WO2007129667A1 - 粒子の検出方法、その装置、分散液中の粒子の濃度差形成方法およびその装置 - Google Patents

粒子の検出方法、その装置、分散液中の粒子の濃度差形成方法およびその装置 Download PDF

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particles
shock wave
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particle size
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Nobuyuki Ichinose
Yoshiyuki Nonoguchi
Toshihiro Nakayama
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National University Corporation Kyoto Institute Of Technology
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    • G01N15/0255—Investigating particle size or size distribution with mechanical, e.g. inertial, classification, and investigation of sorted collections
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    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence

Definitions

  • the present invention relates to a particle detection method, an apparatus thereof, a concentration difference formation method for particles in a dispersion, and an apparatus thereof, and more particularly, a particle detection method performed for first and second particles having different particle diameters.
  • the present invention relates to a device, a method for forming a concentration difference of particles in a dispersion, and a device therefor.
  • Handling and processing of micro objects are fields that have received particular attention in recent years in relation to nanotechnology and biotechnology.
  • Manipulating micrometer-order objects with a laser beam under a microscope can be performed in a non-contact manner with laser tweezers.
  • modeling is performed by laser ablation or polymerization reaction using laser. It can be performed.
  • the combination of these techniques alone is not sufficient for bonding other objects to micro objects or injecting other substances.
  • a shock wave laser-induced shock wave
  • a shock wave generated by condensing a laser beam in a liquid with a microscope objective lens can give a strong acceleration to an object, so that a large force is required. It is considered effective as the power of
  • Electrophoresis and dielectrophoresis are methods for accelerating molecules in a uniform solution and giving a concentration difference.
  • electrophoresis only charged ions cannot be transferred by force.
  • These electrophoresis methods have a problem that it takes a long time for analysis or the like because the moving speed is low.
  • Chromatography using adsorption, permeation, or distribution equilibrium is a method that gives a concentration difference while moving substances, and is widely used as a method for separating and analyzing mixtures.
  • the ultracentrifugation method is applied to high molecular weight molecules and is used for molecular weight measurement and separation.
  • both of the latter methods include diffusion and movement of substances in principle, it is difficult to achieve both high resolution and high speed or downsizing.
  • Particles that can be accelerated are nanometer-order structures such as colloidal gold and polymer latex particles, or biological cells. Using the acceleration of these particles, marking is performed for enhanced Raman spectroscopy in the cell by injection into the cell under a microscope.
  • the object to be accelerated can be extended to a low molecular force polymer, and it is possible to impart a function depending on the molecule, and to analyze the molecular size.
  • a laser index method for injecting foreign substances into cells by laser-induced shock waves has been devised (Japanese Patent Laid-Open No. 2005 287419, Japanese Patent Laid-Open No. 2005 168495).
  • the present invention makes it possible to accelerate relatively large particles dispersed in a dispersion liquid by a laser-induced shock wave at high speed, and to give a concentration difference to the particles in the dispersion liquid. It gives the principle of chromatography (laser permeation chromatography). An apparatus for performing this, measuring, and separating is also within the scope of the present invention.
  • An object of the present invention is to provide a particle detection method capable of easily detecting particles in a dispersion in a short time.
  • Another object of the present invention is to provide a particle detection apparatus that can easily detect particles in a dispersion in a short time.
  • Still another object of the present invention is to provide a method for forming a concentration difference of particles in a dispersion that can be easily performed in a short time.
  • Still another object of the present invention is to provide an apparatus for forming a concentration difference of particles in a dispersion that can be easily performed in a short time.
  • the concentration difference referred to here is not only a case where the concentration of a predetermined particle gradually increases or decreases from a first region toward a second region different from the first region, for example, stepwise.
  • the density difference includes a spatial, that is, three-dimensional density difference.
  • the particle detection method according to the present invention is a dispersion in which first particles having a first particle size and second particles having a second particle size larger than the first particle size are dispersed.
  • the first particle is accelerated and moved at the first acceleration by the shock wave generation process in which a pulse laser is irradiated to generate a shock wave in the dispersion, and the shock wave generated by the shock wave generation process.
  • the first and second particles having different particle diameters dispersed in the dispersion liquid by the laser-induced shock wave are accelerated to form a portion having a high concentration of the accelerated particles. Particles can be detected.
  • Such laser-induced shock waves The particle can be accelerated in a short time, and the particles can be accelerated and moved according to the particle size.
  • Such a laser-induced shock wave can be easily generated in the dispersion using a pulse laser or the like. Therefore, the particles in the dispersion can be easily detected in a short time.
  • the particle includes a molecular assembly such as cholesterol particles and a molecule in a solution.
  • a molecular assembly such as cholesterol particles and a molecule in a solution.
  • the case where particles are detected and the particles are measured or separated is included in the particle detection referred to in this specification.
  • the case where part or all of the particles are dissolved is also within the scope of the present invention.
  • the particle size of the particles is calculated based on the hydrodynamic radius.
  • the first acceleration may include 0, and only the second particle may be accelerated and moved!
  • the detection step is a step of detecting the refractive index, absorbance or fluorescence intensity of the particles.
  • the second particle has a radius of 1 nm or more.
  • a particle detection apparatus uses a pulse laser generating means for generating a pulse laser and a pulse laser generated by the pulse laser generating means to obtain a first particle size.
  • Shock wave generating means for generating a shock wave in a dispersion in which the first particles having the second particle having a second particle size larger than the first particle diameter are dispersed, and the shock wave generated by the shock wave generating means
  • the moving speed difference providing means for accelerating and moving the first particles at the first acceleration, moving the second particles larger than the first acceleration, and accelerating and moving at the second acceleration, Detecting means for detecting the first or second particles moved by acceleration by the moving speed difference applying means.
  • Such a particle detection apparatus accelerates the first and second particles having different particle diameters dispersed in the dispersion liquid by a laser-induced shock wave, and forms a portion having a high concentration of the accelerated particles. Particles can be detected. Therefore, the particles in the dispersion can be easily detected in a short time.
  • a method for forming a concentration difference of particles in a dispersion includes a first particle having a first particle size and a second particle size larger than the first particle size.
  • a pulse laser is irradiated into the dispersion in which the second particles having a dispersion are generated, and a shock wave is generated in the dispersion.
  • the first wave is accelerated and moved at the first acceleration by the shock wave generating process and the shock wave generated by the shock wave generating process, and the second particle is accelerated at the second acceleration greater than the first acceleration.
  • a moving speed difference applying step for moving the image includes a first particle having a first particle size and a second particle size larger than the first particle size.
  • the first or second particles having different particle diameters dispersed in the dispersion liquid are accelerated and accelerated by a laser-induced shock wave.
  • a part having a high particle concentration can be formed. Therefore, the concentration difference of the particles in the dispersion can be easily formed in a short time.
  • an apparatus for forming a difference in concentration of particles in a dispersion includes a pulse laser generating unit that generates a pulse laser, and a pulse laser generated by the pulse laser generating unit.
  • Such a particle concentration difference forming apparatus in the dispersion liquid accelerates the first or second particles having different particle diameters dispersed in the dispersion liquid by the laser-induced shock wave, and the concentration of the accelerated particles High portions can be formed. Therefore, it is possible to easily form a concentration difference of the particles in the dispersion in a short time.
