WO2018131661A1 - 細胞培養基材、培養容器、細胞培養容器の製造方法、細胞の取得方法、細胞の培養方法 - Google Patents

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cell
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武志 川野
千恵 児島
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    • C12N2539/00—Supports and/or coatings for cell culture characterised by properties
    • C12N2539/10—Coating allowing for selective detachment of cells, e.g. thermoreactive coating

Definitions

  • the present invention relates to a cell culture substrate, a culture container, a method for producing a cell culture container, a cell acquisition method, and a cell culture method.
  • the cell culture substrate has a first layer comprising a first gel in which gold fine particles are dispersed, and the gold fine particles are not present or have a concentration lower than that of the first layer.
  • a second layer comprising a second gel present in
  • the method for producing a cell culture container includes a step of forming a first gel layer in the container, and a second method in which gold fine particles are dispersed on the first gel layer.
  • the method for obtaining a cell comprises selecting a cell to be obtained from cells cultured on the cell culture substrate of the first aspect, and the first of the cell culture substrate. Irradiating the layer with light and collecting the cells to be obtained.
  • cultivation method culture cultivates the cell acquired by the cell acquisition method of the 2nd aspect.
  • FIG. 1 (a) is sectional drawing
  • FIG.1 (b) is a top view.
  • FIG. 4A is a cross-sectional view of a conventional cell culture substrate
  • FIG. 4B is a conceptual diagram in which a portion surrounded by a dotted line in FIG. 4A is enlarged and compared.
  • FIG. 5A is a cross-sectional view of a cell culture substrate according to an embodiment
  • FIG. 5B is a conceptual diagram in which a portion surrounded by a dotted line in FIG. 5A is enlarged and compared. . It is a flowchart which shows the flow of the manufacturing method of the cell culture substratum of one Embodiment. It is a flowchart which shows the flow of the acquisition method of the cell using the cell culture substratum of one Embodiment. It is a conceptual diagram which shows the structure of the cell acquisition system containing the cell culture substratum of one Embodiment. It is a flowchart which shows the flow of the acquisition method of the cell using the cell culture substratum of one Embodiment.
  • the cell culture substrate is in an equilibrium state in which the interface with the wall surface has a meniscus structure due to the difference in surface energy from the wall surface of the culture vessel, and the wall surface of the culture vessel is wetted. Therefore, the thickness of the cell culture substrate is a non-uniform structure that is thin at the center and thick at the periphery.
  • the cell culture substrate of the present embodiment includes a plurality of gel layers, so that the thickness of the first layer 10 described later is substantially uniform in the plane of the culture vessel, and the temperature conditions and the like are appropriately adjusted. Realize what to do.
  • FIG. 1 is a conceptual diagram showing the structure of a culture vessel 100 provided with the cell culture substrate 1 of the present embodiment.
  • FIG. 1 (a) is a cross-sectional view taken along the central axis of the cell mounting surface 11.
  • 1 (b) is a top view.
  • the culture vessel 100 includes a cell culture substrate 1, a side wall 31, an opening 32, and a bottom 33.
  • the cell culture substrate 1 includes a first layer 10 and a second layer 20. Both the first layer 10 and the second layer 20 are mainly made of gel.
  • the first layer 10 includes a first gel 14 in which gold fine particles 13 are dispersed.
  • the second layer 20 includes a second gel 24 in which the gold fine particles 13 are not present or are present at a concentration lower than the concentration of the gold fine particles 13 of the first gel 14.
  • the gold fine particles 13 are schematically shown by enlarging the microvolume element 19 inside the first layer 10.
  • the culture vessel 100 and the cell culture substrate 1 are substantially cylindrical and are part of what constitutes a so-called well plate, but these shapes are not particularly limited.
  • the gold fine particle 13 is preferably a particle having a high photothermal conversion characteristic, and particularly a size causing surface plasmon resonance absorption (SPR).
  • the volume average diameter of the gold fine particles 13 measured using a laser diffraction particle size distribution analyzer is preferably 1 nm or more and less than 200 nm, more preferably 10 nm or more and less than 100 nm, and even more preferably 30 nm or more and less than 70 nm.
  • the concentration of the gold fine particles 13 in the first gel 14 is preferably 100 ⁇ M or more and less than 1000 ⁇ M, and more preferably 250 ⁇ M or more and 500 ⁇ M or less.
  • the concentration of the gold fine particles 13 is low, the calorific value of the gold fine particles 13 becomes small, so that the cell scaffold is not easily collapsed, and the probability of successful cell detachment decreases.
  • the concentration of the gold fine particles 13 is high, the local temperature rise increases, so that the temperature control becomes difficult and the cytotoxicity becomes high.
  • the gold fine particles 13 may be further stabilized in the gel using a protective agent, such as encapsulated in a dendrimer or modified with a molecule having affinity for the gel.
  • the first layer 10 includes a mounting surface 11 on which cells to be cultured are mounted, and a lower surface 12 in contact with the upper surface 21 of the second layer 20.
  • the second layer 20 is formed in contact with the bottom surface 22 of the opening 32 of the culture vessel 100.
  • the Z-axis is taken in the direction perpendicular to the mounting surface 11, the X-axis and the Y-axis perpendicular to the X-axis are perpendicular to the Z-axis. I will take it.
  • the Z-axis direction is mentioned.
  • the cell culture substratum 1 of this embodiment was comprised including the two layers of the 1st gel 14 and the 2nd gel 24, you may comprise it including more layers.
  • the first gel 14 is denatured when it rises from room temperature to a predetermined temperature.
  • “denaturation” means that the first gel 14 undergoes a structural change that causes easy detachment of cells due to an increase in temperature.
  • the denaturation includes, for example, solification, aggregation, and low molecular weight, which are states brought about by changes in the secondary or tertiary structure of the collagen protein.
  • the temperature at which the first gel 14 is denatured is preferably 60 ° C. or lower, more preferably 50 ° C. or lower, and further preferably 40 ° C. or lower.
  • the material of the first gel 14 is not particularly limited as long as it enables cells to be obtained by peeling described later, but is preferably a material that can be used by mixing with other polymers. More preferred.
  • the second gel 24 is not particularly limited, but is preferably the same dispersoid as the first gel 14.
  • the bottom 33 of the culture vessel 100 may be light transmissive.
  • the culture vessel 100 can be configured in any shape as long as the technical features of the culture vessel 100 of the present embodiment are not impaired.
  • the cell acquisition system 1000 described later is configured so that the first layer 10 is irradiated with laser light from the mounting surface 11 side, the bottom 33 of the culture vessel 100 and the second gel 24 are light transmissive. You don't have to.
  • FIG. 2 is a conceptual diagram showing a cell acquisition system 1000 that acquires cells using the cell culture substrate 1.
  • the cell acquisition system 1000 includes a culture container 100 and an inverted microscope 70.
  • the cells 50 are cultured in the buffer 51 on the mounting surface 11 of the first layer 10.
  • a cell to be isolated and acquired is designated as a selected cell 500, and other cells are designated as non-selected cells 501.
  • the mode of the selected cell 500 is not particularly limited. For example, cells that have been appropriately modified in the gene or the like and have been characterized by a discriminating means such as a reporter gene, or that are structurally discriminated by initialization or appropriate differentiation being induced. Cells having possible characteristics are preferred.
  • the selected cell 500 may be a single cell 50 as described above, or may be a colony including a plurality of cells 50 or a plurality of cells 50.
  • the inverted microscope 70 includes an irradiation unit 71, a dichroic mirror 72, a lens system 73, an observation unit 74, and a support base 75. It should be noted that the cell acquisition system 1000 may be constructed using an upright microscope if there is no problem with the adverse effects of direct irradiation light on the cells 50.
  • the irradiation unit 71 emits laser light.
  • the wavelength of the laser light emitted from the irradiation unit 71 is preferably set in a wavelength range where the gold fine particles 13 exhibit photothermal conversion characteristics, and particularly in a wavelength range where surface plasmon resonance absorption (SPR) occurs.
  • the laser beam applied to the first gel 14 only needs to have a wavelength and energy that do not cause significant damage when irradiated to cells.
  • the wavelength of the laser light emitted from the irradiation unit 71 is preferably 400 nm or more and less than 1200 nm, more preferably 450 nm or more and less than 900 nm, and is set to, for example, 532 nm.
  • the output of the laser light incident on the culture vessel 100 is preferably 0.1 mW or more and less than 1000 mW, and more preferably 0.4 mW or more and less than 100 mW.
  • the wavelength and energy of the laser light are appropriately adjusted so that the first gel 14 is efficiently heated and denatured without damaging the cells.
  • the light emitted from the irradiation unit 71 is incident on the dichroic mirror 72.
  • the light emitted from the irradiation unit 71 is not particularly limited to laser light, and may be light composed of non-coherent monochromatic light or light in a certain wavelength range.
  • the dichroic mirror 72 reflects the laser light from the irradiation unit 71 and transmits the visible light from the culture vessel 100 to be emitted to the observation unit 74.
