DE69738316T2 - Verfahren zur verabreichung eines polynukleotids über das gefä system - Google Patents

Description

• Gebiet der Erfindung
• Die Erfindung bezieht sich im Allgemeinen auf Techniken zum in vivo-Transferieren von Genen in Säuger-Parenchymzellen. Genauer gesagt wird ein Verfahren zur Transfektion parenchymaler Zellen mit intravaskulär gelieferten Polynukleotiden bereitgestellt.
• Hintergrund der Erfindung
• Zuerst wurde beobachtet, dass die in vivo-Injektion von Plasmid-DNA in einen Muskel die Expression von Fremdgenen im Muskel ermöglichte (Wolff, J.A., Malone, R.W., Williams, P., et al., Direct gene transfer into mouse muscle in vivo, Science 1990: 247 1465–1468). Seit diesem Bericht haben einige andere Untersuchungen die Fähigkeit zur Fremdgen-Expression nach direkter Injektion von DNA in das Parenchym anderer Gewebe berichtet. Nackte DNA wurde nach deren Injektion in Herzmuskel (Acsadi, G., Jiao, S., Jani, A., Duke, D., Williams, P., Chong, W., Wolff, J.A., Direct gene transfer and expression into rat heart in vivo, The New Biologist 3(1), 71–81, 1991)), in Schweine-Epidermis (Hengge, U.R., Chan, E.F., Foster, R.A., Walker, P.S., und Vogel, J.C., Nature Genetics 10: 161–166 (1995)), in Hasen-Schilddrüse (M. Sikes, B. O'Malley, M. Finegold und F. Ledley, Hum. Gene Ther. 5, 837 (1994)), in Lunge durch intratrachiale Injektion (K.B. Meyer, M.M. Thompson, M.Y. Levy, L.G. Barron, F.C. Szoka, Gene Ther. 2, 450 (1995)), in Arterien unter Verwendung eines Hydrogelbeschichteten Angioplastie-Ballons [(R. Riessen et al., Human Gene Ther. 4, 749 (1993)); (G. Chapman et al., Circ. Res. 71, 27 (1992))], in Melanom-Tumore (R.G. Vile und I.R. Hart, Cancer Res. 53, 962 (1993)) und in Ratten-Leber [(Malone, R.W. et al., JBC 269: 29903–29907 (1994)); (Hickman, M.A., Human Gene Therapy 5: 1477–1483 (1994))] exprimiert.
• Die Säuger-Leber ist angesichts ihrer zentralen Rolle im Stoffwechsel und der Produktion von Serum-Proteinen ein weiteres wichtiges Zielgewebe für die Gentherapie. Es wurde eine Vielzahl von Techniken entwickelt, um Gene in die Leber zu transferieren. Kultivierte Hepatozyten wurden durch retrovirale Vektoren genetisch modifiziert [(Wolff, J.A. et al., PNAS 84: 3344–3348 (1987); (Ledley, F.D., Darlington, G.J., Hahn, T. und Woo, S.C.L. PNAS 84: 5335–5339 (1987)] und wurden bei Tieren und Menschen wieder zurück in die Lebern implantiert [(J.R. Chowdhury et al., Science 254, 1802 (1991); (M. Grossman et al., Nature Genetics 6, 335 (1994)]. Es wurden auch retrovirale Vektoren direkt zu den Lebern geliefert, in welchen Hepatozyten-Teilung durch partielle Hepatektomie induziert wurde [(Kay, M.A. et al., Hum. Gene Ther. 3: 641–647 (1992)); (Ferry, N., Duplessis, O., Houssin, D., Danos, O. und Heard, J.-M. PNAS 88: 8377–8381 (1991)); (Kaleko, M., Garcia, J.V. und Miller, A.D., Hum Gene Ther. 2: 27–32 (1991))]. Die Injektion von adenoviralen Vektoren in die portalen oder systemischen Kreislaufsysteme führt zu hohen Konzentrationen an Fremdgenexpression, die vorübergehend ist [(L.D. Stratford-Perricaudet, M. Levrero, J.F. Chasse, M. Perricaudet, P. Briand, Hum. Gene Ther. 1, 241 (1990); (H.A. Jaffe et al. Nat. Genet. 1, 372 (1992); (Q.Li, M.A. Kay, M. Finegold, L.D. Stratford-Perricaudet, S.L.C. Woo, Hum. Gene Ther. 4, 403 (1993)]. Nicht-virale Transfermethoden schlossen Polylysin-Komplexe von Asiaglykoproteinen ein, die in den Systemkreislauf injiziert werden [Wu, G.Y. und Wu, C.H., J. Biol. Chem. 263: 14621–14624 (1988)].
• Fremdgen-Expression wurde auch durch wiederholtes Injizieren von nackter DNA in isotonischen Lösungen in das Leber-Parenchym von mit Dexamethason behandelten Tieren erreicht [(Malone, R.W. et al., JBC 269: 29903–29907 (1994)); (Hickman, M.A., Human Gene Therapy 5: 1477–1483 (1994))]. Plasmid-DNA-Expression in der Leber wurde auch über Liposomen, die über die Schwanzvene oder intraportale Wege geliefert wurden, erreicht [(Kaneda, Y., Kunimitsu, I. und Uchida, T.J., Biol. Chem. 264: 12126–12129 (1989)); (Soriano, P. et al. PNAS 80: 7128–7131 (1983)); (Kaneda, Y., Iwai, K. und Uchida, T. Science 243: 375–378 (1989))].
• Trotz diesem Fortschritt gibt es immer noch Bedarf für ein Gentransfer-Verfahren, das die Expression von Fremdgenen in der Leber einmal und/oder wiederholt effizient und sicher auslöst.
• Zusammenfassung der Erfindung
• Die vorliegende Erfindung gewährleistet den Transfer von Polynukleotiden in Parenchymzellen innerhalb der Leber in situ und in vivo. Eine intravaskuläre Darreichungsform ermöglicht es einem hergestellten Polynukleotid, zu den Parenchymzellen noch gleichmäßiger verteilt und noch effizienter exprimiert geliefert zu werden als bei direkten parenchymalen Injektionen. Die Wirksamkeit der Polynukleotid-Übertragung und -Expression wurde durch Erhöhen der Durchlässigkeit der Leberblutgefäße erheblich erhöht. Dies wurde durch Erhöhen des intravaskulären hydrostatischen (physikalischen) Drucks und/oder Erhöhen des osmotischen Drucks durchgeführt. Die Expression einer Fremd-DNA wurde in einer Säuger-Leber durch intraportales Injizieren von Plasmid-DNA in einer hypertonischen Lösung und vorübergehendes Abklemmen der hepatischen Vene/unteren Hohlvene er reicht. Optimale Expression wurde durch Abklemmen der Pfortader und Injizieren in die hepatische Vene/untere Hohlvene erreicht.
• Es wird ein Verfahren zum Liefern eines Polypeptids in eine Leber-Parenchymzelle in einen Säuger beschrieben, das das Transportieren des Polynukleotids in die untere Hohlvene, die hepatische Vene oder den Gallengang umfasst, jeweils mit der Parenchymzelle des Säugers so in Verbindung stehend, dass das Polynukleotid in die Parenchymzelle transfiziert wird.
• Ein Verfahren zum Liefern eines codierten Polynukleotids in eine Leber-Parenchymzelle eines Säugers zur Expression eines Proteins, das das Transportieren des Polynukleotids zu einem Lebergefäß, das ein Fluid enthält und eine durchlässige Wand aufweist, und die Erhöhung der Durchlässigkeit der Wand für eine Zeit, die ausreichend ist, um das Liefern des Polynukleotids zu vervollständigen, umfasst.
• Kurze Beschreibung der Zeichnungen
• 1(a), (b): Vergleich der Gesamtmenge an Luciferase-Expression in Mäusen, denen pCILUC unter verschiedenen Bedingungen injiziert wurde. Die Abkürzungen der Bedingungen bedeuten Folgendes: PV-CL: Pfortader-Injektionen ohne Abklemmen; PV+CL: Pfortader-Injektionen mit Abklemmen der hepatischen Vene; IVC – CL: IVC-Injektionen ohne Abklemmen; IVC + CL: IVC-Injektionen mit Abklemmen der Pfortader und der hepatischen Arterie; BD – CL: Gallengang-Injektionen ohne Abklemmen; BD + CL: Gallengang-Injektionen mit Abklemmen der hepatischen Vene. Die Zahlen über den Balken geben die Anzahl der Mäuse an. Die T-Balken geben den Standardfehler an.
• 2: Streudiagramm des log(e) von Luciferase (ng Protein) aufgetragen gegen den Peak des intrahepatischen, parenchymalen Drucks (mm Hg). Die durchgezogene Linie gibt die beste Anpassung an. Die gestrichelten Linien geben die 95%-Vorhersagebereiche an.
• 3: Histochemische Analyse der β-Galactosidase-Expression in Lebern nach Injektion von pCILacZ in: A) den Maus-Gallengang mit abgeklemmter hepatischer Vene, B), den Maus-IVC mit abgeklemmter Pfortader und C) die Ratten-Pfortader mit abgeklemmter IVC. Die Injektionen wurden bei Mäusen unter Verwendung von 100 μm pCILacZ in 1 ml 15% Mannitol und 2,5 Einheiten Heparin/ml in normaler Salzlösung ausgeführt, während die Injektionen bei Ratten unter Verwendung von 750 μg pCILacZ in 15 ml derselben Lösung ausgeführt wurden. Die Platten A und B wurden 160X vergrößert und die Platte C wurde 100X vergrößert.
• 4: Konzentrationen des menschlichen Wachstumshormons (Hgh) nach der wiederholten Verabreichung von 100 μg pCMVhGH in den Gallengang von Mäusen über eine Kanüle. Die Zahlen bezeichnen einzelne Mäuse.
• 5(a), (b), (c): Wirkungen des Injektionslösungsvolumens (a), der Injektionszeit (b) und der Ischämie-Zeit vor der Injektion (c) auf die durchschnittlichen Konzentrationen der Luciferase-Expression in Ratten-Hintergliedmaßen-Muskeln. Zwei Tage danach wurden 475 μg pCILux in 9,5 ml NSS einseitig in die Ilialkal-Arterie von adulten Sprague-Dawley-Ratten injiziert, wobei die Luciferase-Aktivitäten in den 6 Hintergliedmaßen-Muskelgruppen (vorderer Oberschenkel, mittlerer Oberschenkel, hinterer Oberschenkel, vorderer Unterschenkel, hinterer Unterschenkel und Fuß) wie kürzlich berichtet gemessen wurden und als die Mittelwerte der gesamten Luciferase-Konzentrationen aller 6 Muskelgruppen dargestellt wurden. Die Ischämie-Zeit vor der Injektion betrug bei "a" und "b" 10 min. Die zu den Datenpunkten benachbarten Zahlen geben die Anzahl an Tieren (1 Gliedmaße/Tier) an, die für jede Bedingung untersucht wurde. Die Fehlerbalken geben den Standardfehler an.
• 6: Wirkungen verschiedener Bedingungen auf die Luciferase-Expression in Ratten-Hintergliedmaßenmuskeln nach der Injektion von pCILux-DNA in die Ilialkal-Arterie. Bedingung 1: 475 μg DNA in 9,5 ml NSS wurden innerhalb 10 Sek. nach einer 10 min-Okklusion des Gliedmaßenblutflusses injiziert; Bedingung 2: 475 μg DNA in 9,5 ml H₂O wurden innerhalb 10 Sek. nach einer 10 min-Okklusion des Gliedmaßenblutfusses injiziert; Bedingung 3: 475 μg DNA in 9,5 ml NSS mit 15% Mannitol wurden innerhalb 30 Sek. nach einer 10 min-Okklusion des Gliedmaßenblutflusses injiziert; Bedingung 4: 80 μg Collagenase in 1 ml NSS wurden unmittelbar nach Blutfluss-Okklusion in die Ilialkal-Arterie injiziert. Nach 10 min wurde der Blutfluss für einige Sek. geöffnet, wieder geschlossen und 475 μg DNA in 9,5 ml NSS wurden innerhalb 10 Sek. injiziert. Die fettgedruckten Zahlen geben die Anzahl der Tiere an, die bei jeder experimentellen Bedingung untersucht wurden. Die Fehlerbalken geben den Standardfehler an.
• Detaillierte Beschreibung
• A. Definitionen
• Der Begriff "nackte Polynukleotide" gibt an, dass die Polynukleotide nicht mit einem Transfektionsreagens oder einem anderen Liefervehikel assoziiert sind, was für das Polynukleotid erforderlich ist, um zu der parenchymalen Zelle geliefert zu werden. Ein Transfektionreagens ist eine im Stand der Technik verwendete Verbindung oder Verbindungen, die an Polynukleotide bindet/(binden) oder mit Polynukleotiden kompexiert/(komplexieren) und deren Eintritt in die Zellen vermittelt. Das Transfektionsreagens vermittelt auch das Binden und Internalisieren von Polynukleotiden in Zellen. Beispiele von Transfektionsreagenzien schließen kationische Liposomen und Lipide, Calciumphosphat-Präzipitate und Polylysin-Komplexe ein. Üblicherweise weist das Transfektionsreagens eine positive Nettoladung auf, die an die negative Ladung des Polynukleotids bindet. Das Transfektionsreagens vermittelt das Binden von Polynukleotiden an eine Zelle über deren positive Ladung (die an die negative Ladung der Zellmembran bindet) oder über Liganden, die an Rezeptoren in der Zelle binden. Beispielsweise weisen kationische Liposomen oder Polylysin-Komplexe positive Nettoladungen auf, die es ihnen ermöglichen, an die DNA zu binden. Im Stand der Technik werden auch andere Vehikel verwendet, um die Gene in Zellen zu transferieren. Diese schließen das Komplexieren der Polynukleotide auf Partikel ein, die dann schnell in die Zelle hineingehen. Dies wird als biolistische- oder Kanonen-Technik bezeichnet. Andere Methoden schließen die Elektroporation ein, bei der eine Vorrichtung verwendet wird, um eine elektrische Ladung an Zellen abzugeben. Die Ladung erhöht die Durchlässigkeit der Zelle.
• Der Begriff Polynukleotid ist ein Fachbetriff, der sich auf eine Kette aus mindestens zwei Base-Zucker-Phosphat-Kombinationen bezieht. Nukleotide sind die Monomereinheiten von Nucleinsäurepolymeren. Der Begriff schließt Desoxyribonucleinsäure (DNA) und Ribonucleinsäure (RNA) in Form von Oligonukleotid-Boten-RNA, Antisense, Plasmid-DNA, Teile einer Plasmid-DNA oder von einem Virus abgeleitetes genetisches Material ein. Hierbei wird ein Polynukleotid von einem Oligonukleotid durch das Enthalten von mehr als 120 Monomereinheiten unter schieden. Antisense ist ein Polynukleotid, das die Funktion der DNA und/oder der RNA beeinträchtigt.
• Ein Polynukleotid kann in eine Zelle geliefert werden, um eine zelluläre Änderung zu erzeugen, die therapeutisch ist. Gentherapie ist das Liefern von Polynukleotiden oder anderem genetischen Material für therapeutische Zwecke (das Fachgebiet des Verbesserns der Gesundheit in einem Tier einschließlich der Behandlung oder Prävention von Krankheiten). Die Polynukleotide werden codiert, um ein ganzes oder partielles Protein zu exprimieren, oder könnte ein Antisense sein, und können entweder in situ direkt zum Organismus oder indirekt durch Transfer zu einer Zelle, die dann in den Organismus transplantiert wird, geliefert werden. Das Protein kann in einem Organismus infolge von genetischen, vererbten oder zugezogenen Defekten in dessen Genom fehlen oder defekt sein. Beispielsweise kann ein Polynukleotid codiert werden, um das Protein Dystrophin zu exprimieren, das bei Duchennes Muskeldystrophy fehlt oder defekt ist. Das codierte Polynukleotid wird an eine ausgewählte Gruppe oder Gruppen von Zellen geliefert und in diese Genome der Zelle eingebaut oder verbleibt abseits des Genoms der Zelle. Anschließend wird Dystrophin von den ehemals defekten Zellen produziert. Andere Beispiele unvollständiger Proteinproduktion, die mit Gentherapie behandelt werden können, schließen die Zugabe der Protein-Gerinnungsfaktoren, die bei den Hämophilien fehlen, und Enzyme, die bei angeborenen Fehlern des Stoffwechsels, wie Phenylalanin-Hydroxylase, fehlen, ein. Ein geliefertes Polynukleotid kann auch bei zugezogenen Störungen wie neurodegenerativen Störungen, Krebs, Herzkrankheit und Infektionen therapeutisch sein. Das Polynukleotid besitzt seine therapeutische Wirkung beim Eindringen in die Zelle. Der Eintritt in die Zelle ist für das Polynukleotid nötig, um das therapeutische Protein zu produzieren, die Produk tion eines Proteins zu blockieren oder um die Menge einer RNA zu verringern.
• Liefern eines Polynukleotids bedeutet, ein Polynukleotid von einem Behälter außerhalb eines Säugers zum Inneren der äußeren Zellmembran einer Zelle in dem Säuger zu transferieren. Hierin wird der Begriff Transfektion im Allgemeinen als ein Ersatz für den Begriff Liefern verwendet, oder noch genauer, der Transfer eines Polynukleotids vom unmittelbaren Äußeren einer Zellmembran zum Innern der Zellmembran. Wenn das Polynukleotid eine primäre RNA-Kopie ist, die zur Boten-RNA verarbeitet wird, translatiert ein Liposom die Boten-RNA, um innerhalb des Zytoplasmas ein Protein zu produzieren. Wenn das Polynukleotid eine DNA ist, dringt sie in den Zellkern ein, wo sie in eine Boten-RNA transkribiert wird, die in das Zytoplasma transportiert wird, wo sie in ein Protein translatiert wird. Das Polynukleotid enthält Sequenzen, die für dessen Transkription und Translation benötigt werden. Diese schließen Promoter- und Enhancersequenzen ein, die zur Initiierung benötigt werden. Die DNA und folglich die entsprechende Boten-RNA (translatiert von der DNA) enthält Introne, die gespleißt werden müssen, Pol-A-Additionssequenzen und Sequenzen, die für die Initiierung und Terminierung von der Translation im Protein benötigt werden. Daher muss ein Polynukleotid in eine Zelle eingedrungen sein, wenn es sein verwandtes Protein exprimiert.
• Eine therapeutische Wirkung des Proteins beim Abschwächen oder Verhindern des Krankheitszustands kann durch das Protein entweder durch Verbleib in der Zelle, wobei es an der Zelle in der Membran befestigt bleibt, oder durch Absondern und Dissozieren von der Zelle, wo es in den allgemeinen Kreislauf und den Blutkreislauf eintritt, zustande gebracht werden. Abgesonderte Proteine, die therapeutisch sein können, schließen Hor mone, Zytokine, Wachstumsfaktoren, Gerinnungsfaktoren, Antiprotease-Proteine (z. B. Alpha-Antitrypsin) und andere Proteine, die im Blut anwesend sind, ein. Proteine auf der Membran können durch Bereitstellen eines Rezeptors für die Zelle zum Aufnehmen eines Proteins oder Lipoproteins einen therapeutischen Effekt aufweisen. Beispielsweise könnten die Rezeptoren für Lipoproteine geringer Dichte (LDL) in Hepatozyten exprimiert werden und die Blutcholesterin-Konzentrationen senken und dadurch atherosklerotische Läsionen verhindern, die Schlaganfälle oder einen Myocard-Infarkt verursachen können. Therapeutische Proteine, die innerhalb der Zelle bleiben, können Enzyme sein, die einen zirkulierenden toxischen Metaboliten – wie bei der Phenylketonurie – beseitigen. Sie können auch eine Krebszelle dazu veranlassen, weniger proliferativ oder krebsartig (z. B. weniger metastatisch) zu sein. Ein Protein in einer Zelle kann auch die Replikation eines Virus stören.
