JP2003525613A - 核酸送達用の改良ポロキサマーおよびポロキサミン組成物 - Google Patents

核酸送達用の改良ポロキサマーおよびポロキサミン組成物

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Abstract

(57)【要約】 本発明は多くの新規PINCポリマー、例えばロクサマー188（Pluronic(商標登録)F68）、ポロキサマー237（Pluronic(商標登録)F87）、ポロキサマー401（Pluronic(商標登録)L121）、ポロキサマー338（Pluronic(商標登録)F108）、ポロキサマー124（Pluronic(商標登録)L44）、ポロキサミン(Tetronics(登録商標))であって、生物に投与した場合に、核酸を分解から保護し、発現される核酸産物に対する免疫応答を向上させる、核酸の発現を増強するPINCポリマーを特徴とする。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】緒言 本発明は、タンパク質、ペプチド、アンチセンスRNA、リボザイムまたはポリ
ペプチドを発現させる目的で、好ましくはパルス電圧送達法によって核酸分子を
細胞内に導入するための新規組成物および方法に関する。本発明はインビトロト
ランスフェクション、インビボ遺伝子治療、治療タンパク質、治療ペプチドおよ
び治療ポリペプチドの投与、そしてワクチン接種に有用である。本願は、2000年
3月3日に出願された米国仮出願第60/187,236号および2000年10月20日に出願され
た米国仮出願第60/242,277号に基づく優先権を主張する（これらの仮出願は図面
も含め、参照により本明細書に記載することで全て包含されるものとする)。
【０００２】発明の背景 遺伝子治療は薬剤開発における主要な研究分野である。しかし、遺伝子治療の
商業化には、実用的かつ効果的な遺伝子の送達方法の必要性という技術的な障壁
がある。従来のニードルシリンジ法(needle-syringe methods)による遺伝子注射
には、標的に遺伝物質を大量に注射しなければならないという問題がある。
【０００３】 プラスミドの分解という課題を克服し、遺伝子のトランスフェクション効率を
高めるために、静電相互作用によりpDNAを凝集させ、pDNAを保護するカチオン凝
集剤（ポリブレン、デンドリマー、キトサン、脂質およびペプチドなど）が開発
されてきた（Therapeutic drug carrier systems 15(2)：143-198（1998）の総
説、A.P.Rolland著「遺伝子から遺伝子医学まで：非ウイルス型遺伝子送達にお
ける最近の進歩」を参照のこと）。しかし、凝集化プラスミド粒子を使ってイン
ビボで多数の筋細胞をトランスフェクトする試みは、「裸の」DNAの場合と直接
比較すると、うまくいっていない（Wolff，J.A.ら，J. Cell Sci.，103，1249，
1992を参照のこと）。
【０００４】 特定の組織に薬物を送達する割合を制御するのに、生分解性マイクロスフェア
が用いられ成功している。1992年11月3日に発行されたDeLucaら著、米国特許第5
,160.745には、生理活性高分子マイクロカプセル剤が開示されている。マイクロ
カプセルの材料としては生分解性ビニル誘導体がある。マイクロスフェアのカプ
セル化を使用することは、遺伝子送達に使用されるまでに至っている。WO007835
7（Chen，W.ら）には、ジヒドラジドで誘導体化され、核酸に架橋されて徐放性
マイクロスフェアを形成しているヒアルロン酸（HA）を含んだマトリックス、フ
ィルム、ゲルおよびヒドロゲルが開示されている。WO9524929（Boekelheide，K.
ら）には、好ましくはマイクロスフェアなどの微粒子、マイクロカプセル、フィ
ルム、インプラント、またはステントなどの装置におけるコーティングの形態で
マトリックスへの遺伝子のカプセル封入が開示されている。US特許第6048551号
（Beer，S.ら）には、ポリ(ラクチド-co-グリコリド)（PLGA）、ヒドロキシプロ
ピルメチルセルロースフタレート、セルロースアセテートフタレートおよびLudr
agit R、LおよびEシリーズのポリマーおよびコポリマーマイクロスフェアを利用
して遺伝子ベクターをカプセル封入した制御放出遺伝子送達系が開示されている
。Luo D.ら，Pharm Res 1999 Aug;16(8):1300-8には、植込み可能なポリマーマ
トリックス（EVAc：ポリ(エチレン-co-ビニルアセテート)）および注射可能なマ
イクロスフェア（PLGAおよびPLA、すなわちそれぞれポリ(D,L-ラクチド-co-グリ
コリド)コポリマーおよびポリ(L-ラクチド)）からDNAを制御送達する系の特性評
価が報告されている。マイクロスフェアは、その将来性にもかかわらず、製造上
の問題を生じ、インビボ、特に筋組織におけるDNAの放出を不利に抑制する場合
がある。
【０００５】 ポロキサマーまたはポロアミン由来のカチオン性ポリマーの使用は開示されて
いる。効率を上げるために遺伝子送達用の組成物は粒子にDNAを凝集できなけれ
ばならないという従来の知識と、カチオン性成分およびポリカチオン性成分に対
する要求は一致している。したがって、Alakhovら著、米国特許第5,656,611号に
は、遺伝子送達に不可欠なポリカチオン性セグメントを有するポロキサマーまた
はポロアミンと共有結合した、ポリヌクレオチドのポリカチオン性複合体が開示
されている。同様に、S. Davisら著、WO0051645には遺伝子送達用の正荷電ポロ
キサマーおよびポロキサミンが開示されている。
【０００６】 ポリ(N-ビニルピロリドン)（PVP)、ポリ(ビニルアルコール)（PVA)およびポロ
キサマー407などの保護性、相互作用性、非凝集性（PINC）ポリマーを使用して
、ラットの骨格筋へのプラスミド送達を増強させることが、米国特許出願番号08
/372,213、現在の米国特許第6,040,190号、および08/798,274に開示されている
（これらの図面などを含む全教示は参照により本明細書中に包含される)。
【０００７】 エレクトロポレーションによる注射はパルス電場にかけ、細胞に恒久的な傷を
与えないで、輸送用の細孔を細胞膜にあけ、それによって外来分子の導入を可能
にすることを含む技術である。エレクトロポレーション用のPINC製剤は、米国特
許出願番号09/322,602に記載されている（図面などを含むこの全教示は参照によ
り本明細書中に包含される)。電気穿孔系(electroporetic system)を使って発生
させる電気パルスを調節することで、核酸分子はこの手順中に形成される通路ま
たは細孔を介して細胞内に侵入できる。
【０００８】 近年の進歩にもかかわらず、改良された新たな核酸製剤と、遺伝子治療のため
に前記製剤を投与する方法が、今なお必要とされている。
【０００９】発明の要旨 本発明は、核酸の投与し、該核酸の生物による取り込みを増強させる組成物お
よび方法を特徴とする。インビボにおける核酸送達を増強させる有効な方策には
、細胞の核酸の取り込み（即ち、細胞中への組み込み）をさらに増加させるため
に、分解から核酸を保護し、それにより投与された核酸を標的部位で維持するこ
とがある。またインビボでの投与についても、細胞表面での核酸の有効濃度を増
加させることが、トランスフェクションの効率を増加させるだろう。好ましくは
パルス電圧装置による核酸を投与するのに用いられる本発明組成物は、生物への
インビボ投与時、または細胞培養物へのインビトロ投与時に、核酸を保護し、か
つ/または核酸の局所的な生物学的利用能を引き延ばす化合物を含む。さらに、
本発明は疾患の処置、ワクチン接種ならびに筋障害および血清タンパク質欠乏症
の処置にも適している。
【００１０】 好ましい態様について、本発明は遺伝子を筋肉内に直接投与した後の筋細胞へ
の該遺伝子の送達を増強させる多くの新規PINCポリマーを特徴とし、これには、
例えばポロキサマー124、188、237、388および401、並びにポロキサミン(Tetron
ics(登録商標))が含まれる。本発明のポロキサマーは筋繊維膜を閉じ直し、また
遺伝子をある範囲に透過させるか、あるいはプラスミドの取り込みまたは発現を
増強させる。また、ポロキサマー製剤はプラスミドにコードされた抗原に対して
生じる免疫応答を増強させるのにも有用である。
【００１１】 従って、１つの態様について、本発明は細胞に核酸分子を送達するための組成
物を特徴とする。製剤化した核酸分子として本明細書にも引用する組成物には、
（a）ポロキサマー188、ポロキサマー124およびポロキサマー401から成る群から
選択される保存性、相互作用性、非凝集性化合物、並びに（b）遺伝子産物をコ
ードする配列を含む核酸分子が含まれる。
【００１２】 PINCは、好ましくは細胞内で発現される遺伝子産物をコードする配列を含む核
酸の、インビボにおける哺乳類の細胞への送達を増強させる。多くの場合、適当
な遺伝子産物はポリペプチドまたはタンパク質である。PINCはゲルを形成しない
条件下か、または投与時、約30〜40℃にてゲル型が存在しない条件下で用いるこ
とが好ましい。このように、本組成物中にPINCは15％(w/v)またはそれ未満の濃
度で存在する。特定の好ましい態様におけるPINC濃度はさらに低く、例えば10％
またはそれ未満、8％またはそれ未満、5％またはそれ未満、あるいは1％または
それ未満である。このように本組成物は、例えば植物のプロトプラストのエチレ
ングリコールを介するトランスフェクション、または薬物または核酸送達につい
てのゲル形成において、これらの化合物を高濃度で使用する該化合物または類似
化合物の使用とは、化合物濃度および機能効果において異なっている。PINCは、
一般に幾つかの化合物がある条件下でゲルを形成し得るとしても、PINCとして用
いる条件下ではゲル型ではない。
【００１３】 その他の態様において、本発明は核酸分子を細胞に送達するための組成物を哺
乳動物に投与する方法を提供する。前記方法は、本発明の組成物を哺乳動物の組
織（例えば、筋肉または腫瘍）または間質空間(interstitial space)中に、好ま
しくは注射によって導入する工程を含む。
【００１４】 本明細書中にて用いる投与とは、細胞体または生物体内に本発明の組成物を導
入する経路を意味する。投与には、パルス電圧装置により哺乳類の身体の標的領
域（例えば筋細胞、およびリンパ節などの領域にあるリンパ細胞）に与えるよう
な、エレクトロポレーション法の使用が包含される。投与には皮内投与、腫瘍内
投与および皮下投与も包含される。その他の態様では、哺乳類の異常または疾患
、好ましくは癌を処置する方法を提供する。前記方法には、異常または疾患を患
っている哺乳動物に治療的有効量の本発明の組成物を投与する工程が含まれる。
組成物の「治療的有効量」とは、疾患または異常の症状または兆候を少なくとも
一時的に緩和もしくは改善させるのに十分な量をいう。したがってこの量は、薬
理学的作用を引き起すのに十分な量でもある。この組成物量は、恒久的な改善ま
たはあらゆる症状もしくは徴候の改善を引き起す必要はない。
【００１５】 本発明はPINC化合物と核酸分子とを組み合わせて本発明組成物を製造する方法
もまた特徴とする。
【００１６】 さらなる他の態様において、本発明は生物、好ましくは植物または哺乳動物、
より好ましくはヒトに核酸分子を送達する方法もまた特徴とする。本方法には、
本組成物のパルス電圧送達が起こるような構成および配置を持つ装置を使って、
生物の細胞に本発明の組成物を与える工程を含む。
【００１７】 好ましい態様において、本方法は抗体応答、免疫応答、体液性免疫応答、T細
胞媒介型免疫応答、予防的免疫応答または治療的免疫応答を引き起こす。
【００１８】 好ましい態様における送達装置は、本発明の組成物をパルス電圧によって細胞
に送達するエレクトロポレーション装置であり、および／または本発明組成物の
送達には細胞を電場にさらすことが含まれる。
【００１９】 キットもまた本発明の特徴である。このキットには、本発明組成物を提供する
ための容器と、（ｉ）本発明組成物を生物の細胞に送達するためのパルス電圧装
置であって、前記容器と組み合わせることができるパルス電圧装置、または（ii
）パルス電圧装置を使って本発明組成物を送達する方法を説明した説明書のいず
れかが含まれる。
【００２０】 このように「容器」には、当業者が本発明組成物を調製できるように記載され
た説明書を含ませることができる。前記説明書には核酸分子を製剤化するために
使用される化合物を調製する工程が記載されるだろう。また、前記説明書には、
エレクトロポレーション後の注射の際に、核酸分子が損傷を受けているかどうか
を確定するのを伴う本発明組成物の試験方法も含まれるだろう。またこのキット
にはFDAが承認した用途の通知および説明書を含めることもできる。
【００２１】 本発明のキットを製造する方法も提供する。この方法には、本発明組成物を提
供するための容器を、（i）生物の細胞に本発明組成物を送達するためのパルス
電圧装置であって、前記容器と組み合わせることができるパルス電圧装置、また
は（ii）パルス電圧装置を使って本発明組成物を送達する方法を説明した説明書
のいずれかと組み合わせる工程が含まれる。
【００２２】 本発明は癌または感染性疾患を患っている哺乳動物の処置方法も提供する。こ
の方法は、哺乳動物の細胞に対する本発明組成物のパルス電圧送達が起こるよう
な構成および配置を持つ装置を使って、核酸分子が癌抗原または感染性疾患の抗
原をコードする本発明組成物を該哺乳動物の細胞に与える工程を含む。
【００２３】 好ましい態様について、癌抗原はMAGE 1であり、癌はメラノーマであり、およ
び／または感染性疾患の抗原はHBVコア抗原であり、そして感染性疾患は慢性肝
炎である。
【００２４】 上述のように、核酸を好ましくはパルス電圧送達法によって投与するために使
用される本発明組成物には、生物へのインビボ投与時または細胞培養物へのイン
ビトロ投与時に、核酸を保護し、かつ/または核酸の局所的な生物学的利用能を
引き延ばす化合物が含まれる。
【００２５】 本組成物は核酸分子の細胞へのインビボ送達に役立つために、関連する一側面
として、本発明はインビボ投与部位に組成物を提供する。特にこれには、哺乳動
物のインビボ部位が含まれる。
【００２６】 本発明は上述した要旨に限定されるものではなく、本発明の他のさらなる目的
、特徴および利点は、以下に述べる現在好ましい本発明の態様の詳細な説明およ
び特許請求の範囲から明らかになるだろう。
【００２７】 図面は必ずしも大きさに対応しているわけではない。本発明の特定の特徴は
一定の尺度において強調するか、または明瞭かつ簡潔にするために図式に示すこ
とができる。
【００２８】好ましい態様の詳細な説明 真核細胞、特に哺乳動物のインビボにおけるベクター上のコード配列の送達お
よび発現は、例えばトランスフェクション効率およびトランスフェクト細胞にお
けるコード配列の寿命などといった様々な因子に依存する。そこで、そのような
