてレーザー走査を行うことにより培養容器100の画像を取得し、不図示の表示装置に表示する構成としてもよい。
なお、培養容器100の大きさ、構造等に応じて、レーザー光7の光路となる部分に開口部が形成されている支持台75を用いることもできる。
本実施形態の細胞培養基材1は、第2の層20の厚さH2が0.8mm以上であることが好ましく、0.8mm以上1.7mm以下であることがより好ましく、0.8mm以上1.2mm以下であることがさらに好ましい。
第2の層20の厚さH2が薄すぎると、第1の層10および/または第2の層20を均一または平坦に作成することが難しくなる。一方で、第2の層20の厚さH2が厚すぎると、第1の層10の第1ゲル14に到達する光が減弱し、細胞50近傍での金微粒子13の発熱量が減少するため、細胞50の取得が難しくなる。
ここで、第1の層10の厚さH1および第2の層20の厚さH2は、細胞培養基材1の中心部の領域における厚さ、例えば中心軸に沿った厚さとする。
第2の層は、第1の層がメニスカス構造となり、中心部と周辺部の厚さの不均一を生じさせることがないように構成されるものであればよく、第2の層が複数の層を備えていても構わない。その場合、複数の層全体の厚さが0.8mm以上であることが好ましい。また、メニスカス構造は、ゲルの表面張力の違いによって構造が変化するものであるため、第1の層10と第2の層20のゲル材料は、表面張力(mN/m)が近似するゲル材料から選択されることが好ましく、第1の層10と第2の層20のゲル材料は同じであることがさらに好ましい。
図6は、本実施形態の細胞培養基材1を用いた細胞培養基材1の製造方法の流れを示すフローチャートである。ステップS1001において、培養容器100にコラーゲンゲル等からなる第2ゲル24の層を作成する。ステップS1001が終了したら、ステップS1003に進む。
なお、ステップS1001とステップS1003の順序は、適宜前後してもよく、並行して操作を行ってもよい。
金微粒子13の体積平均径は、調整した金微粒子13をレーザー回折式粒度分布測定装置で測定することができる。粒度分布測定装置を用いず、簡易的に測定する場合は、透過型電子顕微鏡を用いて撮像し、解析ソフトウェア等を用いて測定して算出することができる。
(1)本実施形態の細胞培養基材1は、金微粒子13が分散された第1ゲル14を備える第1の層10と、金微粒子13が存在しないか、または第1の層10若しくは第1ゲル14より低い濃度で存在する第2ゲル14を備える第2の層20と、を備える。これにより、第1の層10の厚さH1を均一にし、第1の層10の搭載面11のより広い領域で効率的に細胞50を剥離することができる。
(変形例1)
上述の実施形態では、単離して取得したい細胞を選択細胞500として取得する構成としたが、選択細胞500以外の非選択細胞501の近傍にレーザー光7を照射し、非選択細胞501を剥離して取り除き、選択細胞500を残す構成としてもよい。
単一細胞のモデルとしてHela細胞、コロニーを形成する細胞のモデルとしてMDCK細胞、単一神経細胞のモデルとしてSH-SY5Y細胞を用いて本実施形態の細胞の取得を行った。
また、第1の層10の厚さH1と第2の層20の厚さH2との和が等しく、厚さ比率H1/H2が異なる2層ゲルを作成し、この2層ゲル上で培養したHela細胞のうち、2層ゲルの培養面(搭載面11)の中心部に位置している細胞を取得しようとした場合の成功確率を調べた。
・PBS(-)
NaCl(4.003g)、KCl(0.1003g)、KH2PO4(0.1006g)、NaH2PO4(0.575g)をイオン交換水(500mL)に溶かした後、オートクレーブで滅菌してPBS(-)を調製した。
・10倍無機塩培地
イオン交換水(10mL)へCaCl2無水物(20.2mg)、MgCl・6H2O(23.5mg)、KCl(40.4mg)、NaCl(639.7mg)、NaH2PO4・2H2O(14.1mg)を加えて溶解させて10倍無機塩培地を調製した。
・再構成溶液
NaOH(0.05M,10mL)へNaHCO3(219.7mg)、HEPES(477.12mg)を加えて溶解させて再構成溶液を調製した。
・希塩酸
0.05MのHCl水溶液をpHメーター(堀場製作所社製、pH/CONDMETER D-54)を用いてpH=3.0に調整することで希塩酸(ph=3.0)を作製した。ここで、10倍無機塩培地、再構成溶液、希塩酸(ph=3.0)はそれぞれフィルター(ADVANTEC社製、孔径0.20μm)を用いてフィルター滅菌した。
・濃縮金ナノ粒子(AuNP)溶液
4mL(2mL×2)の、金ナノ粒子を成長させた溶液であるGrowth溶液(S. Yagi, et al, JElectrochem Soc, 159, H668 (2012)参照)を遠心管に入れ25℃、回転数3000rpmで20分間遠心分離した。上澄み溶液(1.8mL×2)を除去し、超純水(1.8mL×2)を添加し、再度同じ条件で遠心分離した。その後、上澄み溶液(1.8mL×2)を除去し、超純水(0.2mL×2)を添加し還元剤濃度を希釈した濃縮AuNP溶液(Au500μM)を作製した。
