WO2019163877A1 - 細胞培養容器、細胞培養容器の製造方法、細胞回収システムおよび細胞の取得方法 - Google Patents

細胞培養容器、細胞培養容器の製造方法、細胞回収システムおよび細胞の取得方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2019163877A1
WO2019163877A1 PCT/JP2019/006495 JP2019006495W WO2019163877A1 WO 2019163877 A1 WO2019163877 A1 WO 2019163877A1 JP 2019006495 W JP2019006495 W JP 2019006495W WO 2019163877 A1 WO2019163877 A1 WO 2019163877A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cell culture
culture container
gel
cell
cells
Prior art date
Application number
PCT/JP2019/006495
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
千恵 児島
清水　達也
裕次 原口
武志 川野
賢二 ▲高▼塚
楓 横山
瀧　優介
Original Assignee
公立大学法人大阪
学校法人東京女子医科大学
株式会社ニコン
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 公立大学法人大阪, 学校法人東京女子医科大学, 株式会社ニコン filed Critical 公立大学法人大阪
Priority to EP19757055.9A priority Critical patent/EP3757203A4/en
Priority to JP2020501026A priority patent/JP7113440B2/ja
Publication of WO2019163877A1 publication Critical patent/WO2019163877A1/ja
Priority to US16/996,797 priority patent/US20210032580A1/en

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M3/00—Tissue, human, animal or plant cell, or virus culture apparatus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C12M23/12—Well or multiwell plates
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/508—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes rigid containers not provided for above
    • B01L3/5085—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes rigid containers not provided for above for multiple samples, e.g. microtitration plates
    • B01L3/50855—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes rigid containers not provided for above for multiple samples, e.g. microtitration plates using modular assemblies of strips or of individual wells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
    • C12M25/14—Scaffolds; Matrices
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M33/00—Means for introduction, transport, positioning, extraction, harvesting, peeling or sampling of biological material in or from the apparatus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/02—Separating microorganisms from their culture media
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0809—Geometry, shape and general structure rectangular shaped
    • B01L2300/0829—Multi-well plates; Microtitration plates
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0848—Specific forms of parts of containers
    • B01L2300/0854—Double walls
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2400/00—Moving or stopping fluids
    • B01L2400/04—Moving fluids with specific forces or mechanical means
    • B01L2400/0475—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific mechanical means and fluid pressure
    • B01L2400/0487—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific mechanical means and fluid pressure fluid pressure, pneumatics
    • B01L2400/049—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific mechanical means and fluid pressure fluid pressure, pneumatics vacuum
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2529/00—Culture process characterised by the use of electromagnetic stimulation
    • C12N2529/10—Stimulation by light
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/50—Proteins
    • C12N2533/54—Collagen; Gelatin

