ES2433669T3 - Métodos para fototransfectar ácido nucleico en células vivas - Google Patents

Abstract

Metodo in vitro de transferencia de un fenotipo multigenico a una celula, comprendiendo dicho metodoirradiar dicha celula con un laser, en el que se baña dicha celula en un medio fluido que comprende dos omas acidos nucleicos aislados diferentes que tienen dos o mas secuencias de nucleótidos diferentes, en elque al menos un acido nucleico aislado es ARNm, en el que dicho laser crea un poro en una membranacelular de dicha celula y dichos acidos nucleicos entran en dicha celula, y en el que dicho ARNm se expresapor dicha celula, transfiriendo asi un fenotipo multigenico a una celula.

Description

Métodos para fototransfectar ácido nucleico en células vivas

Antecedentes de la invención

Una grave desventaja de las estrategias de terapia génic:a actuales y los métodos convencionales de introducción de macromoléculas, particularmente ácidos nucleicos, en c:élulas es la incapacidad de las combinaciones de vector y sistema de suministro para suministrar eficazmente ác:idos nucleicos al interior de las células de una población seleccionada como diana. Los métodos para introducir macromoléculas, particularmente ácido nucleico, en una célula individual o un grupo de células son diversos. Los métodos usados comúnmente incluyen tratamientos químicos, transfección mediada por liposoma, microiroyección, electroporación y bombardeo de partículas. Sin embargo, estas técnicas pueden requerir mucho tiemp;o y presentan bajos rendimientos o escasa supervivencia celular, y no todos los tipos de células pueden tratarse rnediante estos métodos de introducción de macromoléculas en una célula.

Se conocen muchas composiciones y métodos para suministrar un ácido nucleico a un tejido o célula de animal. Tales composiciones incluyen ácidos nucleicos "desnudos" (es decir no complejados), ácidos nucleicos complejados con moléculas catiónicas tales como polilisina o lipides que forman liposomas, y vectores de virus. Los ácidos nucleicos desnudos pueden captarse por diversas células de animales, pero se someten a nucleolisis, tanto dentro como fuera de las células que los captan. Para superar la nucleolisis se usan análogos de ácido nucleico que son relativamente resistentes a la nucleolisis, incluyendo an{llogos de ácido nucleico fosforotioato. Sin embargo, cuando se desea la incorporación del ácido nucleico en el genoma de la célula diana, el uso de análogos de ácido nucleico es de uso limitado.

También se han descrito numerosos vectores que comprenden un acido nucleico complejado con un compuesto para mejorar la estabilidad o la caplación del ácido nucleico por una célula diana. Tales compuestos incluyen, por ejemplo, fosfato de calcio, policationes tales como di,etilaminoetildexlrano, polilisina o Polybrene, y lipidos que forman liposomas tales como bromuro de didocilmetilslmonio y Lipofectamine®. Sin embargo, las transfecciones tradicionales con un vector de ADN complejado con otra composición limitan gravemente la capacidad para controlar la cantidad de transcripción de ARNm o expresión dE! protelna, dando como resultado niveles no naturales de expresión de proteína que no pueden controlarse de otro modo.

Los vectores de virus se consideran generalmente los vectores de ácido nucleico más eficaces. Con frecuencia se usan vectores de virus defectuosos para la replicación, recombinantes, para Iransducir (es decir, infectar) células de animales. Tales vectores han incluido vectores de retrovirus, adenovirus, virus adenoasociados y vectores de herpesvirus. Aunque .son altamente eficaces para la transferencia génica, una desventaja principal asociada con el uso de vectores de virus es la incapacidad de muchosveclores de virus para infectar a células que no se dividen, limitando los tipos de célula que pueden lransfeclarse. Además, si no se desea la integración de un ácido nucleico en el genoma, no se recomiendan determinados virus, tales como veclores de relrovirus. Además, con frecuencia hay un limite de tamaño para la longitud del gen o AONc que puede introducirse en un vector. Además, los vectores génicos de virus no permiten una regulación apropiada de la expresión génica a lo largo del tiempo en células transfectadas.

El documento WO 20051044367 da a conocer un mét()do de introducción y liberación de suslancias, lales como ácidos nucleicos, dentro y fuera de células usando un láser. El documento WO 20051044367 no menciona la transfecdón de ARNm y, además, no propone un método para transferir un fenotipo multigénico que comprenda la introducción de dos o más tipos diferentes de ácidos nucleicos.

A pesar del desarrollo y la refinación de las técnicas comentadas anteriormente, sigue existiendo una necesidad en la técnica de métodos y composiciones que puedan USé:lrse para potenciar el suministro de un ácido nucleico a una célula deseada que va a transfectarse con el ácido nuclleico. Además, las técnicas comentadas anleriormente están limitadas a suministrar uno o tan sólo unos pocos ácidos nucleicos para estudiar la expresión de estos números limitados de ácidos nucleicos sobre un fenotipo celular. La presente invención proporciona un mélodo novedoso de transferencia de un fenotipo multigénico a una célula.

Breve sumario de la invención

La presente invención se refiere a los siguientes puntos:

1.

Un método in vitro de transferencia de un fenotipo multigénico a una célula , comprendiendo dicho método irradiar dicha célula con un láser, en el que se baña dicha célula en un medio fluido que comprende dos o más ácidos nuc!eicos aislados diferenles que lienen dos o más secuencias de nucleótidos diferentes, en el que al menos un ácido nucleico aislado es ARNm, en el que dicho lésel' crea un poro en una membrana celular de dicha célula y dichos ácidos nucleicos entran en dicha célula, y en el que dicho ARNm se expresa por dicha célula, transfiriendo asl un fenotipo multigénico a una célula.

2.

El método del punlo 1, en el que dichos ácidos nucleic:os aislados comprenden al menos un ARN seleccionado del

grupo que consiste en ARNip, miARN, ARNnh, ARNt y combinaciones de los mismos.

3.

El método del punto 1, en el que dicha célula se selecciona del grupo que consisle en una célula eucariota y una célula procariota.

4.

El método del punto 3, en el que dicha célula eucariot~1 no es una célula de mamífero.

5.

El método del punto 1, en el que dicha célula es una oélula vegetal.

6.

El método del punto 1, en el que dicha célula es un protozoo.

7.

El método del punto 1, en el que dichos ácidos nucleicos se aislan a partir de una célula.

8.

El método del punto 1, en el que dichos ácidos nuclei,CQs aislados se preparan mediante un método seleccionado del grupo que consiste en aislamiento de ARNm a partir de una célula, transcripción in vitro o síntesis química.

9.

El método del punto 1, en el que dichos ácidos nucleicos codifican para dos o más polipéptidos diferentes.

10.

El método del punto 1, en el que dichos ácidos nucleicos aislados comprenden una combinación de ARN y ADN.

11.

El método det punto 1, en el que dichos ácidos nucleicos aislados comprenden una mezcla de ARN diferentes que codifican para dos o más polipéptidos diferentes, Em el que la abundancia relativa de cada ARN diferente es esencialmente la misma que la abundancia relativa de cada ARN diferente en una segunda célula que está en un estado fisiológico diferente del de la célula irradiada.

12.

El método del punto 9, en el que dichos ácidos nucleicos aislados comprenden además un ácido nucleico inhibidor.

13.

El método del punto 1, en el que dicho láser es un láser de titanio-zafiro.

14.

El método del punto 1, en el que dicho medio fluido es un liquido.

15.

El método del punto 1, en el que dicha célula se baria con dicho medio fluido que comprende dos o más ácidos nucleicos aislados en una ubicación diferenciada sobre la superficie de la célula.

16.

El método del punto 1, en el que la célula comprende: una dendrita.

17.

El método del punto 14, en el que dicho láser es un lé~ser de titanio-zafiro.

18.

El método del punto 14, en el que dicho medio fluido es un liquido.

19.

El método del punto 14, en et que dicha célula es uné! célula individual.

Todavla en otra realización, los ácidos nucleicos aislados se seleccionan del grupo que consiste en ARN, ADN Y combinaciones de los mismos. En otra realización, el ARN se selecciona del grupo que consiste en ARNm, ARNip, miARN, ARNnh, ARNt y

combinaciones de los mismos. Aún en otra realización, los ácidos nucleicos aislados comprenden una mezcla de ARN diferentes que codifican para dos o más polipéptidos diferentes, en la que la abundancia relativa de cada ARN diferente es esencialmente la

misma que la abundancia relativa de cada ARN diferen'le en una segunda célula que está en un estado fisiológico diferente del de la célula irradiada. En otra realización, los ácidos nucleicos aislados compre'nden además un ácido nucleico inhibidor. En una realización, el láser es un láser de titanio-zafiro. Todavla en otra realización, el medio fluido es un liquido. Todavia en otra realización, la célula se baria con el medio fluido que comprende dos o más acidos nucleicos

aislados en una ubicación diferenciada sobre la superfici,g de la célula. La presente invención también abarca un método de transfección local de una célula, comprendiendo el método irradiar la célula con un láser, en el que la célula está en un medio fluido que comprende un ácido nucleico, en el que

el laser crea un poro en la membrana celular de la célula y el acido nucleico entra en la célula, transfectando as! localmente la célula. En una realización, la célula comprende una prolongación celular. En otra realización , la prolongación celular es una dendrita.

En una realización, ell;~ser es un láser de titanio-zafiro.

Aún en otra realización, el medio fluido es un liquido.

Todavía en otra realización , el ácido nucleico es un ARN.

En otra realización, el ARN se selecciona del grupo que consiste en ARNm, ARNip, miARN, ARNnh, ARNt y combinaciones de los mismos.

En una realización, la célula es una célula individual.

la presente invención también incluye un kit para transl'erir un fenotipo multigénico a una célula, comprendiendo el kit una mezcla de ARNm aislado a partir de una célula, en el que la mezcla de ARNm comprende uno o más ARNm aislados que codifican para dos o más polipéptidos, y un material de instrucciones para el uso del mismo.

También se proporciona un kit para transferir un fenotipo multigénico a una célula, comprendiendo el kit una mezcla de ácidos nucleicos, en el que la mezcla es un ácido nucleico convertidor del fenotipo y un material de instrucciones para el uso del mismo.

Breve descripción de los dibujos

Con los fines de ilustrar la invención, se representan en los dibujos determinadas realizaciones de la invención. Sin embargo, la invención no se limita a las disposiciones y a los instrumentos precisos de las realizaciones representadas en los dibujas.

l as figuras 1A y 18 son imágenes esquemáticas de un láser que induce un pequeño orificio transitorio en una membrana celular de una neurona a través del cual sel introduce ácido nucleico en la célula y se traduce en una proteína. las imágenes representan realizaciones no limitativas en las que el ácido nucleico es ARNm, la figura 1 A representa la neurona receptora banada en una disolución que comprende ARNm. la figura 1 8 representa la célula receptora bafiada en una ubicación diferenciada (zona con puntos negros) sobre su superficie con una disolución que contiene ARNm , la célula se somete a fotopora ción con un láser dentro de los puntos diferenciados. la expresión de ARNm se indica en ambas figuras medianti~ una zona de color negro sólido.

la figura 2 es un cronograma a modo de ejemplo para una realización de la invención. El cronograma representa el tratamiento de células receptoras (por ejemplo, neuroni:¡s) antes, durante y después de la fototransfección con un ARNm obtenido a partir de células donantes (por ejEtmplo, células de la glla). También se muestran posibles ensayos para evaluar el efecto de la expresión de ARNrn de la glla en lales neuronas fototransfectadas.

las figuras 3A a 3D son imágenes de una neurona de hipocampo de rata representativa antes y 2 semanas después de la fototransfección . la figura 3A representa una neurona con extensas prolongaciones neuronales antes de la fototransfecciÓn. El soma se indica mediante la flecha. l.as figuras 38-3D son imágenes de una neurona 2 semanas después de la fototransfección con ARNm de aslrodtos de rata. la figura 38 es una imagen de contrasle de interferencia diferencial (DIC) que representa la relracdón de prolongaciones neuronales en la célula sometida a fototransfección. El soma se indica mediante la flecha. la figura 3C es una imagen de la célula sometida a fototransfección en la figura 38 ter'lida con DAPI , que indica la ubicación del núcleo celular. El núcleo se indica mediante la flecha, la figura 3D es una imagen que repr,esenta la inmunorreactividad de la proteína ácida fibrilar gUal (GFAP) de la neurona sometida a fototransfección en la figura 38. El soma se indica mediante la flecha. Se detectó GFAP en células fijadas mediante incubación con anticuerpo de ratón anti-GFAP y después con anticuerpo de cabra anti-ratón conjugado con Cy3 para detectar GFAP.

