KR20060120178A - 세포 투과화 방법 및 장치 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 세포 내부 및 외부로 물질들을 도입 및 방출하기 위한 방법 및 장치에 관한 것으로, 보다 상세하게는 이온, 단백질 및 핵산과 같은 여러가지 물질들중 임의의 1종 이상을 세포에 적재하거나 또는 세포 외부로 방출할 수 있도록 살아있는 세포를 일시적으로 투과화하기 위한 방법 및 장치에 관한 것이다.
세포 막 투과화, 장치

Description

세포 투과화 방법 및 장치{METHOD AND APPARATUS FOR CELL PERMEABILIZATION}
본 발명은 세포 내부 및 외부로 물질들을 도입 및 방출하기 위한 방법 및 장치에 관한 것으로, 보다 상세하게는 이온, 단백질 및 핵산과 같은 여러가지 물질들중 임의의 1종 이상을 세포 내부로 적재하거나 또는 세포 외부로 방출할 수 있도록 살아있는 세포를 일시적으로 투과화하기 위한 방법 및 장치에 관한 것이다.
세포내 물질 도입의 중요성 및 임의의 이상적인 공정 결여는 수많은 기술 개발로 귀결되어 왔다. 예를 들면, DNA는 예컨대, 칼슘 포스페이트 침전, 리포좀, 양이온성 지질, DEAE-덱스트란, 바이러스 벡터, 전기천공(electroporation), 폴리에틸렌이민류, 펩티드-매개 유전자 전달, 활성화된 덴드리머류, 폴리아민류, 폴리-L-오르니틴 및 볼리스틱스(bolistics), 비드-로딩(bead-loading) 및 면역천공(immunoporation)과 같은 비드를 기본으로한 방법으로 도입될 수 있다. 이러한 방법들은, 일반적으로 (i) 단지 하나의 물질만 도입되는 적용성, (ii) 세포에 대한 유해 효과(예, 세포 생존 및 성장 감소, 생리기능 변형), (iii) 생물에 대한 유해 효과(예, 백혈병 유발), (iii) 효율 불량 및 (iv) 도입된 물질의 손상을 포함한, 다수의 문제점들을 가지고 있다.
미세주입은 물질들을 세포내로 물리적으로 적재하기 위하여 모세관을 이용하는 기법이다. 이 방법은, 다른 기법들과는 맞지 않는 물질들을 세포에 선택적으로 주입할 수 있기 때문에, 유용하며, 전술한 많은 기술들과 관련된 한계점 및 잠재적인 문제점들을 가지고 있지 않다. 미세주입은 실제 임의의 물질을 심지어 세포기관들에도 미세주입할 수 있다는 점에서 다목적으로 이용된다. 그러나, 값비싼 노동력 및 매우 낮은 성능은 이러한 방법을 전문화된 용도로 사용하는 것을 제한한다. 성능이 우수하며 세포내에 물질을 적재할 수 있는 다재다능한 방법이 요구된다.
레이저는 세포내로 물질을 도입시키기 위해 사용되는 것으로, 옵토인젝션(optoinjection)로 언급되는 공정이다. 옵토인젝션 기작은 세포 막의 한 부분에 초점을 모았을때 레이저에 의해 막에 물리적인 구멍이 생기는 것으로 가정한다. 옵토인젝션의 한계점은 적재될 모든 단일 세포를 위치화하고 및 레이저로 표적화하여야 한다는 것이다. 관련 기술인 옵토포레이션(optoporation)은 배양 물질상에 레이저를 집중시켜, 발생되는 쇼크 웨이브가 근처 세포 막에 일시적인 투과화를 야기한다. 옵토포레이션의 문제점은 상당한 세포 사멸이 발생되며, 세포는 쇼크 웨이브에서 여러 거리에 따라 차별적인 수준으로 적재된다는 것이다.
따라서, 세포 생존율이 높으며, 다양한 물질들을 세포내로 신속하고 효율적으로 적재할 수 있는 방법 및 장치가 요구된다. 본 발명은 이러한 사항들을 해결하여 그와 관련된 이점들을 제공한다.
발명의 개요
본 발명은 고체 표면으로부터 유효 거리로 정의된 체적(volume)이내에 위치한 실질적으로 고정된 세포를 상기 체적내에서의 세포의 특정한 3차원 위치에 대한 사전 정보없이 일시적으로 투과화시키는 방법을 제공한다. 상기 일반적인 방법은, 세포가 존재하는 체적 방향으로 전자기 방사선을 인가함으로써 세포 막의 투과화를 유도하기에 충분한 전자기 방사선을 이용하여 세포를 조사하는 단계를 포함한다. 높은 비율의 세포 투과화는, 고체 표면으로부터 유효 거리내인 공간의 한 영역내에 다량의 세포를 위치시키고, 이후 전자기 방사선을 공간내 상기 한 영역으로 신속하게 조사함으로써, 이룰 수 있다. 고수율의 투과화는, 전자기 방사선 선량 파라미터들: 파장, 출력 강도(power density) 및 총 노출 시간의 적절한 조합을 선택함으로써, 높은 세포 생존율을 동시에 달성할 수 있다. 에너지 세기는 출력 강도와 총 노출 시간의 함수이다. 상기 방사선을 펄스 시리즈로 인가하는 전자기 방사 프로토콜의 경우, 총 노출 시간은 펄스 지속시간 및 총 펄스 횟수의 함수이다. 부가적으로, 상기 방사선을 펄스 시리즈로 인가하는 전자기 방사 프로토콜의 경우, 펄스 사이의 간격(즉, 펄스 주기)이 중요한 파라미터일 수도 있다. 투과화된 상태의 세포는 세포내로 적재되어질 물질을 함유한 수성 매질과 접촉시킨다는 점에서, 결과적으로 이러한 방법은 세포 생존율이 우수하면서도 여러가지 물질을 세포내로 신속하고 효율적으로 적재시킨다.
구현예는, 규정된 체적(defined volume)내에서의 세포의 특정한 3차원 위치에 대한 사전 정보없이, 규정된 체적내에 위치한 실질적으로 고정된 세포를 일시적으로 투과화하기 위한 장치에 관한 것이다. 일반적으로, 구현예는 세포의 막에 투과화를 유도하기에 충분한 전자기 방사선을 발사하는 에너지원을 포함하는 장치, 세포가 존재하는 상기 규정된 체적의 실질적으로 전체에 전자기 방사선을 인가하기 위한 인가 장치 및 고체 표면을 포함할 수 있으며, 상기 규정된 체적은 고체 표면에 의해 부분적으로 제한되며, 고체 표면에서의 유효 거리로 추가적으로 제한된다. 고체 표면은 전자기 방사선의 광학적 경로에 관여하는 실질적으로 투과적인 물질을 추가적으로 포함할 수 있다. 또한, 구현예는 세포의 막에 투과화를 유도하기에 충분한 전자기 방사선을 발산하는 에너지 원을 포함하고 있는 장치, 세포가 존재하는 상기 규정된 체적의 실질적으로 전체에 전자기 방사선을 인가하기 위한 명령, 및 명령에 대한 반응으로 전자기 방사선을 인가하기 위한 인가 장치를 포함할 수 있다.
일부 구현예들은 하나 이상의 세포를 일시적으로 투과화하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 a) 하나 이상의 세포를 고체 표면으로부터 유효 거리내에서 실질적으로 고정된 위치로 유지시키는 단계, 및 b) 하나 이상의 세포의 특정한 3차원 위치에 대한 사전 정보없이, 하나 이상의 세포의 막에 일시적인 투과화를 유도하기에 충분한 전자기 방사선을 상기 고체 표면에 인가하는 단계를 포함하며, 상기 하나 이상의 세포는 전자기 방사선 경로에 위치될 수 있다.
전자기 방사선은 고체 표면에 대해, 예컨대, 최대 약 0.001, 0.002, 0.003, 0.006, 0.01, 0.02, 0.03, 0.06, 0.1, 0.2, 0.3, 0.6, 1, 2, 3, 4, 5 및 6 μJ/㎛2의 에너지 세기를 가질 수 있다. 상기 전자기 방사선은 상기 세기들의 각각의 또는 임의 조합의 모든 서브세트의 에너지 세기를 가질 수 있으며, 상기 세기들의 임의 범위의 에너지 세기를 가질 수 있다. 또한, 전자기 방사선은 고체 표면에 약 0.001 내지 약 0.3 μJ/㎛2의 에너지 세기를 가질 수 있다.
유효 거리는, 예컨대, 약 1000 ㎛ 미만, 600 ㎛ 미만, 300 ㎛ 미만, 200 ㎛ 미만, 100 ㎛ 미만, 60 ㎛ 미만, 30 ㎛ 미만, 20 ㎛ 미만, 10 ㎛ 미만, 6 ㎛ 미만, 3 ㎛ 미만, 2 ㎛ 미만, 1 ㎛ 미만 등일 수 있다. 유효 거리는 전술한 각각의 거리 또는 임의 조합의 모든 서브세트일 수 있으며, 전술한 거리들의 임의 범위일 수 있다. 또한, 유효 거리는 약 1 ㎛ 내지 약 20 ㎛일 수 있다.
전자기 방사선은, 예컨대, 최대 약 1000 초대, 100 초대, 10 초대, 1초대, 100 밀리초대, 10 밀리초대, 1 밀리초대, 100 마이크로초대, 10 마이크로초대, 1 마이크로초대, 100 나노초대, 10 나노초대, 1 나노초대, 100 피코초(picosencond)대, 10 피코초대, 1 피코초대, 100 펨토초(femtosecond)대, 10 펨토초대, 1 펨토초대, 100 아토초(attosecond)대, 10 아토초대 및 1 아토초대의 시간동안 하나 이상의 세포에 가해질 수 있다. 시간은 상기 시간들의 각각의 또는 임의 조합의 모든 서브세트일 수 있으며, 상기 시간들의 임의 범위일 수 있다. 또한, 하나 이상의 세포는, 예컨대, 약 100 피코초 내지 약 10 초의 시간동안 전자기 방사선에 노출될 수 있다.
전자기 방사선은, 예컨대 약 300 nm 내지 약 3,000 nm, 약 330 nm 내지 약 1,100 nm, 약 400 nm 내지 약 700 nm 등의 파장을 가질 수 있다.
상기 인가 단계는 예컨대, 상기 고체 표면에 방사선 펄스를 전달하는 단계, 방사선 빔을 펄스 패턴에 따라 고체 표면에 통과시키는 단계 등을 포함한다.
하나 이상의 세포의 막에 일시적인 투과화 유도는, 예컨대, 적어도 10, 30, 100, 300, 1000, 3000, 10,000, 30,000, 100,000, 300,000, 1,000,000, 3,000,000, 10,000,000, 30,000,000, 100,000,000 및 240,000,000 세포수/초의 비율로 이루어질 수 있다. 일시적인 투과화 유도 비율은, 전술한 각각의 비율 또는 임의 조합의 모든 서브세트일 수 있으며, 전술한 비율들의 임의 범위일 수 있다. 상기 방법은 약 300 내지 약 10,000,000 세포수/초의 비율로 하나 이상의 세포 막에 일시적인 투과화를 유도하는 단계를 더 포함할 수 있다.
세포막에 일시적인 투과화를 한 이후에 하나 이상의 세포의 생존 가능성을, 예컨대, 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%로 유지시킬 수 있다. 생존율은 상기 각각의 생존율 또는 임의 조합의 모든 서브세트일 수 있으며, 상기 생존율의 임의 범위일 수 있다. 또한, 투과화 이후에 하나 이상의 세포의 생존 가능성은, 예컨대, 적어도 50% 내지 적어도 90%로 유지시킬 수 있다.
상기 방법은, 하나 이상의 세포를 예컨대, 비등장성 수성 매질(non-isotonic aqueous medium)과 접촉시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 방법은, 하나 이상의 세포내 물질이 투과화된 막을 통해 하나 이상의 세포로부터 방출될 수 있도록, 상기 하나 이상의 세포를 하나 이상의 세포내에서의 물질 농도에 비해 더욱 낮은 농도로 물질을 함유하고 있는 수성 매질과 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 물론, 일 예로, 상기 하나 이상의 세포내 물질의 농도보다 낮은 수성 매질내 물질의 농도는 0일 수 있다. 예컨대, 상기 물질은 이온, 유기 분자, 무기 분자, 콜로이달 입자, 다당류, 펩티드, 단백질, 핵산, 변형 핵산 등일 수 있다. 또한, 상기 하나 이상의 세포는 수성 매질내 물질이 상기 세포의 일시적으로 투과화된 막을 통해 통과하여 세포로 들어갈 수 있도록 수성 매질과 접촉시킬 수 있다. 일시적으로 투과화된 막은, 예컨대, 최대 약 0.3 밀리초, 1 밀리초, 3 밀리초, 10 밀리초, 30 밀리초, 100 밀리초, 300 밀리초, 1 초, 3 초, 10초, 30 초, 1 분, 2 분, 3 분, 6 분, 10 분, 20 분 및 30 분의 시간이내에 실질적으로 비투과화된 상태로 회복될 수 있다. 또한, 상기 시간은 상기 각각의 시간대 또는 임의 조합의 모든 서브세트일 수 있으며, 상기 시간대의 임의 범위일 수 있다. 상기 일시적으로 투과화된 막은 예컨대 약 1 초 내지 약 1분의 시간이내에 실질적으로 비투과화된 상태로 회복될 수 있다.
상기 전자기 방사선은, 예컨대, 적어도 적어도 약 0.0001, 0.0003, 0.001, 0.003, 0.01, 0.03, 0.1, 0.3, 1, 3, 10, 30, 100, 200, 300 및 400 cm2/초의 비율로 고체 표면의 영역에 가해질 수 있다. 상기 영역은 상기 각각의 영역 또는 임의 조합의 모든 서브세트일 수 있으며, 상기 영역들의 임의 범위일 수 있다. 또한, 전자기 방사선은 예컨대 약 0.0003 내지 약 10 cm2/초의 비율로 고체 표면의 영역에 가해질 수 있다.
상기 인가 단계는, 고체 표면에 예컨대 적어도 1, 10, 100, 103, 104, 105, 106, 107, 108 및 109 Hz의 비율로 2회 이상의 방사 펄스를 전달하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 비율은 상기 비율 각각 또는 임의 조합의 모든 서브세트일 수 있으며, 상기 비율의 임의 범위일 수 있다. 또한, 상기 인가 단계는 고체 표면에 예컨대, 약 102 내지 약 104 Hz의 비율로 2회 이상의 방사선 펄스를 전달하는 단계를 포함할 수 있다. 또한, 상기 인가 단계는 펄스 표적 패턴에 따라 고체 표면에 전자기 방사선의 2회 이상의 펄스를 전달하는 단계를 포함한다. 또한, 적어도 2회 이상의 전자기 방사선 펄스는 표적 펄스 패턴내 단일 펄스 표적으로 가해질 수 있다.
전자기 방사선은 예컨대 연속파형 레이저, 펄스형 레이저, 연속 램프, 섬광등 등과 같은 에너지 원으로부터 기원된 것일 수 있다.
전자기 방사선 펄스들의 각각의 펄스는 예컨대, 많아야 1000 초, 100 초, 10 초, 1 초, 100 ㎳, 10 ㎳, 1 ㎳, 100 ㎲, 10 ㎲, 1 ㎲, 100 ㎱, 10 ㎱, 1 ㎱, 100 ㎰, 10 ㎰, 1 ㎰, 100 펨토초, 10 펨토초, 1 펨토초, 100 아토초, 10 아토초 및 1 아토초 순의 지속 시간을 가질 수 있다. 지속시간은 상기 지속시간 각각 또는 임의 조합의 모든 서브세트일 수 있으며, 상기 지속시간의 임의 범위일 수 있다. 예컨대, 전자기 방사선의 펄스들의 개별 펄스는 약 100 ㎰ 내지 약 10 초의 지속시간을 가질 수 있다.
전자기 방사선은 고체 표면상의 규정된 영역에 가해질 수도 있으며, 상기 구정된 영역은 예컨대, 적어도 0.0001, 0.0003, 0.001, 0.003, 0.01, 0.03, 0.1, 0.3, 1, 3, 10, 30, 100, 200, 300 및 400 cm2을 가질 수 있다. 상기 영역은 상기 각각의 영역 또는 임의 조합의 모든 서브세트일 수 있으며, 상기 영역들의 임의 범위일 수 있다. 예컨대, 전자기 방사선은 고체 표면상의 규정된 영역에 가해질 수 있으며, 상기 규정된 영역은 약 0.0001 내지 약 10 cm2의 영역일 수 있다. 또한, 전자기 방사선은 상기 규정된 영역의 실질적으로 전체에 동시적으로 가해질 수 있다.
전자기 방사선의 경로는, 예컨대 적어도 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 300, 1 x 103, 2 x 103, 3 x 103, 4 x 103, 5 x 103, 6 x 103, 7 x 103, 8 x 103, 9 x 103 및 l x 104 ㎛의 폭일 수 있다. 또한, 상기 폭은 상기 폭 수치들의 각각 또는 임의 조합의 모든 서브세트일 수 있으며, 상기 폭 수치들의 임의 범위일 수 있다. 예컨대, 전자기 방사선의 경로는 약 10 ㎛ 내지 약 1000 ㎛의 폭일 수 있다.
고체 표면은 예컨대 전자기 방사선에 대해 실질적으로 투과적일 수 있다. 또한 고체 표면은 폴리머 물질, 유리 물질 등을 예컨대 포함할 수 있다.
또한, 구현예는 세포를 일시적으로 투과화하기 위한 장치에 관한 것이다. 상기 장치는 예컨대, a) 세포가 규정된 체적내에 실질적으로 고정되어 위치하며, 상기 규정된 체적내에서의 세포의 특정한 좌표는 미지이며, 상기 규정된 체적은 고체 표면에 의해 부분적으로 제한되는 것을 특징으로 하는, 세포의 막에 투과화를 유도하기에 충분한 전자기 방사선을 방사하는 에너지원; b) 상기 세포는 전자기 방사선의 경로에 있으며, 상기 규정된 체적내 상기 전자기 방사선은 고체 표면에 대해 최대 약 6 μJ/㎛2의 에너지 세기를 가지는 것을 특징으로 하는, 상기 규정된 체적의 실질적으로 전체에 상기 전자기 방사선을 인가하기 위한 인가 장치; 및, 선택적으로 c) 고체 표면을 포함할 수 있다.
규정된 체적내 전자기 방사선은 고정 표면에 약 0.001, 0.002, 0.003, 0.006, 0.01, 0.02, 0.03, 0.06, 0.1, 0.2, 0.3, 0.6, 1, 2, 3,4 및 5 μJ/㎛2의 에너지 세기를 가질 수 있다. 또한, 에너지 세기는 상기 세기들의 개별적인 또는 임의 조합의 모든 서브세트일 수 있으며, 상기 세기들의 임의 범위일 수 있다. 예컨대, 규정된 부피내 전자기 방사선은 고정 표면에 약 0.001 내지 약 0.3 μJ/㎛2의 에너지 세기를 가질 수 있다.