送達を達成する方法が、数多く報告されている。
【００２９】 「送達」とは所望の細胞または任意の細胞への核酸分子の輸送を意味する。核
酸分子は所望の標的を含む複数の細胞系に送達することができる。送達により、
核酸分子は細胞表面、細胞膜、細胞エンドソーム、細胞膜内、核もしくは核内ま
たは細胞の他の任意の望ましい領域と接触し、そこから様々な細胞系（例えば腫
瘍細胞、上皮細胞、ランゲルハンス細胞、ラングハンス細胞、沿岸細胞、ケラチ
ノサイト、樹状細胞、マクロファージ細胞、クッパー細胞、筋細胞、リンパ球お
よびリンパ節などが挙げられるが、これらに限らない）内でトランスフェクショ
ンが起こりうる。本発明の組成物はエレクトロポレーションによって細胞に送達
され、核酸分子成分が送達時にあまり剪断されず、細胞の生存度もパルス電圧送
達過程によって直接的な影響は受けないことが好ましい。
【００３０】 「核酸」とは、RNAとDNAの両方を意味し、cDNA、ゲノムDNA、プラスミドDNAま
たは凝集化核酸、カチオン性脂質と共に製剤化された核酸、ペプチド、カチオン
性ポリマー、RNAまたはmRNAと共に製剤化された核酸を包含する。好ましい一態
様では、投与される核酸は、「ベクター」を含むプラスミドDNAである。核酸は
、潜在的に治療作用を持つタンパク質、例えばhGH、VEGF、DEL-1、EPO、IGF-I、
TPO、第IX因子、IFN-α、IFN-β、IL-2、Il-12などを発現させる真核プロモータ
ーを持つプラスミドDNAベクターの場合がある（ただしこれに限るわけではない
）。
【００３１】 本明細書で使用する「プラスミド」という用語は、遺伝物質（すなわち核酸）
から構成される構築物を意味する。これには、挿入されたコード配列が真核細胞
内で転写されうるように配置された遺伝要素が含まれる。また、プラスミドはウ
イルス核酸由来の配列を含んでもよいが、そのようなウイルス配列はウイルス粒
子へのプラスミドの組込みを引き起さないことが好ましく、それ故プラスミドは
非ウイルスベクターである。プラスミドは閉じた環状DNA分子であることが好ま
しい。
【００３２】 本明細書で使用する「ベクター」という用語は、標的細胞の形質転換を目的と
して設計された遺伝物質を含む構築物を指す。ベクターは、トランスフェクト細
胞での核酸の転写と、要すれば翻訳とが起こりうるように、他の必要な要素との
位置関係および順序関係が調整された複数の遺伝物質、好ましくは連続したDNA
またはRNAの断片を含む。「ベクター」は、好ましくは、治療産物（群）をコー
ドする配列を含むと共に、転写、翻訳、転写物の安定性、複製および当技術分野
で知られている他の機能についての様々な調節要素を含む核酸分子である。ベク
ターは、好ましくは、ベクター中に含まれる核酸配列によってコードされる産物
の産生を可能にする。例えば、ある遺伝子によってコードされるある増殖因子タ
ンパク質の発現である。ベクターはDNAベクターまたはウイルスベクターの場合
がある。「DNAベクター」は本来の形態がDNA分子であるベクターである。「ウイ
ルスベクター」は本来の形態がウイルス粒子のゲノム物質であるベクターである
。
【００３３】 「翻訳後プロセッシング」は、発現した遺伝子産物に対してなされる修飾を意
味する。この過程には、炭化水素、脂質、無機化合物または有機化合物などの側
鎖付加、標的シグナルまたはポリペプチド要素の開裂、および例えばミトコンド
リア、核または膜などの細胞の特定の区画における遺伝子産物の位置決めが含ま
れ得る。ベクターには直鎖または環状構造の１つまたはそれ以上の遺伝子を含ま
せることができる。また、ベクターには遺伝子産物の産生、製造または分析に関
与するプラスミド骨格または他の要素を含ませることもできる。
【００３４】 本発明の化合物および組成物に関連して、「保護」という用語は、核酸分解の
速度が特定の環境において減少するような、当該化合物と核酸との相互作用効果
を意味する。このような分解は種々様々な因子によりもたらされ、具体的にはヌ
クレアーゼの酵素活性がある。保護作用は、種々の様式、例えばヌクレアーゼ分
子の排除または水の排除によりもたらされ得る。
【００３５】 本明細書で使用する「相互作用」という用語は、PINCおよび核酸分子および／
または細胞壁成分との相互作用を意味する。PINCポリマーは核酸分子の一部およ
び／または細胞壁成分と直接的に相互作用できることが好ましい。この相互作用
は、例えばPINCと細胞壁との生物学的相互作用によって核酸分子−PINC複合体を
細胞壁に密接に結び付け、それによりトランスフェクションを媒介するのを補助
することで、トランスフェクションおよび／または形質転換を容易にすることが
できる。また、この相互作用は、核酸分子と密接に会合することでヌクレアーゼ
に対する保護を与えることができる。
【００３６】 本明細書で使用する「トランスフェクション」という用語は、DNA（例えば製
剤化されたDNA発現ベクター）を細胞内に導入することによって、細胞を形質転
換させる過程を指す。細胞への進入後、トランスフェクトされたDNAは（1）宿主
のDNAと組換えを起こすか；（2）プラスミドまたは溶原性ファージとして独立し
て複製するか；または（3）排除されるまで複製することなくエピソームとして
保持されるだろう。
【００３７】 本明細書で使用する場合、「形質転換」とは、細胞がベクターを取り込むこと
によって誘導される細胞の特徴（発現された表現型）の一過性のまたは恒久的な
変化を指す。遺伝物質は、特定の遺伝子産物を発現させるか、または内因性遺伝
子産物の発現もしくは効果を変化させるような形で細胞内に導入される。細胞の
形質転換はタンパク質およびRNAを含む様々な遺伝子産物の産生を伴いうる。こ
れらの産物は細胞内または細胞外構造要素、リガンド、ホルモン、神経伝達物質
、成長調節因子、酵素、ケモタキシン、血清タンパク質、受容体、低分子量化合
物の運搬体、薬物、免疫調節剤、癌遺伝子、サイトカイン、腫瘍抑制因子、毒素
、腫瘍抗原、抗原、アンチセンス阻害剤、三本鎖形成性阻害剤、リボザイムとし
て機能するか、または細胞構造上の特定の構造決定基を認識してその活性を変化
させることを目的とするリガンドとして機能しうる。上記のリストは一例に過ぎ
ず、限定を意味するものではない。
【００３８】 本組成物の保護性、相互作用性、非凝集性化合物と関連して、「非凝集性」と
いう用語は、本組成物で用いられる濃度で、PINCとの相互作用によって会合した
核酸が凝集または崩壊しないことを意味する。したがって、該PINCは凝集性ポリ
マーとは型および／または濃度において異なっている。共通して用いられる凝集
性ポリマーの例としては、ポリリシンおよびカスケードポリマー（球形ポリカチ
オン(spherical polycation)）などがある。
【００３９】 「遺伝子産物」とはベクターによってコードされた産物を意味する。遺伝子産
物の例としては、翻訳用のmRNAテンプレート、リボザイム、アンチセンスRNA、
タンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質、リンタンパク質およびポリペプチ
ドが挙げられる。遺伝子産物をコードする核酸配列および／またはPINC化合物に
は、効果的な標的化送達を達成するための標的リガンドを会合させることができ
る。
【００４０】 標的リガンドおよびPINCの会合と関連して、「結合する」という用語は、物理
的会合が熱力学的に好ましく、これは、その会合の自由エネルギー関数が少なく
とも極小となるように、お互いが部分的に相互作用することを意味する。このよ
うな相互作用には、共有結合、またはイオン結合、水素結合、ファンデルワール
ス相互作用、疎水性相互作用などの非共有相互作用、およびこのような相互作用
の組み合わせが伴いうる。
【００４１】 「取り込み」とは細胞外区画から細胞内区画へのベクターの移行を意味する。
これには受容体を介する過程、細胞膜との融合、エンドサイトーシス、ポトサイ
トーシス、飲作用または他の移行機構が伴いうる。ベクターは取り込まれうる。
【００４２】 「細胞内輸送」とは、取り込まれた位置から遺伝子産物の発現が行なわれる核
への、細胞内におけるベクターの移行を意味する。あるいは、例としてT7ポリメ
ラーゼ系を利用することで、細胞質での核酸構築物の発現を達成することができ
る。細胞内輸送の種々の工程には、エンドソーム放出、および種々の核外区画内
でのベクターの区画化、そして核侵入が含まれる。
【００４３】 「エンドソーム放出」とは、エンドサイトーシス後にベクターがエンドソーム
から出ることを意味する。これは核のベクターの輸送における本質的かつ強力な
律速段階である。溶解ペプチドをこの過程における補助に用いることができる。
【００４４】 「溶解ペプチド」とは、単独またはその他の化合物との組み合わせにより機能
し、膜の細胞区画、具体的にはリソソーム区画またはエンドソーム区画を透過し
、他の細胞区画、例えば細胞質基質区画および／または核区画などへ、該区画の
成分を流出させることができるペプチドを意味する。
【００４５】 「区画化」とは、限定された細胞外または細胞内の空間内にて、ベクターを異
なる区画に分配することを意味する。重要な細胞外区画には、例えば血管スペー
ス、毛包、間質液、関節液、脳髄(cerebral spinal)液、甲状腺卵包液などが含
まれ得る。重要な細胞内区画には、エンドソーム、ポトソーム(potosome)、リソ
ソーム、二次リソソーム、細胞質顆粒、ミトコンドリアおよび核などが含まれ得
る。
【００４６】 「核侵入」とは、核膜を横切って遺伝子が転写され得る核内へのベクターの移
行を意味する。
【００４７】 「排出」とは、長期にわたる物質（ベクター、転写物、遺伝子産物）の特定の
区画からの除去または一掃を意味する。この用語は身体、脈管区画、細胞外区画
または細胞内区画からの排出を反映して用いることができる。排出には特定の区
画からの移行（排泄）または体内変換（分解）が含まれる。
【００４８】 PINCは哺乳類の細胞への核酸分子のインビボ送達を増強し、該核酸分子は該細
胞にて発現される遺伝子産物のコード配列を含むことが好ましい。多くの場合、
適当な遺伝子産物はポリペプチドまたはタンパク質である。PINCは、PINCがゲル
を形成しない条件または約30〜40℃での投与時にゲル型の存在しない条件下にて
用いられることが好ましい。したがって、PINCは本組成物において15％（w/v）
またはそれ未満の濃度で存在する。特定の好ましい態様について、PINC濃度はさ
らに低く、例えば10％またはそれ未満、8％またはそれ未満、5％またはそれ未満
、あるいは1％またはそれ未満である。このように本組成物は、例えば植物のプ
ロトプラストのエチレングリコールを介するトランスフェクション、または薬物
または核酸送達についてのゲル形成において、これらの化合物を高濃度で使用す
る該化合物または類似化合物の使用とは、化合物濃度および機能効果において異
なっている。PINCは、一般に幾つかの化合物がある条件下でゲルを形成し得ると
しても、PINCとして用いる条件下ではゲル型ではない。
【００４９】 本明細書で使用する「パルス電圧装置」または「パルス電圧注射装置」という
用語は、細胞に局所的な電気パルスを放出することにより、細胞膜を不安定化さ
せ、細胞膜に通路または細孔を形成させ、生物の細胞への核酸分子の取り込みを
引き起す能力を持つ機器、またはそのような取り込みを引き起す機器を表す。言
うまでもなく、このタイプの従来装置は、所望の電圧強度および/またはパルス
電圧の持続時間を当業者が選択および/または調節できるように校正できるので
、この機能を果たすこの先の装置も同様に校正できるとが期待される。注射装置
のタイプが本発明の側面を限定するものとは見なされない。実際、パルス電圧装
置の最も重要な点は、生物の細胞への本発明組成物の送達するというその装置の
能力である。パルス電圧注射装置としては、例えば米国特許第5,439,440号、米
国特許第5,704,908号もしくは米国特許第5,702,384号に記載のエレクトロポレー
ション機器またはPCT WO96/12520、PCT WO96/12006、PCT WO95/19805およびPCT
WO97/07826に公開されたエレクトロポレーション機器などを挙げることができる
（これらの全教示は参照により本明細書中に包含される）。
【００５０】 明細書で使用する「機器」という用語は、組み合わせた時に、パルス電圧送達
法によって、生物の細胞に本発明組成物の送達を可能にする一組の部品を表す。
本発明の機器は、1つまたは複数のシリンジ、様々な組合わせの電極、光ファイ
バーおよびビデオモニタリングなどの手段による標的の選択に役立つ装置、電圧
パルスを発生する起電装置であって、様々な電圧強度、持続時間および周期を校
正することができる装置の組合わせの場合がある。シリンジには様々なサイズが
あり、例えば哺乳動物などの生物の皮膚に対して、または皮膚を通じて、本発明
組成物が種々の送達深度で注射されるように選択することができる。
【００５１】 「皮膚」という用語は、上皮組織および真皮組織、並びに汗管および毛包など
の付属器から成る哺乳動物の外側の被覆を意味する。皮膚には、哺乳動物が毛に
覆われた上皮を有する場合には、哺乳動物の毛も含まれ得る。柔毛または毛皮と
みなすのに十分な毛を有する哺乳動物については、剃毛し、おおむね皮膚とする
ことが好ましい。
【００５２】 本明細書で使用する「生物」という用語は、当業者が一般に用いている意味を
表す。生物には、酵母または細菌などの微生物、植物、鳥類、は虫類、魚類また
は哺乳類を含めることができる。生物は伴侶動物(コンパニオンアニマル)または
家畜であってもよい。好ましくは生物は哺乳動物であり、したがって任意の温血
動物である。より好ましくは哺乳動物はヒトである。
【００５３】 本明細書で使用する「伴侶動物」という用語は、従来から「ペット」として扱
われている動物、例えばイヌ、ネコ、ウマ、鳥、は虫類、マウス、ウサギ、ハム
スターなどを指す。
【００５４】 本明細書で使用する「家畜」という用語は、従来から家畜化された動物と見な
されてきた動物を指し、ブタ、ニワトリ、アヒル、ウシ、ヤギ、子ヒツジなどの
動物と共に、「伴侶動物」とみなされる動物なども、これに含まれる。
【００５５】 本明細書にて用いる「免疫応答」とう用語は、外来物質が内部移行した場合に
生じ得る哺乳類の天然の防御機構を意味する。この免疫応答は免疫系全体の構成
成分を含む免疫応答の全体でありうる。免疫応答は組成物中の核酸分子によって
コードされたタンパク産物に起因することが好ましい。免疫応答は抗体産生、T-
細胞増殖／分化、細胞毒性T-リンパ球の活性化、および／またはナチュラルキラ
ー細胞の活性化がありうる（これらに制限されるものではない)。免疫応答は体
液免疫応答であることが好ましい。しかしながら、上記のように他の状況におい
ては、免疫応答は好ましくは、細胞毒性T-リンパ球応答である。
【００５６】 「ヒト免疫応答」という用語は、内部移行した外来物質に応答した免疫の抗体
産生を意味する。外来物質は好ましくは、針を用いない装置によって注射され、