Definitions

  • the present invention relates to a cell culture container, a method for manufacturing a cell culture container, a cell recovery system, and a method for acquiring a cell.
  • the cell culture container is filled with a cell culture substrate including a gel layer formed of a gel that is denatured by heating, and a gold fine particle layer formed on one surface of the gel layer.
  • a cell recovery system includes the cell culture container of the first aspect and a suction pump connected to the cell culture container.
  • the cell acquisition method includes a step of selecting a cell to be acquired from the cells arranged in the cell culture container of the first aspect, and cell culture in the vicinity of the selected cell. Irradiating the substrate with light, and recovering the selected cells.
  • the present inventors cultured cells in a cell culture container filled with a cell culture substrate containing a gel layer formed of a gel that is denatured by heating and a gold fine particle layer formed on one side of the gel layer. Then, it was found that the gel of the cell culture substrate was very efficiently denatured by irradiating light from the outside for a very short time. As a result, the cells are detached from the cell culture substrate or the cells are detached from the culture vessel together with the cell culture substrate, so that the cells can be efficiently recovered without any damage by suction or the like. I found.
  • the cell culture substrate is shrunk and peeled off from the wells by light from the outside, and the cell culture substrate is taken out by aspiration or the like, thereby removing the cell culture substrate.
  • the present inventors have found that the cells can be efficiently recovered without damaging the target cells adhered to the material.
  • the cell culture vessel can be produced without wasting gold fine particles by producing a cell culture substrate by a method of forming a gold fine particle layer on one surface of the gel. I found out that I can do it.
  • the cell culture container of the present embodiment it is possible to specifically and efficiently recover the target cells.
  • FIG. 1 is a cross-sectional view of the first embodiment of the cell culture container of the present embodiment.
  • the cell culture container 1 is filled with a gel 15 that is denatured by heating, and a gold fine particle layer 13 is formed on the lower surface side of the gel 15.
  • the cell culture container 1 has one open port.
  • the cell culture container 1 may have a lid such as a petri dish or may not have a lid.
  • the gold fine particles forming the gold fine particle layer 13 can be particles having a high photothermal conversion characteristic, and may be particularly large enough to cause surface plasmon resonance absorption (SPR).
  • the volume average diameter of the gold fine particles measured using a laser diffraction particle size distribution analyzer can be, for example, 1 nm or more and less than 200 nm, 10 nm or more and less than 100 nm, or 30 nm or more and less than 70 nm.
  • a solution containing gold fine particles having a predetermined volume average diameter is obtained by reducing a reducing agent (ascorbic acid, hydroquinone, etc.) in a solution containing gold ions (HAuCl 4 or the like), for example, as described in JP-A-2013-233101.
  • the volume average diameter of the gold fine particles can be measured with a laser diffraction particle size distribution analyzer.
  • the measurement may be performed by imaging using a transmission electron microscope and measuring using analysis software or the like.
  • Gel 15 is denatured when it rises from room temperature to a predetermined temperature.
  • “denaturation” means that the gel 15 undergoes a structural change that causes easy detachment of cells from the gel 15 or easy detachment of the gel 15 from the cell culture vessel 1 due to a temperature rise. To do.
  • “denaturation” includes, for example, solification, aggregation, and low molecular weight, which are states caused by changes in the secondary or tertiary structure of the collagen protein.
  • the temperature at which the gel 15 is denatured is, for example, 60 ° C. or lower, 50 ° C. or lower, or 40 ° C. or lower.
  • the material of the gel 15 is not particularly limited as long as it enables cells to be obtained by peeling from the gel 15 described later, but may be, for example, a collagen gel or a gelatin gel. Moreover, the gel which added the crosslinking agent and the gel obtained by mixing 2 or more types of polymers can also be used.
  • the gel 15 may be a gel in which gold fine particles are dispersed.
  • a method for forming the gold fine particle layer 13 on the lower surface side of the gel 15 is not particularly limited. For example, first, a solution containing the gold fine particles is poured into the cell culture vessel 1 and dried for a whole day and night. The components are evaporated to form a gold fine particle layer 13 on the bottom surface of the cell culture vessel 1. Subsequently, a gel 15 is formed on the gold fine particle layer 13. For example, in the case of a collagen gel, the gel 15 can be formed by injecting a collagen solution into the cell culture container 1 and gelling it.
  • the concentration of the gold fine particle solution poured into the cell culture vessel 1 may be, for example, 100 ⁇ M or more and less than 2000 ⁇ M, 250 ⁇ M or more and 1500 ⁇ M or less, or 250 ⁇ M or more and 800 ⁇ M or less.
  • concentration of the gold fine particle solution is low, the calorific value of the gold fine particles is small, so that the shrinkage rate of the gel 15 is small, and the probability of successful peeling from the gel 15 tends to decrease.
  • the concentration of the gold fine particle solution is high, the temperature rise locally increases, so that temperature control becomes difficult and the cytotoxicity tends to increase.
  • the gold fine particles may be further stabilized by using a protective agent such as encapsulating in a dendrimer or modifying with a molecule having affinity for the gel.
  • FIG. 2 is a cross-sectional view of a second embodiment of the cell culture container.
  • the cell culture container 1 is filled with a gel 15 that is denatured by heating, and a gold fine particle layer 13 is formed on the upper surface side of the gel 15. Except for the arrangement of the gel 15 and the gold fine particle layer 13, it is the same as that of the first embodiment shown in FIG.
  • the method for producing such a cell culture substrate 14 is not particularly limited.
  • the cell 15 is filled with the gel 15.
  • the filling method of the gel 15 can be performed similarly to the first embodiment.
  • a cell culture substrate 14 can be prepared by pouring a solution containing gold fine particles thereon and drying the solution for 24 hours to evaporate liquid components in the solution to form a gold fine particle layer 13.
  • Placement of cells on the upper surface of the cell culture substrate 14 in which the gold fine particle layer is formed on the upper surface or the lower surface of the gel 15 can be performed, for example, by pouring a liquid containing cells into the cell culture container 1.
  • the number of cells poured into the cell culture vessel 1 can be determined by adjusting the concentration of the liquid containing the cells.
  • the cell culture container 1 may have a light transmittance. Thereby, the cell culture substrate 14 can be irradiated with light through the bottom of the cell culture vessel 1.
  • the cell culture container 1 can be configured in an arbitrary shape as long as the technical characteristics of the cell culture container 1 of the present embodiment are not impaired.
  • FIG. 3 is a cross-sectional view of the third embodiment of the cell culture container 1 of the present embodiment.
  • the cell culture container 1 has a plurality of wells 11.
  • the gel 15 is filled on the gold fine particle layer 13 in each of the wells. Formation of the gold fine particle layer 13 and filling of the gel 15 can be performed in the same manner as in the first embodiment.
  • Placement of cells on the cell culture substrate 14 in which the gel 15 is laminated on the gold fine particle layer 13 can be performed, for example, by pouring a liquid containing cells into the cell culture container 1.
  • cells may be seeded in each of the wells 11 using an ink jet printer.
  • the cell culture container 1 may have a configuration in which about 1 cell is disposed per well.
  • “About 1 cell is arranged per well” means that, when a cell-containing liquid is poured into the cell culture container 1, the well 11 in which only one cell is arranged is the most among the wells 11 in which cells are arranged.
  • One example of a method in which about 1 cell is arranged per well is to adjust the diameter of the well 11.
  • Examples of the diameter at which about 1 cell is arranged per well include an average diameter of cells to be cultured or an average longest diameter of 1 to 3 times, or 1.3 to 2 times.
  • the diameter of each well of the cell culture container 1 may be, for example, 10 ⁇ m to 500 ⁇ m, 20 ⁇ m to 400 ⁇ m, or 30 ⁇ m to 300 ⁇ m. If the diameter of the well becomes too large, denaturation due to light irradiation tends to be difficult to occur.
  • the cell culture container 1 may have any number of wells 11.
  • the wells 11 can be arranged in an array (microarray) in the cell culture container 1.
  • the number of cells arranged per well can be adjusted by adjusting the distance between the adjacent wells 11.
  • about 1 cell may be seeded in each well using an inkjet printer.
  • a configuration in which about one cell is arranged per well can be appropriately designed by a person skilled in the art by at least one of the above-described methods and / or other methods.
  • the cell culture container 1 may have a light transmittance. Thereby, the cell culture substrate 14 can be irradiated with light through the bottom of the well 11.
  • the cell culture container 1 can be configured in an arbitrary shape as long as the technical characteristics of the cell culture container 1 of the present embodiment are not impaired.
  • the gold fine particle layer 13 is filled with the gel 15. However, even when the cell culture container 1 is in a microarray shape, the gold fine particle layer is formed on the gel 15 as in the second embodiment. 13 may be formed.
  • FIG. 4 is a cross-sectional view of the fourth embodiment of the cell culture container 1 of the present embodiment.
  • the cell culture container 1 has a plurality of wells 11, and the well 11 of the cell culture container 1 has a through hole 12 at the bottom.
  • the diameter of the through hole 12 may be the same as or smaller than the diameter of the well 11.
  • the diameters of the through hole 12 and the well 11 are the same.
  • the cell culture substrate 14 is filled to the whole well 11 and the through-hole 12 portion, but the cell culture substrate 14 may not be filled to the well 11 and the through-hole 12 portion.
  • each well 11 and the through-hole 12 are first filled with the gel 15 and are turned upside down from FIG. Place the cell culture vessel 1 (with the surface 16a on top) and place a solution containing gold microparticles on the gel. Then, the liquid component in the solution is evaporated by drying all day and night, and the gold fine particle layer 13 is formed.
  • the surface 16b of the cell culture vessel 1 may be turned upside down.
  • the method of filling each well 11 with the gel 15 is not particularly limited, but as an example, a layer of the gel 15 is formed in another container, and the surface 16b of the cell culture container 1 is pressed thereon, whereby the gel 15 is placed in the well 11.
  • the method of inserting is mentioned.
  • the gold fine particle layer 13 is formed on the lower side (surface 16a side) of the gel 15, but on the upper surface of the gel 15 (the same side as the cells are cultured, on the surface 16b side). A gold fine particle layer 13 may be formed.
  • FIG. 5 is a conceptual diagram showing a cell recovery system 1000 that acquires cells using the cell culture container of the third embodiment.
  • the cell acquisition system 1000 includes a cell culture container 1 and an inverted microscope 70. Cells 30 cultured in another culture container are poured into the cell culture container 1 together with the culture solution 20.
  • the culture solution 20 may be replaced or diluted with a culture solution, a buffer solution, or the like.
  • the cells 30 poured into the cell culture container 1 may have a concentration such that one cell per well is poured into the cell culture container 1.
  • the cells 30 arranged on the upper surface of the cell culture substrate 14 filled in each well 11 of the cell culture container 1 are cultured on the upper surface of the cell culture substrate 14 in each well 11.
  • the cells to be isolated and acquired are designated as selected cells 300, and the other cells are designated as non-selected cells 301.
  • the mode of the selected cell 300 is not particularly limited. For example, cells that have been appropriately modified in the gene or the like and are characterized by a discriminating means such as a reporter gene, or that are structurally discriminated by initialization or appropriate differentiation being induced. Examples thereof include cells having possible characteristics.
  • the selected cell 300 may be a single cell 30 as described above, or may be a colony including a plurality of cells 30 or a plurality of cells 30.
  • the inverted microscope 70 includes an irradiation unit 71, a dichroic mirror 72, a lens system 73, an observation unit 74, and a support base 75. Note that the cell collection system 1000 may be constructed using an upright microscope.
  • the irradiation unit 71 emits laser light.
  • the wavelength of the laser light emitted from the irradiation unit 71 is set to a wavelength region where the gold fine particles of the gold fine particle layer 13 exhibit photothermal conversion characteristics. In particular, it may be set in a wavelength region where surface plasmon resonance absorption (SPR) occurs.
  • SPR surface plasmon resonance absorption
  • the laser light applied to the cell culture substrate 14 may have any wavelength and energy that does not cause significant damage to the cells on the upper surface of the cell culture substrate 14 when the cell culture substrate 14 is irradiated.
  • the wavelength of the laser light emitted from the irradiation unit 71 is set to, for example, 400 nm or more and less than 1200 nm, 450 nm or more and less than 900 nm, 532 nm, or the like.
  • the output of the laser light incident on the cell culture vessel 1 can be, for example, 0.1 mW or more and less than 1000 mW, or 0.4 mW or more and less than 100 mW.
  • the wavelength and energy of the laser light are appropriately adjusted so as to efficiently raise the temperature and denature the gel contained in the cell culture substrate 14 without damaging the cells.
  • the light emitted from the irradiation unit 71 is incident on the dichroic mirror 72.
  • the emitted light of the irradiation unit 71 is not particularly limited to laser light, and is from monochromatic light that is not coherent or light in a certain wavelength range. May be light.
  • the dichroic mirror 72 reflects the laser light from the irradiation unit 71 and transmits the visible light from the cell culture container 1 to be emitted to the observation unit 74.
  • the direction of the laser beam reflected by the dichroic mirror 72 is adjusted so that the laser beam is irradiated at an appropriate position by a galvano mirror (not shown), and the light passes through the lens system 73 and enters the cell culture vessel 1. To do.
  • the laser light incident on the cell culture vessel 1 passes through the bottom of the cell culture vessel 1 and then converges at a predetermined position on the cell culture substrate 14.
  • the converging laser beam 7 is schematically shown using a one-dot chain line. Note that the configuration of the irradiation optical system of the laser light 7 is not particularly limited as long as the laser light 7 can be converged to a desired position.
  • the convergence position of the laser beam 7 in the cell culture substrate 14 can be set to any position in the cell culture substrate 14 below the selected cell 300 that does not damage the selected cell 300, for example, the laser beam. 7 based on a spot diameter, a PSF (Point Spread Function), a parameter based on PSF, and the like.
  • the gold fine particle layer 13 itself or the vicinity of the gold fine particle layer 13 may be used. Accordingly, a high light exothermic effect is obtained, and cytotoxicity due to heat generated by the gold microparticles is reduced. Therefore, the selected cell 300 is also suitable for a case where the selected cell 300 is a heat-sensitive cell.
  • the focusing position of the laser beam 7 on the cell culture substrate 14 may be a position in the gel 15 where the distance to the selected cell 300 is 100 ⁇ m or more. Further, the focusing position of the laser light in the cell culture substrate 14 may be a position close to the wall surface of the well 11 instead of the central portion of the cell culture substrate 14.
  • the gel to which the selected cells 300 are attached contracts, and the well 11 Peel from the wall. Therefore, by pouring a fluid such as a culture solution or a buffer solution into the cell culture vessel 1, the cell culture substrate 14 to which the selected cells 300 are attached can be suspended in the fluid and recovered together with the fluid.
  • a fluid such as a culture solution or a buffer solution
  • the contracted cell culture substrate 14 can be taken out from the through hole 12 below the well 11 by suction using a suction pump or the like (see FIG. 6).
  • the observation unit 74 includes an eyepiece and the like, and allows a user to observe visible light from the cell culture container 1 illuminated by illumination (not shown). The user can appropriately align the cell culture container 1 by observing visible light from the cell culture container 1 and moving the support base 75. In addition, it is good also as a structure which acquires the image of the cell culture container 1 by performing laser scanning using the laser light source and galvanometer mirror different from the irradiation optical system of the laser beam 7, and displays it on a display apparatus not shown.
