IT202100010988A1

IT202100010988A1 - Supporto trasparente riscaldabile selettivamente per la crescita o la differenziazione di campioni biologici

Info

Publication number: IT202100010988A1
Application number: IT102021000010988A
Authority: IT
Inventors: Giuseppe Chirico; Maddalena Collini; Marzia Maria Lecchi; Stefania Blasa; Mykola Borzenkov; Piersandro Pallavicini
Original assignee: Univ Degli Studi Di Milano Bicocca
Priority date: 2021-04-30
Filing date: 2021-04-30
Publication date: 2022-10-30
Also published as: WO2022229467A1

Description

DESCRIZIONE

CAMPO DELL?INVENZIONE

La presente invenzione si riferisce a materiali e metodi per la coltura di campioni biologici. In particolare, si tratta di supporti per campioni biologici atti a fornire calore a detti campioni in modo altamente preciso e controllabile in modo da indurre la crescita o il differenziamento delle cellule.

SFONDO DELL'INVENZIONE

La coltura di campioni biologici ha generalmente come scopo quello di portarli da uno stadio di sviluppo iniziale (precursore) allo stadio maturo e/o di farli sviluppare in numero, massa, dimensione, superficie, ecc. Campioni biologici tipicamente coltivati sono cellule, aggregati cellulari, organismi unicellulari o multicellulari, tessuti, parti di organi (biopsie), ecc.

Un aspetto importante nei metodi di coltura ? il tasso di crescita e differenziamento: spesso questo si ottiene aggiungendo specifici terreni di coltura arricchiti con fattori di crescita o per il differenziamento, e mantenendo la temperatura del campione biologico vicino a 37 ? C. Raramente sono stati applicati altri stimoli fisici, oltre alla temperatura, per stimolare il differenziamento cellulare.

? necessario mettere particolare attenzione nel controllo della temperatura nei metodi di coltura: i campioni biologici sono infatti sensibili alla temperatura e la loro vitalit? e funzionalit? vengono salvaguardate solo entro intervalli di temperatura limitati. Esistono tuttavia alcuni studi (Shui et al.2001<1>; Hossain 2017<2>; Wang 2016<3>;

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Oyama 2015<4>; Kudo 2015<5>, solo per citarne alcuni) che dimostrano che l'applicazione di specifici stimoli termici, eventualmente ripetuti periodicamente, a differenti linee cellulari in coltura pu? migliorare la resa colturale, in termini di differenziamento e/o di crescita.

Si possono distinguere due modalit? di trattamenti termici: trattamento di mantenimento e trattamento di stimolo. L'applicazione termica standard di mantenimento ? essenzialmente finalizzata alla salvaguardia della vitalit? / funzionalit? del campione biologico; si tratta di impostare una temperatura di incubazione stabile per tutto il periodo di coltura, normalmente applicata dall'intero reattore in cui avviene l'incubazione. D'altra parte, le applicazioni termiche di stimolo sono trattamenti tipicamente episodici, intermittenti o ciclici, eseguiti durante e in aggiunta alla normale temperatura di incubazione: sono caratterizzate da un transitorio e repentino cambiamento di temperatura, tipicamente un aumento, rispetto alla temperatura di incubazione; questi eventi termici dovrebbero avere una durata molto pi? breve rispetto al tempo di incubazione complessivo e potrebbero anche essere particolarmente rapidi nell?attivazione e nell?estinzione dello stimolo.

Un approccio molto semplice atto a stimolare termicamente le cellule consiste nel modificare la temperatura dell'incubatore. Tuttavia, questo metodo ? poco efficace e pratico data la notevole inerzia termica dell'apparato, in particolare nel caso di incubatori industriali di grandi dimensioni. Queste apparecchiature non consentono di indurre nel campione biologico un aumento rapido e controllato della temperatura: la temperatura desiderata viene raggiunta troppo lentamente. D?altro

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canto, cercare di aumentare la velocit? di riscaldamento impostando una temperatura pi? alta di quella desiderata sul controller dell'incubatore potrebbe causare il surriscaldamento del campione biologico, con conseguente perdita di vitalit? e/o funzionalit? delle cellule nel campione (inerzia termica eccessiva). ? perci? pi? conveniente stimolare termicamente il materiale biologico in modo separato e indipendente dalla regolazione della temperatura di incubazione globale, tramite dispositivi di riscaldamento aggiuntivi, ad esempio lampade riscaldanti, cio? lampade a raggi infrarossi, posti all'interno dell'incubatore a distanza ravvicinata dal campione biologico. Tali dispositivi aggiuntivi possono indurre variazioni di temperatura pi? rapide e controllabili al campione biologico coltivato. Tuttavia, come notato dai presenti inventori, anche in queste condizioni pi? favorevoli ? comunque molto difficile indurre variazioni di temperatura nette e controllabili (in termini di durata temporale) al campione biologico con un'elevata risoluzione spaziale (idealmente la singola cellula o poche cellule alla volta). I relativi procedimenti risultano tipicamente incoerenti o insufficienti per la stimulazione della porzione specifica del campione da trattare e, d?altra parte, possono risultare dannosi sulla porzione del campione che non si desidera trattare. Tutto questo si traduce in risultati meno efficaci sulla coltura.

La presente invenzione ha come scopo lo sviluppo di dispositivi e metodologie che permettano di stimolare termicamente campioni biologici in modo efficace. Mira inoltre a migliorare l'efficienza e la riproducibilit? degli eventi di riscaldamento applicati al campione

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biologico; si propone inoltre di fornire semplici metodi per differenziare o far crescere cellule in campioni biologici che siano pi? versatili in termini di controllo della temperatura.

RIASSUNTO DELL?INVENZIONE

I presenti inventori hanno scoperto che campioni biologici in coltura, in particolare cellule neuronali (ma pu? essere applicato anche ad altre linee cellulari) possono essere stimolati selettivamente nel loro differenziamento mediante una stimolazione termica localizzata.

