WO2019069931A1 - 細胞培養容器、細胞の取得方法、および細胞の培養方法 - Google Patents

細胞培養容器、細胞の取得方法、および細胞の培養方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2019069931A1
WO2019069931A1 PCT/JP2018/036897 JP2018036897W WO2019069931A1 WO 2019069931 A1 WO2019069931 A1 WO 2019069931A1 JP 2018036897 W JP2018036897 W JP 2018036897W WO 2019069931 A1 WO2019069931 A1 WO 2019069931A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cells
cell culture
gel
cell
culture vessel
Prior art date
Application number
PCT/JP2018/036897
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
千恵 児島
清水　達也
裕次 原口
武志 川野
瀧　優介
楓 横山
Original Assignee
公立大学法人大阪府立大学
学校法人東京女子医科大学
株式会社ニコン
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 公立大学法人大阪府立大学, 学校法人東京女子医科大学, 株式会社ニコン filed Critical 公立大学法人大阪府立大学
Priority to US16/652,660 priority Critical patent/US20200318053A1/en
Priority to JP2019546738A priority patent/JP7489054B2/ja
Priority to EP18864955.2A priority patent/EP3693452A4/en
Publication of WO2019069931A1 publication Critical patent/WO2019069931A1/ja

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/20—Material Coatings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
    • C12M25/02—Membranes; Filters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M31/00—Means for providing, directing, scattering or concentrating light
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M31/00—Means for providing, directing, scattering or concentrating light
    • C12M31/02—Means for providing, directing, scattering or concentrating light located outside the reactor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M33/00—Means for introduction, transport, positioning, extraction, harvesting, peeling or sampling of biological material in or from the apparatus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/12—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/30—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration
    • C12M41/36—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration of biomass, e.g. colony counters or by turbidity measurements
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M47/00—Means for after-treatment of the produced biomass or of the fermentation or metabolic products, e.g. storage of biomass
    • C12M47/04—Cell isolation or sorting
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0657—Cardiomyocytes; Heart cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/50—Proteins
    • C12N2533/54—Collagen; Gelatin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2539/00—Supports and/or coatings for cell culture characterised by properties
    • C12N2539/10—Coating allowing for selective detachment of cells, e.g. thermoreactive coating