• Das gelieferte Polynukleotid kann in dem Zytoplasma oder Zellkern abseits des endogenen genetischen Materials bleiben. Alternativ könnte das Polynukleotid das endogene genetische Material rekombinieren (ein Teil davon werden). Beispielsweise kann DNA entweder durch homologe oder nicht-homologe Rekombination in die chromosomale DNA eingefügt werden.
• Parenchymale Zellen sind die charakteristischen Zellen einer Drüse oder eines Organs, das in dem verbindenden Gewebe-Netzwerk enthalten ist und davon unterstützt wird. Üblicherweise verrichten die parenchymalen Zellen eine Funktion, die für das bestimmte Organ einmalig ist. Der Begriff "parenchymal" schließt meist Zellen aus, die in vielen Organen und Geweben üblich sind, wie Fibroblasten und Endothelzellen in den Blutgefäßen.
• In einem Leberorgan schließen die parenchymalen Zellen Hepatozyten, Kupffer-Zellen und Epithelzellen ein, die den Gallentrakt und die Gallengängchen umsäumen. Der Hauptbestandteil des Leber-Parenchyms sind vielgestaltige Hepatozyten (auch als hepatische Zellen bekannt), die mindestens eine Seite an einem hepatischen Sinusoid und an den Gallenkanälchen anliegende Seiten darstellen. Leberzellen, die keine parenchymalen Zellen sind, schließen Zellen in den Blutgefäßen, wie die Endothelzellen oder Fibroblastenzellen, ein.
• Im gefurchten Muskel schließen die parenchymalen Zellen Myoblasten, Satelliten-Zellen, Myoröhren und Myofasern ein. Im Herzmuskel schließen die parenchymalen Zellen das Myocard, auch bekannt als Herzmuskelfasern oder Herzmuskelzellen, und die Zellen des Impuls-verbindenden Systems, wie die, die den Sinusknoten, den atrioventrikulären Knoten und die atrioventrikuläre Bündel darstellen, ein.
• In einem Pankreas schließen die parenchymalen Zellen Zellen innerhalb der Acini ein, wie zymogene Zellen, zentroazinäre Zellen und Basal- oder Korbzellen und Zellen innerhalb der Langerhans-Inseln, wie Alpha- und Beta-Zellen, ein.
• In Milz, Thymus, den Lymphknoten und Knochenmark schließen die parenchymalen Zellen retikuläre Zellen und Blutzellen (oder Precursor von Blutzellen), wie Lymphozyten, Monozyten, Plasmazellen und Makrophagen, ein.
• Im Nervensystem, welches das zentrale Nervensystem (das Gehirn und das Rückenmark), periphere Nerven und Ganglien einschließt, schließen die parenchymalen Zellen Neuronen, Glia zellen, Mikrogliazellen, Oligodendrozyten, Schwann-Zellen und Epithelzellen des Plexus Chloroideus ein.
• In der Niere schließen die Parenchymzellen Zellen von Sammeltubuli und die proximalen und distalen Tubulizellen ein. In der Prostata schließen die Parenchyme Epithelzellen ein.
• In Drüsengeweben und -organen schließen die Parenchymzellen Zellen, die Hormone produzieren, ein. In den parathyroiden Drüsen schließen die Parenchymzellen die Hauptzellen (Oberzellen) und oxophilen Zellen ein. In der Schilddrüse schließen die Parenchymzellen, follikuläre Epithelzellen und para-follikuläre Zellen ein. In den Nebennierendrüsen schließen die Parenchymzellen die Epithelzellen innerhalb der Nebennierenrinde und die vielgestaltigen Zellen innerhalb des Nebennierenmarks ein.
• Im Parenchym des Verdauungstrakts wie der Speiseröhre, dem Magen und den Därmen schließen die parenchymalen Zellen Epithelzellen, Drüsenzellen, Basal- und Becherzellen ein.
• Im Parenchym der Lunge schließen die parenchymalen Zellen die Epithelzellen, Schleimzellen, Becherzellen und Alveolarzellen ein.
• Im Fettgewebe schließen die parenchymalen Zellen Fettzellen oder Adipozyten ein. In der Haut schließen die parenchymalen Zellen die Epithelzellen der Epidermis, Melanozyten, Zellen der Schweißdrüsen und Zellen der Haarwurzeln ein.
• Im Knorpel schließt das Parenchym Chondrozyten ein. Im Knochen schließt das Parenchym Osteoblasten, Osteozyten und Osteoclasten ein.
• Eine intravaskuläre Darreichungsform ermöglicht einem Polynukleotid, noch gleichmäßiger verteilt und noch effizienter exprimiert zu den parenchymalen Zellen geliefert zu werden als bei direkten parenchymalen Injektionen. Intravaskulär bedeutet hierbei innerhalb einer hohlen Röhrenstruktur, die Gefäß genannt wird, die innerhalb des Körpers mit einem Gewebe oder Organ verbunden ist. Innerhalb der Kavität der Röhrenstruktur fließt ein Körperfluid zu oder von dem Körperteil. Beispiele von Körperfluiden schließen Blut, lymphatisches Fluid oder Galle ein. Beispiele von Gefäßen schließen Arterien, Arteriole, Kapillaren, Venole, Sinusoide, Venen, Lymphgefäße und Gallengänge ein. Der intravaskuläre Weg schließt das Liefern durch die Blutgefäße, wie Arterie oder Vene, ein.
• Polypeptid bezieht sich auf eine lineare Folge von Aminosäureresten, die miteinander durch Peptidbindungen zwischen der Alpha-Aminogruppe und der Carboxylgruppe benachbarter Aminosäurereste verbunden sind.
• Protein bezieht sich auf eine lineare Folge von mehr als 50 Aminosäureresten, die wie in einem Polypeptid miteinander verbunden sind.
• Afferente Blutgefäße von Organen sind definiert als Gefäße, die auf das Organ oder Gewebe gerichtet sind und in denen unter normalen physiologischen Bedingungen Blut zu dem Organ oder Gewebe fließt. Umgekehrt sind efferente Blutgefäße von Organen als Gefäße definiert, die von dem Organ oder Gewebe weg führen und in denen unter normalen physiologischen Bedingungen Blut von dem Organ oder Gewebe weg fließt. In der Leber ist die hepatische Vene ein efferentes Blutgefäß, da sie normalerweise Blut von der Leber in die untere Hohlvene wegführt.
• Ebenso sind die Pfortader und die hepatischen Arterien in der Leber afferente Blutgefäße im Bezug auf die Leber, da sie normalerweise Blut zur Leber führen.
• B. Liefern von Polynukleotiden
• In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein nacktes Polynukleotid an distalen oder proximalen Punkten in ein Leber-Blutgefäß geliefert. Die hepatische Vene ist ein Leber-Blutgefäß. Die hepatische Vene kann auch über die untere Hohlvene erreicht werden. Es wird eine Nadel oder ein Katheter verwendet, um das Polynukleotid in das vaskuläre System zu injizieren. Die Injektion kann nach einem Schnitt und einer Visualisierung der Blutgefäße des Gewebes unter direkter Beobachtung durchgeführt werden. Alternativ kann ein Katheter an einer entfernten Stelle eingeführt werden und durchgezogen werden, so dass er sich im vaskulären System befindet, das mit dem Zielgewebe verbunden ist. In einer anderen Ausführungsform könnte die Injektion durchgeführt werden, indem eine Nadel verwendet wird, die die intakte Haut durchquert und in ein Gefäß eindringt, das zum Zielgewebe zuführt oder abfließt.
• In der Leber ist die hepatische Vene ein efferentes Blutgefäß, da sie normalerweise Blut von der Leber weg in die untere Hohlvene führt. Ebenso sind die Pfortader und die hepatischen Arterien in der Leber afferente Blutgefäße in Bezug auf die Leber, da sie normalerweise Blut zur Leber hinführen. Gemäß der Erfindung wird Plasmid-DNA effizient exprimiert, wenn sie durch einen retrograden Weg in das efferente Gefäß der Leber (d. h. die hepatische Vene) geliefert wird. Wie in den folgenden Beispielen gezeigt, wurden Injektionen in die untere Hohlvene geleitet, die an zwei Stellen – proximal und distal zum Eingang der hepatischen Vene in die untere Hohlvene – abge klemmt wurde. Speziell die Klammer stromabwärts der unteren Hohlvene wurde zwischen dem Zwerchfell und dem Eingangspunkt der hepatischen Vene platziert. Die Abklemmung der unteren Hohlvene stromaufwärts wurde knapp stromaufwärts des Eingangspunkts der Nierenvene platziert. Da die Venen anderer Organe wie die Nierenvenen an dieser Stelle in die untere Hohlvene eintreten, ging nicht alles von dem Injektionsfluid in die Leber. Bei einigen der Tiere, die retrograde Injektionen in die untere Hohlvene erhielten, wurden die hepatische Arterie, die Mesenterialarterie und die Pfortader abgeklemmt (okkludiert).
• C. Permeabilität
• Die Effizienz der Polynukleotidlieferung und -expression wurde durch Erhöhen der Durchlässigkeit eines Blutgefäßes innerhalb des Zielgewebes erheblich erhöht. Die Durchlässigkeit ist hier definiert als die Neigung von Makromolekülen wie Polynukleotiden, sich durch Gefäßwände zu bewegen und in den extravaskulären Raum einzutreten. Ein Maß für die Durchlässigkeit ist die Geschwindigkeit, mit der Makromoleküle sich die durch die Gefäßwand und aus dem Gefäß bewegen. Ein anderes Maß für die Durchlässigkeit ist das Fehlen einer Kraft, die der Bewegung durch die Gefäßwand und aus dem Gefäß Widerstand leistet. Gefäße enthalten Bestandteile, die Makromoleküle am Verlassen des intravaskulären Raums (interne Kavität des Gefäßes) hindern. Diese Bestandteile schließen Endothelzellen und verbindendes Material (z. B. Collagen) ein. Eine hohe Durchlässigkeit zeigt an, dass es weniger dieser Bestandteile gibt, die den Ausgang von Makromolekülen blockieren können und dass die Abstände zwischen diesen Bestandteilen größer und zahlreicher sind. In diesem Zusammenhang ermöglicht eine hohe Durchlässigkeit einen hohen Prozentsatz an Polynukleotiden, die geliefert werden, um den intravaskulären Raum zu verlassen; während ge ringe Durchlässigkeit anzeigt, dass ein geringer Prozentsatz der Polynukleotide den intravaskulären Raum verlassen wird.
• Die Durchlässigkeit eines Blutgefäßes kann durch Erhöhen des intravaskulären hydrostatischen Drucks erhöht werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der intravaskuläre hydrostatische Druck durch schnelles (von 10 Sekunden bis 30 Minuten) Injizieren eines Polynukleotids in Lösung in das Blutgefäß, erhöht, was den hydrostatischen Druck erhöht. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird der hydrostatische Druck durch Obstruktion des Abflusses der Injektionslösung aus dem Gewebe für eine Zeitdauer, die ausreichend ist, um das Liefern eines Polynukleotids zu erlauben, erhöht. Obstruktion bedeutet, den Abfluss von Injektionsfluid zu blockieren oder zu verhindern, dadurch wird der Abfluss des Blutes vorübergehend (reversibel) blockiert. Außerdem könnte in einer noch weiteren bevorzugten Ausführungsform schnelle Injektion mit Obstruktion des Abflusses kombiniert werden. Beispielsweise wird einem afferenten Gefäß, das ein Organ versorgt, schnell injiziert und das efferente Gefäß, das vom Gewebe abfließt, wird vorübergehend abgebunden. Das efferente Gefäß (auch der venöse Abfluss oder Trakt genannt), das den Abfluss von dem Gewebe ableitet, wird für eine Zeitdauer, die ausreichend ist, um das Liefern eines Polynukleotids zu erlauben, ebenfalls teilweise oder vollständig abgeklemmt. Umgekehrt wird in ein efferentes Gefäß injiziert und ein afferentes Gefäß wird okkludiert.
• In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird der intravaskuläre Druck eines Blutgefäßes durch Erhöhen des osmotischen Drucks innerhalb des Blutgefäßes erhöht. Üblicherweise werden hypertonische Lösungen, die Salze wie NaCl, Zucker oder Polyole wie Mannitol enthalten, verwendet. Hypertonisch bedeutet, dass die Osmolalität der Injektionslösung größer als die physiologische Osmolalität ist. Isotonisch bedeutet, dass die Osmolalität der Injektionslösung die gleiche wie die physiologische Osmolalität (die Tonizität oder der osmotische Druck der Lösung ist gleich dem des Blutes) ist. Hypertonische Lösungen weisen eine erhöhte Tonizität und erhöhten osmotischen Druck auf, der ähnlich dem osmotischen Druck von Blut ist, und veranlassen die Zellen zum Schrumpfen.
• In einer anderen bevorzugten Ausführungsform kann die Durchlässigkeit der Blutgefäße auch durch ein biologisch-wirksames Molekül erhöht werden. Ein biologisch-wirksames Molekül ist ein Protein oder eine einfache Chemikalie wie Histamin, das die Durchlässigkeit des Gefäßes erhöht, indem eine Veränderung bezüglich der Funktion, der Aktivität oder der Form der Zellen innerhalb der Gefäßwand, wie die Endothel- oder glatten Muskelzellen, erhöht wird. Üblicherweise interagieren biologischwirksame Moleküle mit einem spezifischen Rezeptor oder Enzym oder Protein innerhalb der vaskulären Zelle, um die Durchlässigkeit der Zelle zu verändern. Biologisch-wirksame Moleküle schließen den vaskulären Durchlässigkeitsfaktor (VPF) ein, der auch als vaskulärer Endothel-Wachstumsfaktor (VEGF) bekannt ist. Eine andere Art von biologisch-wirksamem Molekül kann die Durchlässigkeit auch durch Verändern des extrazellulären Verbindungsmaterials erhöhen. Beispielsweise könnte ein Enzym das extrazelluläre Material digerieren und die Anzahl und Größe der Löcher des Verbindungsmaterials erhöhen.
• BEISPIELE
• Die folgenden Beispiele sind dazu beabsichtigt, die vorliegende Erfindung zu veranschaulichen, aber nicht dazu, sie einzuschränken.
• Beispiel 1
• Intraportale Injektionen von Plasmid-DNA:
• Methoden:
• Nachdem 25 g-Lebern von 6 Wochen alten Mäusen durch einen ventralen Mittellinienschnitt freigelegt wurden, wurden Lösungen, die pBS.CMVLux-Plasmid-DNA enthielten (unten beschrieben), über etwa 30 Sek. unter Verwendung einer 30-Dicke, Halbzoll-Nadel und 1 ml-Spritze manuell in die Pfortader injiziert. Bei einigen Tieren wurde während der Injektion ein 5 × 1 mm Kleinert-Kutz Mikrogefäß-Clip (Edward Weck, Inc., Research Triangle Park, NC) an der Verbindung der hepatischen Vene und der kaudalen Hohlvene appliziert. Anästhesie wurde durch intramuskuläre Injektionen von 1.000 μg Ketamin-HCl (Parke-Davis, Morris Plains, NJ) in 1 ml normaler Salzlösung, und Methoxyfluran (Pitman-Moore, Mudelein, IL, USA), das je nach Bedarf durch Inhalation verabreicht wurde und von Sigma erworben wurde. Heparin wurde von LyphoMed (Chicago, IL) erworben.
• Reporter-Gene und Untersuchungen
• Die pBS.CMVLux-Plasmid-DNA wurde verwendet, um Luciferase aus dem humanen unmittelbaren frühen Zytomegalovirus(CMV)-Promoter (I. Danko, et al., Gene Therapy 1, 114 (1994)) zu exprimieren. Zwei Tage nach der Injektion wurden die Lebern bezüglich der Luciferase-Expression wie vorher berichtet (J.A. Wolff, et al., Sciene 247, 145 (1990)) untersucht – außer der Veränderung wie unten. Die Tiere wurden durch Genickbruch getötet und die Lebern (Durchschnittsgewicht 1,5 g) wurden in sechs Abschnitte aufgeteilt, die aus zwei Stücken des medialen Lappens, zwei Stücken des linkslateralen Lappens, dem rechtslate ralen Lappen und dem kaudalen Lappen plus einem kleinen Stück des rechtslateralen Lappens bestehen. Jeder der sechs Abschnitte wurde separat in 200 μl Lysis-Puffer (0,1% Triton X-100, 0,1 M K-Phosphat, 1 mM DTT pH 7,8) platziert, der dann unter Verwendung eines PRO 200 Homogenisators (PRO Scientific Inc., Monroe CT) homogenisiert wurde. Die Homogenisate wurden bei 4°C 10 min bei 4.000 U/min zentrifugiert und 20 μl des Überstands wurden bezüglich der Luciferase-Aktivität analysiert. Relative Lichteinheiten (RLU) wurden unter Verwendung eines Standards von den Analytic Luminescence Laboratories (ALL, San Diego, CA) in pg Luciferase umgerechnet. Luciferase-Protein (pg) = 5,1 × 10^–5 × RLU + 3 683 (r² = 0,992). Die Gesamtmenge Luciferase/Leber wurde berechnet, indem alle Abschnitte jeder Leber addiert wurden und mit 23 multipliziert wurden, um Verdünnungseffekte zu berücksichtigen. Für jede Bedingung wird die durchschnittliche Gesamtmenge an Luciferase/Leber und die damit verbundene Standardabweichung gezeigt.
• Ergebnisse:
• Nachdem die 25 g-Lebern 6 Wochen alter Mäuse durch einen ventralen Mittellinienschnitt freigelegt wurden, wurden für etwa 30 Sek. 100 μg pBS.CMVLux-Plasmid-DNA in 1 ml Lösungen über eine 30-Dicke Halbzoll-Nadel in die Pfortader injiziert. Zwei Tage nach Injektion wurde ein Mittelwert von nur 0,4 ng Gesamtmenge Luciferase/Leber produziert, wenn die DNA intraportal in einer isotonischen Lösung ohne Abbinden der hepatischen Vene (Tabelle 1) geliefert wurde. Die Einbeziehung von 20% Mannitol in die Injektionslösung erhöhte die durchschnittliche Gesamtmenge an Luciferase/Leber um das Zehnfache auf 4,8 ng (Tabelle 1).
• Um den schnellen Durchgang der DNA zu verhindern und den intraportalen Druck zu erhöhen, wurde die hepatische Vene nach Injektion für 2 min abgeklemmt. Die Luciferase-Produktion erhöhte sich weiter um das Dreifache auf 14,7 ng (Tabelle 1).
• Wenn die DNA in einer hypertonischen Lösung, die 0,9% Salz, 15% Mannitol und 2,5 Einheiten/ml Heparin enthielt, injiziert wurde, um mikrovaskuläre Thrombose zu verhindern, und die hepatische Vene abgeklemmt wurde, erhöhte sich die Luciferase-Expression achtfach auf 120,3 ng/Leber (Tabelle 1). Diese Ergebnisse werden auch in Tabelle 7 (keine Dexamethason-Bedingung) in Beispiel 3 unten für jedes einzelne Tier gezeigt. Wenn das Mannitol unter diesen Bedingungen weggelassen wurde, war die Luciferase-Expression zehnfach niedriger (Tabelle 1).
• Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Hypertonus, Heparin und Verschluß der hepatischen Vene benötigt werden, um sehr hohe Konzentrationen an Luciferase-Expression zu erzielen. Tabelle 1. Durchschnittliche Gesamtmenge an Luciferase in der Leber im Anschluss an die intraportale Injektion (über 30 Sekunden) von 100 μg pBS.CMVLux in 1 ml verschiedener Lösungen ohne Klammer oder mit für zwei Minuten abgeklemmter hepatischer Vene und unterer Hohlvene.

