JP2005168495A - 細胞外物質の細胞内への導入方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 前記目的のために、本発明の導入方法は、細胞を導入目的物質の存在する液中、ゲル中若しくはゲル表面に配置し、前記液若しくはゲル又は前記細胞にパルスレーザーを集光させて照射し、それにより生じた衝撃波により前記細胞の細胞膜の構造を一時的に変化させ、前記物質を細胞内に導入する方法である。具体的には、例えば、図4に示すとおり、細胞4が導入目的物質の存在する液中に配置された細胞チャンバー10にパルスレーザー22を照射し、前記液中で集光させ、それにより生じた衝撃波23を細胞4に接触させて細胞膜の構造を一時的に変化させ、前記物質を細胞内に導入する。パルスレーザーの集光位置を調整することで、例えば、図4Aに示すような特定の単独細胞8への導入や、図4Bに示すような特定範囲の細胞への導入が可能である。
【選択図】 図4
Description
(a)生化学的方法:脂質と遺伝子を混合し、遺伝子を内包したミセル(リポソーム)を形成させ、そのミセルを細胞に取り込ませる方法。
(b)パーティクルガン:遺伝子を金ナノ粒子等に担持させ、その粒子を細胞に打ち付けて粒子ごと遺伝子を細胞内に導入する方法。
(c)エレクトロポレーション:遺伝子と浮遊細胞を含む培養液に高電場を印加し、それにより細胞膜の結合をゆるめて遺伝子を導入する方法。
(d)マイクロインジェクション:マイクロオーダーに先鋭化したマイクロピペットを用いて、顕微鏡下で細胞に直接差し込んで遺伝子を導入する方法。
(e)レーザートラップインジェクション法:光の放射圧による光ピンセットを用い、遺伝子を担持した無機粒子を補足したまま細胞内に導入する方法(例えば、特許文献1参照)。
(f)可視及び紫外レーザーを用いた遺伝子導入方法:細胞を培養した容器の底に可視光若しくは紫外光を照射し、それによるストレス波により、細胞に遺伝子を導入する方法(例えば、非特許文献1及び2参照)。
(g)フェムト秒レーザー法:フェムト秒高強度近赤外レーザーパルスを細胞に使用して細胞膜に小さく局所的な穿孔を作ることにより、さまざまな哺乳類細胞に、細胞構造を混乱させること無く、直接DNAをトランスファーする方法(例えば、非特許文献3参照)。
細胞と集光位置との距離 一般的強度 好ましい強度 より好ましい強度
1000μm以内 0.25〜0.25x109 0.25〜0.25x106 2.5〜0.12x106
20μm以内 10-3〜106 1〜1000 10〜500
0m(細胞膜) 10 -3 〜10 6 1〜1000 10〜500
前記パルスレーザーの波長は、例えば、190nm〜20μmのレーザーが使用でき、その中でも、直接的に強い吸収のある紫外線よりも、赤外光のほうが使用する培養器等の材料に関係なくレーザーの集光部で衝撃波を発生できることより、前記波長は、400nm〜1100nmが好ましく、より好ましくは、600nm〜1100nmである。
細胞チャンバーは、図1に示す接着性細胞用のものを使用した。スペーサー2はシリコンゴム製であり、高さが200μmである。
細胞外物質導入装置は、図2の構成の装置を使用した。パルスレーザー照射装置17として、再生増幅付フェムト秒チタンサファイアレーザー(800nm、120fs、米国Spectra-Physics社製)を用いた。対物レンズ14は、倍率が100倍であり、開口数が1.24のもの(オリンパス株式会社製)を用いた。集光位置は、コリーメーターレンズ20を用いて、顕微鏡11の結像面に集光されるように調整した。パルスレーザー22の集光部は、半径約1μmの円形とした。前記レーザー22の強度は、λ/2板18及び偏光板19で調節した。
標的細胞は、マウス由来の繊維芽細胞NIH3T3株を使用した。この細胞を、前記細胞チャンバーの基板のコラーゲン薄膜(厚み約500μm)上で培養した。その培地として、Dulbecco's modification of Eagle's medium (DMEM)を使用した。前記基板の材質は、ポリスチレンであった。
