WO2019069979A1 - 細胞培養容器、細胞回収システム、細胞の取得方法および細胞の培養方法 - Google Patents

細胞培養容器、細胞回収システム、細胞の取得方法および細胞の培養方法 Download PDF

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cell
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well
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千恵 児島
清水　達也
裕次 原口
武志 川野
瀧　優介
楓 横山
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公立大学法人大阪府立大学
学校法人東京女子医科大学
株式会社ニコン
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C12M1/16—Apparatus for enzymology or microbiology containing, or adapted to contain, solid media
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12M3/00—Tissue, human, animal or plant cell, or virus culture apparatus

Definitions

  • the present invention relates to a cell culture vessel, a cell recovery system, a method for obtaining cells, and a method for culturing cells.
  • the cell culture vessel has a plurality of wells, and each well is filled with a cell culture substrate in which gold microparticles are dispersed in a gel that is denatured by heating.
  • a cell recovery system comprises the cell culture vessel of the first aspect and a suction pump connected to the cell culture vessel.
  • a method for obtaining cells comprising the steps of: selecting a cell to be obtained from cells disposed in a well of the cell culture vessel of the first aspect; Irradiating the cell culture substrate filled in the well with light, removing the cell culture substrate from the cell culture vessel, and recovering the cells from the cell culture substrate.
  • a method of culturing cells is culturing the cells obtained by the method of obtaining cells of the third aspect.
  • the present inventors cultured cells in the wells of a cell culture vessel having a plurality of wells, and in each well, a cell culture substrate comprising gold microparticles dispersed in a gel that is denatured by heating is filled. After that, when a local temperature change is applied to the cell culture substrate by external light, the cell culture substrate contracts and exfoliates from the well, and the cell culture substrate is removed by suction or the like. It has been found that the cells can be efficiently recovered without damaging target cells adhering to the cell culture substrate. By using the cell culture vessel of the present embodiment, it is possible to increase the number of recovery of target cells per unit time.
  • FIG. 1 is a cross-sectional view of a first embodiment of the cell culture vessel of the present embodiment.
  • a plurality of wells 11 are provided on a substrate 10, and each well 11 is filled with a cell culture substrate 14 formed by dispersing gold microparticles 13 in a gel 15 denatured by heating.
  • each well 11 has a bottom.
  • the gold particles 13 schematically show the minute volume elements 19 of the gel 15 in an enlarged manner.
  • the gold fine particles 13 can be particles with high size of light-to-heat conversion characteristics, and in particular, may be large enough to cause surface plasmon resonance (SPR).
  • the volume average diameter of the gold fine particles 13 measured using a laser diffraction type particle size distribution measuring apparatus can be, for example, 1 nm or more and less than 200 nm, 10 nm or more and less than 100 nm, and 30 nm or more and less than 70 nm.
  • the concentration of the gold fine particles 13 in the gel 15 may be, for example, 100 ⁇ M or more and less than 1000 ⁇ M, or 250 ⁇ M or more and 500 ⁇ M or less.
  • the gold particles 13 may be further stabilized in the gel using a protective agent, such as being encapsulated in a dendrimer or modified with a molecule having an affinity to the gel.
  • the gel 15 denatures when the temperature rises from room temperature to a predetermined temperature.
  • “denatured” means that the gel 15 causes a change in structure that causes easy peeling of the gel 15 from the well 11 due to temperature rise.
  • “denaturation” includes, for example, solification, aggregation, depolymerization, and the like which are states brought about by changes in secondary or tertiary structure of collagen protein.
  • the temperature at which the gel 15 is denatured is, for example, 60 ° C. or less, 50 ° C. or less, or 40 ° C. or less.
  • the material of the gel 15 is not particularly limited as long as it makes it possible to obtain cells by exfoliation of the gel 15 from the well 11 described later, and may be, for example, a collagen gel or a gelatin gel. Moreover, the gel which added the crosslinking agent, and the gel obtained by mixing two or more types of polymers can also be used.
  • Placement of cells on the cell culture substrate 14 can be performed, for example, by pouring a liquid containing cells into the cell culture vessel 1.
  • the cell culture vessel 1 may be arranged to arrange about one cell per well. Thereby, cells can be selected one by one and recovered, so that only desired cells can be recovered.
  • "about 1 cell is arranged per well” when a liquid containing cells is poured into the cell culture vessel 1, among the wells 11 in which the cells are arranged, the well 11 in which only one cell is arranged is the most There may be a well 11 in which two or more cells are disposed, or a well 11 in which no cell is disposed.
  • adjusting the diameter of the well 11 can be mentioned.
  • a diameter arranged about 1 cell per well for example, a diameter of 1 to 3 times, or a diameter of 1.3 to 2 times of the average diameter or the average longest diameter of cells to be cultured can be mentioned.
  • the diameter of each well of the cell culture vessel 1 may be, for example, 10 ⁇ m to 500 ⁇ m, 20 ⁇ m to 400 ⁇ m, or 30 ⁇ m to 300 ⁇ m. If the diameter of the well is too large, it tends to be difficult for denaturation by light irradiation to occur.
  • Another method of arranging about 1 cell per well also includes adjusting the concentration of the liquid containing cells.
  • Yet another method of arranging about 1 cell per well includes adjusting the distance between adjacent wells 11 (minimum distance between the openings of adjacent wells 11).
  • the cell culture vessel 1 may have any number of wells 11.
  • the wells 11 can be arranged, for example, in an array (microarray) in the cell culture vessel 1. At this time, it is also possible to adjust the number of cells disposed per well by adjusting the distance between adjacent wells 11. Those skilled in the art can appropriately design the arrangement of about 1 cell per well by at least one of the methods described above and / or other methods.
  • the cell culture container 1 may have light permeability. Thus, even through the bottom of the well 11, the cell culture substrate 14 can be irradiated with light.
  • Cell culture container 1 may be configured in any shape as long as the technical features of cell culture container 1 of the present embodiment are not impaired.
  • FIG. 2 is a cross-sectional view of a second embodiment of the cell culture vessel 1 of the present embodiment.
  • the wells 11 of the cell culture vessel 1 have through holes 12 at the bottom.
  • the diameter of the through hole 12 may be the same as or smaller than the diameter of the well 11.
  • the cell culture substrate 14 is filled only in the well 11 portion, but the cell culture substrate 14 may be filled also in the through hole 12 portion.
  • the gel 15 contained in the cell culture substrate 14 is contracted, and the cell culture substrate 14 is peeled from the wall surface of the well 11.
  • the peeled cell culture substrate 14 can be collected from the through holes 12 by suction or the like.
  • the gel before light irradiation and the gel not irradiated with light are held in the well 11, and only the gel contracted after the light irradiation is recovered from the through hole 12 It becomes easy to do.
  • FIG. 3 is a conceptual view showing a cell collection system 1000 for acquiring cells using a cell culture vessel.
  • the cell acquisition system 1000 includes a cell culture vessel 1 and an inverted microscope 70.
  • the cells 30 cultured in another culture vessel are poured into the cell culture vessel 1 together with the culture solution 20.
  • the culture solution 20 may be replaced or diluted with a culture solution, a buffer solution or the like.
  • the cells 30 to be poured into the cell culture vessel 1 may have a concentration of 1 cell per well when being poured into the cell culture vessel 1.
  • the cells 30 disposed on the cell culture substrate 14 filled in each well 11 of the cell culture vessel 1 are cultured on the cell culture substrate 14 of each well 11.