las figuras 4A y 48 son imágenes de una neurona de hipocampo de rata representativa antes y 3 semanas después de la fototransfección, la figura 4A representa una neurona de hipocampo de rata antes de la fototransfección. la figura 48 representa la misma neurona 3 semanas después de la fototransfección con ARNm de astrocitos de rata. la imagen representa la inmunorreactividad de GFAP de la célula sometida a fototra nsfección, ubicada dentro del recuadro en lineas discontinuas. Se incubaron células fijadas con anticuerpo de ratón anti-GFAP y después con anticuerpo de cabra antí-ratón conjugado con Alexa 546-·fluoresceína para detectar GFAP.

las figuras 5A y 58 son imágenes de dos neuronas de hipocampo de rata sometidas a fototransfefcción representativas 8 semanas después de la fototransfección con ARNm de astrocitos de rata , la figura 5A es una imagen de DIC de las dos células (indicadas mediante 'flechas), que representa la retracción de las prolongaciones neuronales. La figura 58 representa la inmunorreaciividad de GFAP de las mismas dos células sometidas a fototransfección (indicadas mediante flechas). Se incubaron células fijadas con anticuerpo de ratón anti-GFAP y después con anticuerpo de cabra anti-ratón conjugado con Alexa 546-fluorescelna.

las figuras 6A a 6E son una serie de imágenes de microscopía confocal representativas de células neuronales y un gráfico de datos de imágenes de calcio para dos de las células. Se captaron imágenes cada 3 segundOS. la figura 6A representa dos células (rodeadas con cIrculas en I1neas discontinuas blancas y marcadas como Célula 1 y Célula 2), cargadas con un indicador de calcio. Esta imagen es repl'"esentativa de la señal de nivel inicial para cada célula .

S

La figura 68 muestra la respuesta de las mismas dos células a la estimulación con glutamato (100 ¡.tM). La figura 6e representa respuesta de las mismas dos células a la estimulación con potasio (50 mM). La figura 60 representa la recuperación celular de la señal de nivel inicial después de haber eliminado el potasio mediante lavado de las células. La figura 6E es un gráfico de los datos de imágenes de señalización de calcio. Se mide la señalización como el cambio en la fluorescencia fraccional (óFlFo) en función del tiempo.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a un método de transferencia de un fenotipo multigénico a una célula, comprendiendo dicho mélodo irradiar dicha célula con un láser, en el que se baña dicha célula en un medio fluido que comprende dos o más ácidos nucleicos aislados diferentes que tienen dos o más secuencias de nucle6tidos diferentes, en el que al menos un ácido nucleico aislsldo es ARNm, en el que dicho láser crea un poro en una membrana celular de dicha célula y dichos ácidos nucleicos entran en dicha célula, y en el que dicho ARNm se expresa por dicha célula, transfiriendo asl un fenotipo multigénico a una célula.

A diferencia de los sistemas de expreSión conocidos en la técnica, en los que se expresa uno o sólo unos pocos ácidos nucleicos, los métodos de la presente invención permiten la expresión de multiples ácidos nucleicos de manera esencialmente simultánea, dando como resultado un sistema de expresión que imita estrechamente la interacción de diversos ácidos nucleicos y sus productos de expresión en un entorno natural. Por tanto, la presente invención permite la introducción de una mezcla compleja de ácidos nucleicos en una célula para producir un efecto multigénico, iluminando asr el fenotipo de una célula, tejido o animal en el que diversos ácidos nucleicos y las protelnas expresadas a partir de los mismos interaccioOéIO, compiten y producen de otro modo un fenotipo.

Los métodos de la presente invención se logran transfeclando ácidos nucleicos en células vivas. EspeCificamente, la presente invención incluye métodos para inducir un efecto multigénico en una célula usando una creación de poros asistida por láser de membranas de células vivas acoplada con una aplicación en baño de ARNm con el fin de transfectar una mezcla de ácidos nucleicos en una célula viva. Además, el presente método no sólo permite una transfección de una célula allamente especIfica de la ubicación, sino que además no es perjudicial para la viabilidad

o la función celular.

La presente invención permite la Iransfección de dos o roás ácidos nUcleicos, en los que al menos un ácido nucleico es ARNm, en una célula con un control preciso de la cantidad de ácidos nucleicos que entran en la célula, permitiendo por tanto al experto en la técnica imitar el nivel de expresión de ácido nucleico en una célula en condiciones deseadas, tal como se da a conocer en otra parte en el presente documento. Es decir, la presente invención permite al experto en la técnica controlar ce.n precisión el nivel de ácido nucleico transfectado en una célula modulando la concentración de ácido nucleico en el entorno extracelular de la célula. Además, puede modularse la cantidad precisa de ácido nucleico transfectado en una célula mediante la regulación de la intensidad del láser, el tamaño y el numero de poros, y la duración de la apertura de membrana.

Los métodos de la presente invención no se limitan a células, sino que pueden incluir además cortes vivos de tejido y animales vivos, preferiblemente mamlferos, tal como se da a conocer en otra parte en el presente documento. Los métodos de la presente invención pueden comprende·r además otras células que no son de mamifero, células eucariotas y células procariotas, tales como células bacterianas, células de levadura, células vegetales, protozoos, células de insectos, células fUngicas, incluyendo hongos filamentosos y no filamentosos, y similares.

Definiciones

Tal como se usan en el presente documento, cada uno de los siguientes términos tiene los significados asociados con el mismo en esta sección.

Los artlculos · un" y ·una" se usan en el presente documnnto para hacer referencia a uno o más de uno (es decir, a al menos uno) del objeto gramatical del articulo. A modo de ejemplo, "un elemento" significa un elemento o más de un elemento.

Tal como se usa en el presente documento, un "fenotipo de destino" se refiere a un fenotipo de interés que se induce en una célula receptora mediante la introducción en la misma de una mezcla de ácidos nucleicos. El fenotipo de interés puede ser cualquier fenotipo. Por ejemplo, un fenotipo de destino puede ser un cambio morfológico, tal como la retracción de prolongaciones neuronales en una célula receptora que es una neurona. Un fenotipo de deslino puede ser un cambio fisiológico, tal como la presencia de canales de calcio dependientes del voltaje en una célula receptora que es una célula de la astroglía. Un fenotipo de destino puede comprender más de un cambio fenotípico y puede incluso provocar que la célula adopte caractmisticas de un tipo de tejido diferente de su tipo de tejido original.

La frase "ácido nucleico convertidor del fenotipo" se refiere en el presente documento él una mezcla de ácidos nucleicos que puede establecer un fenotipo de destino en una célula receptora. Acido nucleico convertidor del fenotipo no se limita al contenido emplrico de ARN en una célula donante, sino que más bien abarca la abundancia relativa de cada ARN con respeclo a cada uno en una población de ARN de tal manera que la población de ARN es necesaria y suficiente para inducir un fenotipo de destine) en una célula receptora.

Una ~enfermedad' es un estado de salud de un animal en el que el animal no puede mantener la horneastasis, y en el que si la enfermedad no se mejora, entonces la salud del animal continúa deteriorándose. En cambio, un Utrastorno' en un animal es un estado de salud en el que el animal puede mantener la homeostasis, pero en el que el estado de salud del animal es menos favorable de lo que seria en ausencia del trastorno. Si no se trata, un trastorno no provoca necesariamente una reducción adicional en ElI estado de salud del animal.

Se usa un "medio fluido' o "medios fluidos" en el preserrte documento para hacer referencia a una forma de materia, tal como aire, liquido, sólido o plasma, preferiblemente líquido, que puede fluir.

Una "célula aislada" se refiere a una célula que se ha separado de otros componentes y/o células que acompai'lan de manera natural a la célula aislada en un tejido o un mamífero.

Según se aplica a una proteína, un "fragmento~ de un p.:llípéptido, proteína o un antígeno, tiene aproximadamente 6 aminoacidos de longitud. Más preferiblemente, el fragmEmto de una proteina tiene aproximadamente 8 aminoacidos, incluso más preferiblemente al menos aproximadamente 10, aún mas preferiblemente al menos aproximadamente 15, incluso más preferiblemente al menos aproximadamente 20, aún más preferiblemente al menos aproximadamente 30, de manera incluso más preferitlle aproximadamente 40, y más preferiblemente al menos aproximadamente 50, más preferiblemente al menos aproximadamente 60, aún más preferiblemente al menos aproximadamente 70, incluso más preferiblemente al m¡¡¡nos aproximadamente 80, y más preferiblemente al menos aproximadamente 100 aminoácidos de longitud, aminoácidos de longitud, y todos y cada uno de los números enteros entre medias.

Un "ADN genómico" es una cadena de ADN que tienE! una secuencia de nucle6tidos homóloga a un gen según existe en el huésped natural. A modo de ejemplo, un fra~lmento de un cromosoma es un ADN genómico.

Tal como se usa en el presente documento, un "ácido nudeico inhibidor" se refiere a un ARNip, un microARN, un ácido nucleico antisentido o una ribozima.

Tal como se usa en el presente documento, "transfectar localmente" un ácido nucleico se refiere a introducir un ácido nucleico en una región de citoplasma Que no es h:l totalidad del citoplasma de una célula, opcionalmente Que comprende una prolongación celular.

Tal como se usa en el presente documento, "crear un poro" o "crea un poro' se refiere a crear un orificio en una superficie a través del cual pueden pasar compuestos.

"Homólogo· tal como se usa en el presente documento, se refiere a la similitud de secuencia de subunidades entre dos moléculas poliméricas, por ejemplo, entre dos moléc;ulas de ácido nUcleico, por ejemplo, dos moléculas de ADN

o dos moléculas de ARN, o entre dos moléculas polipeplídicas. Cuando una posición de subunidad en ambas de las dos moléculas está ocupada por la misma subunidad monomérica, por ejemplo, si una posición en cada una de dos moléculas de ADN esta ocupada por adenina, entonces son homólogas completamente o al 100% en esa posición. La homología en porcentaje entre dos secuencias es una función directa del número de posiCiones coincidentes u homólogas, por ejemplo, si la mitad (por ejemplo, cinco posiciones en un polímero de diez subunidades de longitud) de las posiciones en dos secuencias de compuesto son homólogas entonces las dos secuencias son idénticas al 50%, si el 90% de las posiciones, por ejemplo, 9 de 10, son coincidentes u homólogas, las dos secuencias comparten una homologla del 90%. A modo de ejemplo, las secuencias de ADN 5'ATTGCC3' y 5'TATGGC3' comparten una homologia del 50%.

Además, cuando se usan los términos "homología" o "identidad" en el presente documento para hacer referencia a los ácidos nucleicos y a las protefnas, debe interpretarse que se aplican a la homología o identidad a niveles tanto de ácido nucleico como de secuencia de aminoácidos.

El término "fenotipo multigénico' se usa en el presente documento para hacer referencia a un fenotipo en una célula, tejido o animal Que está mediado por la expresión o ralta de expresión de dos o más ácidos nucleioos que codifican para una proteina, en el que los ácidos nudeicos se proporcionan de manera exógena a la célula, tejido o animal.

"Polinucleótido recombinante" se refiere a un polinucleótido que tiene secuencias que no están unidas entre sí de manera natural. Puede incluirse un polinucleótido recombinante amplificado o ensamblado en un vector adecuado, y puede usarse el vector para transformar una célula huésped adecuada.

Un polinucle6lido recombinante también puede servir pa.ra una función no codificante (por ejemplo, promotor, origen de replicación, sitio de unión a ribosoma, etc.).

Una célula huésped que comprende un polinucleótido recombinante se refiere a una "célula huésped recombinante". Un gen Que se expresa en una célula huésped recombinante, comprendiendo el gen un polinucleótido recombinanle, produce un ·polipéptido recombinante".

Un 'polipéptido recombinante" es uno que se produce con la expresión de un polinucle6tido recombinante.

'Polipéptido' se refiere a un poUmero compuesto por residuos de aminoácido, variantes estructurales que se producen de manera natural relacionadas y analogos sintéticos que no se producen de manera natural de los mismos unidos mediante enlaces peptidicos, variantes estructurales que se producen de manera natural relacionadas y análogos sintéticos que no se produCE:n de manera natural de los mismos. Pueden sintetizarse polipéptidos sintéticos, por ejemplo, usando un sintetizaclor de polipéptido automatizado.