I presenti inventori hanno inoltre scoperto che la stimolazione termica di un campione biologico in coltura pu? essere ottenuta efficacemente ad alta risoluzione spaziale e hanno dimostrato che sono in grado di innalzare la temperatura in modo spazialmente focalizzato, anche a livello di singole cellule. Tale riscaldamento localizzato ? stato per la prima volta ottenuto dai presenti inventori incorporando nanoparticelle fototermiche dotate di effetto fototermico inducibile da irraggiamento con lunghezza d'onda compresa tra 0,4 ?m e 1,2 ?m, solo in quelle aree specifiche del supporto dove ? richiesto il trattamento termico. Come mostrato dagli esperimenti riportati in questa descrizione, questo riscaldamento localizzato ? risultato inaspettatamente efficiente nello stimolare il differenziamento.

Oggetto dell'invenzione ? quindi un supporto per campioni biologici comprendente nanoparticelle dotate di effetto fototermico incorporate o stratificate su di esso. Il supporto, otticamente trasparente e strutturalmente rigido, pu? essere sagomato in forma di contenitori standard per l'incubazione di campioni biologici come, ad esempio, una

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capsula di Petri ed ? realizzato con materiali con essi compatibili, tipicamente vetro e plastica. Le nanoparticelle non sono presenti in tutto il supporto, ma sono disposte in corrispondenza di porzioni selezionate dove ? richiesta la stimolazione termica, in particolare in corrispondenza di quelle porzioni del supporto destinate a venire a contatto con il campione biologico. L'espressione "in corrispondenza di" qui usata esclude tuttavia un contatto diretto, cio? fisico, tra le nanoparticelle e il campione biologico stesso; in particolare, il termine "in corrispondenza" definisce una localizzazione delle nanoparticelle in prossimit? del campione biologico, tipicamente a una distanza di 140-650 o pi? micrometri dal campione biologico, ad esempio 140-300 micrometri o 140-170 micrometri; rimane quindi sempre una sezione del supporto che ? priva di nanoparticelle e che separa le nanoparticelle da un contatto fisico diretto con il campione biologico.

All'interno delle porzioni selezionate del supporto sopra definite, le nanoparticelle sono presenti a concentrazioni generalmente comprese tra 0,1 e 20 nanoparticelle /?m<3>, concentrazioni che possono essere ulteriormente variate e/o ottimizzate a seconda dei materiali specifici in uso.

Le nanoparticelle sono preferibilmente stratificate sul supporto: coerentemente con i principi sopra esposti, lo strato viene applicato sul piano di supporto opposto a quello che viene a contatto con il campione biologico, evitando cos? un contatto fisico diretto tra nanoparticelle e campione biologico: ad esempio, se il supporto ? una piastra di Petri, lo strato di nanoparticelle verr? applicato solo sulla superficie esterna

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inferiore della piastra, escludendo la stratificazione delle nanoparticelle sulla superficie superiore della piastra che viene a diretto contatto con il campione biologico. Il deposito dello strato di nanoparticelle pu? essere ottenuto rivestendo il supporto con un materiale polimerico contenente nanoparticelle, in cui il polimero pu? essere scelto ad esempio tra alcool polivinilico, polivinilpirrolidone e / o chitosano.

Ulteriore oggetto della presente invenzione ? un metodo di fabbricazione del suddetto supporto, comprendente la stratificazione o incorporazione delle suddette nanoparticelle in un opportuno precursore del supporto. Un ancora ulteriore oggetto dell'invenzione ? un metodo di utilizzo del supporto, ovvero un metodo di coltura di un campione biologico, comprendente (i) il posizionamento di un campione biologico a contatto con il supporto e (ii) l?irraggiamento del supporto con lunghezza d'onda compresa tra 0,4 ?m e 1,2 ?m. L'invenzione include anche un incubatore contenente uno o pi? supporti come descritto sopra.

DESCRIZIONE DELLE FIGURE

Figura 1. Immagini rappresentative di cellule F-11 mantenute in coltura a 37 ? C (A) e stimolate termicamente a 41,5 ?C (B). Le cellule a 41,5 ?C hanno mostrato neuriti significativamente pi? lunghi (frecce nere) rispetto al controllo, suggerendo che la stimolazione termica remota ? stata in grado di modificare la morfologia cellulare.

Figura 2. Propriet? morfologiche delle cellule F-11 irraggiate. A) La lunghezza dei neuriti delle cellule irraggiate a 41,5 ? C (n = 6 esperimenti indipendenti), analizzata dal giorno 1 al giorno 8, era significativamente pi? alta del controllo (n = 6 esperimenti indipendenti)

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a partire dal giorno 2 (p <0,001 , Test di Mann-Whitney). B) Numero medio di neuriti di cellule irraggiate e di controllo a partire da un giorno dopo la semina. Il numero di neuriti aumenta a partire dal giorno 2, con una differenza significativa al giorno 2 e 3 (p <0,01 e p?0,01, rispettivamente). Per ogni esperimento, ? stato analizzato un numero di piatti di coltura da 1 a 5.

Figura 3. Propriet? morfologiche delle cellule F-11 irraggiate in presenza di nanoparticelle PBNP (nero) e senza di queste (grigio scuro). La lunghezza media dei neuriti era significativamente pi? alta (p <0,001) nei campioni irraggiati in presenza di nanoparticelle PBNP, rispetto sia alle cellule irraggiate senza nanoparticelle PBNP che a quelle di controllo. Inoltre, le cellule irraggiate, ma in assenza di nanoparticelle PBNP, hanno mostrato un andamento simile al controllo per tutti i giorni dell'esperimento. Il numero di piatti di coltura per ciascuna condizione era: n = 3 per IR, n = 3 per IR NOPB en = 3 per CTRL.