内部移行した本発明の組成物の核酸分子によってコードされたタンパク産物であ
る。
【００５７】 「核酸の局所的な生物学的利用能を引き延ばす」とは、当該化合物を含む組成
物にて生物に投与される核酸は、当該化合物を含まない組成物にて投与される場
合、例えば食塩水などの製剤にて投与する場合よりも、長期間に渡って細胞によ
る取り込みに利用されることを意味する。この細胞に対する核酸の増大した利用
能は、例えば核酸を含む組成物と細胞との接触時間を増加させることによるか、
またはヌクレアーゼによる攻撃から核酸を保護することによって生じさせること
ができた。核酸の局所的な生物学的利用能を引き延ばす化合物は、内部投与に適
している。
【００５８】 「内部投与に適する」とは、生物の組織内、例えば筋肉内または関節腔内への
、内皮または皮下投与に化合物が適合していることを意味する。利用できる他の
投与形態には、局所的、経口、肺、鼻、および例えば頬側、膣または直腸の粘膜
がある。内部投与に適している化合物を作製する性質は、例えば全体として生物
に対して高レベルの細胞毒性がないことが挙げられるであろう。
【００５９】 「徐放化合物」とは、核酸を含む等張性食塩水（150mM NaCl）の粘度以上の粘
度を有する物体を意味する；例えば、食塩水中1mg/mlのDNAは3.01 mPasecの粘度
を有する、食塩水中2mg/mlのDNAは3.26 mPasecの粘度を有する、食塩水中3mg/ml
のDNAは5.85 mPasecの粘度を有する（粘度測定はNo.40のスピンドル(Spindle)を
備えたBrookfield DV-III Rheometerにて、25℃、75rpmで30分間行なった）。
【００６０】 「徐放」とは、粘性のない媒介、例えば食塩水にて核酸を投与することで達成
されるであろう期間よりも、核酸が長期間に渡って周辺組織または培養物中の細
胞による取り込みに利用されることを意味する。
【００６１】 徐放化合物は、溶液、懸濁液、ゲル、乳濁液、または水/油（w/o)、水/油/水
（w/o/w)、油/水（o/w)もしくは油/水/油（o/w/o)型のマイクロエマルジョンと
して調製することができる。凍結乾燥した核酸、例えばプラスミドDNAの油状懸
濁物を利用することができる。これらの油状懸濁物の担体には、ゴマ油、綿実油
、大豆油、レシチン、ツイーンズ(Tweens)、スパンズ(Spans)およびミグリオル
ズ(Miglyols)が含まれる（これらに制限されるわけではない)。
【００６２】 「溶液」とは、核酸を含む溶液中の溶解性のポリマーおよび／または界面活性
製剤を意味する。
【００６３】 「懸濁液」とは、懸濁された核酸を含む不溶性の油物を意味する。
【００６４】 「ゲル」とは、核酸を含む粘度の高いポリマーを意味する。
【００６５】 「乳濁液」とは、少なくとも２つの不混和性液体相を含む分散系を意味する。
乳濁液は通例、0.1〜100ミクロンの範囲の分散した分子である。乳濁液は典型的
に不透明であり、熱力学的に不安定である。水溶相中の核酸は、油中に分散して
、w/o乳濁液を生成することができる。このw/o乳濁液は分離した水性相中に分散
し、w/o/w乳濁液を産することができる。あるいは、適当な油が水性相中に分散
され、o/w乳濁液を形成させることができた。「マイクロエマルジョン」とは、
ミセルと乳濁液との中間の性質を有しており、均質、透明および熱力学的に安定
などの特徴を持つ。マイクロエマルジョンは油、水、界面活性剤と共界面活性剤
(cosurfactat)を一緒に混合した場合に自発的に形成される。典型的に、分散し
ている相の直径は0.01〜0.1ミクロンであり、通例w/oおよびo/w型である。
【００６６】 また、核酸の生物学的利用能を引き延ばす化合物の幾つかは、分子間力および
／または荷電子帯、例えばファンデルワールス力、イオン−双極子相互作用、イ
オン誘導性双極子相互作用、水素結合またはイオン結合によって核酸と相互作用
するか、または会合することができる。この相互作用は以下の機能： （１）核酸をヌクレアーゼから立体選択的に遮蔽して保護する； （２）「ピギーバック（piggyback）エンドサイトーシス」により核酸の細胞の
取り込みを容易にする、 を果たすことができる。ピギーバックエンドサイトーシスとは、エンドサイトー
シスによる取り込みができる、担体と複合体を形成した薬物または他の分子の細
胞による取り込みのことである。CV UgleaおよびC Dumitriu-Medvichi, 合成オ
リゴヌクレオチドの医療適用, In: Polymeric Biomaterials, Severian Dumitri
u著., Marcel Dekker, Inc., 1993を参照のこと（参照により本明細書中に包含
される)。
【００６７】 記述の所望の効果を達成するために、核酸の生物学的利用能を引き延ばす化合
物は、両親媒性の特徴を持つこと、すなわち親水性領域と疎水性領域の両方を持
つことが望ましいが、必須事項ではない。化合物の親水性領域は、核酸のイオン
領域および親水性領域と主に会合することができ、一方その化合物の疎水性領域
は、核酸の拡散を遅延させる働きをし、核酸をヌクレアーゼから保護することが
できる。加えて、化合物の疎水性領域は細胞膜と特異的に相互作用することで、
化合物のエンドサイトーシスを容易にすることができ、それにより化合物と会合
した核酸またエンドサイトーシスが容易となる。この過程で細胞周囲の核酸濃度
を増加させることができる。両親媒性の特徴を有し、一般に製薬的に許容される
と考えられ得る物質には、ポリグルタミン酸；ポロキサマー（Pluronics(商標登
録)）；ポロキサミン（Tetronics(商標登録)）がある。
【００６８】 DNA型は発現効率に影響する。したがって、DNAは好ましくは、少なくとも約80
％がスーパーコイル型であり、より好ましくはDNAは少なくとも約90％がスパー
コイル型であり、そして最も好ましくはDNAは少なくとも約95％がスーパーコイ
ル型である。組成物は好ましくは、等張性の炭化水素溶液、例えば約10％のラク
トースから実質的に成る等張性の炭化水素溶液が含まれる。核酸を保護し、およ
び／または核酸の局所的な生物学的利用能を引き延ばす化合物は、物理的、化学
的または流体力学的特徴のために、以下の効果： （１）核酸、例えばプラスミドDNAをヌクレアーゼから立体的に、粘性によるか
、または遮蔽などの他の効果により保護する； （２）核酸、例えばプラスミドDNAとの接触範囲を増大させ、細胞外マトリック
スを通じて細胞膜を越え、細胞内へと核酸を取り込ませる； （３）細胞表面において、水を排除し、核酸、例えばプラスミドDNAを濃縮する
； （４）浸透性、疎水性または溶解性効果によって細胞膜を乱すことで核酸、例え
ばプラスミドDNAの取り込みを間接的に容易にする； （５）投与部位の組織を通じて保護された核酸鎖を拡散させることで、核酸の取
り込みを間接的に容易にする； （６）エレクトロポレーションの過程の結果として形成された細胞の細孔、穴、
開口を通じて核酸分子の取り込みを間接的に容易にする、 を１つまたはそれ以上達成することができる。
【００６９】 また、核酸の生物学的利用能を引き延ばす化合物は、分子間力および／または
荷電子帯、例えばファンデルワールス力、イオン−双極子相互作用、イオン誘導
性双極子相互作用、水素結合、またはイオン結合によって、核酸と相互作用する
か、または会合することができる。この相互作用は以下の機能： （１）遮蔽により核酸をヌクレアーゼから立体選択的に保護する； （２）「ピギーバックエンドサイトーシス」による核酸の細胞による取り込みを
容易にする、 を果たすことができる。ピギーバックエンドサイトーシスとは、エンドサイトー
シスによる取り込みができる、担体と複合体を形成した薬物または他の分子の細
胞による取り込みのことである。CV UgleaおよびC Dumitriu-Medvichi, 合成オ
リゴヌクレオチドの医療適用, In: Polymeric Biomaterials. Severian Dumitri
u著. Marcel Dekker, Inc., 1993を参照のこと（参照により本明細書中に包含さ
れる)。
【００７０】 記述の所望の効果を達成するために、核酸の生物学的利用能を引き延ばす化合
物は、両親媒性の特徴を持つこと、すなわち親水性領域と疎水性領域の両方を持
つことが望ましいが、必須事項ではない。化合物の親水性領域は、核酸のイオン
領域および親水性領域と主に会合することができ、一方その化合物の疎水性領域
は、核酸の拡散を遅延させる働きをし、核酸をヌクレアーゼから保護することが
できる。加えて、化合物の疎水性領域は細胞膜と特異的に相互作用することで、
化合物のエンドサイトーシスを容易にすることができる、それにより化合物と会
合した核酸もまたエンドサイトーシスが容易となる。この過程で細胞周囲の核酸
濃度を増加させることができる。
【００７１】 両親媒性の特徴を有し、一般に製薬的に許容されると考えられ得る物質には、
以下の物質がある： ポロキサマー（Pluronics(商標登録)）；ポロキサミン（Tetronics(商標登録)）
; メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチ
ルセルロース；ヘテロプロピルサッカライド（ペクチン）；酢酸ビニルエチレン
；グリコールポリエチレン；ポリビニルピロリドン；キトサン；ポリビニルアル
コール；ポリビニルアセテート；ホスファチジルコリン（レシチン）；プロピレ
ングリコール；ミグリオール；ポリ酪酸；ポリヒドロキシブチル酸；キサトンゴ
ム。また、コポリマー系、例えばポリエチレングリコール−ポリ乳酸（PEG-PLA
）、ポリエチレングリコール−ポリヒドロキシ酪酸（PEG-PHB）、ポリビニルピ
ロリドン−ポリビニルアルコール（PVP-PVA）および誘導体コポリマー、例えば
、N-ビニルプリン（またはピリミジン）誘導体およびN-ビニルピロリドンなどの
コポリマー。
【００７２】 本明細書中にて用いる「ポロキサマー」という用語は、プロピレンオキシドお
よびエチレンオキシドから成るジ−またはトリ−ブロックコポリマーを意味する
。Pluronic（商標登録）型のポロキサマーは、プロピレンオキシドブロックが２
つの酸化エチレンブロックに挟まれたトリ−ブロックコポリマーであり、以下の
一般式および構造：
【化１】 を有する。
【００７３】 逆(reverse)Pluronic（商標登録）型のポロキサマーは、以下の構造：
【化２】 を有する。
【００７４】 本明細書中にて用いる、「ポロキサミン」という用語は、ポリ(オキシエチレ
ン)−ポリ(オキシプロピレン)（POE-POP）ブロックコポリマーであって、POE-PO
P単位が他のPOE-POP単位とアミンによって連結されており、一般構造式： (POEn-POPm)2-N-C2H4-N-(POPm-POEn)2 を有しているコポリマーを意味する。BASFによって生産されているTETRONIC（商
標登録）およびTETRONIC Rの非イオン性界面活性剤が典型的なポロキサミンであ
る。TETRONIC（商標登録）904は平均分子量6,700Daの液体として供給される。TE
TRONIC（商標登録）908は平均分子量25,000Daの固体として供給される。TETRONI
C（商標登録）1107は平均分子量15,000Daの固体として供給される。TETRONIC（
商標登録）90R4は平均分子量7,240Daの液体として供給される。
【００７５】 パルス電圧送達装置の使用による本発明の組成物の送達は、遺伝子送達の新規
方法である。本発明には、製剤化された核酸分子（すなわち、本発明組成物中の
核酸分子）の特異的に標的化された細胞および細胞系による取り込み、並びに所
望の多数の細胞系による取り込みを可能にする利点がある。パルス電圧送達法に
よる製剤化された核酸分子の注射は、電気穿孔(electroporetic)過程の結果とし
て不安定化された細胞壁を介し、および／または電気穿孔過程の結果として形成
された細孔により、より直接的に製剤化された核酸分子を細胞内部に接近できる
ようにする。さらに、いくつかの場合において、細胞系を標的化することができ
、その結果従来の針注射における細胞型よりも、より多くの細胞型と接触させる
ことができる。このように、本発明は核酸分子の増強された送達を提供し、より
効率的な遺伝子送達系であって、免疫応答を引き起こすのに用いることができ、
細胞周期または細胞生理の状況を調整するのに用いることができ、または治療方
法、例えば抗腫瘍治療に関連した他の遺伝子送達関連を達成する方法を提供する
のに用い得る送達系もまた提供する。
【００７６】筋肉に対するプラスミド送達用の重合体製剤および非重合体製剤 本発明は、食塩水中に懸濁した核酸の注射に関連した課題に対処する重合体製
剤および非重合体製剤を提供する。食塩水中に懸濁された製剤化されていないプ
ラスミド（裸の核酸分子）は、細胞外ヌクレアーゼによってプラスミドが迅速に
分解されるので、筋肉における生物学的利用能が低い。この低い生物学的利用能
を克服するための可能な方法の一つは、例えばプラスミドを通常使用されるカチ
オン性錯化剤を使ってプラスミドを凝集することにより、プラスミドを迅速なヌ
クレアーゼ分解から保護することである。しかし、筋肉が持つ生理学的特徴のた
めに、プラスミドを含む堅い凝集性粒子を、多数の筋細胞に効率よくトランスフ
ェクションするのに用いることは、現在まで成功していない。カチオン性脂質お
よびポリリジンプラスミド複合体は、外側の薄膜(external lamina)を横切って
カベオラおよびT細管に接近することができない［Wolff，J.A.ら，1992，J.Cell
.Sci. 103：1249-1259]。
【００７７】 したがって本発明は、プラスミドを迅速な細胞外ヌクレアーゼ分解から保護し
、無傷のプラスミドを筋肉および/または腫瘍に分散させて保持し、筋細胞およ
び/または腫瘍細胞によるプラスミドの取り込みを容易にすることによって、筋
肉におけるプラスミドの生物学的利用能を引き延ばす（増加させる）。これを果
たす具体的方法であって、好ましくはパルス電圧送達法と併用される方法には、
保護性、相互作用性、非凝集性系（PINC）の使用がある。
【００７８】典型的な重合体徐放系 食塩水中に製剤化されたプラスミドは注射された部位から分解および／または
除去される速度が早いので、一つのストラテジーとしては、注射した部位でプラ
スミドを維持するのに粘性を増加させた系を開発することがある。さらに、プラ
スミドの取り込みは飽和し得る工程であると思われるため、筋肉におけるプラス
ミドを高濃度に長期間維持することで、筋肉におけるプラスミドの生物学的利用
能を増強させることができる [March, K. Lら, 1995, Hum. Gene Ther. 6: 41-5
3; Mathiowitz, Eら、(September 21,1995)、Polymeric gene delivery systems
WO 95/24929]。
【００７９】 別の態様においては、熱可逆ゲルを用いることができる。熱可逆ゲル製剤を用