  • the support base 75 supports the cell culture container 1.
  • the support base 75 can be moved in each of the XYZ directions by a moving mechanism (not shown), whereby the cell culture container 1 can be adjusted to an arbitrary position.
  • the support base 75 is configured to include glass on which a transparent heating element is formed, and transmits the laser light 7 to the bottom of the cell culture container 1 and controls the temperature of the entire cell culture container 1. Note that, depending on the size, structure, and the like of the cell culture container 1, a support base 75 in which an opening is formed in a portion that becomes an optical path of the laser light 7 can also be used.
  • FIG. 7 shows a cross-sectional view of the XZ plane of the cell culture container 1 of the third embodiment.
  • the thickness of the gel 15 can be, for example, 0.05 mm or more, 0.05 mm or more and 1.7 mm or less, or 0.1 mm or more and 1.2 mm or less. If the gel 15 is too thin, it tends to be difficult to make the gel 15 uniform or flat. On the other hand, if the thickness of the gel 15 is too thick, the time for irradiating light to shrink the gel 15 may become longer.
  • the thickness of the gel 15 is the thickness of the cell culture substrate 14 in the depth direction of the well 11, for example, the thickness along the central axis of the well 11.
  • FIG. 8 shows a cell collection system using the cell culture container 1 of the third embodiment and the fourth embodiment.
  • the cell culture container 1 is a cell culture of the first embodiment and the second embodiment. It may be a container.
  • the cell collection system of this embodiment includes the cell culture container 1 of this embodiment and a suction pump 40 connected to the cell culture container 1. By connecting the suction pump 40 to the cell culture vessel 1, the cell culture substrate 14 to which the selected cells 300 adhered, which are contracted by irradiating the laser beam 7, can be collected by suction.
  • the cell culture container 1 and the suction pump 40 may be connected by any connection method as long as the selected cells 300 can be sucked or the cell culture substrate 14 contracted by light to which the selected cells 300 are attached can be sucked.
  • it connects to the upper surface of the cell culture container 1 which concerns on 3rd Embodiment, the connection method which attracts
  • Examples include a connection method of sucking the cell culture substrate 14 contracted by light, which is connected to the through-hole 12 of the culture vessel 1 and from which the selected cells 300 are attached.
  • FIG. 9 is a flowchart showing the flow of the cell acquisition method and production method using the cell culture container 1 of the present embodiment.
  • a culture solution containing cells is poured into the cell culture container 1.
  • the culture solution may be diluted with the culture solution or the like before pouring the culture solution containing the cells into the cell culture vessel 1.
  • the cell culture container 1 has a plurality of wells, dilution may be performed so that one cell is arranged per well of the cell culture container.
  • step S2001 ends, the process proceeds to step S2003.
  • step S2003 the cells are cultured on the upper surface of the cell culture substrate 14 filled in the cell culture container.
  • step S2003 ends, the process proceeds to step S2005.
  • step S2005 the culture solution is removed by suction. After removing the culture solution, the upper surface of the cell culture substrate 14 filled in the cell culture container 1 may be washed. Washing is performed using PBS or the like, and unnecessary suspended matters and precipitates are removed.
  • step S2005 ends, the process proceeds to step S2007.
  • step S2007 the cell 30 (selected cell 300) to be acquired is selected from the cells 30 cultured on the upper surface of the cell culture substrate 14. If necessary, a cell 30 in which a fluorescent protein is expressed or a cell 30 having structural characteristics is selected.
  • step S2007 ends, the process proceeds to step S2009.
  • step S2009 the temperature of the support base 75 is appropriately adjusted, and the cell culture container 1 is heated to a temperature lower than the temperature at which the entire denaturation of the cell culture substrate 14 occurs, for example, 37 ° C. or higher and lower than 40 ° C. You may heat the cell culture container 1 by arrange
  • step S2009 and step S2007 may be reversed. In any case, after step 2009 is completed, the process may proceed to the next step (step S2007 or step S2011), and the subsequent steps may be performed while step S2009 is continued.
  • step S2011 the laser beam 7 is irradiated from the lower side of the cell culture container 1 toward the convergence position in the cell culture substrate 14 to which the selected cell 300 is attached.
  • the laser beam 7 By irradiating the laser light 7 from the lower side of the cell culture container 1, it is possible to avoid the direct light from hitting the selected cells 300 and causing cell damage.
  • the gel 15 in the vicinity of the selected cell 300 is denatured and contracted by the heat generation of the gold fine particle in the gold fine particle layer 13, and the bond between the selected cell 300 and the gel is weakened so that the selected cell 300 is cultured in the cell.
  • the cell culture substrate 14 is peeled off from the wall surface of the well 11 together with the cells.
  • step S2013 When the selected cell 300 or the cell culture substrate 14 is peeled from the wall surface of the well 11, the process proceeds to step S2013.
  • a plurality of cells may be selected in step S2007, the cell culture container 1 may be heated in step S2009, and the plurality of cells selected in step S2011 may be irradiated with laser light.
  • the cell culture vessel 1 is heated by performing step S2009, and the selection of the cells in step S2007 and the laser light irradiation in step S2011 are performed on all the selected cells while heating is stopped or the heating is continued. You may repeat until it is irradiated.
  • step S2013 if there is a sufficient amount of fluid such as a culture solution or a buffer solution on the cell culture vessel 1, the state is left as it is. If the amount of fluid is insufficient, the culture solution or the buffer solution is added to the cell culture vessel 1.
  • the cell culture substrate 14 peeled off from the wall surface of the well 11 of the cell culture container 1 floats in the fluid. Therefore, the selected cells 300 can be recovered by recovering the fluid by tilting or aspirating the cell culture container 1. When the selected cells 300 are attached to the cell culture substrate 14, the selected cells 300 can be collected together with the cell culture substrate 14.
  • step S2013 when the cell culture container 1 has a plurality of wells 11 and the well 11 has a through hole 12 at the bottom, the contracted cell culture substrate 14 is sucked from the through hole 12 below the well 11. It may be recovered by suction using a pump or the like.
  • step S2013 ends, the process proceeds to step S2015.
  • step S2015 when the selected cell 300 is recovered in step S2013, the recovered cell 300 can be placed in another medium or the like as it is and cultured, and the cell culture in which the selected cell 300 is attached in step S2013.
  • the gel is dissolved in the cell culture base material 14 to which the recovered selected cell 300 is attached using collagenase or the like, and the selected cell 300 attached to the cell culture base material 14 is used as the cell culture medium.
  • the selected cells 300 collected from the material 14 and collected can be placed in another medium and cultured.
  • step S2015 ends the process ends. If the selected cell 300 is collected in step S2013, the process may return to step S2007 to acquire another cell 30 as the selected cell 300.
  • the collected selected cells may be used as they are for various uses such as clinical, research, and industrial purposes.
  • the cell culture container 1 of this embodiment has a cell culture substrate 14 including a gel layer formed of a gel 15 that is denatured by heating, and a gold fine particle layer 13 formed on one surface of the gel layer. Filled. Compared with the case where gold fine particles are dispersed in the gel 15 by culturing cells on the one side or the other side of the cell culture container 1 and irradiating the cell culture substrate 14 with light, the efficiency is higher. Since the gold fine particles can generate heat, the selected cells 300 can be efficiently detached from the cell culture substrate 14 and collected.
  • the cell culture container 1 has a plurality of wells 11. Each of the wells of the cell culture container 1 is filled with a cell culture substrate 14 including a gel layer formed of a gel 15 that is denatured by heating, and a gold fine particle layer 13 formed on one surface of the gel layer. Has been.
  • the selected cell 300 When cells are cultured on the upper surface of the cell culture vessel 1, the selected cell 300 is irradiated by irradiating the cell culture substrate 14 with light for a very short time as compared with the case where gold fine particles are dispersed in the gel 15.
  • the attached cell culture substrate 14 contracts, and the cell culture substrate 14 can be detached from the well 11.
  • the selected cell 300 can be recovered together with the cell culture substrate 14 by collecting the cell culture substrate 14 contracted by light and having the selected cell 300 attached thereto by suction or the like. For this reason, the number of recovered cells per unit time can be increased without causing damage to the selected cells 300.
  • the gold fine particle layer is formed on the lower surface of the gel layer, the place where the gold fine particles generate heat when irradiated with light is far from the cells, so that cytotoxicity due to heat can be reduced.
  • the cell culture container 1 has a plurality of wells 11, and the well 11 has a bottom. Thereby, since the cell culture substrate peeled from the well 11 can be suspended in a fluid such as a culture solution or a buffer solution, the cell culture substrate 14 to which the cells 300 are attached can be collected together with the fluid.
  • the cell culture container 1 has a plurality of wells 11, and the well 11 has a through-hole 12 at the bottom of the cell culture container 1.
  • the cell culture substrate 14 that has contracted from the bottom of the cell culture vessel through the through-hole 12 and to which the selected cells 300 are attached can be collected by a suction pump or the like.
  • the cell culture container 1 has a plurality of wells 11, and the well 11 has a diameter capable of arranging about one cell per well. This facilitates recovery of desired cells.
  • the gel 15 is a gelatin gel or a collagen gel. Thereby, manufacture, handling, etc. become easy.
  • the manufacturing method of the cell culture container of one Embodiment includes the process of filling the cell culture container 1 with the gel 15 denatured by heating, and the process of forming the gold fine particle layer 13 on one surface of the said gel.
  • the cell culture substrate in which gold fine particles are dispersed is usually filled in each well by preparing a gel in which gold fine particles are dispersed in a large container. The container is pressed against the gel. At this time, it is difficult to fill the prepared gel in all the wells, and therefore, the gel is lost as it protrudes from the well. Since the gold fine particles are dispersed in the gel, the gold fine particles also lose with the loss of the gel. However, by filling the cell culture vessel 1 with a gel and forming a gold fine particle layer on one side of the gel, the gold cell is dispersed in a cell culture substrate in which a cell culture substrate in which gold fine particles are dispersed is filled.
  • a cell culture container capable of collecting selected cells 300 without wasting fine particles can be obtained.
  • the cell culture container 1 has a plurality of wells 11, each of the wells 11 is filled with the gel 15, and the gold fine particle layer 13 is formed on the entire surface of the gel. To do. Thereby, it is possible to obtain a cell culture container that can collect the selected cells 300 without wasting gold fine particles.
  • the method for manufacturing a cell culture container according to one embodiment includes a step of forming a gold fine particle layer 13 in the well of the cell culture container 1 having a plurality of wells, and denaturation by heating on the gold fine particle layer 13. Forming a gel layer.
  • the cell collection system of one embodiment includes a cell culture container 1 and a suction pump 40 connected to the cell culture container 1. Thereby, the selected cell 300 or the cell culture substrate 14 to which the selected cell 300 is attached can be sucked by the suction pump 40, and the selected cell 300 or the cell culture substrate 14 to which the selected cell 300 is attached can be easily collected. become.
  • the method for acquiring a cell includes a step of selecting a cell 300 to be acquired from cells arranged in the cell culture container 1, and light to the cell culture substrate 14 in the vicinity of the selected cell 300. Irradiating and collecting the selected cells.
  • the method for acquiring a cell includes a step of selecting a cell 300 to be acquired from cells arranged in each of the wells 11 of the cell culture container 1, and a well in which the selected cell 300 is arranged.
  • 11 includes a step of irradiating light to the cell culture substrate 14 filled in 11, a step of taking out the cell culture substrate 14, and a step of recovering cells from the cell culture substrate 14.
  • the selected cell 300 can be collected together with the cell culture substrate 14. For this reason, the number of recovered cells per unit time can be increased without causing damage to the cells 300.
  • the step of taking out the cell culture substrate 14 filled in the well 11 is a step of sucking the cell culture substrate 14 filled in the well 11 with a suction pump or the like. It is. Thereby, the cell culture substrate 14 to which the selected cells 300 are attached can be collected by suction, and can be collected without damaging the selected cells 300.
  • the step of taking out the cell culture substrate 14 is a step of pouring a fluid such as a culture solution or a buffer solution into the cell culture vessel 1. Thereby, the cell culture substrate 14 to which the selected cells 300 are attached can be collected together with the fluid, and can be collected without damaging the selected cells 300.
  • the step of recovering the selected cells 300 from the cell culture substrate 14 is a step of adding collagenase to the cell culture substrate 14. Thereby, it can collect
  • the present invention is not limited to the contents of the above embodiment.
  • Other embodiments conceivable within the scope of the technical idea of the present invention are also included in the scope of the present invention.
  • the cells of this embodiment were obtained using HeLa cells as the cells.
  • PBS (-) NaCl (4.003 g), KCl (0.1003 g), KH 2 PO 4 (0.1006 g), NaH 2 PO 4 (0.575 g) were dissolved in ion-exchanged water (500 mL), and then sterilized by autoclave.
  • PBS (-) was prepared. 10-fold inorganic salt medium To ion-exchanged water (10 mL) CaCl 2 anhydrous (20.2 mg), MgCl ⁇ 6H 2 O (23.5 mg), KCl (40.4 mg), NaCl (639.7 mg), NaH 2 PO 4 ⁇ 2H 2 O-10 times mineral salts medium was added and dissolved to prepare (14.1 mg) was prepared.
  • Concentrated gold nanoparticle (AuNP) solution 2 mL (1 mL ⁇ 2) of Growth solution that is a solution in which gold nanoparticles are grown [see S. Yagi, et al, J Electrochem Soc, 159, H668 (2012)]
  • the mixture was placed in a centrifuge tube and centrifuged at 25 ° C. and a rotation speed of 3000 rpm for 20 minutes.
  • the supernatant solution (0.9 mL ⁇ 2) was removed, and ultrapure water (0.3 mL ⁇ 2) was added to prepare a concentrated AuNP solution (Au750 ⁇ M).
  • HeLa cells (6000 cells / microarray) dispersed in DMEM were poured into the prepared cell culture container and cultured at 37 ° C. for 1 day, and then the medium was removed by suction. Under a microscope, the spot diameter was set to the minimum on a 37 ° C. thermoplate on which an aluminum sheet was placed or in a cell culture chamber, and light irradiation was performed.
  • a laser light source (manufactured by Sigma Kogyo Co., Ltd., wavelength 532 nm, output 50 mW) is incorporated via a PA (photoactivation) epifluorescence apparatus (Nikon Corporation, TI-PAU), and has a light transmittance of 532 nm.
  • PA photoactivation
  • a mirror unit (Nikon, TRITC) is used, and the cells are fluorescent / inverted using an inverted fluorescence microscope (Nikon, ECLIPSE Ti-U) and imaging sensor control software (WRAYMER, WraySpec). Phase difference observation and imaging were performed. The observation was performed using a 4 ⁇ 10 ⁇ objective lens (Plan-Fluor, manufactured by Nikon Corporation).
  • the gel was denatured by light irradiation for 30 seconds and peeled off from the microarray.
  • the cell culture container of the present invention shortened the irradiation time by half. It ’s done.
  • the gel was denatured by light irradiation for 8 seconds, but heat-sensitive HeLa cells were killed even by irradiation for 1 second. (Data not shown).
  • the gel could be denatured by light irradiation for 2 seconds, and the cells were alive.
  • SYMBOLS 1 ... Cell culture container, 7 ... Laser light, 10 ... Cell culture container main body, 11 ... Well, 12 ... Through-hole, 13 ... Gold fine particle layer, 14 ... Cell culture substrate, 15 ... Gel, 20 ... Culture solution, 30 ... cells, 40 ... suction pump, 70 ... microscope, 300 ... selected cells, 1000 ... cell recovery system