Definitions

  • the present invention relates to a cell culture vessel, a method for obtaining cells, and a method for culturing cells.
  • a cell culture vessel a method for obtaining cells
  • a method for culturing cells a method for culturing cells.
  • the cell culture vessel comprises an inlet for injecting a fluid, an outlet for discharging a fluid, and a gel which connects the inlet and the outlet and is denatured by heating. And a channel for storing a cell culture substrate in which gold microparticles are dispersed.
  • a method of obtaining cells comprises the steps of selecting cells to be obtained from the cells cultured in the cell culture vessel of the first aspect, and the gel in the vicinity of the selected cells. Irradiating light, flowing the liquid through the flow path of the cell culture vessel, and recovering cells from the outlet of the cell culture vessel.
  • a method of culturing cells is culturing the cells obtained by the method of obtaining cells of the third aspect.
  • FIG. 1 is a cross-sectional view of a cell culture vessel of one embodiment. It is a conceptual diagram which shows the structure of the cell acquisition system containing the cell culture container of one Embodiment. It is a conceptual diagram which shows the structure of the cell culture container of one Embodiment. BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS It is the figure which showed typically the operation before peeling the cell of the object after culture
  • the present inventors place the cell culture substrate in the channel, and external light causes local temperature change to the cell culture substrate to weaken the adhesion of the desired cells to the cell culture substrate. After that, it was found that only the desired cells can be efficiently recovered by flowing the liquid in the flow channel, detaching the cells by the shear stress of the liquid, and collecting the cells together with the liquid.
  • the cell culture container of the present embodiment includes an inlet for injecting a fluid and an outlet for discharging a fluid, and the cell culture substrate is housed in a flow path connecting the inlet and the outlet. A fluid can be flowed into the cell culture vessel to collect the detached cells collectively.
  • FIG. 1 is a cross-sectional view of the cell culture vessel 1 of the present embodiment.
  • the cell culture vessel 1 includes an inlet 21 for injecting a fluid, an outlet 22 for discharging a fluid, and a flow path 23 connecting the inlet and the outlet.
  • the channel 23 contains a cell culture substrate 14 in which gold microparticles are dispersed in a gel 15 denatured by heating.
  • the gold particles 13 schematically show the minute volume elements 19 inside the gel 15 in an enlarged manner.
  • Fluid refers to liquid or gas.
  • the liquid for example, various culture solutions and buffers are selected and used according to the type of cells, and as the gas, for example, air is used.
  • the gold fine particles 13 can be particles with high size of light-to-heat conversion characteristics, and in particular, may be large enough to cause surface plasmon resonance (SPR).
  • the volume average diameter of the gold fine particles 13 measured using a laser diffraction type particle size distribution measuring apparatus can be, for example, 1 nm or more and less than 200 nm, 10 nm or more and less than 100 nm, and 30 nm or more and less than 70 nm.
  • the concentration of the gold fine particles 13 in the gel 15 may be, for example, 100 ⁇ M or more and less than 1000 ⁇ M, or 250 ⁇ M or more and 500 ⁇ M or less.
  • the gold particles 13 may be further stabilized in the gel using a protective agent, such as being encapsulated in a dendrimer or modified with a molecule having an affinity to the gel.
  • the gel 15 denatures when the temperature rises from room temperature to a predetermined temperature.
  • “denaturation” means that the gel 15 causes a change in structure that causes easy detachment of cells due to temperature increase.
  • “denaturation” includes, for example, solification, aggregation, depolymerization, and the like which are states brought about by changes in secondary or tertiary structure of collagen protein.
  • the temperature at which the gel 15 is denatured is, for example, 60 ° C. or less, 50 ° C. or less, 40 ° C. or less.
  • the material of the gel 15 is not particularly limited as long as it makes it possible to obtain cells by exfoliation described later, and may be, for example, a collagen gel or a gelatin gel. A gel obtained by mixing two or more types of polymers can also be used.
  • At least one of the bottom portion 32 and the top portion 31 of the cell culture vessel 1 is formed of a light transmissive material.
  • Cell culture container 1 may be configured in any shape as long as the technical features of cell culture container 1 of the present embodiment are not impaired.
  • the material of the bottom portion 32 and the top portion 31 of the cell culture vessel 1 may have oxygen permeability. Examples thereof include oxygen-permeable polymer resins such as acrylic and polystyrene. By having oxygen permeability, it is possible to supply oxygen necessary for culturing the cell 50 from the outside.
  • FIG. 2 is a conceptual view showing a cell collection system 1000 for acquiring cells using a cell culture vessel.
  • the cell acquisition system 1000 includes a cell culture vessel 1 and an inverted microscope 70.
  • cells 50 are cultured in the culture solution 51 on the mounting surface 11 of the cell culture substrate 14.
  • cells desired to be isolated and obtained are selected cells 500, and other cells are selected non-selected cells 501.
  • the form of the selected cell 500 is not particularly limited.
  • a cell whose characteristics are appropriately displayed by discrimination means such as a reporter gene or the like by appropriately modifying the gene or the like, or initialization or differentiation is induced to discriminate structurally Examples include cells having possible characteristics.
  • the selected cell 500 may be a single cell 50 as described above, or may be a plurality of cells 50 or a colony including the plurality of cells 50.
  • the inverted microscope 70 includes an irradiation unit 71, a dichroic mirror 72, a lens system 73, an observation unit 74, and a support 75.
  • the cell recovery system 1000 may be constructed using an upright microscope.
  • the irradiation unit 71 emits a laser beam.
  • the wavelength of the laser light emitted from the irradiation unit 71 is set to a wavelength range in which the gold fine particles 13 exhibit the light-heat conversion characteristics. In particular, it may be set to a wavelength range where surface plasmon resonance absorption (SPR) occurs.
  • SPR surface plasmon resonance absorption
  • the laser beam irradiated to the gel 15 may be one having a wavelength and energy which will not cause serious damage when the cells are irradiated.
  • the wavelength of the laser beam emitted from the irradiation unit 71 is set to, for example, 400 nm or more and less than 1200 nm, 450 nm or more and less than 900 nm, 532 nm or the like.
  • the output of the laser beam incident on the cell culture vessel 1 can be, for example, 0.1 mW or more and less than 1000 mW, or 0.4 mW or more and less than 100 mW.
  • the wavelength and energy of the laser light are appropriately adjusted so that the gel 15 is efficiently heated and denatured without damaging the cells.
  • the light emitted from the irradiation unit 71 is incident on the dichroic mirror 72.
  • the emission light of the irradiation unit 71 is not particularly limited to the laser light as long as the vicinity of the selected cell 500 can be selectively irradiated, and may be monochromatic light that is not coherent or light consisting of light in a certain wavelength range.
  • the dichroic mirror 72 reflects the laser light from the irradiation unit 71, transmits the visible light from the cell culture vessel 1, and emits the visible light to the observation unit 74.
  • the direction of the laser beam reflected by the dichroic mirror 72 is adjusted so that the laser beam is irradiated to an appropriate position by a galvano mirror (not shown) or the like, passes through the lens system 73, and enters the cell culture vessel 1 Do.
  • the laser light incident on the cell culture vessel 1 passes through the bottom portion 32 of the cell culture vessel 1 and the cell culture substrate 14, and then converges in the cell culture substrate 14 at a predetermined position in the vicinity of the selected cell 500.
  • the converging laser beam 7 is schematically shown using a dashed dotted line.
  • the configuration of the irradiation optical system of the laser beam 7 is not particularly limited as long as the laser beam 7 can be converged to a desired position.
  • the laser beam may be converged in the vicinity of the selected cell 500 by fixing the irradiation position of the laser beam and moving the support 75.
  • the convergence position of the laser beam 7 in the cell culture substrate 14 can be, for example, a position as close as possible to the lower side of the selected cell 500 without damaging the selected cell 500, and the spot diameter of the laser beam 7, PSF (Point It is determined based on parameters based on Spread Function) and PSF.
  • the convergence position of the laser light 7 in the cell culture substrate 14 can be, for example, a range directly below the selected cell 500 and having a depth of less than 100 ⁇ m, or a range less than 100 ⁇ m in radius from the selected cell 500.
  • the selected cell 500 may be set as the convergence position.
  • the gold particles 13 photothermally convert the laser light 7 from the irradiation unit 71 and the gel near the convergence position of the laser light 7 is denatured, the physical or chemical of the gel forming the scaffold of the selected cell 500 or the surrounding environment As the target characteristics change, the adhesion of the selected cells 500 to the mounting surface 11 is weakened. Therefore, only the selected cells 500 can be detached from the gel and taken out by flowing the liquid through the flow path 15.
  • the liquid storage tank and the inlet 21 are directly or indirectly connected by a tube or the like, and the liquid is sent from the inlet 21 using a pump or suctioned from the outlet 22. Thus, the liquid can flow in the flow path 15.
  • the selected cells 500 separated from the gel by the shear stress of the liquid are flushed to the outlet 22 by the liquid, so that the liquid can be recovered together with the liquid.
  • the observation unit 74 includes an eyepiece or the like, and allows the user to observe visible light from the cell culture vessel 1 illuminated by illumination (not shown). The user can see the visible light from the cell culture container 1 and move the support 75 to align the cell culture container 1 appropriately.
  • the image of the cell culture vessel 1 may be acquired by performing laser scanning using a laser light source different from the irradiation optical system of the laser light 7 and a galvano mirror, and may be displayed on a display device (not shown).
  • the support 75 supports the cell culture vessel 1.
  • the support stand 75 can be moved in each direction of XYZ by a moving mechanism (not shown), whereby the cell culture vessel 1 can be adjusted to any position.
  • the support base 75 includes, for example, a glass on which a transparent heating element is formed, and transmits the laser beam 7 to the bottom portion 32 of the cell culture vessel 1 and controls the temperature of the entire cell culture vessel 1. Note that, depending on the size, the structure, and the like of the cell culture vessel 1, it is also possible to use a support 75 in which an opening is formed in a portion to be an optical path of the laser beam 7.
  • the cell culture substrate 14 of the present embodiment may be a stack of a plurality of gels with different concentrations of gold microparticles.
  • the cell culture substrate 14 may have a gel layer not containing gold particles or containing a lower concentration than that of the gel 15 under the gel 15 containing gold particles.
  • the thickness of the heat generating layer gel 15 becomes substantially uniform in the plane. This facilitates adjustment of the irradiation conditions of the laser beam 7 and facilitates the isolation of cells even when the irradiation site is changed.
  • FIG. 3 shows a cross-sectional view of the XZ plane of the cell culture vessel 1.
  • the thickness of the gel 15 can be, for example, 0.4 mm or more, 0.5 mm or more, and 1.7 mm or less, or 0.5 mm or more, and 1.2 mm or less. If the thickness of the gel 15 is too thin, it tends to be difficult to make the gel 15 uniformly or flat. On the other hand, when the thickness of the gel 15 is too thick, the amount of the culture solution which fills the flow path 23 decreases, and the culture of the cells tends to be difficult.
  • the light reaching the gel 15 may be attenuated, and the calorific value of the gold fine particles 13 in the vicinity of the cells 50 may be reduced, which may make it difficult to obtain the cells 50.
  • the thickness of the gel 15 refers to the average of the thickness from the surface of the bottom portion 32 of the cell culture vessel 1.
  • the gel 15 may be warmed before being irradiated with the laser beam 7.
  • the time for irradiating the laser light to denature the gel can be shortened, and the influence of the laser light on the selected cells 500 can also be reduced.
  • the method of injecting the liquid (for example, culture solution) of the temperature below 40 degreeC is mentioned.
  • a heating element of the support table 75 may be used, the cell culture vessel 1 may be placed on a temperature-controllable incubator, or two or more of these methods may be used in combination. .