인가 장치는, 예컨대 펄스 표적 패턴에 따라 규정된 체적으로 전자기 방사선의 펄스를 인가한다. 또한, 전자기 방사선의 적어도 두 펄스는 상기 펄스 표적 패턴내 단일 펄스 표적으로 인가될 수 있다. 전자기 방사선의 펄스들의 각각의 펄스는, 예컨대, 최대 약 1000 초대, 100 초대, 10 초대, 1 초대, 100 밀리초대, 10 밀리초대, 1 밀리초대, 100 마이크로초대, 10 마이크로초대, 1 마이크로초대, 100 나노초대, 10 나노초대, 1 나노초대, 100 피코초대, 10 피코초대, 1 피코초대, 100 펨토초대, 10 펨토초대, 1 펨토초대, 100 아토초대, 10 아토초대 및 1 아토초대의 지속시간을 가질 수 있다. 지속 시간은 상기 각각의 지속 시간의 또는 임의 조합의 모든 서브세트일 수 있으며, 상기 지속 시간들의 임의 범위일 수 있다. 예컨대, 상기 지속 시간은 약 10 초 내지 약 100 피코초일 수 있다.
전자기 방사선의 경로는 적어도 약 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 300, 1 x 103, 2 x 103, 3 x 103, 4 x 103, 5 x 103, 6 x 103, 7 x 103, 8 x 103, 9 x 103 및 l x 104 ㎛의 폭일 수 있다. 또한, 상기 폭은 상기 폭 수치들의 각각 또는 임의 조합의 모든 서브세트일 수 있으며, 상기 폭 수치들의 임의 범위일 수 있다. 예컨대, 전자기 방사선의 경로는 약 10 ㎛ 내지 약 1000 ㎛의 폭일 수 있다.
또다른 구현예는 세포를 일시적으로 투과화하기 위한 장치에 관한 것이다. 상기 장치는, 예컨대, a) 세포가 규정된 체적내에 실질적으로 고정되어 위치될 수 있으며, 상기 규정된 체적내에서의 상기 세포의 특정한 좌표는 미지인 것을 특징으로 하는, 세포의 막에 투과화를 유도하기에 충분한 전자기 방사선을 방사하는 에너지원; b) 상기 규정된 체적의 실질적으로 전체에 전자기 방사선을 인가하기 위한 명령; c) 명령에 대한 반응으로 전자기 방사선을 인가하기 위한 인가 장치를 포함할 수 있다.
명령은, 예컨대, 펄스 표적 패턴에 따라 전자기 방사선의 펄스들을 인가하기 위한 명령을 포함할 수 있다. 또한, 전자기 방사선의 적어도 두 펄스는 상기 펄스 표적 패턴내 단일 펄스 표적으로 인가될 수 있다. 전자기 방사선 펄스들의 각각의 펄스는 예컨대, 최대 1000 초대, 100 초대, 10 초대, 1 초대, 100 밀리초대, 10 밀리초대, 1 밀리초대, 100 마이크로초대, 10 마이크로초대, 1 마이크로초대, 100 나노초대, 10 나노초대, 1 나노초대, 100 피코초대, 10 피코초대, 1 피코초대, 100 펨토초대, 10 펨토초대, 1 펨토초대, 100 아토초대, 10 아토초대 및 1 아토초대의 지속 시간을 가질 수 있다. 지속 시간은 상기 각각의 지속 시간의 또는 임의 조합의 모든 서브세트일 수 있으며, 상기 지속 시간의 임의 범위일 수 있다. 예컨대, 전자기 방사선의 펄스들의 개별 펄스는 약 100 피코초 내지 약 10 초의 지속 시간을 가질 수 있다.
규정된 체적내 전자기 방사선은 고정 표면에 예컨대, 약 0.001, 0.002, 0.003, 0.006, 0.01, 0.02, 0.03, 0.06, 0.1, 0.2, 0.3, 0.6, 1, 2, 3, 4, 5 및 6 μJ/㎛2의 에너지 세기를 가질 수 있다. 또한, 에너지 세기는 상기 세기들의 개별적인 또는 임의 조합의 모든 서브세트일 수 있으며, 상기 세기들의 임의 범위일 수 있다. 예컨대, 규정된 체적내 전자기 방사선은 고정 표면에 약 0.001 내지 약 0.3 μJ/㎛2의 에너지 세기를 가질 수 있다.
또한, 규정된 체적내 전자기 방사선의 순간 경로의 폭은 예컨대, 적어도 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 300, 1 x 103, 2 x 103, 3 x 103, 4 x 103, 5 x 103, 6 x 103, 7 x 103, 8 x 103, 9 x 103 및 l x 104 ㎛일 수 있다. 또한, 상기 폭은 상기 폭 수치들의 각각 또는 임의 조합의 모든 서브세트일 수 있으며, 상기 폭 수치들의 임의 범위일 수 있다. 예컨대, 상기 폭은 약 10 ㎛ 내지 약 1000 ㎛일 수 있다.
다른 구현예는, 세포를 일시적으로 투과화하기 위한 장치에 관한 것이다. 상기 장치는 예컨대, a) 세포는 규정된 체적내 실질적으로 고정되어 위치된 세포일 수 있으며, 상기 규정된 체적내에서의 세포의 특정한 좌표는 미지이며, 상기 규정된 체적은 고체 표면에 의해 부분적으로 제한된 것을 특징으로 하는, 세포의 막에 투과화를 유도하기에 충분한 전자기 방사선을 방사하는 에너지원; b) 펄스 표적 패턴에 따라 상기 규정된 실질적인 전체 체적에 전자기 방사선의 펄스들을 인가하기 위한 인가 장치를 포함하며, 선택적으로 c) 고체 표면을 포함할 수 있다.
전자기 방사선의 펄스들의 펄스 각각은, 예컨대, 최대 1000 초대, 100 초대, 10 초대, 1 초대, 100 밀리초대, 10 밀리초대, 1 밀리초대, 100 마이크로초대, 10 마이크로초대, 1 마이크로초대, 100 나노초대, 10 나노초대, 1 나노초대, 100 피코초대, 10 피코초대, 1 피코초대, 100 펨토초대, 10 펨토초대, 1 펨토초대, 100 아토초대, 10 아토초대 및 1 아토초대의 지속 시간을 가질 수 있다. 또한, 지속 시간은 상기 지속 시간의 개별적인 또는 임의 조합의 모든 서브세트일 수 있으며, 상기 지속 시간들의 임의 범위일 수 있다. 예컨대, 전자기 방사선의 펄스들의 각 펄스의 지속 시간은 약 100 피코초 내지 약 10 초일 수 있다.
또한, 전자기 방사선의 적어도 두가지 펄스는 상기 펄스 표적 패턴내 단일 펄스 표적으로 인가될 수 있다. 규정된 체적내 전자기 방사선 펄스들의 개별 펄스의 폭은, 예컨대, 적어도 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 300, 1 x 103, 2 x 103, 3 x 103, 4 x 103, 5 x 103, 6 x 103, 7 x 103, 8 x 103, 9 x 103 및 l x 104 ㎛일 수 있다. 또한, 상기 폭은 상기 폭 수치들의 각각 또는 임의 조합의 모든 서브세트일 수 있으며, 상기 폭 수치들의 임의 범위일 수 있다. 예컨대, 규정된 체적내 전자기 방사선 펄스들의 개별 펄스의 폭은 약 10 ㎛ 내지 약 1000 ㎛일 수 있다.
다른 구현예는 세포를 일시적으로 투과화하기 위한 장치에 관한 것이다. 상기 장치는 예컨대, a) 세포는 규정된 체적내에 실질적으로 고정되어 위치될 수 있으며 상기 규정된 체적내에서의 상기 세포의 특정한 좌표는 미지인 것을 특징으로 하는, 세포의 막에 투과화를 유도하기에 충분한 전자기 방사선을 방사하는 에너지원; b) 펄스 표적 패턴에 따라 상기 규정된 실질적인 전체 체적으로 전자기 방사선을 인가하기 위한 명령; 및 c) 명령에 대한 반응으로 전자기 방사선을 인가하기 위한 인가 장치를 포함할 수 있다.
전자기 방사선 펄스들의 각각 펄스는, 예컨대, 최대 약 1000 초대, 100 초대, 10 초대, 1 초대, 100 밀리초대, 10 밀리초대, 1 밀리초대, 100 마이크로초대, 10 마이크로초대, 1 마이크로초대, 100 나노초대, 10 나노초대, 1 나노초대, 100 피코초대, 10 피코초대, 1 피코초대, 100 펨토초대, 10 펨토초대, 1 펨토초대, 100 아토초대, 10 아토초대 및 1 아토초대의 지속 시간을 가질 수 있다. 또한, 지속 시간은 상기 지속 시간의 개별적인 또는 임의 조합의 모든 서브세트일 수 있으며, 상기 지속 시간들의 임의 범위일 수 있다. 예컨대, 전자기 방사선의 펄스들의 각 펄스의 지속 시간은 약 100 피코초 내지 약 10 초일 수 있다.
또한, 전자기 방사선의 적어도 2번의 펄스는 상기 펄스 표적 패턴내 단일 펄스 표적으로 인가될 수 있다. 규정된 체적내 전자기 방사선 펄스들의 개별 펄스의 폭은, 예컨대, 적어도 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 300, 1 x 103, 2 x 103, 3 x 103, 4 x 103, 5 x 103, 6 x 103, 7 x 103, 8 x 103, 9 x 103 및 l x 104 ㎛일 수 있다. 또한, 상기 폭은 상기 폭 수치들의 각각 또는 임의 조합의 모든 서브세트일 수 있으며, 상기 폭 수치들의 임의 범위일 수 있다. 예컨대, 규정된 체적내 전자기 방사선 펄스들의 개별 펄스의 폭은 약 10 ㎛ 내지 약 1000 ㎛일 수 있다.
또다른 구현예는, 세포를 일시적으로 투과화하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 예컨대, a) 세포를, 고체 표면에 의해 부분적으로 제한되며 상기 고체 표면으로부터의 유효 거리로 추가적으로 제한된 규정된 체적내의 실질적으로 고정된 위치에 유지시키는 단계, 및 b) 세포의 막에 일시적인 투과화를 유도하기에 충분한 전자기 방사선을 상기 규정된 실질적인 전체 체적에 인가하는 단계를 포함한다.
상기 규정된 체적내 전자기 방사선은 상기 고체 표면에 대해 예컨대, 최대 약 0.001, 0.002, 0.003, 0.006, 0.01, 0.02, 0.03, 0.06, 0.1, 0.2, 0.3, 0.6, 1, 2, 3, 4, 5 및 6 μJ/㎛2의 에너지 세기를 가질 수 있다. 또한, 상기 전자기 방사선은 상기 세기들의 개별적인 또는 임의 조합의 모든 서브세트의 에너지 세기를 가질 수 있으며, 상기 세기들의 임의 범위의 에너지 세기를 가질 수 있다. 예컨대, 상기 규정된 체적내 전자기 방사선은 고체 표면에 대해 약 0.001 내지 약 0.3 μJ/㎛2의 에너지 세기를 가질 수 있다.
유효 거리는, 예컨대, 약 1000 ㎛ 미만, 600 ㎛ 미만, 300 ㎛ 미만, 200 ㎛ 미만, 100 ㎛ 미만, 60 ㎛ 미만, 30 ㎛ 미만, 20 ㎛ 미만, 10 ㎛ 미만, 6 ㎛ 미만, 3 ㎛ 미만, 2 ㎛ 미만, 1 ㎛ 미만일 수 있다. 또한, 유효 거리는 전술한 각각의 거리 또는 임의 조합의 임의 서브세트일 수 있으며, 전술한 거리들의 임의 범위일 수 있다. 예컨대, 유효 거리는 약 1 ㎛ 내지 약 20 ㎛일 수 있다.
세포는 예컨대, 최대 약 1000 초대, 100 초대, 10 초대, 1 초대, 100 밀리초대, 10 밀리초대, 1 밀리초대, 100 마이크로초대, 10 마이크로초대, 1 마이크로초대, 100 나노초대, 10 나노초대, 1 나노초대, 100 피코초대, 10 피코초대, 1 피코초대, 100 펨토초대, 10 펨토초대, 1 펨토초대, 100 아토초대, 10 아토초대 및 1 아토초대의 시간동안 전자기 방사선에 노출될 수 있다. 또한, 상기 시간은 상기 시간들의 개별적 또는 임의 조합의 모든 서브세트일 수 있으며, 상기 시간들의 임의 범위일 수 있다. 예컨대, 세포는 약 100 피코초 내지 약 10 초의 시간동안 전자기 방사선에 노출될 수 있다.
상기 인가 단계는 예컨대, 상기 규정된 체적에 방사선의 펄스를 전달하는 단계를 포함할 수 있으며, 또한, 경로 패턴에 따라 상기 규정된 체적에 방사선 빔을 투과하는 단계 등을 포함할 수 있다.
상기 방법은 추가적으로 예컨대, 초당 적어도 10, 30, 100, 300, 1000, 3000, 10,000, 30,000, 100,000, 300,000, 1,000,000, 3,000,000, 10,000,000, 30,000,000, 100,000,000 및 240,000,000 세포수의 비율로 세포에 일시적인 투과화가 유도되는 단계를 포함할 수 있다. 또한, 상기 비율은 전술한 각각의 속도 또는 임의 조합의 모든 서브세트일 수 있으며, 전술한 속도들의 임의 범위일 수 있다. 예컨대, 세포에 대한 일시적인 투과화는 약 300 내지 약 10,000,000 세포수/초의 비율로 유도될 수 있다.
투과화 이후의 세포 생존 가능성은, 예컨대, 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%로 유지될 수 있다. 또한, 생존율은 상기 각각의 생존율 또는 임의 조합의 모든 서브세트일 수 있으며, 상기 생존율의 임의 범위일 수 있다. 예컨대, 투과화 이후의 세포 생존 가능성은 적어도 50% 내지 적어도 90%로 유지될 수 있다.
상기 방법은 세포를 비등장성 수성 매질과 접촉시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 방법은 세포와 접촉상태일때 투과화된 세포 막을 통해 통과할 수 있는 물질을 포함하는 수성 매질을 포함할 수 있다.
상기 물질은, 예컨대, 이온, 유기 분자, 무기 분자, 콜로이달 입자, 다당류, 펩티드, 단백질, 핵산, 변형 핵산 등일 수 있다. 상기 물질은 투과화된 막을 통해 세포로 들어오거나 또는 나갈 수 있다.
일시적으로 투과화된 막은 예컨대, 최대 약 0.3 밀리초, 1 밀리초, 3 밀리초, 10 밀리초, 30 밀리초, 100 밀리초, 300 밀리초, 1 초, 3 초, 10초, 30 초, 1 분, 2 분, 3 분, 6 분, 10 분, 20 분 및 30 분의 시간이내에 실질적으로 비투과화된 상태로 회복될 수 있다. 또한, 상기 회복 시간은 상기 시간의 개별적인 또는 임의 조합의 모든 서브세트일 수 있으며, 상기 시간대의 임의 범위일 수 있다. 상기 일시적으로 투과화된 막은 예컨대 약 1 초 내지 약 1분의 시간이내에 실질적으로 비투과화된 상태로 회복될 수 있다.
상기 전자기 방사선은, 예컨대, 적어도 약 0.0001, 0.0003, 0.001, 0.003, 0.01, 0.03, 0.1, 0.3, 1, 3, 10, 30, 100, 200, 300 및 400 cm2/초의 비율로 고체 표면의 영역에 인가될 수 있다. 상기 영역은 상기 각각의 영역 또는 임의 조합의 모든 서브세트일 수 있으며, 상기 영역들의 임의 범위일 수 있다. 전자기 방사선은 예컨대 약 0.0003 내지 약 10 cm2/초의 비율로 고체 표면의 영역에 인가될 수 있다.
상기 전자기 방사선은, 예컨대 규정된 체적내에서 약 6 x 107 미만, 3 x 107 미만, 2 x 107 미만, 1 x 107 미만, 6 x 106 미만, 3 x 106 미만, 2 x 106 미만, 1 x 106 미만, 6 x 105 미만, 3 x 105 미만, 2 x 105 미만, 1 x 105 미만, 6 x 104 미만, 3 x 104 미만, 2 x 104 미만 및 1 x 104 w/cm2 미만의 출력 강도를 가질 수 있다. 또한, 출력 강도는 상기 각각의 출력 강도 또는 임의 조합의 모든 서브세트일 수 있으며, 상기 출력 강도들의 임의 범위일 수 있다.
상기 인가 단계는, 2회 이상의 방사선 펄스를 상기 규정된 체적에 예컨대, 적어도 1, 10, 100, 103, 104, 105, 106, 107, 108 및 109 Hz의 비율로 전달하는 단계를 포함할 수 있다. 또한, 상기 비율은 상기 비율 각각 또는 임의 조합의 모든 서브세트일 수 있으며, 상기 비율의 임의 범위일 수 있다. 예컨대, 상기 인가 단계는 상기 규정된 체적에 약 102 내지 약 104 Hz의 비율로 2회 이상의 방사선 펄스를 전달하는 단계를 포함할 수 있다. 또한, 상기 인가 단계는 펄스 표적 패턴에 따라 규정된 체적에 전자기 방사선을 2회 이상 펄스로 전달하는 단계를 포함한다.
전자기 방사선은 예컨대 연속파형 레이저, 펄스형 레이저, 연속 램프, 섬광등 등과 같은 에너지원으로부터 기원될 수 있다.
전자기 방사선 펄스들의 각각의 펄스는 예컨대, 최대 1000 초대, 100 초대, 10 초대, 1 초대, 100 밀리초대, 10 밀리초대, 1 밀리초대, 100 마이크로초대, 10 마이크로초대, 1 마이크로초대, 100 나노초대, 10 나노초대, 1 나노초대, 100 피코초대, 10 피코초대, 1 피코초대, 100 펨토초대, 10 펨토초대, 1 펨토초대, 100 아토초대, 10 아토초대 및 1 아토초대로 이루어진 군으로부터 선택된 지속 시간을 가질 수 있다. 또한, 지속 시간은 상기 지속 시간 각각 또는 임의 조합의 모든 서브세트일 수 있으며, 상기 지속 시간의 임의 범위일 수 있다. 예컨대, 전자기 방사선의 펄스들의 개별 펄스는 약 100 피코초 내지 약 10 초의 지속 시간을 가질 수 있다. 또한, 적어도 2회의 전자기 방사선 펄스는 표적 펄스 패턴내 단일 펄스 표적으로 인가된다.
전자기 방사선은 고체 표면상의 규정된 영역으로 인가될 수도 있으며, 상기 규정된 영역은 예컨대, 적어도 0.0001, 0.0003, 0.001, 0.003, 0.01, 0.03, 0.1, 0.3, 1, 3, 10, 30, 100, 200, 300 및 400 cm2의 영역을 가질 수 있다. 또한, 상기 영역은 상기 영역 각각 또는 임의 조합의 모든 서브세트일 수 있으며, 상기 영역들의 임의 범위일 수 있다. 예컨대, 전자기 방사선은 고체 표면상의 규정된 영역으로 인가될 수 있으며, 상기 규정된 영역은 약 0.0001 내지 약 10 cm2의 면적일 수 있다. 또한, 전자기 방사선은 상기 규정된 실질적인 전체 체적으로 동시에 인가될 수 있다.