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

加熱によって変性するゲル（１５）で形成されたゲル層と、前記ゲル層の一面に形成された金微粒子層（１３）と、を含む細胞培養基材（１４）が充填され、前記細胞培養基材の前記一面側又は他面側で細胞が培養される細胞培養容器。加熱によって変性するゲルを細胞培養容器に充填する工程と、前記ゲルの一面に金微粒子層を形成する工程と、を含む、細胞培養容器の製造方法。該細胞培養容器に配置された細胞から、取得する細胞を選択する工程と、選択された前記細胞の近傍の細胞培養基材に光を照射する工程と、選択された前記細胞を回収する工程と、を含む、細胞の取得方法。

Description

細胞培養容器、細胞培養容器の製造方法、細胞回収システムおよび細胞の取得方法
　本発明は、細胞培養容器、細胞培養容器の製造方法、細胞回収システムおよび細胞の取得方法に関する。
　本願は、２０１８年２月２１日に、日本に出願された特願２０１８－２８９２１号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　培養基材で培養された細胞をより効率的に回収するため、例えば、感温性高分子を含む 培養基材の上で細胞を培養し、温度変化を利用して細胞の回収を行う方法が提案されている（特許文献１参照）。
特開平１１－３４９６４３号公報
　本発明の第１の態様によると、細胞培養容器は、加熱によって変性するゲルで形成されたゲル層と、前記ゲル層の一面に形成された金微粒子層と、を含む細胞培養基材が充填されている。細胞は、細胞培養基材の前記一面側又は他面側で培養される。
　本発明の第２の態様によると、細胞培養容器の製造方法は、加熱によって変性するゲルを細胞培養容器に充填する工程と、前記ゲルの一面に金微粒子層を形成する工程と、を含む。
　本発明の第３の態様によると、細胞回収システムは、第１の態様の細胞培養容器と、前記細胞培養容器に接続された吸引ポンプとを備える。
　本発明の第４の態様によると、細胞の取得方法は、第１の態様の細胞培養容器に配置された細胞から、取得する細胞を選択する工程と、選択された前記細胞の近傍の細胞培養基材に光を照射する工程と、選択された前記細胞を回収する工程と、を含む。
第１の実施形態の細胞培養容器の断面図である。 第２の実施形態の細胞培養容器の断面図である。 第３の実施形態の細胞培養容器の断面図である。 第４の実施形態の細胞培養容器の断面図である。 一実施形態の細胞培養容器を含む細胞取得システムの構成を示す概念図である。 第４の実施形態の細胞培養容器を用いて細胞を取得する方法を模式的に示した図である。 一実施形態の細胞培養容器の構成を示す概念図である。 一実施形態の細胞回収システムの構成を示す概念図である。 一実施形態の細胞培養容器を用いた細胞の取得方法の流れを示すフローチャートである。
（第１の実施形態）
　以下では、適宜図面を参照しながら、一実施形態の細胞培養容器、細胞培養容器の製造方法、細胞回収システム、および細胞の取得方法等について説明する。
　細胞培養基材の上で培養した細胞のうち、遺伝子導入に成功した細胞等、特定の細胞を効率的に剥離し、回収することがしばしば必要になる。
　本発明者らは、加熱によって変性するゲルで形成されたゲル層と、ゲル層の一面に形成された金微粒子層と、を含む細胞培養基材が充填されている細胞培養容器で細胞を培養した後、外部から極めて短時間光を照射することにより、該細胞培養基材のゲルが非常に効率よく変性することを見出した。そしてこれにより、該細胞が細胞培養基材から剥離するか、または、該細胞が細胞培養基材ごと培養容器から剥離するので、吸引等により、障害を与えることなく該細胞を効率的に回収できることを見出した。
　特に、細胞培養容器が複数のウェルを有する場合、外部からの光により、該細胞培養基材が収縮してウェルから剥離し、該細胞培養基材を吸引等により取り出すことにより、該細胞培養基材に接着している目的細胞に障害を与えることなく、該細胞を効率的に回収できることを見出した。
　さらに、ゲルを細胞培養容器に充填した後に、ゲルの一面に金微粒子層を形成する方法で細胞培養基材を製造することにより、金微粒子を無駄にすることなく細胞培養容器を製造することができることを見出した。
　本実施形態の細胞培養容器を用いることにより、目的細胞を特異的に効率よく回収することを実現する。
　図１は、本実施形態の細胞培養容器の第１の実施形態の断面図である。細胞培養容器１は、内部に、加熱によって変性するゲル１５が充填されており、ゲル１５の下面側に金微粒子層１３が形成されている。第１の実施形態においては、細胞培養容器１は、一つの開放口を有する。細胞培養容器１はシャーレ等の蓋を有するものであっても、蓋を有さないものであってもよい。
　金微粒子層１３を形成する金微粒子は、光熱変換特性の高い大きさの粒子とすることができ、特に、表面プラズモン共鳴吸収（ＳＰＲ）が起こる大きさとしてもよい。レーザー回折式粒度分布測定装置を用いて測定された金微粒子の体積平均径は、例えば、１ｎｍ以上２００ｎｍ未満、１０ｎｍ以上１００ｎｍ未満、３０ｎｍ以上７０ｎｍ未満とすることができる。
　所定の体積平均径を有する金微粒子を含む溶液は、例えば、特開２０１３－２３３１０１号公報に記載の方法のように、金イオンを含む溶液（ＨＡｕＣｌ４等）中で還元剤（アスコルビン酸、ヒドロキノン、クエン酸等）の存在下に、金からなる種核を成長させて得ることができる。
　金微粒子の体積平均径は、レーザー回折式粒度分布測定装置で測定することができる。
粒度分布測定装置を用いず、簡易的に測定する場合は、透過型電子顕微鏡を用いて撮像し、解析ソフトウェア等を用いて測定して算出してもよい。
　ゲル１５は、室温から所定の温度に上昇した場合に変性する。本実施形態で「変性」とは、ゲル１５が温度上昇により、ゲル１５からの細胞の容易な剥離、または細胞培養容器１からのゲル１５の容易な剥離をもたらす構造の変化を起こすことを意味する。ゲル１５がコラーゲンゲルまたはゼラチンゲルの場合、「変性」には、例えば、コラーゲンタンパク質の二次または三次構造の変化によりもたらされる状態であるゾル化や凝集化、低分子化等が含まれる。ゲル１５が変性する温度は、例えば６０℃以下、５０℃以下、又は４０℃以下である。ゲル１５の材料は、後述のゲル１５からの剥離による細胞の取得を可能にするものであれば特に限定されないが、例えば、コラーゲンゲルまたはゼラチンゲルとしてもよい。また、架橋剤を添加したゲルや、二種類以上の高分子を混合して得たゲルを用いることもできる。また、ゲル１５は、金微粒子が分散されたゲルを用いてもよい。
　ゲル１５の下面側に金微粒子層１３を形成する方法は、特に制限はないが、例えば、まず、金微粒子を含む溶液を細胞培養容器１に流し込み、一昼夜乾燥させる等により、前記溶液中の液体成分を蒸発させ、細胞培養容器１の底面に金微粒子層１３を形成する。続いて、金微粒子層１３の上にゲル１５を形成する。ゲル１５は、例えばコラーゲンゲルの場合、細胞培養容器１にコラーゲン溶液を注入し、これをゲル化することによって形成することができる。
　このとき細胞培養容器１に流し込む金微粒子溶液の濃度は、例えば、１００μＭ以上２０００μＭ未満、２５０μＭ以上１５００μＭ以下、又は２５０μＭ以上８００μＭ以下としてもよい。金微粒子溶液の濃度が低いと、金微粒子の発熱量が小さくなるため、ゲル１５の収縮率が小さくなり、ゲル１５からの剥離成功確率が下がる傾向がある。一方、金微粒子溶液の濃度が高いと、局所での温度上昇が大きくなるため、温度制御が難しくなり、また細胞傷害性が高くなる傾向がある。なお、金微粒子は、デンドリマーに内包させたり、ゲルに対して親和性を有する分子で修飾したりする等、保護剤を用いてより安定化するようにしてもよい。
（第２の実施形態）
　図２は、細胞培養容器の第２の実施形態の断面図である。細胞培養容器１は、内部に、加熱によって変性するゲル１５が充填されており、ゲル１５の上面側に金微粒子層１３が形成されている。ゲル１５と金微粒子層１３の配置以外は、図１に示される第１の実施形態と同様である。
　このような細胞培養基材１４を作製する方法は、特に制限はないが、例えば、まず細胞培養容器１内にゲル１５を充填する。ゲル１５の充填方法は、第１の実施形態と同様に行うことができる。その上に、金微粒子を含む溶液を流し込み、一昼夜乾燥させる等して、溶液中の液体成分を蒸発させ、金微粒子層１３を形成して、細胞培養基材１４を作製することができる。
　ゲル１５の上面又は下面に金微粒子層が形成された細胞培養基材１４の上面への細胞の配置は、例えば、細胞を含む液体を細胞培養容器１に流し込むことによって行うことができる。細胞培養容器１に流し込む細胞の数は、細胞を含む液体の濃度を調節することにより行うことができる。
　また、細胞培養容器１は、光透過性を有するものであっても良い。これにより細胞培養容器１の底を介しても、細胞培養基材１４に光を照射することができる。細胞培養容器１は、本実施形態の細胞培養容器１の技術的特徴を損なわない限り任意の形状で構成され得る。
（第３の実施形態）
　図３は、本実施形態の細胞培養容器１の第３の実施形態の断面図である。本実施形態においては、細胞培養容器１は複数のウェル１１を有する。第３の実施形態においては、前記各ウェルのそれぞれにおいて、金微粒子層１３の上にゲル１５が充填されている。
　金微粒子層１３の形成とゲル１５の充填は、第１の実施形態と同様に行うことができる。
　金微粒子層１３の上にゲル１５が積層された細胞培養基材１４上への細胞の配置は、例えば、細胞を含む液体を細胞培養容器１に流し込むことによって行うことができる。別の方法として、インクジェットプリンタを用いて、ウェル１１のそれぞれに細胞を播種してもよい。