El término ' proterna" se refiere normalmente a polipéptidos grandes.

El término ' péptido" se refiere normalmente a polipéptidos cortos.

En el presente documento se usa la notación convencional para representar secuencias de polipéptido: el extremo izquierdo de una secuencia de polipéptido es el extremo amino-terminal; el extremo derecho de una secuencia de polipéptido es el extremo carboxilo-terminal.

Se usa "fototransfección" en el presente documento para hacer referencia a un procedimiento mediante el cual se crea un orificio en una barrera, tal como una membrana celular, usando una fuente de fotones, tal como un láser, y se insertan dos o más ácidos nucleicos, en el que los ácidos nucleicos codifican para polipéptidos diferentes, en una célula a través del orificio en la membrana celular.

Por polipéptido "etiqueta" quiere decirse cualquier proterna que, cuando se une mediante un enlace peptídico a una proteína de interés, puede usarse para localizar la pfCIteína, para purificarla a partir de un extracto celular, para inmovilizarla para su uso en ensayos de unión O para estudiar de otro modo sus propiedades biológicas y/o su función.

Se entiende que en el presente documento se incluyen todos y cada uno de los numeros enteros completos o parciales entre cualquier intervalo expuesto en el presen'le documento.

Descripción

la presente invención proporciona métodos de introducción de mezclas de ácidos nucleicos en una célula receptora para producir un efecto muHigénico en la célula receptora. La presente invención comprende Iransfectar dos o más ácidos nucleicos, en los que al menos un ácido nucleic:o es ARNm, localmente en una célula receptora. La célula receptora puede ser cualquier tipo de célula. Una célula receptora puede ser una célula eucariota o una célula procariota. Cuando la célula es una célula eucariotu, la célula es preferiblemente una célula de mamifero, incluyendo, pero sin limitarse a, célula de ser humano, primate no humano, ralón, conejo, rata, cabra, cobaya, caballo y similares. Una célula eucariota no de mamífEifO incluye una célula de levadura, una célula vegetal, una célula de insecto, una célula protozoaria y una célula fúngica, incluyendo hongos filamentosos y no filamentosos. Cuando la célula es una célula procariota, la célula es una célula bacteriana. Preferiblemente, la célula receptora es una célula específica de tejido, más preferiblemente una célula especifica de tejido de mamlfero y todavla más preferiblemente, una célula especifica de tejidO de ser humano. los ejemplos no limitativos de células adecuadas como células receptoras incluyen células epiteliElles, neuronas, fibroblastos, fibroblastos embrionarios, queratinocitos, células madre de adulto, células madre embrionarias y cardiomiocitos. En realizaciones de la invención referidas a la conversión de fenotipo, se prefieren células fenotípicamente maleables. Las células fenotrpicamente maleables son células cuyo fenotipo es susceptible de cambiar en las condiciones del método de la invención. Los ejemplos no limitativos de células fenotlpicamente maleables incluyen neuronas, fibroblastos, fibroblastos embrionarios, células madre de adulto y células madre embrionarias. Preferiblemente, la célula es una neurona, y comprende una prolongación celular tal COITlO una dendrita, y el ácido nucleico es ARN, incluso más preferiblemente, ARNm. Incluso más preferiblemente, el ácido nucleico comprende una mezcla compleja de ARNm, incluyendo ARNm que codifican para dos o más protelnEIS diferentes.

Tal como se da a conocer en otra parte en el presente documento, la presente invención comprende un método para transferir un fenotipo multigénico a una célula receptor.EI. El fenotipo mulligénico se transfiere aislando dos o más ácidos nucleicos a partir de una primera célula, y tran:;¡feclando una segunda célula con esos dos o más ácidos nucleicos. En algunas realizaciones, los dos o más ácidos nucleicos codifican para polipéplidos diferentes. En otras realizaciones, los ácidos nucleicos son ARN no codificantes u otros ácidos nucleicos no codificantes. Aún en otras realizaciones, los ácidos nucleicos comprenden una me:zcla de ácidos nucleicos codificantes y no codificantes. Aún en olras realizaciones, ácido nucleico de una primera célula receptora se transfiere posteriormente a una segunda célula receptora. La presente invención puede comprl~nder ademas sintetizar quimicamente dos o más ácidos nucleicos que codifican para polipéplidos diferentes. En otra parte en el presente documento se dan a conocer métodos para sintetizar químicamente un acido nucleico y pueden incluir transcripción in vitro.

La presente invención no se limita a transferir un fenotipo mulligénico con sólo dos ácidos nucleicos que codifican para polipéptidos diferentes. La presente invención puede comprender además transferir un fenotipo mulligénico usando 3 o mas, 5 o mas, 10 o mas, 20 o mas, 40 o mas, 50 o mas, 75 o más, 100 o más, 200 O más, o la totalidad del ARN o ARNm de una célula, tejido o animal en el qUH el ARN o ARNm codifica para pOllpéptldos diferentes.

La presente invención puede comprender además transfectar localmente una célula que comprende una dendrita. Tal como se demuestra en el presente documento, este método permite ventajosamente la introducción de una cantidad deseada de ácido nucleico en uno o más sitios locales, permitiendo la producción controlada y localizada de proteina en cantidades fisiológicas, dando como resultado un efecto mulligénico en una célula. Este método permite por lanto la localización especlflca de ácido nuc:leico aplicado de manera ex6gena, preferiblemente ARNm, sin recurrir a cortar la prolongación celular de la célula a la que está unida (Kacharmina. el al., 2000, Proc. Nal', Acad. Sci. USA. 97:11545-11550). Además, el presen'te método permite la expresión de una mezcla de ácidos nucleicos, dando por lanto como resultado la expresión ele múltiples prolelnas y un fenotipo multigénico en la célula.

la presente invención describe además métodos para fototransfectar un corte vivo de tejido o un animal vivo. En la técnica se conocen métodos para mantener las prolontlaciones celulares en las células que comprenden un corte vivo de tejido. Como ejemplo no limitativo, pueden refrigerarse cortes vivos 'J someterse a perfusión con fluidos naturales o artificiales, tales como liquido cefalorraqulcleo artifICial, liquido del sistema nervioso central artificial 'J tampones dados a conocer en otra parte en el presente documento. Se describen métodos para la manipulación de cultivos de cortes vivos, por ejemplo, en Roelandse, el al. (2004, J. Neuroscience, 24: 7843-7847); 'J Chen, el al. (2005, Magn. Reson. Med. 53: 69-75).

Se realizan métodos para fototransfectar un animal vivo, preferiblemente un mamífero, usando los métodos descritos en el presente documento combinados con métodos de cirugla en animales 'J seres humanos conocidos en la técnica. Los procedimientos quirúrgicos a modo de ejemplo contemplados para su uso con los métodos descritos en el presente documento incluyen cateterización cardiaca, angioplastia, artroscopia, laparoscopia, resección tumoral, implantación quirúrgica de un implante terapéutico y similares. Los mamlferos contemplados incluyen, pero no se limitan a, ratones, conejos, ratas, cabras, cobayas, seres humanos y similares.

Como ejemplo no limitativo, se aplica un láser a un tejido en un animal vivo para fototransfectar el tejido en el animal vivo con uno o más ácidos nucleicos. Se introduce el ácido nucleico en el animal usando métodos dados a conocer en otra parte en el presente documento, tales como a través de un microscopio o una fibra óptica o endoscopia. La expresión de un pOlipéptido fototransfectado usando los métodos descritos en el presente documento se monitoriza usando métodos de detección de la expresión de proteinas conocidos en la técnica, tales como inmunotransferencias de tipo Western, inmunocitoquimica, detección de proteínas in situ y similares. En la técnica se conocen bien métodos para usar un láser para manipulalr tejidos de animales y se describen, por ejemplo, en Dang, el al. (2005, Exp Dermatol., 14: 876-882).

Los métodos dados a conocer en el presente documento comprenden introducir un ácido nucleico, preferiblemente un ARN y más preferiblemente ARNm, ARNip, miARN, ARNnh, ARNt, ARN no codificantes 'J combinaciones de los mismos, incluyendo, pero sin limitarse a, ARN total, en 'una célula que comprende opcionalmente una prolongación celular, preferiblemente una neurona que comprende una dendrita, y fototransfeclar la célula en uno o más sitios en la membrana celular. La célula es preferiblemente un cultivo celular primario o está en cultivo de cortes. La célula que comprende opcionalmente una prolongación celular puede someterse a fototransfección en cualquier sitio. Preferiblemente, el sitio está en una prolongación celular, tal como una dendrita, o el cuerpo celular, tal como el soma. El nucleico puede proporcionarse a la célula que comprende una prolongación celular mediante cualquier método conocido por el experto en la técnica, y se proporciona preferiblemente por medio de un baño de ácido nuc1eico que comprende una mezcla de ácidos nudeioos, dado a conocer en otra parte en el presente documento. Un baño de Bcido nucleico es una disolución que comprende un ácido nucleico de interés en la que se baña una célula. En una realización, la aplicación de baño de la célula comprende rodear la célula con una disolución que comprende ácido nucleico, bal'\ando así toda la célula. Entonces se irradia la célula con un láser en uno o más sitios ubicados en cualquier parte en la célula. Véase la figura 1A. En otra realización, la aplicación de baño comprende bañar una parte o partes diferenciadas de una célula viva, por ejemplo, aplicando una disolución que comprende ácido nucleico a una ubicación diferenciada sobre la superficie de la célula. Entonces se irradia la célula una o más veces dentro de la ubicación o ubicaciones diferenciadas que se bañaron. Véase la figura 1B. El baño en ubicaciones diferenciadas es ventajoso porque crea un mayor gradiente de concentración de ARNm, lo que pennite que los ARNm se difundan más eficazmente a través de los orificios mediante la creación temporal de poros en la célula sometida a creación de poros. También se requieren menos ARNm (por ejemplo, 0,3 j.tg) que para la aplicación de baño (por ejemplo, 20 j.tg). En cualquier caso, la disolución se tampona de manera apropiada y tiene un pH apropiado para mantener la integridad estructural de la célula que va a someterse a fototransfección.

Un ácido nucleico de interés adecuado para su uso en el método de la invención puede ser de cualquier tamaño. Por ejemplo, se han fototransfectado satisfactoriamente un ácido nucleico de aproximadamente 800 nucleótidos y un ácido nucleico de aproximadamente 3000 nucleótidos en células que comprenden una prolongación celular usando el procedimiento de la invención. Sin embargo, los m·étodos de la presente invención no se limitan a un ácido nucleico, preferiblemente un ARN, de los tamaños dados a conocer en el presente documento. la presente invención comprende fototransfeclar un ácido nucleiccl de aproximadamente 30 bases, de manera incluso más preferible aproximadamente 50 bases, de manera aún más preferible aproximadamente 75 bases, de manera incluso más preferible aproximadamente 100 bases, de manera aún más preferible aproximadamente 75 bases, de manera incluso más preferible aproximadamente 100 bases, de manera aún más preferible aproximadamente 150 bases, de manera incluso más preferible aproximadamente 200 bases, de manera aun más preferible aproximadamente 300 bases, de manera incluso más preferible aproximadamente 500 bases, de manera aun más preferible aproximadamente 750 bases, de manera incluso más preferible aproximadamente 1000 bases, de manera aun más preferible aproximadamente 1500 bases, de manera inctuso más preferible aproximadamente 2000 bases, de manera aún más preferible aproximadamente 2500 bases, de manera incluso más preferible aproximadamente 3000 bases, de longitud. Incluso más preferiblemente, lal presente invención comprende transfectar, preferiblemente mediante fototransfección, una mezcla de ARN que codifican para protelnas diferentes y de pesos moleculares diferentes.

La presente invención es útil para transfeclar ácidos nucleicos homogéneos o heterogéneos en una célula. Especlficamente, los métodos dados a conocer en el presente documento pueden usarse para transfectar ARN, AON o ambos en una célula en cantidades fisiológicamente relevantes. Además, la presente invención puede usarse para introducir una mezcla de ARN que codifican para proteinas diferentes, una mezcla de AON que codifican para proteinas diferentes, o una mezcla tanto de ARN como de AON en una célula con el fin de determinar los efectos multigénicos y las interacciones de diversos ácidos nucleicos. Las mezclas también pueden comprender ácidos nucleicos no codificantes.

