EA002087B1

EA002087B1 - Способ введения фармацевтических препаратов и нуклеиновых кислот в скелетную мышцу

Info

Publication number: EA002087B1
Application number: EA199900882A
Authority: EA
Inventors: Якоб Матиесен; Терье Лёмо
Original assignee: Электрофект Ас
Priority date: 1997-04-03
Filing date: 1998-04-03
Publication date: 2001-12-24
Also published as: JP2006061701A; DE69835761T2; NO327806B1; CA2285056C; CN1198665C; IL132103A0; US6110161A; KR20010005932A; EP1023107B1; KR100427786B1; ES2273408T3; AU6990698A; DE69835761D1; AU733628B2; ATE337794T1; WO1998043702A2; NZ337853A; CN1276740A; JP2001520537A; NO994820D0

Abstract

Предложен эффективный способ введения фармацевтических препаратов и нуклеиновых кислот в скелетную мышцу, включающий в себя инъекцию указанных веществ в мышцу с последующей электрической стимуляцией, формирующей порообразование в соответствующих тканях.

Description

Данное изобретение относится к способу придания скелетной мышце полупроницаемости для фармацевтических препаратов и нуклеиновых кислот. Более конкретно, скелетной мышце придают полупроницаемость при помощи электрической стимуляции мышцы при малых напряженностях поля после инъекции фармацевтических препаратов и нуклеиновых кислот.

Уровень техники

Биологи постоянно открывают гены, ответственные за многие заболевания человека, такие как некоторые формы рака молочной железы, рака толстой кишки, мышечной дистрофии и цистного фиброза. Кроме того, постоянно обнаруживаются гены, которые кодируют бактериальные и вирусные антигены (например, белки вирусного капсида). Несмотря на эти новые открытия, главная проблема, с которой сталкиваются медики, - как безопасно доставить эффективные количества этих агентов больным для лечения заболевания или генетической иммунизации.

В настоящее время большинство фармацевтических агентов принимаются орально или внутривенно. Однако оральный и внутривенный способы доставки препаратов и генов имеют несколько недостатков. Во-первых, большой процент орально или внутривенно доставляемых препаратов разрушается организмом до того, как они достигнут целевых органов или клеток. Например, кислоты и ферменты в желудке и кишечнике могут разрушать многие фармацевтические препараты. Сходным образом, гены могут быстро разрушаться обнаруженными в крови и печени белками, которые разрушают ДНК. Кроме того, внутривенно введенные препараты и гены часто изолируются печенью или иммунной системой до поступления в больной орган или клетки. Во-вторых, оральная и внутривенная доставка препаратов и генов является неспецифической. Это означает, что препарат или ген доставляется как к целевым, так и к нецелевым клеткам.

Скелетная мышца является прекрасным кандидатом для доставки препаратов генной терапии и генетической иммунизации. Вопервых, скелетные мышцы составляют свыше 50% массы тела человека, причем большинство их в отличие от других тканей и органов тела легко доступно. Во-вторых, существуют многочисленные наследственные и приобретенные заболевания, такие как мышечная дистрофия Дюшена (МДД), сахарный диабет, гиперлипидемия и сердечно-сосудистые заболевания, которые являются хорошими вариантами заболеваний для доставки лекарств и генов в мышцу. В-третьих, мышца является идеальным местом для генетической иммунизации, поскольку она легко доступна, а белки, синтезированные в мышце, секретируются, вызывая таким образом иммунный ответ. Наконец, клетки скелетных мышц не размножаются. Поэтому они способны экспрессировать белок, кодируемый геном, в течение более длительного периода времени, чем можно ожидать от других типов клеток, которые непрерывно делятся. Поскольку белок экспрессируется в течение более длительного времени, необходимо меньше введений.

Однако в настоящее время не существует невирусного способа эффективной доставки фармацевтических препаратов и ДНК в скелетную мышцу ίη νίνο. Существует несколько способов, известных специалистам в данной области, для переноса фармацевтических препаратов и ДНК в скелетную мышцу, таких как внутримышечная инъекция ДНК. Однако возможность клинического применения прямой инъекции в мышцу ограничена главным образом из-за низкой эффективности трансфекции, обычно эффективность трансфекции меньше 1%. Было показано, что эффективность трансфекции может быть повышена, если инъекции ДНК производят в регенерирующую мышцу. Инъекцию стимулируют за три дня до инъекции ДНК препаратом Бивукаином. Хотя инъекция в регенерирующую мышцу, стимулированную Бивукаином, демонстрирует более высокую эффективность, способ имеет ограниченную применимость для человека из-за тяжелых повреждений, причиняемых мышце.

Из вышесказанного очевидно, что прогрессом в данной области стало бы обеспечение невирусного способа доставки фармацевтических препаратов и ДНК только к больным органам и клеткам, прогрессом в данной области стало бы также обеспечение способа доставки фармацевтических препаратов и ДНК непосредственно в скелетную мышцу путем электропорообразования, в особенности, если бы способ электропорообразования мог обеспечить доставку терапевтически эффективных количеств фармацевтических препаратов и ДНК одновременно в различные точки скелетной мышцы. Дальнейшие успехи способа могли бы быть связаны с возможностью регулирования эффективности доставки.

Сущность такого способа раскрывается ниже.

Сущность изобретения

Заявляемое изобретение обеспечивает способ доставки или трансфекции фармацевтических препаратов и ДНК в скелетную мышцу. Не касаясь теории, представляется, что способ сходен с электропорообразованием. Принцип электропорообразования заключается в том, что клетки действуют как электрический конденсатор, в целом неспособный проводить ток. Поэтому воздействие на клетки высоковольтным электрическим полем создает в клеточной мембране временные проницаемые структуры или микропоры. Эти поры достаточно велики для того, чтобы позволить фармацевтическим препаратам, ДНК и другим полярным соединениям получить доступ внутрь клетки. Со временем поры в клеточной мембране закрываются и клетка вновь становится непроницаемой.

Обычное электропорообразование, тем не менее, использует высокие напряженности поля от 0,4 до нескольких кВ/см. В противоположность обычному электропорообразованию напряженность поля, используемая в данном изобретении, варьируют от примерно 25 В/см до 250 В/см. Считается, что эти более низкие напряженности поля вызывают меньшее повреждение мышцы без разрушения и с несомненным повышением эффективностей трансфекции. Более того, с использованием способа по данному изобретению, эффективности трансфекции можно регулировать изменением таких параметров, как частота, длительность импульса и число импульсов.

Повышение эффективности трансфекции ДНК наблюдается только в том случае, если мышцу электрически стимулируют сразу же или через короткое время после инъекции ДНК. Таким образом, вызываемое стимуляцией свойство полупроницаемости ткани обратимо. Более того, оно зависит от тока, идущего через мышцу; активность, индуцируемая через нерв, не влияет на эффективность трансфекции.

Будучи трансфицированными, мышечные клетки способны экспрессировать белки, кодируемые нуклеиновой кислотой. Поэтому способ трансфекции по данному изобретению может быть использован, например, для трансфекции векторов экспрессии для генетической иммунизации (например, ДНК-вакцины). В одном варианте осуществления изобретения кроликов трансфицировали плазмидами, содержащими кДНК для агрина крыс. Трансфицированные мышцы продуцировали и секретировали белок агрин. Через девятнадцать дней после трансфекции сыворотка кроликов содержала значительное количество антител к агрину крысы.