  • a permeation gel used in permeation gel chromatography or the like is unnecessary, and a solvent can be used as it is. Therefore, it can be configured at low cost.
  • it is possible to achieve both high resolution and high speed display or downsizing.
  • since such laser-induced shock waves can move relatively large particles, the high-molecular-weight particles that cannot normally be introduced by the cell membrane or cell wall are directly generated by the acceleration of the particles in the liquid by the laser. Can be injected into cells.
  • FIG. 1 is a conceptual diagram regarding a temporal change in fluorescence intensity at a position away from a shock wave generation point based on a concentration distribution change caused by a laser-induced shock wave.
  • FIG. 2 is a diagram showing an outline of the apparatus.
  • FIG. 3 is a schematic view showing a condensing position of laser light.
  • FIG. 4A Among the fluorescence intensities of biranin and pyrene- ⁇ -cyclodextrin 2: 2 clathrate aqueous solution measured by the apparatus of Figs. It is a graph which shows time dependence.
  • FIG. 4B Of the fluorescence intensities of biranin and pyrene- ⁇ -cyclodextrin 2: 2 clathrate aqueous solution measured by the apparatus of FIGS. 2 and 3, 1 064 nm of pyrene- ⁇ -cyclodextrin 2: 2 clathrate It is a graph which shows the delay time dependence of the laser pulse for 355nm fluorescence observation with respect to a laser pulse.
  • FIG. 5 Shock wave of fluorescence of a mixed solution of 3-arlinonaphthalene 8-ammonium sulfonate (hereinafter referred to as “ANS”) and egg albumin (hereinafter simply referred to as “albumin”) It is a figure which shows the influence by this.
  • ANS 3-arlinonaphthalene 8-ammonium sulfonate
  • albumin egg albumin
  • FIG. 6 is a conceptual diagram of laser permeation chromatography.
  • FIG. 7 is a conceptual diagram of a particle detection device in the laser permeation chromatography shown in FIG. 6, showing the position where an induced shock wave generated by a pulse laser is generated and the state after the particle has moved.
  • a pulse laser such as a Q-switched laser with a Q-switch
  • a condensing optical system such as a microscope, water, etc.
  • the laser beam can be condensed into the dispersion and a shock wave can be generated in the dispersion.
  • Dispersed in the dispersion are first particles having a first particle size and second particles having a second particle size larger than the first particle size.
  • Measurements of changes that occur in the dispersion liquid are optical detection methods such as absorption, fluorescence, and refractive index, and other physical property changes in the dispersion liquid are measured at high speed in the nanosecond force microsecond time range. Everything possible is possible.
  • the observation position must be several millimeters away from the condensing position on the order of millimeters.
  • the scale is such that particles having a particle size of several nanometers are moved in about several seconds.
  • shock wave front means the forefront in the propagation of the shock wave. Also, since small particles are not accelerated, it is considered that they are not elastic collisions of shock waves. This size dependence gives rise to the principle of discriminating particle size differences.
  • the propagation speed of this shock wave front is 2000-2200mZs. This speed is larger than the moving speed by electrophoresis or dielectrophoresis.
  • FIG. 1 is a conceptual diagram of the temporal change in fluorescence intensity at the focal position ( ⁇ ) of the excitation light source for observation located at a position distant from the shock wave generation point force based on the concentration distribution change caused by the laser-induced shock wave.
  • the vertical axis represents the concentration of the dispersion
  • the horizontal axis represents the distance (X) from the shock wave generation point force.
  • the function indicated by the solid line in Fig. 1 is the observation region function (F (x)).
  • observation region function is a function that represents the distribution of fluorescence intensity in the observation region from the position X in the direction of the excitation optical axis centered on the focal point position ⁇ of the excitation light source when the spatial distribution of concentration is monitored by fluorescence. is there.
  • the concentration distribution is not uniform, and is represented by a one-dot chain line in FIG. 1 and a concentration distribution function indicated by ⁇ .
  • the position of the shock wave front is also indicated by a one-dot chain line in FIG.
  • the concentration is high near the shock wave front where the concentration is low at the shock wave generation point.
  • the observed fluorescence intensity is expressed as an integral value for X of the product of the observation region function (F (x)) and the concentration distribution (C (t, X)) at that time, where X is the distance from the origin. It is considered to be proportional to the number 1 of.
  • Equation 1 the integration range relating to t corresponds to the observation gate width.
  • the position of the shock wave front also moves in the direction indicated by ⁇ in FIG. 1 to the position indicated by the two-dot chain line in FIG.
  • the cause of the concentration change of the shock wave is thought to be that the shock wave front is a high-pressure, high-density fluid, so that the particles receive a viscous resistance force proportional to the radius in the propagation direction.
  • the present invention is presumed to be based on the principle described above.
  • FIG. 1 An outline of an apparatus for performing time-resolved fluorescence spectroscopy by condensing a laser pulse in a dispersion sample under a microscope as shown in FIG.
  • the feature of this device is that the pulse laser condensing position and the fluorescence observation position in the dispersion can be spatially controlled by adjusting the focal position of an external laser spatial filter optical system.
  • Fig. 3 shows an example of the focal position of the shock wave generating laser (1064nm pulse laser) and the focal position of the fluorescence observation ultraviolet laser (355nm pulse laser).
  • the device shown in Fig. 2 uses two unit lasers, and their oscillation timing is controlled in nanosecond order by a delay circuit.
  • the condensing position of the ultraviolet laser is aligned with the focal point of the microscope, and the emitted fluorescence is focused on the optical fiber by the imaging lens at the top of the microscope and guided to the spectroscope.
  • the spatial resolution in the depth direction is determined by the magnification of the objective lens and the diameter of the optical fiber, and can be selected as required. Moreover, higher spatial resolution can be obtained by using a confocal microscope.
  • the dispersion liquid in which the first and second particles are dispersed is arranged in a region sandwiched between the cover glass and the slide glass as shown in FIG.
  • the prepared slide is provided with a ring-shaped resin ring interposed between the cover glass and the slide glass to secure a distance between the cover glass and the slide glass.
  • the control related to the above is performed by a control unit (not shown) included in the personal computer.
  • the particle concentration difference forming apparatus in the dispersion according to the present invention is a pulse laser.
  • the first and the second particles having the first particle diameter are generated by using a shock wave generating pulse laser and a pulse generator as a pulse laser generating means for generating a pulse, and a pulse laser generated by the pulse laser generating means.
  • a moving speed difference providing means for accelerating and moving the first particle at a first acceleration and moving the second particle at a second acceleration larger than the first acceleration by the shock wave
  • a control unit for accelerating and moving the first particle at a first acceleration and moving the second particle at a second acceleration larger than the first acceleration by the shock wave
  • a control unit for accelerating and moving the first particle at a first acceleration and moving the second particle at a second acceleration larger
  • the method for forming a concentration difference of particles in a dispersion includes a first particle having a first particle size and a second particle having a second particle size larger than the first particle size.
  • the first particle is accelerated at the first acceleration rate by the shock wave generation process that generates a shock wave in the dispersion liquid by irradiating the dispersion liquid with a pulse laser and the shock wave generated by the shock wave generation process.