상기 규정된 체적내 전자기 방사선의 경로는 예컨대, 적어도 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 300, 1 x 103, 2 x 103, 3 x 103, 4 x 103, 5 x 103, 6 x 103, 7 x 103, 8 x 103, 9 x 103 및 l x 104 ㎛의 폭을 가질 수 있다. 또한, 상기 폭은 상기 폭 수치들의 각각 또는 임의 조합의 모든 서브세트일 수 있으며, 상기 폭 수치들의 임의 범위일 수 있다. 예컨대, 규정된 체적내 전자기 방사선의 경로는 약 10 ㎛ 내지 약 1000 ㎛의 폭일 수 있다.
또한, 구현예는 세포를 일시적으로 투과화하기 위한 다른 장치에 관한 것이다. 상기 장치는 예컨대, a) 세포는 규정된 체적내에 실질적으로 고정되어 위치될 수 있으며, 상기 규정된 체적내 상기 세포의 특정한 좌표는 미지인 것을 특징으로 하는, 세포 막의 투과화를 유도하기에 충분한 전자기 방사선을 방사하는 에너지원; b) 복수 위치들의 특성과는 관계없이 상기 규정된 체적내 여러 위치에 전자기 방사선을 인가하기 위한 명령; 및 c) 명령에 대한 반응으로 전자기 방사선을 인가하기 위한 인가 장치를 포함할 수 있다.
다른 구현예는, 세포를 일시적으로 투과화하기 위한 장치에 관한 것이다. 상기 장치는 예컨대, a) 세포는 규정된 체적내에 실질적으로 고정되어 위치될 수 있으며, 상기 규정된 체적내 상기 세포의 특정한 좌표는 미지인 것을 특징으로 하는, 세포 막의 투과화를 유도하기에 충분한 전자기 방사선을 방사하는 에너지원; b) 규정된 체적내 전자기 방사선이 상기 고체 표면에 대하여 최대 6 μJ/㎛2의 에너지 세기를 가질 수 있는 것을 특징으로 하는, 상기 규정된 실질적인 체적 전체를 포함하는 체적내 복수 위치에 전자기 방사선을 인가하기 위한 명령; 및 c) 명령에 대한 반응으로 전자기 방사선을 인가하기 위한 인가 장치를 포함할 수 있다.
구현예들은, 지시사항(instructions) 셋트를 포함하는 메모리를 가진 시스템에 있어서, 실질적으로 고정된 세포의 막에 일시적인 투과화를 유도하기에 충분한 전자기 방사선을, 상기 세포에 대한 특정한 3차원 위치에 대한 사전 정보없이 고체 표면에 인가하는 단계를 포함하는 기능을 컴퓨터로 하여금 수행하도록 하며, 상기 세포는 상기 전자기 방사선의 경로에 있는 것을 특징으로 하는 시스템에 관한 것이다.
임의 구현예에 있어서, 세포는 진핵 세포, 원핵 세포, 포유류 세포, 비-포유류 세포, 줄기 세포, 연구용 동물 세포, 식물 세포, 세균, 진균, 바이러스 등을 포함하는 임의의 세포일 수 있다.
본 발명의 일부 구현예들은 하기 단락들에 개시되어 있다:
1. a) 하나 이상의 세포를 고체 표면으로부터 유효 거리내에서 실질적으로 고정된 위치에 유지시키는 단계; 및
b) 상기 하나 이상의 세포의 특정한 3차원 위치에 대한 사전 정보없이, 상기 하나 이상의 세포의 막에 투과화를 유도하기에 충분한 전자기 방사선을 상기 고체 표면에 인가하는 단계를 포함하며, 상기 하나 이상의 세포는 상기 전자기 방사선의 경로에 위치하는 것을 특징으로 하는, 하나 이상의 세포를 일시적으로 투과화하는 방법;
2. 상기 단락 1의 방법에서, 상기 전자기 방사선은 고체 표면에 대해 최대 약 0.001, 0.002, 0.003, 0.006, 0.01, 0.02, 0.03, 0.06, 0.1, 0.2, 0.3, 0.6, 1, 2, 3, 4, 5 및 6 μJ/㎛2으로 이루어진 군으로부터 선택된 에너지 세기를 가지며;
3. 상기 단락 1의 방법에서, 상기 전자기 방사선은 상기 고체 표면에 대해 약 0.001 내지 약 0.3 μJ/㎛2의 에너지 세기를 가지며;
4. 상기 단락 1의 방법에서, 상기 유효 거리는 약 1000 ㎛ 미만, 600 ㎛ 미만, 300 ㎛ 미만, 200 ㎛ 미만, 100 ㎛ 미만, 60 ㎛ 미만, 30 ㎛ 미만, 20 ㎛ 미만, 10 ㎛ 미만, 6 ㎛ 미만, 3 ㎛ 미만, 2 ㎛ 미만 및 1 ㎛ 미만으로 이루어진 군으로부터 선택되며;
5. 상기 단락 1의 방법에서, 상기 유효 거리는 약 1 ㎛ 내지 약 20 ㎛이며;
6. 상기 단락 1의 방법에서, 상기 전자기 방사선은 최대 1000 초대, 100 초대, 10 초대, 1초대, 100 밀리초대, 10 밀리초대, 1 밀리초대, 100 마이크로초대, 10 마이크로초대, 1 마이크로초대, 100 나노초대, 10 나노초대, 1 나노초대, 100 피코초대, 10 피코초대, 1 피코초대, 100 펨토초대, 10 펨토초대, 1 펨토초대, 100 아토초대, 10 아토초대 및 1 아토초대로 이루어진 군으로부터 선택된 시간동안 상기 하나 이상의 세포에 인가되며;
7. 상기 단락 1의 방법에서, 상기 하나 이상의 세포는 약 100 피코초 내지 약 10 초의 시간동안 상기 전자기 방사선에 노출되며;
8. 상기 단락 1의 방법에서, 상기 인가 단계는 상기 고체 표면에 방사선 펄스를 전달하는 단계를 포함하며;
9. 상기 단락 1의 방법에서, 상기 인가 단계는 방사선 빔을 경로 패턴에 따라 상기 고체 표면에 통과시키는 단계를 포함하며;
10. 상기 단락 1의 방법에서, 초당 적어도 10, 30, 100, 300, 1000, 3000, 10,000, 30,000, 100,000, 300,000, 1,000,000, 3,000,000, 10,000,000, 30,000,000, 100,000,000 및 240,000,000 세포수의 비율로부터 선택된 비율로 상기 하나 이상의 세포의 막에 투과화를 유도하는 단계를 추가적으로 포함하며;
11. 상기 단락 1의 방법에서, 약 300 내지 약 10,000,000 세포/초의 비율로 상기 하나 이상의 세포의 막에 투과화를 유도하는 단계를 포함하며;
12. 상기 단락 1의 방법에서, 상기 하나 이상의 세포의 막 투과화 이후에 상기 하나 이상의 세포의 생존 가능성이 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%로 이루어진 군으로부터 선택된 수치로 유지되며;
13. 상기 단락 1의 방법에서, 상기 하나 이상의 세포의 막 투과화 이후에 상기 하나 이상의 세포의 생존 가능성이 적어도 50% 내지 적어도 90%의 수치로 유지되며;
14. 상기 단락 1의 방법에서, 상기 하나 이상의 세포를 비등장성 수성 매질과 접촉시키는 단계를 추가적으로 포함하며;
15. 상기 단락 1의 방법에서, 추가적으로 상기 하나 이상의 세포는 수성 매질과 접촉하여 상기 투과화된 막을 통해 상기 투과화된 막내 물질이 통과할 수 있으며;
16. 상기 단락 1의 방법에서, 추가적으로 상기 하나 이상의 세포는 투과화된 막을 통해 상기 하나 이상의 세포로부터 나갈 수 있는 물질을 함유하고 있는 수성 매질과 접촉하며;
17. 상기 단락 16의 방법에서, 상기 물질은 이온, 유기 분자, 무기 분자 및 콜로이달 입자로 이루어진 군으로부터 선택되며;
18. 상기 단락 16의 방법에서, 상기 물질은 다당류, 펩티드, 단백질, 핵산 및 변형 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택되며;
19. 상기 단락 16의 방법에서, 상기 물질은 투과화된 막을 통해 하나 이상의 세포로 들어가며;
20. 상기 단락 19의 방법에서, 추가적으로 상기 투과화된 막은 최대 약 0.3 밀리초, 1 밀리초, 3 밀리초, 10 밀리초, 30 밀리초, 100 밀리초, 300 밀리초, 1 초, 3 초, 10초, 30 초, 1 분, 2 분, 3 분, 6 분, 10 분, 20 분 및 30 분으로 이루어진 군으로부터 선택된 시간이내에 실질적으로 비투과화된 상태로 회복되며;
21. 상기 단락 19의 방법에서, 상기 투과화된 막은 약 1초 내지 약 1분의 시간이내에 실질적으로 비투과화된 상태로 회복되며;
22. 상기 단락 1의 방법에서, 상기 전자기 방사선은 상기 고체 표면의 영역에 적어도 약 0.0001, 0.0003, 0.001, 0.003, 0.01, 0.03, 0.1, 0.3, 1, 3, 10, 30, 100, 200, 300 및 400 cm2/초로 이루어진 군으로부터 선택된 비율로 인가되며;
23. 상기 단락 1의 방법에서, 상기 전자기 방사선은 상기 고체 표면의 영역에 약 0.0003 내지 약 10 cm2/초의 비율로 인가되며;
24. 상기 단락 1의 방법에서, 상기 전자기 방사선은 상기 고체 표면에 대해 약 1 x 104 W/cm2 미만의 출력 강도를 가지며;
25. 상기 단락 1의 방법에서, 상기 전자기 방사선은 상기 고체 표면에 대해 약 1 x 104 W/cm2 내지 약 6 x 107 W/cm2의 출력 강도를 가지며;
26. 상기 단락 1의 방법에서, 상기 인가 단계는 2회 이상의 방사선 펄스가 상기 고체 표면에 적어도 1, 10, 100, 103, 104, 105, 106, 107, 108 및 109 Hz로 이루어진 군으로부터 선택된 비율로 전달되는 단계를 포함하며;
27. 상기 단락 1의 방법에서, 상기 인가 단계는 상기 고체 표면에 2회 이상의 방사선 펄스가 약 102 내지 약 104 Hz의 비율로 전달되는 단계를 포함하며;
28. 상기 단락 1의 방법에서, 상기 전자기 방사선은 연속파형 레이저, 펄스형 레이저, 연속 램프 및 섬광등으로 이루어진 군으로부터 선택된 에너지원으로부터 유래되며;
29. 상기 단락 1의 방법에서, 상기 인가 단계는 펄스 표적 패턴에 따라 상기 고체 표면에 전자기 방사선의 2회 이상의 펄스를 전달하는 단계를 포함하며;
30. 상기 단락 29의 방법에서, 상기 전자기 방사선의 펄스들의 각각의 펄스는 최대 1000 초대, 100 초대, 10 초대, 1 초대, 100 밀리초대, 10 밀리초대, 1 밀리초대, 100 마이크로초대, 10 마이크로초대, 1 마이크로초대, 100 나노초대, 10 나노초대, 1 나노초대, 100 피코초대, 10 피코초대, 1 피코초대, 100 펨토초대, 10 펨토초대, 1 펨토초대, 100 아토초대, 10 아토초대 및 1 아토초대로 이루어진 군으로부터 선택된 지속 시간을 가지며;
31. 상기 단락 29의 방법에서, 상기 전자기 방사선 펄스의 개별 펄스의 지속 시간은 약 100 피코초 내지 약 10 초이며;
32. 상기 단락 29의 방법에서, 상기 전자기 방사선의 적어도 2회 펄스는 상기 펄스 표적 패턴내 단일 펄스 표적에 인가되며;
33. 상기 단락 1의 방법에서, 상기 전자기 방사선은 상기 고체 표면상의 규정된 영역에 인가되며, 상기 규정된 영역은 적어도 0.0001, 0.0003, 0.001, 0.003, 0.01, 0.03, 0.1, 0.3, 1, 3, 10, 30, 100, 200, 300 및 400 cm2로 이루어진 군으로부터 선택된 영역을 가지며;
34. 상기 단락 1의 방법에서, 상기 전자기 방사선은 상기 고체 표면상의 규정된 영역에 인가되며, 상기 규정된 영역은 약 0.0001 내지 약 10 cm2의 영역을 가지며;
35. 상기 단락 1의 방법에서, 상기 전자기 방사선은 상기 규정된 실질적으로 전체 영역에 동시적으로 인가되며;
36. 상기 단락 1의 방법에서, 상기 전자기 방사선의 경로는 적어도 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 300, 1 x 103, 2 x 103, 3 x 103, 4 x 103, 5 x 103, 6 x 103, 7 x 103, 8 x 103, 9 x 103 및 l x 104 ㎛로 이루어진 군으로부터 선택되는 폭을 가지며;
37. 상기 단락 1의 방법에서, 상기 전자기 방사선의 경로는 약 10 ㎛ 내지 약 1000 ㎛의 폭을 가지며;
38. a) 세포는 규정된 체적내에 실질적으로 고정되어 위치될 수 있으며, 상기 규정된 체적내 세포의 특정한 좌표는 미지이며, 상기 규정된 체적은 고체 표면에 의해 부분적으로 제한된 것을 특징으로 하는, 세포 막의 투과화를 유도하기에 충분한 전자기 방사선을 방사하는 에너지원;
b) 상기 세포는 전자기 방사선의 경로에 위치하며, 상기 규정된 체적내 상기 전자기 방사선은 고체 표면에 대해 최대 약 6 μJ/㎛2의 에너지 세기를 가지는 것을 특징으로 하는, 상기 규정된 체적의 실질적으로 전체에 전자기 방사선을 인가하기 위한 인가 장치; 및
c) 상기 고체 표면을 포함하는, 세포를 일시적으로 투과화시키는 장치;
39. 상기 단락 38의 장치에서, 상기 규정된 체적내 전자기 방사선은 고체 표면에 대하여 최대 약 0.001, 0.002, 0.003, 0.006, 0.01, 0.02, 0.03, 0.06, 0.1, 0.2, 0.3, 0.6, 1, 2, 3, 4 및 5 μJ/㎛2으로 이루어진 군으로부터 선택되는 에너지 세기를 가지며;
40. 상기 단락 38의 장치에서, 상기 규정된 체적내 전자기 방사선은 고체 표면에 대해 약 0.001 내지 0.3 μJ/㎛2의 에너지 세기를 가지며;
41. 상기 단락 38의 장치에서, 상기 인가 장치는 전자기 방사선의 펄스를 상기 규정된 체적으로 펄스 표적 패턴에 따라 인가하며;
42. 상기 단락 40의 장치에서, 상기 전자기 방사선의 펄스들의 각각의 펄스는 최대 1000 초대, 100 초대, 10 초대, 1 초대, 100 밀리초대, 10 밀리초대, 1 밀리초대, 100 마이크로초대, 10 마이크로초대, 1 마이크로초대, 100 나노초대, 10 나노초대, 1 나노초대, 100 피코초대, 10 피코초대, 1 피코초대, 100 펨토초대, 10 펨토초대, 1 펨토초대, 100 아토초대, 10 아토초대 및 1 아토초대로 이루어진 군으로부터 선택된 지속 시간을 가지며;
43. 상기 단락 40의 장치에서, 상기 전자기 방사선의 펄스들의 각각의 펄스는 약 100 피코초대 내지 약 10 초대의 지속 시간을 가지며;
44. 상기 단락 40의 장치에서, 상기 전자기 빙시산의 적어도 2회의 펄스는 상기 펄스 표적 패턴내 단일 펄스 표적에 인가되며;
45. 상기 단락 38의 장치에서, 상기 전자기 방사선의 경로는 적어도 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 300, 1 x 103, 2 x 103, 3 x 103, 4 x 103, 5 x 103, 6 x 103, 7 x 103, 8 x 103, 9 x 103 및 l x 104 ㎛로 이루어진 군으로부터 선택되는 폭을 가지며;
46. 상기 단락 38의 장치에서, 상기 전자기 방사선의 경로는 약 10 ㎛ 내지 약 1000 ㎛의 폭을 가지며;
47. a) 세포는 규정된 체적내에 실질적으로 고정되어 위치될 수 있으며, 상기 규정된 체적내 상기 세포의 특정한 좌표는 미지인 것을 특징으로 하는, 세포 막의 투과화를 유도하기에 충분한 전자기 방사선을 방사하는 에너지원;
b) 상기 규정된 체적의 실질적으로 전체에 인가하기 위한 명령; 및
c) 명령에 대한 반응으로 전자기 방사선을 인가하기 위한 인가 장치를 포함하는, 세포를 일시적으로 투과화시키는 장치;
48. 상기 단락 47의 장치에서, 상기 명령은 펄스 표적 패턴에 따라 전자기 방사선의 펄스들을 인가하기 위한 명령이며;
49. 상기 단락 48의 장치에서, 상기 전자기 방사선 펄스의 개별 펄스의 지속 시간은 최대 1000 초대, 100 초대, 10 초대, 1 초대, 100 밀리초대, 10 밀리초대, 1 밀리초대, 100 마이크로초대, 10 마이크로초대, 1 마이크로초대, 100 나노초대, 10 나노초대, 1 나노초대, 100 피코초대, 10 피코초대, 1 피코초대, 100 펨토초대, 10 펨토초대, 1 펨토초대, 100 아토초대, 10 아토초대 및 1 아토초대로 이루어진 군으로부터 선택되는 지속 시간을 가지며;
50. 상기 단락 48의 장치에서, 상기 전자기 방사선의 펄스들의 각각의 펄스는 약 100 피코초대 내지 약 10 초대의 지속 시간을 가지며;
51. 상기 단락 48의 장치에서, 상기 전자기 방사선의 적어도 2개의 펄스는 펄스 표적 패턴내 단일 펄스 표적으로 인가되며;
52. 상기 단락 47의 장치에서, 상기 규정된 체적내 전자기 방사선은 고체 표면에 대하여 최대 약 0.001, 0.002, 0.003, 0.006, 0.01, 0.02, 0.03, 0.06, 0.1, 0.2, 0.3, 0.6, 1, 2, 3, 4, 5 및 6 μJ/㎛2으로 이루어진 군으로부터 선택되는 에너지 세기를 가지며;
53. 상기 단락 47의 장치에서, 상기 규정된 체적내 전자기 방사선은 고체 표면에 대해 약 0.001 내지 0.3 μJ/㎛2의 에너지 세기를 가지며;
54. 상기 단락 47의 장치에서, 상기 전자기 방사선의 경로는 적어도 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 300, 1 x 103, 2 x 103, 3 x 103, 4 x 103, 5 x 103, 6 x 103, 7 x 103, 8 x 103, 9 x 103 및 l x 104 ㎛로 이루어진 군으로부터 선택되는 폭을 가지며;
55. 상기 단락 47의 장치에서, 상기 전자기 방사선의 순간 경로는 약 10 ㎛ 내지 약 1000 ㎛의 폭을 가지며;
56. a) 세포는 규정된 체적내에 실질적으로 고정되어 위치될 수 있으며, 상기 규정된 체적내 세포의 특정한 좌표는 미지이며, 상기 규정된 체적은 고체 표면에 의해 일부 제한되는 것을 특징으로 하는, 세포 막의 투과화를 유도하기에 충분한 전자기 방사선을 방사하는 에너지원;
b) 펄스 표적 패턴에 따라 상기 규정된 체적의 실질적으로 전체에 상기 전자기 방사선의 펄스들을 인가하기 위한 인가 장치; 및
c) 상기 고체 표면을 포함하는, 세포를 일시적으로 투과화시키는 장치;
57. 상기 단락 56의 장치에서, 상기 전자기 방사선의 펄스들의 각각의 펄스는 최대 1000 초대, 100 초대, 10 초대, 1 초대, 100 밀리초대, 10 밀리초대, 1 밀리초대, 100 마이크로초대, 10 마이크로초대, 1 마이크로초대, 100 나노초대, 10 나노초대, 1 나노초대, 100 피코초대, 10 피코초대, 1 피코초대, 100 펨토초대, 10 펨토초대, 1 펨토초대, 100 아토초대, 10 아토초대 및 1 아토초대로 이루어진 군으로부터 선택된 지속 시간을 가지며;