Во втором варианте осуществления изобретения мышей и крыс трансфицировали с использованием способа по данному изобретению одним (или несколькими) из трех различных эукариотных векторов экспрессии, содержащих кодирующие последовательности для ΌΗ-ΟΝΤΡ (ЭН-ЦНТФ), агонистического варианта цилиарного нейротрофического фактора человека, ΆΆΌΗ-ΟΝΤΡ (ΆΆΌΗ-ЦНТФ), антагонистического варианта цилиарного нейротрофического фактора человека, и кес-ЭНСХГР (втор-ΌΗЦНТФ), секретируемой формы ΌΗ-ЦНТФ. Мышцы либо не подвергали электрической стимуляции, либо стимулировали непосредственно после инъекции ДНК. Кровь брали в различные моменты времени и определяли титры антител. Как у крыс, так и у мышей электрическая стимуляция сразу же после инъекции ДНК приводила примерно к 5-10-кратному повышению титров антител по сравнению с простой инъекцией ДНК.

Способ трансфекции по данному изобретению может быть использован также для системной доставки белков с целью лечения заболеваний. В одном предпочтительном варианте осуществления изобретения ДНК-плазмиду, включающую ген эритропоэтина (ЭПО), инъецировали в скелетную мышцу, которую стимулировали по данному изобретению. Контроли либо не стимулировали, либо трансфицировали контрольным вектором, не содержавшим ген ЭПО. Через 14 дней только мыши, трансфицированные ЭПО способом по данному изобретению, продемонстрировали повышенный гематокрит, указывавший на то, что трансфицированные мышцы были способны продуцировать и секретировать в кровоток значительные количества ЭПО.

Ненуклеиновые кислоты также могут быть трансфицированы с использованием способа по данному изобретению. В одном варианте осуществления изобретения декстран, конъюгированный с родамином, инъецировали в мышцу с последующей электрической стимуляцией. Через три-пять дней мышцы заморозили в жидком азоте и изготовили срезы на криостате. В клетках инъецированных и стимулированных мышц наблюдали флуоресценцию, свидетельствовавшую о том, что декстран, конъюгированный с родамином, был способен проникать в мышечные клетки и оставаться в них.

Эти и другие задачи и преимущества данного изобретения станут очевидными при рассмотрении сопутствующих фигур и графиков, а также при чтении нижеследующего подробного описания и прилагаемой формулы изобретения.

Перечень фигур чертежей

Более подробное описание изобретения, кратко изложенного выше, будет произведено со ссылками на прилагаемые чертежи. Они дают информацию, касающуюся исключительно типичных вариантов осуществления изобретения, и поэтому их не следует считать ограничивающими его объем.

Фиг. 1 графически иллюстрирует способ доставки фармацевтических препаратов и ДНК в скелетную мышцу по данному изобретению.

Фиг. 2 является графической иллюстрацией электрической стимуляции, осуществляемой в соответствии со способом по данному изобретению.

Фиг. 3 иллюстрирует целые мышцы, в которые были произведены инъекции 50 мкл раствора плазмидной ДНК КБУ-Ьас Ζ в концентрации 1 мкг/мкл. Мышцы на фиг. 3 а и 3Ь были удалены через 15 дней после инъекции ДНК. Мышцы на фиг. 3 с и 36 были удалены через 7 дней после инъекции ДНК. Все мышцы являются парными от одной и той же крысы.

Фиг. 4 - картины целой мышцы и среза трансфицированной мышцы толщиной 1 мм. Темное окрашивание является индикатором онитрофенил-Ь-О-галактопиранозида (ОНФГ), который катализировался β-галактозидазой в мышце с образованием темного преципитата. Стрелки указывают на мышечные волокна, которые были успешно трансфицированы с использованием способа по данному изобретению.

Фиг. 5 включает среднее число трансфицированных волокон от каждой группы скелетных мышц, показанных на фиг. 3.

Фиг. 6 является гистограммой, иллюстрирующей среднее число трансфицированных волокон мышц из нескольких различных экспериментов и нескольких различных партий ДНК, объединенных вместе. В колонках, обозначенных как 8ОЬ 8 и ΕΌΕ 8, мышцы (16 в каждой группе) стимулировали сразу же после инъекции ДНК. В колонках, обозначенных как 8ОЬ N8 и ΕΌΕ N8, мышцы (по 10 в каждой группе) стимулировали через нерв, не стимулировали вообще или производили прямую стимуляцию за 10 мин до инъекции ДНК.

Фиг. 7 является графиком, иллюстрирующим число трансфицированных волокон скелетной мышцы как функцию логарифма частоты стимуляции. Продолжительность серии стимулирующих импульсов была постоянной и равной 1с.

Фиг. 8 - фотография трансфицированных мышц, от которых были получены данные на фиг. 7.

Фиг. 9 иллюстрирует результаты, полученные при трансфекции целых мышц в соответствии со способом по данному изобретению с использованием двух различных электродов.

Фиг. 10 - график, иллюстрирующий сопоставление зависимостей числа трансфицированных волокон скелетной мышцы от возрастающей частоты и от возрастающего числа импульсов.

Фиг. 11 является графической иллюстрацией числа трансфицированных волокон скелетной мышцы как функции числа импульсов при постоянной частоте.

Фиг. 12 является графиком, иллюстрирующим зависимость средней активности люциферазы от числа импульсов.

Фиг. 13 является графиком, иллюстрирующим зависимость способа стимуляции по данному изобретению от напряжения. Фиг. 13а иллюстрирует активность люциферазы мышцы, стимулируемой при различном напряжении. Фиг. 13Ь иллюстрирует среднюю активность люциферазы мышц, стимулированных при амплитуде свыше 13 В и ниже 5 В.

Фиг. 14 является графиком, иллюстрирующим влияние длительности импульса на эффективность трансфекции.

Фиг. 15 является гистограммой, иллюстрирующей сравнение эффективностей трансфекции при различных длительностях импульсов и различных числах импульсов.

Фиг. 16 является гистограммой, иллюстрирующей влияние концентрации ДНК на эффективность трансфекцим.

Фиг. 17 является фотографией трансфицированных мышц, иллюстрирующей повреждение, вызванное стимуляцией, и регенерацию мышцы за короткий промежуток времени. Фиг. 17а иллюстрирует инъецированную мышцу, которая не стимулировалась. Фиг. 17Ь иллюстрирует повреждение мышцы после ее стимуляции. Фиг. 1 7с иллюстрирует мышцу, стимулированную при более жестких условиях стимуляции. Фиг. 176 иллюстрирует тот факт, что мышцы, стимулированные при тех же условиях, что и мышцы на фиг. 17с, полностью регенерировали и восстановились через 14 дней. Фиг. 1 7е иллюстрирует мышцы, трансфицированные зеленым флуоресцирующим белком (ЗФБ). Фиг. 17Г иллюстрирует тот факт, что вблизи поврежденной зоны могут быть видны трансфицированные волокна.

Фиг. 18 является фотографией клеток, окрашенных поликлоновыми антителами к агрину, полученными от кролика, генетически иммунизированного вектором экспрессии, кодирующим агрин крысы, с использованием техники стимуляции по данному изобретению.

Фиг. 19 является графиками, иллюстрирующими повышение генетической иммунизации мышей и крыс при использовании техники стимуляции по данному изобретению по сравнению с изолированной инъекцией ДНК.