いることで、IM投与後にプラスミドDNAを筋肉内に維持することができる。周囲
温度においては水性であるが、体温（例えばヒトについては37℃）ではゲルであ
る化合物の使用は、DNAの製剤化および投与を容易し、さらに転移して、インビ
ボで遭遇する温度にて生物学的利用能の増大したゲル状態を維持させる。
【００８０】 このような製剤（熱可逆ゲル）は、室温またはそれ未満ではベクター送達系を
液体状態であり、生理学的温度のインシチュにおける筋肉ではゲルを形成するよ
うに、ポリマーの濃度を水溶液中にて調節し製造する。ポロキサマー（PLURONIC
（商標登録）L44、F68、F87、F108、L121、F127）またはポロキサミン濃度は、
核酸または核酸複合体の投与経路（すなわち局所、i.m）に基づく製剤化に従い
調節することができる。この調節は、例えば米国特許5,292,516に見つけること
ができる（参照により本明細書中に包含される)。
【００８１】 「熱可逆ゲル」とは、約30℃より低い温度で実質的に液体であるが、約30℃を
越える温度ではゲルを形成するゲルを意味する。これにより、例えば注射による
熱可逆ゲルの投与は、注射時にゲルを冷却して実質的に液体にする場合に容易に
行なえる。しかしながら、約30℃を越える温度の生物組織との接触時には、熱可
逆ゲルの粘度は増加するので、熱可逆ゲルを用いて製剤化された核酸の局所的な
生物学的利用能は増加する（引き延ばされる)。
【００８２】保護性、相互作用性、非凝集性の（PINC）系 本明細書中に記載の情報を用いて、プラスミドとの相互作用をも増強させる新
規コポリマーを設計することができる。「機会の相互作用ウィンドウ(an intera
ctive window of opportunity)」によるPINC系の結合親和力の増強は、ヌクレア
ーゼ分解からプラスミドをより広範囲に保護できるために筋肉内注射後の遺伝子
発現をさらに増強する結果となるであろうと期待される。このことは、筋肉にお
ける生物学的利用能を減少させ、次いで遺伝子発現を減少させる結果となり得る
プラスミドの凝集または「三重」型の形成のいずれかを生じさせることのない、
最適な相互作用が存在するであろうと期待される。
【００８３】 上述のように、PINC化合物は典型的に、疎水性部分および親水性部分の両方を
持つ両親媒性化合物である。多くの場合、親水性部分は極性基によってもたらさ
れる。このような極性基は、これらに制限されないが、例えばピロリドン、アル
コール、アセテート、アミンまたはDavid R. Lide著のCRC Handbook of Chemist
ry and Physics (72版)のpp.2-73および2-74（参照により本明細書に包含される
）に見られるような複素環式基であって、ピロール、ピラゾール、イミダゾール
、トリアゾール、ジチオール、オキサゾール、(イソ) チアゾール、オキサジア
ゾール、オキサトリアゾール、ジアオキサゾール(diaoxazoles)、オキサチオー
ル、ピロン、ダイオキシン、ピリジン、ピリダジン、ピリミジン、ピラジン、ピ
ペラジン、(イソ) オキサジン、インドール、インダゾール、カルパゾール(carp
azoles)およびプリンを含む複素環式基、およびこれらの基の誘導体などの基に
よって提供されることは、当分野において認識される。
【００８４】 本化合物は、ポリマーの場合に分子の骨格鎖に典型的に含まれるが、ポリマー
でない分子の一部でもあり得る疎水基もまた含む。そのような疎水性骨格鎖の基
の例としては、これらに制限されないが、ビニル、エチル、アクリラート、アク
リルアミド、エステル、セルロース、アミド、水素化物、エーテル、カルボナー
ト、ホスファゼン、スルホン、プロピレン、およびこれらの基の誘導体が含まれ
る。種々の基の極性特徴は、例えば任意の工業有機化学教本にある極性の考察に
より例示されるように当業者には周知である。
【００８５】 また、核酸と相互作用する該分子の能力は当業者には理解され、そのような分
子内相互作用の模型をつくるコンピュータープログラムを使用して予想すること
が出来る。別法またはそのような模型作りに加えて、１）ヌクレアーゼ分解速度
の阻害決定、２）DNAのコーティングを示すDNAのゼータ電位の調整、または３）
DNAの間に介入するエチジウムブロマイドなどの相互作用物質の能力の阻害など
の試験を１つまたはそれ以上用いて、効果化合物を容易に同定することができる
。
【００８６】核酸／PINC／標的リガンド複合体の標的化送達 核酸配列の送達および発現のための上述した核酸／PINC複合体に加え、具体的
態様においては、特定の組織、細胞または細胞領域もしくは区画における発現を
優先的に得るために、標的リガンドを与えることもまた有用である。
【００８７】 このような標的化PINC複合体には、プラスミド（または他の核酸分子）と複合
したPINC系（単量体または重量体PINC化合物）が含まれる。PINC系は、リガンド
に対する親和力を有するレセプターと結合する標的リガンド（TL）と共有結合ま
たは非共有結合し（束縛され）ている。該レセプターは細胞区画表面または内部
に存在していてもよい。該標的化により、核酸の取り込みまたは細胞内輸送は増
強される。
【００８８】 標的リガンドには、これらに制限されないが、ガラクトシル残基、フコサル(f
ucosal)残基、マンノシル残基、カルニチン誘導体、モノクローナル抗体、ポリ
クローナル抗体、ペプチドリガンドおよびDNA結合タンパク質が含まれる。有効
に標的化され得る細胞の例としては、これらに制限されないが、抗原を提示する
細胞、肝細胞、筋細胞、上皮細胞、内皮細胞、および癌細胞が含まれる。
【００８９】 このような標的化複合体の形成について、PINC系と共有結合した標的リガンド
（TL）を例として以下に説明する： TL-PINC + プラスミド----------> TL-PINC::::::プラスミド。
【００９０】 また、標的化複合体の形成は、PINC系と非共有結合した標的リガンド（TL）の
例により説明される： TL:::::: PINC + プラスミド--------> TL::::::PINC::::::プラスミド または、 PINC + プラスミド--------> PINC:::::::プラスミド+TL--------> TL::::::PIN
C::::::プラスミド。
【００９１】 上記例において、:::::::は、イオン結合、水素結合、ワンデルワールス相互
作用、疎水性相互作用またはそのような相互作用の組み合わせなどの非共有相互
作用である。
【００９２】 細胞毒性物質についての標的化方法は、Subramanianらの国際出願第PCT/US96/
08852、国際公開公報第WO 96/39124に記載されている（参照により本明細書に包
含される)。本出願は、例えば相互作用性ポリマーの対などのzipポリマーに関連
する2工程標的化法を用いる、細胞毒性物質を標的化するためのポリマー親和力
系の使用を記載する。相互作用性ポリマーの１つと結合した抗体は、細胞の標的
と結合する。そして、このポリマーは細胞毒性物質と結合した第二のポリマーに
ついての標的として作用する。他の毒性物質送達の2工程（または多工程）系は
、参照するようにSubramanianら、にも記載されている。
【００９３】 その他の態様においては、PINC系またはPINC標的リガンド複合体に対する非天
然標的を含む2工程の標的化法を用いて、核酸コード配列を送達し、発現させる
ことができる。このように、例えばPINC−プラスミド複合体は、細胞内標的（例
えばMAB）と結合するリガンドにそれ自体で結合する、結合対(binding pair)メ
ンバーを標的化することができる。PINC化合物として本明細書中にて規定される
特定の化合物についての結合対は、Subramanianら著に規定されている。あるい
は、PINCは抗体などの標的リガンドと複合体を形成することができる。この抗体
は、例えば第二の抗体と結合する非天然標的を標的化できる。
【００９４】製剤の調製 核酸分子製剤は、本明細書に記載のように調製することができる。本出願によ
り規定されるように、代用ポリマーは選択される。典型的に、提供する実施例の
いずれにも例示するように重量／容積の割合は用いられる。
【００９５】 生物の細胞区画、例えばヌクレアーゼによる核酸の分解のために、多くの製剤
中の、例えば食塩水中の核酸の送達および発現は制限される。このように、イン
ビボにおける送達時に、核酸を保護することは結果として発現を大きく増強させ
、それにより所望の製薬的または治療効果を増強させることができる。溶液中の
核酸（例えばDNA）と相互作用するが、核酸を凝集させない特定の化合物型が、
インビボにて核酸に保護を与え、これに相当してコードされた遺伝子産物の発現
をさせることが分かった。これらの化合物の幾つかは、1998年6月7日に出願され
た米国特許第08/484,777、1996年4月23日に出願された国際特許出願第PCT/US96/
05679、および1997年3月2日に出願された米国特許出願番号第60/045,295に考察
されている（任意の図面を含むこれらの全教示は、参照により本明細書に包含さ
れる)。
【００９６】 プラスミドと相互作用し、迅速な細胞外ヌクレアーゼ分解からプラスミドを保
護するように設計された送達系の使用は、Mumper, R. Jら、1996, Phare. Res.
13:701-709; Mumper, R. Jら、1998, J. Cosltroll. Release 52:191-203; Anwe
r Kら. 1998, Human Gene Therapy, 9:659-670; およびAlila Hら. 1997, Human
Gene Therapy 8:1785-1795に記載されている。PINC系の特徴は、非凝集性の系
であって、ヌクレアーゼ分解からプラスミドを保護しながら、プラスミドの柔軟
性を維持させ、筋肉全体に容易に拡散させることができる系である。PINC系は主
に以下に記載するが、カチオン性脂質に基づく系およびPINCとカチオン性脂質の
双方を利用する系もまた、本発明の範囲内にある。
【００９７】 PINC系の共通する構成成分には、疎水性部分と親水性部分の両方を有する、両
親媒性分子がある。PINCの疎水性部分とは、水素結合（水素結合供与基または水
素結合受容器を介した）、ファンデルワールス相互作用、または／およびイオン
相互作用によりプラスミドと相互作用することを意味する。例えば、PVPおよびN
-メチル-2-ピロリドン（NM2P）は水素結合受容体であるが、PVAおよびプロピレ
ングリコール（PG）は水素結合供与体である。
【００９８】 4つの分子の全てが、種々の（ポリ）アニオン性分子と複合体を形成すると報
告された（Buhler V.、BASF Aktiengescellschaft Feinchemie, Ludwigshafen,
pp 39-42; Galaev Yら、J. Chrom. A. 684:45-54(1994); Tarantino Rら, J. Ph
arm. Sci. 83: 1213-1216(1994); Zia、Hら、Pharm. Res. 8:502-504(1991)を参
照のこと)。プラスミド表面をより疎水性にすべくプラスミドを被覆するようにP
INC系の疎水部分を設計する。Kabanovらは、プラスミドの疎水性を増加させ、ヌ
クレアーゼ分解からプラスミドを保護し、そして生体膜に対するプラスミドの親
和性を増加させるように設計された、プラスミド凝集化に対するカチオン性ポリ
ビニル誘導体の使用を以前に記載した（Kabanov, A. VおよびKabanov, V. A., 1
995, Bioconj. Chem. 6:7-20; Kabanov, A. Vら、1991, Biopolymers 31:1437-1
443; Yaroslavov, A. Aら、1996, FEBS Letters 384:177-180を参照のこと）。
【００９９】 本明細書中に記載の典型的な非イオン性PINC系を用いて、ラット筋肉における
遺伝子発現を、食塩水中に製剤化されたプラスミドよりも少なくとも１対数（ロ
グ）まで増強することを実証したことで、実際の保護効果が観察される。我々は
、PINC系と複合体を形成したプラスミドを用いた筋肉におけるレポーター遺伝子
の発現が、プラスミドを食塩水中に製剤化した場合よりも、より再現性があるこ
とも見つけ出した。例えば、食塩水中に製剤化されたプラスミドを用いた筋肉に
おけるレポーター遺伝子発現についての種々の共同作用は、96±35%（n=20調査;
8-12筋肉／調査）であったが、PINC系と複合体を形成したプラスミドを用いた
種々の共同作用は40±19%（n=30調査; 8-12筋肉／調査）であった。食塩水中に
製剤化したプラスミドを用いたレポーター遺伝子発現についての変動の高い共同
作用は、以前に記載された（Davis, H. Lら、1993、Hum. Gene Ther. 4:151-9を
参照のこと）。加えて、DNA：食塩水の結果とは対照的に、異なるトポロジーを
有するプラスミドをポリビニルピロリドン（PVP）と複合体を形成させた場合に
は、筋肉における遺伝子発現と有意な差はなかった。このことは、PVPが迅速な
ヌクレアーゼ分解からプラスミドの全ての型を保護できることを示している。
【０１００】投与 本明細書に記載の投与とは、プラスミドまたはDNAの運搬体を体内に導入する
経路を意味する。投与は標的組織に直接行うか、全身投与後の標的組織への標的
化送達によって行うことができる。特に本発明は、身体に製剤を投与して組織内
で特定の核酸配列のいずれかを遺伝子治療に有用な特定のレベルに制御して発現
させることによる異常の処置に使用することができる。
【０１０１】 ベクター（プラスミド）の好ましい投与手段および送達用製剤の使用について
は上述した。好ましい実施態様は、細胞へのパルス電圧送達と針注射もしくは針
なし注射とを併用することによる実施、またはパルス電圧の直接適用による実施
、この場合はエレクトロポレーション装置の電極を、例えば表皮細胞などの標的
組織または標的細胞に直接押し当て、パルス適用前またはパルス適用後に、ベク
ターを局所投与して、細胞を通じておよび/または細胞にベクターを送達する実
施である。
【０１０２】 選択したベクター構築物の投与経路は、その発現ベクターの特定の用途に依存
するだろう。一般に、使用する各ベクター構築物の具体的製剤では、特定の標的
組織に関するベクター送達、パルス電圧送達パラメーター、続いて効力の実証に
焦点が置かれる。送達試験には、細胞によるベクターの取り込みおよび選択した
DNAの発現を評価するための取り込み検定が含まれるだろう。そのような検定で
は、取り込み後の標的DNAの局在も決定され、発現したタンパク質の定常状態濃
度の維持に必要な条件が確立されるだろう。次に効力および細胞毒性も調べるこ
とができる。毒性には細胞の生存だけでなく細胞の機能も含まれるだろう。
【０１０３】 筋細胞は、DNA粒子を溶液、懸濁液またはコロイドとして筋肉内に単純に注射