Figure 4. Analisi funzionale di cellule F-11. Le propriet? elettrofisiologiche ottenute con la tecnica di Patch-Clamp ai giorni 7 e 8, confermano un profilo maggiormente differenziato per le cellule stimolate con radiazione (IR), rispetto a quelle a 37?C (CTRL). A) I campioni stimolati hanno mostrato una densit? di corrente di sodio pi? alta e una tendenza ad avere una densit? di corrente di potassio pi? elevata rispetto al controllo (per i campioni irraggiati: Ina: 109,7 ? 10,70 pA/pF, e IK= 87,37 ? 9,8 pA/pF, n=32; per i campioni di controllo: Ina = 79,22 ? 11,20 pA/pF e IK = 70,23 ? 7,5 pA/pF, n=31; per la Ina, p?0,05, One-Way ANOVA Test, per la IK, p=0,31, Mann-Whitney Test). B) Le cellule

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irraggiate hanno mostrato una frequenza di attivazione del potenziale di azione pi? elevata se paragonata al campione di controllo (per i campioni irraggiati: 5,86 ? 0,51 Hz, n=36; per i campioni di controllo: 2,52 ? 0,49 Hz, n=36; p<0,001, Mann-Whitney Test). C) Le colture cellulari stimolate termicamente a 41,5?C hanno mostrato una percentuale di cellule con attivit? spontanea pi? elevata se paragonata a controllo (per i campioni irraggiati: n=25/37; per i campioni di controllo: n=7/36; p<0,001, Chi-Square Test). D) I campioni irraggiati hanno mostrato un potenziale di membrana a riposo maggiormente iper-polarizzato se paragonato al controllo (per i camponi irraggiati: -39,29 ? 0,89 mV, n=35; per i campioni di controllo: -30 ? 1,9 m, n=37; p<0,001, Mann-Whitney Test).

Figure 5. Propriet? morfologiche delle cellule F-11 irradiate a 43 ?C. I campioni irraggiati a 43 ?C hanno mostrato neuriti pi? corti. Inoltre, queste cellule sembravano essere maggiormente stressate rispetto al controllo, che aveva una lunghezza dei neuriti media significativamente pi? alta a partire dal giorno 3 (p <0,001, Mann-Whitney Test). Il numero di esperimenti indipendenti per ciascuna condizione ? stato: n = 2 per IR 43 ? C e n = 2 per CTRL. Per ogni esperimento, ? stato analizzato un numero di piatti di coltura da 1 a 5.

DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL?INVENZIONE

Il termine ?supporto? qui usato si riferisce ad ogni materiale solido che sia idoneo a mantenere in una posizione stabile un campione biologico posatovi sopra. Il supporto deve essere strutturalmente rigido, cio? avere un modulo di Young di 0.4 MPa o maggiore, per esempio fra 0.4 e 1.2 MPa. Il supporto ? pertanto strutturalmente differente da ad esempio cerotti flessibili, pellicole o similari. Tipicamente, la rigidit? strutturale del supporto ? ottenuta attraverso vetro, plastica e similari come materiali compositi del supporto. Il supporto ? anche otticamente trasparente. ? principalmente a forma di contenitore o a forma di piastra, a seconda delle caratteristiche del campione biologico che deve essere sostenuto, ad esempio campioni in sospensione, o campioni in adesione. Tipicamente, forme non limitanti del supporto utilizzato in questa invenzione sono una piastra di Petri, un tubo, un vetrino (ad esempio un vetrino da microscopio), un vassoio, una fiasca, un vaso di reazione anche nella forma di un micro-capillare, camere da microfluidica, ecc. Il supporto comprende porzioni che hanno lo scopo di venire in contatto con il campione biologico (ad esempio con la forma e/o contrassegnate per questa funzione): queste aree possono essere ad esempio il fondo del contenitore, la parte centrale di una piastra, etc.

Secondo l?invenzione, le nanoparticelle sono presenti nel supporto in modo localizzato, cio? in corrispondenza di quelle porzioni del supporto che sono destinate, nell?uso, a venire in contatto con il campione biologico. Pi? preferibilmente, le nanoparticelle sono presenti selettivamente solo in quelle porzioni. Entro queste porzioni, la concentrazione di nanoparticelle preferibilmente varia da 0.1 a 20 nanoparticelle/ ?m<3 >(pi? preferibilmente da 0.5 a 10 nanoparticelle/ ?m<3 >oppure da 1.0 a 5.0 nanoparticelle/ ?m<3>).

Il termine ?effetto fototermico? si riferisce alla capacit? delle nanoparticelle di rilasciare calore quando irraggiate alla lunghezza d?onda selezionata, tipicamente entro lo spettro visibile o del vicino infrarosso.

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Lunghezze d?onda idonee variano da 0.4 ?m a 1.2 ?m, preferibilmente da 0.5 ?m a 1.0 ?m, pi? preferibilmente da 0.6 ?m a 0.9 ?m. L?irraggiamento pu? essere fornito da qualsiasi dispositivo adatto, come una lampada che emette luce visibile e/o NIR (Near InfraRed) nell?intervallo di lunghezze d?onda stabilito sopra. Dispositivi di irraggiamento speciali, anche utilizzabili nell?invenzione sono quelli basati su LED; fra loro particolarmente interessanti sono quelli dotati di sistemi ottici che permettono di direzionare e cambiare la forma dell?area di irraggiamento. Esempi di questi dispositivi sono descritti nella domanda di brevetto WO2019185731, incorporata per riferimento.