Фиг. 20 является фотографией мышц, трансфицированных декстраном, конъюгированным с родамином, и зеленым флуоресцирующим белком. Верхняя часть: флуоресценция родамина из декстрана, конъюгированного с родамином. Средняя часть: тот же срез, что и выше, но с фильтрами, выявляющими флуоресценцию ЗФБ. Нижняя часть: окраска предыдущего среза гематоксилином и эозином.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

Данное изобретение решает задачу создания нового способа повышения проницаемости ткани скелетной мышцы, обеспечивающего таким образом возможность проникновения или трансфекции фармацевтических препаратов и нуклеиновых кислот в клетки. Согласно этому способу через ткань скелетной мышцы пропускают электрический ток предварительно заданной величины. Однако в отличие от ранее описанных способов электропорообразования, параметры в способе по данному изобретению уникальны, в частности, в отношении низкой напряженности использованного электрического поля и невысокого уровня возникающего повреждения. Прочие параметры, такие как число серий импульсов, частота, число импульсов и длительность импульсов, можно варьировать с целью регулирования количества доставленных фармацевтического препарата или нуклеиновой кислоты.

Как показано на фиг. 1, обычно скелетную мышцу обнажают и инъецируют в нее заданное предварительно количество молекул. В одном варианте осуществления изобретения ДНК растворяют в 0,9% растворе хлористого натрия (ЫаС1). Однако для изобретения выбор определенного растворителя некритичен. Например, специалистам в данной области хорошо известно, что увеличивать захват ДНК в скелетной мышце способны и другие растворители, такие как сахароза. С учетом различных аспектов полезности совместно с представляющей интерес молекулой могут быть трансфицированы также другие вещества. Например, Р188 (Ьее с1 а1. ΡΝΆ8, 4524-8, 10, 89 (1992)), который, как известно, герметизирует мембраны, проницаемость которых повышена под действием электрического поля, может положительно влиять на эффективности трансфекции путем повышения уровня жизнеспособности трансфицированных волокон.

Возвращаясь к фиг. 1, следует отметить, что электроды помещают на мышце на расстоянии примерно 1-4 мм друг от друга вблизи зоны инъецирования молекулы. Точное положение или конструкция электродов некритичны, поскольку ток пропускают через мышечные волокна перпендикулярно к их расположению в зоне инъецированной молекулы.

Сразу же после установки электродов в нужном положении в мышце производят электропорообразование или стимуляцию. Как проиллюстрировано на фиг. 2, стимуляция осуществляется прямоугольными биполярными импульсами, имеющими предварительно заданную амплитуду и длительность. Чтобы оптимизировать эффективности трансфекции, эти параметры изменяли в широком диапазоне и сравнивали эффективности трансфекции. Например, напряжения варьировали в диапазоне примерно от 0 до 50 В, длительность импульсов колебалась от 5 мкс до 5 мс, число импульсов изменяли от одного импульса до 30000 импульсов, а частоту импульсов в сериях варьировали от 0,5 до 1000 Гц.

Вывод из этих результатов состоит в том, что если напряженность поля выше 50 В/см, другие параметры можно варьировать в зависимости от желаемых условий эксперимента. Хотя не было обнаружено верхней границы, высокие эффективности трансфекции наблюдались при наиболее высоких напряженностях поля. Напряженность поля стимуляции можно рассчитать с использованием формулы

Е = У/(2т 1η(Ό/τ)), которая позволяет рассчитать электрическое поле между проволоками, если Ό>>τ. В формуле V = напряжение = 10 В, Ό = расстояние между центрами проволок = 0,1-0,4 см, г = диаметр электрода = 0,06 см (см. НоГтапп С. А. Се11з ίη е1ес!г1с Пе1б8. Ιη Е. №итапп, А.Е. 8о\\сг5. & С.А. 1огбап (Ебз.), Е1ес1торотабоп апб е1ес1тоГи8юп ίη се11 Ью1оду (рр. 389-407). Р1епит РиЬйзЫпд Сотротабоп (1989)). При 10 В напряженность поля равна от 163 В/см до 43 В/см (для межэлектродного расстояния от 0,1 до 0,4 см, соответственно). Поскольку Ό ненамного больше г, более подходящей для использования может быть формула для электрических полей между большими параллельными пластинками:

Е=АЭ

Эта формула дает сходные уровни напряженности поля между 100 В/см и 25 В/см (при межэлектродном расстоянии от 0,1 до 0,4 см, соответственно). Следует учесть, что на напряженность поля, как и на прочие параметры, влияет процесс трансфекции ткани, и поэтому оптимальные условия могут варьировать. Однако с использованием параметров, заданных в настоящем изобретении, оптимальные параметры может легко подобрать любой специалист в данной области.

Как проиллюстрировано на фиг. 3 и 5-8, способ по данному изобретению резко повышает эффективность доставки лекарственного препарата и ДНК в скелетную мышцу. В одном варианте осуществления изобретения в камбаловидную или ДРП (длинный разгибатель пальцев, ех1еп8от б1дйотит 1опдиз) мышцы крысы инъецировали ДНК-плазмиду, содержащую ген β-галактозидазы (1ас Ζ). Этот ген дает белок, способный превращать бесцветный субстрат в синий, который можно проанализировать визуально или измерить спектрофотометрически. Фиг. 3 изображает репрезентативные камбаловидную и ДРП мышцы, которые были трансфицированы геном β-галактозидазы при использовании различных параметров стимуляции.

Фиг. 3 а иллюстрирует повышенную эффективность доставки ДНК в камбаловидной и ДРП мышцах, которые были трансфицированы в соответствии со способом по данному изобретению. Камбаловидная и ДРП мышцы (п=3) вначале были денервированы путем перерезки седалищного нерва. Это было произведено для того, чтобы устранить любое влияние вызванной нервом активности, которое могло бы участвовать в наблюдавшемся возрастании эффективности трансфекции. Через три дня после денервации в мышцы инъецировали ген βгалактозидазы, как описано выше. После инъекции ДНК мышцы или не обрабатывали, или, сразу же после инъекции ДНК, стимулировали в соответствии со способом по данному изобретению.

Через пятнадцать дней после инъекции ДНК камбаловидную и ДРП мышцы анализировали. Как иллюстрируется на фиг. 3а, мышечные клетки, стимулированные сразу же после инъекции ДНК (нижние сектора), содержат больше синего продукта, что свидетельствует о том, что в мышечные клетки было внедрено больше гена β-галактозидазы. Эффективность трансфекции выражали количественно путем подсчета мышечных волокон, содержащих синий продукт, на поперечном срезе мышцы размером 1 мм, что проиллюстрировано на фиг. 4. Как видно из гистограммы на фиг. 5а, камбаловидная мышца, трансфицированная с использованием способа по данному изобретению, показала 47-кратное превышение над нестимулированными мышцами. Сходным образом ДРП мышца, трансфицированная с использованием способа по данному изобретению, показала 12кратное превышение над нестимулированными мышцами.

Чтобы определить, влияла ли активность нервов на эффективность трансфекции, способ по данному изобретению был выполнен на иннервированных (непересеченный седалищный нерв) и денервированных (седалищный нерв пересечен) камбаловидной и ДРП мышцах, как описано выше. Как проиллюстрировано на фиг. 3Ь, через пятнадцать дней после инъекции ДНК как иннервированные, так и денервированные мышцы образовали большие количества синего продукта, что является индикатором высокоэффективного переноса гена β-галактозидазы. Как проиллюстрировано на фиг. 5Ь, количество трансфицированных мышечных волокон подтверждает высокую эффективность трансфекции как иннервированных, так и денервированных мышц.