  • the direction of the laser beam reflected by the dichroic mirror 72 is adjusted so that the laser beam is irradiated to an appropriate position by a galvano mirror (not shown) or the like, passes through the lens system 73, and enters the culture vessel 100. .
  • the laser light incident on the culture vessel 100 passes through the bottom 33 of the culture vessel 100 and the second layer 20 and then converges at a predetermined position in the vicinity of the selected cell 500 in the first layer 10.
  • the converging laser beam 7 is schematically shown using a one-dot chain line. Note that the configuration of the irradiation optical system of the laser light 7 is not particularly limited as long as the laser light 7 can be converged to a desired position.
  • the convergent position of the laser beam 7 in the first layer 10 is preferably converged to a position as close as possible below the selected cell 500 without damaging the selected cell 500.
  • the spot diameter of the laser beam 7, PSF It is determined based on parameters based on (Point Spread Function) and PSF.
  • the convergence position of the laser beam 7 in the first layer 10 may be located immediately below the selected cell 500 and in a range where the depth is less than 100 ⁇ m, or in a range where the radius from the cell body of the selected cell 500 is less than 100 ⁇ m. preferable. If there is no problem in cytotoxicity, the selected cell 500 may be set as the convergence position.
  • the gold fine particles 13 photothermally convert the laser beam 7 from the irradiation unit 71 and the gel near the convergence position of the laser beam 7 is denatured, the physical or chemical environment of the gel serving as a scaffold for the selected cell 500 or the surrounding environment. Since the target characteristic is changed, the force for attaching the selected cell 500 to the mounting surface 11 is weakened. Accordingly, only the selected cells 500 can be taken out by aspiration using the pipette 60. In addition, it does not specifically limit regarding the method of acquiring a cell physically, In addition to the pipette 60, the buffer solution 51 on the mounting surface 11 can be perfused and taken out.
  • the observation unit 74 includes an eyepiece and the like, and allows a user to observe visible light from the culture vessel 100 illuminated by illumination (not shown).
  • the user can appropriately align the culture container 100 by, for example, moving the support base 75 while viewing the visible light from the culture container 100.
  • the support base 75 supports the culture vessel 100.
  • the support base 75 can be moved in each direction of XYZ by a moving mechanism (not shown), and thereby the culture vessel 100 can be adjusted to an arbitrary position.
  • the support base 75 includes, for example, glass on which a transparent heating element is formed, and transmits the laser light 7 to the bottom 33 of the culture vessel 100 and controls the temperature of the entire culture vessel 100. Note that, depending on the size, structure, and the like of the culture vessel 100, a support base 75 in which an opening is formed in a portion that becomes an optical path of the laser light 7 can also be used.
  • the cell culture substrate 1 of the present embodiment includes a plurality of gel layers, so that the thickness of the first layer 10 that is a heat generation layer is substantially uniform in a plane. Thereby, the adjustment of the irradiation condition of the laser beam 7 is facilitated, and the cells can be easily isolated even when the irradiation site is changed.
  • FIG. 3 shows a cross-sectional view of the XZ plane passing through the central axis of the culture vessel 100.
  • the thickness H2 of the second layer 20 is preferably 0.8 mm or more, more preferably 0.8 mm or more and 1.7 mm or less, and 0.8 mm or more. More preferably, it is 1.2 mm or less. If the thickness H2 of the second layer 20 is too thin, it is difficult to make the first layer 10 and / or the second layer 20 uniform or flat. On the other hand, if the thickness H2 of the second layer 20 is too thick, the light reaching the first gel 14 of the first layer 10 is attenuated and the amount of heat generated by the gold fine particles 13 in the vicinity of the cell 50 is reduced.
  • the thickness H1 of the first layer 10 and the thickness H2 of the second layer 20 are the thicknesses in the central region of the cell culture substrate 1, for example, the thickness along the central axis.
  • the second layer only needs to be configured so that the first layer has a meniscus structure and does not cause unevenness in the thickness of the central portion and the peripheral portion.
  • a layer may be provided. In that case, it is preferable that the whole thickness of the plurality of layers is 0.8 mm or more.
  • the gel material of the first layer 10 and the second layer 20 is a gel material whose surface tension (mN / m) approximates. It is preferable that the gel materials of the first layer 10 and the second layer 20 are the same.
  • the ratio of the thickness H1 of the first layer 10 to the thickness H2 of the second layer 20 (hereinafter referred to as the thickness ratio H1 / H2) is preferably 0.5 or more, more preferably 1.0 or more. 0.0 or more is more preferable. Further, this value (thickness ratio H1 / H2) is preferably 5 or less, more preferably 4 or less, and even more preferably 3 or less. If the thickness ratio H1 / H2 is too small, the first layer 10 will be too thin to make the first gel 14 uniform or flat, or the second layer 20 will be too thick as described above.
  • the thickness H1 of the center portion of the first gel 14 and the thickness Hm of the first gel 14 near the side wall are equal in FIG. Or a close value.
  • FIG. 4 is a conceptual diagram for explaining the influence of the thickness (H1) of the central portion of the heat generating layer and the thickness Hm in the vicinity of the side wall of the heat generating layer on the amount of heat generation using a conventional cell culture substrate ( FIG. FIG. 4A is an example of a conventional culture vessel 101, and the cell culture substrate is composed of only one layer of gel 140. Due to the meniscus shape, the gel 140 has a different thickness H1 at the center and a thickness Hm near the side wall.
  • FIG. 4B is an enlarged view comparing the regions V1 and Vm surrounded by the broken line in FIG.
  • the irradiation region 700a region shaded with V1 by the laser beam 7 and the irradiation region in the vicinity of the side wall.
  • the volume is different from 700b (the region hatched with Vm). Accordingly, the amount of heat generated by the laser beam 7 differs between the center of the gel 140 and the vicinity of the side wall.
  • the temperature increase control for peeling the cells 50 is not limited to the intensity of the laser. It will depend on the thickness. Therefore, in the gel 140 having a non-uniform thickness, it takes time to control the temperature rise, and this limits the portion where the cells 50 can be efficiently acquired on the mounting surface 11.
  • FIG. 5 shows the effect of the thickness H1 of the central portion of the first gel 14 and the thickness Hm of the first gel 14 on the side wall of the first embodiment on the calorific value using the culture vessel 100 according to the present embodiment. It is a conceptual diagram (sectional drawing) for demonstrating. 5A, in the central portion of the first gel 14, the region V1 including a part of the bottom surface 12 of the first gel 14 and a part of the mounting surface 11, and the vicinity of the side wall of the first gel 14, A region Vm including a part of the bottom surface 12 of 1 gel 14 and a part of the mounting surface 11 is surrounded by a broken line.
  • FIG. 5 (b) is an enlarged view comparing the regions V1 and Vm surrounded by the broken line in FIG. 5 (a).
  • the thicknesses H1 and Hm are substantially equal between the central portion and the vicinity of the side wall, and the irradiation region 701a (region marked with the oblique line of V1) by the laser beam 7 and the vicinity of the side wall.
  • the cells 50 can be efficiently obtained from a wider region of the mounting surface 11. For example, since the nonuniformity of the temperature rise due to the position of the cell 50 to be detached becomes small, it becomes easy or unnecessary to adjust the laser energy, irradiation time, etc. at each position.
  • the thickness ratio H1 / H2 is too large, the first layer 10 becomes too thick and light scattering by the gold fine particles 13 attenuates the light just below the cells, making it difficult to obtain cells, or the second The layer 20 becomes too thin, and it becomes difficult to form the uniform or flat second layer 20.
  • the gel thickness at the center of the cell culture substrate is thin due to the meniscus structure, so it is difficult to adjust the irradiation time and energy of the laser beam 7, and the heat from the gold fine particles is reduced. In extreme cases, accumulation of gold fine particles and gelation of the gel may occur.
  • the cell culture substrate 1 of the present embodiment includes the second layer 20, the thickness of the first layer 10 is substantially uniform, and temperature adjustment is easy.
  • the temperature of the center part of the 1st layer 10 can be adjusted by thermal diffusion etc., and problems, such as said blackening of a gel, can be prevented. In particular, problems such as the blackening of the gel described above occur when the inner diameter D (FIG.
  • the inner diameter D of the culture vessel 100 is less than 10 cm, it is preferable in that the effect of homogenizing the first layer 10 is more remarkably obtained. More preferably, it is less than 5 cm.
  • the inner diameter D is the longest diameter perpendicular to the central axis (see FIG. 3).
  • FIG. 6 is a flowchart showing a flow of a method for manufacturing the cell culture substrate 1 using the cell culture substrate 1 of the present embodiment.
  • step S1001 a layer of the second gel 24 made of collagen gel or the like is created in the culture vessel 100.
  • step S1001 ends, the process proceeds to step S1003.
  • step S1003 a solution containing gold fine particles 13 having a predetermined volume average diameter is prepared.