  • cells desired to be isolated and obtained are selected cells 300, and other cells are non-selected cells 301.
  • the mode of the selected cell 300 is not particularly limited. For example, cells whose characteristics have been revealed by discrimination means such as a reporter gene or the like by appropriately modifying genes or the like, initialization, differentiation, etc. are induced to discriminate structurally Examples include cells having possible characteristics.
  • the selected cell 300 may be a single cell 30 as described above, or may be a colony composed of a plurality of cells 30 or a plurality of cells 30.
  • the inverted microscope 70 includes an irradiation unit 71, a dichroic mirror 72, a lens system 73, an observation unit 74, and a support 75.
  • the cell recovery system 1000 may be constructed using an upright microscope.
  • the irradiation unit 71 emits a laser beam.
  • the wavelength of the laser light emitted from the irradiation unit 71 is set to a wavelength range in which the gold fine particles 13 exhibit the light-heat conversion characteristics. In particular, it may be set to a wavelength range where surface plasmon resonance absorption (SPR) occurs.
  • SPR surface plasmon resonance absorption
  • the laser light irradiated to the cell culture substrate 14 may have a wavelength and energy which do not cause serious damage to the cells on the cell culture substrate 14 when the cell culture substrate 14 is irradiated.
  • the wavelength of the laser beam emitted from the irradiation unit 71 is set to, for example, 400 nm or more and less than 1200 nm, 450 nm or more and less than 900 nm, 532 nm or the like.
  • the output of the laser beam incident on the cell culture vessel 1 can be, for example, 0.1 mW or more and less than 1000 mW, or 0.4 mW or more and less than 100 mW.
  • the wavelength and energy of the laser light are appropriately adjusted so that the gel contained in the cell culture substrate 14 is efficiently heated and denatured without damaging the cells.
  • the light emitted from the irradiation unit 71 is incident on the dichroic mirror 72.
  • the emitted light of the irradiation unit 71 is not particularly limited to the laser light as long as the cell culture substrate 14 on which the selected cells 300 are disposed can be selectively irradiated, and the monochromatic light which is not coherent or of a certain wavelength range is not particularly limited. It may be light consisting of light.
  • the dichroic mirror 72 reflects the laser light from the irradiation unit 71, transmits the visible light from the cell culture vessel 1, and emits the visible light to the observation unit 74.
  • the direction of the laser beam reflected by the dichroic mirror 72 is adjusted so that the laser beam is irradiated to an appropriate position by a galvano mirror (not shown) or the like, passes through the lens system 73, and enters the cell culture vessel 1 Do.
  • the laser light incident on the cell culture vessel 1 passes through the bottom of the cell culture vessel 1 and then converges at a predetermined position of the cell culture substrate 14.
  • the convergent laser beam 7 is schematically shown using a dashed dotted line.
  • the configuration of the irradiation optical system of the laser beam 7 is not particularly limited as long as the laser beam 7 can be converged to a desired position.
  • the convergence position of the laser beam 7 in the cell culture substrate 14 can be, for example, any position in the cell culture substrate 14 below the selected cell 300 without damaging the selected cell 300, for example, laser light It is determined based on a spot diameter of 7, a PSF (Point Spread Function), a parameter based on PSF, and the like.
  • the focal position of the laser light 7 in the cell culture substrate 14 is directly below the selected cells 300 and the depth is less than 100 ⁇ m, or the cell body of the selected cells 300. From the radius of 100 .mu.m.
  • the focusing position of the laser light in the cell culture substrate 14 may be a position close to the wall surface of the well 11 instead of the central portion of the cell culture substrate 14.
  • the gel to which the selected cell 300 is attached shrinks and peels off the wall surface of the well 11 Do. Therefore, by flowing a fluid such as a culture solution or a buffer solution into the cell culture vessel 1, the cell culture substrate 14 to which the selected cell 300 is attached can be suspended in the fluid and collected together with the fluid. Further, as shown in FIG. 4, the contracted cell culture substrate 14 can be taken out from the through hole 12 below the well 11 in the direction of the arrow by suction using a suction pump or the like (see FIG. 4). ).
  • the observation unit 74 includes an eyepiece or the like, and allows the user to observe visible light from the cell culture vessel 1 illuminated by illumination (not shown). The user can see the visible light from the cell culture container 1 and move the support 75 to align the cell culture container 1 appropriately.
  • the image of the cell culture vessel 1 may be acquired by performing laser scanning using a laser light source different from the irradiation optical system of the laser light 7 and a galvano mirror, and may be displayed on a display device (not shown).
  • the support 75 supports the cell culture vessel 1.
  • the support stand 75 can be moved in each direction of XYZ by a moving mechanism (not shown), whereby the cell culture vessel 1 can be adjusted to any position.
  • the support base 75 includes, for example, a glass in which a transparent heating element is formed, transmits the laser light 7 to the bottom of the cell culture vessel 1, and controls the temperature of the entire cell culture vessel 1. Note that, depending on the size, the structure, and the like of the cell culture vessel 1, it is also possible to use a support 75 in which an opening is formed in a portion to be an optical path of the laser beam 7.
  • FIG. 5 shows a cross-sectional view of the XZ plane of the cell culture vessel 1.
  • the thickness of the gel 15 can be, for example, 0.05 mm or more, 0.05 mm or more and 1.7 mm or less, or 0.1 mm or more and 1.2 mm or less. If the thickness of the gel 15 is too thin, it tends to be difficult to make the gel 15 uniformly or flat. On the other hand, if the thickness of the gel 15 is too thick, the time for irradiating light to shrink the gel 15 may be long.
  • the thickness of the gel 15 is the thickness of the cell culture substrate 14 in the depth direction of the well 11, for example, the thickness along the central axis of the well 11.
  • the cell recovery system of the present embodiment includes the cell culture vessel 1 of the present embodiment and a suction pump 40 connected to the cell culture vessel 1.
  • the connection between the cell culture vessel 1 and the suction pump 40 may be any connection method as long as the cell culture substrate contracted by light to which the selected cells 300 are attached can be sucked. For example, as shown in FIG.
  • FIG. 7 is a flowchart showing a flow of a method of manufacturing the cell culture vessel 1 of the present embodiment.
  • step S1001 a solution containing gold microparticles 13 having a predetermined volume average diameter is prepared.
  • a seed core made of gold in the presence of a reducing agent (ascorbic acid, hydroquinone, citric acid, etc.) in a solution containing gold ions (HAuCl4, etc.)
  • a solution containing gold ions HuCl4, etc.
  • the volume average diameter of the gold fine particles 13 can be measured with the adjusted gold fine particles 13 using a laser diffraction type particle size distribution measuring apparatus. In the case of simple measurement without using a particle size distribution measuring apparatus, it can be imaged by using a transmission electron microscope and measured and calculated using analysis software or the like.
  • step S1003 using the solution containing gold microparticles 13 prepared in step S1001, a mixed solution containing gel-forming components such as collagen and gold microparticles 13 is prepared, and each well of cell culture vessels on cell culture vessel 1 is prepared. Add the mixed solution evenly until it is filled and let stand. When the mixed solution hardens, gold microparticles 13 are dispersed and embedded in the gel. As shown in FIG. 2, when the well 11 has the through holes 12 at the bottom, the mixed solution is first poured into a flat bottom container to make a sheet-like gel, and cell culture is performed on the gel as step S1003. The well 11 may be filled with a gel in which the gold fine particles 13 are dispersed and embedded so as to press the upper surface of the container 1. When step S1003 ends, the process ends. Note that the order of step S1001 and step S1003 may be appropriately changed, and operations may be performed in parallel.