前記細胞に導入するDNAとして、アクチン-GFPプラスミド(pEGFP-Actin)を使用した。このプラスミドを0.1μg/μlの濃度で前記細胞チャンバーの前記培養液に添加した。前記pEGFP-ActinプラスミドはBD Biosciences Clontech(No.632348)社から購入し、その一部を大腸菌DH5α株に形質転換して単一コロニーを単離した後、プラスミドの大量調製を行った。大量調製は市販のQUIAGEN Plasmid Maxi Kit(QUIAGEN No.12163)を用い、キットに添付のプロトコールに従って実施した。得られたプラスミドのうち50μgを採取し、再度エタノール沈殿を行った後、無菌的に風乾してNuclease-Free Water(Promega No.E111B)に0.1μg/μlとなるように溶解して、これを遺伝子導入に使用した。
細胞の観察は、マルチタイムライムラプスシステムにより観察した。このシステムは、顕微鏡11のステージ12上に配置された前記細胞チャンバー10内の細胞の二次元座標位置を記憶させ、前記電動ステージ12と連動させることで、一定時間の間隔で各細胞の光学的視覚情報のピックアップを可能にするシステムである。このシステムについて、図6の模式図を用いて説明する。同図において、図1及び図2と同一部分には同一符号を付している。同図に示すように、顕微鏡の電動ステージ12の上に細胞チャンバー10を配置すると、最初は、二次元座標(x、y)=(a1、b1)に位置する細胞4に対して検出光37が照射され、これによって前記細胞4が観察され(図6A)、一定時間経過後、前記電動ステージが動いて、二次元座標(x、y)=(a2、b2)に位置する細胞4に対し検出光37が照射され、これによって前記細胞4が観察される(図6B)。この一連の工程の中で、検出光37の位置は固定されており、電動ステージ12により観察対象の細胞4が移動する。このマルチタイムライムラプスシステムを用い、パルスレーザーを照射した細胞約180個を、約10分間隔で順次観察することを繰り返すことにより、時間経過による細胞の変化を観察した。
約180個のNIH3T3細胞を約30個ずつのグループに分け、そのグループごとの6パターンの照射条件で、細胞から20μm横方向の位置にフェムト秒チタンサファイアレーザーを照射し、集光させ、前記アクチン-GFPプラスミドの導入を行った。前記導入は、前記プラスミドが発現するGFPの蛍光を観察することで確認した。前記観察は、前記マルチタイムライムラプスシステムで、レーザー照射後12時間おこなった。その結果の一例を図7に示す。図7A−1,A−2,A−3,A−4(図7Aグループ)及び図7B−1,B−2,B−3,B−4(図7Bグループ)の各図は、レーザー強度360nJ/pulseで細胞の端から20μm横方向の位置に照射した細胞のうちの2つの細胞の観察結果の一例であって、図7Aグループ及びBグループのそれぞれにおいて、A−1,B−1はレーザー照射前の透過像を示し、A−2,B−2はレーザー照射直後の透過像を示し、A−3,B−3はレーザー照射12時間後の透過像を示し、A−4,B−4は、レーザー照射12時間後の蛍光像を示す。図7A−2,B−2のそれぞれの図に示すように、照射後の細胞は、基板に接着しており外傷は観察されなかった。また、図7A−4,B−4のそれぞれの図に示すように、強い蛍光を発する細胞と、弱い蛍光を発する細胞が観察されたが、これらは、導入した時の細胞周期の違いに起因すると考えられる。
レーザー照射を行わない他は、実施例1と同様にして細胞を観察した。その結果、約5%の細胞からプラスミドのGFPに起因する発光が観察された。なお、観察時間は、プラスミドDNAを含む培地を添加して細胞チャンバーを調製した時点を基準とした。観察12時間後の結果の一例を図8に示す。図8Aは、40倍の対物レンズを使用して観察した透過像を示し、図8Bは、その蛍光像を示す。図8Bにおいて発光している細胞が、DNAの自然導入が行われた細胞である。このように、自然条件では、前記プラスミドDNAが、前記細胞に導入される確率は著しく低いことが示された。
細胞に付着した金微粒子(BBInternational, EM. GC50)に対して、前記金微粒子から一定距離の培養液中にパルスレーザーを集光し、集光部で発生させた衝撃波を利用して、前記金微粒子の細胞内への導入を行った。なお、前記金微粒子の直径は、50nmであり、細胞チャンバー、細胞外物質導入層装置及び標的細胞は、実施例1と同様のものを使用した。