Como ejemplo no limitativo, puede obtenerse un perfil de expresión de ácido nudeico de una célula en un estado fisiológico deseado (por ejemplo durante la diferenciación, en un estado patotógico, tras tratamiento con un compuesto farmacéutico, toxina u otro compuesto) y un perfil de expresión de ácido nucleico de una cétuta en otro estado fisiológico (por ejemplo el mismo tipo de céluh:l antes o después de la diferenciación, no en un estado patológico, o antes de tratamiento con un compuesto farmacéutico, toxina u otro compuesto) usando técnicas para el aislamiento de ARN conocidas en la témica y dadas a conocer en otra parte en el presente documento. Pueden generarse los clones de AONc de estos ARN, reflejando las abundancias de ARN alteradas de los diferentes estados fisiológicos, o puede transfectarse el ARN en una célula sin realizar en primer lugar la transcripción inversa del ARN para dar AONc. Estos ARN pueden mezclarse según las mismas razones y abundancias indicadas por los perfiles de expresión de ácido nucleico de las células en estados fisiológicos diferentes. Entonces se transfectan estas mezClas de ácidos nucleicos en una célula usando 105 métodos de fototransfección dados a conocer en el presente documento. Los mélodos de la presente invención permiten la transfección local de una célula, y por tanto puede transfectarse localmente la mezcla de ácidos nucleicos en una parte especifica de una célula , tal como el soma, una prolongación astrocltica, una dendrita, u otra prolongación celular, o puede transfectarse generalmente la mezcla de ácidos nucleicos en una célula mediante fototransfección de cualquier parte de la célula. Usando los métodos de la presente invenCiOn, y las mezClas fisiol4~gicamente relevantes de ácidos nudeicos descritas en el presente documento, una vez expresada la mezcla de ~icidos nucleicos en una célula, puede replicarse el fenotipo del estado fisiológico en una célula o una prolongación celular, permitiendo por tanto al experto en la técnica observar la transferencia de fenotipo en una célula o prolongación celular.

Puede obtenerse ácido nucleico a partir de QJalquier célula de interés en QJalquier estado fisiológico. La célula donante puede ser cualquier tipo de célula. Una célula donante puede ser una célula eucariota o una célula procariota. Cuando la célula es una célula eucariotél, la célula es preferiblemente una célula de mamífero, incluyendo, pero sin limitarse a, una célula de ser humalno, primate no humano, ratón, conejo, rata, cabra, cobaya, caballo y similares. Una célula eucariota no de mamlfe!ro incluye una célula de levadura, una célula vegetal, una célula de insecto, una célula protozoaria y una célula fúngica, incluyendo hongos filamentosos y no filamentosos. Cuando la célula es una célula procariota, la célula es una célula bacteriana. Los ejemplos no limitativos de células a partir de las cuales puede obtenerse ácido nudeico induyen astrocitos, cardiomiocitos, cardiomiocitos neonatales, células madre embrionarias y neuronas. Puede fototransfectarse ARN de cualquier célula donante de interés en cualquier célula receptora en el método de la invención. Preferiblemente, las células donantes son de la misma especie que tas células receptoras. Las células donantes pueden ser del mismo individuo que la célula receptora, o de un individuo diferente. Las células donantes pueden originarse de la misma capa germinal (por ejemplo, ectodermo) que la célula receptora (por ejemplo ambas surgen de la capa germinal del ectOdermo), o de una capa germinal diferente (por ejemplo, una célula surge del ectodermo y la otra surge de la capa germinal del endodermo). Las células donantes pueden ser el mismo tipo de célula que la célula receptora pero en un estadio diferente de diferenciación, expuestas a un compuesto terapéutico candidato , expuestas a una toxina o a un patógeno, con enfermedad. Aún en otras realizaciones, una célula donante puede ser una célula receptora. Por ejemplo, se transfiere ácido nucleico de una célula donante en una primera célula receptora. Entonces posteriormente se transfiere ácido nucleico de la primera célula receptora un una segunda célula receptora. En un aspecto, las células receptoras primera y segunda están en estados fisiológicos diferentes. En otro aspecto, las células receptoras primera y segunda son el mismo tipo de célula . Tat come) se describe en otra parte en el presente documento, puede usarse ARN obtenido a partir de una célula para lrans.fectar una célula, o puede usarse como molde para crear AONc. El AONc puede usarse en métodos de transcripdón in vilro para amplificar parte o la totalidad del ARN, que entonces se usa en el método de la invención.

Como ejemplo no limitativo, puede aislarse el ARN total de una célula madre neuronal u otra célula neuronal progenitora a partir de tal célula usando técnicas conocidas en la técnica y dadas a conocer en otra parte en el presente documento. Entonces puede procesarse el AI~N total usando diversos métodos conocidos en la técnica para aislar ARNm, tal como aislamiento de ARNm usando ácidos nudeicos de poli-cfT complementarios, que pueden conjugarse a perlas o a una columna. Entonces se tranSiteda el ARNm en una célula receptora usando los métodos dados a conocer en el presente documento. Entonces la célula receptora expresa la mezcla de ARNm aislado a partir de la célula madre neuronal y replica el efedo mlJlltigénioo de la traducción y regulación génicas diferenciales características de una célula madre neuronal en desarrollo. Sin embargo, la presente invención no se limita a células madre neuronales y puede usarse para determinar el fenotipo multigénico transferido de cualquier tipo de célula en desarrollo o desarrollada, siempre que se aislen el ARNtotal y ARNm a partir de la célula.

Como ejemplo no limitativo alternativo, puede aislarse el ARN lotal a partir de una célula tratada con un compuesto, lal como un fármaco, un péptido, una citocina, un anticuerpo, un mitógeno, una toxina u otros compuestos conocidos en la técnica, usando los métodos dados a conocer en el presente documento y conocidos en la técnica. Entonces puede transfedarse el ARNm de esa célula en otro tipo de célula usando los métodos dados a conocer en el presente documento, transfiriendo asi el fenotipo multigénico de la célula tratada con un compuesto a otra célula, permitiendo por tanto la determinación rápida y especifica de ese compuesto en otro lipo de célula.

En otra realización no limitativa de la presente invención, puede aislarse el ARN total de una célula enferma, tal como una célula tumoral, una célula que aloja un patógeno intracelular, una célula de un paciente con una enfermedad autoinmunitaria, y similares, a partir de la célula enferma. El ARNm de esa célula puede aislarse usando, por ejemplo, técnicas de aislamiento de poli-dT. El ARNm de la célula enferma se transfecta en otra célula usando los métodos de la presente invención, transfiriendo as! el fenotipo multigénico de la célula enferma a otra célula, proporcionando una imagen más precisa del papel que desempe"an ácidos nudeicos que interaccionan y sus proteinas codificadas en el fenotipo de una célula.

La presente invención puede comprender además el uso de un ácido nudeico de una célula o una población de células de tipos homogéneos o heterogéneos. la presente invención puede comprender además el uso de un ácido nudeico, preferiblemente ARNm, definido por el perfil de expresión de una célula según se determina usando métodos bien conocidos en la técnica, induyendo, pero sin limitarse a, un perfil de matriz génica, ARN total, ARNm total y similares. Se usa un perfil de expresión para determinar las abundancias relativas de ARNm en una célula. Entonces se usa el perfil de expresión como molde para determinar las abundancias relativas de ARNm en el estado fisiológico de la célula de la que se realizó el perfil de ex:presión. Una población de ARNm con la misma abundancia relativa que en la célula para la que se ha obtenido el perfil de expresión se produce usando los métodos dados a conocer en otra parte en el presente documento, incluyendo aislamiento de ARNm, transcripción in vitre o síntesis qulmica. Entonces se fototransfecta el ARNm en la célula usando los métodos descritos en otra parte en el presente documento, transfiriendo asl el fenotipo de la célula de la que se realizó el perfil de expresión a otra célula, tejido o animal.

En otra realización, la población de ARNm que refleja la abundancia relativa de una célula en un estado fisiológico particular comprende además ARNm que codifica para uno o más polipéptidos que facilitan la conversión de fenotipo. Por ejemplo, puede complementarse el ARNm obtenido de una célula neuronal con ARNm que codifica para proteínas que estimulan la exocitosis y entonces se fototransfecta en una célula receptora no neuronal.

La presente invención describe además la fototransfeccij6n secuencial de una célula. La fototransfección secuencial se usa en el presente documento para hacer referencia a un procedimiento en el que se fototransfecta una célula en un primer punto de tiempo, y después se fototransfecta en un segundo punto de tiempo o un punto de tiempo posterior. Como ejemplo, puede fototransfeclarse una célula en el dla 1, cuyo resultado es que se introducen uno o más ácidos nucleicos en la célula. Estos ácidos nucleico:s pueden expresarse por los complejos de traducción celular

o permanecer silenciosos, o pueden inhibirse usando un ácido nucleico inhibidor tal como se da a conocer en otra parte en el presente documento. En el dla 2, puede fototransfectarse de nuevo la misma célula, transfectando uno o más de los ácidos nucleicos iguales o distintos en la misma célula. Sin embargo la presente invención no se limita a la fototransfección separada por un dla. La fototransfección secuencial puede producirse con minutos, horas, dias, semanas o meses entre un primer punto de tiempo y un segundo punto de tiempo, siempre que la fototransfección se produzca en la misma célula. Por tanto, los métodos de fototransfección secuencial de la presente invención sólo se limitan por la vida de la célula.

Los métodos de fototransfección secuencial de la preSl~nte solicitud son útiles, entre otras cosas, para analizar la expresión génica temporal en una célula, analizar los efectos mulligénicos de una prolongación de desarrollo extendida y determinar la relación del genotipo con el fenotipo a lo largo del transcurso de la vida viable de una célula. La fototransfección secuencial usando los mismos ácidos nucleicos también aumenta la robustez de la expresión de los ácidos nucleicos fototransfeclados.

Las realizaciones de las invenciones dadas a conocer en el presente documento no se limitan a ARNm. La presente invención puede comprender además someter a transcripción inversa ARNm para dar ADNc, después transfeclar el ADNc en una célula.

La presente invención no se limita al uso de ARN y .ARNm. Puede usarse una mezcla de ADN y ARN en los métodos de la presente invención para determinar los efectos de la expresión génica transitoria (ARN) asl como prolongada (integración de ADN en el genoma) en una oélula.

Cuando se fototransfecta una mezcla de ácidos nucleicos, tal como una mezcla de ARN, en una célula, pueden fototransfectarse sUbpoblaciones de esa mezcla en una célula para delerminar el conjunto principal de ARN responsables para un fenotipo dado. Corno ejemplo no limitativo. cuando se aisla el ARN total a partir de una célula en un determinado eslado fisiológico y se aisla ARNm a, partir de esa población de ARN lotal, pueden transfeclarse subpoblaciones especIficas del ARNm aislado en una célula para establecer los ARNm principales responsables de ese fenotipo. La presente realización también puede realizarse con ADNc producido a partir de ARNm. Pueden identificarse poblaciones especIficas de ARNm usando dalos de homología de secuencia u otros rasgos

caracterlsticos conocidos en la técnica y disponibles de diversas bases de datos, tales como GenBank® (United States Department of Health and Human Services, Bethe~sda MD).

Alternativamente, puede aislarse el ARNm de una célula y transfectarse en una célula usando los métodos de la presente invendón, y puede transfectarse un ARNip, mic:roARN, ácido nudeico antisentido o ribozima (denominados colectivamente ácido nudeico inhibidor) junto con el ARfllm, dando como resultado el silenciamiento y/o la inhibición de un ARNm. El silenciamiento de un ARNm permite a un experto en la técnica identificar, por ejemplo, elllos ARNm principal(es) responsable(s) de un fenotipo multigénico. Además, la presente invención permite la replicación de un fenotipo en otra célula sin la etapa de determinar el perfil de expresión del ácido nucleico de una célula en un estado fisiológico. Puede aislarse el ácido nucleico, preferibteml3nte ARN, de una cétula en un estado fisiotógico especifico, tal como un determinado estado diferencial o estado patológico. Usando los métodos de la presente invención, puede transfectarse el ARN , o un ADNc del ARN , en una célula con el fin de analizar el fenotipo en la célula transfectada una vez expresado el ácido nucleico. El ácido nucleico, preferiblemente ARN , puede ser el ARN total de una célula, o una subpoblación del ARN, tal como ARNITI.

