RU2614269C2 - Способ введения диэлектрического микроконтейнера в клетку млекопитающего с использованием фемто-пикосекундных импульсов лазерного излучения - Google Patents

Способ введения диэлектрического микроконтейнера в клетку млекопитающего с использованием фемто-пикосекундных импульсов лазерного излучения Download PDF

Info

Publication number
RU2614269C2
RU2614269C2 RU2015129870A RU2015129870A RU2614269C2 RU 2614269 C2 RU2614269 C2 RU 2614269C2 RU 2015129870 A RU2015129870 A RU 2015129870A RU 2015129870 A RU2015129870 A RU 2015129870A RU 2614269 C2 RU2614269 C2 RU 2614269C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
dielectric
microcontainer
cell
wavelength
femto
Prior art date
Application number
RU2015129870A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2015129870A (ru
Inventor
Артем Александрович Астафьев
Александр Михайлович Шахов
Андрей Николаевич Костров
Алина Анатольевна Осыченко
Виктор Андреевич Надточенко
Original Assignee
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической физики им. Н.Н. Семёнова Российской академии наук (ИХФ РАН)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической физики им. Н.Н. Семёнова Российской академии наук (ИХФ РАН) filed Critical Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической физики им. Н.Н. Семёнова Российской академии наук (ИХФ РАН)
Priority to RU2015129870A priority Critical patent/RU2614269C2/ru
Publication of RU2015129870A publication Critical patent/RU2015129870A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2614269C2 publication Critical patent/RU2614269C2/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/16—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
    • C12N5/16—Animal cells

Landscapes

  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Lasers (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для введения сферического диэлектрического микроконтейнера, несущего определенный генетический материал, такой как ДНК или РНК, в клетки млекопитающих. Создают оптическую ловушку для микроконтейнера с использованием сфокусированного лазерного излучения с длиной волны 830 нм. Осуществляют приведение микроконтейнера в соприкосновение с клеточной мембраной путем облучении его цугами импульсов лазерного излучения с длиной волны 780 нм с последующим разрезанием клеточной мембраны сфокусированными лазерными импульсами и контролируемым вводом с использованием оптической ловушки микроконтейнера в клетку. Изобретение позволяет доставить микроконтейнер, несущий генетический материал, в заданную координату клетки млекопитающего с высокой точностью. 3 з.п. ф-лы.