Чтобы исключить возможность того, что наблюдавшаяся повышенная эффективность трансфекции была вызвана мышечной активностью, прямую стимуляцию седалищного нерва сравнили со стимуляцией мышцы (п=5). Если повышенная эффективность трансфекции была вызвана мышечной активностью, эффективность трансфекции в мышцах, стимулированных через нерв, должна иметь сходные значения с эффективностью трансфекции при прямой стимуляции мышц. Как проиллюстрировано на фиг. 3с, прямая стимуляция нерва существенно не увеличивала эффективности трансфекции по сравнению с прямой стимуляцией мышц. Как проиллюстрировано на фиг. 5с, как в камбаловидной, так и в ДРП мышце после прямой стимуляции мышц наблюдали 10-кратное увеличение эффективности трансфекции.

Как проиллюстрировано на фиг. 36, повышение эффективности является временным, совпадающим с электропорообразованием. Мышцы, стимулированные сразу же после инъекции ДНК, обнаруживают значительно больше синей краски по сравнению с мышцами, стимулированными перед инъекцией ДНК. Фактически, мышцы, стимуляцию которых производили после инъекции ДНК, обнаружили эффективности трансфекции в 10-25 раз выше, чем мышцы, которые стимулировали за 10 мин до инъекции ДНК (фиг. 56).

Фиг. 6 суммирует результаты данного изобретения. Мышцы из нескольких различных экспериментов и нескольких различных серий ДНК сгруппированы вместе. В колонках, помеченных как 8ОБ 8 и ЕЭБ 8, стимуляцию мышц (16 в каждой группе) производили сразу же после инъекции ДНК. В колонках, помеченных как 8ОЬ N8 и ЕОБ N8, мышцы (10 в каждой группе) были стимулированы через нерв, не стимулировались вообще или стимулировались непосредственно за 10 мин до инъекции ДНК.

Использованный для экспериментов электрический стимулятор был произведен фирмой ЕНС (Брунсвик, ΜΕ 04011). Использовали стимуляторы РиИаг 6Ьр и РиИаг бЬр-а/к. РиИаг 6Ьра/§ дает максимальное напряжение 150 В и максимальный ток 50 мА. Максимальное напряжение, которое может быть подано, требует межэлектродного сопротивления больше 3000 Ом. Стимуляторы работали в режиме постоянного напряжения. Из-за низкого мышечного сопротивления напряжения были меньше, чем в нижеприведенных примерах. Во всех экспериментах ток поддерживали равным 50 мА.

Для специалистов в данной области должно быть очевидно, что могут быть использованы и другие, причем многочисленные, конфигурации электродов. Например, фиг. 9 иллюстрирует результаты, полученные с использованием двух различных конфигураций электродов. Электрод, использованный для получения данных (А), размещали перпендикулярно мышечным волокнам. Он состоял из серебряной проволоки диаметром (6) 0,6 мм, (С) (это электрод, использовавшийся во всех экспериментах за исключением (В)). С каждой стороны мышцы располагали по одному электроду. Короткий сегмент в средней трети мышцы является положительным в отношении окраски на Бас Ζ (А), что указывает на местную экспрессию. В (В) использовали электрод размером 1,5 см, изготовленный из изолированной серебряной проволоки (6=0,3 мм). Изоляцию удаляли с коротких сегментов (0,5-1,0 мм) вдоль проволоки с интервалами, равными 2 мм (Ό). Электрод вводили в мышцу параллельно мышечным волокнам. Одну из двух проволок электрода вводили в мышцу параллельно мышечным волокнам. Вторую проволоку помещали на поверхность мышцы также параллельно волокнам. Оба типа электродов (фиг. 9с и 96) дали сходное число трансфицированных волокон (примерно 250). Использование более длинного электрода, параллельного мышечным волокнам, однако, привело к значительно более широкому распространению окрашивания, указывая на трансфекцию вдоль более длинного сегмента волокон и/или на повышенную трансфекцию.

Мышцы окрашивали на Бас Ζ целыми блоками с помощью способов, хорошо известных специалистам в данной области. После окрашивания делали снимки с наиболее синей стороны мышцы. После этого мышцу разрезали на три части, как показано на фиг. 2. Подсчитывали число синих волокон в срезе толщиной примерно 1 мм из середины мышцы (поэтому волокна, трансфицированные дистально или проксимально от среза, не считали), чтобы подсчитать трансфицированные волокна, срезы разделяли на более мелкие пучки, так что можно было различить отдельные волокна под микроскопом для препарирования.

Для четырех (4) мышц была использована конструкция р8У40-1ис. Ее инъецировали в камбаловидную мышцу, через 3 дня после этого мышцы удаляли и активность люциферазы измеряли с использованием устройства Рготеда Ьисйетаке Лккау 8у§1ет (Эау^е! е1 а1., 1993). В качестве контроля были использованы неинъецированные ДРП от тех же крыс.

Следует учесть, что в способе по данному изобретению может быть использована любая нуклеиновая кислота, например плазмидная ДНК, линейная ДНК, обратные ДНК и РНК. В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения нуклеиновая кислота является вектором экспрессии ДНК, хорошо известным специалистам в данной области. Обычно, вектор экспрессии содержит промотор, оперативно связанный с молекулой ДНК, кодирующей представляющий интерес белок, с последующим сигналом окончания, таким как сигнал полиаденилации. Могут быть включены другие элементы, необходимые для роста бактерий и для соответствующего процесса у млекопитающих, такие как область, кодирующая βлактамазу, Н источник и производный из Со1Е1 источник репликации плазмид. Сходные конструкции, содержащие представляющую интерес кодирующую область ДНК, могут быть сконструированы специалистами в данной области.

Как проиллюстрировано в нижеследующих примерах, с использованием техники по данному изобретению к мышце могут быть доставлены молекулы, не являющиеся нуклеиновыми кислотами. В одном варианте осуществления изобретения способность проникать в мышечные клетки проявлял конъюгированный с родамином декстран, инъецированный в мышцы и стимулированный в соответствии со способом по данному изобретению. Кроме того, в мышцу, в которой произошло электропорообразование, могут быть одновременно введены нуклеиновая кислота и белки. В одном варианте осуществления изобретения большой сигнал ядерной локализации Т-антигена был смешан с плазмидами, содержащими кодирующую последовательность ДНК для Ьас Ζ. Большой сигнал ядерной локализации Т-антигена является белком, который связывает ДНК и способствует ее транспорту в ядро клетки. В других системах было показано, что большой сигнал ядерной локализации Т антигена увеличивает эффективность трансфекции. При использовании способа по данному изобретению большой сигнал ядерной локализации Т-антигена также увеличивал эффективность трансфекции Ьас Ζ, свидетельствуя, что белок был способен связывать ДНК и проникать в мышечную клетку.

Примеры

Нижеследующие примеры приведены для иллюстрации различных вариантов осуществления, которые были реализованы в данном изобретении. Следует иметь в виду, что они не являются исчерпывающими или всеобъемлющими в отношении многих вариантов осуществления, которые могут быть получены в соответствии с данным изобретением.

Пример 1. Стимулированные мышцы в сравнении с нестимулированными.

Эффективности трансфекции скелетных мышц были определены при инъекции конструкции р8У40-1ис в камбаловидную мышцу. Через три дня после инъекции мышцы удаляли и измеряли активность люциферазы с использованием системы Рготеда Ьисйетаке Лккау 8у§1ет (Медисон, Висконсин) в соответствии с протоколами производителя. Нестимулированные ДРП-мышцы от тех же крыс использовали в качестве контроля. Данные приведены ниже в таблице 1.