  Bedingung	Mittelwert Luciferase (Gesamtmenge in ng in Leber)	Standardfehler	Anzahl an Lebern
  keine Klammer, normale Salzlösung (NSS)	0,4	0,7	n = 6
  keine Klammer, 20% Mannitol	4,8	8,1	n = 3
  Klammer, 20% Mannitol	14,6	26,3	n = 9
  Klammer, 2,5 Einheiten Heparin/ml in NSS	11,8	12,5	n = 4
  Klammer, 15% Mannitol und 2,5 Einheiten Heparin/ml in NSS	120,3	101,5	n = 12

• Die Luciferase-Aktivitäten in jeder Leber waren in den sechs aufgeteilten untersuchten Abschnitten gleichmäßig verteilt (Tabelle 2). Alle sechs Teile jeder Leber von allen drei Tieren wiesen substantielle Mengen an Luciferase auf. Dies steht in merklichem Kontrast zur direkten interstitiellen, intralobären Injektion von DNA, bei der die Expression auf die Injektionsstelle begrenzt ist [(R. W. Malone et al., J. Biol. Chem 269, 29903 (1994)); (M.A. Hickman, et al., Hum. Gene Ther. 5, 1477 (1994))]. Tabelle 2. Die Verteilung der Luciferase-Expression über die sechs Leber-Abschnitte bei Tieren, denen intraportal (über 30 Sekunden) 100 μg pBS.CMVLux in 1 ml normaler Salzlösung plus 15% Mannitol und 2,5 Einheiten Heparin/ml injiziert wurde und denen für 2 Minuten die hepatische Vene abgeklemmt wurde.