Le nanoparticelle con effetto fototermico utilizzabili nella presente invenzione sono largamente note di per s? e sono disponibili commercialmente; possono essere usate singolarmente o in miscele di diverse nanoparticelle. In una forma di realizzazione, le nanoparticelle usate hanno una efficienza di conversione fra radiazione assorbita e calore emesso (qui anche misurata come tasso di assorbimento specifico) maggiore di 50 kW/g, particolarmente da 50 a 300 kW/g, preferibilmente da 150 a 300 kW/g. Il tasso di assorbimento specifico (convenzionalmente chiamato SAR) ? definito come:

dove C ? la capacit? termica della sospensione e MNP ? la massa totale delle nanoparticelle

Esempi preferiti ma non limitanti di nanoparticelle adatte sono

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Nanostelle d?oro (GNS), Nanostelle d?oro peghilate e/o particelle di Blu di Prussia (PBNP). Grazie al valore elevato del loro SAR, queste nanoparticelle sono caratterizzate da un tempo di induzione particolarmente corto (insorgenza della risposta fototermica), cio? raggiungono la temperatura desiderata tipicamente entro 5 s dall?inizio dell?irraggiamento. Le citate GNS e PBNP sono anche capaci di raggiungere un plateau stabile di temperatura, che viene mantenuto nel corso dell?intero irraggiamento. GNS sono disponibili commercialmente ad esempio da NanoSeedz e NanoimmunoTech (https://www.nanoimmunotech.eu/en/Shop/Nanoparticles-/Gold-NanoStars e http://nanoseedz.com/product/gold?nanostars/). GNS e PBNP sono biocompatibili e non tossiche; PBNP sono anche approvate dal U.S. Food and Drug Administration (FDA). Qualora lo si richieda, le GNS possono essere prodotte con metodi di sintesi noti, che includono l?utilizzo del surfattante Triton X-100 (si veda ad esempio Pallavicini et al., Chem.Commun., 2013, 49, 6265-6276, qui incorporata per riferimento). Dette procedure permettono di regolare precisamente la posizione dei picchi di risonanza plasmonica nell?intervallo NIR (tipo di surfattante, concentrazione di reagente). In particolare, le GNS mostrano due o pi? risonanze plasmoniche localizzate (LSPR, caratterizzate da due picchi intensi nell?intervallo 0.6-0.9 ?m e 1.1-1.6 ?m), che inducono un rilassamento termico (=rilascio di calore) quando le GNS sono irraggiate. Anche le PBNP possono essere ottenute con una procedura nota (ad esempio Supramolecular Chemistry, 2017, 19, 1-11, qui incorporata per riferimento): essa contempla la reazione di FeCl<3+ >con acido citrico e la

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seguente aggiunta alla miscela di reazione di una soluzione di K4[Fe(CN)6] e acido citrico. Le PBNP mostrano una intensa banda con un massimo intorno a 0.7 ?m. L?irraggiamento in questa banda risulta in un rilassamento termico corrispondente a rilascio di calore. Altre nanoparticelle usate nella presente invenzione sono nano-barrette d?oro ad elevato rapporto assiale (>4) con picco plasmonico a 800 nm o vicino a 800 nm. Queste possono essere acquistate ad esempio da Nanopartz (https://www.nanopartz.com/). La dimensione delle nanoparticelle pu? essere ampiamente variata entro un intervallo nanometrico: valori non limitanti possono variare da 5 a 100 nm.

La presente invenzione estende ad un metodo di fabbricazione di un supporto per campioni biologici come descritto sopra, comprendente la stratificazione su o l?incorporazione in un adatto precursore del supporto, delle nanoparticelle provviste di effetto fototermico che pu? essere indotto da irraggiamento con lunghezze d?onda nell?intervallo da 0.4 ?m a 1.2 ?m. Per ?supporto precursore? si intende qui un supporto che non contenga nanoparticelle.

Quando le nanoparticelle devono essere incorporate nel supporto, il precursore del supporto ? tipicamente utilizzato nello stato fluido o tipo gel; la fluidit? del materiale del supporto ? tipicamente ottenuta attraverso il riscaldamento. La viscosit? e la tensione superficiale del materiale del supporto possono essere variate mediante l?aggiunta di alcoli o polimeri a basso peso molecolare come PEG o PVP. Una dispersione strutturata delle nanoparticelle pu? essere ottenuta ad esempio preparando campioni separati di materiale supporto in stato

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fluido o gel, alternativamente contenente o meno particelle uniformemente distribuite. I materiali che contengono o meno le nanoparticelle sono quindi portati separatamente ad uno stato solido (oppure tipo gel adatto ad essere manipolato) e assemblati insieme per formare il supporto. In alternativa, e preferibilmente per le applicazioni in coltura cellulare, le strutture si possono ottenere tramite stampa, specificatamente mediante tampografia con silicone o simili timbri. Per questo motivo le nanoparticelle ricoperte di PVP possono essere disperse in acrilati e usate per riempire una struttura su un substrato solido, tipicamente vetro, plastica o similari. La viscosit? della dispersione determina lo spessore della struttura, nell?intervallo specificato di seguito.

Quando le nanoparticelle sono stratificate sul supporto, il termine ?localizzate? indica che le nanoparticelle sono poste in corrispondenza delle relative porzioni del supporto, come definito precedentemente. La stratificazione ? applicata sulla superficie opposta a quella dove il campione biologico deve essere tenuto. La stratificazione ? preferibilmente ottenuta mediante mescolamento di nanoparticelle e di un materiale polimerico (ad esempio un polimero o una composizione polimerica) e stendendo la miscela risultante sul supporto. Il polimero utilizzato ? otticamente trasparente e pu? essere indifferentemente scelto tra quelli disponibili come base adatta alla stratificazione: una lista non limitante di questi include polimeri polivinilici, polisaccaridi, polilattidi, poliglicolidi, poliacrilati, polimetacrilati, policianoacrilati, polioleofine, poliuretani, poliamidi, polimidi, polieteri, poliesteri, poliacetati,

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policarbonati, gomme, polisilossani, loro derivati reticolati e loro miscele. Preferibilmente, lo stato polimerico ? formato da alcol polivinilico, polivinil pirrolidone e/o chitosano.