58. 상기 단락 56의 장치에서, 상기 전자기 방사선의 펄스들의 각각의 펄스는 약 100 피코초대 내지 약 10 초대의 지속 시간을 가지며;
59. 상기 단락 56의 장치에서, 상기 전자기 방사선의 적어도 2회이상의 펄스들이 상기 펄스 표적 패턴내에서 단일 펄스 표적에 인가되며;
60. 상기 단락 56의 장치에서, 상기 전자기 방사선의 경로는 적어도 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 300, 1 x 103, 2 x 103, 3 x 103, 4 x 103, 5 x 103, 6 x 103, 7 x 103, 8 x 103, 9 x 103 및 1 x 104 ㎛로 이루어진 군으로부터 선택된 폭을 가지며;
61. 상기 단락 56의 장치에서, 상기 전자기 방사선의 경로는 약 10 ㎛ 내지 약 1000 ㎛의 폭을 가지며;
62. a) 세포는 규정된 체적내에 실질적으로 고정되어 위치될 수 있으며, 상기 규정된 체적내 상기 세포의 특정한 좌표는 미지인 것을 특징으로 하는, 세포 막의 투과화를 유도하기에 충분한 전자기 방사선을 방사하는 에너지원;
b) 펄스 표적 패턴에 따라 상기 규정된 체적의 실질적으로 전체에 상기 전자기 방사선의 펄스들을 인가하기 위한 명령; 및
c) 명령에 대한 반응으로 전자기 방사선을 인가하기 위한 인가 장치를 포함하는, 세포를 일시적으로 투과화시키는 장치;
63. 상기 단락 62의 장치에서, 상기 전자기 방사선의 펄스들의 각각의 펄스는 최대 1000 초대, 100 초대, 10 초대, 1 초대, 100 밀리초대, 10 밀리초대, 1 밀리초대, 100 마이크로초대, 10 마이크로초대, 1 마이크로초대, 100 나노초대, 10 나노초대, 1 나노초대, 100 피코초대, 10 피코초대, 1 피코초대, 100 펨토초대, 10 펨토초대, 1 펨토초대, 100 아토초대, 10 아토초대 및 1 아토초대로 이루어진 군으로부터 선택된 지속 시간을 가지며;
64. 상기 단락 62의 장치에서, 상기 전자기 방사선의 펄스들의 각각의 펄스는 약 100 피코초대 내지 약 10 초대의 지속 시간을 가지며;
65. 상기 단락 62의 장치에서, 상기 전자기 방사선의 적어도 2회 이상의 펄스들이 상기 펄스 표적 패턴내 단일 펄스 표적에 인가되며;
66. 상기 단락 62의 장치에서, 상기 전자기 방사선의 경로는 적어도 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 300, 1 x 103, 2 x 103, 3 x 103, 4 x 103, 5 x 103, 6 x 103, 7 x 103, 8 x 103, 9 x 103 및 1 x 104 ㎛로 이루어진 군으로부터 선택된 폭을 가지며;
67. 상기 단락 62의 장치에서, 상기 전자기 방사선의 경로는 약 10 ㎛ 내지 약 1000 ㎛의 폭을 가지며;
68. a) 규정된 체적이 고체 표면에 의해 일부 제한되며, 상기 고체 표면으로부터의 유효 거리에 의해 추가적으로 제한되는 것을 특징으로 하는, 세포를 규정된 체적내에 실질적으로 고정된 위치로 유지시키는 단계; 및 b) 상기 세포의 막에 투과화를 일시적으로 유도하기에 충분한 전자기 방사선을 상기 규정된 체적의 실질적으로 전체에 인가하는 단계를 포함하는, 세포를 일시적으로 투과화시키는 방법;
69. 상기 단락 68의 방법에서, 상기 전자기 방사선의 고체 표면에 대한 에너지 세기는 최대 약 0.001, 0.002, 0.003, 0.006, 0.01, 0.02, 0.03, 0.06, 0.1, 0.2, 0.3, 0.6, 1, 2, 3, 4, 5 및 6 μJ/㎛2으로 이루어진 군으로부터 선택되며;
70. 상기 단락 68의 방법에서, 상기 전자기 방사선의 고체 표면에 대한 에너지 세기는 약 0.001 내지 0.3 μJ/㎛2이며;
71. 상기 단락 68의 방법에서, 상기 유효 거리는 약 1000 ㎛ 미만, 600 ㎛ 미만, 300 ㎛ 미만, 200 ㎛ 미만, 100 ㎛ 미만, 60 ㎛ 미만, 30 ㎛ 미만, 20 ㎛ 미만, 10 ㎛ 미만, 6 ㎛ 미만, 3 ㎛ 미만, 2 ㎛ 미만 및 1 ㎛ 미만으로 이루어진 군으로부터 선택되며;
72. 상기 단락 68의 방법에서, 상기 유효 거리는 약 1 ㎛ 내지 약 20 ㎛이며;
73. 상기 단락 68의 방법에서, 상기 세포는 최대 1000 초대, 100 초대, 10 초대, 1초대, 100 밀리초대, 10 밀리초대, 1 밀리초대, 100 마이크로초대, 10 마이크로초대, 1 마이크로초대, 100 나노초대, 10 나노초대, 1 나노초대, 100 피코초대, 10 피코초대, 1 피코초대, 100 펨토초대, 10 펨토초대, 1 펨토초대, 100 아토초대, 10 아토초대 및 1 아토초대로 이루어진 군으로부터 선택된 시간동안 전자기 방사선에 노출되며;
74. 상기 단락 68의 방법에서, 상기 세포는 약 100 피코초 내지 약 10초의 시간동안 상기 전자기 방사선에 노출되며;
75. 상기 단락 68의 방법에서, 상기 인가 단계는 상기 고체 표면에 방사선 펄스를 전달하는 단계를 포함하며;
76. 상기 단락 68의 방법에서, 상기 인가 단계는 방사선 빔을 경로 패턴에 따라 상기 고체 표면으로 통과시키는 단계를 포함하며;
77. 상기 단락 68의 방법에서, 초당 적어도 10, 30, 100, 300, 1000, 3000, 10,000, 30,000, 100,000, 300,000, 1,000,000, 3,000,000, 10,000,000, 30,000,000, 100,000,000 및 240,000,000 세포수의 비율로부터 선택된 비율로 세포에 투과화를 유도하는 단계를 추가적으로 포함하며;
78. 상기 단락 68의 방법에서, 약 300 내지 약 10,000,000 세포/초의 비율로 세포에 투과화를 유도하는 단계를 포함하며;
79. 상기 단락 68의 방법에서, 상기 투과화 이후에 상기 세포의 생존 가능성은 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%로 이루어진 군으로부터 선택된 수치로 유지되며;
80. 상기 단락 68의 방법에서, 상기 투과화 이후에 상기 세포의 생존 가능성은 적어도 50% 내지 적어도 90%의 수치로 유지되며;
81. 상기 단락 68의 방법에서, 상기 세포를 비등장성 수성 매질과 접촉시키는 단계를 추가적으로 포함하며;
82. 상기 단락 68의 방법에서, 추가적으로 상기 세포는 상기 투과화된 막으로 통과시킬 수 있는 물질을 함유하고 있는 수성 매질과 접촉하며;
83. 상기 단락 82의 방법에서, 상기 물질은 이온, 유기 분자, 무기 분자, 콜로이달 입자, 다당류, 펩티드, 단백질, 핵산 및 변형 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택되며;
84. 상기 단락 82의 방법에서, 상기 물질은 투과화된 막을 통해 상기 세포로 들어가며;
85. 상기 단락 84의 방법에서, 상기 투과화된 막은 최대 약 0.3 밀리초, 1 밀리초, 3 밀리초, 10 밀리초, 30 밀리초, 100 밀리초, 300 밀리초, 1 초, 3 초, 10초, 30 초, 1 분, 2 분, 3 분, 6 분, 10 분, 20 분 및 30 분으로 이루어진 군으로부터 선택된 시간이내에 실질적으로 비투과화된 상태로 회복되며;
86. 상기 단락 84의 방법에서, 상기 투과화된 막은 약 1초 내지 약 1분의 시간이내에 실질적으로 비투과화된 상태로 회복되며;
87. 상기 단락 1의 방법에서, 상기 전자기 방사선은 상기 고체 표면의 영역에 적어도 약 0.0001, 0.0003, 0.001, 0.003, 0.01, 0.03, 0.1, 0.3, 1, 3, 10, 30, 100, 200, 300 및 400 cm2/초로 이루어진 군으로부터 선택된 비율로 인가되며;
88. 상기 단락 68의 방법에서, 상기 전자기 방사선은 약 0.0003 내지 약 10 cm2/초의 비율로 상기 고체 표면의 영역에 인가되며;
89. 상기 단락 68의 방법에서, 상기 전자기 방사선은 상기 규정된 체적내에서 약 6 x 107 미만, 3 x 107 미만, 2 x 107 미만, 1 x 107 미만, 6 x 106 미만, 3 x 106 미만, 2 x 106 미만, 1 x 106 미만, 6 x 105 미만, 3 x 105 미만, 2 x 105 미만, 1 x 105 미만, 6 x 104 미만, 3 x 104 미만, 2 x 104 미만 및 1 x 104 w/cm2 미만으로 이루어진 군으로부터 선택된 출력 강도를 가지며;
90. 상기 단락 68의 방법에서, 상기 인가 단계는 고체 표면에 적어도 1, 10, 100, 103, 104, 105, 106, 107, 108 및 109 Hz로 이루어진 군으로부터 선택된 비율로 2회 이상의 방사선 펄스를 전달하는 단계를 포함하며;
91. 상기 단락 68의 방법에서, 상기 인가 단계는 규정된 체적에 약 100 내지 약 104 Hz의 비율로 2회 이상의 방사선 펄스를 전달하는 단계를 포함하며;
92. 상기 단락 68의 방법에서, 상기 전자기 방사선은 연속파형 레이저, 펄스형 레이저, 연속 램프 및 섬광등으로 이루어진 군으로부터 선택된 에너지원으로부터 유래되며;
93. 상기 단락 68의 방법에서, 상기 인가 단계는 펄스 표적 패턴에 따라 규정된 체적에 2회 이상의 전자기 방사선 펄스를 전달하는 단계를 포함하며;
94. 상기 단락 93의 방법에서, 상기 전자기 방사선의 펄스들의 각각의 펄스는 최대 1000 초대, 100 초대, 10 초대, 1 초대, 100 밀리초대, 10 밀리초대, 1 밀리초대, 100 마이크로초대, 10 마이크로초대, 1 마이크로초대, 100 나노초대, 10 나노초대, 1 나노초대, 100 피코초대, 10 피코초대, 1 피코초대, 100 펨토초대, 10 펨토초대, 1 펨토초대, 100 아토초대, 10 아토초대 및 1 아토초대로 이루어진 군으로부터 선택된 지속 시간을 가지며;
95. 상기 단락 93의 방법에서, 상기 전자기 방사선의 펄스들의 각각의 펄스는 약 100 피코초대 내지 약 10 초대의 지속 시간을 가지며;
96. 상기 단락 93의 방법에서, 상기 전자기 방사선의 적어도 2회의 펄스는 상기 펄스 표적 패턴내 단일 펄스 표적으로 인가되며;
97. 상기 단락 68의 방법에서, 상기 전자기 방사선은 고체 표면상의 규정된 영역으로 인가되며, 상기 규정된 영역은 적어도 0.0001, 0.0003, 0.001, 0.003, 0.01, 0.03, 0.1, 0.3, 1, 3, 10, 30, 100, 200, 300 및 400 cm2로 이루어진 군으로부터 선택되며;
98. 상기 단락 68의 방법에서, 상기 전자기 방사선은 고체 표면상의 규정된 영역으로 인가되며, 상기 규정된 영역은 약 0.0001 내지 약 10 cm2이며;
99. 상기 단락 68의 방법에서, 상기 전자기 방사선은 상기 규정된 영역의 실질적으로 전체에 동시에 인가되며;
100. 상기 단락 68의 방법에서, 상기 규정된 체적내 상기 전자기 방사선의 경로는 적어도 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 300, 1 x 103, 2 x 103, 3 x 103, 4 x 103, 5 x 103, 6 x 103, 7 x 103, 8 x 103, 9 x 103 및 l x 104 ㎛로 이루어진 군으로부터 선택되는 폭을 가지며;
101. 상기 단락 68의 방법에서, 상기 전자기 방사선의 경로는 약 10 ㎛ 내지 약 1000 ㎛의 폭을 가지며;
102. a) 세포는 규정된 체적내에 실질적으로 고정되어 위치되며, 상기 규정된 체적내 상기 세포의 특정한 좌표는 미지인 것을 특징으로 하는, 세포 막의 투과화를 유도하기에 충분한 전자기 방사선을 방사하는 에너지원;
b) 복수 위치들의 특징과는 관계없이 상기 규정된 체적내 여러 위치에 전자기 방사선을 인가하기 위한 명령; 및
c) 명령에 대한 반응으로 전자기 방사선을 인가하기 위한 인가 장치를 포함하는, 세포를 일시적으로 투과화하기 위한 장치;
103. a) 세포는 규정된 체적내에 실질적으로 고정되어 위치되며, 상기 규정된 체적내 상기 세포의 특정한 좌표는 미지인 것을 특징으로 하는, 세포 막의 투과화를 유도하기에 충분한 전자기 방사선을 방사하는 에너지원;
b) 규정된 체적내 전자기 방사선의 상기 고체 표면에 대한 에너지 세기는 최대 6 μJ/㎛2인 것을 특징으로 하는, 상기 규정된 실질적인 체적 전체를 포함하는 복수 위치에 상기 전자기 방사선을 인가하기 위한 명령; 및
c) 명령에 대한 반응으로 전자기 방사선을 인가하기 위한 인가 장치를 포함하는, 세포를 일시적으로 투과화하기 위한 장치;
104. 지시사항(instructions) 셋트를 포함하는 메모리를 가진 시스템에 있어서, 실질적으로 고정된 세포의 막에 일시적인 투과화를 유도하기에 충분한 전자기 방사선을, 상기 세포에 대한 특정한 3차원 위치에 대한 사전 정보없이 고체 표면에 인가하는 단계를 포함하는 기능을 컴퓨터로 하여금 수행하도록 하며, 상기 세포는 상기 전자기 방사선의 경로에 있는 것을 특징으로 하는 시스템;
105. 상기 단락 1의 방법에서, 상기 하나 이상의 세포내의 물질이 일시적으로 투과화된 막을 통해 하나 이상의 세포로부터 배출될 수 있도록, 상기 하나 이상의 세포를 상기 물질이 결핍되어있거나 또는 물질의 상기 하나 이상의 세포내 농도보다 낮은 농도로 물질을 포함하고 있는 수성 매질과 접촉시키는 단계를 추가적으로 포함하며;
106. 상기 단락 105의 방법에서, 상기 물질은 이온, 유기 분자, 무기 분자, 콜로이달 입자, 다당류, 펩티드, 단백질, 핵산 및 변형 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택되며;
107. 상기 단락 1의 방법에서, 상기 수성 매질내 물질이 일시적으로 투과화된 막을 통해 하나 이상의 세포로 들어갈 수 있도록 상기 하나 이상의 세포를 수성 매질과 접촉시키는 단계를 추가적으로 포함하며;
108. 상기 단락 107의 방법에서, 상기 물질은 상기 물질은 이온, 유기 분자, 무기 분자, 콜로이달 입자, 다당류, 펩티드, 단백질, 핵산 및 변형 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택되며;
109. 상기 일시적으로 투과화된 막은 최대 약 0.3 밀리초, 1 밀리초, 3 밀리초, 10 밀리초, 30 밀리초, 100 밀리초, 300 밀리초, 1 초, 3 초, 10초, 30 초, 1 분, 2 분, 3 분, 6 분, 10 분, 20 분 및 30 분으로 이루어진 군으로부터 선택된 시간이내에 실질적으로 비투과화된 상태로 회복되는 단계를 추가적으로 포함하며;
110. 상기 단락 107의 방법에서, 상기 일시적으로 투과화된 막은 약 1 초 내지 약 1 분의 시간이내에 실질적으로 비투과화된 상태로 회복된다.
상세한 설명
본 발명의 구현예는 일시적인 투과화 상태를 유도하기 위하여 세포에 전자기 방사선을 비특이적으로 조사하는 방법 및 장치에 관한 것이다. 상기 일시적인 투과화 상태는 세포가 적재/하역후 지속적인 생존에 요구되는 시간내에 실질적으로 비투과화된 상태로 회복가능하면서, 여러가지 물질을 세포에 적재하거나(세포에 적재), 세포에 넣거나 또는 세포에서 분리시키는(세포에서 하역)데 유용하다.
옵토인젝션 및 옵토포레이션 방법에 대한 일반적인 논의는, 아래 참고문헌에서 확인할 수 있으며, 이들 문헌은 원용에 의해 그 전체로서 본 발명에 포함된다: Guo, Y., Liang, H., & Berns, M. W. 1995. Laser-mediated gene transfer in rice. Physio. Plant, 93: 19-24; Shirahata, Y., Ohkohchi, N., Itagak, H., & Satomi, S. 2001. New technique for gene transfection using laser irradiation. J. Invest. Med., 49: 184-190; Tao, W., Wilkinson, J., Stanbridge, E. J., & Berns, M. W. 1987. Direct gene transfer into human cultured cells facilitated by laser micropuncture of the cell membrane. PNAS, 84: 4180-4184; Tirlapur, U. K. & Konig, K. 2002. Targeted transfection by femtosecond laser. Nature, 418: 290-291; Kurata, S., Tsukakoshi, M., Kasuya, T., & Ikawa, Y. 1986. The laser method for efficient introduction of foreign DNA into cultured cells. Exp. Cell Res., 162: 372-378; Koller, M. R., Hanania, E. G., Eisfeld, T. M., & Palsson, B. O., 표제 "옵토인젝션법"의 2001년 9월 21일자로 출원된 미국 특허 출원번호 09/961,691의 2002년 6월 20일자 공개된 미국 특허 출원 공개번호 20020076744; Palsson, B. O.,의 2003년 2월 4일자 미국 특허 출원번호 10/359,483, 표제 "세포 집락에서 특정 세포를 선택적으로 표적화하는 방법 및 장치"; Krasieava, T. B., Chapman, C. F., LaMorte, V. J., Venugopalan, V., Berns, M. W., & Tromberg, B. J. 1998. Mechanisms of cell permeabilization by laser microirradiation. Proc. SPIE, 3260: 38-44; 및 Tsukakoshi, M., Kurata, S., Nominya, Y., Ikawa, Y., & Kasuya, T. 1984. A novel method of DNA transfection by laser microbeam cell surgery. Appl. Phys., 35: 135-140.