  Leberabschnitt	Gesamtmenge Luciferase/Leber [ng/Leber/Maus]
  	Maus #1	Maus #2	Maus #3
  1/2 des medialen Lappens	496,5	66,9	304,5
  Andere 1/2 des medialen Lappens	177,0	126,1	241,4
  1/2 des linkslateralen Lappens	763,8	208,7	325,2
  Andere 1/2 des linkslateralen Lappens	409,4	160,4	218,9
  rechtslateraler Lappen	527,8	129,7	216,2
  kaudaler Lappen + kleines Stück des rechtslateralen Lappens	374,1	149,7	240,8
  Gesamtmenge	2.748,6	841,5	1.547,0
  Mittelwert	458,1	140,3	257,8
  Bereich	177–763	67–209	216–325
  Standardabweichung	194,0	46,6	45,9

• Schlussfolgerungen
• 1. Hohe Konzentrationen an Luciferase-Expression wurden durch intraportales Injizieren von 100 μg pBS.CMVLux erhalten.
• 2. Die höchsten Konzentrationen an Luciferase-Expression wurden erhalten, wenn den Tieren über 30 Sekunden 100 μg pBS.CMVLux in 1 ml normaler Salzlösung plus 15% Mannitol und 2,5 Einheiten Heparin/ml intraportal injiziert wurde und die hepatische Vene 2 Minuten abgeklemmt wurde.
• 3. Diese hohen Expressionslevel wurden bei Dutzenden von Mäusen konsistent erhalten.
• 4. Die Luciferase-Expression war überall in der Leber gleichmäßig verteilt.
• Beispiel 2
• Die Wirkungen anderer Faktoren auf die Expression wurden unter Verwendung der gleichen Methoden wie für die intraportale Injektion von pBS.CMVLux untersucht.
• Methoden
• Wenn nicht anders angegeben, wurden die intraportalen Injektionen und Luciferase-Untersuchungen wie in Beispiel 1 ausgeführt.
• Ergebnisse
• Verglichen mit den Ergebnissen mit 100 μg pBS.CMVLUX war die Luciferase-Expression mit 500 μg Plasmid-DNA nicht größer (Tabelle 3). Die Luciferase-Expression war etwa 7 Mal geringer, wenn anstatt 100 μg 20 μg pBS.CMVLux-DNA injiziert wurde. Tabelle 3. Gesamte Luciferase-Expression in jeder Leber jedes Tiers, dem (über 30 Sek.) 20 μg, 100 μg oder 500 μg pBS.CMVLux in 1 ml normaler Salzlösung plus 15% Mannitol und 2,5 Einheiten Heparin/ml intraportal injiziert wurde und dem die hepatische Vene 2 min okkludiert wurde.

  Gesamtmenge Luciferase/Leber [ng/Leber/Maus]
  Maus-Nummer	100 μg pBS.CMVLux	500 μg pBS.CMVLux
  1	1.023	15
  2	178	82
  3	108	23
  4	140	340
  Mittelwert	362	115
  Standardabweichung	441	153

• Die Zeiten, für die die hepatische Vene okkludiert wurde, Variierten von 2 min bis 4 min und bis zu 6 min. In Tabelle 4 sieht man, dass die Okklusionszeit keine große Wirkung auf die Expression hatte. Tabelle 4. Wirkung der Okklusionszeit der hepatischen Vene auf die Luciferase-Expression bei Tieren, denen 100 μg pBS.CMVLux in 1 ml normaler Salzlösung plus 15% Mannitol und 2,5 Einheiten Heparin/ml intraportal injiziert wurde.

  Maus-Nummer	Gesamtmenge Luciferase/Leber [ng/Leber/Maus]
  	2 Min.	4 Min.	6 Min.
  1	4,6	1,9	32,7
  2	44,9	11,5	64

• Die Zeiten, über die die Injektionen ausgeführt wurden, wurden von 30 Sekunden bis 1 Minute und 2 Minuten variiert. In Tabelle 5 kann man sehen, dass das Injizieren der 1 ml der DNA-Lösung (100 μg pBS.CMVLux) über 30 Sekunden die höchsten Konzentration an Luciferase-Expression ermöglichte. Längere Injektionszeiten führten zu geringeren Konzentrationen. Tabelle 5. Wirkung der Injektionszeitdauer (Zeit, die benötigt wurde, um alles von den 1 ml zu injizieren) auf die Luciferase-Expression bei Tieren, denen 100 μg pBS.CMVLux in 1 ml normaler Salzlösung plus 15% Mannitol und 2,5 Einheiten Heparin/ml intraportal injiziert wurde und denen die hepatische Vene 2 min okkludiert wurde.

  Maus-Nummer	Gesamtmenge Luciferase/Leber [ng/Leber/Maus]
  	30 Sek.	1 Min.	2 Min.
  1	2.697	188	21,6
  2	790	13,4	19,9
  3	1.496	141,1	11,8
  Mittelwert	1.662	114	18
  Standardabweichung	964	91	5

• Wenn das Gesamtvolumen des Injektionsfluids anstatt 1,0 ml 0,5 ml betrug, verringerte sich die Luciferase-Expression 70-fach (Tabelle 6), was darauf hindeutet, dass 0,5 ml nicht ausreichend war, um den intravaskulären Raum zu füllen und die DNA überall im Parenchym zu verteilen. Tabelle 6. Gesamte Luciferase-Expression in jeder Leber jedes Tiers, dem (über 30 Sek.) 100 μg pBS.CMVLux in entweder 0,5 oder 1 ml normaler Salzlösung plus 15% Mannitol und 2,5 Einheiten Heparin/ml intraportal injiziert wurde und dem die hepatische Vene 2 min okkludiert wurde.

  Gesamtmenge Luciferase/Leber [ng/Leber/Maus]
  Maus-Nummer	0,5 ml	1 ml
  1	1,6	51,9
  2	4,7	124,8
  3	0,4	266,9
  Mittelwert	2,3	147,9
  Standardabweichung	2,3	109,4

• Schlussfolgerungen
• 1. Die optimalen Bedingungen sind tatsächlich die zuerst in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen: Den Tieren wurden über 30 Sekunden 100 μg pBS.CMVLux in 1 ml normaler Salzlösung plus 15% Mannitol und 2,5 Einheiten Heparin/ml intraportal injiziert und die hepatische Vene für 2 Minuten abgeklemmt.
• 2. Die Verwendung von 500 μg pBS.CMVLux ermöglichte keine größeren Expressionslevel, sondern die Expression war etwa 7-fach geringer, wenn 20 μg DNA verwendet wurde.
• 3. Das Okkludieren der hepatischen Vene für mehr als 2 Minuten erhöhte die Expression nicht.
• 4. Das Injizieren des pBS.CMVLux über 30 Sekunden ergab im Vergleich zu Injektionszeiten von mehr als 30 Sekunden die höchsten Luciferase-Konzentrationen.
• 5. Das Injizieren des pBS.CMVLux in 1 ml ergab höhere Luciferase-Konzentration als das Injizieren des pBS.CMVLux in 0,5 ml.
• Beispiel 3
• Methoden
• Die intraportalen Injektionen und Luciferase-Untersuchungen wurden wie in Beispiel 1 durchgeführt, außer dass einige Tiere täglich subkutane Injektionen von 1 mg/kg Dexamethason (Elkins-Sinn, Cherry Hill, NJ) erhielten, die einen Tag vor der Operation begannen. Die Bedingungen für die Injektionen waren intraportale Injektionen über 30 Sekunden mit 100 μg pBS.CMVLux in 1 ml normaler Salzlösung plus 15% Mannitol und 2,5 Einheiten Heparin/ml und bei für 2 Minuten abgeklemmter hepatischer Vene.
• Ergebnisse:
• Unter den oben beschriebenen Bedingungen (d. h. Heparin enthaltende hypertonische Lösung und Verschließen der hepatischen Vene) war die Luciferase-Expression bei Tieren, denen beginnend vom Tag vor der Plasmid-Injektion täglich Injektionen von Dexamethason injiziert wurden, dreifach größer als die Expression ohne Dexamethason (Tabelle 7). Tabelle 7. Die Wirkung von Dexamethason-Injektionen auf die Luciferase-Expression nach der intraportalen Injektion von pBS.CMVLux.

  	Gesamtmenge Luciferase/Leber [ng/Leber/Maus]
  Maus-Nummer	OHNE Dexamethason	MIT Dexamethason
  1	51,9	1.181,1
  2	124,8	364,7
  3	266,9	82,8
  4	73,7	120,5
  5	52,6	1.022,9
  6	7,3	178,1
  7	146,1	107,6
  8	231,4	140,2
  9	271,2
  10	8,7
  11	8,3
  12	201,1
  Mittelwert	120,3	399,8
  Standardabweichung	101,4	444,1