  • the liquid 51 in the flow path 23 is irradiated with the laser light 7, it tends to suppress the rise of the gel surface temperature in the vicinity of the selected cells 500 and lower the efficiency of the separation of the selected cells. Therefore, the liquid 51 may be removed from the outlet 22 by injecting air into the inlet 21 or sucking the liquid from the outlet 22 before irradiating the laser light 7. The removal of the liquid 51 may not be complete, and some of the liquid may remain in the flow channel 23.
  • the liquid 51 may be removed to such an extent that the liquid is 0.1 mm to 0.8 mm from the mounting surface 11 of the gel 14.
  • the interface between the gas and the liquid passes through the mounting surface 11 of the gel 14 when flowing the liquid in the flow path 23 after the laser irradiation, so a large shear stress is caused by the selected cell 500. It is also possible to obtain an effect that it is easy to peel off.
  • FIG. 5 is a view schematically showing an operation of irradiating the target cells with the laser light 7.
  • FIG. 6 is a view schematically showing an operation after the target cells are irradiated with the laser light 7.
  • the selected cells 500 whose adhesion to the mounting surface 11 is weakened by the laser light 7 are separated from the mounting surface 11 by the shear stress of the liquid by flowing the liquid in the flow path 15, and are washed away to the discharge port 22 by the liquid.
  • the liquid can be collected from the outlet 22 together.
  • a person skilled in the art can appropriately determine the flow rate of the liquid in the flow path 15.
  • FIG. 7 is a flowchart showing a flow of a method of manufacturing the cell culture vessel 1 of the present embodiment.
  • step S1001 a solution containing gold microparticles 13 having a predetermined volume average diameter is prepared.
  • a seed core made of gold in the presence of a reducing agent (ascorbic acid, hydroquinone, citric acid, etc.) in a solution containing gold ions (HAuCl4, etc.)
  • a solution containing gold ions HuCl4, etc.
  • the volume average diameter of the gold fine particles 13 can be measured with the adjusted gold fine particles 13 using a laser diffraction type particle size distribution measuring apparatus. In the case of simple measurement without using a particle size distribution measuring apparatus, it can be imaged by using a transmission electron microscope and measured and calculated using analysis software or the like.
  • step S1003 a mixed solution containing collagen and gold microparticles 13 is prepared using the solution containing gold microparticles 13 prepared in step S1001, added onto the bottom plate 32 of the cell culture vessel 1, and allowed to stand. When the mixed solution hardens, the gold microparticles 13 are dispersed and embedded in the collagen gel. When step S1003 ends, the process proceeds to step S1005.
  • step S1005 the upper plate 31 is placed on the gel layer formed on the bottom plate 32 of the cell culture vessel 1 so that the flow path 23 is formed.
  • the height of the flow path 23 varies depending on the thickness of the gel layer, but is, for example, 0.2 mm or more and 2.0 mm or less, 0.5 or more and 1.5 mm or less, or 0.8 mm or more and 1.2 mm or less from the gel surface be able to.
  • FIG. 8 is a flow chart showing the flow of a method of obtaining and producing cells using the cell culture vessel 1 of the present embodiment.
  • step S2001 cells are cultured on the surface of the cell culture substrate 14, ie, the mounting surface 11.
  • step S2003 the process proceeds to step S2003.
  • step S2003 the temperature of the support 75 is appropriately adjusted, and the cell culture vessel 1 is heated to a temperature lower than the temperature at which the gel 15 is totally denatured.
  • the irradiation time of the laser light 7 can be shortened, and the cytotoxicity to the selected cells 500 can be reduced.
  • step S2005 a liquid (for example, a culture solution) 51 heated to a temperature lower than a temperature at which the overall denaturation of the gel 15 occurs is injected.
  • a liquid 51 heated to a temperature lower than a temperature at which the overall denaturation of the gel 15 occurs is injected.
  • the irradiation time of the laser light 7 can be shortened, and the influence on the selected cells 500 can be reduced.
  • step 2005 ends, the process proceeds to step 2007. Note that the order of step S2003 and step S2005 may be appropriately reversed, and operations may be performed in parallel.
  • step S2007 the liquid 51 in the cell culture vessel 1 is removed from the flow path 23.
  • the removal of the liquid 51 is carried out by injecting air from the inlet 21 of the cell culture vessel 1 or by suctioning the liquid 51 from the outlet 22.
  • step S2007 ends, the process proceeds to step S2009.
  • step S2009 the cells 50 (selected cells 500) to be obtained are selected from the cells 50 cultured on the mounting surface 11. As necessary, cells 50 expressing a fluorescent protein and cells 50 having structural characteristics are selected.
  • the order from step S2005 to step S2009 may be changed.
  • the heated liquid 51 may be injected to select the cells 50, and then the liquid 51 may be removed, or the cells 50 are selected and then the heated liquid 51 is injected to remove the liquid 51. It is also good.
  • step S2011 the laser light 7 is irradiated toward the convergence position in the vicinity of the selected cell 500 in the gel 15.
  • the laser light 7 By irradiating the laser light 7 from the side opposite to the mounting surface 11 of the gel 15, it is possible to avoid direct light hitting the cells 50 and causing cell damage.
  • the denaturation of the gel weakens the bond between the selected cell 500 and the mounting surface 11.
  • step S2011 ends, the process proceeds to step S2013. If there are a plurality of selected cells 500 to be collected together, step S2009 and step S2011 are repeated a plurality of times, and if all selected cells 500 have been subjected to step S2011, the process proceeds to step S2013.
  • step S2009 for selecting cells is performed before step S2005 for injecting a heated culture solution and step S2007 for removing the culture solution, if there are a plurality of selected cells 500, step S2009 is performed. After all the cells have been selected several times, step S2005 and step S2007 may be performed, and then step 2011 may be repeated to irradiate all selected cells 500 with a laser.
  • step S2013 the selected cells 500 are exfoliated from the mounting surface 11 of the gel 15 by the shear stress of the liquid by causing the liquid to flow in the flow path 23 of the cell culture vessel 1, and then flow to the discharge port 22. Are collected from the outlet 22. In step 2015, the collected selected cells 500 can be placed in another medium or the like to perform culture. When step S2015 ends, the process ends. If the selected cell 500 is recovered in step S2013, the process may return to step S2003 to acquire another cell 50 as the selected cell 500. In addition, the selected cells recovered may be used as they are in various applications such as clinical, research and industrial applications.
  • the cell culture vessel 1 of the present embodiment connects the inlet for injecting the fluid, the outlet for discharging the fluid, the inlet and the outlet, and gold microparticles in the gel denatured by heating. And a channel for containing the dispersed cell culture substrate. As a result, by flowing the liquid through the flow channel, it is possible to collect only selected cells collectively and to increase the number of collected cells per unit time.
  • the method of obtaining cells of the present embodiment comprises the steps of selecting cells to be obtained from the cells cultured in the cell culture vessel of the first aspect, and applying light to the gel in the vicinity of the selected cells. And irradiating the liquid flow path of the cell culture vessel, and collecting cells from the outlet of the cell culture vessel. Thereby, the selected cells can be recovered by the running flow generated in the flow path, and the number of cells recovered per unit time can be increased.
  • the cells of the present embodiment were obtained using cardiomyocytes differentiated from iPS cells using iPS cells.
  • Reconstitution solution A solution of NaHCO 3 (219.7 mg) and HEPES (477.12 mg) was added to and dissolved in NaOH (0.05 M, 10 mL) to prepare a reconstitution solution.
  • Diluted hydrochloric acid (pH 3.0) was prepared by adjusting an aqueous solution of 0.05 M HCl to pH 3.0 using a pH meter (pH / CONDMETER D-54, manufactured by Horiba, Ltd.).
  • pH meter pH meter
  • -Centrifugation of Growth solution S.
  • the volume average diameter of the gold nanoparticles is obtained by imaging the adjusted gold nanoparticles using a transmission electron microscope (JEM-2000F manufactured by JEOL Ltd., acceleration voltage 200 kV) and analysis software (manufactured by Kenith Co., Photomeasure (registered trademark) ) was measured and calculated.
  • Human iPS cells were differentiated into cardiomyocytes in a suspension culture system using a bioreactor according to the literature (Biochem Biophys Res Commun, 425; 321: 2012).
  • human iPS cells adhere to each other without adhering to the inner surface of the bioreactor, and proliferate while forming spherical cell aggregates (embryoid bodies).
  • the embryoid body the above-described cardiomyocyte differentiation proceeds, and an embryoid body containing an independently pulsing cardiomyocyte appears. Cardiomyocyte differentiation was performed for 17 days using this floating culture bioreactor. Seventeen days after differentiation, the embryoid bodies were dispersed to carry out treatment with enzymes etc.
  • Single cells were obtained using a mild treatment method (treated with trypsin / EDTA at a concentration of one-fifth the concentration normally used for cell passaging) to avoid cardiomyocyte injury. By using this method, it was possible to obtain single cells with good reproducibility every time.
  • the cardiomyocytes (6000 cells / well) dispersed in Dumbecco's modified Eagle's medium (DMEM) (containing 10% fetal calf serum and 1% penicillin-streptomycin), usually in animal cell culture medium, into the flow path from the inlet The mixture was poured and cultured at 37 ° C. for 4 days.
  • DMEM Dumbecco's modified Eagle's medium
  • the culture chip was transferred to a heat retention chamber (compact chamber for cell culture C-150AW; manufactured by OO) kept at 37 ° C.
  • tubes were installed at the inlet and outlet of the culture chip, and then the culture solution heated to 40 ° C. was injected using a syringe.
  • air was injected to remove the culture solution from the outlet.
  • the above-mentioned incubation chamber is placed on a support of a microscope, the beating myocardium is detected under a microscope, and the myocardium cells are set so as to minimize the spot diameter, and light irradiation is performed. Obtained.
  • an air-free cell exfoliation chip was obtained in the same manner as described above except that light was irradiated while leaving the culture solution without injecting air.
  • a light stimulator (Ti-LAPP FRAP module) was attached to a motorized Ti-E microscope.
  • the laser was introduced into the light stimulation device by a fiber, and could be driven independently of the observation optical system in the XYZ axis direction.
  • the microscope is covered with a heat retention box, and the chip is surrounded by a small incubator (C150-HA Blast Co., Ltd.) to form a double heat retention structure.
  • the culture solution was introduced into the chip after the culture solution contained in a 50 mL centrifuge tube was sent by a diaphragm pump through a tube to a block heater and preheated.
  • the tube was connected to a flow meter / thermometer (SLI-2000 Sensirion Co., Ltd.) to monitor the flow rate and the temperature of the culture solution.
  • the tube was connected to the tip after the flow meter / thermometer and to the recovery / waste container after the tip.
  • the air was injected by inserting a needle into a tube between the tip and the flow meter / thermometer, from which air was introduced by a syringe.
  • the observation was performed using an objective lens (Plan-Fluor, manufactured by Nikon Corporation) at 4 ⁇ and 10 ⁇ . Light irradiation was performed 5 times for 2.0 seconds at intervals of 1.0 seconds.
  • the procedure of cell detachment was as follows. First, target cardiac muscle cells are visually detected by 10 ⁇ phase contrast observation. Next, about 50 to 100 ⁇ L of air (about the extent that the channel is filled with air) was injected to remove the culture solution from the channel. Then, the filter was changed to one for laser irradiation, and the laser was irradiated for about 2 seconds to 20 seconds. The irradiation time is adjusted by the laser power. After the laser irradiation, the culture solution was flowed through the flow channel by suctioning from the discharge port or by feeding the culture solution from the injection port, and an external force was applied to the cardiomyocytes to separate.
  • the culture solution kept at 40 ° C. was injected from the injection port of the culture chip at a flow rate of 5 ml / min using a syringe, and the detached cells were collected from the tube placed at the discharge port.
  • cardiomyocytes obtained from the collected culture solution have a beat and that the method of the present invention can be recovered without damaging the cells.
  • the culture solution was removed before light irradiation, there was a tendency that the probability that target cells could be detached and recovered was higher than when not removed.
  • the efficiency of acquiring selected cells can be increased by removing the culture solution by displacing air before light irradiation.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Thermal Sciences (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