  • a reducing agent ascorbic acid, hydroquinone, citric acid or the like. It can be obtained by growing nuclei.
  • step S1003 ends, the process proceeds to step S1005.
  • the volume average diameter of the gold fine particles 13 can be measured using a laser diffraction particle size distribution measuring device. In the case of simple measurement without using a particle size distribution measuring device, it can be calculated by imaging using a transmission electron microscope and measuring using analysis software or the like.
  • step S1005 a layer of the first gel 14 in which the gold fine particles 13 are dispersed is formed on the layer of the second gel 24 of the culture vessel 100.
  • a mixed solution containing collagen and gold fine particles 13 is prepared using the solution containing gold fine particles 13 prepared in step S1003, and added to the second gel of the culture vessel and allowed to stand. When the mixed solution is hardened, the gold fine particles 13 are dispersed and embedded in the collagen gel.
  • step S1005 ends, the process ends.
  • FIG. 7 is a flowchart showing the flow of the cell acquisition method and production method using the cell culture substrate 1 of the present embodiment.
  • step S2001 cells are cultured on the surface of the cell culture substrate 1, that is, on the mounting surface 11.
  • step S2003 the inside of the culture vessel 100, particularly the mounting surface 11, is washed. Washing is performed using PBS or the like to remove unnecessary suspended matters and deposits.
  • step S2005 the cell 50 (selected cell 500) to be acquired is selected from the cells 50 cultured on the mounting surface 11. If necessary, a cell 50 in which a fluorescent protein is expressed or a cell 50 having structural characteristics is selected.
  • step S2005 ends, the process proceeds to step S2007.
  • step S2007 the temperature of the support base 75 is appropriately adjusted, and the culture vessel 100 is heated to a temperature lower than the temperature at which the entire denaturation of the first gel 14 occurs. By raising the temperature of the culture vessel 100 before the irradiation with the laser beam 7, the irradiation time of the laser beam 7 can be shortened, and the cytotoxicity to the selected cells 500 can be reduced.
  • step S2009 the laser beam 7 is irradiated from the second layer 20 side toward the convergence position of the first layer 10 near the selected cell 500.
  • the laser beam 7 is in contact with the gold fine particles 13 before reaching the vicinity of the selected cell 500. It is possible to prevent the interaction from being attenuated. If the bond between the selected cell 500 and the mounting surface 11 is weakened, the process proceeds to step S2011.
  • step S2011 the selected cell 500 is aspirated and acquired using the pipette 60, and cultured again as appropriate.
  • the acquired selected cells 500 can be cultured by being placed in another medium or the like.
  • step S2011 ends the process ends.
  • the selected cell 500 is acquired in step S2011 you may return to step S2005 and acquire another cell 50 as the selected cell 500.
  • the obtained selected cells may be used as they are for various uses such as clinical, research, and industrial purposes.
  • the cell culture substrate 1 of the present embodiment includes the first layer 10 including the first gel 14 in which the gold fine particles 13 are dispersed, and the gold fine particles 13 are not present, or the first layer 10 or the first layer 10 is provided.
  • a second layer 20 comprising a second gel 14 present at a lower concentration than the one gel 14.
  • the first layer 10 includes a mounting surface 11 on which cells 50 to be cultured are mounted and a surface 12 in contact with the second layer 20. Thereby, heat can be directly diffused and conducted from the first layer 10 to the second layer 20, and the blackening of the gel can be prevented.
  • the first gel 14 is denatured at 60 ° C. or less by heating. Thereby, local modification
  • the first gel 14 is a gelatin gel or a collagen gel. Thereby, manufacture, handling, etc. become easy.
  • the gel material of the second gel 24 is the same as the gel material of the first gel 14.
  • the thickness of the first layer 10 is made more uniform, the manufacture of the cell culture substrate 1 is facilitated, and the refraction and loss of laser light at the interface between the first gel 14 and the second gel 24. Can be reduced.
  • the volume average diameter of the gold fine particles 13 is 2 nm or more and less than 200 nm, and the concentration of the gold fine particles 13 in the first layer 10 is 100 ⁇ m or more and less than 1000 ⁇ m.
  • the culture container 100 in this embodiment includes the cell culture substrate 1, the selected cells 500 can be efficiently removed from the cultured cells 50 in a state where the cytotoxicity to the cells 50 is low. it can.
  • the method for acquiring a cell includes selecting a selected cell 500 to be acquired from the cells 50 cultured on the cell culture substrate 1, and applying light to the first layer 10 of the cell culture substrate 1. And collecting the selected cells 500. Thereby, since the cells 50 can be efficiently peeled in a wider region of the mounting surface 11 of the first layer 10, more cells 50 cultured on the mounting surface 11 can be acquired more efficiently. .
  • the laser beam 7 passes through the second layer 20 and is irradiated to the first layer 10. Thereby, it is possible to obtain the selected cells 500 without irradiating the cells directly with the laser beam 7 and causing cell damage.
  • the gold fine particles 13 are not present in the second gel 24, or Since the concentration is lower than that of the first gel 14, the attenuation of the laser light 7 in the second gel 24 can be prevented.
  • the cell to be isolated and acquired is acquired as the selected cell 500.
  • the non-selected cell 501 is detached by irradiating the vicinity of the non-selected cell 501 other than the selected cell 500 with the laser beam 7.
  • the selected cells 500 may be left behind.
  • FIG. 8 is a conceptual diagram showing a cell acquisition system 1000 in the cell acquisition method according to this modification.
  • the cell acquisition system 1000 has the same configuration as that of the above-described embodiment, except that the laser light 7 is irradiated in the vicinity of the non-selected cells 501.
  • FIG. 9 is a flowchart showing the flow of the cell acquisition method and production method using the cell culture substrate 1 of the present modification.
  • step S3001 cells are cultured on the surface of the cell culture substrate 1, that is, on the mounting surface 11.
  • step S3001 ends, the process proceeds to step S3003.
  • step S3003 the inside of the culture vessel 100, particularly the mounting surface 11, is washed. Washing is performed using PBS or the like to remove unnecessary suspended matters and deposits.
  • step S3005 the cell 50 to be acquired is selected from the cells 50 cultured on the mounting surface 11. If necessary, a cell 50 in which a fluorescent protein is expressed or a cell 50 having structural characteristics is selected.
  • step S3005 ends, the process proceeds to step S3007.
  • step S3007 the temperature of the support base 75 is adjusted as appropriate, and the culture vessel 100 is heated to a temperature lower than the temperature at which the entire denaturation of the first gel 14 occurs.
  • step S3009 the laser beam 7 is irradiated toward the convergence position of the first layer 10 in the vicinity of the non-selected cells 501.
  • step S3011 non-selected cells 501 are aspirated and acquired using the pipette 60.
  • the selected cell 500 is acquired or cultured.
  • the selected cell 500 may be irradiated with the laser beam 7 on the first gel 14 in the vicinity and peeled off by the pipette 60 in the same manner as the non-selected cell 501, or the mounting surface 11 has an influence on the selected cell 500 such as PBS.
  • a small liquid may be introduced and suspended in the liquid.
  • the culture of the selected cell 500 may be started.
  • the present invention is not limited to the contents of the above embodiment.
  • Other embodiments conceivable within the scope of the technical idea of the present invention are also included in the scope of the present invention.
  • the cells of the present embodiment were obtained using Hela cells as a single cell model, MDCK cells as a model of cells that form colonies, and SH-SY5Y cells as a model of single neurons. Further, a two-layer gel in which the sum of the thickness H1 of the first layer 10 and the thickness H2 of the second layer 20 is equal and the thickness ratios H1 / H2 are different is prepared and cultured on the two-layer gel. The probability of success when trying to obtain a cell located in the center of the culture surface (mounting surface 11) of the two-layer gel among Hela cells was examined.
  • PBS (-) NaCl (4.003 g), KCl (0.1003 g), KH 2 PO 4 (0.1006 g), NaH 2 PO 4 (0.575 g) were dissolved in ion-exchanged water (500 mL), and then sterilized by autoclave.
  • PBS (-) was prepared. 10-fold inorganic salt medium to ion-exchanged water (10 mL) CaCl 2 anhydrous (20.2 mg), MgCl ⁇ 6H 2 O (23.5 mg), KCl (40.4 mg), NaCl (639.7 mg), NaH 2 PO 4 ⁇ 2H 2 O-10 times mineral salts medium was added and dissolved to prepare (14.1 mg) was prepared.
  • Concentrated gold nanoparticle (AuNP) solution 4 mL (2 mL ⁇ 2) of a growth solution of gold nanoparticles (see S. Yagi, et al, JElectrochem Soc, 159, H668 (2012))
  • the tube was placed in a tube and centrifuged at 25 ° C. and a rotation speed of 3000 rpm for 20 minutes.
  • the supernatant solution (1.8 mL ⁇ 2) was removed, ultrapure water (1.8 mL ⁇ 2) was added, and the mixture was centrifuged again under the same conditions.