  • FIG. 8 is a flow chart showing the flow of a method of obtaining and producing cells using the cell culture vessel 1 of the present embodiment.
  • a culture solution containing cells is poured into the cell culture vessel 1.
  • the culture solution containing cells is arranged such that one cell is placed per well of the cell culture container when the culture solution containing the cells is poured into the cell culture container 1
  • the culture solution may be diluted with a culture solution or the like.
  • step S2003 the cells are cultured on the surface of the cell culture substrate 14 filled in each well of the cell culture vessel.
  • step S2003 ends, the process proceeds to step S2005.
  • step S2005 the culture solution is aspirated and removed. After removal of the culture solution, the surface of the cell culture substrate filled in the cell culture vessel 1, particularly in each well, may be washed. The washing is performed using PBS or the like to remove unnecessary suspended matters, precipitates and the like.
  • step S2005 ends, the process proceeds to step S2007.
  • step S2007 the cells 30 (selected cells 300) to be obtained are selected from the cells 30 cultured on the cell culture substrate 14. As needed, cells 30 expressing a fluorescent protein and cells 30 having structural characteristics are selected.
  • step S2007 ends the process proceeds to step S2009.
  • step S2009 the temperature of the support 75 is appropriately adjusted, and the cell culture vessel 1 is heated to a temperature below the temperature at which the overall denaturation of the cell culture substrate 14 occurs, for example, 37 ° C to less than 40 ° C.
  • the heating of the cell culture vessel 1 may be performed by placing the cell culture vessel 1 in a temperature controllable incubator.
  • step S2009 and step S2007 may be reversed. In any case, the process may proceed to the next step (step S2007 or step S2011) after the end of step 2009, or the subsequent steps may be performed while continuing step S2009.
  • step S2011 the laser light 7 is emitted from the lower side of the cell culture vessel 1 toward the convergence position in the cell culture substrate 14 to which the selected cell 300 is attached.
  • the laser light 7 By irradiating the laser light 7 from the lower side of the cell culture vessel 1, it is possible to avoid direct light hitting the cells 30 and causing cell damage.
  • the cell culture substrate 14 By irradiating the laser light, the cell culture substrate 14 is denatured and contracted, and the cell culture substrate 14 is peeled from the wall of the well 11.
  • the process proceeds to step S2013.
  • a plurality of cells may be selected in step S2007, the cell culture vessel 1 may be heated in step S2009, and the plurality of cells selected in step S2011 may be irradiated with laser light.
  • step S2009 is performed to heat the cell culture vessel 1, and heating is stopped or while the heating is continued, selection of cells in step S2007 and irradiation of laser light in step S2011 are performed on all selected cells. May be repeated until irradiation is performed.
  • step S2013 when a fluid such as a culture solution or a buffer solution is sufficiently present on the wells of the cell culture vessel 1, the culture solution or buffer is used as it is when the amount of fluid is insufficient.
  • a fluid such as liquid
  • the cell culture substrate detached from the wall of the well 11 floats in the fluid. Therefore, the selected cell 300 can be collected together with the cell culture substrate 14 by collecting the fluid by tilting or suctioning the cell culture vessel 1.
  • the contracted cell culture substrate 14 may be recovered from the through holes 12 below the wells 11 by suction using a suction pump or the like.
  • step S2015 the cell culture substrate 14 to which the collected selected cells 300 are attached recovers the selected cells 300 attached to the cell culture substrate 14 from the cell culture substrate 14 by dissolving the gel using collagenase or the like. can do.
  • the collected selected cells 300 can be placed in another medium or the like and cultured.
  • step S2015 ends the process ends. If the selected cell 300 is recovered in step S2013, the process may return to step S2007 to acquire another cell 30 as the selected cell 300.
  • the selected cells recovered may be used as they are in various applications such as clinical, research and industrial applications.
  • the cell culture vessel 1 of the present embodiment has a plurality of wells 11, and each well is filled with a cell culture substrate 14 in which gold microparticles 13 are dispersed in gel 15 denatured by heating. There is. By culturing cells using this cell culture vessel 1 and irradiating the cell culture substrate 14 with light, the cell culture substrate 14 to which the selected cell 300 is attached is contracted and peeled off from the well 11. Can.
  • the selected cell 300 can be collected together with the cell culture substrate 14 by collecting the cell culture substrate 14 contracted by light and to which the selected cell 300 is attached by suction or the like. Therefore, the number of collected cells per unit time can be increased without damaging the selected cells 300.
  • the well 11 has a bottom.
  • the cell culture substrate detached from the well 11 can be suspended in a fluid such as a culture solution or a buffer solution, so that the cell culture substrate 14 to which the cells 300 are attached can be collected together with the fluid.
  • the well 11 has a through hole 12 at the bottom of the cell culture vessel 1. Thereby, the cell culture substrate 14 which has contracted through the through holes 12 from the bottom of the cell culture vessel and to which the selected cells 300 are attached can be collected by the suction pump.
  • the cell culture vessel of one embodiment has a diameter such that the well 11 can arrange about 1 cell per well. This facilitates recovery of the desired cells.
  • the gel 15 is a gelatin gel or a collagen gel. This facilitates manufacture, handling, and the like.
  • the cell recovery system of one embodiment includes the cell culture vessel 1 and the suction pump 40 connected to the cell culture vessel 1. Thereby, the cell culture substrate 14 to which the selected cell 300 is attached can be aspirated by the suction pump 40, and the recovery of the cell culture substrate 14 to which the selected cell 300 is attached is facilitated.
  • the method for obtaining cells of one embodiment includes the steps of selecting the cells 300 to be obtained from the cells disposed in the wells 11 of the cell culture vessel 1, and filling the wells 11 in which the cells 300 to be obtained are disposed.
  • the step of removing the cell culture substrate 14 filled in the well 11 is a step of suctioning the cell culture substrate 14 filled in the well 11 using a suction pump or the like. It is. Thereby, the cell culture substrate 14 to which the selected cell 300 is attached can be collected by aspiration, and can be collected without damaging the selected cell 300.
  • the step of removing the cell culture substrate 14 is a step of flowing a fluid such as a culture solution or a buffer solution into the cell culture vessel 1. Thereby, the cell culture substrate 14 to which the selected cell 300 is attached can be collected together with the fluid, and can be collected without damaging the selected cell 300.
  • the step of recovering selected cells 300 from the cell culture substrate 14 is a step of adding collagenase to the cell culture substrate 14. Thus, the cell culture substrate 14 can be recovered without damaging the selected cells 300.
  • the cells of the present embodiment were obtained using HeLa cells as the cells.
  • Reconstitution solution A solution of NaHCO 3 (219.7 mg) and HEPES (477.12 mg) was added to and dissolved in NaOH (0.05 M, 10 mL) to prepare a reconstitution solution.
  • Diluted hydrochloric acid (pH 3.0) was prepared by adjusting an aqueous solution of 0.05 M HCl to pH 3.0 using a pH meter (pH / CONDMETERD-54 manufactured by Horiba, Ltd.).
  • pH meter pH meter
  • ⁇ Growth solution [S.
  • HeLa cells (6000 cells / microarray) dispersed in DMEM were poured into the prepared cell culture vessel and cultured at 37 ° C. for 1 day, and then the medium was removed by aspiration. Under a microscope, on a 37 ° C. thermoplate loaded with an aluminum sheet or in a cell culture chamber, the spot diameter was set so as to be minimum, and light was irradiated.