すると、細胞外間隙からDNAを取り込むという独自の能力を持っている。この方
法によるDNAの発現は数ヶ月間持続させることができる。
【０１０４】 選択した送達方法は、核酸カセット内にコードされた遺伝子産物の発現を適切
な生物学的作用を発揮するレベルでもたらすべきである。発現率は疾患、ベクタ
ーおよび遺伝子産物の薬物動態学、および投与経路に依存するだろうが、0.001
〜100mg/kg-体重/日、好ましくは0.01〜10mg/kg-体重/日の範囲にあるべきであ
る。このレベルは標準的方法によって容易に決定することができる。これは最適
な投薬に依存して増減するかもしれない。処置期間は、疾患症状の経過中は、お
そらく連続して継続されるだろう。投与回数は疾患、送達媒体、および臨床試験
で得られた効力データに依存するだろう。
【０１０５】DNA注射可変要因 本発明によって達成される遺伝子送達および遺伝子発現レベルまたは免疫応答
の強度は、以下の可変要因を変化させることによって最適化することができる。
可変要因は、製剤（組成、プラスミドのトポロジー）、注射技術および注射手順
（注射範囲、電圧の持続時間および強度、電極間隙、放出するパルスの数、針の
配置様式、細胞の注射前パルスまたは注射後パルス、筋肉の状態、腫瘍の状態）
、および筋毒性剤による筋肉の前処置である。免疫応答は、例えば、注射した核
酸分子によってコードされ発現されるタンパク質に対して産生される抗体の量に
よって測定することができるが、これに制限されない。
【０１０６】 本発明のパルス電圧注射法によって与えられる製剤化された核酸分子によって
コードされているタンパク質のレベル、そのタンパク質に応答して産生される抗
体のレベルおよび/または細胞傷害性Tリンパ球のレベルに大きな影響を及ぼすの
に用いられ得る他の注射可変要因は、注射を行う筋肉の状態および注射技術であ
る。可変要因の例としては筋刺激、筋収縮、筋マッサージ、送達角度、および機
器操作が挙げられる。筋肉のマッサージにより、プラスミドは、直接的にまたは
リンパ排液によって筋肉から押し出されるだろう。本発明では、筋繊維に対して
パルス電圧装置を設置する際の貫入深度および/または貫入角度を変えることに
より、注射範囲全体にわたるプラスミド分布を改善し、次いでプラスミドにコー
ドされ、発現されるタンパク質に対する抗体反応を増大させる。
【０１０７】核酸に基づく治療法 本発明は、現時点でこれまで行われてきたものよりも効率のよい態様で核酸ワ
クチンを送達するために使用することができる。核酸ワクチンまたは抗原もしく
はヒト成長ホルモンなどの治療分子をコードするプラスミドの使用は、過去5年
間に集中的な研究開発分野になった。核酸に基づくワクチンに関する包括的な総
説が刊行されている（M.A.Liuら編，1995，DNA Vaccines：A new era in vaccin
ology，Vol.772，Ann.NY.Acad.Sci.，ニューヨーク、Kumar，V.およびSercarz，
E.，1996，Nat.Med．2：857-859、Ulmer，J.B.ら編，Current Opinion in Immun
ology，8：531-536，Vol.772，Ann.NY.Acad.Sci.，ニューヨーク）。ウイルスタ
ンパク質をコードするプラスミドを用いた動物モデルにおける防御免疫は、1993
年にUlmerらによって初めて観察された（Ulmer，J.B.ら，1993，Science 259：1
745-1749）。それ以来、いくつかの研究によっていくつかの疾患標的に関して防
御免疫が実証され、ヒト臨床試験が開始されている。
【０１０８】 多くの疾患標的が研究されてきた。例えばライム病のダニ媒介性感染物質、ボ
レリア ブルグドルフェリの抗原（Lukeら，J.Infect.Dis.175：91-97，1997）、
ヒト免疫不全ウイルス-1（Letvinら，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 94：9378-9383，1
997）、B細胞リンパ腫（Syrengelasら，Nature Medicine. 2：1038-41，1996）
、単純疱疹ウイルス（Bourneら，J.Infectious dis.173：800-807，1996）、C型
肝炎ウイルス（Tedeschiら，Hepatology 25：459-462，1997）、狂犬病ウイルス
（Xiangら，Virology，209：569-579，1995）、マイコバクテリウム ツベルクロ
ーシス（Lowrie「Genetic Vaccines and Immunotherapeutic Strategies」（CA
Thibeault編，Intl Bus Comm，Inc.（マサチューセッツ州01772サウスボロ））
の87〜122頁，1996）、および熱帯熱マラリア原虫（Hoffmanら，Vaccine 15：84
2-845，1997）などが、その例である。さらに、腫瘍細胞の免疫原性、成長およ
び増殖を低下させるための核酸に基づく処置から、腫瘍原性脳腫瘍などの疾患の
遺伝子治療が示唆される（Fakhraiら，Proc.Natl.Acad.Sci.，93：2909-2914，1
996）。
【０１０９】 遺伝治療の重要な目標の一つは、細胞による核酸の取り込みに影響を及ぼし、
それによって注射された核酸にコードされたタンパク質に対する免疫応答を引き
起すことである。細胞による核酸の取り込みは因子の数に依存し、その一つは、
細胞表面へ核酸が接近している時間の長さである。本発明は、核酸が細胞表面に
接近する期間の長さを増加させ、細胞に浸透し、細胞への核酸分子の送達をする
ことができる製剤を提供する。
【０１１０】 核酸に基づくワクチンはサブユニットワクチン、精製ウイルスタンパク質ワク
チンまたはウイルスベクターワクチンに代わる魅力的なワクチン接種法である。
伝統的なアプローチにはそれぞれ制約があるが、それらの制約は、身体の細胞中
で抗原（群）を直接発現させれば克服される。さらに、これらの従来のワクチン
は株特異的な防御しかもたらさない。したがって、いくつかの血清タイプがある
ウイルスまたは突然変異を起こしやすいウイルスに対して長時間持続する免疫を
従来のワクチン法を用いて得ることは極めて困難であり、不可能であるとさえ言
える。
【０１１１】 核酸に基づくワクチンは、ウイルスの核タンパク質などの高度に保存されたウ
イルスエピトープに対して長時間持続する免疫をもたらす可能性がある。特定の
タンパク質をコードするプラスミドを本発明により注射することで、抗体産生に
よって測定される免疫応答の増大をもたらす。したがって本発明は、製剤化され
た核酸分子を上述のパルス電圧装置で送達することによって核酸ワクチンを提供
する新規方法を包含する。
【０１１２】 核酸ワクチンの効力は少なくとも3つの方法、すなわち（1）筋肉内でのプラス
ミドの安定性および分布を増大させる送達系の使用、（2）抗原提示/抗原移行を
刺激する分子の発現（または送達）による方法、または（3）免疫応答を調整し
うるアジュバントを使用する方法、のいずれかによって増強される。
【０１１３】筋肉内プラスミド送達用の疾患または異常 本明細書中に記載の本発明は、多くの異なるコード配列の送達および発現に利
用できる。特に、パルス電圧注射によって多種多様のコード配列を筋肉中に送達
するのに本製剤が効果的であることは、筋肉送達についてのPINC系（PCT出願番
号第PCT/US96/05679）の実証された有効性により示される。筋肉細胞および他の
細胞を形質転換しても効果が見られるので、本発明のさらなる態様では腫瘍細胞
もパルス電圧注射の標的とされる。それ故、本発明は皮膚癌などの異常に見られ
るような腫瘍または集塊型の細胞コロニーの形成と関連した癌性異常の処置方法
を提供する。本発明のパルス電圧装置を用いて筋肉細胞にコード配列を送達する
ための具体的提案としては、以下の表１にまとめたものが挙げられる。 表１：筋肉内注射によるプラスミドに基づく遺伝子治療の適用 引用文献は米国出願第PCT/US96/05679（参照により本明細書中に包含される）
に記載されるように番号付けする。
【表１】
【０１１４】 この異常または疾患は好ましくは癌であり、例えば、腺腫および腺癌を含む上
皮腺癌；ポリープ、乳頭腫、扁平細胞癌および移行性細胞癌を含む扁平上皮癌お
よび移行性癌；組織型陽性、肉腫およびその他（腫）を含む結合組織癌；リンパ
腫、白血病およびホジキン病を含む造血癌およびリンパ細網癌；神経腫、肉腫、
神経繊維腫および芽腫を含む神経組織癌；奇形腫および奇形癌腫を含むオリジン
(origin)癌の混合組織がある。処置に適用できる他の癌性異常には、以下に記載
のいずれかの癌が含まれる： 副腎腫瘍、肛門腫瘍、胆管腫瘍、膀胱腫瘍、脳腫瘍：成人、胸、未知原発性部位
の癌、消化管、頚部、小児癌、大腸および直腸のカルチノイド、食道、胆汁 膀
胱、頭部および頚部、島細胞および他の膵臓癌、カポジー肉腫、腎臓、白血病、
肝臓、肺：非小細胞、肺；小細胞、リンパ腫：AIDS関連、リンパ腫：ホジキン病
、リンパ腫：非ホジキン病、黒色腫、中皮腫、転移性の癌、多発性骨髄腫、卵巣
、卵巣胚芽細胞腫瘍、膵臓、副甲状腺、ペニス、下垂体、前立腺、骨肉腫および
軟組織肉腫、皮膚、小腸、胃、精巣、胸腺、甲状腺、栄養膜疾患、子宮：子宮内
膜癌腫、子宮；子宮肉腫、膣または外陰。本組成物はパルス電圧装置によって投
与されることが好ましく、要すれば公認専門官によって決定される外科的手段に
よって処置される組織を露出させ得る。
【０１１５】実施例１：材料および方法 以下の実施例は、例示の手段により提供され、いかようにも本発明の範囲を制
限するものではない。当業者であれば、実施例に記載の種々の分子および／また
は量を調節または置換できることは認識されよう。実施例に記載の送達標的およ
び／または送達される量は、注射する種々の筋肉、腫瘍または結節中への注射を
選択することによって、あるいはパルスの持続時間を増減させるか、または注射
前から注射後にパルス適用を変更することによって調節または置換することがで
きることもまた認識されよう。
【０１１６】材料 USP/NFグレードプルロニック(Pluronic)（商標登録）F68(ポロキサマー188)、
Pluronic（商標登録）F87(ポロキサマー237)、Pluronic（商標登録）L121(ポロ
キサマー401)、Pluronic（商標登録）F108(ポロキサマー338)、Pluronic（商標
登録）F127(ポロキサマー407)、Pluronic（商標登録）L44(ポロキサマー124)、
およびポロキサミン(テトロニック(Tetronics)（商標登録）)を、Spectrum Qual
ity Products, Inc., (New Brunswick、New Jersey)およびBASFコーポレーショ
ン(Mount Olive, New Jersey)から入手した。CMVプロモーターおよびルシフェラ
ーゼまたはGFPレポーターを含むプラスミドは、Valentis, INCにて製造、精製さ
れた。
【０１１７】 製剤の製造 製剤は、水、プラスミド、ポリマー、および5M NaClの滅菌保存溶液から適当
な体積を分注して等張ポリマー溶液中の最終プラスミドを得ることによって製造
した。全ての製剤の総プラスミド濃度を260nmにおけるUV吸収によって測定した
。選択された製剤の浸透圧をFiske110μサンプルオスモメーター（Fiske Associ
ates（マサチューセッツ州ノーウッド))で測定した。スーパーコイルプラスミド
の割合は、1％アガロースゲル電気泳動の後、蛍光イメージングを行うことによ
って測定した。
【０１１８】動物への注射 雌CD-1マウス（50-60ｇ）をCharles River, Incから購入し、バレンティス(Va
lentis)のラボラトリー動物資源（Laboratory Animal Resources）飼育場にて飼
育した。1.8-2.0 mg/kgの用量でケタミン(42.8 mg/ml)、キシラジン(8.6 mg/ml)
、およびアスプロマジン(1.4 mg/ml)の混合物を、この動物に腹腔内投与して麻
酔した。後肢を剃毛し、ベータダインを塗ったのち、70％エタノールを塗った。
10μLの製剤を製剤化したプラスミドと共に、28ゲージ0.5針を付けた0.3mlイン
スリン注射器（Becton Dikinson（ニュージャージー州フランクリンレイク））
を使って注射した。製剤注射の7日後に、動物をCO2窒息によって屠殺し、前脛骨
筋を摘出し、素速く液体窒素に浸漬し、一晩凍結乾燥した。その乾燥した筋肉を
使用するか、または後にレポーター遺伝子活性を決定するために−80℃で保存し
た。
【０１１９】ルシフェラーゼ活性検定および総タンパクク質量検定 凍結乾燥筋肉を、シリカビーズを用いた小さいビーズ破砕器(biospec Product
s, Bartlesville、OK)を使用し、1〜2分間ホモジナイズした。ルシフェラーゼ細
胞溶菌緩衝液（Promega, Madison, IL）0.5 mLを、粉末化した筋肉に加え、その
試料をさらに2〜3分間、ホモジナイズした。この懸濁液を13,000rpmで15分間遠
心分離した。その上清試料20μL（0.5×溶菌緩衝液を用いて適当に希釈する）を
96マイクロプレート中に添加した。ルシフェラーゼ活性を再構成ルシフェラーゼ
検定溶液（Promega, Madison, IL）100μLを注射し、ルミノメーター(照度計)（
Microlumat LB 96p, Wallac Inc., Gaithersburg, MD）を用いて検定し、相対光
(relative light)を記録した。総タンパク質量はBCAタンパク質検定キット（Pie
rce, Rockford, IL）を用いて決定した。
【０１２０】病理組織検定 筋肉における遺伝子発現の病理組織検定のために、製剤化されたGFPレポート
遺伝子を前頚骨筋に注射した。注射の5日後に、筋肉を回収し、10％中性緩衝性
ホルマリン中にて、室温で6時間置いた。この組織をパラフィン処理し、5μm間
隔に切断し、60℃のオーブンにて1時間乾燥させた。次いで、この試料をキシレ
ン中にて浄化し、PBSにて再水和した。PBSで3度洗浄した後、この試料をVectash
ield封入媒体（Vector Laboratories, Burlingame, CA）を用いてカバースリッ
プで覆った。
【０１２１】製剤中のプラスミドに関する安定性試験 製剤中のｐＤＮＡ安定性の分析に関し、製剤化ｐＤＮＡ５０ｎｇを追跡色素５
μＬとともに、１％トリス−アセテート−ＥＤＴＡ（ＴＡＥ）バッファー中の１
％アガロースゲルにロードし、このゲルを１００ボルトで１〜２時間電気泳動し
た。次いでこのゲルをＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＩＩ（Molecular Probes, Inc.）で
２０分間染色した。染色されたゲルを水で洗浄し、FluorImager（Molecular Dyn
amics Co., Sunnyvale, CA）を用いてスーパーコイル化ＤＮＡおよび開環化ＤＮ