  • the first and second particles having different particle diameters dispersed in the dispersion liquid by the laser-induced shock wave are accelerated, and a portion having a high concentration of the accelerated particles is formed. Particles can be detected.
  • Such a laser-induced shock wave can accelerate the particles in a short time, and can accelerate and move the particles according to the particle size.
  • Such a laser-induced shock wave can be easily generated in the dispersion using a pulse laser or the like. Therefore, it is possible to easily form a concentration difference of the particles in the dispersion in a short time.
  • the particle detection apparatus uses a shock wave generating tag laser and pulse generator as pulse laser generating means for generating a pulse laser, and a pulse laser generated by the pulse laser generating means.
  • Shock wave generation that generates a shock wave in a dispersion in which a first particle having a first particle size and a second particle having a second particle size larger than the first particle size are dispersed.
  • the first particle is accelerated and moved at the first acceleration by the shock wave generated by the shock wave generating means and the microscope including the objective lens and the optical fiber as the means, and the second particle is moved by the first acceleration.
  • Also big second Fluorescence observation as a detection means for detecting the first or second particle accelerated and moved by the moving speed difference providing means, and a control section as moving speed difference providing means for accelerating and moving at the second acceleration And a pulse generator.
  • the first particles having the first particle size and the second particles having the second particle size larger than the first particle size are dispersed.
  • the first particle is accelerated and moved at the first acceleration by the shock wave generation process of irradiating the dispersion liquid with a pulse laser to generate a shock wave in the dispersion liquid, and the shock wave generated by the shock wave generation process.
  • the first and second particles having different particle diameters dispersed in the dispersion liquid by the laser-induced shock wave are accelerated, respectively, and the high concentration portion of the accelerated particles is formed. Particles can be detected.
  • Such a laser-induced shock wave can accelerate the particles in a short time, and can accelerate and move the particles according to the particle size.
  • Such a laser-induced shock wave can be easily generated in the dispersion using a pulse laser or the like. Therefore, the particles in the dispersion can be easily detected in a short time.
  • a permeation gel used in permeation gel chromatography or the like is unnecessary, and a solvent can be used as it is. Therefore, it can be configured at low cost.
  • it is possible to achieve both high resolution and high speed display or downsizing.
  • laser-induced shock waves can move relatively large particles, high-molecular-weight particles that cannot normally be introduced by cell membranes or cell walls are directly introduced into the cell by accelerating the particles in the liquid by the laser. Can be injected inside.
  • the particle concentration difference forming apparatus in the dispersion may be configured to include a separating means for separating the particles. Specifically, a partition is provided between the accelerated first particle and the second particle so as to separate the first particle and the second particle. By doing so, the accelerated first and second particles can be separated in a short time and easily.
  • the particles are detected based on the fluorescence intensity of the particles.
  • the present invention is not limited to this, and the configuration is such that the particles are detected based on the refractive index and absorbance of the particles. Also good.
  • particles may be detected by performing other optical detection.
  • the force used to use a 1064 nm pulse laser as a shock wave generating laser is not limited to this, and a pulse laser having a nanosecond or microsecond pulse width of another wavelength.
  • the laser-induced shock wave may be generated by The intensity of the laser and the distance to the position where the laser-induced shock wave is generated can be arbitrarily changed depending on the size of the particle to be accelerated.
  • the size of the second particle is preferably a radius of lnm or more, more preferably a radius of 1 nm or more and 1 ⁇ m or less, and further preferably a radius of lnm or more and lOnm or less. Is preferred. : When the particle size is larger than m, the effect of deceleration due to viscous resistance is effective, so the difference in the moving speed between the first particle and the second particle is reduced, making it difficult to form a concentration difference. You are. The reason why it is preferably lOnm or less is that the effect of deceleration due to viscous resistance is considered to be less. In addition, at least with the above structure, particles having a radius of 1 nm or more can be accelerated.
  • the dispersion liquid may include three or more kinds of particles having different particle diameters, and with the above structure, the particles may be accelerated and moved.
  • Figures 4A and 4B show the laser pulse for 355 nm fluorescence observation for the 1064 nm laser pulse of the fluorescence intensity of the aqueous solution of biranin and pyrene-y-cyclodextrin 2: 2 clathrate measured by the apparatus shown in Figures 2 and 3. It is a figure which shows delay time dependence of a process.
  • the intensity increases with time.
  • the arrival time of the shock wave at the observation point is about 2 OOns.
  • concentration of pyrene-y-cyclodextrin 2: 2 inclusion bodies at the observation point increased.
  • FIG. 5 shows the influence of the shock wave on the fluorescence of the mixed solution of ANS and albumin.
  • the laser intensity of the fundamental wave that generates shock waves is 1.7 mi / pulse
  • the distance between the focal points of the fundamental wave and the third harmonic is 200 m
  • the observation gate width is 50 ns.
  • the concentration of albumin in the buffer solution is 1.
  • the size of the albumin particle as the second particle is about 4 nm in diameter
  • the size of the ANS particle as the first particle is about 0.6 nm in diameter.
  • the buffer solution exhibits strong fluorescence due to the incorporation of ANS into albumin.
  • ANS incorporated into albumin is referred to as “albumin 'ANS”.
  • ANS that is not incorporated into albumin (hereinafter referred to as “free ANS”) is also fluorescent, but its intensity is weak.
  • the two fluorescences can be distinguished because the observed wavelengths are different.
  • the ANS albumin 1 for captured at 1, the concentration of free ANS is 2. may be considered that almost unchanged at 9 X 10- 4 M.
  • Figure 6 shows a conceptual diagram of laser permeation chromatography.
  • the sample mixture introduced at point A is accelerated by the shock wave generated by the laser pulse and moves in the direction of B.
  • the degree of acceleration is different, so that the particles are spatially divided according to the particle size. Therefore, by continuously flowing the solvent, at point B, signals corresponding to the component particles in the mixture and their amounts are obtained at different timings.
  • FIG. 7 is a conceptual diagram showing the detection process by the laser permeation chromatography shown in FIG. 6, and shows the position where the induced shock wave generated by the pulse laser is generated and the state after the particles move.
  • the first particles Q having the first particle diameter and the first particles And second particles Q having a second particle size larger than the particle size of the particles are dispersed.
  • a shock wave is generated by a pulse laser at a position indicated by a dot. Then, the second particle Q having the second particle size is moved at the second acceleration in the direction indicated by the arrow R in FIG.
  • the first particle Q having the first particle size smaller than the second particle size is accelerated by the first acceleration and observed near the point P where the shock wave is generated.
  • the observation can be detected by fluorescence or scattering in the direction indicated by the arrow in FIG. In this way, separate measurements are taken.
  • the osmotic gel is unnecessary and the solvent can be used as it is.
  • the penetrating part is several millimeters long and is irradiated by several pulses of laser, depending on the molecular weight. Acceleration from the condensing part and penetrating are performed, and ultra-high molecular weight measurement (Laser Permeation Chromatography) ) Will be pretty. In this case, the molecular weight is estimated even if it is a molecular complex that cannot be analyzed by ordinary gel permeation chromatography, and it cannot be separated by electrophoresis. It is also possible to analyze compounds. Furthermore, it is considered that molecular fractionation can be achieved by using the microchannel system together.