Para evaluar el efecto de la expresión de los ácidos nucleicos transfectados, pueden examinarse células transfectadas según el método de la invención usando métodos conocidos en la técnica. Pueden realizarse evaluaCiones, por ejemplo, de cambios fenotlpicos, expresión de ARNm, expresión de protelna y ensayos funcionales. Los ejemplos de tales análisis incluyen, pero no se limitan a, morfologia celular, presencia y ausencia de marcadores inmunológicos, RT-PCR, obtención del perfil de expresión, mediciones de abundancia de ARNm, analisis de inmunocitoqulmica (ICC) para proteínas es·peclficas, viabilidad celular y actividades especificas de la célula, tales como división-mitosis celular y electrofisioloUia.

En algunas realizaciones, se describe un método que comprende además inhibir factores de transcripción en la célula transfectada, evitando asila competición entre la expresión de ARNm endógenos y exógenos y las proteínas codificadas por los mismos. Un factor de transcripción puede inhibirse usando un ácido nudeico inhibidor o compuestos que inhiben factores de transcripCión, tales como una proteasa, o SP100030 (Huang et 81., 2001 , Sr. J. Pharmacol., 134: 1029-1036). Otros agentes útiles para inhibir la transcripción en una célula receptora incluyen, pero no se limitan a, a-amanitina, tricostalina A (TSA; un inhi bidor de histona desacetilasa), despolimerizador de tubulina y despolimerizador de actina. Preferiblemente, se pone I~n contacto una célula receptora con uno o más agentes de inhibición de la transcripción antes de la transfección. Preferiblemente, se pone en contacto la célula durante entre aproximadamente 30 minutos y aproximadamente 80 horas, preferiblemente entre aproximadamente 30 minutos y aproximadamente 60 horas y más preferiblemente, entre aproximadamente 6 horas y aproximadamente 48 horas, antes de la transfección. En un ejemplo no limitativo, sn pone en contacto una neurona de hipocampo de rata con TSA y a-amanitina a una concentración final de 100 nM y 100 microgramos por mi en un medio de células neuronales, respectivamente. Entonces se irradia la neurona entre aproximadamente 24 y aproximadamente 55 horas después. En algunas realizaciones que incluyen la fototransfección secuencial de una célula receptora, preferiblemente no se pone en contacto la célula receptora con un inhibidor de la transcripción tras la primera fototransfección.

La figura 2 representa un ejemplo no limitativo de un cronograma para la fototransfección de una célula receptora, por ejemplo una neurona, con ARNm de una célula receptora, por ejemplo, una célula de la glla. El cronograma representa un periodo de tratamiento con inhibidor die la transcripción, un periodo de recuperación celular de fototransfección y un periodo de remodelacián y rediferenciación celular. Se indican posibles cambios en los medios, incluyendo transferencia de un medio específico de célula receptora a un medio especifico de célula donante. Tales cambios de medios son útiles, por ejemplo, para sopc,rtar la conversión de fenotipo. En el recuadro en la parte superior derecha se indican ensayos que pueden usarse para caracterizar la remodelación y rediferenciación de la célula receplora fotolransfectada.

El presente método también puede usarse para la transfección especifica y local de un ácido nucleico inhibidor, tal como un ARNip, acido nucleico antisentido o un micro-ARN (miAR N), usando los métodos de la presente invención. Usando la Invención dada a conocer en el presente documento, el experto en la técnica puede inhibir espeCíficamente un ácido nuclear celular, especialmente aquellos en prolongaciones celulares. Además, tal como se da a conocer en otra parte en el presente documento, puede usarse un ácido nudeico inhibidor para identificar elllos ácido(s) nucleico(s) principal(es) implicado(s) en un fenotipo multigénico.

La presente invención comprende insertar un ácido nuc:leico en una célula. Los métodos de la presente invención pueden aplicarse a una variedad de ácidos nudeicos, im:luyendo diversas especies de ARN (ARNm, ARNip, miARN, ARNnh, ARNt, ARN total, combinaciones de los mismos y similares) asl como a AON. En la técnica se conocen bien métodos para aislar ARN a partir de una célula, sintetizar un polinucleótido corto, construir un vector que comprende un inserto de AON y otros métodos de obtención de un ácido nucleico para fototransfectarto en una célula, e incluyen, por ejemplo, aislamiento de ARN, slntesis de ADNc, transcripción in vilro y similares.

Las composiciones de ácido nucleico de esta invención, ya sean de ARN, ADNc, ADN genómico o un hlbrido de las diversas combinaciones, pueden aislarse a partir de las fuentes naturales o pueden sintetizarse in vitro. Generalmente se describen técnicas para la manipulación de ácido nudeico en Sambrook el 8/. (2001 , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CoId Spring Harbor Laboratory, Nueva York) y en Ausubel el al. (1997, Current

Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NUe'll8 YOrk). Los ácidos nudeicos adecuados para su uso en el presente método también incluyen análogos de ácido nucleico. los ejemplos de tales análogos incluyen, pero no se limitan a, f05forolioalo, fosfotriéster, fosfonato de metilo, enlaces entre azúcares de cicloalquilo o alquilo de cadena corta, o enlaces entre azúcares ("estructura principal~) helerociclicos o heteroat6micos de cadena corta . Además, también pueden usarse ácidos nucleicos que tienen estructuras principales de morfolino (patente estadounidense n.o 5.034.506) o estructuras principales de poliamida (Nielse~n et 81.,1991, Science 254: 1497).

Los métodos de la presente invención pueden comprender el uso de una variedad de ácidos nudeicos, incluyendo ADN, ARN, un ADNc obtenido mediante transcripción imlersa a partir de un ARNm, un ARN transcrito a partir de ese ADNc, un ADN amplificado a partir del ADNc, un AR N transcrito a partir del ADN amplificado, y similares. la presente invención comprende además usar moléculBlS de ARN y ADN monocatenarias y bicatenarias. Puede usarse cualquier secuencia codificante de interés en los métodos de introducción y traducción de un ácido nucleico en una célula o en una prolongación celular, tal como una dendrita. Un experto en la técnica entenderá, cuando se le proporcione la presente divulgación, que puede afect;:trse a una multitud de propiedades de una prolongación celular. y por asociación, de la célula unida, mediante los métodos de la presente invención. Por ejemplo, para estudios de remodelación de dendritas, cualquier Sl~cuencia codificante para una proteína implicada en el crecimiento, la homeostasis o la remodelación de una dendrita es util en los métodos de la invención. los ejemplos no limitativos de tales proteínas incluyen: caderina, neurexina. sinaptofisina, tubulina. proteínas asociadas a microtubulos y aetina.

En una realización de la presente invención. el ácido nucleico fototransfeetado en una célula es la totalidad o una parte del ARNm total aislado a partir de una muestra bio,lógica. El término "muestra biológica", tal como se usa en el presente documento, se refiere a una muestra obtenidal a partir de un organismo o de componentes (por ejemplo, órganos, tejidos o células) de un organismo. la muestra puede ser de cualquier tejido o fluido biológico. El ácido nucleico (ya sea AON genómico o ARNm) puede aislars·e a partir de la muestra segun cualquiera de varios métodos bien conocidos por los expertos en la técnica. Un experto apreciará que cuando deben detectarse alteraciones en el numero de copias de un gen, preferiblemente se aisla AON genómico. A la inversa, cuando deben detectarse los niveles de eltpresión de un gen o de unos genes, preferiblemente se aisla ARN (ARNm).

los expertos en la técnica conocen bien métodos de aislamiento de ARNm total. Por ejemplo. se describen en detalle métodos de aislamiento y purificación de ácidcls nucleicos en el capitulo 3 de laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology: Hybridization Wi'lh Nucleic Acid Probes, Part 1. Theory and Nucleic Acid Preparation, P. Tijssen, ed. Elsevier, N.Y. (1993) Y en el capitulo 3 de laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology: Hybridization With Nucleic Acid Probes, Part 1. Theory and Nucleic Acid Preparation, P. Tijssen, ed. Elsevier, N.Y. (1993».

Preferiblemente, el ácido nucleico total se aísla a partir de una muestra dada usando, por ejemplo, un método de extracción con guanidinio-fenol-cloroformo ácido y se aí sla ARNm de poliA· mediante cromatografía en columna de oligo-dT o usando perlas magnéticas de (dT)n. Productos disponibles comercialmente, tales como TRIZOl y MICRO-FASTTRACK (InvitrogenT", Carlsbad, CA), son útiles en la extracción de ácido nucleico a partir de una muestra biológica.

El ARNm puede transfedarse de manera local directamente en una célula o una prolongación celular, o puede someterse el ARNm de la muestra a transcripción inversa con una transcriptasa inversa y un promotor que comprende un oligo-dT y una secuencia que codifica para el promotor del fago T7 para proporcionar un molde de AON monocatenario. la segunda cadena de ADN se polimeriza usando una ADN polimerasa. Tras la slntesis de AONc bicatenario, se añade ARN polimerasa de T7 y se transcribe ARN a partir del molde de AONc. Rondas sucesivas de transcripción a partir de cada molde de ADNc individual dan como resultado ARN amplificado. los expertos en la técnica conocen bien métodos de polimerización in vitro (véase, por ejemplo, Sambrook, citado anteriormente; Van Gelder, el al., 1990, Proc. NatL Acad. So. USA, 87: 1663-1667). Además, Eberwine el al. (1992, Proc. Nat!. Acad. Sci. USA, 89: 3010-3014) proporcionan un protocolo que usa dos rondas de amplificación mediante transcripción in vitro para obtener una amplificación de mas de 105 veces del material de partida original.

la presente invención comprende además el uso de transcripción in vitro para la fototransfección en una célula o prolongación celular. la transcripción in vilro comprende la producción de ARNdc transcribiendo un segmento de ácido nucleico (ADN) en ambas direcciones. Por ejemplo, el kit de transcripción de RNAi HiScriben1 (New England Biolabs, Ipswich, MA) proporciona un vedor y un método para producir un ARNdc para un segmento de ácido nucleico que se clona en el veetor en una posición flanqueada en cada lado por un promotor de T7. Se generan moldes separados para la transcripción de T7 de las dos cadenas complementarias para el ARNdc. Se transcriben los moldes in vitro mediante la adición de ARN polimerasa de T7 y se produce ARNdc. También pueden usarse métodos similares usando PCR y/o otras ARN polimera!>8s (por ejemplo, de polimerasa T3 o SPS) y se conocen en la técnica.

la presente invención comprende además el uso de ácidos nucleicos sintetizados químicamente para su uso en la fototransfección. Pueden sintetizarse químicamente oli90nude6tidos para su uso como sondas según el método de triéster de fosforoamidita en fase sólida descrito por primera vez por Beaucage, (1981, Tetrahedron letls., 22:18591862) usando un sintetizador automatizado, tal como se describe en Needham-VanOevanter, el al. (1984, Nucleic Acids Res., 12: 6159-6168). La purificación de oligonude6tidos se realiza o bien mediante electroforesis en gel de acrilamida nativo o bien mediante HPlC de intercambio aniónico tal como se describe en Pearson (1983, J. Chrom., 255:137-149). La secuencia de los oligonucle6tidos sintéticos puede verificarse usando el método de degradación qulmica de Maxam (1980, en Grossman y Moldave, ecls., Methods in Enzymology, Academic Press, Nueva York, 65:499-560).

la presente invención puede comprender además el uso de AON en un procedimiento para !ransfedar localmente una célula o una prolongación celular mediante fololransfecci6n. El AON puede contenerse en un a vector, tal como los descritos en el presente documento.

La invención incluye un ADN aislado que codifica para una protelna operativamente unida a un ácido nucleico que comprende una secuencia promotora/reguladora de manera que el ácido nucleico puede preferiblemente dirigir la expresión de la protelna codificada por el ácido nudeico. Por tanto, la invención abarca vectores de expresión y métodos para la introducción de ADN exógeno en células con expresión concomitante del ADN exógeno en las células tales como las descritas, por ejemplo, en Sambrook el al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York) y en Ausuhel el al. (1997, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva York).