Description

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способам введения сферических диэлектрических микроконтейнеров, несущих определенный генетический материал, такой как ДНК или РНК, в клетки млекопитающих (в том числе в эмбрионы).
Известен (RU, патент 2079554, опубл. 20.05.1997) способ введения биологического материала в живую клетку потоком газа под давлением, включающий предварительное культивирование клеток и внедрение биологического материала, связанного с частицами носителя, в клетки. Связывание биологического материала осуществляют посредством фиксирования его в объеме несущей среды от 0,5 микролитра до 1000 микролитров, несущие частицы имеют диаметр в пределах от 0,1 микрона до 100 микрон, в предпочтительном варианте от 0,5 микрона до 5 микрон. В общем случае, несущие частицы имеют плотность в области от 1 г/см3 до 25 г/см3, в предпочтительном варианте от 10 г/см3 до 25 г/см3.
Известный способ не может обеспечить доставку одного микроконтейнера с генетическим материалом в конкретную клетку с заданной координатой. Возможна только случайная доставка.
Известен также (RU, патент 2510826, опубл. 10.04.2014) способ введения siRNA в клетки фотохимической интернализацией. Известный способ включает контактирование указанной клетки, в том числе и млекопитающих, с молекулой siRNA, носителем и фотосенсибилизирующим веществом и облучение клетки излучением с длиной волны, эффективной для активации фотосенсибилизирующего вещества. Носитель содержит катионный полиамин, выбранный из липополиамина в нелипосомальном составе, разветвленного полиэтиленимина, полимера бетациклодекстринамина, молекулы дендримера РАМАМ и катионного пептида, выбранного из полиаргинина или сополимеры L-или D-аргинина. Способ используют для ингибирования экспрессии гена-мишени, получения клетки или популяции клеток, содержащей молекулы siRNA, а также для лечения или профилактики заболевания, в случае которого может быть полезным подавление одного или нескольких генов, в том числе для лечения злокачественной опухоли.
Известный способ не может обеспечить доставку одного микроконтейнера с генетическим материалом в конкретную клетку с заданной координатой. Возможна только случайная доставка.
Наиболее близким аналогом разработанного способа можно признать Terakawa М et al. Dielretric microshere mediated transfection using a femtosecond laser. Optics Letters, 2011, v. 36, N 15, p. 2877-2879. Согласно известному способу на свободно плавающие микроконтейнеры воздействуют фемто-пикосекундными импульсами лазерного излучения, при этом микроконтейнеры перемещаются в произвольном направлении, случайным образом соприкасаясь с клетками млекопитающих, т.е. клетки случайным образом «засевают» микроконтейнерами.
Известный способ не может обеспечить доставку одного микроконтейнера с генетическим материалом в конкретную клетку с заданной координатой. Возможна только случайная доставка.
Техническая задача, решаемая посредством разработанного способа, состоит в расширении ассортимента методов трансфекции.
Технический результат, достигаемый при реализации разработанного способа, состоит в достижении возможности доставки единичного микроконтейнера в конкретную клетку с заданной координатой.
Для достижения указанного технического результата предложено использовать разработанный способ введения диэлектрических микроконтейнеров в клетки млекопитающих с использованием фемто-пикосекундных импульсов лазерного излучения.
Согласно разработанному способу диэлектрическую микросферу приводили в соприкосновение с клеточной мембраной и облучали цугами фемтосекундных импульсов титан-сапфирового лазера с длиной волны 780 нм, длительностью 30 фс, частотой повторения 1 кГц и энергией порядка 100 нДж, фемтосекундные импульсы фокусировались диэлектрической микросферой в области ближнего поля вблизи диэлектрической микросферы и производили локальное разрезание клеточной мембраны, затем методом оптического захвата с использованием сфокусированного лазерного излучения с длиной волны 830 нм диэлектрическую микросферу сквозь полученный разрез вводили внутрь клетки.
При реализации способа используют диэлектрический микроконтейнер, который может содержать генетический материал или любое физиологически активное вещество.
Обычно, но не обязательно, используют диэлектрический микроконтейнер сферической формы диаметром около 1 мкм.
Для создания оптической ловушки лазерное излучение предпочтительно фокусируют с использованием микроскопа.
В дальнейшем разработанный способ будет раскрыт с использованием примера реализации.
В рассматриваемом примере использованы диэлектрические микроконтейнеры - микросферы полистирола (Spherotech, Cat. No. АР-10-10). В качестве генетически активного вещества использовали плазмид pEFGFP. Вектор был получен на основе коммерчески доступного вектора pcEGFPCl (Invitro gen, США), несущего ген устойчивости к селективному антибиотику неомицину. Последовательность промотора фактора элонгации PEF1A была получена из вектора pBudCE4.1 с использованием рестрикции по сайтам NheI/XhoI и клонирована по липким концам в промежуточный вектор pSPT18. Конечный вектор рестрицирован BgIII/HindIII, при этом был вырезан фрагмент промотора Р CMV. Далее pSPT18 была рестрицирована по BamHI/HindIII, а фрагмент Р EF1A клонирован в вектор pcEGFPCl по сайтам BgIII/HindIII. Введение генетической информации в микросферу осуществили путем адсорбции генетически активного вещества на поверхности диэлектрических микросфер. Раствор плазмида и диэлектрических микросфер был перемешан в шейкере. Затем раствор был помещен на 4 часа в CO2 инкубатор для адсорбции плазмида на поверхности диэлектрических микросфер. Затем раствор был центрифугирован для разделения покрытых плазмидом диэлектрических микросфер и несвязанного плазмида, оставшегося в растворе.
Эмбрионы для экспериментов получали от суперовулированных самок мышей линии C57BL/6, спаренных с самцами линии СВА. Суперовуляцию проводили по стандартной схеме с использованием гонадотропина сыворотки жеребых кобыл (PMSG, Intervet) и человеческого хорионического гонадотропина (hCG, Intervet). Животных умерщвляли путем дислокации шейных позвонков. Эмбрионы мыши получали путем промывания яйцевода мыши средой PBS, затем собирали эмбрионы с использованием капилляра и переносили их в среду М2. Биологические образцы после воздействия культивировали в CO2 инкубаторе с концентрацией углекислого газа 5% при температуре 37°С в четырехлуночных пластиковых чашках "Nunclon" (Nunc).
Для проведения экспериментов эмбрионы выделяли из яйцеводов суперовулированных самок на стадии 2-х бластомеров, которые культивировали in vitro до стадии 8 клеток (морула).
В данной работе в мультиплексном лазерном манипуляторе использовали инвертированный оптический микроскоп (Olympus 1X71). В поле микроскопа через объектив с высокой числовой апертурой заводили лазерное излучение от двух лазеров. Использовали объективы ЛОМО МФЛЮАР100×/1.3 или Olympus LCAchN40x/0.55Ph2.
Диэлектрическую микросферу удерживали и перемещали с использованием оптической ловушки, сформированной непрерывным излучением лазерного диода с длиной волны 830 нм, сфокусированным объективом микроскопа (40х, числовая апертура 0,75). Диэлектрическую микросферу приводили в соприкосновение с клеточной мембраной и облучали цугами фемтосекундных импульсов титан-сапфирового лазера с длиной волны 780 нм, длительностью 30 фс, частотой повторения 1 кГц и энергией порядка 100 нДж. Фемтосекундные импульсы фокусировались диэлектрической микросферой в области ближнего поля вблизи диэлектрической микросферы и производили локальное разрезание клеточной мембраны. Затем методом оптического захвата диэлектрическую микросферу, обладающую генетической информацией, сквозь полученный разрез вводили внутрь. Перемещение предметного столика осуществляли либо "вручную", либо с использованием позиционных пьезодвигателей, причем, в последнем случае, обеспечивалась точность перемещений, равная десяти нанометрам. Визуальный контроль осуществляли с использованием видеокамеры (Sony ExwaveHAD). Далее эмбрионы культивировали в четырехлуночных планшетах в среде Ml6 до стадии бластоцисты.
Таким образом, из приведенных примеров видно, что предлагаемый способ позволяет воздействием лазерного облучения проводить успешное введение микроконтейнера с генетической информацией внутрь мышиного эмбриона. Культивирование invitro полученных экспериментальных эмбрионов до стадии бластоцисты (вплоть до вылупляющихся и вылупившихся бластоцист) подтверждает их жизнеспособность.
Кроме того, дополнительным преимуществом разработанного способа следует признать высокую скорость проведения операции - операция занимает не более 2 мин без оптимизации отдельных стадий по времени, причем время операции может быть существенно сокращено за счет оптимизации.
Приведенный пример доказывает достижение указанного технического результата.