In una possibile implementazione, la miscela del polimero contenente le nanoparticelle, prima o dopo la stratificazione, viene sottoposta a reticolazione. Questo contribuisce a immobilizzare le nanoparticelle, evitando la loro aggregazione, rilascio e/o fuoriuscita, contribuendo alla efficienza e stabilit? della risposta termica del supporto. Oltre a questo, la reticolazione aumenta in generale la stabilit? e la resistenza del supporto. La reticolazione pu? essere ottenuta aggiungendo alla miscela polimerica un agente reticolante opportuno, ad esempio acido citrico o altri agenti reticolanti selezionati a seconda del polimero scelto. Per esempio, si pu? applicare anche una reticolazione non-chimica, ma fisica.

La stratificazione pu? includere uno strato o multipli strati, uguali o diversi in composizione. Lo spessore dello strato contenente le nanoparticelle (o del multistrato nell?insieme, se presente) varia da 30 a 200 ?m, preferibilmente da 70 a 160 ?m, pi? preferibilmente da 80 a 120 ?m, ad esempio 100 o 110 ?m.

Se il precursore del supporto (o parti di esso) ? (sono) in uno stato non-solido, dopo l?incorporazione delle nanoparticelle, il metodo di fabbricazione includer? un passaggio di indurimento del supporto, normalmente raggiunto mediante raffreddamento. Se le nanoparticelle sono state stratificate, il metodo include anche un passaggio di indurimento dello strato, normalmente ottenuto mediante

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raffreddamento e/o, dove applicabile, mediante ?curing?. Dove possibile, l?indurimento del supporto e dello strato possono essere combinati in un singolo passo, ad esempio raffreddando a una temperatura idonea il supporto con le particelle stratificate.

Un ulteriore oggetto dell?invenzione ? un incubatore per campioni biologici che include all?interno uno o pi? supporti come menzionati sopra; in questa realizzazione, i supporti sono componenti strutturali dell?incubatore, cio? sono meccanicamente, se possibile permanentemente attaccati all?incubatore; per questo scopo, ogni incubatore noto dallo stato dell?arte ? adatto per essere modificato integrando meccanicamente i supporti della presente invenzione. Una vantaggiosa realizzazione prevede l?uso di un incubatore di scala industriale, contenente all?interno una pluralit? di supporti in accordo con l?invenzione, ognuno dotato di mezzi di irraggiamento, ad esempio una lampada visibile-infrarossa (preferibilmente a LED), posta nella prossimit? del supporto e ivi focalizzata. Questa disposizione permette di condurre un trattamento termico stimolante altamente indirizzato nel campione biologico, impossibile da realizzare mediante incubatori tradizionali che non includono i supporti selettivamente riscaldabili dell?invenzione.

Un ulteriore oggetto dell?invenzione ? un metodo di utilizzo del supporto definito sopra, cio? un metodo per colture biologiche, che comprende: (i) mettere un campione biologico in contatto con il supporto e (ii) irraggiare il supporto con una lunghezza d?onda da 0.4 ?m a 1.2 ?m: in una realizzazione, nel passo (ii) l?irraggiamento ? focalizzato su porzioni

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selezionate del supporto che contengono le nanoparticelle, su cui ? posizionato il campione biologico.

I supporti utilizzati in questi metodi permettono di trasferire calore al campione biologico in un modo altamente efficiente con alta risoluzione spaziale (decine di micron, 35-40 micrometri) e temporale (secondi). In particolare, le nanoparticelle all?interno del supporto forniscono sorgenti di calore altamente concentrate e altamente focalizzate verso il campione biologico; inoltre, il supporto contenente le nanoparticelle pu? produrre un gradiente di temperatura pi? ripido, sia in riscaldamento sia in raffreddamento, se paragonato al riscaldamento prodotto da un incubatore di cellule in bulk. Questi vantaggi si traducono in metodi di coltura cellulare pi? efficienti, in particolare quelli che richiedono trattamenti di stimolo termico, dove il ciclo termico di stimolo richiesto pu? essere applicato al campione biologico in un modo altamente preciso, controllato e riproducibile. Questo permette di massimizzare la resa di coltura trovandone le condizioni precise e riproducibili. Per esempio, quando il campione biologico ? una coltura cellulare, come cellule neuronali, l?irraggiamento focalizzato ? particolarmente efficace se effettuato giornalmente per 15-45 minuti, preferibilmente 30 minuti, ad una temperatura fra 38 e 42 ?C, preferibilmente 41.5?C.

L?invenzione ? ora descritta per mezzo degli esempi sperimentali che seguono e che non sono limitanti.

PARTE SPERIMENTALE

1. Colture Cellulari

Le cellule della linea F-11 (neuroblastoma di topo N18TG-2 x DRG di ratto, ECACC Cat#08062601 RRID: CVCL_H605; Platika, Doros & Boulos, M & Baizer, L & Fishman, M. (1985). Neuronal traits of clonal cell lines derived by fusion of dorsal root ganglia neurons with neuroblastoma cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82: 3499-503) sono state seminate ad una densit? di 50000 cellule/piastra da 35 mm di diametro (Corning?; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) e sono state mantenute in terreno esente da siero per ridurne la proliferazione. La composizione completa del terreno di coltura ? stata descritta precedentemente (Pastori V, D'Aloia A, Blasa S, Lecchi M. (2019). Serum-deprived differentiated neuroblastoma F-11 cells express functional dorsal root ganglion neuron properties. PeerJ, 7:e7951) e comprendeva: Dulbecco?s modified Eagle?s medium (DMEM, Cat#D6546; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), glutammina 2mM (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), 1% di siero fetale bovino (FBS, Cat# F2442; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) e penicillina/streptomicina (10000 U/ml, lot#753901 ref#15140; Gibco?, Waltham, MA, USA).