본 발명에 따른 방법 및 장치는 일시적인 투과화 상태를 유도하기 위하여 세포의 특정한 3차원 위치에 대한 정보를 필요로하지 않는다. 대신, 일시적으로 투과화되어지는 세포는 규정된 체적내에 존재할 수 있으며, 상기 규정된 체적은 공간내 크기(dimession) 및 위치가 알려져있다. 세포는 바람직하기로는 상기 규정된 체적내 실질적으로 고정된 위치에 있을 수 있으며, 상기 실질적인 고정은 조사 과정중에 세포가 상기 규정된 체적의 경계를 (상기 규정된 체적내로 또는 외부로) 벗어나지 않는 것을 의미한다. 상기 규정된 체적은 고체 표면상의 규정된 영역에 의해 부분적으로 한정되며, 상기 규정된 영역은 고체 표면의 공지된 크기 및 위치를 가진다. 상기 규정된 영역은 본 발명의 이용에 따라, 적어도 0.0001, 0.0003, 0.001, 0.003, 0.01, 0.03, 0.1, 0.3, 1, 3, 10, 30, 100, 200, 300 및 400 cm2를 비제한적으로 포함한, 다양한 유용한 크기 및/또는 경계(예, 멀티-웰 세포 조직 배양판의 단일 웰의 내측 밑면 영역 또는 조직 배양 플라스크의 내측 밑면 영역)를 가질 수 있다. 상기 규정된 체적은 추가적으로 상기 규정된 영역으로부터 직각으로 투사된 유효 거리로 한정될 수 있으며, 상기 유효 거리는 전자기 방사선이 세포의 일시적인 투과화 상태를 유도하기 위한 목적에 유효한 것으로 알려진 범위로 사전 결정된 거리이다(도 1). 본원에서, "직각으로"는 교차하거나 직각으로 놓여진 것으로 정의된 직각의 부사형이다. 일시적인 투과화 상태는 세포막에 투과화를 유도하기에 충분한 특성 및 함량의 전자기 방사선을 상기 규정된 체적에 인가함으로써, 세포에 유도될 수 있다. 조사된 규정 체적내에 함유된 세포는 전자기 방사선의 경로에 위치하며, 따라서 세포는 투과화를 유도하는 전자기 방사선 선량(dose)을 받는다. 세포가 전자기 방사선 경로에 위치하는 것은, 적어도 일부 세포 및 적어도 일부 전자기 방사선이 동일한 순간에 동일한 공간을 차지하는 것을 의미한다.
일부 예들에서, 상기 장치는 세포막에 투과화를 유도하기에 충분한 전자기 방사선을 방사하는 에너지원을 포함할 수 있다. 이러한 에너지원의 일반적인 형태로는 연속파형 레이저, 펄스형 레이저, 연속 램프 및 섬광등을 포함하나, 이로 한정되는 것은 아니다. 이러한 에너지원의 구체적인 형태로는, 필터가 장착 또는 미장착된 arc 램프(예, 수은, 크세논, 금속 할라이드 등), 발광 다이오드(light-emitting diodes, LEDs), 색소 레이저, 가스 레이저, 고형 레이저, Q-스위치 레이저 등을 포함하나, 이로 한정되는 것은 아니다. 임의의 한 순간에 상기 규정된 체적으로 전자기 방사선이 통과하는 경로(즉, 규정된 체적내 전자기 방사선의 순간적인 경로)는, 예컨대, 적어도 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 300, 1 x 103, 2 x 103, 3 x 103, 4 x 103, 5 x 103, 6 x 103, 7 x 103, 8 x 103, 9 x 103 및 l x 104 ㎛의 충분한 폭을 가질 수 있다. 상기 폭 크기들에 속하는 구체적인 폭 범위들 역시 유용할 수 있다. 예컨대, 폭은 약 10 ㎛ 내지 약 1000 ㎛일 수 있다. 하나의 세포보다 큰 폭은, 2개 이상의 세포를 동시에 조사할 수 있다는 점에서 이로울 수 있다. 많은 예들에서, 전자기 방사선을 상기 규정된 체적내 유용한 빔 범위에 속하는 빔을 구현하는 광학 인자들을, 광학적 전자기 방사선 경로(에너지원에서 규정된 체적으로 이동하면서)에 포함하는 것이 또한 유용하다.
일부 예들에서, 상기 장치는 규정된 체적에 전자기 방사선을 인가하기 위한 인가 장치를 추가적으로 포함하여, 상기 전자기 방사선은 규정된 체적의 실질적으로 전체에 투사된다. 전자기 방사선이 에너지원에서 발사되면, 규정된 체적에 세포의 막에 투과화를 유도하기에 충분한 특성 및 함량으로 이를 인가하기 위한, 적어도 하나의 인자를 요구할 수 있다. 전자기 방사선의 에너지원에서 규정된 체적으로의 궤도가 인가되는 인자들의 예로는, 반사 인자(즉, 거울), 굴절 인자(즉, 프리즘 또는 광섬유), 회절 인자, 전류 측정 인자, 압절 틸트 플랫폼(piezo-electric tilt platform) 및 광음파 변류기(acousto-optical deflector)를 포함하나, 이것으로 한정되는 것은 아니다.
전자기 방사선을 만족할만한 특성으로 규정된 체적에 인가하는 방법의 일 예는, 광 설계 분야에서 공지된 광학 인자들을 이용하여 전자기 방사선 빔의 기하학 프로파일을 구현하는 것이다. 기하학 프로파일은, 규정된 체적내 수렴각/발산각, 규정되 체적내 빔이 직경, 규정된 체적내 빔 허리(beam waist)의 직경, 빔내 광선 에너지 분포 등을 포함하지만, 이것으로 한정되는 것은 아니다. 전자기 방사선을 충분한 특성으로 규정된 체적에 인가하는 방법의 다른 예는, 전자기 방사선의 각각의 펄스들의 지속 시간을 제어하는 것으로, 개별 펄스는 1 아토초대 내지 1000 초대의 지속 시간(즉, 펄스 폭)을 가지는 것이 유용하다. 이러한 제어는 예컨대, 기계적 셔터(mechanical shutter), 광 셔터, 개별 피정의 펄스들을 형성하기 위한 에너지원의 전기적 제어 등을 통해 수행될 수 있다. 전자기 방사선을 충분한 특성으로 규정된 체적에 인가하는 방법의 또다른 예는, 규정된 체적내 동일 위치로 인가된 연속 펄스들의 진동수를 (예, 기계적 셔터, 광 셔터, 개별 피정의 펄스들을 형성하기 위한 에너지원의 전기적 제어 등을 통해) 제어하는 방법이며, 이러한 펄스 진도수는 예컨대 적어도 1 Hz 내지 109 Hz의 범위일 수 있으나, 이것으로 한정되는 것은 아니다. 또한, 전자기 방사선을 충분한 특성으로 규정된 체적에 인가하는 방법의 예는 예컨대, 하나 이상의 필터를 통해 전자기 방사선의 파장을 제어하는 방법이다.
전자기 방사선을 충분한 선량으로 규정된 체적에 인가하는 방법의 예는, 규정된 체적의 실질적으로 전체에 전자기 방사선이 발사되는 중에 고체 표면상의 규정된 영역쪽으로 발사되는 에너지의 면 밀도나 또는 단위 영역당 에너지를 제어하는 방법이다. 예를 들어, 이는 정해진 빔 직경에 속하는 방사선의 에너지를 집중시키는 방법, 레이저 빔의 수렴각을 규정된 체적내로 통제함으로써 레이저 빔 허리를 형성시키는 방법, 방사선 빔의 에너지를 필터로 약화시키는 방법, 펄스 폭을 제어함으로써 방사선 빔의 규정된 체적내 노출 지속 시간을 제한하는 방법, 규정된 영역내 특정 위치로 인가된 다수 펄스들을 통제함으로써 방사선 빔의 노출 축적 시간을 한정하는 방법, 또는 규정된 영역보다 작은 횡단면적을 가지는 방사빔을 규정된 영역내 다수 위치들에 인가하여, 규정된 전 영역이 실질적으로 일정한 누적 에너지 면 밀도를 받는 방법을 포함할 수 있다. 나아가, 방사선 빔은 연속적(예, 섬광 또는 펄스형이 아님)일 수 있으며, 또한 규정된 영역보다 작은 횡단면적을 가질 수 있다. 전체 규정된 체적은, 규정된 체적의 실질적으로 전체에 전자기 방사선을 발사하면서 빔의 경로 중첩 수준을 누적 에너지 면 밀도의 허용 한계 범위내로 조절하는 경로 패턴으로, 규정된 영역을 횡단하여 통과시킴으로써, 실질적으로 일정한 누적 에너지 세기를 받을 수 있다. 연구자들은 세포막의 소정 부위에 (세포 직경보다 작은 조사 스팟으로) 전자기 방사선을 위치시키고 7 μ(마이크로)J/μ(마이크로)m2 이상을 인가함으로써, 투과화된 세포를 제조한다(Tao, W., Wilkinson, J., Stanbridge, E. J., & Berns, M. W. 1987. Direct gene transfer into human cultured cells facilitated by laser micropuncture of the cell membrane. PNAS, 84: 4180-4184, at approximately 7 to 21 μJ/㎛2; Palumbo G, Caruso M, Crescenzi E, Tecce MF, Roberti G, Colasanti A. 1996 Targeted gene transfer in eucaryotic cells by dye-assisted laser optoporation. J Photochem Photobiol B. 36(1): 41-6; at approximately 1.6 x 105 μJ/㎛2; and Guo, Y., Liang, H., & Berns, M. W. 1995. Laser-mediated gene transfer in rice. Physio. Plant, 93: 19-24, at approximately 2.5 x 102 to 1.3 x 103 μJ/㎛2; 각각은 원용에 의해 그 전체로서 본 명세서에 포함된다). 그러나, 일부, 본 발명의 예들은 바람직하기로는, 특히 상기 전체 세포를 조사하거나(막의 일부 부분에 방사선을 위치시키는 것과는 반대) 또는 (㎲, ㎱, ㎰, 펨토초 또는 아토초 보다 짧은 시간으로) 매우 단시간내에 에너지를 전달할때, 6, 1, 0.1, 0.01 또는 0.001 μJ/㎛2 이하의 에너지 세기를 사용할 수 있다.
일시적인 투과화 유도에 유효한 에너지 세기를 이루기 위해, 에너지원의 성질 및 규정된 체적내 도달된 출력 강도에 따라, 다양한 시간으로 세포를 전자기 방사선에 노출시키는 것이 유용할 수 있다. 예를 들어, 비교적 저출력(예, 연속 램프) 에너지원은 충분한 수준의 일시적인 투과화를 유도하기 위해 1000 초대의 시간이 필요할 수 있다. 추가적인 예로서, 고출력의 펄스를 전달하는 에너지원(예, 섬광등 또는 펄스형 레이저)는 충분한 수준의 일시적인 투과화를 유도하기 위해 단지 1회의 방사선 펄스만을 필요로할 수 있으며, ㎲, ㎱, ㎰, 펨토초 또는 아토초 대의 노출 시간을 부여할 수 있다.
전자기 방사선을 충분한 선량으로 규정된 체적에 인가하는 다른 예는, 전자기 방사선을 규정된 체적의 실질적으로 전체에 투사하면서 고체 표면상의 규정된 영역으로 투사되는, 출력 강도의 평면 밀도 또는 단위 면적당 출력 강도를 조절하는 방법이다. 예컨대, 이는, 규정된 빔 직경에 속하는 방사선의 출력 강도를 집중시키는 방법, 규정된 체적내 레이저 빔의 수렴각의 조절에 의한 레이저 빔 허리 형성 방법, 또는 필터를 이용한 방사선 빔의 출력 강도를 약화시키는 방법을 포함할 수 있다. 따라서, 인가하는 방법은, 또한 에너지원의 성질 및 생물학적 적용의 필요요건에 따라 전자기 방사선의 규정된 체적내에서의 선량 및 선 특성을 조절하는 방법을 포함할 수 있으므로, 규정된 체적내로 전자기 방사선의 궤도를 조절하는 방법만을 포함할 수 있는 것은 아니다.
고체 표면은 다양한 세포-격납기(cell-containment device) 형태로 존재할 수 있으며, 비제한적으로 표준 조직 배양 멀티플 웰 플레이트(예, 6-웰, 12-웰, 24-웰, 48-웰, 96-웰, 384-웰, 및 1536-웰 플레이트), 페트리 디쉬, 현미경 슬라이드, 플라스틱 백, 조직 배양 플라스크 및 조직 배양 병을 포함한다. 이러한 세포-격납기의 고체 표면은 일반적으로 수성의 세포 매질과 접촉한다. 일부 예들에서, 전자기 방사선의 에너지원으로부터 규정된 체적으로의 광 경로는, 고체 표면을 형성하는 고형 물질을 함유하거나 또는 함유하지 않을 수 있으며, 따라서, 그 각각이 독특하 이점을 지닌 적어도 2가지의 다른 광 경로를 설정하는 것이 가능하다.
광 경로 설정의 한가지 타입에서, 광 경로는 세포(즉, 세포 공간)를 함유하는 고체 표면의 측면으로 규정된 체적에 접근한다. 이러한 광 경로 설정 타입의 일예는, 세포와 상기 세포가 접촉하고 있는 수성 매질이 격납기내에 있는 경우로, 상기 격납기는 수평 방향의 고체 바닥, 고형 벽 및 개방형 상부 또는 전자기 방사선에 실질적으로 투과적인 상부 구성을 가진다. 전자기 방사선은 상기 격납기로부터 격납기내 규정된 체적으로 접근하여 개방형 상부 또는 실질적으로 투과적인 상부 구성, 상부 액체 경계면, 수성 매질, 상기 규정된 체적의 상부 경계선으로 규정된 체적 및 고형 층 표면상의 규정된 영역을 관통하여, 규정된 체적내에 함유된 세포에 방사선이 조사된다. 이러한 광 경로 설정 형태에서, 전자기 방사선이 규정된 영역으로의 입사 시점에 벌써 규정된 체적을 통과하였으므로, 고체 표면을 형성하는 고형 물질은 규정된 영역상에서 전자기 방사선 입사에 투사될 필요가 없다. 이러한 광 경로 설정의 명백한 이점은, 고체 표면을 형성하는 고형 물질에 특수 투사 물질이 필요하지 않아, 제조가 보다 간단하고 저렴할 수 있다는 것이다.
광 경로 설정의 다른 형태는, 광 경로가 고형 물질을 함유하는 고체 표면의 측면으로부터 규정된 체적에 접근하는 형태이다. 이러한 광 경로 설정 형태는, 세포와 세포와 접촉하는 수성 매질이 격납기안에 있는 형태로, 상기 격납기는 벽과 전자기 방사선에 실질적으로 투과적인 물질로 구성된 수평 방향의 고형 층을 가진다. 전자기 방사선은 격납기 하부로부터 격납기내 규정된 체적에 접근하고, 실질적으로 투과적인 고형 층의 바닥, 고형 층, 고형 층 표면상의 규정된 영역, 및 규성정 체적을 통과하여, 규정된 체적내에 함유된 세포에 조사한다. 이러한 광 경로 설정에서, 전자기 방사선이 규정된 체적에 도달하기 위해 고형 물질을 통과하여야 하므로, 고체 표면을 형성하는 고체 물질은 실질적으로 전자기 방사선을 투과하여야 한다. 이러한 광 경로 설정 타입의 이점은, 비제한적으로, a) 실질적으로 투과적인 층을 가지는 격납기는 세포를 고해상도로 이미지화할 수 있으며, 및 b) 수성의 세포 매질을 통과하는 광 경로가 최소화되어, 광의 수계 특성과 관련된 변화성을 최소화시킨다는 것이다. 더욱이, 본 발명의 응용 및 특정 예에 따라, 고체 표면은 비제한적으로 폴리머 및 유리를 포함한 다양한 물질들을 포함할 수 있다.