La expresión de una proteina en una célula o una prolongación celular sometida a fototransfección tal como se da a conocer en el presente documento puede lograrse gen,~rando un plásmido u otro tipo de vector que comprende el ácido nucleico deseado operativa mente unido a una ~;ecuencia promotora/reguladora que sirve para impulsar la expresión de la proteína, con o sin una etiqueta, en células en las que se introduce el vector. Hay muchas secuencias promotoras/reguladoras útiles para impulsar la expresión constitutiva de un gen disponibles en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, la seGuencia potenciadora de promotor temprano inmediato de citomegalovirus, el promotor temprano del SV40, así cClmo el promotor del virus del sarcoma de Rous, y similares. Además, puede lograrse la expresión inducible y espaclfica del tejido del ácido nucleico que codifica para una proteina colocando el ácido nucleico que codifica para una proteina bajo el control de una secuencia promotoralreguladora inducible o especifica del tejido. Los ejemplos de secuencias promotoras/reguladoras especificas del tejido o inducibles que son útiles para este propósito incluyen, pero no se limitan al promotor inducible de L TR del MMTV, y el potenciador/promotor tardío del SV40. Además, en la invención también se contemplan promotores que se conocen bien en la téc:nica que se inducen en respuesta a agentes de inducción tales como metales, glucocortlcoides y similares. Por tanto, se apreciará que la invención incluye el uso de cualquier secuencia promotora/reguladora, que o bien se conoce o bien no se conoce, y que puede impulsar la expresión de la protelna deseada unida operativamente a la misma.

La selección de cualquier vector de plásmido particular u otro vector de ADN no es un factor limitante en esta invención y en la técnica se conoce bien una amplia abundancia de vectores. Además, queda dentro de la experiencia del experto elegir secuencias promotoras/reguladoras partiCUlares y unir operativamente esas secuencias promotoras/reguladoras a una secuencia de ADN que codifica para un polipéptido deseado. Tal tecnología se conoce bien en la técnica y se describe, por ejemplo, en Sambrook el al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York) y en Ausubel el al. (1997, Current Protocols en Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva YOrk).

Los ácidos nucleicos que codifican para una proteina pueden clonarse en diversos vectores de plásmido. Sin embargo, la presente invención no debe interpretarse como limitada a plásmidos o a cualquier vector particular. En vez de eso, debe interpretarse que la presente invención abarca una amplia abundancia de vectores que están disponibles fácilmente y/o se conocen bien en la técnica.

La presente invención comprende además Iransfectar localmente un ácido nucleico inhibidor, tal como un ácido nucleico antisentido, un ARNip O un miARN mediante fototransfección en una célula. Un polinudeótido de ARNip es una molécula de ácido nucleico de ARN que interfiere con la actividad de ARN que generalmente se considera que se produce mediante un mecanismo de silenciamiento génico postranscripcional. Un polinucle6tido de ARNip comprende preferibtemente un ARN bicatenario (ARNdl::) , pero no se pretende que se limite de ese modo y puede comprender un ARN monocatenario (véase, por ejemplcl, Martinez el al., 2002, Cetl110:563-74). El polinucleótido de ARNip incluido en la invención puede comprender otros potimeros de nucle6tidos monocatenarios o bicatenarios, que se producen de manera natural, recombinantes (1 sintéticos (ribonucle6tidos o desoxirribonucle6tidos o una combinación de ambos) y/o análOQOS de nude6tidos tal como se proporciona en el presente documento (por ejemplo, un oligonudeótido o polinucle6tido o similar, normalmente con un enlace fosfodiéster de 5' a 3'). Por consiguiente se apreciará que determinadas secuencias a modo de ejemplo dadas a conocer en el presente documento como secuencias de ADN que pueden dirigir la transcripción de los polinucle6tidos de ARNip también se pretende que describan las secuencias de ARN correspondientes y sus complementos, dados los principios bien establecidos de apareamiento de bases de nucleótidos complementarios.

Un ARNip puede transcribirse usando como molde un ,l\DN (genómico, ADNc O sintético) que contiene un promotor para un promotor de ARN polimerasa. Por ejemplo, el promotor puede ser el promotor de U6 o el promotor de ARN polimerasa 111 de H1. Alternativamente, el ARNip puede ser una molécula de ARN derivada sintéticamente. En determinadas realizaciones, el polinucleótido de ARNip puede tener extremos romos. En determinadas otras realizaciones, al menos una cadena del polinucle6tido de ARNip tiene al menos uno, y preferiblemente dos nucleótidos que forman una ·proyección" (es decir, que no realizan un apareamiento de bases con una base complementaria en la cadena opuesta) en el extremo ~I' de cualquier cadena del polinucleólido de ARNip. En una realización preferida de la invención, cada cadena delljúplex de polinucle6tido de ARNip tiene una proyección de dos nucle6tidos en el extremo 3'. La proyección de do~; nuclebtidos es preferiblemente un dinucle6tido de timidina (TI) pero también puede comprender otras bases, por ejemplo, un dinucleótido de Te o un dinucle6tido de TG, o cualquier otro dinude6tido. El dinudeótido de proyección también puede ser complementario a los dos nudeótidos en el extremo 5' de la secuencia del polinucleótido qUE! se selecciona como diana para la inteñerencia, Para una discusión de los extremos 3' de polinucle6tidos de ARNip véase, por ejemplo, el documento WO 01f75164 ,

los polinudeótidos de ARNip preferidos comprenden pc>linucle6tidos bicatenarios de aproximadamente 18~3O pares de bases de nude6tidos, preferiblemente aproximadamente 18, aproximadamente 19, aproximadamente 20, aproximadamente 21, aproximadamente 22, aproximadamente 23, aproximadamente 24, aproximadamente 25, aproximadamente 26 o aproximadamente 27 pares de bases, y en otras realizaciones preferidas aproximadamente 19, aproximadamente 20, aproximadamente 21, aproximadamente 22 o aproximadamente 23 pares de bases o aproximadamente 27 pares de bases, El polinucleótido de ARNip útil en la presente invención también puede comprender una secuencia de polinudeótido que mue:stra variabilidad que se diferencia (por ejemplo, mediante sustitución de nudeótido, induyendo transición o transversi6n) en uno, dos, tres o cuatro nucle6tidos de una secuencia particular, Estas diferencias pueden producirse en cualquiera de las posiciones de nucle6tido de una secuencia de polinucleótido de ARNip particular, depenljiendo de la longitud de la molécula, si está situada en una cadena sentido o en una antisenlido del polinucleótido bicatenario, la diferencia de nucleótidos puede encontrarse en una cadena de un polinudeótido bicatenario, en el que el nucleótido complementario con el que el nudeótido sustituto formarla normalmente un apareamiento de bases mediante puente de hidrógeno, puede no estar sustituido de manera correspondiente, En realizaciones preferidas, los polinude6tidos de ARNip son homogéneos con respecto a una secuencia de nucleótidos espedfica,

los polinude6tidos que comprenden los polinucle6tidos de ARNip de la presente invención pueden derivarse en determinadas realizaciones de un pollnude6tido monocatenario que comprende un fragmento de 0ligonucle6Udo monocatenario (por ejemplo, de aproximadamente 18-30 nUde6tidos) y su complemento inverso, normalmente separado por una secuencia espaciadora, Según determinadas realizaciones de este tipo, la escisión del espaciador proporciona el fragmento de oligonucleótido monocatenario y su complemento inverso, de modo que pueden aparearse para formar, opcionalmente con etapas de procesamiento adicionales que pueden dar como resultado la adición o eliminación de uno, dos, tres o mas nude6tid4)s del extremo 3' y/o del extremo 5' de cualquiera o ambas cadenas, el polinudeótido de ARNip bicatenario de la presente invención. En determinadas realizaciones el espaciador tiene una longitud que permite que el fragrnento y su complemento inverso se apareen y formen una estructura bicatenaria (por ejemplo, como un polinucle6tido en horquilla) antes de la escisión det espaciador, y opcionatmente, etapas de procesamiento posteriores que pueden dar como resultado la adición o eliminación de uno, dos, tres, cuatro o más nude6tidos del extremo 3' y/o del extremo 5' de cualquiera o ambas cadenas, Por tanto, una secuencia espaciadora puede ser cualquier secuencia de polinudeótido tal como se proporciona en el presente documento que esta situada entre dos regiones de secuencias de polinudeótido complementarias que, cuando se aparean para formar un ácido nudeico bicatenario, da como resultado un polinucle6tido de ARNip,

El presente método comprende además fototransf4:!C1ar una célula en presencia de un ácido nUcleico, preferiblemente ARN y/o ADN , en el que el ácido nudeico está en un medio fluido que permite la transferencia del ácido nudeico desde un lado de la membrana celular hasta el otro lado de la membrana celular a través de un orificio en la membrana celular. El medio fluido pued<9 comprender cualquier medio que tiene la capacidad de tamponamiento y el pH para soportar la viabilidad de una célula y la estabilidad de una molécula de ácido nudeico. los medios contemplados incluyen, pero no se limitan a, solución salina tamponada con fostato, Tris, medios de cultivo celular de Tris-EDTA (TE), otros tampones y medios acuosos, y similares.

El número de moléculas de ácido nucleico que entran en la célula se ve influido por la concentración de ácido nuclelco en el bano de ácido nudeico, el tamano de la molécula de acldo nudelco y la intensidad del laser, por ejemplo, la duración de cada pulso de láser y el número de pUlsos de láser suministrados. Basándose en las enser'lanzas en el presente documento, el experto en la técnica puede ajustar fácilmente los parámetros del procedimiento de fototransfección para controlar el núrnero aproximado de moléculas nucleicas que entran en la neurona por pulso.

En una realización, se rodea una célula por un bano de ácido nucleico que comprende una molécula de ácido nUcleico, preferiblemente una molécula de ARN, a de aproximadamente 1 a aproximadamente 150 llg/ml, más preferiblemente de aproximadamente 10 a aproximadamente 100 Ilg/ml, y todavía más preferiblemente a de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 Ilg/ml en el bar'lo. Preferiblemente el bar'lo está en un recipiente que es permeable mediante un láser y no altera el haz, incluso más preferiblemente, el bar'lo es un vidrio ópticamente transparente con un grosor de aproximadOOlente 0,1 mm.

En otra realización, se bana una célula en ubicaciones diferenciadas sobre la supeñicie celular con una disolución que comprende una molécula de ácido nudeico. Por I~jemplo, usando una pipeta de fijación, micropipeta u otro aplicador, se aplica una disolución que comprende ácido nucleico a una ubicación diferenciada sobre la superficie de

\O

una célula. La disolución puede aplicarse a más de una ubicación sobre una célula. Entonces se irradia la célula

usando un láser en uno o más sitios dentro de una ubicación diferenciada. El ácido nucleico en la disolución está presente a de aproximadamente 1 nanograma por microlitro (ngl~l) a aproximadamente 2 microgramos/microlitro (~g/lJl), preferiblemente de aproximadamente 50 n9/1.11 a aproximadamente 1 (¡.¡g/IJI) V más preferiblemente de aproximadamente 100 ng/l.ll a aproximadamente 500 ng/Ill.

la presente invención describe además el uso de olros métodos para introducir un ácido nucleico en una célula, tejido o animal mediante fototransfecci6n. Los mét<::x:los incluyen, por ejemplo, perfusión, tratamiento con Picospritzer, microinyecci6n y similares. los métodos para la perfusión incluyen, pero no se limitan a, usar una bomba para mover un medio fluido que comprende un ácido nucleico, preferiblemente ARN, incluso más preferiblemente ARNm, a una célula, tejido o animal. El medio fluido usado en los métodos de perfusión puede incluir los dados a conocer en otra parte en el presente documento, tates como disoluciones tampanadas que sopartan y mantienen la estabilidad de un ácido nucleico y una célula, tejido o animal. En una realización de la presente invención, el medio fluido puede incluir un mt~dio, tal como medio basal de Eagle (BME), medio BGJb, medio BMOC-3 de Brinster, medio CMRl, medio independiente de C(h, medios de Eagle modificados por Dulbecco (D-MEM), mezclas de nutrientes F-10, mezclas de nutrie!ntes F-12, medios esenciales minimos de Glasgow, medios de cuHivo de células de insectos de Grace, MEM mejorado, medios de insectos IPl-41, medios de Dulbecco modificados par Iscove, medios l-15 de leibovilz, medios 5A de McCoy (modificado), medio MCDB 131, medios 199, medio NCTC-109, medio esencial mlnimo (MEM), medio de Eagle modificado (MEM), medios de suero reducido Opli-MEM® 1, medios RPMI 1640, medios de Drosophfla de Schneider, medios MB 752/1 de Wayrnouth, medios E de Williams, liquido cefalorraquideo artificial (a,CSF), solución de Ringer y similares. la presente invención puede comprender además el uso de disoluciones de sal tampanadas, incluyendo, pero sin limitarse a, solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (O-PBS), solución salina equilibrada de Earle, solución salina equilibrada de Hanks, solución salina tampanada con fosfato (PBS) y similares.

la presente invención describe además usar un instrumento Picosprilzer junto con la fototransfección para introducir un ácido nucleico en una célula, órgano o tejido. El instrumento Picosprilzer comprende el uso de pulsos eléctricos con un dispositivo de presión para suministrar un compuesto, tal como un ácido nucleico, a una célula, tejido o animal. En la técnica se conocen métodos para el instrumento Picosprilzer y se describen, por ejemplo, en Herberholz, el al., 2002, J. Neuroscience, 22: 9078-90U5). Hay aparatos Pioosprilzer disponibles, poi' ejemplo, de Wortd Precision Instruments (Sarasota, Fl).