金ナノ粒子の体積平均径は、調整した金ナノ粒子を透過型電子顕微鏡(日本電子社製,JEM-2000F,加速電圧200kV)を用いて撮像し、解析ソフトウェア(ケニス社製,Photomeasure(登録商標))を用いて測定して算出した。
クリーンベンチ(昭和科学社製,S-1001PRV)内で、細胞培養用基材(新田ゼラチン社製,Cellmatrix(登録商標)I-A,コラーゲン濃度0.3wt%,pH=3.0,0.56mL)へ希塩酸(0.42mL)、超純水(0.70mL)、10倍無機塩培地(0.20mL)、再構成溶液(0.20mL)を氷冷下で、この順番で加えてコラーゲンゲル溶液(2.1mL)を調製した。これを、氷冷下で、96穴プレート(Nunc社製)に入れた後、ダイレクトヒートCO2インキュベーター内で37℃下、30分間インキュベーションした。その上に同様の操作で、上記の超純水(0.70mL)を濃縮金ナノ粒子(AuNP)溶液(0.70mL)に変更した金ナノ粒子包埋コラーゲンゲルを作製した。その後、37℃下でゲル上へPBS(-)を100μL/well加え、6時間インキュベーションすることでゲルを洗浄した。
作製したゲル上にDMEMに分散させたHeLa細胞(6000cell/well)を播種し24時間培養した後、培地をPBS(-)で3回洗浄した。続いてPBS(-)を10μL培地上に添加し、顕微鏡下、アルミシートを載せた37℃サーモプレート上で3分間インキュベーションした後、スポット径が最小となるように設定し光照射した。照射後、三次元ジョイスティック手動マイクロマニピュレーター(ナリシゲ社製,NT-88-V3MSH)と空圧マイクロインジェクター(ナリシゲ社製,IM-11-2)を用いて口径30μmのマニピュレーターを用いることで細胞を吸引剥離した。
Hela細胞、MDCK細胞、SH-SY5Y細胞のいずれにおいても実施例の2層ゲルで選択細胞の取得が可能であった。
Hela細胞における2層ゲルの厚さ比率H1/H2と選択細胞を取得する成功確率との関係を示す結果を表1に示した。ゲルの総量が同じであれば、厚さ比率H1/H2が大きい、つまり金ナノ粒子が包埋されたコラーゲンゲルの厚さが金ナノ粒子を包埋させる操作を行わなかったコラーゲンゲルの厚さよりも大きい程、選択細胞を取得する成功確率が上昇した。
日本国特許出願2017年第003427号(2017年1月12日出願)
Claims (11)
- 金微粒子が分散された第1ゲルを備える第1の層と、前記金微粒子が存在しないか、または前記第1の層より低い濃度で存在する第2ゲルを備える第2の層と、を備える細胞培養基材を備える培養容器と、
前記第1の層上で培養された少なくとも1つの細胞の近傍の部分に光を照射し前記第1ゲルを局所的に変性させる照射部と、
を備える、細胞取得システム。 - 請求項1に記載の細胞取得システムにおいて、
前記第1の層は、培養する細胞を搭載する搭載面と、前記第2の層と接する面と、を備える細胞取得システム。 - 請求項1または2に記載の細胞取得システムにおいて、
前記第2の層の厚さは、0.8mm以上である細胞取得システム。 - 請求項1から3までのいずれか一項に記載の細胞取得システムにおいて、
前記第1の層の厚さの前記第2の層の厚さに対する比率は、0.5以上である細胞取得システム。 - 請求項1から4までのいずれか一項に記載の細胞取得システムにおいて、
前記第1ゲルは、加熱により60℃以下で変性する細胞取得システム。 - 請求項5に記載の細胞取得システムにおいて、
前記第1ゲルは、ゼラチンゲルまたはコラーゲンゲルである細胞取得システム。 - 請求項1から6までのいずれか一項に記載の細胞取得システムにおいて、
前記第2ゲルのゲル材料は、前記第1ゲルのゲル材料と同じである細胞取得システム。 - 請求項1から7までのいずれか一項に記載の細胞取得システムにおいて、
前記金微粒子の体積平均径は1nm以上200nm未満であり、
前記第1の層の前記金微粒子の濃度は、100μM以上1000μM未満である細胞取得システム。 - 請求項1から8までのいずれか一項に記載の細胞取得システムにおいて、
前記培養容器は、前記細胞培養基材が収容される開口部を有し、
前記開口部の最大径は10cm未満である細胞取得システム。 - 金微粒子が分散された第1ゲルを備える第1の層と、前記金微粒子が存在しないか、または前記第1の層より低い濃度で存在する第2ゲルを備える第2の層と、を備える細胞培養基材の前記第1の層上で細胞を培養することと、
前記第1の層上で培養された少なくとも1つの細胞の近傍の部分に光を照射することと、
前記少なくとも1つの細胞を取得することと、
を備える細胞の取得方法。 - 前記請求項10に記載の細胞の取得方法において、
前記光は、前記第2の層を透過して前記第1の層に照射される細胞の取得方法。
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