또한, 장치는 전자기 방사선을 규정된 체적의 실질적으로 전체에 인가하기 위한 명령을 포함할 수 있다. 임의의 일정 예에서, 규정된 체적으로 인가되는 전자기 방사선은 최대 및 전체 규정된 체적을 포함하는 규정된 체적의 일부분을 교차할 것이다. 상기 예에서 전자기 방사선에 의해 교차되는 규정된 체적의 상기 부분을, 본원에서는 교차 체적(volume of intersection)이라고 한다. 교차 체적은 규정된 전체 체적보다 작으면, 명령은 규정된 체적 전체에 조사되도록, 전자기 방사선을 다수의 교차 체적으로 인가되도록 하거나 또는 공간내 경로를 통해 교차 체적에 미치도록 하여야 한다. 전자기 방사선을 규정된 실질적인 전체 체적으로 가하기에 유용한 명령의 예로는, 비제한적으로, 각각의 전자기 방사선 펄스가 펄스 표적 패턴(즉, 펄스 표적 패턴)에 따라, 전자기 방사선을 인가하기 위한 명령으로, 각각의 펄스 표적은 1회 또는 2회 이상의 펄스를 받을 수 있는 명령; 각각의 전자기 방사선 펄스들이 펄스 표적의 격자 패턴(즉, 예컨대, 2차 직각 격자 패턴 또는 3차 직각 격자 패턴)에 따라 전자기 방사선을 인가하기 위한 명령; 방사선의 연속 빔이 스위핑 패턴(sweeping pattern)에 따라 전자기 방사선을 인가하기 위한 명령으로 상기 스위핑 패턴은 빔의 중첩을 실제 0% 내지 100%로 허용하는 명령; 단일 펄스의 전자기 방사선에 관한 명령; 다수 펄스의 전자기 방사선에 관한 명령; 특정 시간동안 연속 빔의 전자기 방사선을 규정된 체적으로 인가하기 위한 명령; 에너지원을 켜거나 또는 방사를 개시하기 위한 명령; 에너지원을 끄거나 또는 방사를 중지시키기 위한 명령; 셔터를 열거나 또는 닫기 위한 명령; 및 거울 또는 렌즈를 특정 위치로 이동하기 위한 명령을 포함한다. 예를들면, 펄스형의 레이저 에너지원의 각 펄스의 교차 체적은 규정된 전체 체적의 불과 10%를 포함할 수 있으며, 명령들은 적어도 10회의 연속적인 레이저 펄스가 발생되도록 명령함으로써, 전자기 방사선을 규정된 체적의 실질적으로 전체에 인가할 수 있으며, 각 레이저 펄스는 고유 교차 체적을 가지며 10개의 고유 교차 체적들의 중첩 체적이 최소화되며(예, 0% 중첩, 규정된 전체 체적의 10%인 펄스 10회는 규정된 전체 체적의 100%에 해당됨), 이러한 연속적인 10회 펄스들은, 예컨대 2 펄스 표적들 x 5 펄스 표적들의 직각 격자로 이루어진 펄스 표적 패턴에 따라 규정된 체적으로 인가될 수 있으며, 각각의 펄스 표적은 전자기 방사선이 상기 펄스 표적으로 가해질때 고유 교차 체적을 형성하며, 10개의 고유 교차 체적을 모우면 규정된 실질적인 전체 체적을 포함한다. 두번째 예로서, 연속 레이저 에너지원으로부터의 전자기 방사선 빔은 임의의 주어진 경우에서 전체 규정된 체적의 단지 1%를 포함할 수 있으며, 약 1 밀리초간의 방사선 노출시 규정된 체적내의 세포의 막에 투과화를 유도하기에 충분한 에너지량을 포함하는 점에서, 명령은 빔이 약 1 밀리초의 점 특이 체류 시간(point-specific dwell time)을 포함하며 실제 규정된 체적내에서 경로가 중첩되지 않는 경로 패턴에 따라, 전체 규정된 체적을 통해 지나가도록 명령함으로써, 전자기 방사선을 대략 100 밀리초 이내에 규정된 실질적인 전체 체적으로 가할 수 있다. 예를 들어, 명령은 컴퓨터나 또는 다른 전기적 조절을 통해 자동적으로, 또는 인간의 조작 조절을 통한 수동으로 지시될 수 있다. 이러한 명령들을 구비한 장치는 또한 이러한 명령들에 대한 반응으로 전자기 방사선을 규정된 체적으로 인가하기 위한 인가 장치를 포함하는 것이 유용하다. 전자기 방사선을 인가하기 위한 이러한 지시 기기는, 비제한적으로, 반사 요소, 굴절 요소, 회절 요소, 검류계에 의한 전류 측정 요소, 피에조-전기 틸트 플랫폼(piezo-electric tilt platform), 아쿠스토우-광 변류기(acousto-optical deflector), 셔터 및 필터를 포함할 수 있다. 전자기 방사선을 규정된 체적으로 인가하기 위한 이러한 지시 기기는, 이러한 명령에 대해 반응하는 전기적 또는 기계적 작동기를 추가적으로 포함할 수 있다.
전체 규정된 체적이 실질적으로 일정한 전자기 방사선 선량을 받도록, 규정된 체적보다 더 작은 교차 체적에서 규정된 체적을 교차하는 전자기 방사선 빔은, 복수의 교차 체적으로의 인가를 필요로할 수 있다. 그러므로, 실질적으로 일정한 선량은 선량이 실질적으로 한정된 정량 수치 범위내인 것으로 이해된다. 전자기 방사선의 선량은 여러가지 방법으로 정량화될 수 있다: 에너지 면 밀도, 동력 면 밀도, 에너지 체적 밀도, 동력 체적 밀도, 에너지 흐름 및 공학 및 광학 분야에서 공지된 그외 전자기 방사선 정량의 표준법.
일부 예들은, 규정된 체적내에 위치한 다양한 물질 및 대상에 의해 현저하게 흡수, 확산, 굴절 또는 반사될 수 있는 전자기 방사선의 파장을 이용한다. 상기 물질 및 대상은, 비제한적으로, 생존가능한 세포, 생존가능하지 않은 세포, 세포 파편 및 수성 매질을 포함할 수 있다. 이러한 예들의 설계는, 여러가지 물질 및 대상이 규정된 체적을 통해 전자기 방사선의 전송시 가질지 모르는 영향을 고려낼 수 있다. 세포를 일시적으로 투과화하는데 유용한 전자기 방사선의 파장은, 특히 유용한 전자 스펙트럼(대략 400 나노미터 - 700 나노미터)의 가시 영역내 파장을 포함한, 대략 300 나노미터에서 3000 나노미터의 범위이다. 세포를 일시적으로 투과화하는데 유용한 근자외선 파장을 포함하는 파장 범위의 예는, 330 나노미터 내지 400 나노미터이다. 세포를 일시적으로 투과화하는데 유용한 근적외선 파장을 포함하는 파장 범위의 예는, 700 나노미터 내지 1100 나노미터의 범위이다.
흡광, 확산, 굴절 또는 반사와 같은 규정된 체적내에서의 광 현상의 부절적한 영향은, 이러한 부절적한 영향을 무의미하게 하는데 충분한 전자기 방사선 선량을 이용함으로써 무효화될 수 있다. 또한, 규정된 체적에 접한 고체 표면으로부터의 유효 거리는 제한될 수 있으므로, 따라서, 세포가 세포 막에 일시적인 투과화를 유도하기에 충분히 유효한 거리에 위치될 수 있는 범위로 규정된 체적을 한정하여, 상당한 방사선의 확산, 굴절, 반사 및 흡광을 고려할 수 있다. 예컨대, 유효 거리는 고체 표면에 부착되는 단일 세포의 두께(예, 1 ㎛대)에서 최대 1000 ㎛ 대 까지로 여러가지이다. 1000 ㎛ 대를 넘어선 거리는 전자기 방사선의 에너지 또는 출력 밀도상의 상당한 세력 약화를 경험할 수도 있다. 부적절한 영향을 무효화시키는 다른 방법으로는, 비제한적으로, 전자기 방사선 흡수에 의해 규정된 체적내의 온도 상승을 감소시키는 동안 원하는 총 에너지 선량을 유지하기 위해, 보다 긴 기간동안 보다 낮은 출력을 이용하는 방법, 및 규정된 표면에 다수개의 전자기 방사선의 입사각을 이용하는 방법을 포함한다.
세포의 투과화 비율은 여러가지 방법으로 조절될 수 있다. 전자기 방사선의 투입 방법 및 선량은 규정된 체적내 특정 세포 밀도 범위로 특정 타입의 세포에 투과화를 유도하기 위해 설계될 수 있다. 이러한 설계 정보는 적절한 에너지원 및 설계된 선량을 전달하기 위한 지시 기기를 선택 또는 설계하는데 이용될 수 있다. 세포는 다양한 세포 밀도 범위로 규정된 체적내에 위치될 수 있으며, 범위는 예컨대, 규정된 체적당 하나의 세포 내지 살아있는 동물 조직에서 발견된 세포 밀도(예, cm2 당 최대 108 세포)의 범위이다. 부가적으로, 에너지원이 충분한 출력을 가지며 지시 기기가 전자기 방사선을 400 cm2/초의 속도로 규정된 영역으로 인가될 수 있는 경우, 이후 세포 투과화 비율은 (규정된 체적은 실질적으로 규정된 영역을 조사하는 경로로 조사됨으로써) 규정된 체적내의 세포 밀도 및 규정된 영역 조사율의 함수이다. 고성능 세포 투과화 장치의 예는, 1초 미만동안 지속되는 섬광등으로부터의 1회 방사선 펄스를 이용하여, 각각이 약 8.5 cm X 12.7 cm 크기인 최대 4개의 표적 멀티-웰 플레이트 전체에 동시적으로, 즉 400 cm2/초 를 조사하는 위한 섬광등 및 지시 기기를 함유하고 있는 장치이며, 이러한 예에서, 규정된 체적은 모든 플레이트에 함유된 모든 웰들을 포함한다. 예컨대, 각 표준 멀티 웰 플레이트가 적어도 6천만개의 세포를 포함하는 경우, 초당 24천만개 이상의 세포를 조사할 수 있다. 다른 장치 및 방법예를 이러한 원칙을 토대로 제조하여, 매우 다양한 유용한 세포 투과율을 산출할 수 있다. 특정 예에서, 영역에 대한 조사는 적어도 0.0001, 0.0003, 0.001, 0.003, 0.01, 0.03, 0.1, 0.3, 1, 3, 10, 30, 100, 200, 300 또는 400 cm2/초의 비율로, 보다 바람직하기로는 적어도 약 0.0003 내지 약 10 cm2/초의 비율로 진행할 수 있다. 특정 예에서, 세포의 투과화는 적어도 10, 30, 100, 300, 1000, 3000, 10,000, 30,000, 100,000, 300,000, 1,000,000, 3,000,000, 10,000,000, 30,000,000, 100,000,000 또는 240,000,000 세포수/초의 세포 비율로, 보다 구체적으로는 적어도 약 300 내지 적어도 약 10,000,000 세포수/초 비율로 진행할 수 있다.
일시적인 투과가능한 상태는 여러가지 물질들을 세포내에 적재 또는 하역(unloading)하는데 유용하며, 세포가 적재후 세포의 연속적인 생존가능성에 도움이 되는 시간 이내에 실질적으로 비투과화된 상태로 회복하도록 허용한다. 하역은, 예컨대, 물질이 세포막의 바깥쪽에서 발견되는 농도보다 더 높은 농도로 세포막 내부에 존재할때 이루어지며, 물질은 고농도의 위치에서 저농도의 위치로 이동한다. 물질을 일시적으로 투과화된 세포로 적재하기 위해, 물질은 규정된 체적내에서 세포로 둘러싼 수성 매질에 함유될 수 있다. 이러한 물질로는, 비제한적으로, 이온류, 유기 분자들, 무기 분자들(예, quantum dots (Han, M., Gao, X., Su, J. Z., & Nie, S. 2001. Quantum-dot-tagged microbeads for multiplexed optical coding of biomolecules. Nat. Biotech., 19: 631-635); 원용에 의해 본 발명에 포함됨), 다당류, 펩티드류, 단백질류, 콜로이달 입자류, 핵산(예, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드 및 플라스미드) 및 변형 핵산(예, 펩티드 핵산)을 포함한다. 핵산은 사용에 따라 단일 가닥 또는 이중 가닥 DNA 또는 RNA일 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 포스포다이에스테르 결합으로 연결된 최대 약 20개의 뉴클레오티드로 이루어진 서열이다. 폴리뉴클레오티드는 일반적으로 약 20개 이상의 뉴클레오티드로 이루어진 서열이다. 이온류의 예로는, 비제한적으로, 아연 및 칼슘 이온이 있다. 무기 분자의 예로는, 비제한적으로, 반도체 나노크리스탈류(또한 퀸텀 도트(quantuum dot)라함)이 있다. 일시적으로 투과가능한 상태에서, 이러한 물질은 투과화된 막을 통해 세포에 들어갈 수 있다.
전자기 방사선의 투사가 적절히 조절될때 투과화된 막은 충분한 함량의 물질을 세포내로 적재하고 적재후 세포의 계속적인 생존이 가능하는데 도움이 되는 시간이내에 실질적으로 비투과화된 상태로 회복될 수 있다. 유용한 일시적 투과가능한 시간은 이온 및 그외 작은 분자의 경우 0.3 밀리초 미만으로 짧을 수 있다(Nilius B, Hess P, Lansman JB, Tsien RW. A novel type of cardiac calcium channel in ventricular cells. Nature. 1985 Aug 1-7; 316 (6027): 443-6; 원용에 의해 본 발명에 포함됨). 일반적으로 30분대를 넘는 일시적인 투과화 시간은 세포의 저생존율을 초래한다. 적재된 물질은 특정 세포내에서의 물질의 운명에 따라 실질적으로 비투과화된 상태로 막이 돌아간 후에도 세포내에서 다양한 시간동안 본래의 형태로 잔존할 수도 있다. 예컨대, 물질은 신속하게 가수분해, 인산화, 효소학적 절단 또는 세포 게놈으로 병합될 수 있다. 세포의 적재 후 생존율이 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상으로 유지되도록 전자기 방사선의 투입(특성, 선량 및 투여 방법)을 조절하는 것이 일반적으로 적절하다. 바람직하기로는, 생존율은 적어도 약 50% 내지 적어도 약 90%이다.
적재후 세포의 생존율, 특정 활용에 따른 적합성을 결정하기 위해 다양한 시점을 선택할 수 있다. 예컨대, 시점은 물질이 세포에 들어가는지를 결정할 수 있는 시점, 물질이 세포의 대사 또는 유전자 회로에 강한 영향을 주는 시점, 또는 24시간과 같이 고정된 적재후 경과 시간일 수 있다.
일부 예들에서, 만족스러운 높은 수준으로 세포 생존성을 유지하기 위한 전자기 방사선 투사는, 일반적으로 l x 1013 Watts (W)/cm2 미만의 출력 강도를 가진다. Tirlapur 등은(Nature, Vol. 418, 18 July 2002, pp. 290-1) 1회 펄스 동안 1019 W/cm2의 최고 세기와 동급의 평균 출력 강도 1012 W/cm2 의 사용을 개시하고 있으며, Tao 등은(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 84, pp. 4180-4184, June 1987) 2.1 x 1011 W/cm2와 동급의 약 7.3 x 1010 W/cm2의 사용을, Palumbo 등은(J. of Photochem. Photobio. B: Biology 36, 1996, pp. 41-46) 약 6.4 x 107 W/cm2의 사용을, Guo 등은(Physiologia Plantarum 93, pp. 19-24, 1995) 8.5 x 1012 W/cm2와 동급의 약 1.7 x 1012 W/cm2의 사용을 개시하고 있다. Tirlapur 등, Tao 등 및 Palumbo 등의 문헌들은 그 전체로 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 일부 예들에서, 예컨대, 노출 시간이 충분히 짧거나 또는 세포 생존의 필수요건이 상대적으로 낮다면, 약 1 x 1013, 2 x 1013, 3 x 1013, 6 x 1013, 1 x 1014, 2 x 1014, 3 x 1014, 6 x 1014, 1 x 1015, 2 x 1015, 3 x 1015, 6 x 1015, 1 x 1016, 2 x 1016, 3 x 1016, 6 x 1016, 및 1 x 1017 W/cm2 보다 높은 출력 강도가 사용될 수 있다. 부가적으로, 다른 예들에서, 노출 시간이 충분히 길고 조사 영역이 세포 투과화를 실행할 수 있는 비율을 수용하기에 충분히 넓다면, 약 6 x 107, 3 x 107, 2 x 107, 1 x 107, 6 x 106, 3 x 106, 2 x 106, 1 x 106, 6 x 105, 3 x 105, 2 x 105, 1 x 105, 6 x 104, 3 x 104, 2 x 104, 1 x 104 W/cm2 보다 낮은 출력 강도가 사용될 수 있다.
세포내 물질 적재율의 부가적인 증진은, 세포에 투과가능한 일시적인 상태 유도와 함께 비-등장성 수성 매질을 이용함으로써 이룰수 있다. 세포는 물질 적재율을 증가시기키 위해, 전자기 방사선에 의한 투과화 유도 이전에, 동안에 또는 이후에 비-등장성 수성 매질에 노출될 수 있다. 상기 비율은 세포당 적재된 물질의 함량, 단위 시간당 세포당 적재된 물질의 함량 또는 규정된 체적내 물질의 역치 수준으로 성공적으로 적재된 총 세포의 분획(또는 대안적으로 %)을 비제한적으로 포함하는 다양한 용어로 표현된다. 유용한 저삼투압성 수성 매질의 예는, 25 mM KCl, 0.3 mM KH2PO4, 및 90 mOsm/Kg 미오이노시톨로 구성된 용액이며, 이 용액은 또한 표준적인 등장의 PBS(phosphate-buffered saline)와 1:1 비율로 혼합하여 보다 적당한 저삼투성의 저삼투 매질을 만들 수 있다. 유용한 삼투압성 수성 매질의 예는, 25 mM KC1, 0.3 mM KH2PO4, 및 400 mOsm/Kg 미오이노시톨로 구성된 용액으로, 상기 용액은 표준적인 이소토닉 PBS와 1:1 비율로 혼합하여 보다 적당한 고삼투성의 고삼투 매질을 만들 수 있다. 당업자는 물질 적재율 증진에 유용할 수 있는 그외 비-등장성 수성 매질을 인지할 것이다.
도 2는 세포를 일시적으로 투과화시키거나/시키고 세포에 물질을 적재하는데 사용될 수 있는 장치(10)의 일예를 도시한다. 장치(10)는 내부 구성을 갖는 하우징(15)을 포함한다. 상기 하우징은 사용자의 안정을 확보하기 위한 레이저 안전 연동 장치를 포함하며, 또한 외부 영향(예, 환경광, 먼지 등)에 의한 간섭을 제한한다. 하우징(15)의 상부에는 공정 정보를 표시하기 위한 디스플레이 유닛(2)이 위치한다. 키보드(25) 및 마우스(30)은 데이타를 입력하고 장치(10)를 통제하는데 사용된다. 액세스 도어(35)는 세포 용기를 수용하는 가동성 스테지로의 접근을 제공한다.
장치(10)의 내부도는 도 3에 있다. 도시된 바와 같이, 장치(10)은 상기 장치의 내부 구성을 수용하는 상단 트레이(200) 및 하단 트레이(210)를 구비하고 있다. 상단 트레이(200)는 상기 장치(10)의 내부로 들어오는 대기 공기를 여과하는 흡입 필터(215A,B) 한쌍을 포함한다. 상기 액세스 도어(35) 아래는 광 서브어셈블리(미기재)이다. 상기 광 서브어셈블리는 상단 트레이(200)에 장착되며, 도 4-7에서 상세히 논의된다.
하단 트레이(210)은 소프트웨어 프로그램들, 명령 및 장치(10)을 운용하는 지시들을 저장하는 컴퓨터(225)이다. 또한, 컴퓨터(225)는 레이저 에너지원으로부터 전자기 방사선을 유도하기 위해 조절 신호를 전기 신호 연결장치를 통해 처리 장치에 제공한다.
본원에서, "컴퓨터"는 비제한적으로, 임의의 마이크로프로세서 또는 프로세서 조절 장치, 예컨대 퍼스날 컴퓨터, 워크스테이션, 서버, 클라이언트, 미니 컴퓨터, 메인-플래임 컴퓨터, 랩탑 컴퓨터, 개별 컴퓨터들의 네트워크, 이동 컴퓨터, 팜탑 컴퓨터, 휴대용 컴퓨터, TV 세트 탑 박스, 쌍방향 텔레비젼, 쌍방향 키오스크, PDA(personal digital assistant), 쌍방향 무선 통화 장치, 모바일 브로셔(mobile browser) 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 컴퓨터는, 키보드, 마우스, 터치패드, 조이스틱, 펜-입력-패드와 같은 입력 장치 및 컴퓨터 스크린 및 스피커와 같은 출력 장치를 추가적으로 구비할 수 있다. 이러한 컴퓨터는 유니-프로세서 또는 멀티-프로세서 기계일 수 있다.