Таблица 1

Стимулированные мышцы в сравнении с нестимулированными
Мышца	Стимулированная (относительная активность люциферазы)	Нестимулированная (относительная активность люциферазы)	Процент возрастания
Камбаловидная, животное I	34,40	1,950	1664%
Камбаловидная, животное II	21,50	0,250	8500%
ДРП, животное I		0,045
ДРП, животное II		0,046

Пример 2. Эффективность трансфекции в зависимости от частоты.

Крысам инъецировали 50 мкл раствора плазмиды, несущей ген Ьас Ζ, в концентрации 1 мг/мкл. Сразу же после инъекции размещали электроды на расстоянии 2-3 мм друг от друга, и мышцу стимулировали при следующих параметрах стимуляции: напряжение = 30 В; длительность импульса = 0,2 мс (общая длительность 0,4 мс; биполярные импульсы); серии = 30 (1 с включения - 1 с выключения в течение 1 мин). Трансфицированные волокна подсчитывали на срезе толщиной 1 мм из середины мышцы. Число трансфицированных волокон показано ниже в таблице 2 и проиллюстрировано на фиг. 7. Эти данные также показывают, что способ по данному изобретению трансфицирует не только поверхностные мышечные волокна; мышечные волокна нескольких более глубоко лежащих слоев клеток также трансфицированы.

Таблица 2

Эффективность трансфекции в зависимости от частоты
Частота (Гц)	Среднее (трансфицированные волокна)	Процент возрастания после стимуляции
0	22	-
1	83	277%
10	153	595%
100	215	877%
1000	315	1332%

Пример 3. Эффективность трансфекции в зависимости от числа импульсов.

В камбаловидные мышцы крыс ^181ат (200-270 г) инъецировали 50 мкг КЬУ плазмиды с ДНК люциферазы в 50 мкл 0,9% №1С1. Через короткое время после инъекции мышцы подвергали электрической стимуляции с использованием следующих параметров: 1000 Гц, от 0 до 1000 биполярных импульсов длительностью 200 мкс в каждой серии, серии подавали на мышцу 30 раз за период времени, равный 1 мин. Через 3 дня после трансфекции мышцы удаляли и замораживали в жидком азоте. Из мышц изготавливали срезы на криостате и окрашивали гематоксилином, эозином и сафранином (см. пример 9). Оставшиеся куски гомогенизировали, как описано ниже в примере 4. Как проиллюстрировано на фиг. 10-12, эффективность трансфекции возрастала с увеличением числа импульсов, подаваемых на мышцу.

Пример 4. Определение влияния напряжения на эффективность трансфекции.

В ДРП и камбаловидные мышцы крыс \УМаг (245-263 г) инъецировали 25 мкг К.8У плазмиды, несущей ДНК люциферазы, в 50 мкл 0,9% №1С1. Через короткое время после инъекции инъецированные мышцы подвергали электрической стимуляции с использованием следующих параметров: 100 Гц, 100 биполярных импульсов длительностью 200 мкс в каждой серии, напряжение варьировали между 0 и 47,5 В. Через 4 дня после инъекции и стимуляции мышцы удаляли, гомогенизировали в буфере системы Рго тс да (Медисон, Висконсин) и измеряли люминесценцию в соответствии с протоколами производителя. Для записи первых импульсов напряжения были использованы компьютер Масш1о8Й и программа выявления ЬаЬ^1СУ. Регистрация производилась параллельно с работой стимулирующих электродов. Измерения напряжения были выполнены вручную на распечатках как среднее значение максимального напряжения 10 импульсов примерно за 100 мс после начала стимуляции.

Как проиллюстрировано на фиг. 13 а, с возрастанием напряжения происходило выраженное повышение эффективности трансфекции. Как проиллюстрировано на фиг. 13Ь при условиях этого эксперимента мышцы, стимулировавшиеся напряжением 13В или выше, обнаруживали 40-кратное повышение активности люциферазы по сравнению с мышцами, стимулировавшимися напряжением 5 В или ниже.

Пример 5. Определение оптимальной длительности импульсов.

В камбаловидную мышцу крыс ^181ат (200-270 г) инъецировали 50 мкг ДНКплазмиды, содержащей ген β-галактозидазы, в 50 мкл 0,9% №1С1. Через короткое время после инъекции мышцы подвергали электрической стимуляции с использованием следующих параметров: 100 Гц, 25 В, 100 биполярных импульсов длительностью от 5 до 200 мкс в каждой серии. Число трансфицированных волокон подсчитывали в срезе толщиной 1 мм из середины мышцы под микроскопом для препарирования. Второй группе крыс инъецировали 25 мкг КЬУ плазмиды, несущей ДНК люциферазы, в 50 мкл 0,9% №1С1 и электрически стимулировали при тех же вышеуказанных параметрах, за исключением того, что длительности импульсов варьировали от 50 до 2000 мкс. Как проиллюстрировано ниже в таблице 3 и на фиг. 14, при этих параметрах стимуляции оптимальная длительность импульсов колебалась от примерно 50 мкс до примерно 200 мкс. Этот способ можно использовать для оптимизации длительности импульсов и при других параметрах стимуляции.

Таблица 3

Эффективность трансфекции в зависимости от длительности импульсов
Длительность импульса (мкс)	Трансфицированные волокна (среднее)	Длительность импульса (мкс)	Активность люциферазы (средняя)
0	-	0	52,7
5	51	50	631
20	107	200	536
50	228	500	348
200	272	2000	194

Пример 6. Ток в зависимости от числа импульсов.

В камбаловидные мышцы шести крыс XV Маг (178-193 г) вводили 50 мкг ДНКплазмиды, содержащей ген β-галактозидазы, в 50 мкл 0,9% №1С1. Через короткое время после инъекции мышцы подвергали электрической стимуляции, как описано выше, за исключением того, что длительность импульсов варьировали. Сравнивали следующие параметры электропорообразования: (1) 100 импульсов длительностью по 50 мкс и 1 импульс длительностью 5000 мкс, и (2) 10 серий из 100 импульсов длительностью по 50 мкс и 10 импульсов по 5000 мкс. Через 14 дней мышцы удаляли и делали срезы на криостате. Поперечные срезы окрашивали так, как это описано ранее. Подсчитывали число трансфицированных волокон. Как проиллюстрировано на фиг. 15, увеличенная длительность импульсов приводит к более высокой эффективности трансфекции.

Пример 7. Концентрация ДНК.

В мышцы ДРП шести крыс ХУМаг (178-193 г) инъецировали либо 1 мкг/мкл, либо 5 мкг/мкл

ДНК-плазмиды, содержащей ген β-галактозидазы, в 50 мкл 0,9% №1С1. Через короткое время после инъекции мышцы подвергали электрической стимуляции 30 сериями по 100 импульсов длительностью 200 мкс или не стимулировали вообще. Через 14 дней мышцы удаляли и делали срезы на криостате. Поперечные срезы окрашивали так, как это описано выше, и подсчитывали число трансфицированных волокон. Как проиллюстрировано на фиг. 15, увеличенные эффективности трансфекции были получены при более высоких концентрациях ДНК.

Пример 8. Большой сигнал ядерной локализации Т-антигена.