• Dexamethason könnte die Produktion von Luciferase und die Expression anderer Gene durch verschiedene Mechanismen erhöht haben. Diese schließen das Erhöhen der Menge an Plasmid-DNA ein, die durch Modifizieren des Zustands der Leberzellen in die Leberzellen eindringt. Es könnte den Leberzellen auch helfen, dem hohen Druck standzuhalten. Allerdings ist der wahrscheinlichste Mechanismus der, dass das Dexamethason den CMV-Promoter direkt stimuliert und dabei durch Stimulieren der Transkription der Luciferase-Boten-RNA die Luciferase-Expression direkt erhöht.
• Die Verwendung von Dexamethason zeigt, dass durch das Verwenden eines jederzeit verfügbaren Pharmakons die Expressionslevels substantiell erhöht und reguliert werden können.
• Schlussfolgerung:
• 1. Die Dexamethason-Verabreichung erhöhte die Luciferase-Expression von intraportal injizierter pBS.CMVLux-Plasmid-DNA dreifach.
• 2. Dies zeigt, dass die Expression unter Verwendung eines herkömmlich verwendeten Pharmakons von der Leber aus reguliert werden kann.
• Beispiel 4
• Methoden
• Die intraportalen Injektionen wurden unter Verwendung der zuvor genannten Injektionstechniken über 30 Sekunden mit 100 μg Plasmid-DNA in 1 ml normaler Salzlösung plus 15% Mannitol und 2,5 Einheiten Heparin/ml und mit der für 2 Minuten abgeklemmten hepatischen Vene durchgeführt. Die Mäuse erhielten ebenfalls täglich subkutane Injektionen von 1 mg/kg Dexamethason (Elkins-Sinn, Cherry Hill, NJ), die einen Tag vor der Operation begannen.
• Die Plasmide pBS.CMVLacZ und pBS.CMVnLacZ wurden verwendet, um von dem CMV-Promoter jeweils ein zytoplasmatisches und ein nukleares β-Galactosidase-Protein zu exprimieren (Picard, D. & Yamamoto, K., EMBO J. 6: 3333–3340, 1987). Sie wurden durch Platzieren von entweder einer 3,5-kg-HindIII/XbaI B-Galactosidasesequenz von pSDKLacZpa (Danko, I. et al., Gene Therapy 1: 114–121, 1994) oder einer Sequenz, die eine nuklear-lokalisierende-Galactosidase (Picard, D. & Yamamoto, K., EMBO J. 6: 3333–3340, 1987) in pBlueCMV (Danko, I. et al., Gene Therapy 1 114–121, 1994) kodiert, errichtet.
• Zwei Tage nach intraportaler Injektion wurden die Lebern mit 1% Paraformaldehyd und 1,25% Glutaraldehyd in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) durchströmt und dann einen Tag in dieser Lösung aufbewahrt. Nachdem die Lebern in 30% Saccharose gelagert wurden, wurden sie gefrier-geschnitten. Die Schnitte wurden auf Objektträgern angebracht und für 1 Stunde bis einen Tag mit einer PBS-Lösung (pH 7,5), die 400 μg/ml X-gal (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactosid) (Sigma), 5 mM Kaliumferricyanid, 5 mM Ferrocyanid und 1 mM MgCl₂ enthielt, gefärbt. Nach dem Waschen wurden die Schnitte dann mit Hämatoxylin und Eosin gegen-gefärbt. In den Lebern, denen der nuklearlokalisierende β-Galactosidasevektor injiziert wurde, wurde der Wasch-Schritt nach der Hämatoxylin-Inkubation weggelassen, um dessen Kernfärbung zu verringern.
• Ergebisse:
• Nachdem die optimalen Bedingungen definiert waren, wurden die Arten und Prozentzahlen der transfizierten Zellen bestimmt. Nach Injektionen von 100 μg der zytoplasmatischen (pBS.CMVLacZ)- oder der nuklearen (pBS.CMVnLacZ)-β-Galactosidase-Expressionsvektoren in Dexamethason-behandelte Tiere wurden 10 bis 30 μm dicke Leber-Gefrierschnitte unter Verwendung von X-gal bei pH 7,5 bezüglich β-Galactosidase gefärbt, um Hintergrund-Färbung zu verhindern. In etwa 1% der Leberzellen wurde eine intensive blaue Färbung beobachtet, die überall in der Leber gleichmäßig verteilt war. X-gal-Inkubationen für nur 1 Stunde führten zu intensiv blauen Zellen; dies deutete darauf hin, dass die transfizierten Zellen relativ große Mengen der fremden Gene exprimierten. Kontrolllebern, denen 100 μg pBS.CMVLux injiziert wurde, enthielten keine positiv-gefärbten Zellen. In etwa 10% der Schnitte wurde Nekrose beobachtet. Allerdings enthielten einige Lebern mit hoher β-Galactosidase-Expression keine Abschnitte mit Nekrose.
• Die Hepatzyten wurden durch ihre charakteristische Morphologie identifiziert. Zum Beispiel wiesen viele der Zellen in den Lebern, denen der nukleare β-Galactosidase-Vektor pBS.CMVnLacZ injiziert wurde, in zwei Nuklei blaue Färbung auf, was nur eine Eigenschaft von Hepatozyten ist. Obwohl die Mehrzahl der positiv-gefärbten Zellen Hepatozyten waren, enthielten einige wenige kleine, nicht-Hepatozytenzellen blaue Färbung.
• Schlussfolgerung:
• 1. Etwa 1% der Leberzellen wurden überall in der ganzen Leber mit dem B-Galactosidase-Gen transfiziert.
• 2. Fast alle der transfizierten Leberzellen waren Hepatozyten.
• Beispiel 5
• Methoden:
• Die Luciferase-Expression in der Leber wurde mit der in in 35 mm Platten kultivierten HepG2-Hepatozyten verglichen. Die Transfektionen wurden unter Verwendung von 3 μg pBS.CMVLux/Platte und entweder mit 3 μg Lipofectin (Life Tech nologies, Bethesda, MD) oder mit 6 μg LipofectAMINE (Life Technologies, Bethesda, MD) nach Herstellervorschrift ausgeführt. Zwei Tage nach Transfektion wurden 200 μl Lysis-Puffer zu den Kulturen zugegeben und 20 μl des Überstands wurden wie in Beispiel 1 bezüglich der Luciferase-Aktivität analysiert.
• Ergebnisse:
• Unter Verwendung dieser Technik wurde die Effizienz der Luciferase-Expression mit anderen Gentransfer-Methoden – sowohl in vitro als auch in vivo – verglichen. Transfektionen, die unter optimalen Bedingungen mit pBS.CMVLUX und Lipofectin oder LipofectAMINE (Life Technologies Inc.) in HepG2 Hepatozyten in Kultur (n = 8) durchgeführt wurden, ergaben eine durchschnittliche Gesamtmenge von 3,7 ± 4,5 ng Luciferase/35 mm Platte und 2,8 ± 2,0 ng Luciferase/35 mm Platte. Folglich betrug die Effizienz der Transfektion (ohne Dexamethason) in Bezug auf ng Luciferase/μg pBS.CMVLUX DNA sowohl in vitro als auch in vivo etwa 1 ng/μg.
• Das veröffentlichte Verfahren des wiederholten und direkten Injizierens nackter Pasmid-DNA in einen Rattenleber-Lappen wurde für Mäuseleber (R.W. Malone et al., J. Biol. Chem. 269, 29903 (1994); M.A. Hickman, et al., Hum. Gene Ther. 5, 1477 (1994)) proportional reduziert. Eine Gesamtmenge von 100 μg pBS.CMVLUX in einem Gesamtvolumen von 200 μl normaler Salzlösung wurde in fünf verschiedene Stellen (40 μl/Stelle) in den linkslateralen Lappen von mit Dexamethason behandelten 30 g-Mäusen injiziert. Es wurde eine durchschnittliche Gesamtmenge von nur 0,1 ng/Leber (4 Lebern; 0,001 ng Luciferase/μg DNA) erhalten, und die Luciferase-Expression war nur in dem Lappen vorhanden, dem injiziert wurde. Etwa 30-fach mehr Luciferase-Expression wurde erhalten, wenn die direkten intralobären Injektionen unter Verwendung von 1 ml Injektionsfluid und Ab klemmen der hepatischen Vene ausgeführt wurden. In den früheren Untersuchungen, die die mehrfachen Injektionen einer Gesamtmenge von 500 μg pCMVL in einen Leberlappen von mit Dexamethason-behandelten Ratten betreffen, wurde ein Mittelwert von 9,87 ng Luciferase/Leber (0,02 ng/μg DNA) exprimiert (R.W.
• Malone et al., J. Biol. Chem. 269, 29903 (1994); M.A. Hickman, et al., Hum. Gene Ther. 5, 1477 (1994)).
• In Bezug auf einen Muskel injizierten wir üblicherweise pro Experiment 10 μg pBS.CMVLUX oder pBS.RSVLUX ((Danko, I. et al., Gene Therapy 1: 114–121, 1994)) in normaler Salzlösung in 6–8 Maus-Quadrizepsmuskeln. In Dutzenden von Experimenten betrug die durchschnittliche Gesamtmenge Luciferase pro Muskel 0,4–1 ng (±0,5–1,2) und die Effizienz betrug 0,04–0,1 ng Luciferase/μg DNA. Tabelle 8. In μg pBS.CMVLux-Plasmid-DNA ausgedrückter Vergleich der Effizienz des Gentransfers in Bezug auf Luciferase, die für die Methode (ng Luciferase/μg DNA) verwendet wurde

  Art des Gentrans-fers	Durchschnittliche Gesamtausbeute an Luciferase [ng]	Menge an verwendeter pBS.CMVLux [μg]	Effizienz [ng Luciferase/μg DNA]
  Intraportale Mäuseleber (obige Optimalbedingungen -Tabelle 1) bei abgeklemmter hepatischer Vene	120,3 ± 101,5 n = 12	100	1,2
  HepG2 in vitro mit Lipofectin	3,7 ± 4,5 (n = 8)	3	1,2
  HepG2 in vitro mit LipofectAMINE	2,8 ± 2,0 (n = 8)	3	0,9
  Intralobäre Mäuse-leber (20 μl/Stelle × 5 Stellen) bei nicht abgeklemmter hepatischer Vene	0,1 ± 0,1 n = 4	100	0,001
  Intralobäre Mäuse-leber (1 ml/1 Stelle) bei abgeklemmter hepatischer Vene	2,8 ± 5,6 n = 4	100	0,028
  Intralobäre Rattenleber (5 Stellen) von veröffentlichten Daten (Journal of Biologic Chemistry 269: 29903, 1994; Human Gene Therapy 5 1477, 1994)	9,87	500	0,02
  Intramuskulär	0,4–1 ± 0,5–1,2 n > 50	10	0,04–0,1

• Schlussfolgerungen:
• 1. Das intraportale Liefern nackter DNA war um mehr als eine Zehnerpotenz effizienter als interstitielles Liefern in entweder die Leber oder den Muskel, und es war gleichmäßiger verteilt.
• Beispiel 6
• Methoden:
• Die intraportalen Injektionen wurden unter Verwendung der obigen, optimalen Injektionen ausgeführt, welche intraportale Injektionen über 30 Sekunden mit 100 μg pCMVGH in 1 ml normaler Salzlösung plus 15% Mannitol und 2,5 Einheiten Heparin/ml und mit für 2 Minuten abgeklemmter hepatischer Vene sind. Einige Tiere erhielten täglich intramuskuläre Injektionen von 100 mg/kg Cyclosporin (Sandimmune, Sandoz) oder täglich subkutane Injektionen von 1 mg/kg Dexamethason (Elkins-Sinn, Cherry Hill, NJ), oder beide begannen einen Tag vor der Operation.
• Die vorher beschriebene pCMVGH-Plasmid-DNA wurde verwendet, um das menschliche Wachstumshormon (hGH) zu exprimieren (C. Andree, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 12188 (1994)). Vom retroorbitalen Sinus erhaltenes Blut wurde bezüglich der Serumkonzentration von hGH unter Verwendung des radioimmunologischen Assays (RIA), HGH-TGES 100T-Kit vom Nichols Institute (San Juan Capistrano, CA) analysiert.
• Ergebnisse:
• Das menschliche Wachstumshormon (hGH) wurde als Marker-Gen verwendet, um die Fähigkeit dieser Gentransfertechnik, ein therapeutisches Serumprotein zu produzieren, zu bewerten (Tabelle 9). Zwei Tage nach der intraportalen Injektion von 100 μg pCMVGH unter den obigen optimalen Bedingungen betrug die durchschnittliche hGH Serum-Konzentration 57 ± 22 ng/ml (n = 12) – bei einem Bereich von 21–95 ng/ml. Weder Dexamethason- noch Cyclosporin-Vorbehandlung beeinflusste diese anfänglichen hGH-Konzentrationen signifikant. In zwei Tieren, denen pBS.CMVLUX injiziert wurde, betrugen die hGH-Hintergrund-Konzentrationen 4 Wochen danach 0,3 ± 0,1 ng/ml.
• Bei Menschen erreichen normal pulsierende GH-Konzentrationen bei etwa 20 ng/ml einen Peak, der über den Grundlinienwerten von etwa 1 ng/ml liegt und nach Wachstumshormon-freisetzender Hormonstimulation (GHRH) Konzentrationen von 10–180 ng/ml erreichen kann (A. Favia, J.D. Veldhuis, M.O. Thorner, M.L. Vance, J. Clin. Endocrinol. Metab. 68, 535 (1989); R.W. Holl, M.L. Harturan, J.D. Veldhuis, W.M. Taylor, M.O. Thorner, J. Clin. Endocrinol Metab. 72, 854 (1991); W.S. Evans et al., Am J. Physiol. 252, E549 (1987); F.P. Alford, H.W.G. Baker, H.G. Burger, J. Clin Endocrinol. Metab. 37, 515 (1973)). Die Halbwertszeit von hGH beträgt bei Menschen etwa 20 min und bei Mäusen 4,5 min; folglich könnten diese Serumkonzentrationen für stabilere Proteine in weitaus höhere Konzentrationen überführt werdem (S. Peeters und H.G. Friesen, Endocrinol. 101, 1164 (1977); A. Favia, J.D. Veldhuis, M.O. Thorner, M.L. Vance, J. Clin. Endocrinol. Metab. 68, 535 (1989)). Wenn zum Beispiel ein Protein wie Alpha-Antitrypsin eine Halbwertszeit aufweist, die zehnmal länger als die von menschlichem GH ist, dann sollten die zirkulierenden Blut-Konzentrationen angesichts der gleichen Effizienz der Proteinproduktion mehr als zehnmal höher sein. Ein anderes Beispiel ist das für Hämophilie, welche Konzentrationen des Faktors VIII oder IX im Bereich von etwa 1 μg des Gerinnungsfaktors/ml Blut benötigt. Angesichts der erhöhten Stabilität dieser Gerinnungsfaktoren bedeuten dann die 0,1 μg/ml hGH, die wir nach intraportaler Injektion der jeweiligen Gene erreichen können, dass wir in der Lage wären, therapeutische Konzentrationen an Gerinnungsfaktoren zu erhalten, um Blutung in Patienten mit Hämophilie zu verhindern. Zusammengefasst zeigen diese Ergebnisse, dass die Technik intraportaler-nackter DNA verwendet werden könnte, um therapeutische Konzentrationen eines zirkulierenden Blutproteins zu produzieren.
• Serienmessungen von hGH-Serumkonzentrationen ermöglichten die Beurteilung der Expressionsstabilität in einzelnen Mäusen (Tabelle 9). Wie in vorherigen Studien, in denen die Plasmid-DNA unter Verwendung von Polylysin-Komplexen oder intralobären Injektionen nackter DNA zu nicht-hepatotektomisierten Lebern ge liefert wurde, war die hGH-Expression bei unbehandelten Tieren instabil.
• Eine Immunreaktion könnte die Hepatozyten töten, die das menschliche Protein exprimieren. Um die Hypothese, dass die Expression aufgrund einer Immunreaktion instabil wäre, zu prüfen, wurden die hGH-Konzentrationen bei Tieren verfolgt, die Cyclosporin mit oder ohne Dexamethason-Verabreichung erhielten (Tabelle 9). Nach einem akuten Absetzen blieben die hGH-Konzentrationen bei Tieren, die sowohl Dexamethason als auch Cyclosporin erhielten, für vier Wochen bei 6–11 ng/ml. Bei Tieren, die Dexamethason allein oder Cyclosporin allein erhielten, war die hGH-Expression verglichen mit den nicht behandelten Tieren verlängert, aber nicht im gleichen Ausmaß wie bei den Tieren, die beide Mittel erhielten. Die Fähigkeit dieses Gentransfer-Verfahrens, Expression eines fremden Gens zu ermöglichen, sollte dessen Nützlichkeit erhöhen. Tabelle 9. Durchschnittliche Serum-Konzentrationen (ng/ml an Serum) des menschlichen Wachstumshormons (hGH) nach der intraportalen Verabreichung von pCMVGH unter optimalen Bedingungen bei Mäusen (2 bis 3 Tiere für jeden Zeitpunkt), die verschiedene Behandlungen erhielten. Als optimale Bedingungen werden die Verwendung von 0,9% Salzlösung, 15% Mannitol, 2,5 Einheiten/ml Heparin-Lösung festgelegt, die bei geschlossener hepatischer Vene intraportal injiziert wurde.