  • a laser light source (manufactured by Sigma Koki Co., wavelength 532 nm, output 50 mW) is incorporated into the light irradiation via a PA (photoactivation) epi-fluorescent device (manufactured by Nikon Co., TI-PAU), and has optical transparency of 532 nm
  • PA photoactivation
  • a mirror unit Nakon, TRITC
  • cells are fluorescent / fluorescent using an inverted fluorescence microscope (Nikon, ECLIPSE Ti-U) and imaging sensor control software (WRAYMER, WraySpect) Phase contrast observation and imaging were performed. The observation was performed using an objective lens (Plan-Fluor, manufactured by Nikon Corporation) at 4 ⁇ and 10 ⁇ .

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Abstract

複数のウェルを有する細胞培養容器であって、各ウェルに、加熱によって変性するゲル中に金微粒子を分散させてなる細胞培養基材が充填されている細胞培養容器。該細胞培養容器の各ウェルに配置された細胞から、取得する細胞を選択する工程と、前記細胞培養容器の取得する細胞が配置されているウェルに充填された細胞培養基材に光を照射する工程と、前記細胞培養基材を前記細胞培養容器から取り出す工程と、前記細胞培養用容器から取り出したゲルから細胞を回収する工程と、を含む、細胞の取得方法。

Description

細胞培養容器、細胞回収システム、細胞の取得方法および細胞の培養方法
　本発明は、細胞培養容器、細胞回収システム、細胞の取得方法および細胞の培養方法に関する。
　本願は、２０１７年１０月６日に、日本に出願された特願２０１７－１９５９３２号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　培養基材で培養された細胞をより効率的に回収するため、例えば、感温性高分子を含む 培養基材の上で細胞を培養し、温度変化を利用して細胞の回収を行う方法が提案されている（特許文献１参照）。
特開平１１－３４９６４３号公報
　本発明の第１の態様によると、細胞培養容器は、複数のウェルを有し、各ウェルに、加熱によって変性するゲル中に金微粒子を分散させてなる細胞培養基材が充填されている。
　本発明の第２の態様によると、細胞回収システムは、第１の態様の細胞培養容器と、前記細胞培養容器に接続された吸引ポンプとを備える。
　本発明の第３の態様によると、細胞の取得方法は、第１の態様の細胞培養容器のウェルに配置された細胞から、取得する細胞を選択する工程と、前記取得する細胞が配置されているウェルに充填された細胞培養基材に光を照射する工程と、前記細胞培養基材を前記細胞培養容器から取り出す工程と、前記細胞培養基材から細胞を回収する工程と、を含む。
　本発明の第４の態様によると、細胞の培養方法は、第３の態様の細胞の取得方法により 取得した細胞を培養する。
第１の実施形態の細胞培養容器の断面図である。 第２の実施形態の細胞培養容器の断面図である。 一実施形態の細胞培養容器を含む細胞取得システムの構成を示す概念図である。 第２の実施形態の細胞培養容器を用いて細胞を取得する方法を模式的に示した図である。 一実施形態の細胞培養容器の構成を示す概念図である。 一実施形態の細胞回収システムの構成を示す概念図である。 一実施形態の細胞培養容器の製造方法の流れを示すフローチャートである。 一実施形態の細胞培養容器を用いた細胞の取得方法の流れを示すフローチャートである。
（第１の実施形態）
　以下では、適宜図面を参照しながら、一実施形態の細胞培養容器、細胞回収システム、および細胞の取得方法等について説明する。
　細胞培養基材の上で培養した細胞のうち、遺伝子導入に成功した細胞等、特定の細胞を効率的に剥離し、回収することがしばしば必要になる。
　本発明者らは、複数のウェルを有し、各ウェルに、加熱によって変性するゲル中に金微粒子を分散させてなる細胞培養基材が充填されている細胞培養容器のウェルで細胞を培養した後、外部からの光により、該細胞培養基材に局所的な温度変化を加えると、該細胞培養基材が収縮してウェルから剥離し、該細胞培養基材を吸引等により取り出すことにより、該細胞培養基材に接着している目的細胞に障害を与えることなく、該細胞を効率的に回収できることを見出した。
　本実施形態の細胞培養容器を用いることにより、目的細胞の単位時間当たりの回収数を多くすることを実現する。
　図１は、本実施形態の細胞培養容器の第１の実施形態の断面図である。細胞培養容器１は、基板１０に複数のウェル１１が設けられており、各ウェル１１に、加熱によって変性するゲル１５中に金微粒子１３を分散させてなる細胞培養基材１４が充填されている。第１の実施形態においては、各ウェル１１は底を有する。金微粒子１３は、ゲル１５の微小体積要素１９を拡大して模式的に示した。
　金微粒子１３は、光熱変換特性の高い大きさの粒子とすることができ、特に、表面プラズモン共鳴吸収（ＳＰＲ）が起こる大きさとしてもよい。レーザー回折式粒度分布測定装置を用いて測定された金微粒子１３の体積平均径は、例えば、１ｎｍ以上２００ｎｍ未満、１０ｎｍ以上１００ｎｍ未満、３０ｎｍ以上７０ｎｍ未満とすることができる。ゲル１５での金微粒子１３の濃度は、例えば、１００μＭ以上１０００μＭ未満、２５０μＭ以上５００μＭ以下としてもよい。金微粒子１３の濃度が低いと、金微粒子１３の発熱量が小さくなるため、ゲル１５の収縮率が小さくなり、ゲル１５のウェル１１からの剥離成功確率が下がる傾向がある。一方、金微粒子１３の濃度が高いと、局所での温度上昇が大きくなるため、温度制御が難しくなり、また細胞傷害性が高くなる傾向がある。
　なお、金微粒子１３は、デンドリマーに内包させたり、ゲルに対して親和性を有する分子で修飾したりする等、保護剤を用いてゲル中でより安定化するようにしてもよい。
　ゲル１５は、室温から所定の温度に上昇した場合に変性する。本実施形態で「変性」とは、ゲル１５が温度上昇により、ゲル１５のウェル１１からの容易な剥離をもたらす構造の変化を起こすことを意味する。ゲル１５がコラーゲンゲルまたはゼラチンゲルの場合、「変性」には、例えば、コラーゲンタンパク質の二次または三次構造の変化によりもたらされる状態であるゾル化や凝集化、低分子化等が含まれる。ゲル１５が変性する温度は、例えば６０℃以下、５０℃以下、又は４０℃以下である。ゲル１５の材料は、後述のゲル１５のウェル１１からの剥離による細胞の取得を可能にするものであれば特に限定されないが、例えば、コラーゲンゲルまたはゼラチンゲルとしてもよい。また、架橋剤を添加したゲルや、二種類以上の高分子を混合して得たゲルを用いることもできる。