  • the range of molecules that can be accelerated is limited by the hydrodynamic radius, but the molecular charge required for electrophoresis is not necessary. Therefore, it can be applied to the analysis of non-electrolyte biomolecules such as sugar. In other words, it depends on the molecular size, and as a single molecule, the higher the molecular weight, such as a polymer, the greater the acceleration. Therefore, small molecules with low molecular weight cannot be accelerated as they are, but it is possible to accelerate low molecules using inclusion. For example, low molecules can be accelerated by inclusion with cyclodextrin, calixarene, etc., and formation of high molecular weight low molecular complexes. In addition, molecular aggregates formed by low molecules can be accelerated, and micelles, vesicles, dye aggregates, and microcrystals can be considered.

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Abstract

　粒子の検出方法は、第一の粒径を有する第一の粒子と第一の粒径よりも大きい第二の粒径を有する第二の粒子とが分散した分散液中にパルスレーザーを照射し、分散液中に衝撃波を発生させる衝撃波発生工程と、衝撃波発生工程によって発生した衝撃波により、第一の粒子を第一の加速度で加速して移動させ、第二の粒子を第一の加速度よりも大きい第二の加速度で加速して移動させる移動速度差付与工程と、第一または第二の粒子を検出する検出工程とを備える。

Description

明 細 書
粒子の検出方法、その装置、分散液中の粒子の濃度差形成方法および その装置
技術分野
[0001] この発明は、粒子の検出方法、その装置、分散液中の粒子の濃度差形成方法およ びその装置に関し、特に、粒径の異なる第一および第二の粒子について行う粒子の 検出方法、その装置、分散液中の粒子の濃度差形成方法およびその装置に関する ものである。
背景技術
[0002] 微小物体の取り扱い操作、加工は、ナノテクノロジーやバイオテクノロジーに関連し て近年特に注目されて ヽる分野である。顕微鏡下にお ヽてマイクロメーターオーダー の物体をレーザー光により操作することは、レーザーピンセットにより非接触で行うこ とができ、また、加工については、レーザーアブレーシヨンやレーザーによる重合反 応により造形を行うことができる。さらに、微小物体に対して他の物体を接合すること や他の物質を注入することは、これら技術の組み合わせのみでは不十分である。レ 一ザ一光を顕微鏡の対物レンズにより液体中に集光して発生する衝撃波（レーザー 誘起衝撃波）は、物体に強い加速度を与えることができるため、大きな力を必要とす る作業を行うための動力として有効と考えられる。
[0003] ここで、上記に関連した技術力、特開 2003— 210159号公報、特開 2003— 3442 60号公報、特開 2005— 144538号公報、特開 2005— 335020号公報、特開 200 5— 287419号公報、特開 2005— 168495号公報、 Appl. Phys. Lett. , 84, 294 0 (2004)、 Appl. Phys. A, 79, 795 (2004)【こ開示されて! /、る。
[0004] 均一溶液中の分子を加速し、濃度差を与える方法として電気泳動法や誘電泳動法 があるが、電気泳動法では電荷をもつイオンのみし力移動させることができない。これ らの泳動法では、移動速度が小さいため、分析等の時間がかかる問題がある。また、 吸着や浸透、あるいは分配平衡を用いたクロマトグラフィーは、物質を移動させなが ら濃度差を与える方法であり、混合物の分離'分析方法として広く用いられている。一 方、超遠心分離法は、高分子量の分子に対して適用され、分子量測定や分離に用 いられている。しかし、後者のいずれの方法も原理的に物質の拡散、移動を含むた め、高い分離能と高速ィ匕あるいは小型化を両立することは困難である。
[0005] すなわち、従来における電気泳動法や誘電泳動法では、その対象が電荷を持つィ オンに限られ、移動速度が小さいことが問題である。また、従来におけるクロマトダラ フィーや超遠心分離法では、高い分離能と高速化あるいは小型化を両立することは 困難である。
[0006] ここで、顕微鏡等を用いて液体内にパルスレーザーを集光して衝撃波を発生させる ことは多くの研究者が行っており、その発生機構等が研究されている (Appl. Phys. Lett. , 84, 2940 (2004)、 Appl. Phys. A, 79, 795 (2004) )。このレーザー誘 起衝撃波を利用した公知技術にお!、ては、細胞および細胞の一部分の分離 (特開 2 003— 210159号公報）、粒子のカロ速'移動（Appl. Phys. A, 79, 795 (2004) )、 粒子の進行方向制御（特開 2003— 344260号公報）、微小物体の加工 (特開 2005 144538号公報、特開 2005— 335020号公報）などがある。加速できる粒子とし ては、金コロイド、高分子ラテックス粒子などのナノメートル力もマイクロメーターォー ダ一の構造体、または生体細胞である。これらの粒子の加速を利用して顕微鏡下で 細胞への注入による細胞内の増強ラマン分光を意図したマーキングを行なっている 。本発明では、加速する対象を低分子力 高分子までに拡げることを可能であること を見出しており、分子に依存した機能の付与、分子サイズの分析などが可能である。 また、レーザー誘起衝撃波により細胞内へ外来物質を注入するレーザーインジヱク シヨン方法力 S考案されて ヽる（特開 2005 287419号公報、特開 2005 168495 号公報)。
[0007] すなわち、上記した特開 2003— 210159号公報、特開 2003— 344260号公報、 特開 2005— 144538号公報、特開 2005— 335020号公報、特開 2005— 287419 号公報、特開 2005— 168495号公報、 Appl. Phys. Lett. , 84, 2940 (2004)、 Appl. Phys. A, 79, 795 (2004)によると、特定の粒子や糸田胞に限られたカロ工ゃ 細胞注入に関する技術であり、粒径の異なる第一および第二の粒子が分散液中に 存在する場合に対応することができな ヽ。 発明の開示