　細胞培養容器１は、１ウェル当たり約１細胞配置される構成としてもよい。これにより、細胞を１つずつ選択し回収することができるので、所望の細胞のみ回収することが可能である。「１ウェル当たり約１細胞配置される」とは、細胞を含む液体を細胞培養容器１に流し込んだとき、細胞が配置されるウェル１１のうち、細胞が１つだけ配置されたウェル１１が最も多くなる状態をいい、２つ以上の細胞が配置されたウェル１１や、１つも細胞が配置されていないウェル１１が存在してもよい。
　１ウェル当たり約１細胞配置される構成とする方法の一例として、ウェル１１の径を調節することが挙げられる。１ウェル当たり約１細胞配置される径として、例えば、培養する細胞の平均径又は平均最長径の１倍以上３倍未満、又は１．３倍以上２倍未満の径が挙げられる。細胞培養容器１の各ウェルの径は、例えば、１０μｍ～５００μｍ、２０μｍ～４００μｍ、または３０μｍ～３００μｍとしてもよい。ウェルの径が大きくなりすぎると、光照射による変性が生じにくくなる傾向がある。
　１ウェル当たり約１細胞配置される構成とする別の方法として、細胞を含む液体の濃度を調節することも挙げられる。
　１ウェル当たり約１細胞配置される構成とするさらに別の方法として、隣り合うウェル１１の距離（隣り合ったウェル１１の開口部の最小距離）を調節することも挙げられる。
細胞培養容器１は、ウェル１１をいくつ有してもよい。ウェル１１は、例えば、細胞培養容器１にアレイ状（マイクロアレイ状）に配置することができる。このとき、隣り合うウェル１１の距離を調節することにより、１ウェル当たりに配置される細胞数を調節することも可能である。
　上述のように、インクジェットプリンタを用いて、各ウェルに約１細胞ずつ播種してもよい。
　１ウェル当たり約１細胞配置される構成は、上述の方法の少なくとも一つ、及び／又はその他の方法により、当業者が適宜設計することができる。
　また、細胞培養容器１は、光透過性を有するものであっても良い。これによりウェル１１の底を介しても、細胞培養基材１４に光を照射することができる。細胞培養容器１は、本実施形態の細胞培養容器１の技術的特徴を損なわない限り任意の形状で構成され得る。
　なお、第３の実施形態では、金微粒子層１３の上にゲル１５を充填したが、細胞培養容器１がマイクロアレイ状の場合も、第２の実施形態と同様にゲル１５の上に金微粒子層１３を形成してもよい。
（第４の実施形態）
　図４は、本実施形態の細胞培養容器１の第４の実施形態の断面図である。本実施形態においては、細胞培養容器１は複数のウェル１１を有し、細胞培養容器１のウェル１１は底に貫通孔１２を有する。貫通孔１２の径は、ウェル１１の径と同一でも小さくてもよい。図４では、貫通孔１２とウェル１１の径が同一である。また、図４では、ウェル１１及び貫通孔１２部分いっぱいに細胞培養基材１４が充填されているが、細胞培養基材１４がウェル１１及び貫通孔１２部分いっぱいに充填されていなくてもよい。ウェル１１に充填されている細胞培養基材１４に光を照射することにより、細胞培養基材１４の下面に存在する金微粒子の発熱によりゲル１５が収縮し、細胞培養基材１４がウェル１１の壁面から剥離する。剥離した細胞培養基材１４は、貫通孔１２より吸引等により回収することができる。
　第４の実施形態に係る細胞培養容器１を作製する方法は、特に制限はないが、例えば、まず各ウェル１１及び貫通孔１２にゲル１５を充填し、図４とは上下反転した状態で（面１６ａが上になるように）細胞培養容器１を載置し、ゲル上に金微粒子を含む溶液を配置する。そして、一昼夜乾燥させる等して、溶液中の液体成分を蒸発させ、金微粒子層１３を形成した後、細胞培養容器１の面１６ｂが上になるように上下反転させればよい。各ウェル１１にゲル１５を充填する方法も特に限定されないが、一例として、別の容器にゲル１５の層を形成し、そこに細胞培養容器１の面１６ｂを押し付けることによりゲル１５をウェル１１に挿入する方法が挙げられる。
　なお、第４の実施形態では、ゲル１５の下側（面１６ａ側）に金微粒子層１３が形成されているが、ゲル１５の上面（細胞を培養するのと同じ側。面１６ｂ側）に金微粒子層１３が形成されていてもよい。
　図５は、第３の実施形態の細胞培養容器を用いて細胞の取得を行う細胞回収システム１０００を示す概念図である。細胞取得システム１０００は、細胞培養容器１と、倒立顕微鏡７０とを備える。
　細胞培養容器１に、別の培養容器で培養された細胞３０を培養液２０とともに流し込む。培養液２０は培養液、緩衝液等で置換又は希釈してもよい。細胞培養容器１に流し込む細胞３０は、細胞培養容器１に流し込んだとき、１ウェル当たり１細胞になるような濃度としてもよい。
　細胞培養容器１の各ウェル１１に充填された細胞培養基材１４の上面に配置された細胞３０は、各ウェル１１の細胞培養基材１４の上面で培養される。各ウェル１１に充填された細胞培養基材１４の上面で培養された細胞３０のうち、単離して取得したい細胞を選択細胞３００とし、その他の細胞を非選択細胞３０１とする。選択細胞３００はその態様は特に限定されないが、例えば、適切に遺伝子等が改変されレポーター遺伝子等の判別手段により特徴が現れている細胞や、初期化や適切な分化等が誘導されて構造上判別可能な特徴を有している細胞等が挙げられる。
　なお、選択細胞３００は、上記のように単一の細胞３０でもよいし、複数の細胞３０または複数の細胞３０を含んで構成されるコロニーでもよい。
　倒立顕微鏡７０は、照射部７１と、ダイクロイックミラー７２と、レンズ系７３と、観察部７４と、支持台７５とを備える。
　なお、正立顕微鏡を用いて細胞回収システム１０００を構築してもよい。
　照射部７１は、レーザー光を出射する。照射部７１から出射されるレーザー光の波長は、金微粒子層１３の金微粒子が光熱変換特性を発揮する波長域に設定される。特に表面プラズモン共鳴吸収（ＳＰＲ）が起こる波長域に設定してもよい。細胞培養基材１４に照射されるレーザー光は、細胞培養基材１４に照射した場合に細胞培養基材１４の上面の細胞に重大な損傷を与えない波長およびエネルギーを有するものであればよい。照射部７１から出射されるレーザー光の波長は、例えば、４００ｎｍ以上１２００ｎｍ未満、４５０ｎｍ以上９００ｎｍ未満、５３２ｎｍ等に設定される。細胞培養容器１へ入射するレーザー光の出力は、例えば０．１ｍＷ以上１０００ｍＷ未満、０．４ｍＷ以上１００ｍＷ未満とすることができる。レーザー光の波長およびエネルギーは、細胞に傷害を与えずに細胞培養基材１４に含まれるゲルに効率よく温度上昇および変性を起こすよう、適宜調整される。照射部７１から出射した光は、ダイクロイックミラー７２に入射する。
　なお、選択細胞３００の近傍の細胞培養基材１４を選択的に照射することができれば、照射部７１の出射光は特にレーザー光に限定されず、コヒーレントでない単色光や一定の波長範囲の光からなる光でもよい。
　ダイクロイックミラー７２は、照射部７１からのレーザー光を反射するとともに、細胞培養容器１からの可視光を透過させて観察部７４へと出射する。ダイクロイックミラー７２で反射されたレーザー光は、不図示のガルバノミラー等により適切な位置にレーザー光が照射されるように光の向きが調節され、レンズ系７３を透過して細胞培養容器１に入射する。細胞培養容器１に入射したレーザー光は、細胞培養容器１の底部を透過した後、細胞培養基材１４の所定の位置で収束する。図５では、収束するレーザー光７を、一点鎖線を用いて模式的に示した。
　なお、所望の位置にレーザー光７を収束することができれば、レーザー光７の照射光学系の構成は特に限定されない。
　細胞培養基材１４におけるレーザー光７の収束位置は、例えば、選択細胞３００に傷害を与えない、選択細胞３００の下方の細胞培養基材１４中の任意の位置とすることができ、例えばレーザー光７のスポット径、ＰＳＦ（Ｐｏｉｎｔ Ｓｐｒｅａｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ）やＰＳＦに基づくパラメータ等に基づいて定められる。選択細胞３００への影響を低くするために、金微粒子層１３自体又は金微粒子層１３付近としてもよい。これにより、高い光発熱効果が得られるとともに、金微粒子が発する熱による細胞毒性が低減されるので、選択細胞３００が熱に弱い細胞の場合にも好適である。
　細胞培養基材１４におけるレーザー光７の集束位置は、選択細胞３００までの距離が１００μｍ以上であるゲル１５内の位置としてもよい。また、細胞培養基材１４におけるレーザー光の集束位置は、細胞培養基材１４の中心部ではなく、ウェル１１の壁面に近い位置でもよい。
　照射部７１からのレーザー光７を金微粒子層１３の金微粒子が光熱変換し、レーザー光７の収束位置の近傍のゲルが変性すると、選択細胞３００が付着しているゲルが収縮し、ウェル１１の壁面から剥離する。従って、細胞培養容器１に培養液や緩衝液等の流体を流し入れることにより、選択細胞３００が付着した細胞培養基材１４を流体中に浮遊させ、流体ごと回収することができる。
　また、ウェル１１の下方の貫通孔１２から、収縮した細胞培養基材１４を、吸引ポンプ等を用いた吸引により取り出すこともできる（図６参照）。
　観察部７４は、接眼レンズ等を備え、不図示の照明により照らされた細胞培養容器１からの可視光をユーザにより観察可能にする。ユーザは、細胞培養容器１からの可視光を見て、支持台７５を移動させる等して細胞培養容器１を適切に位置合わせ等することができる。
　なお、レーザー光７の照射光学系とは異なるレーザー光源およびガルバノミラーを用いてレーザー走査を行うことにより細胞培養容器１の画像を取得し、不図示の表示装置に表示する構成としてもよい。
　支持台７５は、細胞培養容器１を支持する。支持台７５は不図示の移動機構によりＸＹＺの各方向に移動可能であり、これにより細胞培養容器１を任意の位置に調整することが可能である。支持台７５は、例えば、透明発熱体が形成されたガラスを含んで構成され、細胞培養容器１の底部へレーザー光７を透過させると共に、細胞培養容器１全体の温度を制御する。