В мышцы крыс \У|Чаг инъецировали ДНКплазмиду, содержащую ген β-галактозидазы, при 100:1 молярном избытке большого сигнала ядерной локализации Т-антигена. В других исследованиях с трансфекцией было показано, что он усиливает трансфекцию. (См. Р.Со11ак е1 а1. Тгапкдеше Кек., 6:451-8 (1996)). Мышцы стимулировали 10 сериями по 100 импульсов длительностью 50 мкс каждый. Мышцы, содержавшие большой сигнал ядерной локализации Т-антигена, имели наибольшее число трансфицированных волокон. В частности, мышца, совместно трансфицированная большим сигналом ядерной локализации Т-антигена, имела 100 и 38 трансфицированных волокон по сравнению с 7,3 и 4,7 в мышцах, трансфицированных только ДНК, соответственно. Эти данные иллюстрируют тот факт, что эффективностям трансфекции можно помочь, смешивая ДНК с молекулами, не являющимися нуклеиновыми кислотами. Кроме того, эти данные показывают, что указанные молекулы также можно доставить в мышцу с использованием технологий электропорообразования по данному изобретению. В клетках, которые не были стимулированы после инъекции, повышения эффективности обнаружено не было.

Пример 9. Повреждение мышц в результате стимуляции.

Чтобы оценить повреждение мышцы при электропорообразовании из мышц примера 3 делали срезы и окрашивали их. Как проиллюстрировано на фиг. 17а, определенное повреждение может наблюдаться и от самой инъекции, хотя большинство нестимулированных мышц были неповрежденными. В мышцах, стимулированных 300 импульсами, наблюдалось большее повреждение (фиг. 17Ь). Как проиллюстрировано на фиг. 1 7с, мышцы, стимулированные 30 сериями по 1000 импульсов в каждой, обнаруживали большее повреждение, что свидетельствует о пропорциональности повреждения объему стимуляции. Фиг. 176 иллюстрирует тот факт, что мышцы, стимулированные при тех же условиях, что и мышцы на фиг. 1 7с, полностью регенерировали и восстанавливались через 14 дней.

В другую мышцу, которая получила наивысший объем стимуляции (30 серий по 1000 импульсов), внедрили также плазмидную ДНК, кодирующую зеленый флуоресцирующий белок (ЗФБ). Фиг. 17е изображает мышцы, трансфицированные ЗФБ. Трансфицированные волокна можно видеть вблизи поврежденной зоны (фиг. 171). Трансфицированные регенерирующие волокна никогда не обнаруживались на поперечных срезах через 3 дня после электропорообразования.

Пример 10. Генетическая иммунизация кроликов.

Самке кроликов (4,5 кг) инъецировали в правую прямую мышцу бедра 2 мл раствора ДНК-плазмиды (концентрация 1 мкг/мкл), содержащей кДНК неврального агрина крысы, управляемую промотором цитомегаловируса (ЦМВ) (Со йен е1 а1. МСЫ, 9, 237-53 (1997)). Первый миллилитр инъецировали в мышцу равными долями в десять разных мест поверхностно, после чего подавали 10 серий из 1000 импульсов каждая при частоте 1000 Гц. Второй миллилитр вводили в мышцу глубже. Чтобы исследовать сыворотку кролика, мышцы крысы и СО8-клетки трансфицировали той же конструкцией. Мышцы забирали для анализа через 5 дней после трансфекции, а СО8-клетки окрашивали через 4 дня после трансфекции.

Пробы крови отбирали на 0, 19, 50, 81 и 106 дни и разводили в соотношении 1:100 и 1:1000. Через 19 дней проба крови содержала в сыворотке количество антител, достаточное для слабого окрашивания трансфицированных волокон при разведении 1:10. В качестве положительного контроля использовали моноклоновое антитело (мАт) АС-86 (см. Ное11 е1 а1. ЕМВО 1., 12 (13): 2814-21 (1994)). Сыворотка до иммунизации не давала какого-либо окрашивания трансфицированных волокон. Все более поздние пробы крови содержали в сыворотке антитела к агрину. Пробы крови, взятые на 50-й день или позже, содержали количество антител, достаточное для окрашивания срезов при разведении 1:1000.

Фиг. 18а иллюстрирует трансфицированные агрином СО8-клетки, окрашенные антисывороткой от иммунизированного кролика (разведенной в соотношении 1:100) и вторичным антителом, конъюгированным с флуоресцеином. СО8-клетки окрашивали, сначала фиксируя их в течение 10 мин в 1,5% параформальдегиде, а затем промывая их в течение 30 мин физиологическим раствором фосфатного буфера (ФФБ). Далее клетки блокировали 0,2% раствором альбумина сыворотки быка, тритоном Х-100, 0,1% раствором в 0,1М ФФБ, в течение 4 мин. К клеткам добавляли сыворотку, разведенную в том же растворе, и инкубировали в течение 20 мин. Клетки промывали в течение 4 мин в ФФБ и инкубировали с вторичным антителом (Сарре1, 55646) в течение 10 мин с последующей промывкой ФФБ. Первичное мАт мыши Адг-86 включали в ту же смесь антител, а вторичное антитело, конъюгированное с родамином (81дта Т-5393, США) использовали при разведении 1:100. Фиг. 18Ь иллюстрирует те же клетки, окрашенные конъюгатом мАт Ад-86/родамина. Эти данные иллюстрируют потенциальные возможности техники по данному изобретению для генетической иммунизации или технологии получения ДНК-вакцин.

Пример 11. Генетическая иммунизация мышей.

Группы двухмесячных самцов крыс 8ртадие ИаМеу инокулировали билатерально в ДРП и камбаловидные мышцы общим количеством 200 мкг (4 х 50 мкл раствора ДНК в физиологическом растворе в концентрации 1 мг/мл) трех различных эукариотных векторов экспрессии, содержащих прямой ранний промотор ЦМВ и кодирующие последовательности для следующих белков: ΌΗ-ЦНТФ, агонистического варианта цилиарного нейротрофического фактора человека (8аддю е! а1. ЕМВО 1., 14, 3045-3054, 1995); ААЭН-ЦНТФ, антагонистического варианта цилиарного нейротрофического фактора человека (Όί Магсо е! а1. Ргос. №И1. АсаД. δοί. И8А, 93, 9247-9252, 1996); вюр-1)11-Ц11ТФ. секретируемой формы ΌΗ-ЦНТФ. Мышцы либо не стимулировали электрически, либо стимулировали сразу же после инъекции ДНК с использованием 30 серий по 100 или 200 прямоугольных биполярных импульсов (длительность 200 мкс; установленная амплитуда 150 В; эффективное напряжение ~ 25 В) в каждой, подаваемых с частотой 1000 Гц с двухсекундным интервалом между последовательными сериями.

Группы двухмесячных самцов мышей СЭ1 инокулировали билатерально в четырехглавые мышцы 100 мкг (2 х 50 мкл раствора ДНК в физиологическом растворе в концентрации 1 мг/мл) втор-ЭН-ЦНТФ-плазмиды с электрической стимуляцией мышцы сразу же после инъекции ДНК или без стимуляции. Условия стимуляции состояли в 10 сериях по 1000 прямоугольных биполярных импульсов (установленная амплитуда 150 В), подававшихся с частотой 1000 Гц с двухсекундным интервалом между последовательными сериями.

Кровь забирали из заглазничного синуса в выбранные моменты времени, а сыворотку приготавливали и хранили при -20°С. Присутствие антител к ЦНТФ в сыворотках крыс и мышей определяли с помощью набора для иммуноферментативного твердофазного анализа (ЕЬ18А). Пластинки для микротитрования с нанесенным на них рекомбинантным ЦНТФ человека инкубировали с серийными разведениями сыворотки с последующей обработкой антителами к 1дС (иммуноглобулину С) крыс или мышей, конъюгированными с щелочной фосфатазой (Р1егсе).