2. Preparazione delle Nanoparticelle di Blu di Prussia (PBNP)

Le nanoparticelle di Blu di Prussia (PBNP), biocompatibili e approvate dalla Food and Drug Administration (FDA), mostrano un assorbimento intenso nella regione tra 700 e 750 nm dato dal trasferimento di cariche tra il Fe II e il Fe III, attraverso la formazione di un ponte cianuro, e l?irraggiamento di questa banda porta a un rilassamento termico.

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Le nanoparticelle sono state preparate secondo i protocolli pubblicati in letteratura (

(2017). Self-assembled monolayers of Prussian blue nanoparticles with photo-thermal effect. Supramolecular Chemistr. 29:11, 823-833), aumentando la concentrazione dei reagenti da 1 mM a 10 mM. La soluzione FeCl3 10 mM (100 ml) ? stata miscelata con K4[Fe(CN)6] 10 mM in acido citrico 0.025 M e riscaldata a 60?C in agitazione. Dopo 1 minuto a 60?C, la soluzione ? stata raffreddata a temperatura ambiente. La soluzione ? stata centrifugata per 25 minuti a 13000 rpm in tubi per la purificazione da 10 ml. Il pellet con le nanoparticelle centrifugate ? stato risospeso in met? del volume originale. Il picco di assorbanza della soluzione acquosa di PBNP ? stato verificato utilizzando lo spettrofotometro Jasco, V-570.

3. Preparazione dello strato di PVA con nanoparticelle PB (PB-PVA)

? stata preparata una soluzione contenente alcol polivinilico al 7% (PVA, peso molecolare 72000 g mol<-1>, grado di idrolisi 98%, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) e il 27-30% della soluzione di PBNP 10 mM. La polvere di PVA ? stata disciolta in acqua e mantenuta in stufa a 70?C per almeno un?ora. A questa ? stata poi aggiunta la soluzione di PBNP e la miscela finale ? stata ottenuta dopo un?ora in agitazione continua.

Sulla superficie esterna della piastra Petri ? stata depositata una goccia di 70 ?l di composto finale, che ? stata poi fatta asciugare in stufa a 60?C per almeno un?ora. Lo strato di PVA con le PBNP (di colore blu) copriva approssimativamente un?area circolare di 1 cm<2>. Un cerchio

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della stessa area ? stato disegnato con un pennarello sulle piastre Petri di controllo, in modo da confrontare aree di dimensioni simili.

4. Protocollo di irraggiamento con riscaldamento dello strato di nanoparticelle

Per aumentare la temperatura delle cellule nella piastra Petri in corrispondenza dello strato di PBNP-PVA ? stato utilizzato un Ti:Sa laser (Mai-Tai DeepSea Ti:Sapphire?, Spectra Physics?, Santa Clara, CA, USA) regolabile tra 0.69 ?m e 1.10 ?m. Sfruttando una lunghezza d?onda di 0.72 ?m, ? stata scelta una potenza in grado di raggiungere la temperatura desiderata. La calibrazione della temperatura ? stata effettuata sia sulla piastra Petri a secco, per verificare la riproducibilit? del metodo, sia in piastre Petri con 2 ml di terreno di coltura, per determinare la potenza necessaria a raggiungere la temperatura desiderata. ? stata effettuata un?accurata calibrazione utilizzando una termocamera (FLIR E40, FLIR Systems Inc., OR, USA) e una sonda ipodermica (Omega Engineering Ltd, Stamford, CT). Anche la dimensione del fascio laser ? stata accuratamente calibrata, in modo da coprire l?intera area dello strato di PBNP-PVA. Per raggiungere questo obiettivo, ? stato posizionato sul fascio laser un espansore ed ? stata misurata la sua dimensione registrando la potenza del laser dopo il suo passaggio attraverso un diaframma di diametro regolabile. L?interpolazione dei valori della potenza rispetto al diametro del diaframma ha permesso di valutare la dimensione totale del fascio. La piastra Petri ? stata posizionata su un supporto e irraggiata con il fascio laser a livello della sua superficie inferiore. Durante l?irraggiamento, le piastre Petri sono

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state mantenute a 37?C grazie all?uso di una camera appositamente costruita, la cui temperatura ? stata controllata dallo strumento The Cube (Life Imaging Servicec, Basel, CH).

5. Analisi morfologica

La morfologia delle cellule ? stata analizzata tramite l?acquisizione di immagini delle cellule per 8 giorni a partire dalla semina. Le cellule sono state seminate il giorno 1 e dal giorno 2 sono state effettuate le acquisizioni con un microscopio a luce trasmessa (si veda di seguito); dopo un recupero di almeno 2 ore, le cellule sono state irraggiate per la prima volta. La stessa procedura ? stata effettuata il terzo giorno. Le registrazioni elettrofisiologiche sono state condotte nei giorni 7 e 8.

Le immagini trasmesse sono state acquisite con il microscopio Leica SP5 (Leica Microsystems, Wetzlar, D) con un obiettivo ad aria (20X HCX PL Fluoter, Leica Microsystems, Wetzlar, D). Per quanto riguarda le immagini, per ciascun campione ? stata acquisita una griglia di sei colonne in modo da coprire l?intera area irraggiata dove lo strato era presente, o un?area equivalente nel controllo. In questo modo sono state acquisite immagini della stessa area nel corso degli 8 giorni, consentendo un?analisi statistica comparativa tra esperimenti differenti. Le immagini sono state processate dal software ImageJ (Version 2.0.0, Opensource code). Dopo aver tracciato manualmente i neuriti ? stata utilizzata una macro in grado di sottrarre le immagini tracciate da quelle originali. Le nuove immagini, contenenti solo i neuriti tracciati, sono state convertite in forma binaria e ridotte a una struttura essenziale. Le caratteristiche

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dei neuriti tracciati sono quindi state estratte in un file di testo e analizzate con il software Origin 9 (OriginPro, Version 2019, OriginLab Corporation, Northampton, MA, USA).