流体を注入する注入口（２１）と、流体を排出する排出口（２２）と、前記注入口と前記排出口とを結び、且つ、加熱によって変性するゲル中に金微粒子（１３）を分散させてなる細胞培養基材（１４）を収納する流路（２３）と、を備える細胞培養容器。該細胞培養容器で培養された細胞から、取得する細胞を選択する工程と、前記選択された細胞の近傍の前記ゲルに光を照射する工程と、前記細胞培養容器の前記流路に液体を流す工程と、 前記細胞培養容器の前記排出口から細胞を回収する工程と、を含む細胞の取得方法。

Description

細胞培養容器、細胞の取得方法、および細胞の培養方法
　本発明は、細胞培養容器、細胞の取得方法、および細胞の培養方法に関する。
　本願は、２０１７年１０月３日に、日本に出願された特願２０１７－１９３５８４号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　培養基材で培養された細胞をより効率的に回収するため、例えば、感温性高分子を含む 培養基材の上で細胞を培養し、温度変化を利用して細胞の回収を行う方法が提案されている（特許文献１参照）。
特開平１１－３４９６４３号公報
　本発明の第１の態様によると、細胞培養容器は、流体を注入する注入口と、流体を排出する排出口と、前記注入口と前記排出口とを結び、且つ、加熱によって変性するゲル中に金微粒子を分散させてなる細胞培養基材を収納する流路と、を備える。
　本発明の第２の態様によると、細胞の取得方法は、第１の態様の細胞培養容器で培養された細胞から、取得する細胞を選択する工程と、前記選択された細胞の近傍の前記ゲルに光を照射する工程と、前記細胞培養容器の前記流路に液体を流す工程と、前記細胞培養容器の前記排出口から細胞を回収する工程と、を含む。
　本発明の第３の態様によると、細胞の培養方法は、第３の態様の細胞の取得方法により 取得した細胞を培養する。
一実施形態の細胞培養容器の断面図である。 一実施形態の細胞培養容器を含む細胞取得システムの構成を示す概念図である。 一実施形態の細胞培養容器の構成を示す概念図である。 一実施形態の細胞培養容器を用いて、細胞を培養した後に、目的の細胞を剥離する前の操作を模式的に示した図である。 一実施形態の細胞培養容器を用いて、目的の細胞にレーザー光を照射する操作を模式的に示した図である。 一実施形態の細胞培養容器を用いて、目的の細胞にレーザー光を照射した後の操作を模式的に示した図である。 一実施形態の細胞培養容器の製造方法の流れを示すフローチャートである。 一実施形態の細胞培養容器を用いた細胞の取得方法の流れを示すフローチャートである。 実施例の細胞培養容器の上面図と断面図とを示した図である。
（第１の実施形態）
　以下では、適宜図面を参照しながら、一実施形態の細胞培養容器、および細胞の取得方法等について説明する。
　細胞培養基材の上で培養した細胞のうち、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）から分化誘導された細胞等、特定の細胞を効率的に剥離し、回収することがしばしば必要になる。
　本発明者らは、細胞培養基材を流路内に配置し、外部からの光により、細胞培養基材に局所的な温度変化を加えて所望の細胞の細胞培養基材に対する接着性を弱めた後、流路に液体を流して、液体のせん断応力により細胞を剥離し、液体ごと細胞を回収することにより、効率的に所望の細胞のみを回収できることを見出した。
　本実施形態の細胞培養容器は、流体を注入する注入口と、流体を排出する排出口を備え、該注入口と該排出口とを結ぶ流路に、細胞培養基材を収納することにより、該細胞培養容器に流体を流して剥離した細胞をまとめて回収することができる。
　図１は、本実施形態の細胞培養容器１の断面図である。細胞培養容器１は、流体を注入する注入口２１と、流体を排出する排出口２２と、前記注入口と排出口を結ぶ流路２３と、を備える。流路２３には、加熱によって変性するゲル１５中に金微粒子を分散させてなる細胞培養用基材１４が収納されている。金微粒子１３は、ゲル１５の内部の微小体積要素１９を拡大して模式的に示した。
　流体とは、液体又は気体をいう。液体としては、例えば、各種の培養液や緩衝液が細胞の種類に応じて選択して用いられ、気体としては、例えば、空気が用いられる。
　金微粒子１３は、光熱変換特性の高い大きさの粒子とすることができ、特に、表面プラズモン共鳴吸収（ＳＰＲ）が起こる大きさとしてもよい。レーザー回折式粒度分布測定装置を用いて測定された金微粒子１３の体積平均径は、例えば、１ｎｍ以上２００ｎｍ未満、１０ｎｍ以上１００ｎｍ未満、３０ｎｍ以上７０ｎｍ未満とすることができる。ゲル１５での金微粒子１３の濃度は、例えば、１００μＭ以上１０００μＭ未満、２５０μＭ以上５００μＭ以下としてもよい。金微粒子１３の濃度が低いと、金微粒子１３の発熱量が小さくなるため、細胞培養基材の熱変性が起こりにくくなり、細胞の剥離成功確率が下がる傾向がある。一方、金微粒子１３の濃度が高いと、局所での温度上昇が大きくなるため、温度制御が難しくなり、また細胞傷害性が高くなる傾向がある。
　なお、金微粒子１３は、デンドリマーに内包させたり、ゲルに対して親和性を有する分子で修飾したりする等、保護剤を用いてゲル中でより安定化するようにしてもよい。
　ゲル１５は、室温から所定の温度に上昇した場合に変性する。本実施形態で「変性」とは、ゲル１５が温度上昇により、細胞の容易な剥離をもたらす構造の変化を起こすことを意味する。ゲル１５がコラーゲンゲルまたはゼラチンゲルの場合、「変性」には、例えば、コラーゲンタンパク質の二次または三次構造の変化によりもたらされる状態であるゾル化や凝集化、低分子化等が含まれる。ゲル１５が変性する温度は、例えば６０℃以下、５０℃以下、４０℃以下である。ゲル１５の材料は、後述の剥離による細胞の取得を可能にするものであれば特に限定されないが、例えば、コラーゲンゲルまたはゼラチンゲルとしてもよい。二種類以上の高分子を混合して得たゲルを用いることもできる。
　細胞培養容器１の底部３２及び上部３１の少なくとも一方は、光透過性を有する材料で形成される。細胞培養容器１は、本実施形態の細胞培養容器１の技術的特徴を損なわない限り任意の形状で構成され得る。
　細胞培養容器１の底部３２及び上部３１の材質は、酸素透過性を有するものであってよい。例えば、アクリルやポリスチレン等の酸素透過性高分子樹脂等が挙げられる。酸素透過性を有することにより、外部から細胞５０の培養に必要な酸素を供給することができる。
　図２は、細胞培養容器を用いて細胞の取得を行う細胞回収システム１０００を示す概念図である。細胞取得システム１０００は、細胞培養容器１と、倒立顕微鏡７０とを備える。
　細胞培養容器１には、細胞培養基材１４の搭載面１１上に細胞５０が培養液５１中で培養されている。
　細胞培養基材１４で培養されている細胞５０のうち、単離して取得したい細胞を選択細胞５００とし、その他の細胞を非選択細胞５０１とする。選択細胞５００はその態様は特に限定されないが、例えば、適切に遺伝子等が改変されレポーター遺伝子等の判別手段により特徴が現れている細胞や、初期化や適切な分化等が誘導されて構造上判別可能な特徴を有している細胞等が挙げられる。
　なお、選択細胞５００は、上記のように単一の細胞５０でもよいし、複数の細胞５０または複数の細胞５０を含んで構成されるコロニーでもよい。
　倒立顕微鏡７０は、照射部７１と、ダイクロイックミラー７２と、レンズ系７３と、観察部７４と、支持台７５とを備える。
　なお、正立顕微鏡を用いて細胞回収システム１０００を構築してもよい。
　照射部７１は、レーザー光を出射する。照射部７１から出射されるレーザー光の波長は、金微粒子１３が光熱変換特性を発揮する波長域に設定される。特に表面プラズモン共鳴吸収（ＳＰＲ）が起こる波長域に設定してもよい。ゲル１５に照射されるレーザー光は、細胞に照射した場合に重大な損傷を与えない波長およびエネルギーを有するものであればよい。照射部７１から出射されるレーザー光の波長は、例えば、４００ｎｍ以上１２００ｎｍ未満、４５０ｎｍ以上９００ｎｍ未満、５３２ｎｍ等に設定される。細胞培養容器１へ入射するレーザー光の出力は、例えば０．１ｍＷ以上１０００ｍＷ未満、０．４ｍＷ以上１００ｍＷ未満とすることができる。レーザー光の波長およびエネルギーは、細胞に傷害を与えずにゲル１５に効率よく温度上昇および変性を起こすよう、適宜調整される。照射部７１から出射した光は、ダイクロイックミラー７２に入射する。
　なお、選択細胞５００の近傍を選択的に照射することができれば、照射部７１の出射光は特にレーザー光に限定されず、コヒーレントでない単色光や一定の波長範囲の光からなる光でもよい。
　ダイクロイックミラー７２は、照射部７１からのレーザー光を反射するとともに、細胞培養容器１からの可視光を透過させて観察部７４へと出射する。ダイクロイックミラー７２で反射されたレーザー光は、不図示のガルバノミラー等により適切な位置にレーザー光が照射されるように光の向きが調節され、レンズ系７３を透過して細胞培養容器１に入射する。細胞培養容器１に入射したレーザー光は、細胞培養容器１の底部３２、細胞培養基材１４を透過した後、細胞培養基材１４において選択細胞５００の近傍の所定の位置で収束する。図２では、収束するレーザー光７を、一点鎖線を用いて模式的に示した。
　なお、所望の位置にレーザー光７を収束することができれば、レーザー光７の照射光学系の構成は特に限定されない。
　また、レーザー光の照射位置を固定し、支持台７５を移動することによって、選択細胞５００の近傍にレーザー光が収束する構成としてもよい。
　細胞培養基材１４におけるレーザー光７の収束位置は、例えば、選択細胞５００に傷害を与えずに選択細胞５００の下方のできるだけ近い位置とすることができ、レーザー光７のスポット径、ＰＳＦ（Ｐｏｉｎｔ Ｓｐｒｅａｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ）やＰＳＦに基づくパラメータ等に基づいて定められる。細胞培養基材１４におけるレーザー光７の収束位置は、例えば、選択細胞５００の直下であって、深さが１００μｍ未満の範囲、または選択細胞５００から半径１００μｍ未満の範囲とすることができる。また、細胞傷害性に問題が無ければ、選択細胞５００を収束位置としてもよい。