Claims (4)

1. Способ введения диэлектрического микроконтейнера в клетку млекопитающих с использованием фемто-пикосекундных импульсов лазерного излучения, отличающийся тем, что в качестве микроконтейнера используют диэлектрическую микросферу, которую приводят в соприкосновение с клеточной мембраной и облучают цугами фемтосекундных импульсов титан-сапфирового лазера с длиной волны 780 нм, длительностью 30 фс, частотой повторения 1 кГц и энергией порядка 100 нДж, фемтосекундные импульсы фокусируют диэлектрической микросферой в области ближнего поля вблизи диэлектрической микросферы и производят локальное разрезание клеточной мембраны, затем методом оптического захвата с использованием сфокусированного лазерного излучения с длиной волны 830 нм диэлектрическую микросферу сквозь полученный разрез вводят внутрь клетки.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что используют диэлектрический микроконтейнер, содержащий генетический материал.
3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что используют диэлектрический микроконтейнер, содержащий физиологически активное вещество.
4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что используют диэлектрический микроконтейнер сферической формы диаметром около 1 мкм.
RU2015129870A 2015-07-21 2015-07-21 Способ введения диэлектрического микроконтейнера в клетку млекопитающего с использованием фемто-пикосекундных импульсов лазерного излучения RU2614269C2 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2015129870A RU2614269C2 (ru) 2015-07-21 2015-07-21 Способ введения диэлектрического микроконтейнера в клетку млекопитающего с использованием фемто-пикосекундных импульсов лазерного излучения

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2015129870A RU2614269C2 (ru) 2015-07-21 2015-07-21 Способ введения диэлектрического микроконтейнера в клетку млекопитающего с использованием фемто-пикосекундных импульсов лазерного излучения

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2015129870A RU2015129870A (ru) 2017-02-02
RU2614269C2 true RU2614269C2 (ru) 2017-03-24

Family

ID=58453223

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2015129870A RU2614269C2 (ru) 2015-07-21 2015-07-21 Способ введения диэлектрического микроконтейнера в клетку млекопитающего с использованием фемто-пикосекундных импульсов лазерного излучения