Затем пластинки инкубировали в присутствии паранитрофенилфосфата и определяли поглощение при 405 нм с использованием считывающего устройства для микропластинок. Титры антител определяли по разведению сыворотки, дававшему показание абсорбции, равное 50% от величины, полученной для концентрации насыщенного раствора антисыворотки к ЦНТФ.

Результаты показаны на фиг. 19. Из-за того, что у некоторых животных не образовалось обнаружимых количеств антител, титры невозможно было точно усреднить. Поэтому данные представлены для отдельных животных при уровне 1:100, представляющем низкий или необнаруживаемый титр антител (реципрокный титр 3/4 100). Результаты были сходными для всех использованных плазмид как у крыс, так и у мышей, что изображено на фиг. 19. Сходные результаты были получены также у крыс и мышей с другой плазмидой, кодирующей неродственный вирусный белок (данные не показаны). Как у крыс, так и у мышей электрическая стимуляция непосредственно после инъекции ДНК приводила к примерно в 5-10-кратному повышению титров антител по сравнению с простой инъекцией ДНК. Это имело место для стимуляции как высоким, так и низким числом импульсов. Полученные результаты демонстрируют, что способ электропорообразования повышает эффективность ДНК-опосредованной иммунизации.

Пример 12. Секретируемые белки с системной биологической активностью. Пятьдесят мкг (50 мкл раствора в 0,9% №101 с концентрацией 1 мг/мл) эукариотной экспрессирующей плазмиды (ЦМВ-ЭПО), содержащей кДНК эритропоэтина мыши под контролем прямого раннего промотора цитомегаловируса, инъецировали в левую четырехглавую мышцу трехмесячных самок мышей 129хВа1Ь/С. У пяти мышей (группа 1) мышцы стимулировали электрически непосредственно после инъекции ДНК с использованием 10 серий по 1000 прямоугольных биполярных импульсов длительностью 200 мкс с интервалом в 2 с между последовательными сериями. Частота серий была 1000 Гц, а установленная амплитуда 150 В (эффективное напряжение ~ 25 В). В другой группе из 5 мышей (группа 2) мышцы после инъекции ДНК не стимулировали. В качестве контроля группе из 4 мышей (группа 3) инъецировали плазмиду (ЦМВ-ЗФБ), содержащую кодирующую последовательность для зеленого флуоресцирующего белка под контролем промотора ЦМВ, с последующей электрической стимуляцией при тех же условиях, что и в группе 1. Группа 4 состояла из 5 мышей, которым инъецировали только физиологический раствор без электрической стимуляции.

Таблица 4

Концентрация и активность ЭПО в сыворотке

Группа 1 ЦМВЭПО Стимулиро- ванные	Мышь №	День 2	День 5	День 14
НСТ %	мЭПО (мЕд./мл)	НСТ %	мЭПО (мЕд./мл)	НСТ %	мЭПО (мЕд./мл)
7	45	НО	НО	55,7	71	72,4
8	48	НО	НО	54,6	68	5,3
9	47	НО	НО	59	75,5	48,7

10	44	НО	НО	62,2	69,5	62,9
11	47	НО	НО	7,9	66	22,4
Средн.	46,2	НО	НО	47,9	70,0 ^абв	48,3
Станд. откл.	1,6				3,6
Группа 2ЦМВЭПО Нестимулированные	12	45	НО	НО	НО	50	<15
13	45	НО	НО	НО	50	<15
14	НО	НО	НО	НО	48	<15

15	46	НО	НО	НО	49,5	<15
16	44	НО	НО	НО	52	<15
Средн.	45	НО	НО	НО	49,9	<15
Станд. откл.	0,8
Группа 3 ЦМВ-ЗФБ Стимулированные	2	НО	НО	НО	<15	43,5	<15
3	НО	НО	НО	<15	48	<15
5	НО	НО	НО	<15	46	<15
6	НО	НО	НО	<15	46	<15
Средн.	НО	НО	НО	<15	45,9	<15
Станд. откл.					1,8
Группа 4ЦМВЭПО	17	45	НО	НО	<15	45,5	НО
18	45	НО	НО	<15	49	НО
19	43	НО	НО	<15	48	НО

20	45	НО	НО	<15	51,5	НО
21	50	НО	НО	<15	47	НО
Средн.	45,6	НО	НО	<15	48,2	НО
Станд. откл.	2,6				2,3

НО = не определялся. ^а р < 0,0001 по сравнению с группой 2; ^ь р < 0,0001 по сравнению с группой 3; р < 0,0001 по сравнению с группой 4 (по Фишеру различия менее существенные).

Кровь отбирали из заглазничного синуса в определенные моменты времени и измеряли гематокрит путем центрифугирования в капиллярных трубках. Пробы сыворотки анализировали на присутствие ЭПО с использованием серийного набора ЕЬ1§Л (Κ&Ό Буйетк). Результаты показаны в таблице 4. Во всех группах мышей, кроме тех, которым была инъецирована ЭПО-конструкция с электрической стимуляцией непосредственно после инъекции, уровни циркулирующего ЭПО были ниже предела чувствительности набора ЕЫ8Л (<15 мЕд/мл). Напротив, мыши, которым была инъецирована ЭПОконструкция и которых электрически стимулировали, имели существенно повышенные уровни ЭПО в сыворотке через 5 дней после инъекции (среднее значение примерно 50 мЕд/мл). Концентрация ЭПО в сыворотке оставалась повышенной в течение 28 дней после инъекции ДНК (последний исследованный срок; данные не показаны). Эти уровни ЭПО вызывали возрастание гематокрита, который увеличивался с

46,2% перед инъекцией до 70,0% и 76,7% через 14 и 28 дней после инъекции ДНК, соответственно. Эти значения существенно отличались от данных, полученных для обеих контрольных групп (группы 3 и 4), и от данных для мышей, которым инъецировали вектор экспрессии ЭПО без электрической стимуляции мышцы (группа 2). Действительно, последние имели уровни гематокрита, не отличавшиеся существенно от значений в контрольных группах (см. таблицу 4). Эти результаты демонстрируют, что способ электропорообразования превосходит простую инъекцию ДНК в отношении как уровней экспрессии секретируемого белка, так и возникновения биологического эффекта, опосредуемого секретируемым белком.

Пример 13. Доставка молекул, не являющихся нуклеиновыми кислотами.

В мышцы инъецировали 50 мкл смеси плазмидной ДНК для ЗФБ в концентрации 1 мкг/мкл и 2 мкг/мкл декстрана, конъюгированного с родамином (10 кД из Мо1еси1аг РгоЬек).

Через 3-5 дней мышцы (п=б) замораживали в жидком азоте и делали срезы на криостате. Как проиллюстрировано на фиг. 20, стимулированные мышцы (нижняя часть фиг.) были трансфицированы декстраном, конъюгированным с родамином (верхняя часть фиг.) и ЗФБ (нижняя часть фиг.). Как иллюстрируется далее, те же мышечные волокна были трансфицированы как ЗФБ, так и декстраном, конъюгированным с родамином. Эти данные свидетельствуют, что молекулы, не являющиеся нуклеиновыми кислотами, могут быть доставлены к мышечным клеткам с использованием техники данного изобретения.