  TAGE NACH DER INJEKTION	NICHTS	CSA allein	DEX allein	CSA + DEX
  2	69	43	72	51
  4	11	8	14	14
  8	3	6	7	13
  12	0	4	7	15
  15	0	3	5	13
  21	0	1,5	2,6	9,7
  28	0	1	2,2	7,9

• Schlussfolgerungen:
• 1. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Technik intraportalernackter DNA verwendet werden könnte, um therapeutische Konzentrationen eines zirkulierenden Blutproteins zu produzieren, das gegenwärtig verwendet wird, um Menschen zu behandeln.
• 2. Die Konzentrationen des zirkulierenden Blutproteins (d. h. hGH) blieben für mindestens einen Monat nach einer Einzelinjektion erhöht.
• Beispiel 7
• Methoden:
• Nachdem die Pfortadern von 6 Wochen alten 25 g Mäusen durch einen ventralen Mittellinienschnitt freigelegt wurden, wurden 100 μg pBS.CMVLux-Plasmid-DNA in 0,5 ml oder 1 ml normaler Salzlösung plus 15% Mannitol und 2,5 Einheiten Heparin/ml nahe der Verbindungsstelle der Milzvene und der Pfortader über 30 Sekunden in die Pfortader injiziert. Die Pfortader wies zwei distal und proximal zum Injektionspunkt platzierte Klammern auf, um das Injektionsfluid nur in die Milzvene zu leiten und um das Injektionsfluid davon abzuhalten, zur Leber oder den Därmen zu gehen. Die Injektionen wurden unter Verwendung einer 30-Dicke, 1/2-Inch Nadel und 1 ml Spritze durchgeführt. Es wurden 5 × 1 mm Kleinert-Kutz Mikrogefäß-Clips verwendet (Edward Weck, Inc., Research Triangle Park, NC). Anästhesie wurde mit intramuskulären Injektionen von 1000 μg Ketamin-HCl (Parke-Davis, Morris Plains, NJ) und Methoxyfluran (Pitma-Moore, Mudelein, IL. U.S.A.), von Sigma erworben, das je nach Bedarf durch Inhalation verabreicht wurde, erhalten. Heparin wurde von LyphoMed (Chicago, IL) erworben.
• Zwei Tage nach Injektion wurden die Milzen und die Pankreasen entfernt und in 500 μl Lysis-Puffer gelegt, und 20 μl wurden wie oben beschrieben bezüglich der Luciferase-Expression analysiert.
• Ergebnisse:
• In der Milz und dem Pankreas aller vier Mäuse mit sowohl Injektionsfluiden von 0,5 ml als auch 1 ml wurden erhebliche Mengen an Luciferase-Aktivität erhalten. Tabelle 10. Luciferase-Expression nach der intravaskulären Verabreichung von pBS.CMVLux in die Milzvene über die Pfortader.

  Gesamtmenge Luciferase/Organ [pg/Organ/Ma/Organus]
  Injektionsvolumen	Milz	Pankreas
  0,5 ml	814,4	97,2
  0,5 ml	237,3	88,7
  1 ml	168,7	109,4
  1 ml	395,0	97,7
  Mittelwert	403,9	98,3
  Standardabweichung	289,6	8,5

• Schlussfolgerung:
• 1. Intravaskulär verabreichte Plasmid-DNA kann in der Milz und dem Pankreas effizient exprimieren.
• Beispiel 8
• Methoden:
• 100 μg pBS.CMVLux in 10 ml normaler Salzlösung plus 15% Mannitol wurde bei abgeklemmter Oberschenkelvene in die Oberschenkelarterie von adulten Ratten injiziert. Ein bis vier Tage nach Injektion wurde der Quadrizeps entfernt und in 10 gleiche Abschnitte geschnitten. Jeder Abschnitt wurde in 500 μl Lysis-Puffer gelegt und 20 μl wurden wie oben beschrieben bezüglich der Luciferase-Aktivität untersucht.
• Ergebnisse:
• Nach der intravaskulären Lieferung von Plasmid-DNA wurden im Quadrizeps erhebliche Mengen an Luciferase-Expression exprimiert. Tabelle 11. Luciferase-Expression im Quadrizeps einer Ratte nach der Injektion von 100 μg pBS.CMVLux in die Oberschenkelarterie und bei abgeklemmter Oberschenkelvene.

  Ratten-Nummer	Gesamtmenge Luciferase [pg/Quadrizeps]
  1	157,5
  2	108,8
  3	139,2
  4	111,3
  Mittelwert	129,2
  Standardabweichung	23,4

• Schlussfolgerung:
• 1. Intravaskulär verabreichte Plasmid-DNA kann im Muskel effizient exprimieren.
• Beispiel 9
• Die vorherigen Beispiele betrafen Injektionen in die afferenten Blutgefäße von Organen. In der Leber ist die hepatische Vene ein efferentes Blutgefäß, da sie normalerweise Blut von der Leber weg hin zur unteren Hohlvene transportiert. Ebenso sind die Pfortader und die hepatischen Arterien in der Leber in Bezug auf die Leber afferente Blutgefäße, da sie normalerweise Blut zur Leber transportieren.
• Diese Experimentenreihe wurde entworfen, um zu bestimmen, ob die Plasmid-DNA effizient exprimiert werden könnte, wenn sie durch einen retrograden Weg in die efferenten Gefäße der Leber (d. h. der hepatischen Vene) geliefert wird.
• Da pCILuc, ein anderer Luciferase-Expressionsvektor, verwendet wurde, wurden die mit den hepatischen Venen-Injektionen erhaltenen Ergebnisse direkt mit Ergebnissen verglichen, die die obige Technik zur Injektion in die Pfortader verwenden.
• Methoden:
• 100 μg pCILuc in 1 ml normaler Salzlösung plus 15% Mannitol und 2,5 Einheiten Heparin/ml wurden über 30 Sekunden über die untere Hohlvene in die hepatische Vene injiziert. Da es bei Nagetieren schwierig war, direkt in die hepatische Vene zu injizieren, wurden die Injektionen in die untere Hohlvene geleitet, die an zwei Stellen abgeklemmt wurde: Proximal und distal (d. h. stromabwärts und stromaufwärts) zum Eintritt der hepatischen Vene in die untere Hohlvene. Speziell die Klemme stromabwärts der unteren Hohlvene wurde zwischen dem Zwerchfell und dem Eintrittspunkt der hepatischen Vene platziert. Die Klammer stromaufwärts der unteren Hohlvene wurde genau stromabwärts des Eintrittspunkts der Nierenvene platziert. Daher tritt der 1 ml des Injektionsfluids in die hepatische Vene und die Leber ein. Da die Venen anderer Organe, wie die Nierenvenen, an dieser Stelle in die untere Hohlvene eintreten, geht nicht alles der 1 ml Injektionsfluids in die Leber.
• Bei einigen der Tiere, die die retrograden Injektionen in die untere Hohlvene erhielten, wurde die hepatische Arterie, die Mesenterialarterie und die Pfortader für etwa fünf Minuten sofort vor und dann nach den Injektionen abgeklemmt (okkludiert). Insbesondere die Reihenfolge der Platzierung der Klammern war wie folgt: Zuerst an der hepatischen Arterie, dann an der Pfortader, dann stromabwärts der Hohlvene und dann stromaufwärts der Hohlvene. Es dauert etwa drei Minuten, um all diese Klammern zu platzieren, und dann wurden die Injektionen ausgeführt. Die Klammern wurden für zusätzliche zwei Minuten ab der Zeit, bei der die letzte Klammer (stromaufwärts der Hohlvenen-Klammer) platziert wurde, am Platz gelassen.
• Die intraportalen Injektionen wurden, wie dargelegt, unter Verwendung optimaler intraportaler Injektionen über 30 Sekunden mit 100 μg pCILuc in 1 ml normaler Salzlösung plus 15% Mannitol und 2,5 Einheiten Heparin/ml und bei für 2 Minuten abgeklemmter hepatischer Vene durchgeführt.
• Einige der Mäuse erhielten auch täglich subkutane Injektionen von 1 mg/kg Dexamethason (Elkins-Sinn, Cherry Hill, NJ), die einen Tag vor der Operation begannen.
• Das pCILuc-Plasmid exprimiert von dem CMV-Promoter eine zytoplasmatische Luciferase. Es wurde durch Insertieren der zytoplasmatischen-Luciferase-cDNA in den pCI (Promega Corp., Madison, WI)-CMV-Expressionsvektor erstellt. Insbesondere wurde aus pSPLuc (Promega Corp.) ein NheI/EcoRI-Restriktionsverdauungsfragment, das die zytoplasmatische Luciferase-cDNA enthielt, erhalten und unter Verwendung herkömmlicher rekombinanter DNA-Techniken in pCI-Plasmid-DNA, die mit NheI und EcoRI verdaut wurde, insertiert (Sambrook, J., Fritsch, E.F. und Maniatis, T. (1989) in: Molecular Cloning Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).
• Zwei Tage nach den Injektionen wurde die Luciferase-Aktivität in sechs Leberabschnitten wie oben gemessen, die aus zwei Teilen des medialen Lappens, zwei Teilen des linkslateralen Lappens, dem rechtslateralen Lappen und dem kaudalen Lappen plus einem kleinen Teil des rechtslateralen Lappens bestanden.
• Ergebnisse:
• A. Injektionen in die untere Hohlvene/hepatische Vene bei abgeklemmter Pfortader und hepatischer Arterie (*Injektionen in Tier #3 waren nicht optimal, da das Fluid während der Injektionen leckte). Die Injektionen wurden bei 6 Wochen alten Tieren ausgeführt, die Dexamethason erhielten.

  Abschnitte	Luciferase Aktivität [ng]
  	Tier #1	Tier #2	Tier #3*
  1	5.576,7	4.326,4	1.527,4
  2	8.511,4	4.604,2	1.531,6
  3	5.991,3	5.566,1	2.121,5
  4	6.530,4	9.349,8	1.806,3
  5	8.977,2	4.260,1	484,2
  6	9.668,6	6.100,2	1.139,3
  Leber-Gesamtmenge	45.255,5	34.206,9	8.610,4
  Mittelwert	29.357,6
  Standardabweichung	18.797,7

  B. Injektionen in die untere Hohlvene/hepatische Vene, bei denen die Pfortader und die hepatische Arterie nicht abgeklemmt sind. Die Injektionen wurden bei 6 Wochen alten Tieren durchgeführt, die kein Dexamethason erhielten.