En otra realización descrita, la transfección de célul,as con ácidos nucleicos que codifican para dos o más polipéptidos diferentes se realiza mediante microiny'ección. En estas realizaciones, la célula receptora es preferiblemente una célula somática, preferiblemente una célula somática diferenciada.

la presente invención comprende irradiar una célula 0:)0 un láser para fototransfectar y transfectar localmente la célula. Cuando el láser entra en contacto con la meml:)rana celular, o la pared celular en el caso de las células vegetales, células fúngicas y otras células que comprende una pared celular, se perfora la membrana plasmática o la pared celular, permitiendo la difusión de moléculas foráneas, tales como ARN ylo ADN, para entrar en la célula. la fluidez de las membranas celulares de mamiferos facilita el posterior cierre de la perforación. los láseres compatibles con la presente invención incluyen, pero no se limitan a, láseres de ión de argón de onda continua que funcionan a 488 nm (Schneckenburger, et al., 2002, J. Biomed. Opl., 7: 410-416; Palumbo et al., 1996, J. Fotochem. Fotobiol. B-Biol., 36: 41-46), láseres de Nd:YAG pulsados y con conversión ascendente de frecuencia que funcionan a 355 nm (Shirahata, et al., 2001, J. Invesl. Med., 49: 184-190), 532 nm (Soughayer, el al., 2000, Anal. Chem., 72: 1342-1347) y 1064 nm (Mohanty, el si., 2003, Biotochnol. Lett. 25: 895--899), y láseres de tilanio-zafiro de femtosegundos (Tirlapur, et al., 2002, Plant J. 31: 365--374; Tirlapur, el al., 2002, Nature 418: 290-291 ; Zeira, el al., 2003, Mol. Therapy 8: 342-350). Preferiblemente, se u.sa un láser de titanio-zafiro a 405 nm (PicoQuant GmbH, Berlln, Alemania) para fototransfectar una célula. Sin embargo, la presente invención no se limita al láser de titaniozafiro, sino que incl~e cualquier láser con la capacidad de suministrar un volumen focal localizado de

aproximadamente 10.19 m•

El control del haz de láser incidente se alcanza usando diversos aparatos para controlar el enfoque y la potencia del láser, así como para apuntar el láser. Se consigue enfocar el láser haciendo pasar el láser incidente a través de una lente, tal oomo una lente de microsoopio, colocada entre el láser y la célula. la potencia del láser se oontrola modulando la tensión y la corriente que llega al láser y mediante el uso de filtros de densidad neutra o células Pockels. La exposición de las células al láser se controla mediante un obturador, tal como un obturador de cámara de reflejo de lente individual (SLR) ylo con células de Pockels controladas electrónicamente.

Se logra apuntar el láser mediante una lente de microscopio y con espejos dieléctricos y de dirección y AOD (deflector acústico-óptico) entre la fuente de láser y una célula. Un microscopio útil en la práctica de la presente invención incluye, pero no se limita a, un microscopio (;anfocal, un microscopio de fluorescencia de excitación por múltiples fotones, un microscopio óptico y similares. El presente método oomprende además apuntar el láser usando una fibra óptica para transmitir el láser a una zona distante o de dificil acceso. Como ejemplo no ¡¡mitativo, se usa una fibra óptica para fototransfectar células intestinales, neurales o cardiotorácicas en un animal vivo. Además, la presente invención comprende fototransfectar una célula o una población de células usando múltiples fibras ópticas en un animal. En la técnica se conocen bien las fibras ópticas y se describen, por ejemplo, en las patentes

estadounidenses n.os 3,711.262, 6.973.245.

Un haz de láser con menos de un milivatio de potencia durante decenas de milisegundos es suficiente para crear un poro en una célula (Paterson, el 81., 2005, Optics Express, 13: 595-600). Preferiblemente, el laser tiene una densidad de potencia de aproximadamente 1200 MWm·,2 y una potencia total de aproximadamente 30-55 mW en la apertura posterior de la lente. Además, con el fin de proporcionar un area superficial máxima para la transfección, el haz de láser debe ser altamente circular (dx = dy) con un diámetro de haz de aproximadamente 2 mm.

la emisión de potencia inicial del láser se atenúa mediante el uso de diversos filtros, tales como un filtro de densidad neutra (NO) para reducir la potencia hasta el intervalo de milivatios requerido para la fototransfección sin efectos patológicos relacionados sobre la célula diana. El haz puede expandirse mediante el uso de un telescopio en el que f = 100 mm, y dirigirse en un microscopio, tal como un microscopio óptico o un microscopio de inmersión en aceite con un objetivo de X100 (N.A. =1,25). Un obturador $lH entre la fuente de laser y el microscopio permite el control del tiempo de exposición. Un tiempo de expOSición de a.proximadamente 40 ms es suficiente para crear un poro en una célula sin dal"io relacionado, pero este parámetro puede alterarse para aumentar o disminuir el tiempo de exposición.

las células diana en un bal"io de ácido nucleico se coloc:an y se enfocan manipulando la plataforma del microscopio y/o usando espejos dieléctricos y de dirección y AOD, dE! modo que se centra el haz sobre la membrana celular y no hacia el núcleo de la célula. Cuando se crea un poro en una prolongación celular, tal como una dendrita, se enfoca el haz directamente sobre la prolongación celular.

Se irradia la célula o la prolongación celular con un láser según los parámetros dados a conocer en el presente documento. En una realización, se transfectan las células con un ácido nucleico que comprende un marcador que indica una transfección satisfactoria. Tales marcadores se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, resistencia a antibióticos y protelnas fluorescentes. Puede realizarse un seguimiento de la creación satisfactoria de un poro mediante la adición de una molécula detectable en la disolución de ácido nucleico. Tales moléculas se conocen bien en la técnica. Preferiblemente, la molécula no es tóxica para la célula receptora. los ejemplos no limitativos incluyen amarillo lucifer y éster succinimidilico de diacetato de carboxifluoresceina. Se incuban las células según las condiciones de incubación antes de la irradiación Don el láser. Se analiza la expresión del ácido nucleico transfectado localmente según la presencia y actividad de un marcador o el fenotipo de la célula.

la presente invención describe diversos kits que compn~nden un compuesto, incluyendo un ácido nucleico, para su uso en los métodos de fotolransfección de la presente solicitud. los kits pueden comprender además un aplicador, y materiales de instrucciones que describen el uso de un ácido nucleico para realizar los métodos de la invención. Aunque a continuación se describen kits de modelo. ~~I contenido de otros kits útiles resultará evidente para el experto en la técnica a la vista de la presente divulgación. Cada uno de estos kits se contempla en el presente documento.

En un aspecto, se describe un kit para fototransfectar una célula, tejido, tal como un corte vivo, o un animal, preferiblemente un mamífero. El kit comprende un recipiente que comprende un ácido nucleico, preferiblemente ARNm, que cuando se expresa confiere un fenoti po especifico a la célula, tejido o animal sometido a fototransfecciÓn. Es decir, el kit comprende una mezcla ~je ARNm o ácidos nucleicos derivados a partir de ARNm tal como se describe en otra parte en el presente documento que confiere un fenotipo especifico a una célula. Tales fenotipos incluyen los dados a conocer en otra parte en I~I presente documento, tales corno un fenotipo canceroso, el fenotipo de una estado de desarrollo especifico, el fenotipo de un estadio especifico inducido mediante la administración de un fármaco, y similares. Como ejemplo, el ARNm aislado a partir de una célula madre puede quedar abarcado en el kit, y entonces puede fototrans;fectarse en una célula para conferir un fenotipo de célula madre a la célula sometida a fototransfección .

Como otro ejemplo, puede fototransfectarse el ARNm a partir de una célula no cancerosa en una célula cancerosa para conferir un fenotipo no canceroso a esa célula.

En otra realización, un kit comprende un recipiente que comprende una mezcla de ARN esencialmente en la misma abundancia relativa a la encontrada en una célula particular en un estado fisiológico particular, en el que los ARN pueden convertir fenotlpicamente una célula cuando se introducen en la misma. Aún en otra, un kit comprende un recipiente que comprende una mezcla de ácidos nucleicos en el que la mezcla es convertidora del fenotipo. En otra realización, el kit comprende un recipiente que compren¡je una mezcla de ARN que comprende dos o más ARN que codifican para dos o más polipéptidos diferentes y en ,el que los dos o más ARN están en la misma abundancia relativa que la encontrada en una célula. El ARN en cualquiera de los kits puede obtenerse mediante aislamiento de ARNm, sintesis química y/o transcripción in vitro. Sin E!mbargo, los presentes ejemplos no se limitan a células, y también pueden incluir ARNm a partir de un tejido, tal como un corte vivo, o un animal, preferiblemente un mamífero. Adicionalmente, el kit comprende un aplicador y un material de instrucciones para el uso del kit. Estas instrucciones presentan una realización de la divulgación proporcionada en el presente documento.

Ejemplos la invención se describe adicionalmente en detalle mediante referencia a los siguientes ejemplos experimentales. Estos ejemplos se proporcionan únicamente con fines dE~ ilustración.

Ejemplo experimenlall: Neuronas sometidas a fQtotransfecci6n con ARNm de aslrocilos

Ahora se deSCliben los materiales y métodos usados e,n el experimento presentado en el ejemplo experimental a continuación .

Preparación de células receptoras: Se cultivaron neuronas de hipocampo de rata en condiciones de cultivo convencionales con cubreobjetos en rejilla. Se trataron 'las neuronas con Q-amanitina alOa ng/ml y TSA alOa nM durante 48 horas antes de la fototransfecci6n. EnlonCEls se incubaron estos cubreobjetos con células receptoras tratadas con inhibidor en disolución de hipocampo normal (NHS) que contenía 100 ng/ml de a-amanitina, 5 antibióticos (penicilina-estreptomicina, gentamicina, neClmicina y kanamicina) y FUNGIZONE (anfotericina 8; E_R. Squibb & Sons, Princeton, NJ) durante el procedimiento de fototransfección.

Preparación de ARNm de donante: Se cultivaron astrocbtos de rata en DMEM/F8S al 10% en un matraz usando un protocolo convencional. Se agitó el matraz durante la noche para garantizar la pureza de la población de astrocitos. Entonces se extrajo ARN total usando TRIZOL y segun las recomendaciones del fabricante, seguido por extracción de ARNm usando el kit MICROFASTTRACK 2.0. Se disolvió el ARNm en un tampón de elución (Tris-Cll0 mM en agua DEPC) a una concentración final de 100 ng/ul a aproximadamente 300 ng/ul y se congeló a -800C para su uso futuro como ARNm de donante.

Fololransfección: Se obtuvieron imágenes de célula!> receptoras en NHS (complementado con a-amanitina. antibióticos y FUNGIZONE) con una lente sumergida en agua de 40X y se barrieron con láser Chameleon. Se delineó la zona que iba a transfectarse en cada célula en una imagen de la célula en el monitor. Una aplicación local de aproximadamente 100-300 ng/)ll de ARNm a partir dE! astrootos de rata directamente sobre el cuerpo de la célula usando una micropipeta y se crearon poros secuencialmente en 16 (4X4) puntos dentro de la zona delineada usando un láser de Ti-zafiro (Mai-Taj"m, Newport Corpclration, Spectra-Physics Laser division, Mountain View, CA) durante 5 milisegundos por punto a una potencia de láser de 35 mW (en la apertura posterior de la lente). Se aplicaron de aproximadamente 0,5 a aproximadamente· 1 microlitros de disolución de ARNm a cada neurona. la disolución de ARNm también contenía amarillo Lucifer para realizar un seguimiento de la correcta aspiración de la disolución de ARNm pulverizada sobre la célula que iba a transfectarse.