[0008] 本発明は、レーザー誘起衝撃波により分散液中に分散している比較的大きな粒子 を高速で加速し、分散液中の粒子に濃度差を与えることができることを可能にし、パ ルスレーザーによるクロマトグラフィーの原理（レーザー浸透クロマトグラフィー）を与 えるものである。また、このことを行い、計測、分離を行う装置についても本発明の範 囲である。
[0009] この発明の目的は、短時間で、かつ、容易に分散液中の粒子を検出することができ る粒子の検出方法を提供することである。
[0010] また、この発明の他の目的は、短時間で、かつ、容易に分散液中の粒子を検出す ることができる粒子の検出装置を提供することである。
[0011] この発明のさらに他の目的は、短時間で、かつ、容易に行うことができる分散液中 の粒子の濃度差形成方法を提供することである。
[0012] この発明のさらに他の目的は、短時間で、かつ、容易に行うことができる分散液中 の粒子の濃度差形成装置を提供することである。
[0013] なお、ここでいう濃度差とは、例えば、第一の領域から第一の領域と異なる第二の 領域に向かって徐々に所定の粒子の濃度が増減するもののみならず、段階的に所 定の粒子の濃度が増減する濃度勾配、さらには相対的に所定の粒子の濃度の高い 部分と所定の粒子の低い部分とを二極化させて濃度差を形成するものも含めるもの である。ここで、濃度差は、空間的、すなわち 3次元的な濃度差を含めるものである。
[0014] この発明に係る粒子の検出方法は、第一の粒径を有する第一の粒子と第一の粒径 よりも大きい第二の粒径を有する第二の粒子とが分散した分散液中にパルスレーザ 一を照射し、分散液中に衝撃波を発生させる衝撃波発生工程と、衝撃波発生工程 によって発生した衝撃波により、第一の粒子を第一の加速度で加速して移動させ、 第二の粒子を第一の加速度よりも大きい第二の加速度で加速して移動させる移動速 度差付与工程と、第一または第二の粒子を検出する検出工程とを備える。
[0015] このような粒子の検出方法は、レーザー誘起衝撃波によって分散液中に分散した 粒径の異なる第一および第二の粒子をそれぞれ加速し、加速された粒子の濃度の 高い部分を形成して、粒子を検出することができる。このようなレーザー誘起衝撃波 は、短時間で粒子を加速することができ、かつ、粒径に応じて粒子を加速して移動さ せることができる。また、このようなレーザー誘起衝撃波は、パルスレーザー等を用い て分散液中に容易に発生させることができる。したがって、短時間で、かつ、容易に 分散液中の粒子の検出を行うことができる。
[0016] なお、この明細書中、粒子とは、たとえば、コレステロール粒子のような分子集合体 や溶液中の分子も含めるものとする。また、粒子を検出し、粒子の測定や、粒子の分 離を行う場合についても、この明細書でいう粒子の検出に含めるものとする。なお、 粒子の一部または全部が溶解した場合についても、本発明の範囲である。また、粒 子の粒径は、流体力学的半径を基に算出されるものである。ここで、第一の加速度は 0を含み、第二の粒子のみを加速して移動させるようにしてもよ!、。
[0017] 好ましくは、検出工程は、粒子の屈折率、吸光度または蛍光強度を検出する工程 である。
[0018] さらに好ましくは、第二の粒子は、半径 lnm以上である。
[0019] この発明の他の局面においては、粒子の検出装置は、パルスレーザーを発生させ るパルスレーザー発生手段と、パルスレーザー発生手段によって発生させたパルス レーザーを用いて、第一の粒径を有する第一の粒子と第一の粒径よりも大きい第二 の粒径を有する第二の粒子とが分散した分散液中に衝撃波を発生させる衝撃波発 生手段と、衝撃波発生手段によって発生した衝撃波により、第一の粒子を第一の加 速度で加速して移動させ、第二の粒子を第一の加速度よりも大き!、第二の加速度で 加速して移動させる移動速度差付与手段と、移動速度差付与手段によって加速して 移動された第一または第二の粒子を検出する検出手段とを備える。
[0020] このような粒子の検出装置は、レーザー誘起衝撃波によって分散液中に分散した 粒径の異なる第一および第二の粒子をそれぞれ加速し、加速された粒子の濃度の 高い部分を形成して、粒子を検出することができる。したがって、短時間で、かつ、容 易に分散液中の粒子の検出を行うことができる。
[0021] この発明のさらに他の局面においては、分散液中の粒子の濃度差形成方法は、第 一の粒径を有する第一の粒子と第一の粒径よりも大きい第二の粒径を有する第二の 粒子とが分散した分散液中にパルスレーザーを照射し、分散液中に衝撃波を発生さ せる衝撃波発生工程と、衝撃波発生工程によって発生した衝撃波により、第一の粒 子を第一の加速度で加速して移動させ、第二の粒子を第一の加速度よりも大きい第 二の加速度で加速して移動させる移動速度差付与工程とを備える。
[0022] このような分散液中の粒子の濃度差形成方法によると、レーザー誘起衝撃波によつ て分散液中に分散した粒径の異なる第一または第二の粒子を加速し、加速された粒 子の濃度の高い部分を形成することができる。したがって、短時間で、かつ、容易に 分散液中の粒子の濃度差を形成することができる。
[0023] この発明のさらに他の局面においては、分散液中の粒子の濃度差形成装置は、パ ルスレーザーを発生させるパルスレーザー発生手段と、パルスレーザー発生手段に よって発生させたノ ルスレーザーを用いて、第一の粒径を有する第一の粒子と第一 の粒径よりも大きい第二の粒径を有する第二の粒子とが分散した分散液中に衝撃波 を発生させる衝撃波発生手段と、衝撃波発生手段によって発生した衝撃波により、 第一の粒子を第一の加速度で加速して移動させ、第二の粒子を第一の加速度よりも 大きい第二の加速度で加速して移動させる移動速度差付与手段とを備える。
[0024] このような分散液中の粒子の濃度差形成装置は、レーザー誘起衝撃波によって分 散液中に分散した粒径の異なる第一または第二の粒子を加速し、加速された粒子の 濃度の高い部分を形成することができる。したがって、短時間で、かつ、容易に分散 液中の粒子の濃度差を形成することができる。
[0025] また、これらの発明によると、たとえば、浸透ゲルクロマトグラフィー等において使用 される浸透ゲルが不要であり、溶媒をそのまま用いることができる。したがって、安価 に構成することができる。また、高い分解能と高速ィ匕あるいは小型化を両立すること ができる。また、このようなレーザー誘起衝撃波は、比較的大きな粒子も移動させるこ とができるため、レーザーによる液体中の粒子の加速により、通常では細胞膜や細胞 壁により導入できないような高分子量の粒子を直接細胞内に注入できる。
図面の簡単な説明
[0026] [図 1]レーザー誘起衝撃波による濃度分布変化に基づく衝撃波発生点から離れた位 置における蛍光強度の時間変化に関する概念図である。
[図 2]装置の概略を示す図である。 [図 3]レーザー光の集光位置を示す概略図である。
[図 4A]図 2、 3の装置により測定されたビラニンおよびピレン一 γ—シクロデキストリン 2 : 2包接体水溶液の蛍光強度のうち、ビラニンの 1064nmレーザーパルスに対する 355nm蛍光観測用レーザーノ ルスの遅延時間依存性を示すグラフである。
[図 4B]図 2、 3の装置により測定されたビラニンおよびピレン一 γ—シクロデキストリン 2 : 2包接体水溶液の蛍光強度のうち、ピレン一 γ—シクロデキストリン 2 : 2包接体の 1 064nmレーザーパルスに対する 355nm蛍光観測用レーザーパルスの遅延時間依 存性を示すグラフである。