Ａの％を測定した。
【０１２２】 ＣＴＬ検定プロトコル： 脾細胞刺激を計画するため、群当たり３までの脾細胞を無菌的に回収し、滅菌
培地中に置く。組織を分離し、細胞を７０マイクロメートル細胞ストレーナーに
通す。細胞を十分に洗浄し、ＲＢＣを溶解する。細胞を５ｍＬ完全培地／脾臓に
再懸濁（すなわち３脾臓に関して、１５ｍＬに再懸濁）する。完全培地中、１０ 8 細胞／ｍＬの濃度で再懸濁する。これらのエフェクター細胞に関して、ｍＩＬ
−２の１０Ｘ保存物およびペプチド（免疫化に用いられる；１００Ｕ／ｍＬ ｍ
ＩＬ−２および１０マイクログラム／ｍＬペプチド）４ｍＬおよび培地３６ｍＬ
中の１０8細胞／ｍＬをＴ７５フラスコに加える。各フラスコは３Ｘ１０9トータ
ル細胞を含む４０ｍＬを含有するはずである。３７℃／５％ＣＯ2インキュベー
ター中に５日間、フラスコを垂直に置く。
【０１２３】 ５日後、標的細胞を２．５Ｘ１０6細胞／ｍＬで再懸濁し、１５０マイクロＣ
ｉの硫酸クロム−５１を加える。２試験管を作成する。１試験管には、ペプチド
２５μｇ／ｍＬを加える。試験管を３７℃で２時間インキュベートする。Ｔ７５
フラスコを回収してエフェクター細胞を調製し、十分に洗浄（少なくとも３回）
後、１０7細胞／ｍＬで再懸濁する。標的細胞をクロム−５１とインキュベート
した後、未結合放射能を洗浄し、５ｘ１０4細胞／ｍＬで再懸濁する。丸底９６
ウェルプレートに、１００：１、５０：１、２５：１、および１２．５：１の濃
度で１００マイクロリットル／ウェルのエフェクターを加えた。１００マイクロ
リットル／ウェルのＣｒ51−標的細胞を、エフェクターを含有しないウェルを含
むすべてのウェルに加える。標的のみのウェルの半分に、１％ Triton X-100 １
００μＬを加える。プレートを３７℃で６時間インキュベートする。プレートを
回収し、WallacL470 Wizard ガンマカウンターを用いてカウントする。
【０１２４】 Ｅｌｉｓａプロトコル： 高アフィニティー検定プレートをＰＢＳで希釈された抗原（５０マイクロリッ
トル／ウェル）でコーティングする。プレート（群）を室温にした後、１Ｘ Ｐ
ＢＳ／Tween20 中で作成された２００マイクロリットル／ウェルの４％ＢＳＡ／
４％ＮＧＳ溶液を用い、３７℃で１時間すべてのウェルをブロックする。血清サ
ンプル（５０マイクロリットル／ウェルの、４％ＢＳＡ／４％ＮＧＳ／ＰＢＳ／
Tween20 中１：１００の出発希釈で、２回）を加え、３７℃で１〜２時間インキ
ュベートする。プレート（群）をＰＢＳ／Tween 20 で洗浄し、５０マイクロリ
ットル／ウェルのＨＲＰ−コンジュゲート化セカンダリーを加え、１％ＢＳＡ中
で希釈し、３７℃で１時間インキュベートする。プレート（群）をＰＢＳ／Twee
n 20 で洗浄し、１００マイクロリットル／ウェルのＴＭＢ可溶性試薬を加える
。室温で１０分間インキュベートした後、５０マイクロリットル／ウェルの０．
２Ｍ Ｈ2ＳＯ4を加えて反応を止める。プレート（群）を４５０ｎｍで読み取る
。
【０１２５】 サイトカイン放出プロトコル： 脾細胞を分離し、細胞を７０マイクロメートル細胞ストレーナーに通す。細胞
を十分に洗浄し、ＲＢＣを溶解する。脾細胞を５Ｘ１０6細胞／ｍＬで再懸濁す
る。平底９６ウェルプレートを用いて、２０マイクログラム／ｍＬ（１００マイ
クロリットル／ウェル）で出発して、抗原を４回滴定する。１００マイクロリッ
トル／ウェルの脾細胞を各ウェルに加え、３７℃で６０時間インキュベートする
（抗原の最終出発濃度は、１０マイクログラム／ｍＬであろう）。各ウェル由来
の上清を収集（４回分をプール可能）し、サイトカインＥＬＩＳＡキット（ＩＦ
Ｎ−γ、ＩＬ−５および／またはＩＬ−１０；それぞれ Pharmingen から得るこ
とができる）を用いて試験する。
【０１２６】プラスミド ＣＭＶエンハンサー−プロモーターおよび、ヒト胎盤分泌性アルカリホスファ
ターゼレポーター遺伝子（ＳＥＡＰ）（ｐＡＰ１１６６）、緑色蛍光タンパク質
（ｐＧＦ９９１０）、またはルシフェラーゼ（ｐＣＬ０８８８）を含有するプラ
スミドｐＡＰ１１６６（ＳＥＡＰ）、ｐＧＦ９９１０（ＧＦＰ）およびｐＣＬ０
８８８（ルシフェラーゼ）は Valentis, Inc. で製造され、精製された。Valent
is バックボーンには、１０７ｂｐ５’ＵＴＲｍ（ＵＴ１２）、１１７ｂｐ合成
イントロン（ｉｖｓ８）、カナマイシン耐性遺伝子およびＰＵＣ１２バックボー
ンが含まれる。
【０１２７】実験動物 雄性ＣＤ−１マウス（２９〜３１ｇ）（Charles Rivers Laboratories）およ
び雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウス（７〜８週）を、州および合衆国のガイドラインに
したがって、２３℃／４０％ＲＨでの１２時間明暗サイクルにおいて３〜７日間
順応させた。動物を混合麻酔（ケタミン７４ｍｇ／ｍＬ、キシラジン３．７ｍｇ
／ｍＬおよびアセプロマジン０．７３ｍｇ／ｍＬ）を１．８〜２．０ｍＬ／ｋｇ
（マウス）の用量で用いてＩＰ麻酔した。
【０１２８】装置および投与計画 必要とされる用量の製剤化されたプラスミドを、齧歯目の両脛骨頭蓋または両
腓腹筋内への長期間の注射（両側投与）により投与した。エレクトロポレーショ
ン時には、全下肢をカリパス電極間に固定し、良好な「エレクトロトランスフェ
クション」を得た。注射２分後に、Electro Square Porator（T820, BTX, San D
iego, CA）により送達される各２５ｍｓで３７５Ｖ／ｃｍの２矩形波パルス（１
秒当たり１回）型で電場を適用した。クランプ電極は２ステンレス鋼の並行プレ
ートカリパス（１．５ｃｍ2）からなり、これを皮膚に接触させて設置し、パル
ス投与中を通して脚を半伸張位置で保持した。電極の分極間隔は記載の通りであ
る。
【０１２９】血清検定 プラスミド投与後適当な時点で血液サンプルを収集した。マウスをケタミン（
６０ｍｇ／ｋｇ）（Phoenix Scientifics, Inc., St Louis, MO）でＩＰ麻酔し
た。塩酸プロパラカイン眼（opthalmic）溶液（Solvay Animal Health Inc., Me
ndota Heights, MN）を眼に適用した。血液をマイクロテイナー血清分離試験管
（Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ）に収集し、１５〜３０分凝固させた
後、７０００ｒｐｍで５分間遠心した。ＳＥＡＰの血清レベルは、製造元の指示
書にしたがい化学ルミネセンス検定（Tropix, Benford, MA）を用いて測定した
。
【０１３０】 ＤＮＡ製剤および投与経路の適正な選択により、「裸の」ＤＮＡを用いて見ら
れる応答以上および以下の免疫応答を得ることができる。これらの「ＤＮＡ製剤
」は、他のストラテジー、例えばサイトカイン添加より多くの恩恵、すなわち安
全性、コスト、および使用の容易さを有する。
【０１３１】実施例ＩＩ：レポーター遺伝子発現に対するポリマータイプおよび濃度の効果 図１は、ポロキサマー１８８製剤中のｐＤＮＡをＩＭ注射した後の、ＣＤ−１
マウスにおける、ルシフェラーゼレポーター遺伝子発現に対するポリマー濃度の
効果を示す。ＡおよびＢは、それぞれ３０マイクログラムＤＮＡおよび１０マイ
クログラムＤＮＡ／筋肉を用いる並行実験であった。図１Ａに関して、結果は、
ＣＤ−１マウスの脛骨内へ注射された製剤１０マイクロリットル中のｐＬＣ０８
８８ １０マイクログラムに関する平均±ＳＥＭ（ｎ＝１０）として報告する。
７日目に回収される（ｎ＝１０）。図１Ｂは、脛骨内へ注射された製剤１０マイ
クロリットル中のｐＬＣ０８８８ ３０マイクログラムの結果を示し、回収は３
日目である（ｎ＝１０）。結果はポロキサマー１８８が０．２５％〜１０％の範
囲の濃度で遺伝子発現を有意に高めることを示す。
【０１３２】 図２は、Ａ）食塩水中、およびＢ）食塩水中５％ポロキサマー中のｐＤＮＡの
ＩＭ注射５日後の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に関するマウス脛骨筋肉の組織
学を示す。筋肉当たりに注射されたｐＤＮＡは、各動物に対し、トータル２０マ
イクロリットルに関して１０マイクログラム／１０マイクロリットルであった。
発現はポロキサマー製剤を用いて高められた。
【０１３３】 図３は、注射されたＤＮＡ量に対するルシフェラーゼ発現の用量応答を示す。
０．１〜３ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度のｐＬＣ０８８８を、１〜１０％の範囲のポ
ロキサマー１８８濃度中で製剤化し、製剤１０マイクロリットルをＣＤ−１マウ
スの脛骨内に注射し、注射後７日目（ｎ＝１０）に回収した。結果は平均±ＳＥ
Ｍ（ｎ＝１０）として報告する。１％ポロキサマーでのＤＮＡ用量では発現が継
続的に増大したが、最大発現は５％ポロキサマー中１ｍｇ／ｍＬのＤＮＡ濃度を
用いて得られた。
【０１３４】 図４は、食塩水、５％ＰＶＰ、０．２５％ポロキサマー１８８（Ｆ６８）およ
び５％ポロキサマー１８８（Ｆ６８）中で製剤化されたＣＭＶ−ルシフェラーゼ
コード化プラスミド（ＤＮＡ３０ｕｇ／筋肉）の注射後７日目の、ルシフェラー
ゼ発現の時間経過を示す。３ｍｇ／ｍＬのプラスミドＤＮＡｐＬＣ０８８８は、
動物当たりトータル２０マイクロリットルを用いて、１０マイクロリットル／筋
肉で脛骨筋肉内に注射された。結果は平均±ＳＥＭ（ｎ＝１０）として報告され
る。
【０１３５】 図５は、マウスにおけるｉｍ注射後の、インビボ遺伝子発現に対する選択され
たポロキサマー製剤の比較を示す。各製剤（１ｍｇ／ｍＬ）１０マイクロリット
ルをＣＤ−１脛骨内に注射し、７日目（ｎ＝１０）に回収した。５％Ｆ６８およ
び１％Ｌ４４を用いた場合、食塩水と比較して遺伝子発現の有意な改善が得られ
た。Ｐ＜０．０５。また、この実験において食塩水と比較して改善を示すポロキ
サマー製剤には、５％Ｌ４４、１％Ｌ１２１、１％Ｆ８７、１％Ｆ１０８、およ
び１％Ｆ１２７が含まれる。
【０１３６】 図６は、１ｍｇ／ｍＬ ＳＥＡＰプラスミドを用いる５％Ｌ４４、５％Ｆ６８
および食塩水の比較を示す。各マウス脛骨筋肉は２５マイクロリットル、５０マ
イクログラム用量を受けた。Ｌ４４は、７日目において、食塩水と比較して１７
倍の発現増加を与え、２１日にわたる曲線下領域における１４倍増加を与えた。
５％Ｆ６８は、７日目において、食塩水より６倍高く（ｐ＝０．１５）、２１に
わたって６倍高かった。両ポロキサマーに関して、５％溶液は１％および１０％
濃度より優秀であった。
【０１３７】 図７Ａおよび７Ｂは、５％Ｆ６８および５％Ｌ４４中のＳＥＡＰプラスミド１
〜５０ｕｇの用量応答を示す。Pluronic（登録商標）Ｌ４４は１ｕｇ以上のすべ
ての濃度においてＦ６８より１．５〜２．５倍高かった。
【０１３８】実施例ＩＩＩ：ポリマー製剤を用いる高められた免疫応答 多数の核酸製剤を、β−ｇａｌまたはｇｐ１００マウスモデルのいずれかにお
いてスクリーニングし、以下のうち１またはそれ以上を測定することによって得
られた免疫応答を評価した：ＩｇＧ力価、ＣＴＬ応答、培養脾細胞からのサイト
カイン放出、感染性または致死性のチャレンジからの保護。結果は、製剤材料の
選択、製剤材料のモル％および投与経路がすべて、得られた免疫応答に大きな影
響を有することを示した。１またはそれ以上の我々の検定系にて、以下のすべて
のポリマー材料は、同等な応答または、「裸の」ＤＮＡと比較して、向上を示す
：Pluronic（登録商標）Ｌ１２１、Tween-20、Tween-80、Ｃ１２Ｅ８、ヒドロキ
シプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース。
【０１３９】 典型的なワクチン接種実験においては、０日目、１４日目および２８日目に、
ＰＩＮＣポリマーおよびモデル抗原β−ガラクトシダーゼをコードするプラスミ
ドＤＮＡを含有する製剤を用いて、２０〜２５ｇ Ｂａｌｂ／Ｃマウスを注射し
た。２８日および４２日目に、動物から採血し、ＥＬＩＳＡに基づく検定を用い
、β−ｇａｌに対するトータルＩｇＧに関してこの血液を検定した。典型的な実
験に関する体液性の結果を図８に示す。この実験では、ＰＢＳ中の２．５％また
は５％ Pluronic（登録商標）Ｌ１２１のいずれかにおいてＤＮＡを製剤化する
。未処置動物およびＰＢＳ中のＤＮＡで処置された動物をコントロールとする。
マウスに製剤化ＤＮＡ（トータル用量１０ｕｇに関して０．１ｍｇ／ｍＬ）１０
０マイクロリットルを、尾部の基の毛をそった領域に皮内注射するか、あるいは
脛骨（１０マイクロリットルｘ２脚）および腓腹筋（４０マイクロリットルｘ２
脚）の筋肉に筋肉内注射した。結果は、Ｌ１２１中にて製剤化されたＤＮＡを用
いて、ＰＢＳ中のＤＮＡより高レベルの抗体が得られることを示す。図８はポロ
キサマーＬ１２１を用いて高められた免疫応答を示す。
【０１４０】 細胞性応答の存在を調査するために、最後の免疫化後３〜４週間、ＣＴＬ検定
を典型的に行った。図９に示される典型的な結果は、Ｌ１２１／プラスミド製剤
のＩＭ投与後の高められたＣＴＬ活性を示す。
【０１４１】 この実験において、動物を、０、１４および２８日目に、再び上記のように筋
肉内処置したが、今度は、製剤は１．５％Ｌ１２１（ＴＧＶ１５０）または２．
５％Ｌ１２１（ＴＧＶ２５０）のいずれか中で製剤化されたＤＮＡからなり、未
処置およびＰＢＳ中のＤＮＡはコントロールであった。４９日または４９日頃、
脾臓を採り出し、脾細胞をＣＴＬクロム放出検定用に培養した。この結果は、未
処置マウスにおいて見られるレベル以上の特異的溶解が、Ｌ１２１中にて製剤化
されたＤＮＡを用いて試験されたすべてのエフェクター：標的率において達成さ
れたことを示す。したがって、Ｌ１２１製剤化プラスミドは、β−ｇａｌＤＮＡ
でマウスをワクチン接種するのに用いられる場合、体液性および細胞性応答の両
者を誘発することができる。
【０１４２】実施例ＩＶ：ポロキサマー製剤は長期間のプラスミド安定性を付与する 実験は、プラスミドＤＮＡに長期間の安定性を付与するポロキサマー製剤の能
力を測定するために行われた。図１０は、３７℃での、５％ポロキサマーＦ６８
中のヒトＤｅｌ−１コード化プラスミドＤＮＡの経時的な安定性を示す。ポロキ
サマー製剤は、液状または凍結乾燥剤型において、３７℃で安定である。
【０１４３】実施例Ｖ：ポロキサミン製剤を用いる遺伝子発現の向上 ＳＥＡＰをコードするプラスミドＤＮＡを、ＢＡＳＦコーポレーションから得
た種々のポロキサミン中で製剤化した。TETRONIC（登録商標）９０４、TETRONIC
（登録商標）９０８、TETRONIC（登録商標）１１０７および TETRONIC（登録商
標）９０Ｒ４に関して、５％Ｆ６８を用いる発現と比較して、０．０５％〜５％
の範囲のポロキサミン濃度を試験した。これらすべては、その理想的濃度におい
て、食塩水より増加した発現を与えることが測定された。１％を超える濃度が最
大発現に、典型的に必要とされるポロキサマーＦ６８とは対照的に、ポロキサミ