  • a concentrated AuNP solution (Au 500 ⁇ M) was prepared by adding ultrapure water (0.2 mL ⁇ 2) to dilute the reducing agent concentration.
  • the volume average diameter of the gold nanoparticles was measured by imaging the adjusted gold nanoparticles using a transmission electron microscope (JEOL Ltd., JEM-2000F, acceleration voltage 200 kV), and analysis software (Kenith Corp., Photomeasure (registered trademark). )).
  • a gold nanoparticle-embedded collagen gel in which the ultrapure water (0.70 mL) was changed to a concentrated gold nanoparticle (AuNP) solution (0.70 mL) was prepared in the same manner. Thereafter, PBS ( ⁇ ) was added at 100 ⁇ L / well onto the gel at 37 ° C., and the gel was washed by incubation for 6 hours.
  • HeLa cells (6000 cells / well) dispersed in DMEM were seeded on the prepared gel and cultured for 24 hours, and then the medium was washed three times with PBS ( ⁇ ). Subsequently, PBS ( ⁇ ) was added onto 10 ⁇ L medium, and incubated under a microscope on a 37 ° C. thermoplate on which an aluminum sheet was placed for 3 minutes. Then, the spot diameter was set to a minimum and irradiated with light.
  • the cells are aspirated by using a 30 ⁇ m caliber manipulator using a three-dimensional joystick manual micromanipulator (Narishige, NT-88-V3MSH) and a pneumatic microinjector (Narishige, IM-11-2). It peeled.
  • a laser light source (manufactured by Sigma Kogyo Co., Ltd., wavelength 532 nm, output 50 mW) is incorporated via a PA (photoactivation) epifluorescence apparatus (Nikon Corporation, TI-PAU), and has a light transmittance of 532 nm.
  • PA photoactivation
  • a mirror unit (Nikon, TRITC) installed, cells were fluorescence / inverted using an inverted fluorescence microscope (Nikon, ECLIPSE Ti-U) and imaging sensor control software (WRAYMER, WraySpec). Phase difference observation and imaging were performed. Observation is performed using a 4 ⁇ 10 ⁇ objective lens (Plan-Fluor, manufactured by Nikon Corporation).
  • Table 1 shows the results showing the relationship between the thickness ratio H1 / H2 of the bilayer gel in Hela cells and the success probability of obtaining selected cells. If the total amount of the gel is the same, the thickness ratio H1 / H2 is large, that is, the thickness of the collagen gel in which the gold nanoparticles are embedded is larger than the thickness of the collagen gel in which the operation for embedding the gold nanoparticles is not performed. The larger the value, the higher the probability of obtaining a selected cell.

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Abstract

細胞培養基材は、金微粒子が分散された第１ゲルを備える第１の層と、金微粒子が存在しないか、または第１の層より低い濃度で存在する第２ゲルを備える第２の層と、を備える。

Description

細胞培養基材、培養容器、細胞培養容器の製造方法、細胞の取得方法、細胞の培養方法
　本発明は、細胞培養基材、培養容器、細胞培養容器の製造方法、細胞の取得方法、および細胞の培養方法に関する。
　培養基材で培養された細胞をより効率的に回収するため、例えば、感温性高分子を含む培養基材の上で細胞を培養し、温度変化を利用して細胞の回収を行う方法が提案されている（特許文献１参照）。
日本国特開平１１－３４９６４３号
　本発明の第１の態様によると、細胞培養基材は、金微粒子が分散された第１ゲルを備える第１の層と、前記金微粒子が存在しないか、または前記第１の層より低い濃度で存在する第２ゲルを備える第２の層と、を備える。
　本発明の第２の態様によると、細胞培養容器の製造方法は、第１のゲル層を容器内に形成する工程と、前記第１のゲル層の上に、金微粒子が分散された第２のゲル層を形成する工程と、を含む細胞培養容器の製造方法であって、前記第１のゲル層は、金微粒子を含まないか、または前記第２のゲル層より低い濃度で金微粒子を含む。
　本発明の第３の態様によると、細胞の取得方法は、第１の態様の細胞培養基材で培養された細胞から、取得する細胞を選択することと、前記細胞培養基材の前記第１の層に光を照射することと、前記取得する細胞を回収することと、を備える。
　本発明の第４の態様によると、細胞の培養方法は、第２の態様の細胞の取得方法により取得した細胞を培養する。
一実施形態の細胞培養基材の構成を示す概念図であり、図１（ａ）が断面図、図１（ｂ）が上面図である。 一実施形態の細胞培養基材を含む細胞取得システムの構成を示す概念図である。 一実施形態の細胞培養基材の構成を示す概念図である。 図４（ａ）は、従来の細胞培養基材の断面図であり、図４（ｂ）は、図４（ａ）の点線で囲まれた部分を拡大して比較する概念図である。 図５（ａ）は、一実施形態の細胞培養基材の断面図であり、図５（ｂ）は、図５（ａ）の点線で囲まれた部分を拡大して比較する概念図である。 一実施形態の細胞培養基材の製造方法の流れを示すフローチャートである。 一実施形態の細胞培養基材を用いた細胞の取得方法の流れを示すフローチャートである。 一実施形態の細胞培養基材を含む細胞取得システムの構成を示す概念図である。 一実施形態の細胞培養基材を用いた細胞の取得方法の流れを示すフローチャートである。
（第１の実施形態）
　以下では、適宜図面を参照しながら、一実施形態の細胞培養基材、培養容器、および細胞の取得方法等について説明する。
　細胞培養基材の上で培養した細胞のうち、遺伝子導入に成功した細胞等、特定の細胞を効率的に単離することがしばしば必要になる。この際、外部からの光により、細胞培養基材に局所的な温度変化を加えて一部の細胞の単離を促進する場合、照射部分および周辺の温度の調整が重要である。