　なお、細胞培養容器１の大きさ、構造等に応じて、レーザー光７の光路となる部分に開口部が形成されている支持台７５を用いることもできる。
　図７は、第３の実施形態の細胞培養容器１のＸＺ平面の断面図を示したものである。
　本実施形態の細胞培養基材１４は、ゲル１５の厚さを、例えば０．０５ｍｍ以上、０．０５ｍｍ以上１．７ｍｍ以下、又は０．１ｍｍ以上１．２ｍｍ以下とすることができる。ゲル１５の厚さが薄すぎるとゲル１５を均一または平坦に作成することが難しくなる傾向がある。一方でゲル１５の厚さが厚すぎると、ゲル１５を収縮させるために光を照射する時間が長くなることがある。
　ここで、ゲル１５の厚さは、細胞培養基材１４のウェル１１の深さ方向における厚さ、例えばウェル１１の中心軸に沿った厚さとする。
（細胞回収システム）
　本実施形態の細胞回収システムの概略図を図８に示す。図８は、第３の実施形態及び第４実施形態の細胞培養容器１を用いた細胞回収システムを示したが、細胞培養容器１は、第１の実施形態及び第２の実施形態の細胞培養容器であってもよい。
　本実施形態の細胞回収システムは、本実施形態の細胞培養容器１と前記細胞培養容器１に接続された吸引ポンプ４０と、を備える。前記細胞培養容器１に吸引ポンプ４０を接続することにより、レーザー光７を照射することにより収縮した、選択細胞３００が付着した細胞培養基材１４を、吸引により回収することができる。
　細胞培養容器１と吸引ポンプ４０との接続は、選択細胞３００を吸引できるか、選択細胞３００が付着した、光により収縮した細胞培養基材１４を吸引できれば、いかなる接続方法でもよい。例えば、第３の実施形態に係る細胞培養容器１の上面へ接続して、培養液２０とともに、選択細胞３００を吸引する接続方法や、図６に示したように第４の実施形態に係る細胞培養容器１の貫通孔１２に接続して、貫通孔１２から、選択細胞３００が付着した、光により収縮した細胞培養基材１４を吸引する接続方法等が挙げられる。
　図９は、本実施形態の細胞培養容器１を用いた細胞の取得方法および生産方法の流れを示すフローチャートである。ステップＳ２００１において、細胞を含む培養液を細胞培養容器１に流し込む。培養液中の細胞の濃度が高い場合は、細胞を含む培養液を細胞培養容器１に流し込む前に、該培養液を培養液等により希釈してもよい。細胞培養容器１が複数のウェルを有する場合は、細胞培養容器のウェル当たり１個の細胞が配置されるように希釈してもよい。ステップＳ２００１が終了したら、ステップＳ２００３に進む。
　ステップＳ２００３において、細胞培養容器に充填した細胞培養基材１４の上面で細胞を培養する。ステップＳ２００３が終了したら、ステップＳ２００５に進む。ステップＳ２００５において、培養液を吸引除去する。培養液の除去後、細胞培養容器１内に充填された細胞培養基材１４の上面を洗浄してもよい。洗浄はＰＢＳ等を用いて行い、不要な浮遊物や沈殿物等が取り除かれる。ステップＳ２００５が終了したら、ステップＳ２００７に進む。
　ステップＳ２００７において、細胞培養基材１４の上面で培養された細胞３０の中から、取得する細胞３０（選択細胞３００）を選択する。必要に応じて、蛍光蛋白質が発現している細胞３０や、構造的特徴を持った細胞３０が選択される。ステップＳ２００７が終了したら、ステップＳ２００９に進む。ステップＳ２００９において、支持台７５の温度を適宜調節し、細胞培養容器１を細胞培養基材１４の全体的な変性が起きる温度未満の温度、例えば、３７℃以上４０℃未満に加熱する。細胞培養容器１の加熱は、細胞培養容器１を温度制御可能なインキュベーター内に配置することによって行ってもよい。レーザー光７の照射を行う前に細胞培養容器１の温度を上げることで、レーザー光７の照射時間を短くすることができ、選択細胞３００への細胞傷害性を低減することができる。
　なお、ステップＳ２００９とステップＳ２００７は順序を逆にしてもよい。いずれの場合も、ステップ２００９が終了してから次のステップ（ステップＳ２００７又はステップＳ２０１１）に進んでもよく、ステップＳ２００９を継続したまま、次のステップ以降を行ってもよい。
　ステップＳ２０１１において、選択細胞３００が付着している細胞培養基材１４中の収束位置に向けて細胞培養容器１の下側からレーザー光７を照射する。細胞培養容器１の下側からレーザー光７を照射することで、選択細胞３００に直接光が当たり細胞傷害を引き起こすことを避けることができる。レーザー光を照射することで、金微粒子層１３における金微粒子の発熱により、選択細胞３００近傍のゲル１５が変性して収縮し、選択細胞３００とゲルとの結合が弱まって選択細胞３００が細胞培養基材１４から剥離するか、細胞培養基材１４が細胞ごとウェル１１の壁面から剥離する。選択細胞３００、又は細胞培養基材１４がウェル１１の壁面から剥離したら、ステップＳ２０１３に進む。
　なお、複数の細胞を選択する場合は、ステップＳ２００７で複数の細胞を選択し、ステップＳ２００９で細胞培養容器１を加熱し、ステップＳ２０１１で選択された複数の細胞にレーザー光を照射すればよい。あるいは、まずステップＳ２００９を行って細胞培養容器１を加熱し、加熱を止めて、または加熱を継続したまま、ステップＳ２００７の細胞の選択とステップＳ２０１１のレーザー光の照射を、すべての選択細胞について光が照射されるまで繰り返し行ってもよい。
　ステップＳ２０１３において、細胞培養容器１上に培養液や緩衝液等の流体が十分に存在する場合にはそのままで、流体の量が不十分な場合には細胞培養容器１に培養液や緩衝液等の流体を流し入れることにより、選択細胞３００、又は細胞培養容器１のウェル１１の壁面から剥離した細胞培養基材１４が流体中に浮遊する。したがって、細胞培養容器１を傾けるか、吸引するなどして流体を回収することにより、選択細胞３００を回収することができる。選択細胞３００が細胞培養基材１４に付着している場合は、選択細胞３００を細胞培養基材１４ごと回収することができる。
　または、細胞培養容器１が複数のウェル１１を有しており、ウェル１１が底に貫通孔１２を有する場合は、ウェル１１の下方の貫通孔１２から、収縮した細胞培養基材１４を、吸引ポンプ等を用いた吸引により回収してもよい。ステップＳ２０１３が終了したら、ステップＳ２０１５に進む。
　ステップＳ２０１５において、ステップＳ２０１３で選択細胞３００が回収された場合は、回収した細胞３００をそのまま、他の培地等に配置して培養を行うことができ、ステップＳ２０１３で選択細胞３００が付着した細胞培養基材１４が回収された場合は、回収した選択細胞３００が付着した細胞培養基材１４を、コラゲナーゼ等を用いてゲルを溶解させ、細胞培養基材１４に付着した選択細胞３００を細胞培養基材１４から回収し、回収した選択細胞３００を、他の培地等に配置して培養を行うことができる。ステップＳ２０１５が終了したら、処理を終了する。なお、ステップＳ２０１３において、選択細胞３００を回収したら、ステップＳ２００７に戻って他の細胞３０を選択細胞３００として取得してもよい。また、回収した選択細胞は、そのまま臨床、研究、工業用等の様々な用途に使用してもよい。
　上述の実施の形態によれば、次の作用効果が得られる。
（１）本実施形態の細胞培養容器１は、加熱によって変性するゲル１５で形成されたゲル層と、前記ゲル層の一面に形成された金微粒子層１３と、を含む細胞培養基材１４が充填されている。この細胞培養容器１の前記一面側又は他面側で細胞を培養し、細胞培養基材１４に光を照射することにより、金微粒子をゲル１５に分散させた場合に比較して、高い効率で金微粒子を発熱させることができるので、選択した細胞３００を細胞培養基材１４から効率よく剥離させ、回収することができる。また、特に、ゲル層の下面に金微粒子層が形成されている場合、光照射で金微粒子が熱を発する場所が細胞から遠くなるので、熱による細胞毒性を低減させることができる。
（２）一実施形態の細胞培養容器１において、細胞培養容器１は複数のウェル１１を有している。細胞培養容器１の前記ウェルのそれぞれには、加熱により変性するゲル１５で形成されたゲル層と、前記ゲル層の一面に形成された金微粒子層１３と、を含む細胞培養基材１４が充填されている。この細胞培養容器１の上面で細胞を培養すると、金微粒子をゲル１５に分散させた場合に比較して、極めて短い時間、細胞培養基材１４に光を照射することにより、選択した細胞３００が付着している細胞培養基材１４が収縮し、該細胞培養基材１４をウェル１１から剥離させることができる。光により収縮した、選択した細胞３００が付着した細胞培養基材１４を吸引等により回収することにより、選択した細胞３００を細胞培養基材１４ごと回収することができる。このため、選択した細胞３００に障害を与えることなく、単位時間当たりの細胞回収数を多くすることができる。また、特に、ゲル層の下面に金微粒子層が形成されている場合、光照射で金微粒子が熱を発する場所が細胞から遠くなるので、熱による細胞毒性を低減させることができる。
（３）一実施形態の細胞培養容器１において、細胞培養容器１は複数のウェル１１を有し、ウェル１１は底を有している。これにより、培養液、緩衝液等の流体に、ウェル１１から剥離した細胞培養基材を浮遊させることができるので、細胞３００が付着した細胞培養基材１４を流体ごと回収することができる。
（４）一実施形態の細胞培養容器１において、細胞培養容器１は複数のウェル１１を有し、ウェル１１は細胞培養容器１の底に貫通孔１２を有する。これにより、細胞培養容器の底から貫通孔１２を通じて収縮した、選択細胞３００が付着した細胞培養基材１４を吸引ポンプ等により回収することができる。
（５）一実施形態の細胞培養容器は、細胞培養容器１は複数のウェル１１を有し、ウェル１１が１ウェル当たり約１個の細胞を配置できる径を有する。これにより、所望の細胞の回収が容易になる。
（６）一実施形態の細胞培養容器において、ゲル１５は、ゼラチンゲルまたはコラーゲンゲルである。これにより、製造、取扱い等が容易となる。