　照射部７１からのレーザー光７を金微粒子１３が光熱変換し、レーザー光７の収束位置の近傍のゲルが変性すると、選択細胞５００の足場となっているゲルまたは周囲の環境の物理的または化学的特性が変化するため、選択細胞５００が搭載面１１との接着性が弱まる。従って、流路１５に液体を流すことにより、選択細胞５００のみをゲルから剥離させ、取り出すことができる。具体的には、例えば、液体の貯留槽と注入口２１とを直接的又は間接的にチューブ等で接続し、ポンプを使用して注入口２１から送液するか、排出口２２から吸引することにより、流路１５に液体を流すことができる。この液体のせん断応力によってゲルから剥離した選択細胞５００は液体によって排出口２２に押し流されるので、排出口２２から液体ごと回収することができる。
　観察部７４は、接眼レンズ等を備え、不図示の照明により照らされた細胞培養容器１からの可視光をユーザにより観察可能にする。ユーザは、細胞培養容器１からの可視光を見て、支持台７５を移動させる等して細胞培養容器１を適切に位置合わせ等することができる。
　なお、レーザー光７の照射光学系とは異なるレーザー光源およびガルバノミラーを用いてレーザー走査を行うことにより細胞培養容器１の画像を取得し、不図示の表示装置に表示する構成としてもよい。
　支持台７５は、細胞培養容器１を支持する。支持台７５は不図示の移動機構によりＸＹＺの各方向に移動可能であり、これにより細胞培養容器１を任意の位置に調整することが可能である。支持台７５は、例えば、透明発熱体が形成されたガラスを含んで構成され、細胞培養容器１の底部３２へレーザー光７を透過させると共に、細胞培養容器１全体の温度を制御する。
　なお、細胞培養容器１の大きさ、構造等に応じて、レーザー光７の光路となる部分に開口部が形成されている支持台７５を用いることもできる。
　本実施形態の細胞培養基材１４は、金微粒子の濃度の異なる複数のゲルが積層されたものであってもよい。例えば、細胞培養基材１４は、金微粒子を含むゲル１５の下に、金微粒子を含まないかゲル１５より低濃度で含むゲルの層を配置したものとすることができる。複数のゲルの層を備えることにより、発熱層であるゲル１５の厚さが面内で概ね均一となる。これにより、レーザー光７の照射条件の調整が容易となり、照射部位を変えた場合であっても細胞の単離が容易となる。
　図３は、細胞培養容器１のＸＺ平面の断面図を示したものである。
　本実施形態の細胞培養基材１４は、ゲル１５の厚さを、例えば０．４ｍｍ以上、０．５ｍｍ以上１．７ｍｍ以下、０．５ｍｍ以上１．２ｍｍ以下とすることができる。ゲル１５の厚さが薄すぎるとゲル１５を均一または平坦に作成することが難しくなる傾向がある。一方でゲル１５の厚さが厚すぎると、流路２３を満たす培養液の量が少なくなり、細胞の培養が難しくなる傾向がある。また、ゲル１５に到達する光が減弱し、細胞５０近傍での金微粒子１３の発熱量が減少することがあるため、細胞５０の取得が難しくなる可能性がある。
　ここで、ゲル１５の厚さは、細胞培養容器１の底部３２の表面からの厚さの平均をいう。
　細胞培養後、レーザー光７を照射する前に、ゲル１５を加温してもよい。これにより、ゲルを変性させるためにレーザー光を照射する時間を短くすることができ、選択細胞５００へのレーザー光による影響を低減することもできる。ゲル１５の加温方法の一例として、図４に示すように、注入口２１から流路２３に矢印の方向に沿って、ゲルに全体的な変性が起きる温度未満の温度、例えば、３７℃以上４０℃未満の温度の液体（例えば培養液）を注入する方法が挙げられる。注入口２１から流路２３にゲルに全体的な変性が起きる温度未満の液体５１を供給することにより、選択細胞５００の周囲の温度が上昇する。
　ゲル１５の加温には、支持台７５の発熱体を用いてもよく、細胞培養容器１を温度制御可能なインキュベータに載置してもよく、またこれらの方法を二以上併用してもよい。
　また、流路２３内の液体５１は、レーザー光７を照射したときに、選択細胞５００の近傍でのゲル表面温度の上昇を抑制し、選択細胞の剥離の効率を下げる傾向がある。そのため、レーザー光７を照射する前に、注入口２１に空気を注入するか、排出口２２から液体を吸引することにより、液体５１を排出口２２より除去してもよい。液体５１の除去は完全でなくてもよく、一部の液体が流路２３に残っていてもよいが、残存する液体が多すぎると、選択細胞５００の近傍でのゲル表面温度の上昇が抑制されるため、選択細胞５００の取得効率を上げることが難しくなる。また、液体を除去しすぎると細胞５０に障害を与える可能性がある。例えば、液体が、ゲル１４の搭載面１１から０．１ｍｍ～０．８ｍｍとなる程度に液体５１を除去してもよい。
　なお、ここで液体を除去しておくと、レーザー照射後、流路２３に液体を流す際、気体と液体の界面がゲル１４の搭載面１１を通過するので、選択細胞５００により大きなせん断応力がかかり、剥離しやすいという効果も得られる。
　図５は、目的の細胞にレーザー光７を照射する操作を模式的に示した図である。液体５１を除去する場合はその後、選択細胞５００の近傍にレーザー光７を照射すると、ゲル１５中の金微粒子１３が光熱変換し、選択細胞５００の足場となっているゲルまたは周囲の環境の物理的または化学的特性が変化するため、選択細胞５００を搭載面１１に付着させている力が弱まり、流路に液体を流すと、せん断応力により選択細胞５００が搭載面１１から剥離する。
　図６は、目的の細胞にレーザー光７を照射した後の操作を模式的に示した図である。レーザー光７により搭載面１１に対する接着性が弱くなった選択細胞５００は、流路１５に液体を流すことにより、液体のせん断応力によって搭載面１１から剥離し、液体によって排出口２２に押し流されるので、排出口２２から液体ごと回収することができる。
　流路１５に液体を流す速さは、当業者が適宜決定することができる。
（細胞培養基材１の製造方法）
　図７は、本実施形態の細胞培養容器１の製造方法の流れを示すフローチャートである。
ステップＳ１００１において、所定の体積平均径を有する金微粒子１３を含む溶液を調製する。例えば、特開２０１３－２３３１０１号公報に記載の方法のように、金イオンを含む溶液（ＨＡｕＣｌ４等）中で還元剤（アスコルビン酸、ヒドロキノン、クエン酸等）の存在下に、金からなる種核を成長させて得ることができる。ステップＳ１００１が終了したら、ステップＳ１００３に進む。
　金微粒子１３の体積平均径は、調整した金微粒子１３をレーザー回折式粒度分布測定装置で測定することができる。粒度分布測定装置を用いず、簡易的に測定する場合は、透過型電子顕微鏡を用いて撮像し、解析ソフトウェア等を用いて測定して算出することができる。
　ステップＳ１００３において、ステップＳ１００１で調製された金微粒子１３を含む溶液を用いてコラーゲンと金微粒子１３とを含む混合溶液を調製し、細胞培養容器１の底板３２の上に加えて静置する。混合溶液が固まると、コラーゲンゲル中に金微粒子１３が分散され包埋される。ステップＳ１００３が終了したら、ステップ１００５に進む。
　ステップＳ１００５において、細胞培養容器１の底板３２の上に形成されたゲル層の上に、流路２３が形成されるように上板３１を被せる。流路２３の高さは、ゲル層の厚さにより異なるが、例えば、ゲル表面から０．２ｍｍ以上２．０ｍｍ以下、０．５以上１．５ｍｍ以下、０．８ｍｍ以上１．２ｍｍ以下とすることができる。ステップＳ１００５が終了したら、処理を修了する。
　図８は、本実施形態の細胞培養容器１を用いた細胞の取得方法および生産方法の流れを示すフローチャートである。ステップＳ２００１において、細胞培養基材１４の表面、すなわち搭載面１１の上で細胞を培養する。ステップＳ２００１が終了したら、ステップＳ２００３に進む。
　ステップＳ２００３において、支持台７５の温度を適宜調節し、細胞培養容器１をゲル１５の全体的な変性が起きる温度未満の温度に加熱する。レーザー光７の照射を行う前に細胞培養容器１の温度を上げることで、レーザー光７の照射時間を短くすることができ、選択細胞５００への細胞傷害性を低減することができる。ステップＳ２００３が終了してから、ステップＳ２００５に進んでもよく、ステップＳ２００３は、その後ステップＳ２００５からＳ２０１３のいずれかまで、継続して行ってもよい。
　ステップＳ２００５において、ゲル１５の全体的な変性が起きる温度未満の温度に加温した液体（例えば培養液）５１を注入する。レーザー光７の照射を行う前に液体５１の温度を上げることで、レーザー光７の照射時間を短くすることができ、選択細胞５００への影響を低減することができる。ステップ２００５が終了したら、ステップ２００７に進む。なお、ステップＳ２００３とステップＳ２００５の順序は、適宜前後してもよく、平行して操作を行ってもよい。
　ステップＳ２００７において、細胞培養容器１内の液体５１を流路２３から除去する。液体５１の除去は、細胞培養容器１の注入口２１から空気を注入するか、または排出口２２から液体５１を吸引することにより行う。ステップＳ２００７が終了したら、ステップＳ２００９に進む。ステップＳ２００９では、搭載面１１上で培養された細胞５０の中から、取得する細胞５０（選択細胞５００）を選択する。必要に応じて、蛍光蛋白質が発現している細胞５０や、構造的特徴を持った細胞５０が選択される。
　なお、ステップＳ２００５からステップＳ２００９は順序を変えてもよい。例えば、加温した液体５１を注入し、細胞５０を選択してから、液体５１を除去してもよく、細胞５０を選択してから加温した液体５１を注入し、液体５１を除去してもよい。
　ステップＳ２０１１において、ゲル１５における選択細胞５００の近傍の収束位置に向けてレーザー光７を照射する。ゲル１５の搭載面１１と反対の面側からレーザー光７を照射することで、細胞５０に直接光が当たり細胞傷害を引き起こすことを避けることができる。ゲルの変性により選択細胞５００と搭載面１１との結合が弱まる。ステップＳ２０１１が終了したら、ステップＳ２０１３に進む。まとめて回収する選択細胞５００が複数存在する場合、ステップＳ２００９とステップＳ２０１１を複数回繰り返し、すべての選択細胞５００に対してステップＳ２０１１を行ったら、ステップＳ２０１３に進む。また、細胞を選択するステップＳ２００９を、加温した培養液を注入するステップＳ２００５及び培養液を除去するステップＳ２００７の前に行う場合であって、選択細胞５００が複数存在する場合は、ステップＳ２００９を複数回繰り返してすべての細胞を選択してから、ステップＳ２００５及びステップＳ２００７を行い、その後ステップ２０１１を繰り返してすべての選択細胞５００にレーザーを照射するとよい。