　細胞培養基材１４上への細胞の配置は、例えば、細胞を含む液体を細胞培養容器１に流し込むことによって行うことができる。
　細胞培養容器１は、１ウェル当たり約１細胞配置される構成としてもよい。これにより、細胞を１つずつ選択し回収することができるので、所望の細胞のみ回収することが可能である。「１ウェル当たり約１細胞配置される」とは、細胞を含む液体を細胞培養容器１に流し込んだとき、細胞が配置されるウェル１１のうち、細胞が１つだけ配置されたウェル１１が最も多くなる状態をいい、２つ以上の細胞が配置されたウェル１１や、１つも細胞が配置されていないウェル１１が存在してもよい。
　１ウェル当たり約１細胞配置される構成とする方法の一例として、ウェル１１の径を調節することが挙げられる。１ウェル当たり約１細胞配置される径として、例えば、培養する細胞の平均径又は平均最長径の１倍以上３倍未満、又は１．３倍以上２倍未満の径が挙げられる。細胞培養容器１の各ウェルの径は、例えば、１０μｍ～５００μｍ、２０μｍ～４００μｍ、または３０μｍ～３００μｍとしてもよい。ウェルの径が大きくなりすぎると、光照射による変性が生じにくくなる傾向がある。
　１ウェル当たり約１細胞配置される構成とする別の方法として、細胞を含む液体の濃度を調節することも挙げられる。
　１ウェル当たり約１細胞配置される構成とするさらに別の方法として、隣り合うウェル１１の距離（隣り合ったウェル１１の開口部の最小距離）を調節することも挙げられる。細胞培養容器１は、ウェル１１をいくつ有してもよい。ウェル１１は、例えば、細胞培養容器１にアレイ状（マイクロアレイ状）に配置することができる。このとき、隣り合うウェル１１の距離を調節することにより、１ウェル当たりに配置される細胞数を調節することも可能である。
　１ウェル当たり約１細胞配置される構成は、上述の方法の少なくとも一つ、及び／又はその他の方法により、当業者が適宜設計することができる。
　また、細胞培養容器１は、光透過性を有するものであっても良い。これによりウェル１１の底を介しても、細胞培養基材１４に光を照射することができる。細胞培養容器１は、本実施形態の細胞培養容器１の技術的特徴を損なわない限り任意の形状で構成され得る。
（第２の実施形態）
　図２は、本実施形態の細胞培養容器１の第２の実施形態の断面図である。本実施形態においては、細胞培養容器１のウェル１１は底に貫通孔１２を有する。貫通孔１２の径は、ウェル１１の径と同一でも小さくてもよい。また、図２では、ウェル１１部分にのみ細胞培養基材１４が充填されているが、貫通孔１２部分にも細胞培養基材１４が充填されていてもよい。ウェル１１に充填されている細胞培養基材１４に光を照射することにより、細胞培養基材１４に含まれているゲル１５が収縮し、細胞培養基材１４がウェル１１の壁面から剥離する。剥離した細胞培養基材１４は、貫通孔１２より吸引等により回収することができる。貫通孔１２の径をウェル１１の径より小さくしておくことにより、光照射前のゲル及び光照射されていないゲルはウェル１１中に保持し、光照射後に収縮したゲルのみ貫通孔１２から回収することが容易となる。
　図３は、細胞培養容器を用いて細胞の取得を行う細胞回収システム１０００を示す概念図である。細胞取得システム１０００は、細胞培養容器１と、倒立顕微鏡７０とを備える。
　細胞培養容器１に、別の培養容器で培養された細胞３０を培養液２０とともに流し込む。培養液２０は培養液、緩衝液等で置換又は希釈してもよい。細胞培養容器１に流し込む細胞３０は、細胞培養容器１に流し込んだとき、１ウェル当たり１細胞になるような濃度としてもよい。
　細胞培養容器１の各ウェル１１に充填された細胞培養基材１４上に配置された細胞３０は、各ウェル１１の細胞培養基材１４上で培養される。各ウェル１１に充填された細胞培養基材上１４で培養された細胞３０のうち、単離して取得したい細胞を選択細胞３００とし、その他の細胞を非選択細胞３０１とする。選択細胞３００はその態様は特に限定されないが、例えば、適切に遺伝子等が改変されレポーター遺伝子等の判別手段により特徴が現れている細胞や、初期化や適切な分化等が誘導されて構造上判別可能な特徴を有している細胞等が挙げられる。
　なお、選択細胞３００は、上記のように単一の細胞３０でもよいし、複数の細胞３０または複数の細胞３０を含んで構成されるコロニーでもよい。
　倒立顕微鏡７０は、照射部７１と、ダイクロイックミラー７２と、レンズ系７３と、観察部７４と、支持台７５とを備える。
　なお、正立顕微鏡を用いて細胞回収システム１０００を構築してもよい。
　照射部７１は、レーザー光を出射する。照射部７１から出射されるレーザー光の波長は、金微粒子１３が光熱変換特性を発揮する波長域に設定される。特に表面プラズモン共鳴吸収（ＳＰＲ）が起こる波長域に設定してもよい。細胞培養基材１４に照射されるレーザー光は、細胞培養基材１４に照射した場合に細胞培養基材１４上の細胞に重大な損傷を与えない波長およびエネルギーを有するものであればよい。照射部７１から出射されるレーザー光の波長は、例えば、４００ｎｍ以上１２００ｎｍ未満、４５０ｎｍ以上９００ｎｍ未満、５３２ｎｍ等に設定される。細胞培養容器１へ入射するレーザー光の出力は、例えば０．１ｍＷ以上１０００ｍＷ未満、０．４ｍＷ以上１００ｍＷ未満とすることができる。レーザー光の波長およびエネルギーは、細胞に傷害を与えずに細胞培養基材１４に含まれるゲルに効率よく温度上昇および変性を起こすよう、適宜調整される。照射部７１から出射した光は、ダイクロイックミラー７２に入射する。
　なお、選択細胞３００が配置されている細胞培養基材１４を選択的に照射することができれば、照射部７１の出射光は特にレーザー光に限定されず、コヒーレントでない単色光や一定の波長範囲の光からなる光でもよい。
　ダイクロイックミラー７２は、照射部７１からのレーザー光を反射するとともに、細胞培養容器１からの可視光を透過させて観察部７４へと出射する。ダイクロイックミラー７２で反射されたレーザー光は、不図示のガルバノミラー等により適切な位置にレーザー光が照射されるように光の向きが調節され、レンズ系７３を透過して細胞培養容器１に入射する。細胞培養容器１に入射したレーザー光は、細胞培養容器１の底部を透過した後、細胞培養基材１４の所定の位置で収束する。図３では、収束するレーザー光７を、一点鎖線を用いて模式的に示した。
　なお、所望の位置にレーザー光７を収束することができれば、レーザー光７の照射光学系の構成は特に限定されない。
　細胞培養基材１４におけるレーザー光７の収束位置は、例えば、選択細胞３００に傷害を与えない、選択細胞３００の下方の細胞培養基材１４中の任意の位置とすることができ、例えばレーザー光７のスポット径、ＰＳＦ（Ｐｏｉｎｔ Ｓｐｒｅａｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ）やＰＳＦに基づくパラメータ等に基づいて定められる。選択細胞３００への影響を低くするために、細胞培養基材１４におけるレーザー光７の集束位置は、選択細胞３００の直下であって、深さが１００μｍ未満の範囲、または選択細胞３００の細胞体から半径１００μｍ未満の範囲を避ける位置にしてもよい。