6. Analisi elettrofisiologica

La caratterizzazione funzionale delle propriet? elettrofisiologiche delle cellule F-11 ? stata effettuata utilizzando la tecnica del patch-clamp in configurazione whole-cell. Prima delle registrazioni, il terreno di coltura ? stato sostituito con una soluzione extracellulare standard contenente (mM): NaCl 135, KCl 2, CaCl2 2, MgCl2 2, hepes 10, glucosio 5, pH 7.4. La soluzione standard interna alla pipetta conteneva (mM): potassio aspartato 130, NaCl 10, MgCl2 2, CaCl2 1.3, EGTA 10, hepes 10, pH 7.3. Le registrazioni sono state effettuate con il software pClamp8.2 (Axon Instruments; Molecular Devices, LLC., San Jose, CA, USA). Il potenziale di membrana a riposo e i potenziali d?azione sono stati analizzati nella modalit? current-clamp. Durante le registrazioni in modalit? voltage-clamp, l?errore dato dalla resistenza ? stato compensato fino al 50%. Le correnti di sodio (INa) e di potassio (Ik) sono state registrate applicando un protocollo di voltaggio standard che, partendo da un potenziale di -60 mV, condizionava le cellule a -90 mV per 500 ms, e successivamente imponeva alla membrana potenziali compresi tra -80 e 40 mV, con incrementi di 10 mV. Per questa caratterizzazione, sono state considerate sia cellule dalla forma rotonda, sia cellule che mostravano prolungamenti simili a neuriti.

7. Saggio dell?enzima lattato deidrogenasi (LDH)

Per verificare l?eventuale presenza di stress cellulare generato

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dalla stimolazione termica, la vitalit? cellulare ? stata misurata tramite il saggio dell?enzima lattato deidrogenasi (LDH), sia nelle cellule stimolate che nella coltura di controllo. L?enzima ubiquitario LDH ? normalmente localizzato nel citosol e viene rilasciato nel terreno di coltura dalle cellule danneggiate.

I campioni utilizzati per l?analisi sono stati mantenuti a -20?C fino al momento del loro utilizzo. Seguendo il protocollo, sono stati scongelati in ghiaccio, centrifugati a 1000 rpm per 4 minuti e il surnatante ? stato prelevato per il saggio. ? stato preparato 1 ml (volume totale) di soluzione contenente (?l): tampone K-fosfato 850, NADH 20 e campione stimolato o controllo 70. La reazione partiva con l?aggiunta di 60 ?l di piruvato. E? stata osservata la diminuzione dell?assorbanza nel tempo, ed il rapporto di attivit? LDH (U/ml) nel terreno di coltura ? stato calcolato utilizzando la formula standard.

8. Analisi Statistica

Per l?analisi statistica dei dati sono stati utilizzati i software Origin 9 (OriginPro, Version 2019, OriginLab corporation, Northampton, MA, USA) ed Excel (Microsoft, Redmond, WA, USA). I dati sono stati presentati come media ? errore standard (SE). I confronti tra le medie sono stati ottenuti tramite il test parametrico One-Way ANOVA o il test non parametrico Mann-Whitney. Le percentuali di cellule con attivit? elettrica spontanea sono state confrontate utilizzando il test Chi-Quadro (?<2>). La significativit? ? stata determinata per valori di p?0.05.

9. RISULTATI DELL?IRRAGGIAMENTO NEL VICINO INFRAROSSO (NIR)

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9.1 Effetti dell?irraggiamento sulla morfologia La combinazione di 41,5?C di temperatura e 30 minuti di esposizione ? stata testata per indurre una stimolazione selettiva e localizzata tramite irraggiamento laser NIR dello strato polimerico a base di Blu di Prussia, applicato sulla parte centrale delle piastre Petri contenenti le nanoparticelle, prodotte come descritto in precedenza.

Durante la procedura di irraggiamento, le piastre Petri sono state mantenute in un box a 37?C. La temperatura di 41,5?C ? stata raggiunta solo in corrispondenza del dischetto di Blu di Prussia attraverso l?uso del fascio laser. Campioni mantenuti a 37?C sono stati usati come controllo. La caratterizzazione morfologica ha mostrato che i campioni stimolati avevano una tipica morfologia neuronale e che erano in grado di formare diverse piccole reti all?interno della piastra Petri, come mostrato in Figura 1.

Le cellule irraggiate hanno mostrato neuriti pi? lunghi rispetto al controllo, soprattutto nei giorni 7 e 8 (Figura 2). Questo ? coerente con l?ipotesi che questo metodo di stimolazione termica possa indurre un differenziamento neuronale.

Un esperimento di controllo, dove le cellule sono state sottoposte allo stesso protocollo di irraggiamento ma senza il supporto delle PBNP, ? stato condotto per verificare se l?uso del solo laser NIR potesse indurre differenziamento. Le cellule cresciute su supporti senza PBNP e irraggiate hanno mostrato un comportamento simile al controllo nel corso di tutta la durata dell?esperimento, con una la lunghezza dei neuriti inferiore rispetto ai campioni irraggiati contenenti le PBNP,

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suggerendo che l?uso del singolo laser NIR non induce un differenziamento significativo nelle cellule F-11 (Figura 3).