　ステップＳ２０１３において、細胞培養容器１の流路２３に液体を流すことにより、選択細胞５００は、液体のせん断応力によりゲル１５の搭載面１１から剥離し、排出口２２に流されるので、選択細胞５００を排出口２２から回収する。ステップ２０１５において、回収した選択細胞５００を、他の培地等に配置して培養を行うことができる。ステップＳ２０１５が終了したら、処理を終了する。なお、ステップＳ２０１３において、選択細胞５００を回収したら、ステップＳ２００３に戻って他の細胞５０を選択細胞５００として取得してもよい。また、回収した選択細胞は、そのまま臨床、研究、工業用等の様々な用途に使用してもよい。
　上述の実施の形態によれば、次の作用効果が得られる。
（１）本実施形態の細胞培養容器１は、流体を注入する注入口と、流体を排出する排出口と、前記注入口と排出口を結び、且つ、加熱によって変性するゲル中に金微粒子を分散させてなる細胞培養基材を収納する流路と、を備える。これにより、前記流路に液体を流すことによって、選択した細胞のみをまとめて回収することができ、単位時間当たりの細胞回収数を多くすることができる。
（２）本実施形態の細胞の取得方法は、第１の態様の細胞培養容器で培養された細胞から、取得する細胞を選択する工程と、前記選択された細胞の近傍の前記ゲルに光を照射する工程と、前記細胞培養容器の前記流路に液体を流す工程と、前記細胞培養容器の前記排出口から細胞を回収する工程と、を含む。これにより、前記流路に生じた走流によって、選択した細胞を回収することができ、単位時間当たりの細胞回収数を多くすることができる。
　本発明は上記実施形態の内容に限定されるものではない。本発明の技術的思想の範囲内で考えられるその他の態様も本発明の範囲内に含まれる。
（実施例）
　ｉＰＳ細胞を用いてｉＰＳ細胞から分化誘導された心筋細胞を用いて本実施形態の細胞の取得を行った。
　（試薬調製）
・カルシウム・マグネシウム不含有リン酸緩衝食塩水［ＰＢＳ（－）］
　ＮａＣｌ（４．００３ ｇ）、ＫＣｌ（０．１００３ ｇ）、ＫＨ２ＰＯ４（０．１００６ ｇ）、ＮａＨ２ＰＯ４（０．５７５ ｇ）をイオン交換水（５００ ｍＬ）に溶かした後 、オートクレーブで滅菌してＰＢＳ（－）を調製した。
・１０倍無機塩培地
　イオン交換水（１０ｍＬ）へＣａＣｌ２ 無水物（２０．２ｍｇ）、ＭｇＣｌ・６Ｈ２Ｏ （２３．５ｍｇ）、ＫＣｌ（４０．４ｍｇ）、ＮａＣｌ（６３９．７ｍｇ）、ＮａＨ２ＰＯ４ ・２Ｈ２Ｏ（１４．１ｍｇ）を加えて溶解させて１０倍無機塩培地を調製した。
・再構成溶液
　ＮａＯＨ（０．０５Ｍ，１０ｍＬ）へＮａＨＣＯ３（２１９．７ｍｇ）、ＨＥＰＥＳ（４７７．１２ ｍｇ）を加えて溶解させて再構成溶液を調製した。
・希塩酸
　０．０５ＭのＨＣｌ水溶液をｐＨメーター（堀場製作所社製、ｐＨ／ＣＯＮＤＭＥＴＥＲ Ｄ－５４）を用いてｐＨ３．０に調整することで希塩酸（ｐＨ３．０）を作製した。ここで、１０倍無機塩培地、再構成溶液、希塩酸（ｐＨ３．０）はそれぞれフィルター（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製、孔径０．２０μｍ）を用いてフィルター滅菌した。
・濃縮金ナノ粒子（ＡｕＮＰ）溶液
　４ｍＬ（２ｍＬ×２）の、金ナノ粒子を成長させた溶液であるＧｒｏｗｔｈ溶液（Ｓ.Ｙａｇｉ, ｅｔ ａｌ, ＪＥｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍ Ｓｏｃ, １５９, Ｈ６６８ （２０１２）参照）を遠心管に入れ２５℃、回転数３０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。上澄み溶液（１．８ｍＬ×２）を除去し、超純水（１．８ｍＬ×２）を添加し、再度同じ条件で遠心分離した。その後、上澄み溶液（１．８ｍＬ×２）を除去し、超純水（０．２ｍＬ×２）を添加し還元剤濃度を希釈した濃縮ＡｕＮＰ溶液（Ａｕ５００μＭ）を作製した。金ナノ粒子の体積平均径は、調整した金ナノ粒子を透過型電子顕微鏡（日本電子社製，ＪＥＭ－２０００Ｆ，加速電圧２００ｋＶ）を用いて撮像し、解析ソフトウェア（ケニス社製，Ｐｈｏｔｏｍｅａｓｕｒｅ（登録商標））を用いて測定して算出した。
（ゲル作製）
　クリーンベンチ（昭和科学社製，Ｓ－１００１ＰＲＶ）内で、細胞培養用基材（新田ゼラチン社製，Ｃｅｌｌｍａｔｒｉｘ（登録商標）Ｉ－Ａ，コラーゲン濃度０．３ｗｔ%，ｐＨ３．０，０．５６ｍＬ）へ希塩酸（０．４２ｍＬ）、濃縮金ナノ粒子（ＡｕＮＰ）溶液（０．７０ｍＬ）、１０倍無機塩培地（０．２０ｍＬ）、再構成溶液（０．２０ｍＬ）を氷冷下で、この順番で加えてコラーゲンゲル溶液（２．１ｍＬ）を調製した。これを、氷冷下で、９６穴プレート（Ｎｕｎｃ社製）に入れた後、ダイレクトヒートＣＯ２インキュベータ内で３７℃下、３０分間インキュベーションし、金ナノ粒子包埋コラーゲンゲルを作製した。その後、３７℃下でゲル上へＰＢＳ（－）を１００μＬ／ｗｅｌｌ加え、６時間インキュベーションすることでゲルを洗浄した。
（培養チップの作製）
　レーザー加工機を用い、アクリル板に、高さ１．０ｍｍの流路が形成されるようにアクリル板をＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン；厚さ１００μｍ）シートを用いて貼りあわせた。この流路に、上記で作製した金ナノ粒子包埋コラーゲンゲルをゲルの高さが０．５ｍｍとなるまで加え、ダイレクトヒートＣＯ２インキュベータ内で３７℃下、３０分間インキュベーションした。次に、ゲル表面から上板の底面までの高さが０．５ｍｍとなるように加工したアクリル板の上板をＰＤＭＳシートを用いて接着し、培養チップを作製した。作製した培養チップの上面図と断面図を図９に示す。
（細胞播種および剥離）
　文献（Biochem Biophys Res Commun, 425;321:2012）にしたがって、バイオリアクターを用いた浮遊培養系で、ヒトiPS細胞を心筋細胞に分化させた。
　浮遊培養系においてヒトiPS細胞はバイオリアクターの内表面に接着することなく細胞同士が相互に接着し、球状の細胞凝集塊（胚様体）を形成しながら増殖する。その胚様体の中で上述の心筋細胞分化は進行し、自立拍動心筋細胞を含んだ胚様体が出現する。この浮遊培養バイオリアクターを用い心筋細胞分化を17日間行った。分化17日後の胚様体を分散させシングル細胞を得るために酵素等処理を行った。心筋細胞の障害を避けるためマイルドな処理方法（通常細胞の継代時に使用する濃度の5分の1の濃度のトリプシン/EDTAで処理）を用いシングル細胞を獲得した。この方法を用いることで毎回再現性良くシングル細胞を得ることができた。
　作製した培養チップに通常動物細胞用培地ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（１０％牛胎児血清および１％ペニシリン－ストレプトマイシン含有）で分散させた前記心筋細胞（６０００ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ）を注入口から流路に流し込み、３７℃で４日間培養した。
　培養終了後、培養チップを３７℃に保温した保温チャンバー（細胞培養用コンパクトチャンバーＣ－１５０ＡＷ；○○社製）に移した。次に、培養チップの注入口と排出口にチューブを設置した後、シリンジを用いて４０℃に加温した培養液を注入した。次に、空気を注入して、排出口から培養液を除去した。続いて、上記保温チャンバーを顕微鏡の支持台に設置し、拍動する心筋を顕微鏡下で検出し、その心筋細胞へスポット径が最小となるように設定し光照射し、空気置換細胞剥離チップを得た。
　対照として、空気を注入せずに、培養液を残したまま、光照射する以外は上記と同様にして、空気無置換細胞剥離チップを得た。
　電動Ti-E顕微鏡に光刺激装置（Ti-LAPP FRAPモジュール）を取り付けた。光刺激装置にレーザーをファイバによって導入し、XYZ 軸方向に観察光学系とは独立して駆動させることが出来る構成とした。また精密な温度管理をするために、保温箱で顕微鏡を覆い、さらにチップの周辺を小型インキュベータ（C150-HA 株式会社ブラスト）で覆った2 重の保温構造とした。チップへの培養液の導入は、50mL 遠沈管に入れた培養液をダイアフラムポンプでチューブを通じてブロックヒーターへ送り、予熱してから行った。予熱しない場合、細胞剥離時に培養液の温度が低下してレーザー照射で熱変性した金ナノ粒子包埋コラーゲンゲルが熱変性前の状態に戻ってしまうことがあるからである。ブロックヒーターの後は、チューブを流量計/温度計（SLI-2000 センシリオン（株））に接続し、流量と培養液の温度をモニターした。チューブは、流量計/温度計の後、チップに接続され、チップの後は回収/廃液容器に接続した。空気の注入はチップと流量計/温度計の間にあるチューブに針を刺し、そこからシリンジで空気を入れた。観察は４倍、１０倍の対物レンズ（ニコン社製，Ｐｌａｎ－Ｆｌｕｏｒ）を用いて行った。
　光照射は、１．０秒の間隔で２．０秒間５回行った。
　細胞剥離の手順は以下のようにした。まず、ターゲットとなる心筋細胞を10 倍位相差観察によって目視検出する。次に、空気を50～100μL 程度（流路が空気で満たされる程度）注入して、流路から培養液を除去した。そして、フィルターをレーザー照射用に変え、レーザーを2 秒～20秒程度照射した。照射時間はレーザーパワーによって調整する。レーザー照射後、排出口から吸引するか、注入口から培養液を送液することにより、流路に培養液を流して心筋細胞に外力を加え剥離した。
（細胞回収）
　光照射後、４０℃に保温した培養液を、シリンジを用いて培養チップの注入口から５ｍｌ／分の流速で注入し、排出口に設置したチューブから剥離した細胞を回収した。
（結果）
　回収した培養液から取得した心筋細胞は拍動を有し、本発明の方法によれば細胞に障害を与えることなく回収できることが確認できた。
　光照射する前に、培養液除去した場合は、除去しなかった場合に比較して、目的の細胞を剥離・回収できる確率が高い傾向が見られた。
　この結果、光照射する前に空気を置換することにより培養液を除去することで、選択した細胞の取得の効率を上げることができることが判明した。
１…細胞培養容器、７…レーザー光、１０…第１の層、１１…搭載面、１３…金微粒子、１４…細胞培養基材、１５…ゲル、２１…注入口、２２…排出口、２４…流路、５０…細胞、５１…培養液、７０…顕微鏡、５００…選択細胞、１０００…細胞取得システム