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2614269C2 (ru)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2399667C1 (ru) * 2009-04-10 2010-09-20 Общество С Ограниченной Ответственностью "Лаборатория Клеточных Технологий" Способ получения плюрипотентных клеток

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2399667C1 (ru) * 2009-04-10 2010-09-20 Общество С Ограниченной Ответственностью "Лаборатория Клеточных Технологий" Способ получения плюрипотентных клеток

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANTKOWIAK M. et al., Femtosecond optical transfection of individual mammalian cells, Nature Protocols, 2013, v. 8, n. 6, p. 1216-1233. *
ASHKIN A. et al., Optical trapping and manipulation of single cells using infrared laser beams, Nature, 1987, v. 330, p. 769-771. *
GEINTS Y.E. et al., Nonstationary photonic jet from dielectric microsphere, J. Quant. Spectroscop. & R.A., 2013, v. 131, p. 146-152. *
TERAKAWA M. et al., Dielectric microshepe mediated transfection using a femtosecond laser, Optics Letters, 2011, v. 36, n. 15, p. 2877-2879. *
TERAKAWA M. et al., Dielectric microshepe mediated transfection using a femtosecond laser, Optics Letters, 2011, v. 36, n. 15, p. 2877-2879. ASHKIN A. et al., Optical trapping and manipulation of single cells using infrared laser beams, Nature, 1987, v. 330, p. 769-771. WALEED M. et al., Single-cell optoporation and transfection using femtosecond laser and optical tweezers, BIOMED. OPT. EXP., 2013, v. 4, n. 9, p. 1533-1547. ANTKOWIAK M. et al., Femtosecond optical transfection of individual mammalian cells, Nature Protocols, 2013, v. 8, n. 6, p. 1216-1233. GEINTS Y.E. et al., Nonstationary photonic jet from dielectric microsphere, J. Quant. Spectroscop. & R.A., 2013, v. 131, p. 146-152. *
WALEED M. et al., Single-cell optoporation and transfection using femtosecond laser and optical tweezers, BIOMED. OPT. EXP., 2013, v. 4, n. 9, p. 1533-1547. *

Also Published As

Publication number Publication date
RU2015129870A (ru) 2017-02-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20230272427A1 (en) Intracellular delivery of biomolecules mediated by a surface with pores
US20240017097A1 (en) Sonogenic stimulation of cells
Stevenson et al. Single cell optical transfection
Mellott et al. Physical non-viral gene delivery methods for tissue engineering
US9845480B2 (en) Transcriptome transfer produces cellular phenotype conversion
Man et al. Intracellular photothermal delivery for suspension cells using sharp nanoscale tips in microwells
KR20060120178A (ko) 세포 투과화 방법 및 장치
Kohli et al. An alternative method for delivering exogenous material into developing zebrafish embryos
Guo et al. Photonic Nanojet‐Mediated Optogenetics
EP2751274A1 (en) Optical based delivery of exogenous molecules to cells
Stevenson et al. Transfection by optical injection
ES2433669T3 (es) Métodos para fototransfectar ácido nucleico en células vivas
Ronchi et al. At the cutting edge: applications and perspectives of laser nanosurgery in cell biology
RU2614269C2 (ru) Способ введения диэлектрического микроконтейнера в клетку млекопитающего с использованием фемто-пикосекундных импульсов лазерного излучения
JP4681279B2 (ja) 細胞外物質の細胞内への導入方法
Liu et al. Nanochannel Electro‐Injection as a Versatile Platform for Efficient RNA/DNA Programming on Dendritic Cells
JP2023072043A (ja) 脳障害の治療用材料、脳障害の治療方法、脳の神経細胞の再生用材料、及び、脳の神経細胞の再生方法
Mahmoudi et al. Neuronal Replenishment via Hydrogel-Rationed Delivery of Reprogramming Factors
US20100216109A1 (en) Method and apparatus for drug delivery to tissue or organ for transplant
Lyu et al. Extracellular vesicle directed exogenous ion channel transport for precise manipulation of biological events
Liang et al. Labeling microglia with genetically encoded calcium indicators
JP5115686B2 (ja) 細胞への薬剤導入装置
WO2019157316A2 (en) Methods and devices for the isolation of subcellular components
US20230241166A1 (en) Ultra-sensitive step-function opsin for minimally invasive optogenetic stimulation
Numano et al. Nanoscale‐tipped wire array injections transfer DNA directly into brain cells ex vivo and in vivo

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20170722