　通常、細胞培養基材は、培養容器の壁面との表面エネルギーの差によって、壁面との界面がメニスカス構造となり、培養容器の壁面を濡れ上がる形で平衡状態になる。そのため、細胞培養基材の厚さは、中心部において薄く、周辺部において厚い不均一な構造となる。この厚さの不均一は、培養容器の直径が小さく培養基材の量が少ないほど、相対的に大きくなる。
　培養容器内で細胞培養基材から細胞の単離を行う際に、この不均一な構造（細胞培養基材の厚さの不均一）が存在すると、光ビーム照射による細胞培養基材の温度変化の制御が困難となり、個々の細胞の単離が困難となることを本発明者らは見出した。
　本実施形態の細胞培養基材は、複数のゲルの層を備えることにより、後述する第１の層１０の厚さが、培養容器の面内で概ね均一となり、温度条件の調整等を適切に行うことを実現する。
　図１は、本実施形態の細胞培養基材１を備える培養容器１００の構造を示す概念図であり、図１（ａ）が細胞の搭載面１１の中心軸に沿った断面図であり、図１（ｂ）が上面図である。培養容器１００は、細胞培養基材１と、側壁３１と、開口部３２と、底部３３とを備える。細胞培養基材１は、第１の層１０と第２の層２０とを備える。第１の層１０と第２の層２０とは共にゲルを主材とする。第１の層１０は、金微粒子１３が分散された第１ゲル１４を備える。第２の層２０は、金微粒子１３が存在しないか、第１ゲル１４の金微粒子１３の濃度より低い濃度で分散されて存在する第２ゲル２４とを備える。金微粒子１３は、第１の層１０の内部の微小体積要素１９を拡大して模式的に示した。
　本実施形態では、培養容器１００および細胞培養基材１は略円筒形状で、いわゆるウェルプレートを構成するものの一部であるが、これらの形状は特に限定されない。
　金微粒子１３は、光熱変換特性の高い大きさの粒子であることが好ましく、特に、表面プラズモン共鳴吸収（ＳＰＲ）が起こる大きさが好ましい。レーザー回折式粒度分布測定装置を用いて測定された金微粒子１３の体積平均径は、１ｎｍ以上２００ｎｍ未満が好ましく、１０ｎｍ以上１００ｎｍ未満がより好ましく、３０ｎｍ以上７０ｎｍ未満がさらに好ましい。第１ゲル１４での金微粒子１３の濃度は１００μＭ以上１０００μＭ未満が好ましく、２５０μＭ以上５００μＭ以下がより好ましい。金微粒子１３の濃度が低いと、金微粒子１３の発熱量が小さくなるため、細胞の足場が崩れにくくなり、細胞の剥離成功確率が下がる。一方、金微粒子１３の濃度が高いと、局所での温度上昇が大きくなるため、温度制御が難しくなり、また細胞傷害性が高くなる。
　なお、金微粒子１３は、デンドリマーに内包させたり、ゲルに対して親和性を有する分子で修飾させたりする等、保護剤を用いてゲル中でより安定化するようにしてもよい。
　第１の層１０は、培養する細胞を搭載する搭載面１１と、第２の層２０の上面２１と接する下面１２と、を備える。第２の層２０は、培養容器１００の開口部３２の底面２２と接して形成されている。以下の実施形態では、特に断りの無い限り、図中に示したようにＺ軸を搭載面１１に垂直な方向にとり、Ｘ軸と、Ｘ軸に垂直なＹ軸とを、Ｚ軸に垂直にとることにする。また、以下の実施形態で「上下」「上下方向」と記載した場合、Ｚ軸方向について言及しているものとする。
　なお、本実施形態の細胞培養基材１は第１ゲル１４と第２ゲル２４の２層を含んで構成したが、さらに多くの層を含んで構成してもよい。
　第１ゲル１４は、室温から所定の温度に上昇した場合に変性する。本実施形態で「変性」とは、第１ゲル１４が温度上昇により、細胞の容易な剥離をもたらす構造の変化を起こすことを意味する。第１ゲル１４がコラーゲンゲルまたはゼラチンゲルの場合、例えば、コラーゲンタンパク質の二次または三次構造の変化によりもたらされる状態であるゾル化や凝集化、低分子化等が変性に含まれる。第１ゲル１４が変性する温度は６０℃以下が好ましく、５０℃以下がより好ましく、４０℃以下がさらに好ましい。第１ゲル１４の材料は、後述の剥離による細胞の取得を可能にするものであれば特に限定されないが、他の高分子と混合して用いることができるものが好ましく、コラーゲンゲルまたはゼラチンゲルがより好ましい。第２ゲル２４は特に限定されないが、第１ゲル１４と同一の分散質であるものが好ましい。
　培養容器１００の底部３３は、光透過性を有するものであって良い。培養容器１００は、本実施形態の培養容器１００の技術的特徴を損なわない限り任意の形状で構成され得る。
　なお、第１の層１０に対し搭載面１１の側からレーザー光を照射するように後述の細胞取得システム１０００を構成する場合、培養容器１００の底部３３および第２ゲル２４は光透過性を有しなくともよい。
　図２は、細胞培養基材１を用いて細胞の取得を行う細胞取得システム１０００を示す概念図である。細胞取得システム１０００は、培養容器１００と、倒立顕微鏡７０とを備える。培養容器１００には、第１の層１０の搭載面１１上に細胞５０が緩衝液５１中で培養されている。
　細胞培養基材１で培養されている細胞５０のうち、単離して取得したい細胞を選択細胞５００とし、その他の細胞を非選択細胞５０１とする。選択細胞５００はその態様は特に限定されないが、例えば、適切に遺伝子等が改変されレポーター遺伝子等の判別手段により特徴が現れている細胞や、初期化や適切な分化等が誘導されて構造上判別可能な特徴を有している細胞等が好適である。
　なお、選択細胞５００は、上記のように単一の細胞５０でもよいし、複数の細胞５０または複数の細胞５０を含んで構成されるコロニーでもよい。
　倒立顕微鏡７０は、照射部７１と、ダイクロイックミラー７２と、レンズ系７３と、観察部７４と、支持台７５とを備える。
　なお、照射光が直接細胞５０に当たることによる悪影響等が問題にならなければ、正立顕微鏡を用いて細胞取得システム１０００を構築してもよい。
　照射部７１は、レーザー光を出射する。照射部７１から出射されるレーザー光の波長は、金微粒子１３が光熱変換特性を発揮する波長域に設定され、特に表面プラズモン共鳴吸収（ＳＰＲ）が起こる波長域に設定されることが好ましい。第１ゲル１４に照射されるレーザー光は、細胞に照射した場合に重大な損傷を与えない波長およびエネルギーを有するものであればよい。照射部７１から出射されるレーザー光の波長は、４００ｎｍ以上１２００ｎｍ未満が好ましく、４５０ｎｍ以上９００ｎｍ未満がより好ましく、例えば５３２ｎｍ等に設定される。培養容器１００へ入射するレーザー光の出力は０．１ｍＷ以上１０００ｍＷ未満が好ましく、０．４ｍＷ以上１００ｍＷ未満がより好ましい。レーザー光の波長およびエネルギーは、細胞に傷害を与えずに第１ゲル１４に効率よく温度上昇および変性を起こすよう、適宜調整される。照射部７１から出射した光は、ダイクロイックミラー７２に入射する。
　なお、選択細胞５００の近傍を選択的に照射することができれば、照射部７１の出射光は特にレーザー光に限定されず、コヒーレントでない単色光や一定の波長範囲の光からなる光でもよい。
　ダイクロイックミラー７２は、照射部７１からのレーザー光を反射するとともに、培養容器１００からの可視光を透過させて観察部７４へと出射する。ダイクロイックミラー７２で反射されたレーザー光は、不図示のガルバノミラー等により適切な位置にレーザー光が照射されるように光の向きが調節され、レンズ系７３を透過して培養容器１００に入射する。培養容器１００に入射したレーザー光は、培養容器１００の底部３３、第２の層２０を透過した後、第１の層１０において選択細胞５００の近傍の所定の位置で収束する。図２では、収束するレーザー光７を一点鎖線を用いて模式的に示した。
　なお、所望の位置にレーザー光７を収束することができれば、レーザー光７の照射光学系の構成は特に限定されない。
　第１の層１０におけるレーザー光７の収束位置は、選択細胞５００に傷害を与えずに選択細胞５００の下方のできるだけ近い位置に収束されることが好ましく、例えばレーザー光７のスポット径、ＰＳＦ（Ｐｏｉｎｔ　Ｓｐｒｅａｄ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎ）やＰＳＦに基づくパラメータ等に基づいて定められる。第１の層１０におけるレーザー光７の収束位置は、選択細胞５００の直下であって、深さが１００μｍ未満の範囲、または選択細胞５００の細胞体から半径１００μｍ未満の範囲等に位置することが好ましい。また、細胞傷害性に問題が無ければ、選択細胞５００を収束位置としてもよい。
　照射部７１からのレーザー光７を金微粒子１３が光熱変換し、レーザー光７の収束位置の近傍のゲルが変性すると、選択細胞５００の足場となっているゲルまたは周囲の環境の物理的または化学的特性が変化するため、選択細胞５００を搭載面１１に付着させている力が弱まる。従って、ピペット６０を用いて吸引することにより、選択細胞５００のみを取り出すことができる。
　なお、細胞を物理的に取得する方法に関しては特に限定されず、ピペット６０以外にも、搭載面１１上の緩衝液５１を灌流させて取り出すこと等もできる。
　観察部７４は、接眼レンズ等を備え、不図示の照明により照らされた培養容器１００からの可視光をユーザにより観察可能にする。ユーザは、培養容器１００からの可視光を見て、支持台７５を移動させる等して培養容器１００を適切に位置合わせ等することができる。