[図 5]3—ァ-リノナフタレン一 8—スルホン酸アンモ-ゥム（以下、「ANS」と称する。 ) と卵アルブミン (以下、単に「アルブミン」と称する）との混合溶液の蛍光の衝撃波によ る影響を示す図である。
[図 6]レーザー浸透クロマトグラフィーの概念図である。
[図 7]図 6に示すレーザー浸透クロマトグラフィーのうち、粒子の検出装置に関する概 念図であり、パルスレーザーによる誘起衝撃波を発生させる位置および粒子が移動 した後の状態を示す。
発明を実施するための最良の形態
[0027] 以下、この発明の実施の形態を、図面を参照して説明する。まず、原理について説 明する。 Q—スィッチを有するャグレーザーのようなパルスレーザー、顕微鏡などの 集光光学系、水などを用いて、レーザー光を分散液中に集光して分散液中に衝撃 波を発生できる仕組みになっている。分散液中には、第一の粒径を有する第一の粒 子と、第一の粒径よりも大きい第二の粒径を有する第二の粒子とが分散している。分 散液中に起こる変化についての測定は、測定方法として吸収、蛍光、屈折率などの 光学検出、およびその他の分散液中の物性の変化を、ナノ秒力 マイクロ秒の時間 領域において高速で検出できるものならばすベて可能である。また、観測する位置 は、集光位置より数マイクロメートル力もミリメートルオーダーで離れて 、ることが必要 である。なお、この発明においては、粒径が数 nmの粒子を数 n秒程度で移動させる というスケーノレである。
[0028] 集光点における、光吸収、プラズマ発生を経て発生した衝撃波の伝播により粒子を 流体力学的に加速すると考えられる。このとき、粒子は、そのサイズ、すなわち、粒径 が大きい程加速を受けることから、衝撃波フロントにおける粘度が高圧のため高くなり 、衝撃波が粒子を追い越す際に粘性抵抗を生じ加速すると考えられる。ここで、衝撃 波フロントとは、衝撃波の伝播における最前面をいう。また、粒径の小さい粒子では 加速されないことから、衝撃波の弾性衝突ではないことが考えられる。このサイズ依 存性のために粒子サイズの違いを識別できる原理を生じる。なお、この衝撃波フロン トの伝播速度は、 2000〜2200mZsである。この速度は、電気泳動法や誘電泳動 法による移動速度よりも大き 、ものである。
[0029] この発明の原理について、さらに詳細に説明する。ここで、観測された蛍光強度の 時間変化は、次のように解釈できる。図 1は、レーザー誘起衝撃波による濃度分布変 化に基づく衝撃波発生点力 離れた位置にある観測用の励起光源の焦点位置 (χθ) における蛍光強度の時間変化に関する概念図である。図 1中、縦軸は、分散液の濃 度を示し、横軸は、衝撃波発生点力ゝらの距離 (X)を示す。また、図 1中、実線で示す 関数は、観測領域関数 (F (x) )である。ここで、観測領域関数とは、濃度の空間分布 を蛍光によりモニターする際、励起光源の焦点位置 χθを中心とする励起光軸方向の 位置 Xからの観測領域における蛍光強度の分布を表す関数である。
[0030] 図 1を参照して、衝撃波を発生させる以前 (t=0)では、分散液中の濃度分布は、 図 1中の点線で示すように均一（C = C )である。しかし、衝撃波発生後の時刻 t=t
0 1 においては、濃度分布は均一ではなぐ図 1中の一点鎖線および αで示す濃度分布 関数で表される。なお、衝撃波フロントの位置についても、図 1中の一点鎖線で示し ている。ここで、衝撃波発生点では濃度が低ぐ衝撃波フロント付近では濃度が高く なる。観測される蛍光強度は、発生点からの距離を Xとすると、観測領域関数 (F (x) ) と、その時刻における濃度分布 (C (t, X) )との積の Xに関する積分値としての数 1に 比例すると考えられる。
[0031] [数 1]
Figure imgf000009_0001
[0032] ここで、数 1中、 tに関する積分範囲は、観測ゲート幅に相当する。このように考える と、図 1において、 衝撃
Figure imgf000010_0001
波発生後の時刻 t=tにおいては、濃度分布は、図 1中の二点鎖線および j8で示す
2
濃度分布関数で表される。また、衝撃波フロントの位置についても、図 1中の二点鎖 線で示している。時刻 t=tでは蛍光強度は衝撃波発生前より強度が低くなることが
2
理解できる。また、衝撃波フロントの位置についても、図 1中の二点鎖線で示している 位置まで、図 1中の γで示す方向に移動する。衝撃波がこのような濃度変化を起こす 原因は、衝撃波フロントが高圧、高密度流体となっているため、粒子はその伝播方向 に、半径に比例する粘性抵抗力を受けるためであると考えられる。本発明は、上述の ような原理であると推定される。
[0033] 次に、装置について説明する。本発明に係る装置の例として、図 2に示すような顕 微鏡下において分散液試料中にレーザーパルスを集光し、時間分解蛍光分光を行 う装置の概略を示す。この装置の特徴は、外部に設けたレーザー空間フィルタ一光 学系の焦点位置を調整することにより、分散液中のパルスレーザー集光位置と蛍光 観測位置を空間的に制御することができる。
[0034] 図 3に、衝撃波発生用レーザー（1064nmパルスレーザー）の焦点位置と蛍光観測 用紫外レーザー（355nmパルスレーザー）集光位置の例を示す。図 2に示す装置で は、 2台のャグレーザーを用いており、それらの発振タイミングは、遅延回路によりナ ノ秒オーダーで制御されて ヽる。紫外レーザーの集光位置は顕微鏡の焦点と一致さ せており、そこ力 発せられる蛍光は、顕微鏡上部の結像レンズにより光ファイバ一 に集光されて分光器に導かれる。対物レンズの倍率および光ファイバ一の直径により 深さ方向の空間分解能が決まり、必要に応じて選択できる。また、顕微鏡を共焦点型 にすることにより、より高い空間分解能が得られる。
[0035] ここで、第一および第二の粒子が分散した分散液は、図 3に示すように、カバーガラ スとスライドガラスに挟まれた領域に配置される。これらにより形成されるプレパラート は、例えば、環状の榭脂製リングをカバーガラスとスライドガラスの間に介在させること により、カバーガラスとスライドガラスの間の距離が確保される。なお、上記に関する 制御は、パソコンに含まれる制御部（図示せず）により行なわれる。
[0036] すなわち、この発明に係る分散液中の粒子の濃度差形成装置は、パルスレーザー を発生させるパルスレーザー発生手段としての衝撃波発生用のャグレーザーおよび パルス発生器と、パルスレーザー発生手段によって発生させたパルスレーザーを用 いて、第一の粒径を有する第一の粒子と第一の粒径よりも大きい第二の粒径を有す る第二の粒子とが分散した分散液中に衝撃波を発生させる衝撃波発生手段としての 対物レンズおよび光ファイバ一を含む顕微鏡と、衝撃波発生手段によって発生した 衝撃波により、第一の粒子を第一の加速度で加速して移動させ、第二の粒子を第一 の加速度よりも大きい第二の加速度で加速して移動させる移動速度差付与手段とし ての制御部とを備える。
[0037] また、この発明に係る分散液中の粒子の濃度差形成方法は、第一の粒径を有する 第一の粒子と第一の粒径よりも大きい第二の粒径を有する第二の粒子とが分散した 分散液中にパルスレーザーを照射し、分散液中に衝撃波を発生させる衝撃波発生 工程と、衝撃波発生工程によって発生した衝撃波により、第一の粒子を第一の加速 度で加速して移動させ、第二の粒子を第一の加速度よりも大き!、第二の加速度で加 速して移動させる移動速度差付与工程とを備える。