부가적으로, 이러한 컴퓨터는 어드레스로 불러낼 수 있는 메모리 또는 저장 매체 또는 컴퓨터로 접근가능한 매체, 즉 RAM(random access memory), EEPROM(electronically erasable programmable read-only memory), PROM(programmable read-only memory), EPROM(erasable programmable read-only memory), 하드 디스크, 플로피 디스크, 레이저 디스크 플레이어, 디지탈 비디오 장치, 컴팩트 디스트, 비디오 테입, 오디오 테입, 자기 기록 트랙, 전자 네트워크 및 그외 예컨대 프로그램 및 데이타의 방식으로 전자적 내용을 전송 또는 보관하기 위한 기술들을 포함할 수 있다. 일부 예들에서, 컴퓨터에 네트워크 인터페이스 카드, 모뎀 또는 네트워크를 형성한 통신 매체에 연결하기에 적합한 그외 네트워크 연결 장치가 장착될 수 있다.
도시한 바와 같이, 일련의 전원(230A, B, C)은 장치(10)내의 여러가지 전기 부품들에게 전력을 공급한다. 또한, 무정전 전원공급 장치(235)는 상기 장치가 순간적인 외부 정전시에도 계속적으로 작동하도록 하기 위해 장착된다.
도 4는 장치(10)의 구현예의 광 서브어셈블리 디자인(300)의 레이아웃 일 예이다. 레이저(400)은 세포를 조사하기 위해 존재한다. 확인되는 바와 같이, 레이저(400)은 서터(410)을 통해 통과하는 523 nm의 에너지 빔을 출력한다. 상기 예시적인 레이저는 523 nm 파장을 가지는 에너지 빔을 출력하지만, 다른 파장에서 에너지를 형성하는 다른 소스 역시 본 발명의 범위에 포함된다.
레이저 에너지 빔이 일반 셔터(410)을 통과하면, 고체 표면의 면에 적절한 크기로 에너지 빔의 직경을 조정하는 빔 확대기(Special Optics, Wharton, NJ)(415)에 들어간다. 빔 확대기(415) 이후에는 빔의 극성화를 조절하는 반파장판이 뒤따른다. 이후 레이저 에너지 빔은 거울(425)에 의해 반사되어 큐브 광분할기(350)로 전송된다. 레이저 에너지 빔은 큐브 광분할기(350)에서 90°로 반사된다. 큐브 광분할기(350)으로부터 레이저 빔은 장파장 통과 거울(355)에 의해 반사되어, 검류계(360)를 지나간 다음, 스캐닝 렌즈(365)로 전송되고, 최종적으로 규정된 체적내로 집중된다.
Nd:YLF 2배 주파수, 고상 레이저(Spectra-Physics, Mountain View, CA)가, 안정성, 높은 점화 반복율 및 장기간의 무상 서비스로 인해 사용된다. 또한, 나노레이저(JDS Uniphase, San Jose, CA) Nd:YAG 제1 고조파(first harmonic)(1064 nm), Nd:YAG 제2 고조파(532 nm), 및 Nd:YAG 제3 고조파(355 nm) 버전들을 포함한, 다른 유사 레이저를 상기 장치에 사용할 수 있다.
도 5는 광 서브어셈블리 일예의 사시도를 도시하고 있다. 도 5의 사시도에 도시된 바와 같이, 레이저(400)은 셔터(410)를 통해 빔 확대기(415)로 에너지를 전송한다. 레이저(400)로부터 시작된 에너지는 빔 확대기(415)를 통과하고, 반파장 플레이트(420)을 통과하여 폴드 거울(fold mirror)(425)에 부딪친 다음 장파장 통과 거울(355)에서 90°로 반사되는 큐브 광분할기(350)으로 수렴되며, 컴퓨터로 조절되는 검류계 거울(360)에서 반사된다. 스캐닝 렌즈(365)를 통해 검류계 거울(360)을 지난 다음, 레이저 에너지 빔은 내부에 존재하는 임의의 세포에 투과화를 유도하기 위하여 규정된 체적을 비춘다.
표면적이 매우 넓은 표본을 처리하기 위하여, 상기 장치는 스캐닝 렌즈에 대하여 표본 용기를 기계적으로 이동시키는 가동성 스테이지를 포함한다. 또한, 고체 표면의 특정 영역이 처리되면, 가동성 스테이지는 스캐닝 렌즈 시야내에 고체 표면의 다른 영역이 오게 한다. 도 6에 도시된 바와 같이, 컴퓨터로 조절된 가동성 스테지(500)은 처리되는 용기(미기재)를 수용하고 있다. 상기 가동성 스테지(500)은 컴퓨터로 조절되는 서보 모터(servo motor)에 의해 두가지 축을 따라 이동되며, 표본 용기는 기구의 광학성 구성에 비해 이동될 수 있다. 규정된 경로에 따른 스테지 이동은 장치의 다른 조작들과 좌표를 이룬다. 또한, 특정 좌표를 저장할 수 있으며 다시 불러들려 목적한 위치로 가동성 스테이지를 복귀시킬 수 있다. X 및 Y 이동에 관한 엔코더(Encoder)는 스테지 위치에 대한 폐루프 피드백 제어를 제공한다.
평면-시아(F-theta) 스캐닝 렌즈(365)는 가동성 스테지 위에 놓여진다. 렌즈(365)는 규정된 체적에 상기 시스템을 집중시키기 위한 목적으로 렌즈(365)의 자동적인 상향 및 하향이동(Z-축을 따라)을 허용하는 스테퍼 모터(stepper motor)상에 있다.
도 8에는 가동성 스테지(500)의 상면 도가 도시되어 있다. 나타낸 바와 같이, 용기는 가동성 스테지(500)에 놓여져 있다. 용기(505)는 가동성 스테지(500)에 대해 정방향/역방향으로 이동하도록 설계된 상부 축 네스트 플레이트(upper axis nest plate, 510)에 위치한다. 스패터 모터(미기재)는 상부 축 네스트 플레이트(510) 및 컴퓨터 시스템에 연결되어, 컴퓨터로부터 내려진 명령은 표본 용기(505)의 정방향/역방향 이동을 발생시킨다.
또한, 가동성 스테지(500)는 한쌍의 베어링 트랙 525A, B를 따라 가동성 스테지(500)의 좌우 이동을 제공하는 타이밍 벨트(timing belt, 515)에 연결되어 있다. 상기 타이밍 벨트(515)는 풀리커버(pulley cover, 53)아래에 장착된 풀리(미기재)에 붙어있다. 상기 풀리는 타이밍 벨트(515)가 가동성 스테지(500)의 좌우 이동을 발생시키도록 하는 스태퍼 모터(535)와 연결되어 있다. 스태퍼 모터(535)는 컴퓨터 시스템과 전기적으로 연결되어 있어, 컴퓨터 시스템 내부 명령은 가동성 스테이지(500)의 좌우 이동을 발생시킨다. 이동 한계 센서(travel limit sensor, 540)는 컴퓨터 시스템과 연결되어 있으며, 가동성 스테지가 사전에 결정된 측면 거리 이상으로 이동하는 경우 경보를 발생시킨다.
한쌍의 가속모터(accelerometer, 545A, B)는 장치 작동을 방해할 수도 있는 과다 충돌 또는 진동을 기록하기 위해, 이 플랫트폼상에 통합되는 것이 바람직하다. 또한, 2-축 경사계(two-axis inclinometer, 550)는 용기가 수평이도록 가동성 스테이지상에 통합되는 것이 바람직하며, 따라서, 용기내 중력-유도성 이동 가능성을 줄일 수 있다.
챔버는 용기에서의 응결을 소거하기 위한 배관이 장착된 팬과, 챔버가 허용가능한 온도 범위내인지를 측정하기 위한 열전대(thermocouple)를 가지고 있다. 추가의 팬은 전기 부품들에 의해 형성된 열을 배출하고, 적절한 필터가 공기 흡입기(215A, B)에 사용된다.
컴퓨터 시스템(225)은 전술한 전자 하드웨어의 여러가지 부분들의 운영 및 동기화를 제어한다. 컴퓨터 시스템은 하드웨어와 접속할 수 있는 상업적으로 이용가능한 임의의 컴퓨터일 수 있다. 컴퓨터는, 예컨대 비제한적으로 리눅스, 유닉스, 마이크로소프트® 윈도우®, 애플® MacOS® 및 IBM®을 포함한 모든 적합한 운영 시스템을 사용할 수 있다. 이러한 컴퓨터 시스템의 일예는 마이크로소프트 윈도우® NT 운영 시스템을 운영하는 인텔 펜티움 II 컴퓨터이다. 컴퓨터 시스템의 다른 예는, 펜티움 III 또는 IV를 가지는 것 및 윈도우® XP 운영 시스템을 운영하는 것이다. 여러가지 장치와 통신하고 전술한 방식으로 운영을 제어하기 위한, 소프트웨어가 사용된다.
용기를 가동성 스테지상에 위치시키고 도어를 닫으면, 컴퓨터는 신호를 상기 스테지에 전달하여 홈 위치로 이동시킨다. 팬이 초기화되어 용기의 워밍(warming) 및 서리 제거가 개시된다. 이때, 용기내 세포의 고체 표면 정착이 허용된다. 또한, 이 기간동안, 장치에는 용기가 적절하게 적재되어 광학 시스템의 초점 범위내이도록 하는 명령을 운영할 수 있다. 예컨대, 용기상에 구체적인 표시가 있을 수 있으며 스캔 렌즈가 용기 바닥에 적절하게 초점을 맞출 수 있도록 한 시스템에 의해 초점 맞추어질 수 있다. 적정 시간후, 컴퓨터로 팬을 꺼, 처리 동안의 과다 진동을 방지하고, 처리 공정을 시작한다.
조작자는 키보드 및 마우스로, 예컨대 용기의 전자기 방사선에 노출되는 영역을 선택함으로써, 상기 장치를 조작할 수 있다. 이후, 컴퓨터는 가동성 스테지가 스캐닝 렌즈 위에 위치되도록 지시하여, 노출되어진 용기의 제1 영역은 스캐닝 렌즈 시야내네 있게 한다. 레이저는 미리 결정된 속도로 발사를 개시하고, 각 레이저 펄스가 검류계 거울의 이동에 의해 여러 규정된 체적에 가해진다. 레이저의 속도 및 검류계로 인해, 수천회의 펄스들이 초당 수천개의 규정된 체적에 가해져, 세포 막의 고성능 투과화가 가능할 수 있다. 검류계 상품명의 일예는, Cambridge Technology, Inc. 모델 번호 6860(Cambridge, MA)이다. 이 검류계는 밀리초내에 매우 정확하게 재배치할 수 있어, 적당한 시간이내에 가능한 넓은 영역을 처리한다. 검류계 제어 보드에 의해 연속 발생된 에러 신호는, 컴퓨터로 모니터링되어 거울은 적당한 위치에 있게 되고 레이저 발사전에 폐루프 형상으로 안정하게 된다.
도 2-8에 개시된 시스템은 변형될 수 있음을 주지 및 이해하여야 한다. 예컨대, 방법 및 장치는 본 발명에 개시된 예로 사용될 수 있으므로, 카메라 및 광원과 같은 광학적 부품의 일부를 필요로하지 않는다.
다른 구현예는 메모리를 가진 시스템에 관한 것으로, 상기 메모리는 지시 사항 셋트를 포함한다. 지시는 컴퓨터가 기능을 수행하도록 할 수 있다. 상기 기능은 상기 세포의 특정한 3차원 위치에 대한 사전 정보없이 실질적으로 고정 세포의 막에 투과화를 유도하기에 충분한 전자기 방사선을 인가하는 단계를 포함할 수 있으며, 상기 세포는 전자기 방사선의 경로에 위치한다. 또한, 기능은 전자기 방사선을 위치 특성에 상관없이 규정된 체적내 위치로 인가하는 단계를 포함할 수 있다. "위치 특성"은 세포가, 예컨대, 위치의 가시화, 위치의 색상, 위치의 형광, 광 전송 등을 기반으로한 특정 위치에 위치되었는지에 대한 정보를 포함할 수 있다. 이는 방사선을 형광 표지, 비쥬얼 이미지, 염료 등을 기반으로한 구체적인 위치에 인가하는 시스템과는 대조적이다. 전자기 방사선의 선량은 전자기 방사선과 부합되는 세포 막의 투과화 유도에 충분할 수 있다.
메모리는 전술한 임의의 것을 포함한 모든 적정 메모리일 수 있다. 지시사항 셋트는 C++ 코드, 다른 임의의 코드, 초기화 파일, 아날로그 조건 등일 수 있다. 컴퓨터는 윈도우 XP® 운영 시스템을 포함한 임의의 운영 시스템을 이용하는 전술한 것을 포함한, 임의의 컴퓨터일 수 있다.
도 1은 고체 표면(S) 상의 규정된 영역 및 상기 규정된 영역에서 직각으로 설정된 유효 거리(d)를 나타내는 규정된 체적(V, x * y * d)의 투시도이다. 또한 상기 규정된 체적내 존재하는 몇개의 세포와, 고체 표면을 형성하는 실질적으로 투과적인 고형 물질(M)을 나타낸다.
도 2는 일예의 세포 처리 장치의 투시도이며, 하우징 및 디스플레이 외관을 도시한다.
도 3은 외부 아우징이 제거된 일예의 세포 처리 장치의 투시도이며 내부 구성을 도시한다.
도 4는 일예의 세포 처리 장치 내부의 광학 서브어셈블리 설계안의 블록도이다.
도 5는 일예의 세포 처리 장치 내부의 광학 서브어셈블리 일예의 투시도이다.
도 6은 스캐닝 렌즈 및 이동가능한 스테이지의 배열을 도시한 광학 어셈블리 일예의 측면도이다.
도 7은 광학 어셈블리 일예의 바닥 투시도이다.
도 8은 세포 처리 장치의 가동 스테이지의 상단 투시도이다.
도 9는 48시간 후 혈관에서 측정한 siRNA를 코딩하는 DNA의 옵토인젝션에 의한 GFP 무발현(silencing)을 나타낸 사진이다.
도 10은 SU-DHL-6 세포에 siRNA를 옵토인젠션한 이후 세포 생육을 나타낸 그래프이다.
도 11은 1분 후 Zn2+-표시자(indicator) RhodZin-1의 형광으로 측정한, Zn2+을 NIH-3T3 세포에 주입한 사진이다.
하기 실시예들은 여러가지 적용에서의 본 발명의 방법 및 장치의 사용을 예시한다.
실시예 1: 세포에 핵산 적재
최근, 포유류 세포에서의 효과적인 RNA 간섭(RNAi)-매개상 유전자의 무발현(silencing)을 발견한 이래(Elbashir,, S. M., Harborth, J., Lendeckel, W., Yalcin, A., Weber, K., & Tuschl, T. 2001. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature, 411: 494-498; 상기 문헌은 원용에 의해 그 전체가 본 명세서에 포함됨), 발견과 치료학적 적용에 있어서, 학술 및 법인 연구자들로부터 상당한 검증이 있었으며, 관심이 집중되고 있다. RNAi는 유전자 무발현에 있어 오래된 안티센스 기술을 능가하는 많은 장점 을 가지고 있으며, 이는 많은 유용한 모델 시스템에 대한 최근 많은 보고서를 선도하였다. 그러나, 핵산은 살아있는 무손상 세포 막을 통해 쉽게 통과하지 못하며, 최근 대부분의 보고서에서 RNAi 이식에 있어 기존 세포 형질감염 방법을 이용하는 경우의 한계점들이 지적되고 있다. RNAi는 잠재적으로 강력한 기법이지만, 이용가능한 고성능 및 고생존성 형질감염 방법은 아니다. 레이저 매개의 옵토인젝션은 다른 기술과 관련된 수많은 한계점들을 극복할 가능성을 가진다.
본 실시예에서, 센스 및 안티센스 RNAi 가닥을 암호하는 DNA를 Allele Biotechnology(San Diego, CA)에서 구입하였다. U6 RNA 중합효소 III 프로모터 및 변형된 종결인자를 세포내에서 고수준의 특이적 RNAi 발현에 사용하는, RNAi 카세트를 근간으로 수행하였다. DNA 주형 및 상위 프라이머는 키트와 함께 제공된다. 하위 GFP 특이 프라이머들, 즉 센스 및 안티센스 모두, 제조사의 추천방법(LineSilenceTM Kit, Allele Biotechnology, San Diego, CA)에 따른 조건으로 PCR 하여 작은 센스 및 안티센스 간섭 RNA(siRNA) 전사체 제조에 사용하였다. 하기 54 bp의 DNA 서열은 종결인자, 유전자 특이적 하위 서열 및 주형에 부합되는 부위를 나타낸다.
5'-caaaaactgtaaa AA GAACGGCATCAAGGTGAA C ggtgtttcgtcctttccaca-3'(서열번호 1)
5'-caaaaactgtaaa AA GTTCACCTTGATGCCGTT C ggtgtttcgtcctttccaca-3'(서열번호 2)
이후 PCR 산물을 정제한 다음 어닐링하여 옵토인젝션 실험에 사용함으로써 GFP 리포터 유전자의 유전자 무발현을 수행하였다.
Figure 112006037819110-PCT00001
10% FBS 및 0.2 mg/ml G418이 함유된 RPMI 1640에서 배양한 293T-GFP 세포(293T은 ATCC, Manassas, VA로부터 제공받았으며 phrGFP-1(Stratagene, La Jolla, CA)을 형질감염시킴)에 트립신을 처리하고 384-웰 플레이트에 접종하였다. 세포를 배양하여 24시간동안 부착되도록 한 다음, PBS로 1회 세척한 후 센스 및 안티센스 PCR 올리고(10-25 ng)을 5 ㎕ 저삼투압 완충액(Brinlcman, Westbury, NY)에 용해시킨 상태로 첨가하여 in situ를 수행하였다. 웰 부분을 발사전에 표적 세포 위치 선정이 필요하지 않는 미리 결정된 레이저 발사 격자 패턴에 노출시켰다. 참조로, 상기 부분의 주변은 도 9의 점선 박스로 표시된다. 이러한 세포는 고체 표면에 부착되어 생육하므로, 유효 거리는 수초 마이크로미터이었다. 523 nm 파장의 10 μJ/펄스 및 10 ㎱ 펄스 폭의 펄스형 레이저 빔을 지름 30 μ(마이크로)m로 아래로 초점을 맞추었고(견본에서 규정된 체적에 대해 50% 전이율을 고려하여, 펄스당 0.007 μJ/㎛2 에너지 세기 및 7 x 107 W/cm2의 최고 출력 강도를 형성), 펄스를 발사하여 미리 결정된 격자 패턴내 인접 발사(adjacent shot)간의 거리가 x- 및 y- 방향으로 20 ㎛가 되도록 연속 조정하였다. 레이저 펄스를 초당 300 비율로 발사 및 조정하여, 1/10 초 미만으로 전체 규정된 체적에 조사되도록 하였다. 이러한 방법으로 세포 위치에 대한 사전 정보없이도 규정된 체적내 모든 세포를 조사하게 된다. 도 9의 이미지는 단순 대조군으로, 세포 또는 영역을 표적으로 사용한 것이 아니다. 레이저 처리 후 바로 완충액을 제거하고 성장 매질로 치환한 다음 플레이트를 배양기에 두었다. 48시간 후, 프로피디움 요오드화물을 사용하여 세포 생존율이 >70%임을 확인하였고, 형광 사진으로 박스내 세포에서의 GFP 유전자의 무발현성을 확인하였다. 규정된 체적을 벗어난 대조군 웰 영역의 경우(레이저 조사하지 않았으나, 동일 시약에 노출시킴), 대부분의 세포들은 GFP를 발현하였다. 규정된 체적내 모든 세포(대략 30개)에서 GFP 발현이 현저하게 감소되었다. 이러한 결과는 규정된 체적내 세포가 성공적으로 투과화되어 DNA가 적재됨으로써, GFP 유전자의 무발현을 유발하였음을 보인 것이다.