Claims (8)

  1. 　流体を注入する注入口と、
    　流体を排出する排出口と、
    　前記注入口と前記排出口とを結び、且つ、加熱によって変性するゲル中に金微粒子を分散させてなる細胞培養基材を収納する流路と、
    を備える細胞培養容器。
  2. 　前記ゲルが、コラーゲンゲルまたはゼラチンゲルである、請求項１に記載の細胞培養容器。
  3. 　前記流路の高さが、前記ゲルの表面から０．２ｍｍ以上２．０ｍｍ以下である、請求項１又は２に記載の細胞培養容器。
  4. 　請求項１～３のいずれか１項に記載の細胞培養容器で培養された細胞から、取得する細胞を選択する工程と、
    　前記選択された細胞の近傍の前記ゲルに光を照射する工程と、
    　前記細胞培養容器の前記流路に液体を流す工程と、
    　前記細胞培養容器の前記排出口から細胞を回収する工程と、
    を含む、細胞の取得方法。
  5. 　前記ゲルに光を照射する工程の前に、前記細胞培養容器の前記流路に３７℃以上４０℃未満の液体を注入する工程を含む、請求項４に記載の細胞の取得方法。
  6. 　前記ゲルに光を照射する工程の直前に、前記流路から液体の全部又は一部を除去する工程を含む、請求項４又は５に記載の細胞の取得方法。
  7. 　前記液体を除去する工程が、前記細胞培養容器の前記注入口から気体を注入するか、前記細胞培養容器の前記排出口から液体を吸引する工程である、請求項６に記載の細胞の取得方法。
  8. 　請求項４～７のいずれか一項に記載の細胞の取得方法により取得した細胞を培養する細胞の培養方法。
PCT/JP2018/036897 2017-10-03 2018-10-02 細胞培養容器、細胞の取得方法、および細胞の培養方法 WO2019069931A1 (ja)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US16/652,660 US20200318053A1 (en) 2017-10-03 2018-10-02 Cell culture container, method for acquiring cells, and method for culturing cells
JP2019546738A JP7489054B2 (ja) 2017-10-03 2018-10-02 細胞の取得方法、および細胞の培養方法
EP18864955.2A EP3693452A4 (en) 2017-10-03 2018-10-02 CELL CULTURE CONTAINERS, METHOD FOR CELL RECOVERY, AND METHOD FOR CULTIVATION OF CELLS

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2017193584 2017-10-03
JP2017-193584 2017-10-03

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2019069931A1 true WO2019069931A1 (ja) 2019-04-11