ン発現は約０．５％濃度で最大であった。図１１は、プラスミド濃度１ｍｇ／ｍ
ＬからのＳＥＡＰ発現を示し、注射後、３、７および１４日目に、種々のポロキ
サミンを５％Ｆ６８および食塩水と比較している。試験されたすべてのポロキサ
ミンは、特に７日目において、食塩水より増加した発現を示した。
【０１４４】実施例ＶＩ：ポロキサマー製剤はヌクレアーゼ保護を付与する 実験は、プラスミドＤＮＡをヌクレアーゼ消化から保護する、ポリ−Ｌ−グル
タメートおよび Pluronic（登録商標）Ｆ６８の能力を測定するために行われた
。ＤＮアーゼＩはＧｉｂｃｏ／ＢＲＬ（＃１８０６８−０１５）から得た。ポリ
−Ｌ−グルタミン酸（２〜１５ｋＤａ）のナトリウム塩はＳｉｇｍａから得た。
Pluronic（登録商標）Ｆ６８はＳｐｅｃｔｒｕｍから得た。ポリマー／ＤＮＡ
２ｘ 保存溶液を調製した（Pluronic（登録商標）Ｆ６８＝１０％Ｆ６８中２０
０マイクログラム／ｍＬプラスミドＤＮＡ；ポリ−Ｌ−グルタメート＝１２ｍｇ
／ｍＬポリ−Ｌ−グルタミン酸ナトリウム中２００マイクログラム／ｍＬプラス
ミドＤＮＡ）。１ｘ ＤＮアーゼバッファー中、１：１０〜１：１０，０００ま
でのＤＮアーゼ希釈物を調製した。最終反応混合物には、製剤２５マイクロリッ
トル、水１５マイクロリットル、１０ｘ ＤＮアーゼバッファー５マイクロリッ
トルおよびＤＮアーゼ５マイクロリットルが含まれていた（これらは列記される
順に加えられた）。この反応混合物を３７℃で１５分間インキュベートし、ＥＤ
ＴＡを加えて終了させた後、ゲル電気泳動に付した。
【０１４５】 ＤＮアーゼ保護検定の結果を図１２に示す。パネルＡは食塩水製剤中のＤＮＡ
を示し；パネルＢは５％ Pluronic（登録商標）Ｆ６８中で製剤化されたＤＮＡ
を示し；パネルＣは６ｍｇ／ｍＬポリ−Ｌ−グルタメート中で製剤化されたＤＮ
Ａを示す。レーンＡはネガティブコントロール（すなわちＤＮアーゼを伴わない
プラスミドＤＮＡ）を示し；レーンＢはポジティブコントロール（すなわち１：
１混合されたプラスミドＤＮＡおよびＤＮアーゼ）を示し；レーンＣ〜Ｇは、食
塩水（パネルＡ）、Ｆ６８（パネルＢ）、またはポリ−グルタメート（パネルＣ
）のいずれかで製剤化されたＤＮＡを１：１（レーンＣ）；１：１０（レーンＤ
）；１：１００（レーンＥ）；１：１，０００（レーンＦ）；および１：１０，
０００（レーンＧ）希釈されたＤＮアーゼと混合する実験条件を示す。食塩水中
、１：１００のＤＮアーゼは、ＤＮＡの分解に加えて、スーパーコイルされたプ
ラスミドの低級バンドを破壊でき、ゲル上種々の分子量の油性物質を生じさせる
。対照的に、両ポリ−Ｌ−グルタメートおよび Pluronic（登録商標）Ｆ６８は
１：１００希釈にて、ＤＮアーゼ分解からの保護を付与することができた。
【０１４６】実施例ＶＩＩ：製剤化プロセスパラメータ 実験は、製剤化プロセスおよびパラメータが遺伝子発現に影響を有するかどう
かを測定するために行われた。ルシフェラーゼをコードするプラスミドｐＬＣ０
８８８を用いた。１０マイクロリットルの各製剤をマウスの脛骨の筋肉に注射し
、以下の表のように各動物に関してトータル２０マイクロリットルとした。７日
目に筋肉を回収し、シリコン化エッペンドルフチューブ中、乾燥氷上で収集し、
凍結乾燥し、ルシフェラーゼ検定を行うまで−７０℃で保存した。各群６マウス
を含んでいた。
【式１】
【０１４７】 図１３に記載の実験の結果は、ポリマーおよびＤＮＡがＮａＣｌの添加前に相
互作用することが可能である場合により多く発現される傾向を示唆する。結論と
して、ポリマー製剤への成分添加の好ましい順序には、水性ポリマーを、保存溶
液由来の水または１０ｍＭまでのトリス中のＤＮＡとともに混合することが含ま
れる。製剤化ＤＮＡの所望の濃度の調節は、水を用いて行う。次いで、５Ｍ Ｎ
ａＣｌの保存溶液から最終１５０ｍＭまでＮａＣｌを加える。
【０１４８】 実施例ＶＩＩＩ：エレクトロポレーションを用いる、ポロキサマー製剤中の治療
遺伝子の発現 Ｄｅｌ−１は、血管系の発生に関与する因子として最近同定された。Ｄｅｌ−
１タンパク質および、ヒトおよびマウスＤｅｌ−１をコードするヌクレオチド配
列は米国特許第５，８７７，２８１号および第５，８７４，５６２号（これらは
引用によりその全開示内容が本明細書中に包含される）の主題である。
【０１４９】 ポロキサマー製剤化プラスミドＤＮＡの遺伝子発現に影響するエレクトロポレ
ーションの能力を測定するために、５％Ｆ６８中で製剤化されたｍＤｅｌ−１プ
ラスミドＤＮＡの注射後の、マウス脛骨の腹側筋肉中のｍＤｅｌ−１発現のレベ
ルおよび期間を、エレクトロポレーション有りおよび無しで測定した。Ｄｅｌ−
１をコードするプラスミドＤＮＡ１０マイクログラムをＣＤ−１マウス脛骨の腹
側筋肉内に注射した。注射された筋肉を注射後７、１４、３０および６０日で摘
出し、定量的逆転写ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）によりｍＤｅｌ−１ ｍＲＮＡに
関して検定した。図１４に示すこの実験の結果は、ｍＤｅｌ−１の発現は、エレ
クトロポレーション無しで投与された場合、１月当たり約１対数の割合で減少し
たことを示す。５％Ｆ６８中で製剤化されたｍＤｅｌ−１プラスミドを、エレク
トロポレーションと組み合わせて投与すると、Ｄｅｌ−１ ｍＲＮＡレベルの約
２対数増加を生じ、さらに、ｍＤｅｌ−１発現の持続性が明らかに増加した。示
されるデータポイントは、ｎ＝５／群／時点に関して平均＋／−ＳＥＭで示す。
【０１５０】 エレクトロポレーション有りおよび無しで注射された７日後のマウスの酸素正
常状態（normoxic）脛骨の腹側筋肉における、ポロキサマー製剤化ｈＤｅｌ−１
プラスミドＤＮＡの生物学的効果は、図１５に示すように測定された。マウス脛
骨の腹側に、製剤化Ｄｅｌ−１またはコントロールプラスミドをＩＭ注射し、次
いでエレクトロポレーションを用いて、注射された筋肉の半分においてプラスミ
ド摂取をさらに高めた（＋ＥＰ）。パネルＡ：棒グラフの結果は、ＣＤ３１免疫
染色のコンピューターイメージ分析によって測定された処置７日後の毛細管密度
を示す。データは、ｎ＝３／群に関する平均＋／−ＳＥＭを示す。アスタリスク
はこの群がコントロールと異なっていることを示す（ｐ＜０．０１）。パネルＢ
：写真は、筋肉交差セクション（muscle cross-sections）における典型的ＣＤ
−３１免疫染色を示す。５％Ｆ６８中で製剤化されたｈＤｅｌ−１プラスミドの
単一の１０マイクログラム用量は、毛細管：筋線維の割合を約６０％増加させる
（ｐ＜０．０１）。エレクトロポレーションの使用を介するｈＤｅｌ−１発現レ
ベルの増加は、毛細管：筋線維の割合をさらに増加させることはなかった。示さ
れていないが、このモデルにおけるヒトおよびマウスＤｅｌ−１の効果は同等で
あった。
【０１５１】実施例ＩＸ：ポロキサマーは経皮経路により送達されるプラスミドＤＮＡからの 発現を実質的に増加させる 実験は、ポロキサマー製剤が、経皮経路を介して筋肉に送達されたＤＮＡから
の遺伝子発現を増加させるかどうかを測定するために行われた。ブタ左心室への
逆行性ＩＶ送達は、腹側心室静脈内の中間領域に７Ｆバルーンカテーテルを設置
し、バルーン膨張による静脈流出の妨害後、約１ｍＬ／ｓの割合で製剤化プラス
ミド１０ｍＬを注射することによって行われた。この手法による対照媒体または
色素の送達は、媒体の、左心室の実質組織への局所的管外遊出を生じさせた。製
剤化プラスミドの送達後、膨張したバルーンを数分間（実験に応じてブタ中２〜
１０分）設置したままにし、この組織内での製剤の残留時間を増加させた。この
経路により、８ブタに製剤化プラスミドを投与した（ポロキサマー製剤を用いて
ｎ＝４、カチオン性脂質製剤を用いてｎ＝４）。送達手法はすべての動物におい
て十分に寛容された。しかし、投与７日後の回収時に、カチオン性脂質製剤を投
与されたブタの心筋に有意に著しい病状が見られた。１：０．５（−／＋）製剤
より１：３（−／＋）製剤を投与されたブタにおいて病状は明らかに重篤であっ
た。
【０１５２】 Ｄｅｌ−１ ｍＲＮＡの発現は、表１に示すように、ポロキサマー１８８製剤
を投与されたブタにおいて最も高く、カチオン性脂質の濃度が高くなるほど有意
に減少した。試験された送達様相および製剤のうち、逆行性ＩＶ注入を介して投
与されたポロキサマー１８８製剤のみが、ＩＭ注射後のマウス肢筋肉において典
型的に達成されるレベルに匹敵する発現レベルを生じた。ポロキサマー製剤の心
筋内注射および逆行性ＩＶ注入による送達はともに、十分に寛容されることがわ
かった。
【０１５３】 表１．これまでに行われた経皮心筋送達実験で得られたデータのまとめ
【表２】 1技術的成功とは、重大な問題なく行われた送達手順の割合として定義される。2 コピーＤｅｌ−１ ｍＲＮＡ／μｇトータルＲＮＡ、ＬＯＱ＝５００コピー（５
００，０００−１，０００，０００ マウス肢筋肉において達成される典型的レ
ベル）。
【０１５４】 実施例Ｘ：ポロキサマーは経皮経路で送達されたプラスミドＤＮＡからの発現を
実質的に増加させる ヒトＩＬ−１２をコードするプラスミドＤＮＡの、マウスモデルの肺への経皮
（静脈内）送達に関して、ポロキサマー製剤をカチオン性脂質製剤と比較した。
最も高いポロキサマー１８８（Ｆ６８）発現は８％（４５ｕｇ）で観察され、こ
れはＤＯＴＭＡ／Ｃｈｏｌより２５倍高かった。同じＤＮＡ用量（５マイクログ
ラム）において、ポロキサマー１８８（Ｆ６８）（８％）はＤＯＴＭＡ／Ｃｈｏ
ｌより３．８倍高かった。ポロキサマー製剤を用いる高レベルの送達は、転移性
肺腫瘍を原因とする死を減少させることに関係する。４％Ｆ６８（９０ｕｇ）か
らの最大発現はＤＣより１３倍高かった。同じＤＮＡ用量（５ｕｇ）では、４％
Ｆ６８はＤＣより２．８倍高かった。（図１６）。
【０１５５】 実施例ＸＩ：ポロキサマーは経皮経路によって送達されるプラスミドＤＮＡから
の発現を実質的に増加させる サイトカインをコードするプラスミドＤＮＡを肝動脈によって肝臓へ送達する
能力に関して、ポロキサマー製剤を試験した。５％ポロキサマー１８８は、食塩
水、ＤＯＴＭＡ／Ｃｈｏｌおよび５％マンニトールと比較してｈＩＬ−１２の発
現を有意に増加させた。（図１７）。
【０１５６】 当業者であれば、本発明は、課題を実施し、ならびに上記および発明が本来有
する目的および利点を得るのに十分適用できることが容易に理解できよう。本明
細書中に記載の、分子複合体および方法、手法、処理、分子、特定化合物は好ま
しい態様によって現在記載されているが、これは例示的であり、本発明の範囲に
を限定するものとして意図されるものではない。請求の範囲によって規定される
発明の思想の範囲内に含まれる本発明の変更および他の使用は、当業者であれば
思いつくものであろう。
【０１５７】 本明細書中に開示される発明に対して、本発明の範囲および思想から逸脱する
ことなく種々の置換および修飾を施し得ることが、当業者には容易に明らかであ
ろう。
【０１５８】 明細書中に記載されるすべての特許および刊行物は、発明の属する分野の当業
者の水準の指標である。すべての特許および刊行物は、それぞれ個々の刊行物が
特にかつ個別に引用により包含されることが示されているのと同様に、引用によ
り本明細書中に包含される。
【０１５９】 特許文献および非特許文献両者を含む、上に、引用によって本明細書中に包含
されていない参考文献は、すべての目的に関して、引用により本明細書中に明示
的に包含される。他の態様は、本明細書中、請求の範囲内に存する。
【図面の簡単な説明】
【図１】 ポロキサマー188製剤中のpDNAをCD-1マウスに筋肉内（IM）注射
した後の、CD-1マウスにおけるルシフェラーゼレポーター遺伝子発現におけるポ
リマー濃度の効果を示す。AとBはそれぞれ、10μg DNA／筋肉および30μg／筋肉
を用いた平衡実験である。結果は平均値±SEM（n=10）として表す。
【図２】 A）食塩水およびB）食塩水中の5％ポロキサマー188中のpDNAをIM
注射した5日後の緑色蛍光タンパク質（GFP）についての、マウス前頚筋の組織像
を表す。マウス一匹当たり注射したDNAは10μg／10μLであった。
【図３】 種々の濃度のポロキサマー188を含む製剤10μLを注射した7日後
の、ルシフェラーゼ発現のプラスミドDNA用量−応答を示す。結果は平均値±SEM
（n=10）として表す。
【図４】 CMV−ルシフェラーゼ（DNA30μg／筋肉）を注射した7日後の、ル
シフェラーゼ発現の時間経過を示す。結果は平均値±SEM（n=10）として表す。
【図５】 マウスにおけるIM注射後のインビボ遺伝子発現に対する選択した
ポロキサマー製剤の比較を示す。
【図６】 5％ポロキサマー124、5％ポロキサマー188、および食塩水、1mg/
mL SEAP プラスミドを各々のマウスの頚骨筋中に25μl（50μg用量）注射した。
ポロキサマー124（L44）は7日後に発現量が食塩水よりも17倍増加（p=0.03）し
、21日にわたる曲線下領域においては14倍増加した。5％ポロキサマー188（F68
）は7日後に食塩水よりも6倍増高く(p=0.15)、21日にわたって6倍高かった。両
方のポロキサマーについて、濃度1％および10％は5％よりも低かった。
【図７ＡおよびＢ】 5％ポロキサマー188（F68）および5％ポロキサマー12
4（L44）中のSEAPプラスミド1〜50μgの用量応答を示す。
【図８】 ポロキサマー401（L121）を用いた免疫応答の増強を示す。マウ
スをそれぞれβ−gal発現プラスミドDNAの指示された製剤を筋肉内または内皮の
いずれかにより注射し、β−galタンパク質の抗体形成を試験した。
【図９】 ポロキサマー401（L121）／プラスミド製剤をIM投与した後の、
増強されたCTL活性を示す。
【図１０】 5％ポロキサマー188（F68）中のhDel−1をコードするプラスミ
ドDNAの37℃における安定性のプロフィールを示す。
【図１１】 食塩水中に製剤化したプラスミドDNA由来のSEAP発現に対して
、5％ポロキサマー188（F68）、および種々のポロキサミンの製剤由来のSEAP発
現とを示す。
【図１２】 食塩水と5％ポロキサマー188または6mg/mlポリ−L−グルタメ
ートとを比較する、DNase保護検定の結果を示す。パネルAは食塩水中に製剤され
たDNAを表し；パネルBは5％ポロキサマー188（F68）中に製剤されたDNAを表し；
パネルCは6mg/mlポリ−L−グルタメート中に製剤されたDNAを表す。レーンAはDN
aseを含まないプラスミドDNAのネガティブコントロールであり；レーンBはプラ
スミドDNAとDNaseとが1：1で混合されたポジティブコントロールであり；レーン
CはDNaseの1：1希釈；レーンDはDNaseの1：10希釈；レーンEはDNaseの1：100希
釈；レーンFはDNaseの1：1000希釈；レーンGはDNaseの1：10000希釈である。食
塩水においては、DNaseの1：100希釈で、ゲルにはスーパーコイル型のプラスミ
ドの下のバンドがなくなり、さらにDNAが分解されたことによる種々の分子量の