（７）一実施形態の細胞培養容器の製造方法は、加熱によって変性するゲル１５を細胞培養容器１に充填する工程と、前記ゲルの一面に金微粒子層１３を形成する工程と、を含む。細胞培養容器が、複数のウェルを有する場合、金微粒子を分散させた細胞培養基材の各ウェルへの充填は、通常、金微粒子を分散させたゲルを大きめの容器内で作製し、細胞培養容器を、当該ゲルに押し付けることにより行うが、このとき、作製したゲルを全てのウェルに充填するのは困難なため、ウェル外にはみ出した分、ゲルのロスが発生することになる。ゲルには金微粒子が分散されているので、ゲルのロスに伴い、金微粒子もロスが発生する。しかしながら、ゲルを細胞培養容器１に充填し、前記ゲルの一面に金微粒子層を形成することにより、金微粒子を分散させた細胞培養基材を細胞培養容器に充填する場合と比較して、金微粒子を無駄にすることなく、選択細胞３００を回収できる細胞培養容器を得ることができる。
（８）一実施形態の細胞培養容器の製造方法において、細胞培養容器１は複数のウェル１１を有し、ウェル１１のそれぞれに、前記ゲル１５を充填し、ゲル一面に金微粒子層１３を形成する。これにより、金微粒子を無駄にすることなく、選択細胞３００を回収できる細胞培養容器を得ることができる。
（９）一実施形態の細胞培養容器の製造方法は、ウェルを複数有する細胞培養容器１の前記ウェル内に金微粒子層１３を形成する工程と、前記金微粒子層１３の上に、加熱によって変性するゲル層を形成する工程と、を含む。これにより、金微粒子を無駄にすることなく、選択細胞３００を回収できる細胞培養容器を得ることができる。
（１０）一実施形態の細胞回収システムは、細胞培養容器１と細胞培養容器１に接続された吸引ポンプ４０と、を備える。これにより、選択細胞３００、又は選択細胞３００が付着した細胞培養基材１４を吸引ポンプ４０により吸引することができ、選択細胞３００、又は選択細胞３００が付着した細胞培養基材１４の回収が容易になる。
（１１）一実施形態の細胞の取得方法は、細胞培養容器１に配置された細胞から、取得する細胞３００を選択する工程と、選択された細胞３００の近傍の細胞培養基材１４に光を照射する工程と、選択された前記細胞を回収する工程と、を含む。これにより、選択細胞３００に障害を与えることなく、選択細胞３００を回収することができる。
（１２）一実施形態の細胞の取得方法は、細胞培養容器１のウェル１１のそれぞれに配置された細胞から、取得する細胞３００を選択する工程と、選択された細胞３００が配置されているウェル１１に充填された細胞培養基材１４に光を照射する工程と、細胞培養基材１４を取り出す工程と、細胞培養基材１４から細胞を回収する工程と、を含む。これにより、選択した細胞３００を、細胞培養基材１４ごと回収することができる。このため、細胞３００に障害を与えることなく、単位時間当たりの細胞回収数を多くすることができる。
（１３）一実施形態の細胞の取得方法において、ウェル１１に充填されている細胞培養基材１４を取り出す工程は、ウェル１１に充填されている細胞培養基材１４を吸引ポンプ等により吸引する工程である。これにより、選択細胞３００が付着した細胞培養基材１４を、吸引により回収することができ、選択細胞３００に障害を与えることなく回収することができる。
（１４）一実施形態の細胞の取得方法において、細胞培養基材１４を取り出す工程は、細胞培養容器１に培養液や緩衝液等の流体を流し入れる工程である。これにより、選択細胞３００が付着した細胞培養基材１４を、流体とともに回収することができ、選択細胞３００に障害を与えることなく回収することができる。
（１５）一実施形態の細胞の取得方法において、細胞培養基材１４から選択細胞３００を回収する工程は、コラゲナーゼを細胞培養基材１４に添加する工程である。これにより、細胞培養基材１４から、選択細胞３００に障害を与えることなく、回収することができる。
　本発明は上記実施形態の内容に限定されるものではない。本発明の技術的思想の範囲内で考えられるその他の態様も本発明の範囲内に含まれる。
　細胞としてＨｅＬａ細胞を用いて本実施形態の細胞の取得を行った。
（試薬調製）
・ＰＢＳ（－）
　ＮａＣｌ（４．００３ｇ）、ＫＣｌ（０．１００３ｇ）、ＫＨ２ＰＯ４（０．１００６ｇ）、ＮａＨ２ＰＯ４（０．５７５ｇ）をイオン交換水（５００ｍＬ）に溶かした後、オートクレーブで滅菌してＰＢＳ（－）を調製した。
・１０倍無機塩培地
　イオン交換水（１０ｍＬ）へＣａＣｌ２無水物（２０．２ｍｇ）、ＭｇＣｌ・６Ｈ２Ｏ（２３．５ｍｇ）、ＫＣｌ（４０．４ｍｇ）、ＮａＣｌ（６３９．７ｍｇ）、ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ（１４．１ｍｇ）を加えて溶解させて１０倍無機塩培地を調製した。
・再構成溶液
　ＮａＯＨ（０．０５Ｍ，１０ｍＬ）へＮａＨＣＯ３（２１９．７ｍｇ）、ＨＥＰＥＳ（４７７．１２ｍｇ）を加えて溶解させて再構成溶液を調製した。
・希塩酸
　０．０５ＭのＨＣｌ水溶液をｐＨメーター（堀場製作所社製、ｐＨ／ＣＯＮＤＭＥＴＥＲＤ－５４）を用いてｐＨ３．０に調整することで希塩酸（ｐＨ３．０）を作製した。ここで、１０倍無機塩培地、再構成溶液、希塩酸（ｐＨ３．０）はそれぞれフィルター（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製、孔径０．２０μｍ）を用いてフィルター滅菌した。
・濃縮金ナノ粒子（ＡｕＮＰ）溶液
　２ｍＬ（１ｍＬ×２）の、金ナノ粒子を成長させた溶液であるＧｒｏｗｔｈ溶液［Ｓ.　Ｙａｇｉ,　ｅｔ　ａｌ,　Ｊ　Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍ　Ｓｏｃ,　１５９,　Ｈ６６８　（２０１２）参照］を遠心管に入れ２５℃、回転数３０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。上澄み溶液（０．９ｍＬ×２）を除去し、超純水（０．３ｍＬ×２）を添加して、濃縮ＡｕＮＰ溶液（Ａｕ７５０μＭ）を作製した。
（コラーゲン溶液の作製）
　クリーンベンチ（昭和科学社製，Ｓ－１００１ＰＲＶ）内で、細胞培養基材［新田ゼラチン社製，Ｃｅｌｌｍａｔｒｉｘ（登録商標）Ｉ－Ａ，コラーゲン濃度０．３ｗｔ%，ｐＨ３．０，０．５６ｍＬ］へ希塩酸（０．４２ｍＬ）、１０倍無機塩培地（０．２０ｍＬ）、再構成溶液（０．２０ｍＬ）を氷冷下で、この順番で加えてコラーゲンゲル溶液（２．１ｍＬ）を調製した。
（井戸型マイクロアレイ（細胞培養容器）の作製）
　１０２０個の底を有するウェルが形成されたアクリル製のマイクロアレイを作製した。ウェルの径と深さは２００μｍ、隣接するウェルの中心間の距離が３３０μｍ、各ウェルの底からマイクロアレイの底までの距離を約８００μｍとした。マイクロアレイをエタノールで置換し、続いて純水で置換した。上記で調製した濃縮金ナノ粒子（ＡｕＮＰ）溶液を各ウェルの底に配置し、３７℃で一昼夜静置した。さらに、上記で作製したコラーゲン溶液を２００μＬで３回置換し、各ウェルをコラーゲンゲルで満たした。これを、ダイレクトヒートＣＯ２インキュベーター内で３７℃下、３０分間インキュベーションした。
（貫通穴型マイクロアレイ（細胞培養容器）の作製）
　１０２０個の底に貫通孔を有するウェルが形成されたアクリル製のマイクロアレイを作製した。ウェルと貫通孔の径は等しく２００μｍとし、ウェルの深さは２００μｍ、隣接するウェルの中心間の距離は３３０μｍとした。３５ｍｍ培養皿に上記で作製した包埋コラーゲン溶液を１．８ｍＬ加え、これを、ダイレクトヒートＣＯ２インキュベーター内で３７℃下、３０分間インキュベーションしゲルを作製した。次に、マイクロアレイの底面を上記のゲルに押しつけ、各ウェルをコラーゲンゲルで満たした。その後、コラーゲンゲル上に上記で調製した濃縮金ナノ粒子（ＡｕＮＰ）溶液を配置し、３７℃で一昼夜静置した。そして、マイクロアレイを反転させ、ゲルが露出している面を細胞培養面とした。
（細胞播種および剥離）
　作製した細胞培養容器にＤＭＥＭに分散させたＨｅＬａ細胞（６０００個／マイクロアレイ）を流し込み、３７℃で１日間培養した後、培地を吸引除去した。顕微鏡下、アルミシートを載せた３７℃サーモプレート上もしくは細胞培養チャンバー内で、スポット径が最小となるように設定し光照射した。
　光照射にはＰＡ（ｐｈｏｔｏａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）落射蛍光装置（ニコン社製，ＴＩ－ＰＡＵ）を経由してレーザー光源（シグマ光機社製，波長５３２ｎｍ，出力５０ｍＷ）を組み込み、波長５３２ｎｍの光透過性をもつミラーユニット（ニコン社製，ＴＲＩＴＣ）を設置したものを使用し、細胞は倒立型蛍光顕微鏡（ニコン社製,　ＥＣＬＩＰＳＥ　Ｔｉ－Ｕ）およびイメージングセンサー制御ソフトウェア（ＷＲＡＹＭＥＲ社製，ＷｒａｙＳｐｅｃｔ）を用いて蛍光/位相差観察および撮像を行った。観察は４倍、１０倍の対物レンズ（ニコン社製，Ｐｌａｎ－Ｆｌｕｏｒ）を用いて行った。
（結果）
　井戸型マイクロアレイでは、３０秒間の光照射でゲルが変性し、マイクロアレイから剥離した。ゲル内に金ナノ粒子を均一に分散・包埋させた場合は、ゲルの変性に６０秒間要したので（データ示さず）、本発明の細胞培養容器により、照射時間を２分の１に短縮できたことになる。
　貫通穴型マイクロアレイでは、ゲル内に金ナノ粒子を均一に分散・包埋させた場合は、８秒間の光照射でゲルが変性したが、熱に弱いＨｅＬａ細胞は１秒間の照射でも殺傷された（データ示さず）。一方、本発明の方法では、２秒間の光照射でゲルを変性させることができ、細胞も生存していた。
　１…細胞培養容器、７…レーザー光、１０…細胞培養容器本体、１１…ウェル、１２…貫通孔、１３…金微粒子層、１４…細胞培養基材、１５…ゲル、２０…培養液、３０…細胞、４０…吸引ポンプ、７０…顕微鏡、３００…選択細胞、１０００…細胞回収システム