　なお、レーザー光７の照射光学系とは異なるレーザー光源およびガルバノミラーを用いてレーザー走査を行うことにより培養容器１００の画像を取得し、不図示の表示装置に表示する構成としてもよい。
　支持台７５は、培養容器１００を支持する。支持台７５は不図示の移動機構によりＸＹＺの各方向に移動可能であり、これにより培養容器１００を任意の位置に調整することが可能である。支持台７５は、例えば、透明発熱体が形成されたガラスを含んで構成され、培養容器１００の底部３３へレーザー光７を透過させると共に、培養容器１００全体の温度を制御する。
　なお、培養容器１００の大きさ、構造等に応じて、レーザー光７の光路となる部分に開口部が形成されている支持台７５を用いることもできる。
　本実施形態の細胞培養基材１は、複数のゲルの層を備えることにより、発熱層である第１の層１０の厚さが面内で概ね均一となる。これにより、レーザー光７の照射条件の調整が容易となり、照射部位を変えた場合であっても細胞の単離が容易となる。
　図３は、培養容器１００の中心軸を通るＸＺ平面の断面図を示したものである。
　本実施形態の細胞培養基材１は、第２の層２０の厚さＨ２が０．８ｍｍ以上であることが好ましく、０．８ｍｍ以上１．７ｍｍ以下であることがより好ましく、０．８ｍｍ以上１．２ｍｍ以下であることがさらに好ましい。
第２の層２０の厚さＨ２が薄すぎると、第１の層１０および／または第２の層２０を均一または平坦に作成することが難しくなる。一方で、第２の層２０の厚さＨ２が厚すぎると、第１の層１０の第１ゲル１４に到達する光が減弱し、細胞５０近傍での金微粒子１３の発熱量が減少するため、細胞５０の取得が難しくなる。
　ここで、第１の層１０の厚さＨ１および第２の層２０の厚さＨ２は、細胞培養基材１の中心部の領域における厚さ、例えば中心軸に沿った厚さとする。
第２の層は、第１の層がメニスカス構造となり、中心部と周辺部の厚さの不均一を生じさせることがないように構成されるものであればよく、第２の層が複数の層を備えていても構わない。その場合、複数の層全体の厚さが０．８ｍｍ以上であることが好ましい。また、メニスカス構造は、ゲルの表面張力の違いによって構造が変化するものであるため、第１の層１０と第２の層２０のゲル材料は、表面張力（ｍＮ／ｍ）が近似するゲル材料から選択されることが好ましく、第１の層１０と第２の層２０のゲル材料は同じであることがさらに好ましい。
　第１の層１０の厚さＨ１の第２の層２０の厚さＨ２に対する比率（以下、厚さ比率Ｈ１／Ｈ２と呼ぶ）は０．５以上が好ましく、１．０以上がより好ましく、２．０以上がさらに好ましい。また、この値（厚さ比率Ｈ１／Ｈ２）は５以下が好ましく、４以下がより好ましく、３以下がさらに好ましい。厚さ比率Ｈ１／Ｈ２が小さすぎると、第１の層１０が薄過ぎて第１ゲル１４を均一または平坦に作成することが難しくなるか、または第２の層２０が厚過ぎて上述のように第１の層１０の第１ゲル１４に到達する光が減弱し、細胞５０近傍での金微粒子１３の発熱量が減少するため、細胞５０の取得が難しくなる。ここで、第１ゲル１４が均一または平坦に作成されていると、図３中において、第１ゲル１４の中心部の厚さＨ１と、第１ゲル１４の側壁近傍の厚さＨｍとが等しいか近い値となる。
　図４は、発熱層の中心部の厚さ（Ｈ１）と、発熱層の側壁近傍の厚さＨｍとの発熱量への影響を従来の細胞培養基材を用いて説明するための概念図（断面図）である。図４（ａ）は、従来の培養容器１０１の例であり、細胞培養基材が一層のゲル１４０のみにより構成されている。メニスカス形状により、ゲル１４０は中心部の厚さＨ１と側壁近傍の厚さＨｍとが異なっている。
　図４（ｂ）は、図４（ａ）の破線で囲まれた領域Ｖ１およびＶｍを比較した拡大図である。培養容器１０１の中心部と側壁近傍とで厚さが異なった場合のゲル１４０では、レーザー光７による中心部での照射領域７００ａ（Ｖ１の斜線が付された領域）と側壁近傍での照射領域７００ｂ（Ｖｍの斜線が付された領域）との体積が異なることになる。従って、レーザー光７による発熱量がゲル１４０の中心部と側壁近傍とで異なることになる。また、細胞５０を生きたまま剥離することができる、金微粒子を含むゲルの温度範囲が限定的であるから、細胞５０の剥離のための温度上昇の制御が、レーザーの強度の他に発熱層の厚さに依存することになる。従って、厚さが均一でないゲル１４０では温度上昇の制御に時間がかかり、また、これにより搭載面１１上で効率よく細胞５０の取得を行える部分は限定されてしまう。
　図５は、本実施形態の第１ゲル１４の中心部の厚さＨ１と、第１ゲル１４の側壁近傍の厚さＨｍとの発熱量への影響を本実施形態に係る培養容器１００を用いて説明するための概念図（断面図）である。図５（ａ）では、第１ゲル１４の中心部において、第１ゲル１４の底面１２の一部と搭載面１１の一部とを含む領域Ｖ１と、第１ゲル１４の側壁近傍において、第１ゲル１４の底面１２の一部と搭載面１１の一部とを含む領域Ｖｍとが破線で囲まれて示されている。
　図５（ｂ）は、図５（ａ）の破線で囲まれた領域Ｖ１およびＶｍを比較した拡大図である。本実施形態に係る培養容器１００では中心部と側壁近傍とで厚さＨ１，Ｈｍが略等しくなり、レーザー光７による中心部での照射領域７０１ａ（Ｖ１の斜線が付された領域）と側壁近傍での照射領域７０１ｂ（Ｖｍの斜線が付された領域）との体積も略等しくなる。従って、レーザー光７による発熱量が第１ゲル１４の中心部と側壁近傍とで略等しいことになる。本実施形態の細胞培養基材１では、第１ゲル１４が中心部から周辺まで一定の厚さで作成されるため、細胞５０を搭載面１１のより広い領域から効率よく取得することができる。例えば、剥離しようとする細胞５０の位置による温度上昇の不均一性が小さくなるため、各位置におけるレーザーのエネルギーや照射時間等を調整することが容易になるか、不要となる。
　厚さ比率Ｈ１／Ｈ２が大き過ぎると、第１の層１０が厚くなり過ぎて金微粒子１３による光の散乱によって細胞直下での光が減弱してしまい細胞の取得が難しくなるか、または第２の層２０が薄くなり過ぎて均一または平坦な第２の層２０の形成が難しくなる。
　発熱層のみで構成された従来の細胞培養基材では、メニスカス構造により細胞培養基材の中心部のゲルの厚みが薄いためレーザー光７の照射時間やエネルギーの調整が難しく、金微粒子による熱が蓄積し、極端な場合には予期しない金微粒子の凝集やゲルの黒化等が起こることがあった。本実施形態の細胞培養基材１は、第２の層２０を備えるため、第１の層１０の厚さが概ね均一となり、温度調整が容易となる。また、熱拡散等により第１の層１０の中心部の温度を調整し、上記のゲルの黒化等の問題を防ぐことができる。特に、上記のゲルの黒化等の問題は、培養容器１００の内径Ｄ（図３）、または第１の層１０の搭載面１１における最大径が小さい場合、第１の層１０のメニスカス構造１５が第１の層１０の中心部の厚さに大きく影響するため顕著となる。従って、細胞培養基材１において、培養容器１００の内径Ｄが１０ｃｍ未満であると第１の層１０の均一化の効果がより顕著に得られる点で好ましく、５ｃｍ未満であるとより好ましく、２．５ｃｍ未満であるとさらに好ましい。ここで、内径Ｄは中心軸に垂直な最も長い方向の径とする（図３参照）。
（細胞培養基材１の製造方法）
　図６は、本実施形態の細胞培養基材１を用いた細胞培養基材１の製造方法の流れを示すフローチャートである。ステップＳ１００１において、培養容器１００にコラーゲンゲル等からなる第２ゲル２４の層を作成する。ステップＳ１００１が終了したら、ステップＳ１００３に進む。
　ステップＳ１００３において、所定の体積平均径を有する金微粒子１３を含む溶液を調製する。例えば、特開２０１３－２３３１０１号公報に記載の方法のように、金イオンを含む溶液（ＨＡｕＣｌ４等）中で還元剤（アスコルビン酸、ヒドロキノン、クエン酸等）の存在下に、金からなる種核を成長させて得ることができる。ステップＳ１００３が終了したら、ステップＳ１００５に進む。
　なお、ステップＳ１００１とステップＳ１００３の順序は、適宜前後してもよく、並行して操作を行ってもよい。
　金微粒子１３の体積平均径は、調整した金微粒子１３をレーザー回折式粒度分布測定装置で測定することができる。粒度分布測定装置を用いず、簡易的に測定する場合は、透過型電子顕微鏡を用いて撮像し、解析ソフトウェア等を用いて測定して算出することができる。
　ステップＳ１００５において、培養容器１００の第２ゲル２４の層の上に、金微粒子１３が分散された第１ゲル１４の層を形成する。ステップＳ１００３で調製された金微粒子１３を含む溶液を用いてコラーゲンと金微粒子１３とを含む混合溶液を調製し、培養容器の第２ゲルの上に加えて静置する。混合溶液が固まると、コラーゲンゲル中に金微粒子１３が分散され包埋される。ステップＳ１００５が終了したら、処理を終了する。
　図７は、本実施形態の細胞培養基材１を用いた細胞の取得方法および生産方法の流れを示すフローチャートである。ステップＳ２００１において、細胞培養基材１の表面、すなわち搭載面１１の上で細胞を培養する。ステップＳ２００１が終了したら、ステップＳ２００３に進む。ステップＳ２００３において、培養容器１００内、特に搭載面１１上を洗浄する。洗浄は、ＰＢＳ等を用いて行い、不要な浮遊物や沈着物等が取り除かれる。