　また、細胞培養基材１４におけるレーザー光の集束位置は、細胞培養基材１４の中心部ではなく、ウェル１１の壁面に近い位置でもよい。
　照射部７１からのレーザー光７を金微粒子１３が光熱変換し、レーザー光７の収束位置の近傍のゲルが変性すると、選択細胞３００が付着しているゲルが収縮し、ウェル１１の壁面から剥離する。従って、細胞培養容器１に培養液や緩衝液等の流体を流し入れることにより、選択細胞３００が付着した細胞培養基材１４を流体中に浮遊させ、流体ごと回収することができる。また、図４に示されるように、ウェル１１の下方の貫通孔１２から、収縮した細胞培養基材１４を、吸引ポンプ等を用いた吸引等により矢印の方向に取り出すこともできる（図４参照）。
　観察部７４は、接眼レンズ等を備え、不図示の照明により照らされた細胞培養容器１からの可視光をユーザにより観察可能にする。ユーザは、細胞培養容器１からの可視光を見て、支持台７５を移動させる等して細胞培養容器１を適切に位置合わせ等することができる。
　なお、レーザー光７の照射光学系とは異なるレーザー光源およびガルバノミラーを用いてレーザー走査を行うことにより細胞培養容器１の画像を取得し、不図示の表示装置に表示する構成としてもよい。
　支持台７５は、細胞培養容器１を支持する。支持台７５は不図示の移動機構によりＸＹＺの各方向に移動可能であり、これにより細胞培養容器１を任意の位置に調整することが可能である。支持台７５は、例えば、透明発熱体が形成されたガラスを含んで構成され、細胞培養容器１の底部へレーザー光７を透過させると共に、細胞培養容器１全体の温度を制御する。
　なお、細胞培養容器１の大きさ、構造等に応じて、レーザー光７の光路となる部分に開口部が形成されている支持台７５を用いることもできる。
　図５は、細胞培養容器１のＸＺ平面の断面図を示したものである。
　本実施形態の細胞培養基材１４は、ゲル１５の厚さを、例えば０．０５ｍｍ以上、０．０５ｍｍ以上１．７ｍｍ以下、又は０．１ｍｍ以上１．２ｍｍ以下とすることができる。ゲル１５の厚さが薄すぎるとゲル１５を均一または平坦に作成することが難しくなる傾向がある。一方でゲル１５の厚さが厚すぎると、ゲル１５を収縮させるために光を照射する時間が長くなることがある。
　ここで、ゲル１５の厚さは、細胞培養基材１４のウェル１１の深さ方向における厚さ、例えばウェル１１の中心軸に沿った厚さとする。
（細胞回収システム）
　本実施形態の細胞回収システムの概略図を図６に示す。
　本実施形態の細胞回収システムは、本実施形態の細胞培養容器１と前記細胞培養容器１に接続された吸引ポンプ４０と、を備える。前記細胞培養容器１に吸引ポンプ４０を接続することにより、レーザー光７を照射することにより収縮した、選択細胞３００が付着した細胞培養基材１４を、吸引により回収することができる。
　細胞培養容器１と吸引ポンプ４０との接続は、選択細胞３００が付着した、光により収縮した細胞培養基材１４を吸引できれば、いかなる接続方法でもよい。例えば、細胞培養容器１のウェル１１の上面へ接続して、培養液２０とともに、選択細胞３００が付着した、光により収縮した細胞培養基材１４を吸引する接続方法や、図４に示したように細胞培養容器１の貫通孔１２に接続して、貫通孔１２から、選択細胞３００が付着した、光により収縮した細胞培養基材１４を吸引する接続方法等が挙げられる。
（細胞培養容器１の製造方法）
　図７は、本実施形態の細胞培養容器１の製造方法の流れを示すフローチャートである。ステップＳ１００１において、所定の体積平均径を有する金微粒子１３を含む溶液を調製する。例えば、特開２０１３－２３３１０１号公報に記載の方法のように、金イオンを含む溶液（ＨＡｕＣｌ４等）中で還元剤（アスコルビン酸、ヒドロキノン、クエン酸等）の存在下に、金からなる種核を成長させて得ることができる。ステップＳ１００１が終了したら、ステップＳ１００３に進む。
　金微粒子１３の体積平均径は、調整した金微粒子１３をレーザー回折式粒度分布測定装置で測定することができる。粒度分布測定装置を用いず、簡易的に測定する場合は、透過型電子顕微鏡を用いて撮像し、解析ソフトウェア等を用いて測定して算出することができる。
　ステップＳ１００３において、ステップＳ１００１で調製された金微粒子１３を含む溶液を用いてコラーゲンなどのゲル生成成分と金微粒子１３とを含む混合溶液を調製し、細胞培養容器１上に細胞培養容器の各ウェルに均等に混合溶液が充填されるまで加えて、静置する。混合溶液が固まると、ゲル中に金微粒子１３が分散され包埋される。図２に示されるように、ウェル１１が底に貫通孔１２を有する場合、ステップＳ１００３として、まず底が平らな容器に混合溶液を注ぎ入れてシート状のゲルを作製し、そのゲルに細胞培養容器１の上面を押し付けるようにして、金微粒子１３が分散され包埋されたゲルで、ウェル１１を充填してもよい。ステップＳ１００３が終了したら、処理を修了する。なお、ステップＳ１００１とステップＳ１００３の順序は、適宜前後してもよく、平行して操作を行ってもよい。
　図８は、本実施形態の細胞培養容器１を用いた細胞の取得方法および生産方法の流れを示すフローチャートである。ステップＳ２００１において、細胞を含む培養液を細胞培養容器１に流し込む。培養液中の細胞の濃度が高い場合は、細胞を含む培養液を細胞培養容器１に流し込んだ際に、細胞培養容器のウェル当たり１個の細胞が配置されるように、細胞を含む培養液を細胞培養容器１に流し込む前に、該培養液を培養液等により希釈してもよい。ステップＳ２００１が終了したら、ステップＳ２００３に進む。
　ステップＳ２００３において、細胞培養容器の各ウェルに充填した細胞培養基材１４の表面で細胞を培養する。ステップＳ２００３が終了したら、ステップＳ２００５に進む。ステップＳ２００５において、培養液を吸引除去する。培養液の除去後、細胞培養容器１内、特に各ウェルに充填された細胞培養基材の表面上を洗浄してもよい。洗浄はＰＢＳ等を用いて行い、不要な浮遊物や沈殿物等が取り除かれる。ステップＳ２００５が終了したら、ステップＳ２００７に進む。
　ステップＳ２００７において、細胞培養基材１４上で培養された細胞３０の中から、取得する細胞３０（選択細胞３００）を選択する。必要に応じて、蛍光蛋白質が発現している細胞３０や、構造的特徴を持った細胞３０が選択される。ステップＳ２００７が終了したら、ステップＳ２００９に進む。ステップＳ２００９において、支持台７５の温度を適宜調節し、細胞培養容器１を細胞培養基材１４の全体的な変性が起きる温度未満の温度、例えば、３７℃以上４０℃未満に加熱する。細胞培養容器１の加熱は、細胞培養容器１を温度制御可能なインキュベーター内に配置することによって行ってもよい。レーザー光７の照射を行う前に細胞培養容器１の温度を上げることで、レーザー光７の照射時間を短くすることができ、選択細胞３００への細胞傷害性を低減することができる。