[0038] このように構成することにより、レーザー誘起衝撃波によって分散液中に分散した粒 径の異なる第一および第二の粒子をそれぞれ加速し、加速された粒子の濃度の高 い部分を形成して、粒子を検出することができる。このようなレーザー誘起衝撃波は、 短時間で粒子を加速することができ、かつ、粒径に応じて粒子を加速して移動させる ことができる。また、このようなレーザー誘起衝撃波は、パルスレーザー等を用いて分 散液中に容易に発生させることができる。したがって、短時間で、かつ、容易に分散 液中の粒子の濃度差を形成することができる。
[0039] また、この発明に係る粒子の検出装置は、パルスレーザーを発生させるパルスレー ザ一発生手段としての衝撃波発生用のャグレーザーおよびパルス発生器と、パルス レーザー発生手段によって発生させたパルスレーザーを用いて、第一の粒径を有す る第一の粒子と第一の粒径よりも大きい第二の粒径を有する第二の粒子とが分散し た分散液中に衝撃波を発生させる衝撃波発生手段としての対物レンズおよび光ファ ィバーを含む顕微鏡と、衝撃波発生手段によって発生した衝撃波により、第一の粒 子を第一の加速度で加速して移動させ、第二の粒子を第一の加速度よりも大きい第 二の加速度で加速して移動させる移動速度差付与手段としての制御部と、移動速度 差付与手段によって加速して移動された第一または第二の粒子を検出する検出手 段としての蛍光観測用のャグレーザーおよびパルス発生器とを備える。
[0040] また、この発明に係る粒子の検出方法は、第一の粒径を有する第一の粒子と第一 の粒径よりも大きい第二の粒径を有する第二の粒子とが分散した分散液中にパルス レーザーを照射し、分散液中に衝撃波を発生させる衝撃波発生工程と、衝撃波発生 工程によって発生した衝撃波により、第一の粒子を第一の加速度で加速して移動さ せ、第二の粒子を第一の加速度よりも大き!/、第二の加速度で加速して移動させる移 動速度差付与工程と、第一または第二の粒子を検出する検出工程とを備える。
[0041] こうすることにより、レーザー誘起衝撃波によって分散液中に分散した粒径の異なる 第一および第二の粒子をそれぞれ加速し、加速された粒子の濃度の高 、部分を形 成して、粒子を検出することができる。このようなレーザー誘起衝撃波は、短時間で粒 子を加速することができ、かつ、粒径に応じて粒子を加速して移動させることができる 。また、このようなレーザー誘起衝撃波は、パルスレーザー等を用いて分散液中に容 易に発生させることができる。したがって、短時間で、かつ、容易に分散液中の粒子 の検出を行うことができる。
[0042] さらに、この発明によると、たとえば、浸透ゲルクロマトグラフィー等において使用さ れる浸透ゲルが不要であり、溶媒をそのまま用いることができる。したがって、安価に 構成することができる。また、高い分解能と高速ィ匕あるいは小型化を両立することが できる。また、このようなレーザー誘起衝撃波は、比較的大きな粒子も移動させること ができるため、レーザーによる液体中の粒子の加速により、通常では細胞膜や細胞 壁により導入できないような高分子量の粒子を直接細胞内に注入できる。
[0043] なお、分散液中の粒子の濃度差形成装置は、粒子を分離する分離手段を備えるよ う構成してもよい。具体的には、加速された第一の粒子と第二の粒子との間に仕切り を設け、第一の粒子と第二の粒子とを分離するようにする。こうすることにより、短時間 で、かつ、容易に、加速された第一および第二の粒子の分離を行うことができる。
[0044] なお、上記の実施の形態においては、粒子の蛍光強度により、粒子を検出すること にしたが、これに限らず、粒子の屈折率や吸光度により、粒子を検出する構成として もよい。さらに、その他の光学検出を行なうことにより、粒子を検出することにしてもよ い。
[0045] また、上記の実施の形態においては、衝撃波発生用レーザーとして 1064nmのパ ルスレーザーを用いることにした力 これに限らず、他の波長のナノ秒またはマイクロ 秒のパルス幅を有するパルスレーザーによりレーザー誘起衝撃波を発生させることに してもよい。なお、加速させる粒子の大きさ等により、レーザーの強度やレーザー誘 起衝撃波を発生させる位置までの距離等は、任意に変更可能である。
[0046] また、第二の粒子の大きさとしては、半径 lnm以上であることが好ましぐさらに半 径 lnm以上 1 μ m以下であることが好ましぐさらに半径 lnm以上 lOnm以下である ことが好ましい。： mよりも大きい粒径では、粘性抵抗による減速の効果があるため 、第一の粒子と第二の粒子との移動速度差が小さくなり、濃度差の形成が困難にな ると考えられるカゝらである。 lOnm以下であることが好ましいのは、粘性抵抗による減 速の効果がより少ないと考えられるからである。また、少なくとも上記構成とすることに より、半径 lnm以上の粒子を加速することができる。
[0047] さらに、分散液は、粒径の異なる三種類以上の粒子を含み、上記構成により、これ ら粒子をそれぞれ加速して移動させる構成としてもょ ヽ。
[0048] 以下に、実験例を示す。図 4Aおよび図 4Bは、図 2および図 3によって示される装 置により測定されたビラニンおよびピレン一 y—シクロデキストリン 2： 2包接体水溶液 の蛍光強度の 1064nmレーザーパルスに対する 355nm蛍光観測用レーザーパル スの遅延時間依存性を示す図である。
[0049] 図 4Aおよび図 4Bを参照して、 1064nmレーザーパルス照射により衝撃波発生後 の集光点力 約 300 μ m離れた観測点でのピレン一 y—シクロデキストリン 2： 2包接 体の蛍光強度は、時間とともに増加している。衝撃波の観測点への到達時間は、約 2 OOnsである。しカゝし、ビラニンではそのような効果はみられない。このことは、ピレン一 y—シクロデキストリン 2 : 2包接体の観測点における濃度が増大したことを示している 。第一の粒子としてのビラニンおよび第二の粒子としてのピレン一 γ—シクロデキスト リン 2 : 2包接体での結果の違いは、それらの流体力学的半径が 0. 3nmおよび 1. On mであることに起因する加速効果の違 、である。 [0050] 次に、他の実験例を示す。図 5は、 ANSとアルブミンとの混合溶液の蛍光の衝撃波 による影響を示す図である。なお、衝撃波を発生させる基本波のレーザー強度は、 1 . 7mi/pulse,基本波と第三高調波との焦点間の距離を 200 m、観測ゲート幅を 50nsとしている。また、緩衝溶液中のアルブミンの濃度を 1. O X 10_5M、 ANSの濃 度を 3. 0 X 10_4Mとする。ここで、第二の粒子としてのアルブミン粒子の大きさは、直 径約 4nmであり、第一の粒子としての ANS粒子の大きさは、直径約 0. 6nmである。