　ステップＳ２００５において、搭載面１１上で培養された細胞５０の中から、取得する細胞５０（選択細胞５００）を選択する。必要に応じて、蛍光蛋白質が発現している細胞５０や、構造的特徴を持った細胞５０が選択される。ステップＳ２００５が終了したら、ステップＳ２００７に進む。ステップＳ２００７において、支持台７５の温度を適宜調節し、培養容器１００を第１ゲル１４の全体的な変性が起きる温度未満の温度に加熱する。レーザー光７の照射を行う前に培養容器１００の温度を上げることで、レーザー光７の照射時間を短くすることができ、選択細胞５００への細胞傷害性を低減することができる。
　ステップＳ２００９において、第１の層１０における選択細胞５００の近傍の収束位置に向けて第２の層２０の側からレーザー光７を照射する。第２の層２０の側からレーザー光７を照射することで、細胞５０に直接光が当たり細胞傷害を引き起こすことを避けることができる。さらに、第２の層２０は金微粒子１３が存在しないか、第１の層１０よりも金微粒子１３の濃度が低いため、選択細胞５００の近傍に到達するまでにレーザー光７が金微粒子１３と相互作用して減衰することを防ぐことができる。選択細胞５００と搭載面１１との結合が弱まったら、ステップＳ２０１１に進む。
　ステップＳ２０１１において、ピペット６０を用いて選択細胞５００を吸引し取得し、適宜再び培養する。取得した選択細胞５００は、他の培地等に配置して培養を行うことができる。ステップＳ２０１１が終了したら、処理を終了する。　なお、ステップＳ２０１１において、選択細胞５００を取得したら、ステップＳ２００５に戻って他の細胞５０を選択細胞５００として取得してもよい。また、取得した選択細胞は、そのまま臨床、研究、工業用等の様々な用途に使用してもよい。
　上述の実施の形態によれば、次の作用効果が得られる。
（１）本実施形態の細胞培養基材１は、金微粒子１３が分散された第１ゲル１４を備える第１の層１０と、金微粒子１３が存在しないか、または第１の層１０若しくは第１ゲル１４より低い濃度で存在する第２ゲル１４を備える第２の層２０と、を備える。これにより、第１の層１０の厚さＨ１を均一にし、第１の層１０の搭載面１１のより広い領域で効率的に細胞５０を剥離することができる。
（２）本実施形態の細胞培養基材１において、第１の層１０は、培養する細胞５０を搭載する搭載面１１と、第２の層２０と接する面１２と、を備える。これにより、第１の層１０から第２の層２０に直接熱を拡散・伝導することができ、ゲルの黒化を防ぐことができる。
（３）本実施形態の細胞培養基材１において、第１ゲル１４は、加熱により６０℃以下で変性する。これにより、第１の層１０において局所的に光を照射することによる、第１ゲル１４の局所的な変性を容易にすることができる。
（４）本実施形態の細胞培養基材１において、第１ゲル１４は、ゼラチンゲルまたはコラーゲンゲルである。これにより、製造、取扱い等が容易となる。
（５）本実施形態の細胞培養基材１において、第２ゲル２４のゲル材料は、第１ゲル１４のゲル材料と同じである。これにより、第１の層１０の厚さをより均一にするとともに、細胞培養基材１の製造を容易にし、また第１ゲル１４と第２ゲル２４との境界面でレーザー光の屈折や損失が起こることを少なくすることができる。
（６）本実施形態の細胞培養基材１において、金微粒子１３の体積平均径は２ｎｍ以上２００ｎｍ未満であり、第１の層１０の金微粒子１３の濃度は、１００μｍ以上１０００μｍ未満である。これにより、金微粒子１３による光熱変換および第１ゲル１４の変性が効率的に行われる。
（７）本実施形態における培養容器１００は、細胞培養基材１を備えるため、培養した細胞５０の中から選択細胞５００を効率的に、細胞５０への細胞傷害性が低い状態で取り出すことができる。
（８）本実施形態の細胞の取得方法は、細胞培養基材１で培養された細胞５０から、取得する選択細胞５００を選択することと、細胞培養基材１の第１の層１０に光を照射することと、選択細胞５００を回収することと、を備える。これにより、第１の層１０の搭載面１１のより広い領域で効率的に細胞５０を剥離することができるため、搭載面１１で培養された細胞５０をより多く効率的に取得することができる。
（９）本実施形態の細胞の取得方法において、レーザー光７は、第２の層２０を透過して第１の層１０に照射される。これにより、細胞に直接レーザー光７を照射して細胞傷害を起こすことなく選択細胞５００の取得を行うことができ、また、この場合に、第２ゲル２４に金微粒子１３が存在しないか、または第１ゲル１４より低い濃度で存在するため、第２ゲル２４でのレーザー光７の減衰を防ぐことができる。
　次のような変形も本発明の範囲内であり、上述の実施形態と組み合わせることが可能である。以下の変形例において、上述の実施形態と同様の構造、機能を示す部位に関しては、同一の符号で参照し、適宜説明を省略する。
（変形例１）
　上述の実施形態では、単離して取得したい細胞を選択細胞５００として取得する構成としたが、選択細胞５００以外の非選択細胞５０１の近傍にレーザー光７を照射し、非選択細胞５０１を剥離して取り除き、選択細胞５００を残す構成としてもよい。
　図８は、本変形例に係る細胞の取得方法における細胞取得システム１０００を示す概念図である。細胞取得システム１０００は、上述の実施形態と同様の構成だが、非選択細胞５０１の近傍にレーザー光７を照射する点が異なっている。
　図９は、本変形例の細胞培養基材１を用いた細胞の取得方法および生産方法の流れを示すフローチャートである。ステップＳ３００１において、細胞培養基材１の表面、すなわち搭載面１１の上で細胞を培養する。ステップＳ３００１が終了したら、ステップＳ３００３に進む。ステップＳ３００３において、培養容器１００内、特に搭載面１１上を洗浄する。洗浄は、ＰＢＳ等を用いて行い、不要な浮遊物や沈着物等が取り除かれる。
　ステップＳ３００５において、搭載面１１上で培養された細胞５０の中から、取得する細胞５０を選択する。必要に応じて、蛍光蛋白質が発現している細胞５０や、構造的特徴を持った細胞５０が選択される。ステップＳ３００５が終了したら、ステップＳ３００７に進む。ステップＳ３００７において、支持台７５の温度を適宜調節し、培養容器１００を第１ゲル１４の全体的な変性が起きる温度未満の温度に加熱する。
　ステップＳ３００９において、第１の層１０における非選択細胞５０１の近傍の収束位置に向けてレーザー光７を照射する。剥離する全ての非選択細胞５０１と搭載面１１との結合が弱まったら、ステップＳ３０１１に進む。ステップＳ３０１１において、ピペット６０を用いて非選択細胞５０１を吸引し取得する。ステップＳ３０１１が終了したらステップＳ３０１３に進む。
　ステップＳ３０１３において、選択細胞５００を取得または培養する。選択細胞５００は、近傍の第１ゲル１４にレーザー光７を照射し、非選択細胞５０１と同様にピペット６０により剥離してもよいし、または搭載面１１にＰＢＳ等の選択細胞５００への影響が小さい液体を導入し、当該液体中に浮遊させて取り出してもよい。あるいは、選択細胞５００の培養を始めてもよい。本変形例の細胞の取得方法により非選択細胞を取得し選択細胞５００を培養する場合、細胞培養基材１の上の細胞５０の量を適宜調節し、観察したい選択細胞５００の経過のみをより詳しく観察することができる。選択細胞５００を取得または培養したら、処理を終了する。
　本発明は上記実施形態の内容に限定されるものではない。本発明の技術的思想の範囲内で考えられるその他の態様も本発明の範囲内に含まれる。
（実施例）
　単一細胞のモデルとしてＨｅｌａ細胞、コロニーを形成する細胞のモデルとしてＭＤＣＫ細胞、単一神経細胞のモデルとしてＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞を用いて本実施形態の細胞の取得を行った。
　また、第１の層１０の厚さＨ１と第２の層２０の厚さＨ２との和が等しく、厚さ比率Ｈ１／Ｈ２が異なる２層ゲルを作成し、この２層ゲル上で培養したＨｅｌａ細胞のうち、２層ゲルの培養面（搭載面１１）の中心部に位置している細胞を取得しようとした場合の成功確率を調べた。
（試薬調製）
・ＰＢＳ（－）
ＮａＣｌ（４．００３ｇ）、ＫＣｌ（０．１００３ｇ）、ＫＨ２ＰＯ４（０．１００６ｇ）、ＮａＨ２ＰＯ４（０．５７５ｇ）をイオン交換水（５００ｍＬ）に溶かした後、オートクレーブで滅菌してＰＢＳ（－）を調製した。
・１０倍無機塩培地
イオン交換水（１０ｍＬ）へＣａＣｌ２無水物（２０．２ｍｇ）、ＭｇＣｌ・６Ｈ２Ｏ（２３．５ｍｇ）、ＫＣｌ（４０．４ｍｇ）、ＮａＣｌ（６３９．７ｍｇ）、ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ（１４．１ｍｇ）を加えて溶解させて１０倍無機塩培地を調製した。
・再構成溶液
ＮａＯＨ（０．０５Ｍ，１０ｍＬ）へＮａＨＣＯ３（２１９．７ｍｇ）、ＨＥＰＥＳ（４７７．１２ｍｇ）を加えて溶解させて再構成溶液を調製した。
・希塩酸