　なお、ステップＳ２００９とステップＳ２００７は順序を逆にしてもよい。いずれの場合も、ステップ２００９が終了してから次のステップ（ステップＳ２００７又はステップＳ２０１１）に進んでもよく、ステップＳ２００９を継続したまま、次のステップ以降を行ってもよい。
　ステップＳ２０１１において、選択細胞３００が付着している細胞培養基材１４中の収束位置に向けて細胞培養容器１の下側からレーザー光７を照射する。細胞培養容器１の下側からレーザー光７を照射することで、細胞３０に直接光が当たり細胞傷害を引き起こすことを避けることができる。レーザー光を照射することで、細胞培養基材１４が変性して収縮し、細胞培養基材１４がウェル１１の壁面から剥離する。細胞培養基材１４がウェル１１の壁面から剥離したら、ステップＳ２０１３に進む。
　なお、複数の細胞を選択する場合は、ステップＳ２００７で複数の細胞を選択し、ステップＳ２００９で細胞培養容器１を加熱し、ステップＳ２０１１で選択された複数の細胞にレーザー光を照射すればよい。あるいは、まずステップＳ２００９を行って細胞培養容器１を加熱し、加熱を止めて、または加熱を継続したまま、ステップＳ２００７の細胞の選択とステップＳ２０１１のレーザー光の照射を、すべての選択細胞について光が照射されるまで繰り返し行ってもよい。
　ステップＳ２０１３において、細胞培養容器１のウェル上に培養液や緩衝液等の流体が十分に存在する場合にはそのままで、流体の量が不十分な場合には細胞培養容器１に培養液や緩衝液等の流体を流し入れることにより、ウェル１１の壁面から剥離した細胞培養基材が流体中に浮遊する。したがって、細胞培養容器１を傾けるか、吸引するなどして流体を回収することにより、選択細胞３００を細胞培養基材１４ごと回収することができる。
　または、ウェル１１の下方の貫通孔１２から、収縮した細胞培養基材１４を、吸引ポンプ等を用いた吸引により回収してもよい。ステップＳ２０１３が終了したら、ステップＳ２０１５に進む。
　ステップＳ２０１５において、回収した選択細胞３００が付着した細胞培養基材１４は、コラゲナーゼ等を用いてゲルを溶解させることにより、細胞培養基材１４に付着した選択細胞３００を細胞培養基材１４から回収することができる。回収した選択細胞３００を、他の培地等に配置して培養を行うことができる。ステップＳ２０１５が終了したら、処理を終了する。なお、ステップＳ２０１３において、選択細胞３００を回収したら、ステップＳ２００７に戻って他の細胞３０を選択細胞３００として取得してもよい。また、回収した選択細胞は、そのまま臨床、研究、工業用等の様々な用途に使用してもよい。
　上述の実施の形態によれば、次の作用効果が得られる。
（１）本実施形態の細胞培養容器１は、複数のウェル１１を有し、各ウェルに、加熱によって変性するゲル１５中に金微粒子１３を分散させてなる細胞培養基材１４が充填されている。この細胞培養容器１を用いて細胞を培養し、細胞培養基材１４に光を照射することにより、選択した細胞３００が付着している細胞培養基材１４が収縮し、ウェル１１から剥離させることができる。光により収縮した、選択した細胞３００が付着した細胞培養基材１４を吸引等により回収することにより、選択した細胞３００を細胞培養基材１４ごと回収することができる。このため、選択した細胞３００に障害を与えることなく、単位時間当たりの細胞回収数を多くすることができる。
（２）一実施形態の細胞培養容器１において、ウェル１１は底を有している。これにより、培養液、緩衝液等の流体に、ウェル１１から剥離した細胞培養基材を浮遊させることができるので、細胞３００が付着した細胞培養基材１４を流体ごと回収することができる。
（３）一実施形態の細胞培養容器１において、ウェル１１は細胞培養容器１の底に貫通孔１２を有する。これにより、細胞培養容器の底から貫通孔１２を通じて収縮した、選択細胞３００が付着した細胞培養基材１４を吸引ポンプにより回収することができる。
（４）一実施形態の細胞培養容器は、ウェル１１が１ウェル当たり約１個の細胞を配置できる径を有する。これにより、所望の細胞の回収が容易になる。
（５）一実施形態の細胞培養容器において、ゲル１５は、ゼラチンゲルまたはコラーゲンゲルである。これにより、製造、取扱い等が容易となる。
（６）一実施形態の細胞回収システムは、細胞培養容器１と細胞培養容器１に接続された吸引ポンプ４０と、を備える。これにより、選択細胞３００が付着した細胞培養基材１４を吸引ポンプ４０により吸引することができ、選択細胞３００が付着した細胞培養基材１４の回収が容易になる。
（７）一実施形態の細胞の取得方法は、細胞培養容器１のウェル１１に配置された細胞から、取得する細胞３００を選択する工程と、取得する細胞３００が配置されているウェル１１に充填された細胞培養基材１４に光を照射する工程と、細胞培養基材１４を取り出す工程と、細胞培養基材１４から細胞を回収する工程と、を含む。これにより、選択した細胞３００を、細胞培養基材１４ごと回収することができる。このため、細胞３００に障害を与えることなく、単位時間当たりの細胞回収数を多くすることができる。
（８）一実施形態の細胞の取得方法において、ウェル１１に充填されている細胞培養基材１４を取り出す工程は、ウェル１１に充填されている細胞培養基材１４を吸引ポンプ等により吸引する工程である。これにより、選択細胞３００が付着した細胞培養基材１４を、吸引により回収することができ、選択細胞３００に障害を与えることなく回収することができる。
（９）一実施形態の細胞の取得方法において、細胞培養基材１４を取り出す工程は、細胞培養容器１に培養液や緩衝液等の流体を流し入れる工程である。これにより、選択細胞３００が付着した細胞培養基材１４を、流体とともに回収することができ、選択細胞３００に障害を与えることなく回収することができる。
（１０）一実施形態の細胞の取得方法において、細胞培養基材１４から選択細胞３００を回収する工程は、コラゲナーゼを細胞培養基材１４に添加する工程である。これにより、細胞培養基材１４から、選択細胞３００に障害を与えることなく、回収することができる。
　本発明は上記実施形態の内容に限定されるものではない。本発明の技術的思想の範囲内で考えられるその他の態様も本発明の範囲内に含まれる。
（実施例）
　細胞としてＨｅＬａ細胞を用いて本実施形態の細胞の取得を行った。
（試薬調製）
・ＰＢＳ（－）
　ＮａＣｌ（４．００３ｇ）、ＫＣｌ（０．１００３ｇ）、ＫＨ２ＰＯ４（０．１００６ｇ）、ＮａＨ２ＰＯ４（０．５７５ｇ）をイオン交換水（５００ｍＬ）に溶かした後、オートクレーブで滅菌してＰＢＳ（－）を調製した。
・１０倍無機塩培地
　イオン交換水（１０ｍＬ）へＣａＣｌ２無水物（２０．２ｍｇ）、ＭｇＣｌ・６Ｈ２Ｏ（２３．５ｍｇ）、ＫＣｌ（４０．４ｍｇ）、ＮａＣｌ（６３９．７ｍｇ）、ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ（１４．１ｍｇ）を加えて溶解させて１０倍無機塩培地を調製した。
・再構成溶液
　ＮａＯＨ（０．０５Ｍ，１０ｍＬ）へＮａＨＣＯ３（２１９．７ｍｇ）、ＨＥＰＥＳ（４７７．１２ｍｇ）を加えて溶解させて再構成溶液を調製した。
・希塩酸