Claims (18)

  1. 　加熱によって変性するゲルで形成されたゲル層と、前記ゲル層の一面に形成された金微粒子層と、を含む細胞培養基材が充填され、
    　前記細胞培養基材の前記一面側又は他面側で細胞が培養される、細胞培養容器。
  2. 　前記細胞培養容器が、複数のウェルを有する細胞培養容器であって、前記各ウェルのそれぞれに、前記細胞培養基材が充填されている、請求項１に記載の細胞培養容器。
  3. 　前記ウェルが底を有する請求項２に記載の細胞培養容器。
  4. 　前記ウェルが底に貫通孔を有する請求項２に記載の細胞培養容器。
  5. 　前記貫通孔の径は、前記ウェルの径と同一かそれより小さい、請求項４に記載の細胞培養容器。
  6. 　前記ウェルが１ウェル当たり約１細胞配置される径を有する請求項２～５のいずれか一項に記載の細胞培養容器。
  7. 　前記ウェルが、アレイ状に配置されている、請求項２～６のいずれか一項に記載の細胞培養容器。
  8. 　前記ゲルが、コラーゲンゲル又はゼラチンゲルである、請求項１～７のいずれか一項に記載の細胞培養容器。
  9. 　加熱によって変性するゲルを細胞培養容器に充填する工程と、
    　前記ゲルの一面に金微粒子層を形成する工程と、を含む、細胞培養容器の製造方法。
  10. 　前記細胞培養容器が、複数のウェルを有する細胞培養容器であって、
    　前記ゲルを細胞培養容器に充填する工程が、前記ゲルを前記ウェルのそれぞれに充填する工程である、請求項９に細胞培養容器の製造方法。
  11. 　前記ゲルの一面に前記金微粒子層を形成する工程は、金微粒子を含む溶液を前記ゲルの上に配置する工程と、
    　前記溶液中の液体成分を蒸発させる工程と、
    を含む、請求項９または１０に記載の細胞培養容器の製造方法。
  12. 　前記複数のウェルは底に貫通孔を有し、
    　前記ゲルの一面に金微粒子層を形成する工程は、
    　前記細胞培養容器の細胞培養面となる面を下にして、金微粒子を含む溶液を前記ゲルの上に配置する工程と、
    　前記溶液中の液体成分を蒸発させる工程と、
    　前記細胞培養容器を上下反転させる工程と、
    を含む、請求項１０に記載の細胞培養容器の製造方法。
  13. 　ウェルを複数有する細胞培養容器の前記ウェル内に金微粒子層を形成する工程と、
    　前記金微粒子層の上に、加熱によって変性するゲル層を形成する工程と、を含む、細胞培養容器の製造方法。
  14. 　請求項１～８のいずれか一項に記載の細胞培養容器と、吸引ポンプとを備える、細胞回収システム。
  15. 　請求項１～８のいずれか一項に記載の細胞培養容器に配置された細胞から、取得する細胞を選択する工程と、
    　選択された前記細胞の近傍の細胞培養基材に光を照射する工程と、
    　選択された前記細胞を回収する工程と、
    を含む、細胞の取得方法。
  16. 　請求項２～８のいずれか一項に記載の細胞培養容器の前記ウェルのそれぞれに配置された細胞から、取得する細胞を選択する工程と、
    　選択された前記細胞が配置されているウェルに充填された細胞培養基材に光を照射する工程と、
    　前記光を照射した細胞培養基材を前記細胞培養容器から取り出す工程と、
    　前記細胞培養容器から取り出した細胞培養基材から細胞を回収する工程と、を含む、細胞の取得方法。
  17. 　前記細胞培養基材を細胞培養容器から取り出す工程が、前記光を照射した細胞培養基材を吸引する工程である、請求項１６に記載の細胞の取得方法。
  18. 　前記細胞培養基材を細胞培養容器から取り出す工程が、前記光を照射したゲルを前記細胞培養容器中で液体に浮遊させ、該液体を回収する工程である、請求項１６に記載の細胞の取得方法。
PCT/JP2019/006495 2018-02-21 2019-02-21 細胞培養容器、細胞培養容器の製造方法、細胞回収システムおよび細胞の取得方法 WO2019163877A1 (ja)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP19757055.9A EP3757203A4 (en) 2018-02-21 2019-02-21 CELL CULTURE CONTAINER, METHOD FOR MAKING CELL CULTURE CONTAINER, CELL COLLECTION SYSTEM AND METHOD FOR OBTAINING CELLS
JP2020501026A JP7113440B2 (ja) 2018-02-21 2019-02-21 細胞培養容器、細胞培養容器の製造方法、細胞回収システムおよび細胞の取得方法
US16/996,797 US20210032580A1 (en) 2018-02-21 2020-08-18 Cell culture container, method for manufacturing cell culture container, cell recovery system and method for acquiring cells

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2018028921 2018-02-21
JP2018-028921 2018-02-21

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US16/996,797 Continuation US20210032580A1 (en) 2018-02-21 2020-08-18 Cell culture container, method for manufacturing cell culture container, cell recovery system and method for acquiring cells

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2019163877A1 true WO2019163877A1 (ja) 2019-08-29

Family

ID=67688390

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2019/006495 WO2019163877A1 (ja) 2018-02-21 2019-02-21 細胞培養容器、細胞培養容器の製造方法、細胞回収システムおよび細胞の取得方法

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20210032580A1 (ja)
EP (1) EP3757203A4 (ja)
JP (1) JP7113440B2 (ja)
WO (1) WO2019163877A1 (ja)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20200318053A1 (en) * 2017-10-03 2020-10-08 University Public Corporation Osaka Cell culture container, method for acquiring cells, and method for culturing cells

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH11349643A (ja) 1998-06-05 1999-12-21 Nitta Gelatin Inc 感温性高分子化合物およびその製造方法、感温性高分子組成物、細胞培養基材
JP2012039947A (ja) * 2010-08-19 2012-03-01 Osaka Prefecture Univ 細胞培養用基材
JP2013233101A (ja) 2012-05-08 2013-11-21 Osaka Prefecture Univ 細胞培養用基材および細胞の取得方法
JP2017000113A (ja) * 2015-06-12 2017-01-05 アイシン精機株式会社 細胞培養・分離用基材、細胞培養・分離用基材を用いた細胞の取得方法、細胞培養・分離用基材を作製するための金微粒子分散液、及び細胞培養・分離用基材作製用キット
WO2018003443A1 (ja) * 2016-06-27 2018-01-04 公立大学法人大阪府立大学 伝熱プレート、ウェルプレートユニット、及び、細胞剥離装置
JP2018028921A (ja) 2011-03-14 2018-02-22 株式会社ニコン 電子機器およびプログラム
WO2018131661A1 (ja) * 2017-01-12 2018-07-19 株式会社ニコン 細胞培養基材、培養容器、細胞培養容器の製造方法、細胞の取得方法、細胞の培養方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6428811B1 (en) * 1998-03-11 2002-08-06 Wm. Marsh Rice University Temperature-sensitive polymer/nanoshell composites for photothermally modulated drug delivery

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH11349643A (ja) 1998-06-05 1999-12-21 Nitta Gelatin Inc 感温性高分子化合物およびその製造方法、感温性高分子組成物、細胞培養基材
JP2012039947A (ja) * 2010-08-19 2012-03-01 Osaka Prefecture Univ 細胞培養用基材
JP2018028921A (ja) 2011-03-14 2018-02-22 株式会社ニコン 電子機器およびプログラム
JP2013233101A (ja) 2012-05-08 2013-11-21 Osaka Prefecture Univ 細胞培養用基材および細胞の取得方法
JP2017000113A (ja) * 2015-06-12 2017-01-05 アイシン精機株式会社 細胞培養・分離用基材、細胞培養・分離用基材を用いた細胞の取得方法、細胞培養・分離用基材を作製するための金微粒子分散液、及び細胞培養・分離用基材作製用キット
WO2018003443A1 (ja) * 2016-06-27 2018-01-04 公立大学法人大阪府立大学 伝熱プレート、ウェルプレートユニット、及び、細胞剥離装置
WO2018131661A1 (ja) * 2017-01-12 2018-07-19 株式会社ニコン 細胞培養基材、培養容器、細胞培養容器の製造方法、細胞の取得方法、細胞の培養方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KOJIMA C. ET AL.: "Visible Laser -Induced In Situ Cell Detachment from Gold Nanoparticle-Embedded Collagen Gel", MACROMOLECULAR BIOSCIENCE, vol. 17, no. 1600341, 2017, pages 1 - 4, XP055450579, doi:10.1002/mabi.201600341 *
S. YAGI ET AL., J ELECTROCHEM SOC, vol. 159, 2012, pages H668
See also references of EP3757203A4

Also Published As

Publication number Publication date
US20210032580A1 (en) 2021-02-04
JP7113440B2 (ja) 2022-08-05
JPWO2019163877A1 (ja) 2021-02-12
EP3757203A4 (en) 2022-01-12
EP3757203A1 (en) 2020-12-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2018131661A1 (ja) 細胞培養基材、培養容器、細胞培養容器の製造方法、細胞の取得方法、細胞の培養方法
Guillemot et al. High-throughput laser printing of cells and biomaterials for tissue engineering
Berthing et al. Intact mammalian cell function on semiconductor nanowire arrays: New perspectives for cell‐based biosensing
JP4029987B2 (ja) 結晶核の製造方法および結晶化条件スクリーニング方法
US20180010149A1 (en) Plasmonic nanocavity-based cell therapy method and system
Sima et al. Fibronectin layers by matrix-assisted pulsed laser evaporation from saline buffer-based cryogenic targets
CN102565057B (zh) 一种基于左手材料的光镊
Okolo et al. Sample preparation strategies for efficient correlation of 3D SIM and soft X-ray tomography data at cryogenic temperatures
US20120329123A1 (en) Method for detaching cultured cells, cell detachment device used in said method for detaching cultured cells, and incubator
Sochacki et al. Correlative fluorescence super-resolution localization microscopy and platinum replica EM on unroofed cells
JP7489054B2 (ja) 細胞の取得方法、および細胞の培養方法
WO2019163877A1 (ja) 細胞培養容器、細胞培養容器の製造方法、細胞回収システムおよび細胞の取得方法
US12007317B2 (en) Microscopic object collection system and microscopic object collection method
JP4681279B2 (ja) 細胞外物質の細胞内への導入方法
Wang et al. Effects of Superimposed Micro/Nano‐Structured Titanium Alloy Surface on Cellular Behaviors In Vitro
Umemura et al. Diatom cells grown and baked on a functionalized mica surface
WO2019069979A1 (ja) 細胞培養容器、細胞回収システム、細胞の取得方法および細胞の培養方法
US20210340482A1 (en) Cell culture tool and method for producing cell culture tool
JPWO2006104048A1 (ja) 微小粒子の配置方法
JP2005232238A (ja) ３次元多孔質構造体とその製造方法
Nishiyama et al. Fabrication of 3D cell supporting structures with multi-materials using the bio-printer
JP5736118B2 (ja) 珪藻凝集膜の製造方法
JP6374187B2 (ja) 細胞内への外来物質の導入方法
Cox-Muranami et al. Large area magnetic micropallet arrays for cell colony sorting
JP2023067487A (ja) 細胞の観察または培養用の板状基体、および細胞の観察または培養用の板状基体の作製方法

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 19757055

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2020501026

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2019757055

Country of ref document: EP

Effective date: 20200921