Tras la fotolransfección: Tras la fototransfección con J!\RNm de donante, se incubaron las células receptoras en medio especifico de células receptoras con 25 nglml de a-amanitina (asl como antibióticos y FUNGIZONE como anteriormente) durante 6 horas antes de sustituirlo por medio especifico de células receptoras que contenla antibióticos y FUNGIZONE pero sin a-amanitina. Posteriormente, se cultivaron las células sometidas a fototransfección con cubreobjetos en los medios especl"ficos de células donantes apropiados tras la retirada de aamanitina. Posteriormente se cambiaron los medios de cultivo dos veces por semana.

Obtención de imágenes y Unción: Se obtuvieron imágenes de las células receptoras antes de la fototransfección y periódicamente tras la fototransfección. Se tiñeron las células con 4,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) para delectar los núcleos. Se tomaron imágenes de conlraste de interferencia diferencial (DIC) para evaluar la morfologia de las células sometidas a fototransfección. Para la detección inmunohistoquímica de proteína ácida fibrilar gUal (GFAP), se fijaron las células mediante exposición a paraformaldehí(jo a14% durante 10 minutos. Entonces se incubó la muestra con anticuerpo de ratón (1 :400) frente a proteína ácida fibrilar glial (GFAP) durante la noche a 4°C, seguido por incubación con un anticuerpo de cabra anti-ratón conjugado con fluoróforo (1:1500) durante 45 minutos a temperatura ambiente.

Fisiologia (obtención de imágenes de calcio): Se cargaron células sometidas a fototransfección con un indicador de calcio fluorescente que penetra en la célula (flUO-4 AM) y se obtuvieron imágenes mediante microscopía confocal. En primer lugar, se estimularon las células con glutamat:o 100 IAM. Después se lavaron las células y se dejó que se recuperaran (retorno de la señal al nivel inicial). Entonces se estimularon las células con potasio 50 mM. Se lavaron de nuevo las células y se monitorizaron para evaluar si la señal volvía al nivel inicial.

Ahora se describen y se comentan los resultados de los IE!xperimentos.

Dos semanas Iras la folotransfección de ARNm de astrocllos en neuronas del hipocampo, los cambios morfológicos eran claramente evidentes. En particular, se observó la retracción de prolongaciones neuronales en células sometidas a fototransfección . Véanse las figuras 3A, 38 Y 3C.

Además, se realizó la tinción ¡nmunohisloqulmica para detectar la proteína ácida fibrilar gUal (GFAP). la GFAP es una proteína expresada específicamente en células de la gUa; no se expresa en neuronas de hípocampo. la vida media in vivo del ARNm de GFAP es de aproximadamente 5 horas y la vida media in VNO de la proteína GFAP es de aproximadamente 18 horas. Por tanto, dos semanas Iras ta folotransfección, no se esperarla que estuviera presente ARNm de GFAP derivado de células de la glla y ningurla protelna GFAP expresada a partir del mismo en la célula sometida a fototransfección. Notablemente, se detectó GFAP en células sometidas a fototransfección (figura 30).

También se detectó GFAP lanto a 3 semanas (figuras 4A y 46) como a 8 semanas (figuras 5A y 56) tras la fololransfecci6n de ARNm de la glia en neuronas de hipocampo. También se mantuvo la retracción de prolongaciones neuronales a las 8 semanas tras la folotransfecci6n (figura 5A). Por lanto, estos dalos indican Que estaba expresándose el gen de GFAP endógeno en la neurona sometida a folotransfecd6n. Por tanto, estos datos sugieren que la fololransfección de ARNm total de la gira da como resultado la activación de la expresión a largo plazo de genes subyacentes al fenotipo de células de la glla. Estos indicadores de conversión del fenotipo permanecieron en células sometidas a fololransfección durante más de 3 meses.

Se realizaron experimentos de obtención de imágenes die calcio para evaluar la captación de calcio en función de la estimulación con glutamato y la estimulación con potasi,~. Tanto los astrocitos como las neuronas tienen receptores de glutamato. La activación de los receptores de glutamato mediante la presencia de glutamato conduce a un aumento en el calcio citosólico. Sin embargo, sólo las neuronas tienen canales de calcio dependientes de voltaje (es decir, excitabilidad eléctrica). Cuando se hiperpolariza apropiadamente el potencial de membrana de una neurona mediante estimuladón eléctrica o una alta concentración de potasio, se obtiene como resultado un flujo entrante de calcio al citosol. Por tanto, puede usarse esta diferencia en la captación de calcio para distinguir fisiológicamente entre células de la astroglía y neuronas.

La figura 6A muestra dos células cargadas con un indicador de caldo fluorescente a las 3 semanas tras la fototransfección, y es una imagen representativa de la setlal de nivel inicial para las dos células. La célula 1 es una célula de control. La célula 2 se transfectó con ARNm de! astrocitos. La estimulaci6n de las células con glutamato dio como resultado la captación de calcio en ambas células (figura 68). El aumento en el gráfico de la figura 6E a aproximadamente 35 segundos es la respuesta a la estimulación con glutamato. La figura 68 es una imagen representativa de las células durante el aumento induddo por glutamato. Tras lavar las células y permitir que se recuperaran, la estimulación con un alto contenido de potasio indujo un aumento máximo y rápido (comenzando a aproximadamente 270 segundos) de la captación de calcio en la célula 1. La estimulación con alto contenido de potasio dio como resultado un aumento de calcio retraBado y limitado en la célula 2. Véanse las figuras 6C y 6E. Tras eliminarse el potasio mediante lavado, ambas célufas volvieron a la senal de nivel inicial (figura 60), indicando que las estimulaciones no eran tóxicas para las células.

El aumento de la captación de calcio observado en la dllula 1 se espera si una célula tiene un fenotipo neuronal. El resultado en la célula 2 contrasta notablemente. La captación de calcio retrasada y limitada en la célula 2 indica la reducción del número o la ausencia de canales de calcio dependientes de voltaje. Por tanto, estos datos demuestran que las células transfectadas presentan, de hecho, receptores de glutamato funcionales (figura 68), sin embargo una característica importante del fenotipo neuronal ha cambiado en la célula 2: la pérdida de canales de calcio dependientes de voltaje (figura 6e y 6E).

Estos datos indican que un fenotipo multigénico en un primer tipo de célula puede inducirse en un segundo tipo de célula mediante folotransfección de ARNm de la primera célula a la segunda célula según la invención. La conversión de fenotipo es estable durante meses, lo que indica que el perfil de expresión génica en la célula receptora se convierte de manera estable en el perfil de ,expresión de la célula donante de ARNm y se mantiene.

Ejemplo experimental 2: Neuronas sometidas a fototransfección con ARNm de cardiomiocitos neonatales

Se prepararon neuronas de hipocampo de rata como células receptoras tal como se describió en el ejemplo experimental 1. Se obtuvo ARNm a partir de cardiomiocnos neonalales de rata esencialmente tal como se describió anteriormente. Se fototransfectaron neuronas tal como se describió en el ejemplo experimental 1. Seis (6) horas tras la fotolransfección, se retiraron las neuronas sometidas a fololransfecci6n de medio neural basaVB27 a OMEMlFBS al 10%, un medio adecuado para el cultivo de cardiomiocitos. Siete (7) dias tras la fototransfección, se transfirieron las neuronas sometidas a fototransfección a medio OMEOIFBS aI10%/suplementado con G5.

Ejemplo experimental 3: Fibroblastos sometidos a fototransfección CQn ARNm de células ES positivas para nestina

Se prepararon fibroblastos de ratón como células rece,ptoras esencialmente tal como se describió en el ejemplo experimental 1. Se preparó ARNm a partir de células madre embrionarias de ratón positivas para nestina esencialmente tal como se describió en el ejemplo experimental 1. Se fototransfectaron fibroblastos lal como se describió en el ejemplo experimental 1, sin embargo, se crearon poros en 64 (8X8) puntos a 55 mW cada uno. Veinticuatro (24) horas tras la fotOlransfecci6n, se movi,eron los fibroblastos sometidos a fototransfecd6n de medio OMEM (sin piruvalo de sodio)IFBS al 10% a medio DMEMlF121suplementado con N2/ácido ascórbico, que es adecuado para cultivar células ES.

Ejemplo experimental 4: Fibroblastos sometidos a fototransfecdón con ARNm de astrocitos

Se prepararon fibroblastos de ratón como células receptoras esencialmente tal como se describió en el ejemplo experimental 1. Se preparó ARNm a partir de astrocnos de ratón esencialmente tal como se describió en el ejemplo experimental 1. Se fototransfectaron fibroblastos tal como se describió en el ejemplo experimental 1, sin embargo, se crearon poros en 64 (8X8) puntos a 55 mW cada uno. Seis (6) horas tras la fototransfección, se movieron fibroblastos sometidos a fototransfección de medio OMEM (sin piruvato de sodio)IFBS al 10% a medio OMEM/FBS al 10%.

Aunque se ha dado a conocer la invend6n con referencia a realizaciones especificas, resuHa evidenle que olros expertos en la técnica pueden diset'iar olras realizaciones y variaciones de esta invenci6n.

Claims (19)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Método in vitro de transferencia de un fenotipo mulligénico a una célula, comprendiendo dicho método irradiar dicha célula con un láser, en el que se baña dicha célula en un medio fluido que comprende dos o más ácidos nudeicos aislados diferentes que tienen dos o más secuencias de nudeótidos diferentes, en el que al menos un ácido nucleico aislado es ARNm, en el que dicho láser crea un poro en una membrana celular de dicha célula y dichos ácidos nucleicos entran en dicha célula, y en el que dicho ARNm se expresa por dicha célula, transfiriendo asi un fenotipo multigénico a una célula.

2. 2.

   Método según la reivindicación 1, en el que dictloS ácidos nucleicos aislados comprenden al menos un ARN seleccionado del grupo que consiste en ARNip, miARN, ARNnh, ARNt y combinaciones de los mismos.

3. 3.

   Método según la reivindicación 1, en el que dicha célula se selecciona del grupo que consiste en una célula eucariota y una célula procariota.

4. 4.

   Método según la reivindicación 3, en el que dicha célula eucariota no es una célula de mamífero.

5. 5.

   Método según la reivindicación 1, en el que dicha célula es una célula vegetal.

6. 6.

   Método según la reivindicación 1, en el que dicha célula es un protozoo.

7. 7.

   Método según la reivindicación 1, en el que dichos acidos nucleicos se aislan a partir de una célula.

8. 8.

   Método según la reivindicación 1, en el que dichos ácidos nucleicos aislados se preparan mediante un método seleccionado del grupo que consiste en aislamiento de ARNm a partir de una célula, transcripción in vitre o slntesis qulmica.

9. 9.

   Método según la reivindicación 1, en el que dichos ácidos nucleicos codifican para dos o más polipéptidos diferentes.

10. 10.

    Método según la reivindicación 1, en el que did10s ácidos nucleicos aislados comprenden una combinación de ARN Y AON.

11. 11 . Método según la reivindicación 1, en el que di,ehos ácidos nucleicos aislados comprenden una mezda de ARN diferentes que codifican para dos o más polipéptidos diferentes, en el que la abundancia relativa de cada ARN diferente es esencialmente la misma que la abundancia relativa de cada ARN diferente en una segunda célula que está en un estado fisiológico diferente del de la célula irradiada.

12. 12.

    Método según la reivindicación 9, en el que dichos ácidos nucleicos aislados comprenden además un ácido nudeico inhibidor.

13. 13.

    Método según la reivindicación 1, en el que dicho táser es un láser de titanio-zafiro.

14. 14.

    Método según la reivindicación 1, en el que dictlo medio fluido es un liquido.

15. 15.

    Método según la reivindicación 1, en el que dic~la célula se batla con dicho medio fluido que comprende dos

    o mas acidos nucleicos aislados en una ubicación diferenciada sobre la superficie de la célula.

16. 16.

    Método según la reivindicación 1, en el que la célula comprende una dendrita.

17. 17.

    Método según la reivindicación 14, en el que dicho láser es un láser de titanio-zafiro.

18. 18.

    Método según la reivindicación 14, en el que dicho medio fluido es un liquido.

19. 19.

    Método según la reivindicación 14, en el que dicha célula es una célula individual.