  Abschnitte	Luciferase Tier #1	Aktivität [ng] Tier #2
  1	360,6	506,2
  2	413,5	724,7
  3	463,0	626,0
  4	515,5	758,6
  5	351,6	664,8
  6	437,8	749,6
  Leber-Gesamtmenge	2.542,0	4.029,8
  Mittelwert	3.285,9
  Standardabweichung	1.052,1

  C. Pfortader-Injektionen bei abgeklemmter hepatischer Vene bei 6 Monate alten Mäusen, die Dexamethason erhielten.

  Abschnitte	Luciferase Aktivität [ng]
  	Tier #1	Tier #2	Tier #3
  1	287,4	417,0	129,2
  2	633,7	808,1	220,5
  3	689,8	1.096,5	328,2
  4	957,8	1.056,9	181,6
  5	660,7	1.487,4	178,6
  6	812,4	1.276,4	233,4
  Leber-Gesamtmenge	4.041,8	6.142,2	1.271,5
  Mittelwert	3.818,5
  Standardabweichung	2.443,0

  D. Pfortader-Injektionen bei abgeklemmter hepatischer Vene bei 6 Wochen alten Mäusen, die Dexamethason erhielten.

  Abschnitte	Luciferase Aktivität [ng]
  	Tier #1	Tier #2	Tier #3
  1	352,9	379,1	87,0
  2	667,5	373,9	108,2
  3	424,8	1.277,9	178,4
  4	496,3	1.308,6	111,9
  5	375,2	296,4	162,3
  6	434,7	628,7	123,0
  Leber-Gesamtmenge	2.751,4	4.264,7	770,9
  Mittelwert	2.595,7
  Standardabweichung	1.752,1

  E. Übersichtstabelle, die die unter Verwendung der obigen Bedingungen erhaltene Luciferase-Expression vergleicht.

  Injektionsbedingung @	Durchschnittliche Gesamtmenge Luciferase/Leber [μg/Leber]	Zeiten Bedingung D
  Bedingung A	29,4	11,3 X
  Bedingung B	3,3	1,27 X
  Bedingung C	3,8	1,46 X
  Bedingung D	2,6	1,00 X

• Bedingung A = Injektionen in die untere Hohlvene/hepatische Vene bei abgeklemmter Pfortader und hepatischer Vene bei 6 Wochen alten Tieren, die Dexamethason erhielten.
• Bedingung B = Injektionen in die untere Hohlvene/hepatische Vene bei nicht abgeklemmter Pfortader und hepatischer Arterie bei 6 Wochen alten Tieren, die kein Dexamethason erhielten.
• Bedingung C = Pfortader-Injektionen bei abgeklemmter hepatischer Vene in 24 Wochen alten Mäusen, die Dexamethason erhielten.
• Bedingung D = Pfortader-Injektionen bei abgeklemmter hepatischer Vene bei 6 Wochen alten Mäusen, die Dexamethason erhielten.
• Schlussfolgerungen:
• 1. Retrograde Lieferung von Plasmid-DNA in die efferenten Gefäße der Leber über die hepatische Vene/untere Hohlvene führt zu hohen Konzentrationen an Genexpression.
• 2. Die höchsten Konzentration wurden unter Verwendung dieses retrograden Ansatzes erreicht, wenn die zur Leber afferenten Gefäße (Pfortader und hepatische Arterie) okkludiert wurden.
• 3. Das CILuc-Plasmid ermöglichte unter Verwendung des Pfortader-Ansatzes sowohl bei 6 Wochen alten als auch bei 6-Monate alten Mäusen viel höhere Konzentrationen an Luciferase-Expression als das pBS.CMVLux-Plasmid (siehe obige Beispiele).
• 4. Unter allen Bedingungen war die Luciferase-Expression über alle sechs Leber-Abschnitte gleichmäßig verteilt.
• Beispiel 10
• Tiere, die Injektionen in die untere Hohlvene erhielten, wurden bezüglich Luciferase untersucht, um zu bestimmen, ob retrograde Lieferung in die efferenten Gefäße (Venen) anderer Organe Genexpression ermöglicht.
• Methoden:
• Bei denselben Tieren, denen unter Verwendung der obigen Bedingung A injiziert wurde (Injektionen in die untere Hohlvene/hepatische Vene bei abgeklemmter Pfortader und hepatischer Arterie bei 6 Wochen alten Tieren, die Dexamethason erhielten), wurden die Nieren entfernt und wie oben beschrieben bezüglich Luciferase untersucht.
• Bei denselben Tieren, denen unter obiger Bedingung B injiziert wurde (Injektionen in die untere Hohlvene/hepatische Vene bei NICHT abgeklemmter Pfortader und hepatischer Arterie bei 6 Wochen alten Tieren, die kein Dexamethason erhielten), wurden die Nebennierendrüse und der Zwerchfellmuskel, die Abdomenmuskeln und Rückenmuskeln zur Luciferase-Analyse entfernt.
• Ergebnisse
• A. Luciferase-Aktivität in Nieren bei Tieren, denen unter Bedingung A injiziert wurde

  Gesamtmenge	Luciferase-Aktivität/ Niere [pg/Niere]
  Tier #1	Tier #2	Tier #3*
  Rechte Niere 10.827,8	7.662,3	636,3
  Linke Niere 733,1	753,8	479,7
  *Injektionsfluid leckte

  B. Luciferase-Aktivität in Nebennieren und verschiedenen Muskeln, denen unter Bedingung B injiziert wurde.

  	Gesamtmenge Luciferase-Aktivität/ Gewebe [pg/Gewebe]
  	Tier #7	Tier #8	Tier #9
  Rechte Nebenniere	Nicht untersucht	82,0	49,9
  Linke Nebenniere	Nicht untersucht	48,4	42,2
  Zwerchfell	41,9	67,9	117,6
  Abdomen	40,4	43,9	44,0
  Rücken	37,7	40,1	40,9