Фиг. 2. Целая мышца и срез толщиной 1 мм из ее середины. Число трансфицированных волокон подсчитывали после разделения мышцы на более мелкие пучки, а отдельные волокна можно было видеть через микроскоп для препарирования. В некоторых зонах мышцы было трансфицировано большинство волокон (черные стрелки). Эти зоны находились близко к тому положению, где находились электроды во время стимуляции.

Фиг. 9. Для повышения эффективности трансфекции было использовано два различных электрода. Процедура инъекции и паттерн стимуляции (100 Гц) были такими же, как описано ранее. Электрод, изображенный на (а), размещали перпендикулярно к мышечным волокнам. Он состоял из серебряной проволоки диаметром (6) 0,6 мм (в) (это электрод, который был использован во всех экспериментах, за исключением (Ь)). По одному электроду размещали с каждой стороны мышцы. Короткий сегмент средней трети мышцы является позитивным в отношении окрашивания на Ε;·κΖ (а), что свидетельствует о локализованной экспрессии. В (Ь) был использован электрод длиной 1,5 см, изготовленный из изолированной серебряной проволоки (6=0,3 мм). Изоляцию удаляли с коротких сегментов (0,5-1,0 мм) вдоль проволоки с интервалами 2 мм (6). Электрод вводили в мышцу параллельно мышечным волокнам. Второй электрод помещали на поверхность мышцы. Положительное синее окрашивание наблюдалось примерно в 250 волокнах, которые были локализованы в средней трети мышцы. В (Ь) волокна демонстрировали обширное окрашивание, свидетельствующее о трансфекции вдоль более длинного сегмента волокна и/или о повышенной трансгенной экспрессии

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ введения фармацевтических препаратов и/или терапевтических веществ, включая нуклеиновые кислоты и молекулы белка, в организм млекопитающего ίη νίνο, при котором осуществляют инъекцию молекул и стимуляцию доставки этих молекул электрическим током, отличающийся тем, что инъекцию про изводят в скелетную мышцу, электроды располагают вблизи места инъекции таким образом, чтобы текущий через электроды ток проходил через место инъекции, при этом напряженность электрического поля стимуляции составляет от 25 до 200 В/см.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что электрическая стимуляция представляет собой одиночный прямоугольный биполярный импульс.
3. Способ по п.2, отличающийся тем, что указанный биполярный импульс имеет длительность примерно от 50 до 5000 мкс.
4. Способ по п.1, отличающийся тем, что электрическая стимуляция представляет собой примерно от 2 до 30000 прямоугольных биполярных импульсов.
5. Способ по п.4, отличающийся тем, что указанные биполярные импульсы имеют общую длительность примерно от 10 до 12000 мс.
6. Способ по п.5, отличающийся тем, что указанные биполярные импульсы подают в виде, по меньшей мере, двух серий.
7. Способ по п.6, отличающийся тем, что частота указанной электрической стимуляции составляет примерно от 0,5 до 1000 Гц.
8. Способ по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что указанное вещество является нуклеиновой кислотой, оперативно присоединенной к промотору, который управляет экспрессией белка, кодированного указанной нуклеиновой кислотой, в клетках указанной мышцы.
9. Способ по п.8, отличающийся тем, что нуклеиновая кислота представляет собой однонитевую нуклеиновую кислоту.
10. Способ по п. 1, отличающийся тем, что электрическое поле изменяют ступенчатым образом.
11. Способ по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что силовые линии электрического поля ориентированы примерно поперек мышечных волокон.
12. Способ генетической иммунизации млекопитающего путем трансфекции нуклеиновой кислоты в скелетную мышцу указанного млекопитающего ίη νίνο, включающий операции инъецирования в скелетную мышцу млекопитающего нуклеиновой кислоты, оперативно присоединенной к промотору, который управляет экспрессией белка, кодированного указанной нуклеиновой кислотой, в указанной мышце, расположения электродов вблизи места указанной инъекции нуклеиновой кислоты таким образом, чтобы текущий через электроды ток проходил через место указанной инъекции нуклеиновой кислоты, и стимуляции мышцы электрическим током, соответствующим напряженности поля примерно от 5 до 200 В/см.
13. Способ по п.12, отличающийся тем, что электрическая стимуляция представляет собой одиночный прямоугольный биполярный импульс.
14. Способ по п.13, отличающийся тем, что указанный биполярный импульс имеет длительность примерно от 50 до 5000 мкс.
15. Способ по п.12, отличающийся тем, что электрическая стимуляция представляет собой примерно от 2 до 30000 прямоугольных биполярных импульсов.
16. Способ по п.15, отличающийся тем, что сумма длительностей импульсов указанных биполярных импульсов составляет примерно от 10 до 12000 мс.
17. Способ по п.16, отличающийся тем, что указанные биполярные импульсы подают в виде, по меньшей мере, двух серий.
18. Способ по п.17, отличающийся тем, что частота указанной электрической стимуляции составляет примерно от 0,5 до 1000 Гц.
19. Способ по п.12, отличающийся тем, что электрическое поле изменяют ступенчатым образом.
20. Способ по любому из пп. 12-19, отличающийся тем, что нуклеиновая кислота представляет собой однонитевую нуклеиновую кислоту.
21. Способ по любому из пп. 12-20, отличающийся тем, что силовые линии электрического поля ориентированы примерно поперек мышечных волокон.
22. Способ систематической доставки белка в млекопитающее, включающий операции инъецирования в мышцу млекопитающего нуклеиновой кислоты, оперативно присоединенной к промотору, который управляет экспрессией белка, кодированного указанной нуклеиновой кислотой, в указанной мышце, расположения электродов вблизи места указанной инъекции нуклеиновой кислоты таким образом, чтобы текущий через электроды ток проходил через место указанной инъекции нуклеиновой кислоты, и стимуляции мышцы электрическим током, соответствующим напряженности поля примерно от 5 до 200 В/см.
23. Способ по п.22, отличающийся тем, что электрическая стимуляция представляет собой одиночный прямоугольный биполярный импульс.
24. Способ по п.23, отличающийся тем, что указанный биполярный импульс имеет длительность примерно от 50 до 5000 мкс.
25. Способ по п.22, отличающийся тем, что электрическая стимуляция представляет собой примерно от 2 до 30000 прямоугольных биполярных импульсов.
26. Способ по п.25, отличающийся тем, что сумма длительностей импульсов указанных биполярных импульсов составляет примерно от 10 до 12000 мс.
27. Способ по п.26, отличающийся тем, что указанные биполярные импульсы подают в виде, по меньшей мере, двух серий.
28. Способ по п.27, отличающийся тем, что частота указанной электрической стимуляции составляет примерно от 0,5 до 1000 Гц.
29. Способ по п.22, отличающийся тем, что электрическое поле изменяют ступенчатым образом.
30. Способ по любому из пп.22-29, отличающийся тем, что нуклеиновая кислота представляет собой однонитевую нуклеиновую кислоту.
31. Способ по любому из пп.22-30, отличающийся тем, что силовые линии электрического поля ориентированы примерно поперек мышечных волокон.
32. Устройство для обеспечения доставки фармацевтического и/или терапевтического вещества к клеточной ткани в организм млекопитающего ΐπ νινο, содержащее аппарат для управления напряжением, способный формировать периодическое электрическое поле с напряженностью 25 - 200 В/см;

электроды, пригодные для установки вокруг части тела млекопитающего и обеспечивающие приложение электрического поля к соответствующей части тела, отличающееся тем, что аппарат для управления напряжением выполнен с возможностью дополнительного формирования в альтернативных режимах электрического поля ступенчатой формы и электрического поля в форме одиночного прямоугольного биполярного импульса.