フェムト秒レーザーの集光位置を、金微粒子から約5μm離れた培養液中に代えて、金微粒子直下の標的細胞の細胞膜とした以外は、実施例2と同様にして、標的細胞上に付着した金微粒子を細胞内に導入した。細胞上に付着したいくつかの金微粒子のうち、1つの金微粒子の直下の細胞膜にレーザーを集光させた。その様子を図10に示す。
2 スペーサー
3 カバーガラス
4 細胞
5 薄膜
6 基板
8 標的細胞
10 細胞チャンバー
11 顕微鏡
12 ステージ
13 コンデンサーレンズ
14 対物レンズ
15 光源ランプ
16 CCDカメラ
17 パルスレーザー照射装置
18 λ/2板
19 偏光板
20 コリーメーターレンズ
21 ダイクロイックミラー
22 パルスレーザー
23 衝撃波
30 光学セル
31 細胞
32 導入する物質を含む液
33 パルスレーザー照射装置
34 パルスレーザー
35 レンズ
36 衝撃波
37 検出光
41 微粒子
Claims (18)
- 導入目的物質を細胞内に導入する方法であって、前記細胞を前記導入目的物質の存在する液中、ゲル中若しくはゲル表面に配置し、前記液若しくはゲル又は前記細胞にパルスレーザーを集光させて照射し、それにより生じた衝撃波により前記細胞の細胞膜の構造を一時的に変化させ、前記物質を細胞内に導入することを特徴とする導入方法。
- 前記細胞からの距離が1mm以内の位置にパルスレーザーを集光させる請求項1記載の導入方法。
- 前記パルスレーザーの集光部が、円形若しくは球形であり、前記円形若しくは球形の半径が、0を越え100μm以内である請求項1又は2記載の導入方法。
- 前記パルスレーザーの光密度が、5×105(watt)以上1018(watt)以下である請求項1から3のいずれかに記載の導入方法。
- 前記パルスレーザーの単発あたりのレーザー強度が、0.25nJ/pulse〜0.25×109nJ/pulseである請求項1から4のいずれかに記載の導入方法。
- 前記パルスレーザーの波長が、190nm〜20μmである請求項1から5のいずれかに記載の導入方法。
- 前記パルスレーザーが、フェムト秒レーザー及びピコ秒レーザーの少なくとも一方のレーザーである請求項1から6のいずれかに記載の導入方法。
- 前記細胞が、接着性細胞である請求項1から7のいずれかに記載の導入方法。
- 前記細胞が、浮遊性細胞である請求項1から7のいずれかに記載の導入方法。
- 前記導入目的物質が、DNA、RNA、ポリペプチド、タンパク質、脂質、糖類及びこれらの誘導体からなる群から選択される少なくとも一つである請求項1から9のいずれかに記載の導入方法。
- 前記導入目的物質が、微粒子又は修飾微粒子である請求項1から9のいずれかに記載の導入方法。
- 前記微粒子又は修飾微粒子の直径が、10nm〜100μmである請求項11に記載の導入方法。
- 前記微粒子が、金属、無機物、有機高分子、タンパク質微結晶からなる群から選択される少なくとも一つからなる微粒子である請求項11又は12に記載の導入方法。
- 請求項11から13のいずれかに記載の導入方法において、前記細胞を前記導入目的物質の存在する液中、ゲル中若しくはゲル表面に配置することに代えて、前記細胞を液中、ゲル中若しくはゲル表面に配置した後に、前記微粒子又は修飾微粒子を、前記細胞に付着するように配置し、この状態で、前記液若しくはゲル又は前記細胞にパルスレーザーを集光させて照射する導入方法。
- 請求項14に記載の方法において、前記液若しくはゲル又は前記細胞にパルスレーザーを集光させて照射することに代えて、前記微粒子又は修飾微粒子にパルスレーザーを集光させて照射する導入方法。
- 細胞外物質が導入された細胞の製造方法であって、請求項1から15のいずれかに記載の導入方法により導入目的物質である前記細胞外物質を前記細胞内に導入する工程を含む製造方法。
- 細胞外物質が遺伝子を含む請求項16に記載の製造方法。
- 形質転換細胞の製造方法であって、請求項1から15のいずれかに記載の導入方法により導入目的物質である遺伝子を宿主細胞に導入して形質転換する工程を含む製造方法。
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