Questo esperimento ha mostrato che, per ottenere questo risultato, non ? sufficiente proiettare la radiazione infrarossa sulle cellule, ma ? necessario utilizzare delle nanoparticelle fototermiche incorporate in modo tale che, tramite un irraggiamento nel vicino infrarosso (qui a una lunghezza d?onda di 0.72 ?m, ma pi? in generale tra 0.4 ?m e 1.2 ?m), possa essere possibile riscaldare il supporto alla temperatura desiderata. La mediazione data dalle nanoparticelle nell?indurre l?effetto termico consente di localizzare il calore in corrispondenza delle cellule che devono essere stimolate.

9.2 Analisi elettrofisiologica delle colture cellulari di F-11 irraggiate

L?analisi elettrofisiologica ? stata effettuata sulle cellule sottoposte ad irraggiamento per verificare l?eventuale sviluppo di propriet? elettriche tipiche dei neuroni maturi. I parametri elettrofisiologici analizzati sono stati l?attivit? elettrica, le densit? delle correnti di sodio e di potassio e il potenziale di membrana a riposo. Come mostrato nella Figura 4, tutti i parametri analizzati si sono modificati significativamente nei campioni irraggiati, compresa la densit? della corrente di sodio.

I campioni irraggiati hanno mostrato una percentuale di cellule con attivit? spontanea significativamente maggiore rispetto alle cellule mantenute a 37?C (p<0,001, Test del Chi-Quadro). Questi risultati indicano che questo metodo pu? indurre il differenziamento della linea

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cellulare F-11.

9.3 Saggio LDH

Il saggio dell?enzima lattato deidrogenasi (LDH) ? stato effettuato sia sui campioni irraggiati che sul controllo nei giorni 7 e 8, per verificare un?eventuale presenza di stress cellulare insorto con questo metodo. I risultati hanno mostrato che i livelli di LDH nel terreno di coltura dei campioni stimolati non erano significativamente differenti rispetto al controllo, indicando che questo trattamento non danneggia la vitalit? cellulare (per il giorno 7: p=0,10, Test One-Way ANOVA, n=4; per il giorno 8: p=0,058, Test One-Way ANOVA, n=4).

9.4 Limiti della temperatura di irraggiamento

Per verificare la massima temperatura tollerata dalle cellule, i campioni sono stati irraggiati a una temperatura di 43?C. I risultati hanno mostrato una lunghezza media dei neuriti nei campioni stimolati a 43?C inferiore rispetto al controllo. Inoltre, anche se il numero di cellule seminate al giorno 1 era il medesimo in ogni piastra Petri (5x10<4>), nei campioni trattati a 43?C il numero di cellule adese al centro del dischetto con PBNP irraggiato diminuiva a partire dal quarto giorno, suggerendo che questa temperatura potrebbe causare un eccessivo stress cellulare (Figura 5).

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Claims

RIVENDICAZIONI

1. Supporto per campioni biologici, otticamente trasparente e strutturalmente rigido, che include, stratificate su oppure incorporate all?interno, nanoparticelle con effetto fototermico, che pu? essere indotto da irraggiamento con lunghezze d?onda comprese tra 0.4 ?m e 1.2 ?m.

2. Supporto come da rivendicazione 1, nel quale le nanoparticelle sono presenti soltanto in corrispondenza di porzioni selezionate del supporto destinate a venire a contatto con il campione biologico.

3. Supporto come da rivendicazione 2, nel quale le nanoparticelle sono presenti in dette porzioni a concentrazioni comprese tra 0.1 e 20.0 nanoparticelle/?m<3>.

4. Supporto come da rivendicazioni 1-3, nel quale le nanoparticelle stratificate sono parte di un materiale polimerico stratificato superficialmente su detto supporto.

5. Supporto come da rivendicazione 4, nel quale lo strato polimerico ? costituito da un materiale selezionato tra polimeri polivinilici, polisaccaridi, polilattidi, poliglicolidi, poliacrilati, polimetacrilati, policianoacrilati, polioleolefine, poliuretani, poliammidi, poliimmidi, polieteri, poliesteri, poliacetati, policarbonati, gomme, polisilossani, loro derivati reticolati e loro miscele.

6. Supporto come da rivendicazione 5, nel quale lo strato polimerico ? costituito da alcool polivinilico, polivinilpirrolidone e/o chitosano, eventualmente reticolati.

7. Supporto come da rivendicazioni 1-6, nel quale le

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nanoparticelle hanno dimensione compresa tra 5 e 100 nm.

8. Supporto come da rivendicazioni 1-7, nel quale le nanoparticelle sono selezionate tra nanostelle d?oro, nanostelle d?oro peghilate e/o nanoparticelle di Blu di Prussia, eventualmente ricoperte di PVP.

9. Supporto come da rivendicazioni 1-8, come piastra di Petri, provetta, vetrino (ad es. per microscopio), fiasca, vaso di reazione, sotto forma di microcapillare e camere microfluidiche.

10. Supporto come da rivendicazioni 1-9, sul quale il materiale deposto ? una coltura cellulare.

11. Incubatore per campioni biologici comprendente al suo interno uno o pi? supporti, come descritto nelle rivendicazioni 1-10.

12. Metodo per la preparazione di un supporto come da rivendicazioni 1-10, comprendente lo stratificare su o l?incorporare in adatto precursore del supporto, nanoparticelle con effetto fototermico, che pu? essere indotto mediante irraggiamento con lunghezze d?onda comprese tra 0.4 ?m e 1.2 ?m.

13. Metodo come da rivendicazione 12, nel quale i motivi di nanoparticelle all?interno del supporto sono ottenuti mediante stampa, preferibilmente tampografia con timbri in silicone.

14. Metodo di utilizzo di un supporto come da rivendicazioni 1-10, comprendente: (i) il posizionare un campione biologico a contatto con detto supporto e (ii) irraggiare detto supporto con lunghezze d?onda comprese tra 0.4 ?m e 1.2 ?m.

15. Metodo come da rivendicazione 14, in cui il campione

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biologico ? una coltura cellulare.