Family

ID=65994273

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2018/036897 WO2019069931A1 (ja) 2017-10-03 2018-10-02 細胞培養容器、細胞の取得方法、および細胞の培養方法

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20200318053A1 (ja)
EP (1) EP3693452A4 (ja)
JP (1) JP7489054B2 (ja)
WO (1) WO2019069931A1 (ja)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20220282201A1 (en) 2021-03-07 2022-09-08 Cellino Biotech, Inc. Platforms and systems for automated cell culture
IT202100010988A1 (it) * 2021-04-30 2022-10-30 Univ Degli Studi Di Milano Bicocca Supporto trasparente riscaldabile selettivamente per la crescita o la differenziazione di campioni biologici
US11931737B2 (en) * 2021-09-02 2024-03-19 Cellino Biotech, Inc. Platforms and systems for automated cell culture

Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH08172956A (ja) * 1994-12-28 1996-07-09 Tokimec Inc 培養装置及びその培地交換方法
JPH11349643A (ja) * 1998-06-05 1999-12-21 Nitta Gelatin Inc 感温性高分子化合物およびその製造方法、感温性高分子組成物、細胞培養基材
JP2001349643A (ja) 2000-06-06 2001-12-21 Kenmore Thermo Kaelte Gmbh 液化器と蒸発器を備えた冷凍回路
JP2010011747A (ja) * 2008-07-01 2010-01-21 Canon Inc 細胞培養容器および細胞培養方法
JP2011244713A (ja) * 2010-05-25 2011-12-08 Shimadzu Corp 細胞培養デバイス、細胞培養システム、及び細胞培養方法
JP2012039947A (ja) * 2010-08-19 2012-03-01 Osaka Prefecture Univ 細胞培養用基材
JP2013013367A (ja) * 2011-07-04 2013-01-24 Nikon Corp 培地供給装置、顕微鏡システム
JP2013233101A (ja) 2012-05-08 2013-11-21 Osaka Prefecture Univ 細胞培養用基材および細胞の取得方法
WO2015105029A1 (ja) * 2014-01-09 2015-07-16 東京エレクトロン株式会社 細胞培養容器および細胞継代培養システム並びに細胞継代培養方法
JP2017000113A (ja) * 2015-06-12 2017-01-05 アイシン精機株式会社 細胞培養・分離用基材、細胞培養・分離用基材を用いた細胞の取得方法、細胞培養・分離用基材を作製するための金微粒子分散液、及び細胞培養・分離用基材作製用キット
JP2017193584A (ja) 2007-05-22 2017-10-26 ワイス・エルエルシー ヒドラジドを製造するための改善されたプロセス
WO2018131661A1 (ja) * 2017-01-12 2018-07-19 株式会社ニコン 細胞培養基材、培養容器、細胞培養容器の製造方法、細胞の取得方法、細胞の培養方法

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0387975A1 (en) * 1989-03-16 1990-09-19 W.R. Grace & Co.-Conn. Cell culture substrate cell sheet, cell cluster and preparations thereof
JP2005278564A (ja) 2004-03-30 2005-10-13 Hitachi Medical Corp 細胞培養装置
WO2009017695A1 (en) * 2007-07-26 2009-02-05 The Regents Of The University Of California A single cell surgery tool and a cell transfection device utilizing the photothermal properties of thin films and/or metal nanoparticles
CN103502426B (zh) * 2011-02-28 2018-03-13 哈佛大学校长及研究员协会 细胞培养系统
JP6121127B2 (ja) 2012-10-03 2017-04-26 株式会社日立ハイテクノロジーズ 細胞回収用デバイス、装置及び方法
US10793820B2 (en) * 2013-04-30 2020-10-06 Lawrence Livermore National Security, Llc Miniaturized, automated in-vitro tissue bioreactor
JP6563409B2 (ja) 2014-09-29 2019-08-21 東京エレクトロン株式会社 培養培地分析による多能性幹細胞の未分化状態の判定方法
EP3757203A4 (en) * 2018-02-21 2022-01-12 University Public Corporation Osaka CELL CULTURE CONTAINER, METHOD FOR MAKING CELL CULTURE CONTAINER, CELL COLLECTION SYSTEM AND METHOD FOR OBTAINING CELLS

Patent Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH08172956A (ja) * 1994-12-28 1996-07-09 Tokimec Inc 培養装置及びその培地交換方法
JPH11349643A (ja) * 1998-06-05 1999-12-21 Nitta Gelatin Inc 感温性高分子化合物およびその製造方法、感温性高分子組成物、細胞培養基材
JP2001349643A (ja) 2000-06-06 2001-12-21 Kenmore Thermo Kaelte Gmbh 液化器と蒸発器を備えた冷凍回路
JP2017193584A (ja) 2007-05-22 2017-10-26 ワイス・エルエルシー ヒドラジドを製造するための改善されたプロセス
JP2010011747A (ja) * 2008-07-01 2010-01-21 Canon Inc 細胞培養容器および細胞培養方法
JP2011244713A (ja) * 2010-05-25 2011-12-08 Shimadzu Corp 細胞培養デバイス、細胞培養システム、及び細胞培養方法
JP2012039947A (ja) * 2010-08-19 2012-03-01 Osaka Prefecture Univ 細胞培養用基材
JP2013013367A (ja) * 2011-07-04 2013-01-24 Nikon Corp 培地供給装置、顕微鏡システム
JP2013233101A (ja) 2012-05-08 2013-11-21 Osaka Prefecture Univ 細胞培養用基材および細胞の取得方法
WO2015105029A1 (ja) * 2014-01-09 2015-07-16 東京エレクトロン株式会社 細胞培養容器および細胞継代培養システム並びに細胞継代培養方法
JP2017000113A (ja) * 2015-06-12 2017-01-05 アイシン精機株式会社 細胞培養・分離用基材、細胞培養・分離用基材を用いた細胞の取得方法、細胞培養・分離用基材を作製するための金微粒子分散液、及び細胞培養・分離用基材作製用キット
WO2018131661A1 (ja) * 2017-01-12 2018-07-19 株式会社ニコン 細胞培養基材、培養容器、細胞培養容器の製造方法、細胞の取得方法、細胞の培養方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BIOCHEM BIOPHYS RES COMMUN, vol. 425, 2012, pages 321
S. YAGI ET AL., JELECTROCHEM SOC, vol. 159, 2012, pages H668
See also references of EP3693452A4

Also Published As

Publication number Publication date
EP3693452A1 (en) 2020-08-12
EP3693452A4 (en) 2021-06-23
JPWO2019069931A1 (ja) 2020-10-22
US20200318053A1 (en) 2020-10-08
JP7489054B2 (ja) 2024-05-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2019069931A1 (ja) 細胞培養容器、細胞の取得方法、および細胞の培養方法
JP4002720B2 (ja) 一細胞長期培養顕微観察装置
JP4051440B2 (ja) 細胞操作装置及び方法
US11697791B2 (en) Cell culture substrate, culture vessel, method for producing cell culture vessel, method for acquiring cells and method for culturing cells
KR20220131302A (ko) 형질감염 및 세포의 클론 집단 생성을 위한 장치 및 방법
JP4649224B2 (ja) 付着性細胞の培養方法および培養装置
JP4831543B2 (ja) 細胞剥離方法
US20210032580A1 (en) Cell culture container, method for manufacturing cell culture container, cell recovery system and method for acquiring cells
WO2017056695A1 (ja) 細胞培養装置
JP2005168495A (ja) 細胞外物質の細胞内への導入方法
JP2010022227A (ja) 目的細胞の取得方法および解析方法
Scherp et al. Microinjection-a tool to study gravitropism
US20030165483A1 (en) Method for the modification of biological cells
CN108642566A (zh) 基于混合组装方式制备有序排列的二维胶体晶体膜的方法
Maezawa et al. In situ observation of cell-detachment process initiated by femtosecond laser-induced stress wave
Durán et al. Silicon-nanowire based attachment of silicon chips for mouse embryo labelling
WO2019069979A1 (ja) 細胞培養容器、細胞回収システム、細胞の取得方法および細胞の培養方法
JP2012152154A (ja) シート状細胞培養物の製造方法、シート状細胞培養物形成用基材の製造方法、気泡の除去方法および気体の検出システム
JP5406481B2 (ja) 胚培養容器
JP6374187B2 (ja) 細胞内への外来物質の導入方法
JP6981666B2 (ja) レーザーを用いた細胞内への外来物質の導入方法
JPH11187868A (ja) ウィルスまたは細胞の培養法
CN106318897A (zh) 一种植物单染色体的激光显微切割分离方法
EP4107248A1 (en) A cell culture plate for conducting 3d cell culture and a method of fabricating the same
US20090311767A1 (en) Method for molecular delivery into cells using naonotube spearing

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 18864955

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2019546738

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2018864955

Country of ref document: EP

Effective date: 20200504