　０．０５ＭのＨＣｌ水溶液をｐＨメーター（堀場製作所社製、ｐＨ／ＣＯＮＤＭＥＴＥＲＤ－５４）を用いてｐＨ３．０に調整することで希塩酸（ｐＨ３．０）を作製した。ここで、１０倍無機塩培地、再構成溶液、希塩酸（ｐＨ３．０）はそれぞれフィルター（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製、孔径０．２０μｍ）を用いてフィルター滅菌した。
・濃縮金ナノ粒子（ＡｕＮＰ）溶液
　４ｍＬ（２ｍＬ×２）の、金ナノ粒子を成長させた溶液であるＧｒｏｗｔｈ溶液［Ｓ.　Ｙａｇｉ,　ｅｔ　ａｌ,　Ｊ　Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍ　Ｓｏｃ,　１５９,　Ｈ６６８　（２０１２）参照］を遠心管に入れ２５℃、回転数３０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。上澄み溶液（１．８ｍＬ×２）を除去し、超純水（１．８ｍＬ×２）を添加し、再度同じ条件で遠心分離した。その後、上澄み溶液（１．８ｍＬ×２）を除去し、超純水（０．２ｍＬ×２）を添加し還元剤濃度を希釈した濃縮ＡｕＮＰ溶液（Ａｕ５００μＭ）を作製した。
（コラーゲン溶液の作製）
　クリーンベンチ（昭和科学社製，Ｓ－１００１ＰＲＶ）内で、細胞培養基材［新田ゼラチン社製，Ｃｅｌｌｍａｔｒｉｘ（登録商標）Ｉ－Ａ，コラーゲン濃度０．３ｗｔ%，ｐＨ３．０，０．５６ｍＬ］へ希塩酸（０．４２ｍＬ）、濃縮金ナノ粒子（ＡｕＮＰ）溶液（０．７０ｍＬ）、１０倍無機塩培地（０．２０ｍＬ）、再構成溶液（０．２０ｍＬ）を氷冷下で、この順番で加えてコラーゲンゲル溶液（２．１ｍＬ）を調製した。
（井戸型マイクロアレイ（細胞培養容器）の作製）
　１０２０個の底を有するウェルが形成されたアクリル製のマイクロアレイを作製した。ウェルの径と深さは２００μｍ、隣接するウェルの中心間の距離が３３０μｍ、各ウェルの底からマイクロアレイの底までの距離を約８００μｍとした。マイクロアレイをエタノールで置換し、続いて純水で置換した。さらに、上記で作製した金ナノ粒子包埋コラーゲン溶液を２００μＬで３回置換し、各ウェルを金ナノ粒子包埋コラーゲンゲルで満たした。これを、ダイレクトヒートＣＯ２インキュベーター内で３７℃下、３０分間インキュベーションした。
（貫通穴型マイクロアレイ（細胞培養容器）の作製）
　１０２０個の底に貫通孔を有するウェルが形成されたアクリル製のマイクロアレイを作製した。ウェルと貫通孔の径は等しく２００μｍとし、ウェルの深さは２００μｍ、隣接するウェルの中心間の距離は３３０μｍとした。３５ｍｍ培養皿に上記で作製した金ナノ粒子包埋コラーゲン溶液を１．８ｍＬ加え、これを、ダイレクトヒートＣＯ２インキュベーター内で３７℃下、３０分間インキュベーションしゲルを作製した。次に、マイクロアレイの下面を上記のゲルに押しつけ、各ウェルを金ナノ粒子包埋コラーゲンゲルで満たした。そして、マイクロアレイを反転させ、ゲルと接触した面を上部とし、細胞培養面とした。
（細胞播種および剥離）
　作製した細胞培養容器にＤＭＥＭに分散させたＨｅＬａ細胞（６０００個／マイクロアレイ）を流し込み、３７℃で１日間培養した後、培地を吸引除去した。顕微鏡下、アルミシートを載せた３７℃サーモプレート上もしくは細胞培養チャンバー内で、スポット径が最小となるように設定し光照射した。
　光照射にはＰＡ（ｐｈｏｔｏａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）落射蛍光装置（ニコン社製，ＴＩ－ＰＡＵ）を経由してレーザー光源（シグマ光機社製，波長５３２ｎｍ，出力５０ｍＷ）を組み込み、波長５３２ｎｍの光透過性をもつミラーユニット（ニコン社製，ＴＲＩＴＣ）を設置したものを使用し、細胞は倒立型蛍光顕微鏡（ニコン社製,　ＥＣＬＩＰＳＥ　Ｔｉ－Ｕ）およびイメージングセンサー制御ソフトウェア（ＷＲＡＹＭＥＲ社製，ＷｒａｙＳｐｅｃｔ）を用いて蛍光/位相差観察および撮像を行った。観察は４倍、１０倍の対物レンズ（ニコン社製，Ｐｌａｎ－Ｆｌｕｏｒ）を用いて行った。
（結果）
　光照射によりゲルが変性・収縮し、マイクロアレイのウェルから剥離することが確認された。
　なお、ウェルの径を６００μｍとするマイクロアレイも作製したが、光照射による変性効果は、ウェルの径を２００μｍとしたときの方が高く得られた。
　また、ウェルの径を１００μｍとして貫通穴型のマイクロアレイを作製したところ、光照射による変性効果は、ウェルの径を２００μｍとしたときよりも高く得られた。
　１…細胞培養容器、７…レーザー光、１０…細胞培養容器本体、１１…ウェル、１２…貫通孔、１３…金微粒子、１４…細胞培養基材、１５…ゲル、２０…培養液、３０…細胞、４０…吸引ポンプ、７０…顕微鏡、３００…選択細胞、１０００…細胞回収システム

Claims (14)

  1. 　複数のウェルを有する細胞培養容器であって、各ウェルに、加熱によって変性するゲル中に金微粒子を分散させてなる細胞培養基材が充填されている細胞培養容器。
  2. 　前記ウェルが底を有する請求項１記載の細胞培養容器。
  3. 　前記ウェルが底に貫通孔を有する請求項１記載の細胞培養容器。
  4. 　前記貫通孔の径は、前記ウェルの径と同一かそれより小さい、請求項３に記載の細胞培養容器。
  5. 　前記貫通孔の径は、加熱によって変性したゲルが通過できる大きさである、請求項３に記載の細胞培養容器。
  6. 　前記ウェルの径は、１０μｍ～５００μｍである、請求項１～５のいずれか一項に記載の細胞培養容器。
  7. 　前記ウェルが１ウェル当たり約１細胞配置される径を有する請求項１～６のいずれか一項に記載の細胞培養容器。
  8. 　前記ゲルが、コラーゲンゲル又はゼラチンゲルである、請求項１～７のいずれか一項に記載の細胞培養容器。
  9. 　前記ウェルが、アレイ状に配置されている、請求項１～８のいずれか一項に記載の細胞培養容器。
  10. 　請求項１～９のいずれか一項に記載の細胞培養容器と、吸引ポンプとを備える、細胞回収システム。
  11. 　請求項１～９のいずれか一項に記載の細胞培養容器の各ウェルに配置された細胞から、取得する細胞を選択する工程と、
    　前記取得する細胞が配置されているウェルに充填された細胞培養基材に光を照射する工程と、
    　前記光を照射した細胞培養基材を前記細胞培養容器から取り出す工程と、
    　前記細胞培養容器から取り出した細胞培養基材から細胞を回収する工程と、
    を含む、細胞の取得方法。
  12. 　前記細胞培養基材を細胞培養容器から取り出す工程が、前記光を照射した細胞培養基材を吸引する工程である、請求項１１に記載の細胞の取得方法。
  13. 　前記細胞培養基材を細胞培養容器から取り出す工程が、前記光を照射したゲルを前記細胞培養容器中で液体に浮遊させ、該液体を回収する工程である、請求項１１に記載の細胞の取得方法。
  14. 　請求項１１～１３のいずれか一項に記載の細胞の取得方法により取得した細胞を培養する細胞の培養方法。 
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