　０．０５ＭのＨＣｌ水溶液をｐＨメーター（堀場製作所社製、ｐＨ／ＣＯＮＤＭＥＴＥＲ　Ｄ－５４）を用いてｐＨ＝３．０に調整することで希塩酸（ｐｈ＝３．０）を作製した。ここで、１０倍無機塩培地、再構成溶液、希塩酸（ｐｈ＝３．０）はそれぞれフィルター（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製、孔径０．２０μｍ）を用いてフィルター滅菌した。
・濃縮金ナノ粒子（ＡｕＮＰ）溶液
　４ｍＬ（２ｍＬ×２）の、金ナノ粒子を成長させた溶液であるＧｒｏｗｔｈ溶液（Ｓ. Ｙａｇｉ, ｅｔ ａｌ, ＪＥｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍ Ｓｏｃ, １５９, Ｈ６６８ （２０１2）参照）を遠心管に入れ２５℃、回転数３０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。上澄み溶液（１．８ｍＬ×２）を除去し、超純水（１．８ｍＬ×２）を添加し、再度同じ条件で遠心分離した。その後、上澄み溶液（１．８ｍＬ×２）を除去し、超純水（０．２ｍＬ×２）を添加し還元剤濃度を希釈した濃縮ＡｕＮＰ溶液（Ａｕ５００μＭ）を作製した。
　金ナノ粒子の体積平均径は、調整した金ナノ粒子を透過型電子顕微鏡（日本電子社製，ＪＥＭ－２０００Ｆ，加速電圧２００ｋＶ）を用いて撮像し、解析ソフトウェア（ケニス社製，Ｐｈｏｔｏｍｅａｓｕｒｅ（登録商標））を用いて測定して算出した。
（２層ゲル作製）
　クリーンベンチ（昭和科学社製，Ｓ－１００１ＰＲＶ）内で、細胞培養用基材（新田ゼラチン社製，Ｃｅｌｌｍａｔｒｉｘ（登録商標）Ｉ－Ａ，コラーゲン濃度０．３ｗｔ%，ｐＨ＝３．０，０．５６ｍＬ）へ希塩酸（０．４２ｍＬ）、超純水（０．７０ｍＬ）、１０倍無機塩培地（０．２０ｍＬ）、再構成溶液（０．２０ｍＬ）を氷冷下で、この順番で加えてコラーゲンゲル溶液（２．１ｍＬ）を調製した。これを、氷冷下で、９６穴プレート（Ｎｕｎｃ社製）に入れた後、ダイレクトヒートＣＯ２インキュベーター内で３７℃下、３０分間インキュベーションした。その上に同様の操作で、上記の超純水（０．７０ｍＬ）を濃縮金ナノ粒子（ＡｕＮＰ）溶液（０．７０ｍＬ）に変更した金ナノ粒子包埋コラーゲンゲルを作製した。その後、３７℃下でゲル上へＰＢＳ（－）を１００μＬ／ｗｅｌｌ加え、６時間インキュベーションすることでゲルを洗浄した。
（細胞播種および剥離）
　作製したゲル上にＤＭＥＭに分散させたＨｅＬａ細胞（６０００ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ）を播種し２４時間培養した後、培地をＰＢＳ（－）で３回洗浄した。続いてＰＢＳ（－）を１０μＬ培地上に添加し、顕微鏡下、アルミシートを載せた３７℃サーモプレート上で３分間インキュベーションした後、スポット径が最小となるように設定し光照射した。照射後、三次元ジョイスティック手動マイクロマニピュレーター（ナリシゲ社製，ＮＴ－８８－Ｖ３ＭＳＨ）と空圧マイクロインジェクター（ナリシゲ社製，ＩＭ－１１－２）を用いて口径３０μｍのマニピュレーターを用いることで細胞を吸引剥離した。
　光照射にはＰＡ（ｐｈｏｔｏａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）落射蛍光装置（ニコン社製，ＴＩ－ＰＡＵ）を経由してレーザー光源（シグマ光機社製，波長５３２ｎｍ，出力５０ｍＷ）を組み込み、波長５３２ｎｍの光透過性をもつミラーユニット（ニコン社製，ＴＲＩＴＣ）を設置したものを使用し、細胞は倒立型蛍光顕微鏡（ニコン社製, ＥＣＬＩＰＳＥ　Ｔｉ－Ｕ）およびイメージングセンサー制御ソフトウェア（ＷＲＡＹＭＥＲ社製，ＷｒａｙＳｐｅｃｔ）を用いて蛍光/位相差観察および撮像を行った。観察は４倍、１０倍の対物レンズ（ニコン社製，Ｐｌａｎ－Ｆｌｕｏｒ）を用いて行っている。
　同様の操作をＤＭＥＭに分散させたＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞（６０００ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ）、ＭＥＭに分散させたＭＤＣＫ細胞（２０００ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ）でも行った。ＭＤＣＫ細胞はＣｅｌｌ　Ｔｒａｃｋｅｒ　Ｇｒｅｅｎ　ＣＭＦＤＡ（１０μＭ，１０μＬ）を用いて細胞を蛍光染色した後、細胞を剥離・回収した。金ナノ粒子を包埋させる操作を行わなかったゲルの側からレーザー光を照射し、レンズのピントをデフォーカスし、コロニー形成している細胞全体に光照射されるように、コロニーサイズに合わせて複数回光照射した。細胞観察は４倍のレンズを用いた。
（結果）
　Ｈｅｌａ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞のいずれにおいても実施例の２層ゲルで選択細胞の取得が可能であった。
　Ｈｅｌａ細胞における２層ゲルの厚さ比率Ｈ１／Ｈ２と選択細胞を取得する成功確率との関係を示す結果を表１に示した。ゲルの総量が同じであれば、厚さ比率Ｈ１／Ｈ２が大きい、つまり金ナノ粒子が包埋されたコラーゲンゲルの厚さが金ナノ粒子を包埋させる操作を行わなかったコラーゲンゲルの厚さよりも大きい程、選択細胞を取得する成功確率が上昇した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　次の優先権基礎出願の開示内容は引用文としてここに組み込まれる。
　日本国特許出願２０１７年第００３４２７号（２０１７年１月１２日出願）
　１…細胞培養基材、７…レーザー光、１０…第１の層、１１…搭載面、１３…金微粒子、１４…第１ゲル、２０…第２の層、２４…第２ゲル、７０…顕微鏡、１００…培養容器、５００…選択細胞、１０００…細胞取得システム、Ｈ１…第１の層の厚さ、Ｈ２…第２の層の厚さ、Ｄ…培養容器の内径。

Claims (15)

  1. 　金微粒子が分散された第１ゲルを備える第１の層と、
    　前記金微粒子が存在しないか、または前記第１の層より低い濃度で存在する第２ゲルを備える第２の層と、
    を備える細胞培養基材。
  2. 　請求項１に記載の細胞培養基材において、
    　前記第１の層は、培養する細胞を搭載する搭載面と、前記第２の層と接する面と、を備える細胞培養基材。
  3. 　請求項１または２に記載の細胞培養基材において、
    　前記第２の層の厚さは、０．８ｍｍ以上である細胞培養基材。
  4. 　請求項１から３までのいずれか一項に記載の細胞培養基材において、
    　前記第１の層の厚さの前記第２の層の厚さに対する比率は、０．５以上である細胞培養基材。
  5. 　請求項１から４までのいずれか一項に記載の細胞培養基材において、
    　前記第１ゲルは、加熱により６０℃以下で変性する細胞培養基材。
  6. 　請求項５に記載の細胞培養基材において、
    　前記第１ゲルは、ゼラチンゲルまたはコラーゲンゲルである細胞培養基材。
  7. 　請求項１から６までのいずれか一項に記載の細胞培養基材において、
    　前記第２ゲルのゲル材料は、前記第１ゲルのゲル材料と同じである細胞培養基材。
  8. 　請求項１から７までのいずれか一項に記載の細胞培養基材において、
    　前記金微粒子の体積平均径は１ｎｍ以上２００ｎｍ未満であり、
    　前記第１の層の前記金微粒子の濃度は、１００μＭ以上１０００μＭ未満である細胞培養基材。
  9. 　請求項１から８までのいずれか一項に記載の細胞培養基材を備える培養容器。
  10. 　請求項９に記載の培養容器において、
    　前記細胞培養基材が収容される開口部を有し、
    　前記開口部の最大径は１０ｃｍ未満である培養容器。
  11. 　第１のゲル層を容器内に形成する工程と、
    　前記第１のゲル層の上に、金微粒子が分散された第２のゲル層を形成する工程と、を含む細胞培養容器の製造方法であって、
    　前記第１のゲル層は、金微粒子を含まないか、または前記第２のゲル層より低い濃度で金微粒子を含む、細胞培養容器の製造方法。
  12. 　請求項１１に記載の細胞培養容器の製造方法において、
    　前記第１のゲル層のゲル材料と前記第２のゲル層のゲル材料は同じである、細胞培養容器の製造方法。
  13. 　請求項１から８までのいずれか一項に記載の細胞培養基材または請求項９若しくは１０の培養容器で培養された細胞から、取得する細胞を選択することと、
    　前記細胞培養基材の前記第１の層に光を照射することと、
    　前記取得した細胞を回収することと、
    を備える細胞の取得方法。
  14. 　請求項１３に記載の細胞の取得方法において、
    　前記光は、前記第２の層を透過して前記第１の層に照射される細胞の取得方法。
  15. 　請求項１３または１４に記載の細胞の取得方法により取得した細胞を培養する細胞の培養方法。
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