スメアーを見ることができる。対照的に、両ポロキサマー、1％および10％濃度
は5％よりも低かった。
【図１３】 レポーター遺伝子発現におけるポリマー製剤の製法パラメータ
の重要度を示す。
【図１４】 エレクトロポレーションを用いた場合と、用いなかった場合の
5％ポロキサマー188（F68）製剤中のプラスミドDNAを送達した後の、マウスの前
頚骨筋におけるmDellの発現を示す。
【図１５】 5％ポロキサマー188（F68）製剤中のプラスミドDNAを送達した
後の、酸素定常状態マウス骨格筋での毛細血管密度におけるhDel−1発現の生物
学的効果を示す。
【図１６】 DOTMA/Cholと比較して、1〜12％ポロクサマー188（F68）製剤
を肺へ静脈内送達した場合の増強したhIL-12発現を示す。
【図１７】 DOTMA／Chol、食塩水またはマンニトールと比較した、5％ポロ
キサマー188（F68）製剤を肝動脈送達により送達した場合の、増強されたhIL12
発現を示す。
【図１８】 用いた種々のPLURONIC（商標登録）型のポロキサマーポリマー
と一般（非専売）的学名のPLURONIC（商標登録）ポリマーにおける、ポリオキシ
エチレンのポリオキシプロピレンに対する割合との関係を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 35/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＯ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ， ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ， ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，Ｐ Ｔ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ， ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 マイケル・コールマン アメリカ合衆国77381テキサス州ザ・ウッ ドランズ、サウス・ヘイブンリッジ50番 (72)発明者 フィオナ・マクローリン アメリカ合衆国77098テキサス州ヒュース トン、ブラナード・ナンバー３、2010番 (72)発明者 アラン・ロラン アメリカ合衆国77381テキサス州ザ・ウッ ドランズ、ドリフトオーク・サークル22番 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA20 BA33 BA36 CA02 CA11 CA12 CA20 DA03 EA04 FA02 GA11 GA14 HA17 HA20 4C076 AA11 AA16 BB15 CC27 EE23Q FF63 GG41 4C084 AA13 MA21 NA03 NA12 ZB261

Claims (73)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 （ａ）ポロキサマー188、ポロキサマー237、ポロキサマー33
    8、ポロキサマー124、ポロキサマー401、テトロニック904、テトロニック908、
    テトロニック1107およびテトロニック90R4から成る群より選択される保護性、相
    互作用性、非凝集性化合物および、（ｂ）遺伝子産物をコードする配列を含む核
    酸分子を含む、核酸分子を細胞に送達するための組成物。
  2. 【請求項２】 該遺伝子産物がポリペプチドまたはタンパク質を含む、請求
    項１に記載の組成物。
  3. 【請求項３】 該ポリペプチドまたはタンパク質が治療分子を含む、請求項
    ２に記載の組成物。
  4. 【請求項４】 該保護性、相互作用性、非凝集性化合物が標的リガンドと結
    合している、請求項１に記載の組成物。
  5. 【請求項５】 該標的リガンドが抗体である、請求項４に記載の組成物。
  6. 【請求項６】 該核酸が凝集化核酸、カチオン性脂質と共に製剤化されてい
    る核酸、ペプチドまたはカチオン性ポリマーと共に製剤化されている核酸から成
    る群より選択される、請求項１に記載の組成物。
  7. 【請求項７】 該化合物が0.05％〜10％の濃度で存在する、請求項１に記載
    の組成物。
  8. 【請求項８】 該化合物が約10％(w/v)またはそれ未満の濃度で存在する、
    請求項７に記載の組成物。
  9. 【請求項９】 該化合物が8.0％またはそれ未満の濃度で存在する、請求項
    ８に記載の組成物。
  10. 【請求項１０】 該化合物が5％またはそれ未満の濃度で存在する、請求項
    ９に記載の組成物。
  11. 【請求項１１】 該標的リガンドが保護性、相互作用性、非凝集性、両親媒
    性化合物と非共有結合している、請求項４に記載の組成物。
  12. 【請求項１２】 該標的リガンドが該保護性、相互作用性、非凝集性化合物
    と共有結合している、請求項４に記載の組成物。
  13. 【請求項１３】 該抗体が哺乳類の細胞内部で抗原と特異的に結合する、請
    求項５に記載の組成物。
  14. 【請求項１４】 該核酸分子がデオキシリボ核酸分子を含む、請求項１に記
    載の組成物。
  15. 【請求項１５】 該核酸分子が１つまたはそれ以上の治療分子を発現し、真
    核生物のプロモーターを有する１つまたはそれ以上のプラスミドである、請求項
    １４に記載の組成物。
  16. 【請求項１６】 該核酸分子がRNAを含む、請求項１に記載の組成物。
  17. 【請求項１７】 哺乳動物の組織中に請求項１に記載の組成物を導入する工
    程を含む、細胞に核酸分子を送達するための組成物を哺乳動物に投与する方法。
  18. 【請求項１８】 抗体応答を引き起こす、請求項１７に記載の方法。
  19. 【請求項１９】 免疫応答を引き起こす、請求項１７に記載の方法。
  20. 【請求項２０】 該組成物を哺乳動物の組織中に導入する工程が注射によっ
    て行なわれる、請求項１７に記載の方法。
  21. 【請求項２１】 該組織が筋肉である、請求項２０に記載の方法。
  22. 【請求項２２】 該組織が腫瘍である、請求項２０に記載の方法。
  23. 【請求項２３】 哺乳類の異常または疾患を患っている哺乳動物に、治療的
    有効量の請求項１に記載の組成物を投与する工程を含む、該異常または疾患を処
    置する方法。
  24. 【請求項２４】 該疾患または異常が癌である、請求項２３に記載の方法。
  25. 【請求項２５】 請求項１に記載の組成物についてのパルス電圧送達が起こ
    るような構成および配置を持つ装置を使用して、該組成物を生物の細胞に与える
    工程を含む、核酸分子を生物に送達するための方法。
  26. 【請求項２６】 該生物が哺乳動物である、請求項２５に記載の方法。
  27. 【請求項２７】 該哺乳動物がヒトである、請求項２５に記載の方法。
  28. 【請求項２８】 該送達装置が、パルス電圧によって該細胞に該組成物を送
    達するエレクトロポレーション装置である、請求項２５に記載の方法。
  29. 【請求項２９】 該組成物の該送達が該細胞を電場にかけることを含む、請
    求項２５に記載の方法。
  30. 【請求項３０】 請求項１に記載の組成物を提供するための容器と、（i）
    生物の細胞に該組成物を送達するためのパルス電圧装置であって、該容器と組み
    合わせることができるパルス電圧装置、または（ii）該パルス電圧装置を使って
    該組成物を送達する方法を説明した説明書のいずれかを含む、請求項３０に記載
    のキットを製造する方法。
  31. 【請求項３１】 請求項１に記載の組成物を提供するための容器を、（i）
    生物の細胞に該組成物を送達するためのパルス電圧装置であって、該容器と組み
    合わせることができるパルス電圧装置、または（ii）該パルス電圧装置を使って
    該組成物を送達する方法を説明した説明書のいずれかと組み合わせる工程を含む
    方法。
  32. 【請求項３２】 癌または感染性疾患を患っている哺乳動物を処置する方法
    であって、核酸分子が癌抗原または該感染性疾患の抗原をコードしている請求項
    １に記載の組成物を該哺乳動物の細胞にパルス電圧送達する構成および配置を持
    つ装置を用いて、該組成物を該哺乳動物の細胞に与える工程を含む方法。
  33. 【請求項３３】 該癌抗原がMAGE 1であり、かつ該癌がメラノーマである、
    請求項３２に記載の方法。
  34. 【請求項３４】 該感染性疾患の抗原がHBVコア抗原であり、該感染性疾患
    が慢性肝炎である、請求項３２に記載の方法。
  35. 【請求項３５】 （ａ）ポロキサマー188、ポロキサマー237、ポロキサマー
    338、ポロキサマー124およびポロキサマー401から成る群より選択されるポロキ
    サマーと、（ｂ）遺伝子産物をコードする配列を含む核酸分子とを含む、核酸分
    子を細胞に送達するための組成物。
  36. 【請求項３６】 該ポロキサマーがポロキサマー188である、請求項３５に
    記載の組成物。
  37. 【請求項３７】 該ポロキサマー188が0.25％〜10％(w/v)の濃度で存在する
    、請求項３６に記載の組成物。
  38. 【請求項３８】 該ポロキサマー188が約5％〜約8.0％(w/v)の濃度で存在す
    る、請求項３７に記載の組成物。
  39. 【請求項３９】 該ポロキサマー188が約8.0％(w/v)またはそれ未満の濃度
    で存在する、請求項３５に記載の組成物。
  40. 【請求項４０】 該ポロキサマー188が約5％(w/v)またはそれ未満の濃度で
    存在する、請求項３９に記載の組成物。
  41. 【請求項４１】 該ポロキサマーがポロキサマー237である、請求項３５に
    記載の組成物。
  42. 【請求項４２】 該ポロキサマー237が約1％(w/v)またはそれ未満の濃度で
    存在する、請求項４１に記載の組成物。
  43. 【請求項４３】 該ポロキサマーがポロキサマー388である、請求項３５に
    記載の組成物。
  44. 【請求項４４】 該ポロキサマー388が約1％(w/v)またはそれ未満の濃度で
    存在する、請求項４３に記載の組成物。
  45. 【請求項４５】 該ポロキサマーがポロキサマー124である、請求項３５に
    記載の組成物。
  46. 【請求項４６】 該ポロキサマー124が約5％(w/v)またはそれ未満の濃度で
    存在する、請求項４５に記載の組成物。
  47. 【請求項４７】 該ポロキサマーがポロキサマー401である、請求項３５に
    記載の組成物。
  48. 【請求項４８】 該ポロキサマー401が5％(w/v)またはそれ未満の濃度で存
    在する、請求項４７に記載の組成物。
  49. 【請求項４９】 該ポロキサマー401が約2.5％(w/v)またはそれ未満の濃度
    で存在する、請求項４８に記載の組成物。
  50. 【請求項５０】 該遺伝子産物がポリペプチドまたはタンパク質を含む、請
    求項３５に記載の組成物。
  51. 【請求項５１】 該ポロキサマーが標的リガンドと結合している、請求項３
    ５に記載の組成物。
  52. 【請求項５２】 該標的リガンドが抗体を含む、請求項５１に記載の組成物
    。
  53. 【請求項５３】 該核酸が凝集化核酸、カチオン性脂質と共に製剤化されて
    いる核酸、ペプチドまたはカチオン性ポリマーと共に製剤化されている核酸から
    成る群より選択される、請求項３５に記載の組成物。
  54. 【請求項５４】 該遺伝子産物がポリペプチドまたはタンパク質を含む、請
    求項３５に記載の組成物。
  55. 【請求項５５】 該ポリペプチドまたはタンパク質が治療分子を含む、請求
    項５４に記載の組成物。
  56. 【請求項５６】 請求項３５に記載の組成物を哺乳動物の組織中に導入する
    工程を含む、細胞に核酸分子を送達するための組成物を哺乳動物に投与する方法
    。
  57. 【請求項５７】 (ａ) テトロニック904、テトロニック908、テトロニック1
    107およびテトロニック90R4を含む群より選択されるポロキサミンと、（ｂ）遺
    伝子産物をコードする配列を含む核酸分子とを含む、細胞に核酸分子を送達する
    ための組成物。
  58. 【請求項５８】 該ポロキサミンが0.05％〜5％(w/v)の濃度で存在する、請
    求項５７に記載の組成物。
  59. 【請求項５９】 該ポロキサミン188が約1％〜約5％(w/v)の濃度で存在する
    、請求項５８に記載の組成物。
  60. 【請求項６０】 該ポロキサミンがテトロニック904である、請求項５７に
    記載の組成物。
  61. 【請求項６１】 該テトロニック904が約0.5％(w/v)またはそれ未満の濃度
    で存在する、請求項６０に記載の組成物。
  62. 【請求項６２】 該テトロニック904が約0.1％(w/v)またはそれ未満の濃度
    で存在する、請求項６１に記載の組成物。
  63. 【請求項６３】 該遺伝子産物がポリペプチドまたはタンパク質を含む、請
    求項５７に記載の組成物。
  64. 【請求項６４】 該核酸が凝集化核酸、カチオン性脂質と共に製剤化されて
    いる核酸、ペプチドまたはカチオン性ポリマーと共に製剤化されている核酸から
    成る群より選択される、請求項５７に記載の組成物。
  65. 【請求項６５】 該遺伝子産物がポリペプチドまたはタンパク質を含む、請
    求項５７に記載の組成物。
  66. 【請求項６６】 該ポリペプチドまたはタンパク質が治療分子を含む、請求
    項６５に記載の組成物。
  67. 【請求項６７】 哺乳動物の組織中に請求項５７に記載の組成物を導入する
    工程を含む、細胞に核酸分子を送達するための組成物を哺乳動物に投与する方法
    。
  68. 【請求項６８】 該組成物を注射により投与することをさらに含む、請求項
    ５６および６７に記載の方法。
  69. 【請求項６９】 該組成物を筋肉内注射により投与することをさらに含む、
    請求項１７、５６および６７に記載の方法。
  70. 【請求項７０】 該組成物を静脈内注射により投与することをさらに含む、
    請求項１７、５６および６７に記載の方法。
  71. 【請求項７１】 該組織が筋肉である、請求項５６および６７に記載の方法
    。
  72. 【請求項７２】 該組織が腫瘍である、請求項５６および６７に記載の方法
    。
  73. 【請求項７３】 該組織が肺である、請求項１７、５６および６７に記載の
    方法。
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