실시예 2: 세포에 siRNA 적재
본 실시예에서, SU-DHL-6 세포에서의 bcl-2/IgH 유전자의 무발현은 세포 성장 억제를 유발하는 siRNA를 옵토인젝션하여 수행하였으며(도 10), 이는 세포 기능에 영향을 미치는 기능적 siRNA의 전달을 명확하게 입증한다. 세포는 RPMI 1640 및 10% FBS가 있는 384웰 플레이트에서 웰당 500개 세포 비율로 배양하였다. bcl-2를 코딩하는 siRNA를 1% HSA와 함께 PBS에 10 nM의 농도로 첨가하였다. 본 실시예에서, 규정된 체적은 상기 웰의 전체 영역(약 0.03 cm2)으로 구성되며, SU-DHL-6 세포는 고체 표면에 부착되어 자라지 않기 때문에 유효 거리는 약 10-20 ㎛이다. 직경 25 ㎛의 빔으로 532 nm 광을 5 ㎛ 공간의 격자 패턴으로 펄스당 10 μJ 및 0.5 ㎲의 펄스 폭로 발사하여 세포를 옵토인젝션하였다((견본에서 규정된 체적에 대해 50% 전이율을 고려하여, 펄스당 0.001 μJ/㎛2 에너지 세기 및 2 x 109 W/cm2의 최고 출력 강도를 형성함). 본 실시예에서, 펄스를 초당 1,200 비율로 발사 및 조정하여, 약 4 초간 규정된 체적에 조사되도록 하였다. 옵토인젝션 후 즉시 세포를 세척하고, 성장 배지를 첨가한 다음 배양하였다. 24시간 후, 세포 생존율은 50% 보다 높았다. 세포는 2, 4, 6, 8 및 10일에 세포 수를 측정하면서 총 10일간 배양하였다. 유용한 세포 투과화, 적재 및 유전자 무발현 뿐만 아니라, 상기 데이타는 siRNA 또는 부적절한 표적(즉, GFP)에 대한 siRNA를 함께 옵토인젠션 이후에 정상적인 세포 성장을 나타낸다.
이러한 세포 형질감염법은 매우 간단하고, 신속하며, 긍정적이며(>90% 생존율, 세포 성장율 무변화), 다양한 물질(예, 플라스미드, 올리고뉴클레오티드, 소형 유기 분자, 이온 등)에 적용된다.
실시예 3: 세포에 아연 적재
세포외 매질로부터 이온이 세포내로 적재될 수 있는지를 입증하기 위해, 세포내 함량이 매우 낮은 Zn2+를 옵토인젝션에 사용하였다. NIH-3T3 세포를 먼저 완충액으로 PBS를 [Zn2+]o = 1 mM를 이용하여 Zn2+-민감성 지시제(RhodZin-1; Molecular Probes, Inc. Eugene, OR)로 염색하였다. 도 11에서, 규정된 영역의 주변(약 0.001 cm2)이 명확하게 표시된다. 상기 세포들은 고체 표면에 부착되어 자라므로, 유효 거리는 수 마이크로미터에 불과하였다. 523 nm 파장의 2 μJ/펄스 및 10 ㎱ 펄스 폭의 펄스형 레이저 빔을 지름 30 ㎛ 아래로 초점을 맞추었고(견본에서 규정된 체적에 대해 50% 전이율을 고려하여, 펄스당 0.001 μJ/㎛2 에너지 세기 및 1 x 107 W/cm2의 최고 동력 강도를 형성), 펄스를 발사하여 미리 결정된 격자 패턴내 인접 발사간의 거리가 x- 및 y- 방향으로 50 ㎛가 되도록 연속 조정하였다. 도 11은 590 nm에서 방사, 530 nm에서 여기된 형광 이미지이다. 패널 A는 바닥 [Zn2+]I이 약 0인 세포가 매우 낮은 형광 밀도를 가짐을 보인다. 패널 B는 옵토인젝션 이후에, 규정된 체적내 세포(즉, 좌측 아래 코너)는 [Zn2+]I의 증가로 인해 RhodZin-1 형광 밀도 증가를 보인다. 세포 생존율은 이러한 조건하에서 >90%인 것으로 결정되었다. 이러한 사실은, 고농도의 [Zn2+]o 존재하에, 규정된 체적내 세포에 대한 레이저 조사가 [Zn2+]I의 증가를 초래함으로 나타낸다. 또한, 이러한 실험은 세포질로의 이온 유입은 세포내 저장된 것으로부터가 아닌 외부 매질에서 유래된 것임으로 나타낸다.
본 발명의 측면은 본원에서 예시한 특정 실시예에 의해 설명되지만 본 발명이 상기한 사항으로 한정되진 않는다.
인용 문헌
모든 문헌들은 원용에 의해 그 전체로서 본 발명에 포함된다.
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Claims (44)

  1. 하나 이상의 세포를 일시적으로 투과화하는 방법에 있어서, 상기 방법은
    a) 하나 이상의 세포를 고체 표면으로부터 유효 거리내에서 실질적으로 고정된 위치에 유지시키는 단계; 및
    b) 상기 하나 이상의 세포에 대한 특정한(specific) 3차원 위치에 대한 사전 정보없이 상기 하나 이상의 세포의 막에 일시적인 투과화(permeabilization)를 유도하기에 충분한 전자기 방사선을 상기 고체 표면에 인가하는 단계를 포함하며, 상기 하나 이상의 세포는 상기 전자기 방사선의 경로에 위치하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 전자기 방사선은 상기 고체 표면에 대해 최대 약 0.001, 0.002, 0.003, 0.006, 0.01, 0.02, 0.03, 0.06, 0.1, 0.2, 0.3, 0.6, 1, 2, 3, 4, 5 및 6 μJ/㎛2로 이루어진 군으로부터 선택된 에너지 세기를 가지는 것을 특징으로 하는, 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 전자기 방사선은 상기 고체 표면에 대해 약 0.001 내지 약 0.3 μJ/㎛2의 에너지 세기를 가지는 것을 특징으로 하는, 방법.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 유효 거리는 약 1000 ㎛ 미만, 600 ㎛ 미만, 300 ㎛ 미만, 200 ㎛ 미만, 100 ㎛ 미만, 60 ㎛ 미만, 30 ㎛ 미만, 20 ㎛ 미만, 10 ㎛ 미만, 6 ㎛ 미만, 3 ㎛ 미만, 2 ㎛ 미만 및 1 ㎛ 미만으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 유효 거리는 약 1 ㎛ 내지 약 20 ㎛인 것을 특징으로 하는, 방법.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 전자기 방사선은 최대 1000 초대, 100 초대, 10 초대, 1초대, 100 밀리초대, 10 밀리초대, 1 밀리초대, 100 마이크로초대, 10 마이크로초대, 1 마이크로초대, 100 나노초대, 10 나노초대, 1 나노초대, 100 피코초(picosencond)대, 10 피코초대, 1 피코초대, 100 펨토초(femtosecond)대, 10 펨토초대, 1 펨토초대, 100 아토초(attosecond)대, 10 아토초대 및 1 아토초대로 이루어진 군으로부터 선택된 시간동안 상기 하나 이상의 세포에 인가되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  7. 제 1항에 있어서, 상기 하나 이상의 세포는 약 100 피코초 내지 약 10 초의 시간동안 상기 전자기 방사선에 노출되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  8. 제 1항에 있어서, 상기 인가 단계는 상기 고체 표면에 방사선 펄스를 전달하 는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  9. 제 1항에 있어서, 상기 인가 단계는 경로 패턴에 따라 방사선 빔을 고체 표면에 통과시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  10. 제 1항에 있어서, 상기 하나 이상의 세포의 막에, 초(second) 당 적어도 10, 30, 100, 300, 1000, 3000, 10,000, 30,000, 100,000, 300,000, 1,000,000, 3,000,000, 10,000,000, 30,000,000, 100,000,000 및 240,000,000 세포수의 비율로 이루어진 군으로부터 선택된 비율로 일시적인 투과화를 유도하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  11. 제 1항에 있어서, 상기 하나 이상의 세포의 막에, 약 300 내지 10,000,000 세포수/초의 비율로 일시적인 투과화를 유도하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  12. 제 1항에 있어서, 상기 하나 이상의 세포의 생존 가능성이 하나 이상의 세포의 막의 일시적인 투과화 이후에도 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%로 이루어진 군으로부터 선택된 수치로 유지되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  13. 제 1항에 있어서, 상기 하나 이상의 세포의 생존 가능성이 일시적인 투과화 이후에 적어도 50% 내지 적어도 90%의 수치로 유지되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  14. 제 1항에 있어서, 상기 하나 이상의 세포를 비등장성 수성 매질(non-isotonic aqueous medium)과 접촉시키는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  15. 제 1항에 있어서, 상기 하나 이상의 세포내의 물질이 일시적으로 투과화된 막을 통해 상기 하나 이상의 세포로부터 배출될 수 있도록, 상기 하나 이상의 세포를 상기 물질이 결핍되어있거나 또는 상기 하나 이상의 세포내 농도보다 낮은 농도로 물질을 포함하고 있는 수성 매질과 접촉시키는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  16. 제 15항에 있어서, 상기 물질은 이온, 유기 분자, 무기 분자, 콜로이달 입자, 다당류, 펩티드, 단백질, 핵산 및 변형 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  17. 제 1항에 있어서, 상기 수성 매질내 물질이 일시적으로 투과화된 막을 통해 하나 이상의 세포로 들어갈 수 있도록 상기 하나 이상의 세포를 수성 매질과 접촉시키는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  18. 제 17항에 있어서, 상기 물질은 이온, 유기 분자, 무기 분자, 콜로이달 입자, 다당류, 펩티드, 단백질, 핵산 및 변형 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  19. 제 17항에 있어서, 상기 일시적으로 투과화된 막은 최대 약 0.3 밀리초, 1 밀리초, 3 밀리초, 10 밀리초, 30 밀리초, 100 밀리초, 300 밀리초, 1 초, 3 초, 10초, 30 초, 1 분, 2 분, 3 분, 6 분, 10 분, 20 분 및 30 분으로 이루어진 군으로부터 선택된 시간이내에 실질적으로 비투과화된 상태로 회복되는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  20. 제 17항에 있어서, 상기 일시적으로 투과화된 막은 약 1 초 내지 약 1 분의 시간내에 실질적으로 비투과화된 상태로 회복되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  21. 제 1항에 있어서, 상기 전자기 방사선은 상기 고체 표면의 영역에 적어도 약 0.0001, 0.0003, 0.001, 0.003, 0.01, 0.03, 0.1, 0.3, 1, 3, 10, 30, 100, 200, 300 및 400 cm2/초로 이루어진 군으로부터 선택된 비율로 인가되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  22. 제 1항에 있어서, 상기 전자기 방사선은 약 0.0003 내지 약 10 cm2/초의 비율로 상기 고체 표면의 영역에 인가되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  23. 제 1항에 있어서, 상기 인가 단계는 적어도 1, 10, 100, 103, 104, 105, 106, 107, 108 및 109 Hz로 이루어진 군으로부터 선택된 비율로 상기 고체 표면에 2회 이상의 방사선 펄스를 전달하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  24. 제 1항에 있어서, 상기 인가 단계는 약 102 내지 약 104 Hz의 비율로 상기 고체 표면에 2회 이상의 방사선 펄스를 전달하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  25. 제 1항에 있어서, 상기 전자기 방사선은 연속파형 레이저, 펄스형 레이저, 연속 램프 및 섬광등으로 이루어진 군으로부터 선택된 에너지 원으로부터 기원하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  26. 제 1항에 있어서, 상기 인가 단계는 펄스 표적 패턴(pulse target pattern)에 따라 상기 고체 표면에 2회 이상의 전자기 방사선 펄스들을 전달하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  27. 제 26항에 있어서, 상기 전자기 방사선의 펄스들의 각각의 펄스는 최대 1000 초대, 100 초대, 10 초대, 1 초대, 100 밀리초대, 10 밀리초대, 1 밀리초대, 100 마이크로초대, 10 마이크로초대, 1 마이크로초대, 100 나노초대, 10 나노초대, 1 나노초대, 100 피코초대, 10 피코초대, 1 피코초대, 100 펨토초대, 10 펨토초대, 1 펨토초대, 100 아토초대, 10 아토초대 및 1 아토초대로 이루어진 군으로부터 선택된 지속시간을 가지는 것을 특징으로 하는, 방법.
  28. 제 26항에 있어서, 상기 전자기 방사선의 펄스들의 각각의 펄스는 약 100 피코초 내지 약 10 초의 지속시간을 가지는 것을 특징으로 하는, 방법.
  29. 제 26항에 있어서, 전자기 방사선의 적어도 2회 이상의 펄스는 상기 펄스 표적 패턴내에서 단일 펄스 표적에 인가되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  30. 제 1항에 있어서, 상기 전자기 방사선은 상기 고체 표면상의 규정된 영역에 인가되며, 상기 규정된 영역은 적어도 0.0001, 0.0003, 0.001, 0.003, 0.01, 0.03, 0.1, 0.3, 1, 3, 10, 30, 100, 200, 300 및 400 cm2로 이루어진 군으로부터 선택된 면적을 가지는 것을 특징으로 하는, 방법.
  31. 제 1항에 있어서, 상기 전자기 방사선은 상기 고체 표면상의 규정된 영역에 인가되며, 상기 규정된 영역은 약 0.0001 내지 약 10 cm2의 면적을 가지는 것을 특징으로 하는, 방법.
  32. 제 1항에 있어서, 상기 전자기 방사선은 상기 규정된 영역의 실질적으로 전체에 동시에 인가되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  33. 제 1항에 있어서, 상기 전자기 방사선의 경로는 적어도 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 300, 1 x 103, 2 x 103, 3 x 103, 4 x 103, 5 x 103, 6 x 103, 7 x 103, 8 x 103, 9 x 103 및 1 x 104 ㎛로 이루어진 군으로부터 선택된 폭을 가지는 것을 특징으로 하는, 방법.
  34. 제 1항에 있어서, 상기 전자기 방사선의 경로는 약 10 ㎛ 내지 약 1000 ㎛의 폭을 가지는 것을 특징으로 하는, 방법.
  35. 세포를 일시적으로 투과화시키는 장치에 있어서, 상기 장치는
    a) 세포가 규정된 체적내에 실질적으로 고정되어 위치하며, 상기 규정된 체적내에서의 상기 세포의 특정한 좌표는 미지(unkwon)이며, 상기 규정된 체적은 고체 표면에 의해 부분적으로 제한된 것을 특징으로 하는, 상기 세포의 막에 일시적 인 투과화를 유도하기에 충분한 전자기 방사선을 방사하는 에너지원;
    b) 상기 세포는 상기 전자기 방사선의 경로에 있으며, 상기 규정된 체적내의 상기 전자기 방사선은 고체 표면에 대해 최대 약 6 μJ/㎛2의 에너지 세기를 가지는 것을 특징으로 하는, 상기 전자기 방사선을 상기 규정된 체적의 실질적으로 전체에 인가하기 위한 인가 장치; 및
    c) 상기 고체 표면을 포함하는, 세포를 일시적으로 투과화시키는 장치.
  36. 제 35항에 있어서, 상기 규정된 체적내의 상기 전자기 방사선은 상기 고체 표면에 대해 최대 약 0.001, 0.002, 0.003, 0.006, 0.01, 0.02, 0.03, 0.06, 0.1, 0.2, 0.3, 0.6, 1, 2, 3, 4 및 5 μJ/㎛2로 이루어진 군으로부터 선택된 에너지 세기를 가지는 것을 특징으로 하는, 세포를 일시적으로 투과화시키는 장치.
  37. 제 35항에 있어서, 상기 규정된 체적내의 상기 전자기 방사선은 상기 고체 표면에 대해 약 0.001 내지 약 0.3 μJ/㎛2의 에너지 세기를 가지는 것을 특징으로 하는, 세포를 일시적으로 투과화시키는 장치.
  38. 제 35항에 있어서, 상기 인가 장치는 펄스 표적 패턴에 따라 상기 규정된 체적에 전자기 방사선 펄스를 인가하는 것을 특징으로 하는, 세포를 일시적으로 투과화시키는 장치.
  39. 제 37항에 있어서, 상기 전자기 방사선의 펄스들의 각각의 펄스는 최대 1000 초대, 100 초대, 10 초대, 1 초대, 100 밀리초대, 10 밀리초대, 1 밀리초대, 100 마이크로초대, 10 마이크로초대, 1 마이크로초대, 100 나노초대, 10 나노초대, 1 나노초대, 100 피코초대, 10 피코초대, 1 피코초대, 100 펨토초대, 10 펨토초대, 1 펨토초대, 100 아토초대, 10 아토초대 및 1 아토초대로 이루어진 군으로부터 선택된 지속시간을 가지는 것을 특징으로 하는, 세포를 일시적으로 투과화시키는 장치.
  40. 제 37항에 있어서, 상기 전자기 방사선의 펄스들의 각각의 펄스는 약 100 피코초 내지 약 10 초의 지속시간을 가지는 것을 특징으로 하는, 세포를 일시적으로 투과화시키는 장치.
  41. 제 37항에 있어서, 상기 전자기 방사선의 적어도 2회 이상의 펄스들이 상기 펄스 표적 패턴내에서 단일 펄스 표적에 인가되는 것을 특징으로 하는, 세포를 일시적으로 투과화시키는 장치.
  42. 제 35항에 있어서, 상기 전자기 방사선의 경로는 적어도 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 300, 1 x 103, 2 x 103, 3 x 103, 4 x 103, 5 x 103, 6 x 103, 7 x 103, 8 x 103, 9 x 103 및 1 x 104 ㎛로 이루어 진 군으로부터 선택된 폭을 가지는 것을 특징으로 하는, 세포를 일시적으로 투과화시키는 장치.
  43. 제 1항에 있어서, 상기 전자기 방사선의 경로는 약 10 ㎛ 내지 약 1000 ㎛의 폭을 가지는 것을 특징으로 하는, 세포를 일시적으로 투과화시키는 장치.
  44. 지시 사항(instructions) 셋트를 포함하는 메모리를 가진 시스템에 있어서, 실질적으로 고정된 세포의 막에 일시적인 투과화를 유도하기에 충분한 전자기 방사선을, 상기 세포에 대한 특정한 3차원 위치에 대한 사전 정보없이 고체 표면에 인가하는 단계를 포함하는 기능을 컴퓨터로 하여금 수행하도록 하며, 상기 세포는 상기 전자기 방사선의 경로에 있는 것을 특징으로 하는 시스템.
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