[0051] 図 5を参照して、緩衝溶液は、 ANSがアルブミンに取り込まれることにより、強い蛍 光性を示す。以下、 ANSがアルブミンに取り込まれたものを、「アルブミン 'ANS」と いう。アルブミンに取り込まれていない ANS (以下、「遊離 ANS」という）も蛍光性を示 すが、その強度は弱い。また、両者の蛍光は、観測される波長が異なるため、区別す ることができる。この場合、 ANSはアルブミンに 1： 1で取り込まれるため、遊離 ANS の濃度は、 2. 9 X 10—4 Mでほぼ変わらないと考えてよい。この溶液にレーザー衝撃 波を作用させ、 200 m離れた位置で蛍光を観測すると、アルブミン 'ANSからの蛍 光の遊離 ANSからの蛍光に対する相対強度力 観測点への衝撃波到達時間付近 で高くなり、その後減少している。このことも衝撃波がアルブミンへの作用により、伝播 方向への移動を起こし、サイズの小さい ANSに対しては、ほとんど影響を及ぼさない ことを示している。このようにして、粒子の粒径の違いによる粒子分別が可能であるこ とを強く示唆している。
[0052] 次に、応用例について示す。図 6にレーザー浸透クロマトグラフィーの概念図を示 す。 A点に導入された試料混合物は、レーザーパルスにより発生した衝撃波により加 速を受け、 Bの方向へ移動する。このとき、混合物中の粒子の流体力学的半径が異 なると加速を受ける程度が異なるので、空間的に粒子サイズにより分けられることにな る。そこで、溶媒を連続的に流すことにより、 B点では、時間的に異なるタイミングで混 合物中の成分粒子とその量に対応する信号を得ることになる。
[0053] これを、さらに具体的に説明する。図 7は、図 6に示すレーザー浸透クロマトグラフィ 一による検出工程を示す概念図であり、パルスレーザーによる誘起衝撃波を発生さ せる位置および粒子が移動した後の状態を示す。
[0054] 図 6、図 7を参照して、分散液中には、第一の粒径を有する第一の粒子 Qと、第一 の粒径よりも大きい第二の粒径を有する第二の粒子 Qとが分散している。ここで、 P
2
点で示される位置においてパルスレーザーによる衝撃波を発生させる。そうすると、 第二の粒径を有する第二の粒子 Qは図 7中の矢印 Rで示す方向に第二の加速度で
2
大きく加速され、衝撃波発生点である P点よりも遠い地点で観測される。また、第二の 粒径よりも小さい第一の粒径を有する第一の粒子 Qは、第一の加速度で小さく加速 され、衝撃波発生点である P点付近で観測される。ここで、観測は、図 7中の矢印で 示す方向への蛍光または散乱により検出することができる。このようにして、分離して 計測する。
[0055] 以上、図面を参照してこの発明の実施形態を説明した力 この発明は、図示した実 施形態のものに限定されない。図示した実施形態に対して、この発明と同一の範囲 内において、あるいは均等の範囲内において、種々の修正や変形をカ卩えることが可 能である。
産業上の利用可能性
[0056] 本発明の利用分野として、以下のようなものが挙げられる。
[0057] ·サイズ依存性を利用した浸透クロマトグラフィーの高速 ·小型化、分子量測定等の 分析'分取への応用。
[0058] この場合の利点として、浸透ゲルが不要であり溶媒をそのまま用いることができる。
浸透を行う部分は数ミリの長さでよぐ数パルスのレーザー照射により分子量に応じて 集光部分からの加速 ·浸透が行われ、超高速の分子量測定 (レーザー浸透クロマトグ ラフィー（Laser Permeation Chromatography) )が可會 になると考えられる。ま た、この場合には、通常のゲル浸透クロマトグラフィーで分析できない分子複合体に っ ヽても分子量を推定できる特徴を持ち、電気泳動法では分離できな ヽ電荷を持た ない中性の高分子量ィ匕合物の分析も可能と考えられる。さらに、マイクロ流路系と併 用することにより分子の分別分取も可能となると考えられる。
[0059] ·細胞等への分子注入による選択的生体操作、マーキング、遺伝子操作。
[0060] レーザーによる溶液中の分子の加速により、通常では細胞膜や細胞壁により導入 できないような高分子量の分子を直接細胞内に注入できる。また、包接現象を利用 すると低分子量の薬物等を非接触で細胞に注入できるため、その生細胞への効果を 調べることができる。同様に細胞に類似したマイクロカプセルなどの調製後の加工、 マイクロカプセル内反応の触媒注入による開始などが考えられる。
本発明においては、加速を行うことができる分子の範囲が流体力学的半径により制 限されるが、電気泳動法で必要な分子の電荷は必要ではない。そのため、糖のよう な非電解質生体分子の分析にも応用可能と考えられる。つまり、分子サイズ依存性 があり、単分子としては高分子のような分子量の大きいもの程大きく加速を受ける。し たがって、低分子量の小さい分子はそのままでは加速できないが、包接化を利用し た低分子の加速が可能である。その例として、シクロデキストリン、カリックスアレン等 による包接、高分子 低分子複合体の形成により低分子を加速することができる。ま た、低分子が形成する分子会合体の加速が可能であり、ミセル、べシクル、色素会合 体、微結晶などが考えられる。

Claims

請求の範囲
[1] 第一の粒径を有する第一の粒子と前記第一の粒径よりも大きい第二の粒径を有する 第二の粒子とが分散した分散液中にパルスレーザーを照射し、前記分散液中に衝 撃波を発生させる衝撃波発生工程と、
前記衝撃波発生工程によって発生した衝撃波により、前記第一の粒子を第一の加 速度で加速して移動させ、前記第二の粒子を前記第一の加速度よりも大き!/、第二の 加速度で加速して移動させる移動速度差付与工程と、
前記第一または第二の粒子を検出する検出工程とを備える、粒子の検出方法。
[2] 前記検出工程は、粒子の屈折率、吸光度または蛍光強度を検出する工程である、請 求項 1に記載の粒子の検出方法。
[3] 前記第二の粒子は、半径 lnm以上である、請求項 1に記載の粒子の検出方法。
[4] パルスレーザーを発生させるパルスレーザー発生手段と、
前記パルスレーザー発生手段によって発生させた前記パルスレーザーを用いて、 第一の粒径を有する第一の粒子と前記第一の粒径よりも大きい第二の粒径を有する 第二の粒子とが分散した分散液中に衝撃波を発生させる衝撃波発生手段と、 前記衝撃波発生手段によって発生した衝撃波により、前記第一の粒子を第一の加 速度で加速して移動させ、前記第二の粒子を前記第一の加速度よりも大き!、第二の 加速度で加速して移動させる移動速度差付与手段と、
前記移動速度差付与手段によって加速して移動された前記第一または第二の粒 子を検出する検出手段とを備える、粒子の検出装置。
[5] 第一の粒径を有する第一の粒子と前記第一の粒径よりも大きい第二の粒径を有する 第二の粒子とが分散した分散液中にパルスレーザーを照射し、前記分散液中に衝 撃波を発生させる衝撃波発生工程と、
前記衝撃波発生工程によって発生した衝撃波により、前記第一の粒子を第一の加 速度で加速して移動させ、前記第二の粒子を前記第一の加速度よりも大き!、第二の 加速度で加速して移動させる移動速度差付与工程とを備える、分散液中の粒子の 濃度差形成方法。
[6] パルスレーザーを発生させるパルスレーザー発生手段と、 前記パルスレーザー発生手段によって発生させた前記パルスレーザーを用いて、 第一の粒径を有する第一の粒子と前記第一の粒径よりも大きい第二の粒径を有する 第二の粒子とが分散した分散液中に衝撃波を発生させる衝撃波発生手段と、 前記衝撃波発生手段によって発生した衝撃波により、前記第一の粒子を第一の加 速度で加速して移動させ、前記第二の粒子を前記第一の加速度よりも大き!、第二の 加速度で加速して移動させる移動速度差付与手段とを備える、分散液中の粒子の 濃度差形成装置。
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