• Schlussfolgerungen:
• 1. Retrograde Lieferung von Plasmid-DNA in die efferenten Gefäße verschiedener unterschiedlicher Gewebe führte zu erheblichen Konzentrationen an Fremdgen-Expression in den Geweben.
• 2. Diese Gewebe schließen die Nebennierendrüsen (suprarenale Drüsen), den Zwerchfellmuskel, Rückenmuskeln und Abdomenmuskeln ein.
• 3. Fremdgen-Expression im Zwerchfell würde für Duchennes Muskeldystrophie besonders nützlich sein, da Menschen mit dieser Krankheit an Atemversagen aufgrund von Fibrose der Zwerchfellmuskeln sterben.
• Beispiel 11
• Dieses Beispiel untersucht die Verwendung zugänglicherer Gefäße, wie der hepatischen Vene und des Gallengangs, um die nackte pDNA in Mäuse zu liefern. Unter Verwendung dieser efferenten Lieferwege wurde effiziente Genexpression erhalten. Die Okklusion anderer Gefäße, um den Abfluß der Injektionslösungen einzuschränken, verbesserte sich, war aber bezüglich effizienter Expression nicht kritisch. Es wurden auch wiederholte Injektionen in den Gallengang zustande gebracht. Vorläufige Ergebnisse werden auch bei größeren Tieren, wie Ratte und Hund gezeigt. Die Einbeziehung dieser Befunde in Labor- und Klinikprotokolle wird diskutiert.
• Materialien und Methoden:
• Plasmid-Konstrukte:
• Das pCILuc-Plasmid exprimiert eine zytoplasmatische Luciferase von dem unverzüglich frühen menschlichen CMV-Promoter (hCMV ID). Es wurde durch Insertieren des luc-Gens, einem Nhe I-EcoR I luc-Fragment von pSLuc (Promega, Madison, Wi) in den pCI-Expressionsvektor (Promega) errichtet. pCILux exprimiert unter Kontrolle des hCMV IE-Promoters peroxisomale Luciferase. Es wurde durch Insertieren des Luciferasegens (RindIII – BamHI Fragment von pBlueCMVLux) in die SmaI Stelle von pCI errichtet. pCILacz wurde durch Platzieren des E. coli LacZ-Gens (PstI – ApaI Fragment pBS-RSV-LacZ) in den pCI-Vektor (SmaI Stelle) errichtet. Das pCMVGH-Konstrukt wurde früher beschrieben (Andree, et al., 1994).
• Injektionsmethoden:
• Plasmid-Lieferung in die hepatischen Gefäße wurde bei 6 Wochen alten ICR-Mäusen, bei 2,5–6,25 Monate alten 200-300g-Sprague-Dawley-Ratten und bei Beagle-Hunden durchgeführt. Es wurden ventrale Mittellinienschnitte durchgeführt, um die Leber und die verknüpften Gefäße freizulegen. Die Mäuse wurden mit intramuskulären Injektionen von 1000 μg Ketamin-HCl (Parke-Davis, Morris Plains, NJ) und Methoxyfluran (Pitman-Moore, Mudelein, IL) anästhesiert, das je nach Bedarf durch Inhalation verabreicht wurde. Die Ratten wurden mit Äther anästhesiert und die Hunde wurden mit Halothan durch Inhalation anästhesiert. Die pDNA wurde in Lösungen injiziert, die 2,5 Einheiten/ml oder Heparin (Lypho-Med, Inc., Chicago, IL) (Quian et al., 1991) und entweder normale Salzlösung (0,9% NaCl) oder 15% Mannitol in normaler Salzlösung (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) enthielten. Alle Tiere erhielten menschliche Pflege gemäß den institutionellen (IACUC) Richtlinien.
• Bei Mäusen wurden die intraportalen Injektionen wie früher beschrieben (Budker, et al., 1996) durchgeführt. 100 μg pDNA in 1 ml wurden über –30 Sek. unter Verwendung einer 30-Dicke, 1/2-Inch Nadel und 1 ml Spritze manuell injiziert, ohne die Pfortader stromaufwärts vom Injektionspunkt zu okkludieren. Bei einigen Tieren wurde während der Injektion an der Verbindungsstelle der hepatischen Vene und der kaudalen Hohlvene ein 5 × 1 mm Kleinert-Kutz Mikrogefäß-Clip (Edward Week, Inc., Research Triangle Park, NC) appliziert.
• Bei Mäusen wurde DNA über eine okkludierte IVC zur hepatischen Vene geliefert. Klammern (6 × 1 mm, gekrümmte Kleinert-Kutz-Mikrogefäß-Clips (Edward Week, Inc., Research Triangle Park, NC) wurden stromabwärts (zum Herz hin) der hepatischen Vene und stromaufwärts (zu den Beinen hin) der hepatischen- und Nieren-Venen appliziert. Injektionen wurden stromaufwärts der hepatischen Vene durchgeführt. Bei einigen der Injektionen wurden die Pfortader und die hepatische Arterie unter Verwendung von 6 × 1 mm gekrümmten Kleinert-Kutz-Mikrogefäß-Clips abgeklemmt. Die IVC-Mausinjektionen wurden ebenfalls mit 100 μg pDNA in 1 ml durchgeführt, die über –30 Sek. mit einer 30-Dicke, 1/2 Inch Nadel und 1 ml Spritze manuell injiziert wurden.
• Bei Mäusen wurden die Gallengang-Injektionen unter Verwendung manueller Injektionen mit einer 30-Dicke, 1/2-Inch Nadel und 1 ml Spritze durchgeführt. Ein 5 × 1 mm Kleinert-Kutz Mikrogefäß-Clip wurde verwendet, um den Gallengang stromabwärts vom Injektionspunkt zu okkludieren, um einen Fluß in den Zwölffingerdarm und weg von der Leber zu verhindern. Der Gallenblasen-Einlaß wurde nicht okkludiert. Bei einigen der Gallengang-Injektionen wurde die Verbindungsstelle der hepatischen Vene und der kaudalen Hohlvene wie oben abgeklemmt. Bei noch weiteren Injektionen wurden die Pfortader und die hepatische Arterie zusätzlich zur Okklusion der hepatischen Vene abgeklemmt.
• Bei Mäusen wurden wiederholte Injektionen in den Gallengang durch Platzieren eines Polyethylenschlauch-Katheters (I.D. 0,28 mm, O.D. 0,61 mm; Intramedic Clay Adams Brand, Becton Dickinson Co., Sparks. MD, USA) in den Gallengang durchgeführt, nachdem mit einer 27-Dicke Nadel ein Loch gemacht wurde. Die Schlauchleitung wurde durch eine Naht um den Gallengang und die Schlauchleitung gesichert; wodurch der Gallengang okkludiert wurde. Das andere Ende der Schlauchleitung wurde außerhalb der Haut des Tierrückens platziert, so dass für Wiederholungsinjektionen keine Operation nötig war. Für diese sich wiederholenden Verabreichungen wurden keine Blutgefäßokklusionen durchgeführt. Nach Vollendung der Untersuchungen deutete eine anatomische Untersuchung darauf hin, dass der Katheter im Gallengang verblieb.
• Bei Ratten wurden die intraportalen IVC- und Gallengang-Injektionen wie bei Mäusen durchgeführt, aber mit den folgenden Modifikationen. Die Injektionen wurden über eine 25-g Schmetterlingsnadel unter Verwendung einer peristaltischen Pumpe(Preston varistaltic power pump. Manostat Corp., New York, NY) über 1 oder 3 Minuten durchgeführt. Bei den IVC-Injektionen wurden die stromabwärts befindlichen IVC-Klammern stromabwärts der Nieren durchgeführt. Für die Pfortaderinjektionen wurden die Pfortader und die hepatische Arterie abgeklemmt. Bei einigen Tieren wurde der Abfluß durch die hepatische Vene durch Abklemmen der stromaufwärts und stromabwärts befindlichen IVC begrenzt. Bei einigen Tieren wurden die Lebern vor der DNA-Injektion mit normaler Salzlösung gespült. Rattengallengang-Injektionen wurden wie bei Mäusen durchgeführt. Die Ratte besitzt keine Gallenblase.
• Bei einigen der Ratten-Pfortader-Injektionen wurde eine mit einem Druckmeßgerät (Gilson Medical Electronics, Model ICT-11 Unigraph) verbundene 25 G Nadel in das Leber-Parenchym eingebracht, um während den Injektionen den Maximaldruck innerhalb der Leber zu bestimmen. Die statistische Beziehung zwischen Druck und Luciferase wurde unter Verwendung der Spearmans Rangkorrelation durchgeführt. Ein glättendes Spline-Regressionsmodell, das die Beziehung zwischen log Luciferase und Druck beschreibt, wurde unter Verwendung einer Methode mit generalisiertem additiven Modell (Hastie, 1992) abgeschätzt. Akaikes Informationskriterium (Akaike, 1973) deutete darauf hin, dass ein glättender Spline mit 2 Freiheitsgraden zum besten Fit über alle ganzzahligen Freiheitsgrade zwischen 0 und 5 führt.
• Bei Hunden wurden die Injektionen wie bei Ratten ausgeführt, außer dass ein 18-Dicke, 2-Inch Angiokatheter (Becton Dickinson, San Jose, CA) verwendet wurde. Alle Hunde außer Hund #1 waren Weibchen. Tabelle I gibt die Injektionsbedingungen an. Für die Gallenganginjektionen wurde eine Naht appliziert, um den Gallengang stromabwärts vom Injektionspunkt zu okkludieren. Während der Injektion wurde eine DeBakey-Vielzweck-Vaskulärklammer am Gallenblasengang appliziert, um das Injektat am Eindringen in die Gallenblase zu hindern. Bei Hunden war die DNA pCILux.
• Protein-Assays:
• Die Luciferase-Assays wurden wie früher berichtet (Wolff, et al., 1990) durchgeführt. Die Tiere wurden einen Tag nach den pCILuc-Injektionen getötet und die Nagerlebern wurden in sechs Abschnitte aufgeteilt, die aus dem rechtslateralen Lappen, dem kaudalen Lappen, den zwei Teilen des medialen Lappens und zwei Teilen des linkslateralen Lappens bestehen. Für jedes der sechs Teile wurde für Mäuse 0,7 ml Lysis-Puffer (0,1% Triton X-100, 0,1 M Kaliumphosphat, 1 mM DTF pH 7,8) verwendet, und für Rattenleber wurde vier ml Lysis-Puffer verwendet. Für die Hundelebern wurde etwa 10% jedes Lappens in fünf bis 20 Teile aufgeteilt und in zwei ml Lysis-Puffer gelegt. Die Proben wurden unter Verwendung eines PRO 200 Homogenisators (PRO Scientific Inc., Monroe, CT) homogenisiert und bei 4°C 10 min bei 4°C bei 4.000 U/min zentrifugiert. Zwanzig μl des Überstands wurden bezüglich der Luciferase-Aktivität analysiert. Relative Lichteinheiten (RLU) wurden unter Verwendung eines Standards von den Analytic Luminescence Laboratories (ALL, San Diego, CA) in pg Luciferase umgerechnet. Luciferase Protein (pg) = 5,1 × 10^–5 × RLU + 3 683 (r² = 0,992) in pg Luciferase umgerechnet.
• Zehn um dicke Gewebeschnitte wurden bezüglich β-Galactosidase-Expression wie früher beschrieben unter Verwendung von 1–4 Stunden X-GAL-Inkubationen (Budker, et al., 1996) gefärbt. Für das Gegenfärben wurde Hämatoxilin verwendet, aber der alkalische Schritt wurde weggelassen, so dass die Hämatoxilinfarbe rot blieb. Die Prozentzahl an blaugefärbten Zellen in den Leberschnitten wurde durch Zählen von –3000 Zellen in drei Abschnitten und Mitteln ermittelt.
• Blut, das vom retroorbitalen Sinus erhalten wurde, wurde bezüglich der Serumkonzentration an hGH unter Verwendung des RIA, HGH-TGES 100T Kits vom Nichols Institute (San Juan Capistrano, CA) analysiert. Die Serum-ALT und -GGT-Konzentrationen wurden unter Verwendung von EKTACHEM DT Objektträgern und eines KODAK EKTACHEM DT 60 ANALYZER, wie vom Hersteller (Kodak, Rochester, NY) empfohlen, ausgeführt.
• Luciferase-Experimente bei Mäusen:
• Unsere vorigen Studien verwendeten das pBS.CMVLux-Plasmid zum Evaluieren der optimalen Bedingungen für die Nackt-pDNA- Expression nach intraportaler Injektion. Diese optimalen Bedingungen waren intraportale Injektionen von 100 μg pDNA in 1 ml 15% Mannitol und 2,5 Einheiten Heparin/ml in normaler Salzlösung. Die Injektionen wurden über 30 Sekunden bei okkludierter hepatischer Vene und IVC durchgeführt. In dieser Untersuchung erzielten unter gleichen Bedingungen injizierte 100 μg pCILuc eine durchschnittliche Gesamtmenge an Luciferase Protein/Leber von 3,73 μg/Leber (1A, Pv + CL), etwa 30-mal größer als die mit pBS.CMVLux erhaltene. Ein Teil dieses Anstiegs könnte auf größere Anwendererfahrung bei diesen Injektionstechniken zurückzuführen sein. Injektionen mit pCILuc unter diesen Bedingungen ohne Abklemmen der hepatischen Vene erzielten etwa 750-mal weniger Luciferase (1A, PV-CL).
• Den hepatischen Venen (über die IVC) einer anderen Reihe von Mäusen wurden 100 μg pCILuc in 1 ml 15% Mannitol und 2,5 Einheiten Heparin/ml in normaler Salzlösung injiziert. Wenn die Pfortader abgeklemmt wurde, wurde eine durchschnittliche Gesamtmenge an Luciferase-Protein/Leber von 17,34 μg/Leber (1A, IVC + CL) im Vergleich zu einer durchschnittlichen Gesamtmenge an Luciferase-Protein/Leber von 2,83 μg/Leber (1A, IVC – CL) ohne Abklemmen der Pfortader erhalten.
• Ähnliche Ergebnisse wurden ebenfalls erhalten, wenn den Gallengängen 100 μg pCILuc in 1 ml 15% Mannitol und 2,5 Einheiten Heparin/ml in normaler Salzlösung injiziert wurden. Im Vergleich zu einer durchschnittlichen Gesamtmenge an Luciferase-Protein/Leber von 1,33 μg/Leber (1A, BD – CL) ohne Abklemmen der hepatischen Vene wurde bei abgeklemmter hepatischer Vene eine durchschnittliche Gesamtzahl an Luciferase-Protein/Leber von 15,39 μg/Leber (1A, BD + CL) erhalten. Wenn Mannitol weggelassen wurde, dann erzielten die Gallengang-Injektionen ohne Abklemmen irgendwelcher Blutgefäße etwa 15-mal weniger Luciferase (0,086 μg/Leber ± 0,06, n = 25). Das Abklemmen der hepatischen Arterie und der Pfortader zusätzlich zur hepatischen Vene verbesserte die Expression nicht über das hinaus, was erhalten wurde, wenn nur die hepatische Vene abgeklemmt wurde (keine Daten gezeigt).
• An Mäusen wurden Serum-ALT und -GGT-Assays einen und acht Tage nach jeder der obigen Injektionen mit PCILuc durchgeführt (4 Mäuse für jede Bedingung). Nach jedweder Injektion, die die Gallengang-Injektionen einschlossen, wurden keine Erhöhungen bezüglich GOT beobachtet. Einen Tag nach Pfortadern- und Gallengang-Injektionen erhöhten sich die Serum-ALT-Konzentrationen auf 200–400 U/L. Einen Tag nach den IVC-Injektionen erhöhten sich die Serum-ALT Konzentrationen bei der Hälfte der Mäuse auf –1500 U/L, betrugen aber bei der anderen Hälfte nur –250 U/L. Bei allen Tieren sanken die Serum-ALT Konzentrationen bis acht Tage nach Injektion auf Basislinien-Konzentration. Zu positiven Kontrollzwecken wurde eine nicht-letale intraperitoneale Injektion von 40 μl 50% Kohlenstofftetrachlorid in Mineralöl durchgeführt. Einen Tag nach der Injektion wurde ein Durchschnittswert von 25.900 U/L (n = 4) beobachtet.
• Luciferase-Experimente bei Ratte und Hund:
• Bei Ratten wurden gleiche Injektionen in die Pfortader, IVC (zur hepatischen Vene) und Gallengang durchgeführt (1B). Für die Pfortaderinjektionen wurden die Injektionsvolumina 15-fach über den in Mäusen verwendeten erhöht, weil die Rattenlebern ~15-fach größer sind als Mäuselebern. Einen Tag danach wurden 750 μg pCILuc in 15 ml 15% Mannitol und 2,5 Einheiten Heparin/ml in normaler Salzlösung bei abgeklemmter hepatischer Vene in die Pfortader injiziert und es wurde ein Durchschnittswert von 53,5 μg Luciferase/Leber erhalten (1B, PV + CL). Die Effizienz des Gentransfers bei der Ratte wurde mit der bei Mäusen auf zwei Arten verglichen: In Bezug auf die durch die mg Luciferase pro mg Gewebegewicht definierte Effizienz betrugen die Konzentrationen der Expression für portale Injektionen 3,6 μg Luciferase/g Gewebe bei Ratten im Vergleich zu 3,7 μg Luciferase/g Gewebe bei Mäusen. Alternativ betrugen die Wirksamkeiten der Expression, im Sinne der durch ng Luciferase pro μg gelieferter pDNA definierten Effizienz, für portale Injektionen 71 ng Luciferase/μg DNA in Ratten verglichen mit 37 ng Luciferase/μg DNA in Mäusen.
• Weniger, aber immer noch erhebliche Luciferase-Expression wurde erhalten, wenn die Injektionen von pCILuc in den efferenten Gefäßen von Ratten, wie der IVC, oder dem Gallengang durchgeführt wurden (1B). Injektionen von 750 μg PCILuc in 15 ml in die hepatische Vene (über die IVC), während die Pfortader okkludiert wurde, erzielte einen Durchschnittswert von 1,5 μg Luciferase/Leber. Injektionen von 750 μg pCILuc in 5 bis 8 ml in den Gallengang ohne irgendeine Abfluß-Obstipation erzielte einen Durchschnittswert von 1,3 μg Luciferase/Leber.
• In 23 Rattenlebern wurden während der Injektion von 750 μg pCILuc in 15 oder 20 ml in die Pfortader bei Okklusion der IVC parenchymale Drücke von 12–50 mm Hg gemessen (2). Die Spearmans Rangkorrelation zwischen Druck und Luciferase-Expression betrug 0,76 (zweiseitiger p-Wert < 0,001), was darauf hindeutet, dass der Druck und die Luciferase signifikant positiv verknüpft waren. Es schien, dass Drücke von über 40 mm Hg nicht zu erhöhter Expression führten. Die Notwendigkeit der nichtlinearen Komponente zusätzlich zu einem einfachen linearen Fit wurde durch eine volle Näherung gegenüber dem reduzierten F-Test (p-Wert = 0,014) verifiziert, was darauf hindeutet, dass der beobachtete Plateaueffekt echt ist. Die Untersuchung der Auftragung von sowohl dem verbleibenden Quantil-Quantil als auch dem Restwert gegen die Vorhersage zeigt außerdem, dass es keine ernsthaften Verstöße gegen die Regressionsmodell-Annahmen gibt, und daher sind die Regressionsmodelle und p-Werte gültig (Fisher und van Belle, 1993).
• Vorläufige Experimente untersuchten die Fähigkeiten der nackten pCILux (nicht pCILuc), bei Hunden exprimiert zu werden (Tabelle I). Bei Mäusen stellte pCILux im Fall der intraportalen Injektion 3x geringere Expression als pCILuc bereit (Daten nicht gezeigt). Bei fünf Hunden wurden verschiedene Mengen an DNA in, den Gallengang entweder mit oder ohne Blockierung des Abflusses durch Okkludieren der IVC injiziert. Bei einem Tier wurde die DNA ohne irgendeine Abfluß-Blockierung in die IVC injiziert. Alle Hunde überlebten die Vorgehensweise, außer dass Tiere, die die abgeklemmte IVC hatten, postoperativ langsamer genasen. Die Tiere wurden einen Tag nach den Injektionen getötet und Dutzende von Gewebeproben aus jedem Leberlappen wurden bezüglich Luciferase analysiert. Die Luciferase-Expression war über alle Lappen in jeder Leber gleichmäßig verteilt, außer in einem Lappen von einem Hund. Eine histologische Routineanalyse bei Hund #5 (Tabelle I) deutete darauf hin, dass der Gewebeaufbau erheblich zerstört war, was darauf hinweist, dass die Injektionsvolumina zu groß waren.
• Das Verringern des Injektionsvolumens bei Hund #6 auf 200 ml führte zur besten Expression (Tabelle I).
• β-Galactosidase-Ergebnisse bei Mäusen und Ratten:
• Der β-Galactosidase-Expressionsvektor wurde verwendet, um den Prozentsatz und die Art der Zellen zu ermitteln, die transfiziert wurden (3). Wie früher für portale Veneninjektionen beobachtet (Budker, et al., 1996), schien die umfassende Mehr heit der blaugefärbten Zellen aus morphologischen Gründen Hepatozyten zu sein, aber wenige schienen Endothelzellen oder andere Zellarten zu sein. Nach den Gallengang- oder IVC-Injektionen bei Mäusen oder Ratten wurde ebenfalls eine Mehrheit an Hepatozyten blau gefärbt (3).
• Unter den verschiedenen Injektionsbedingungen entsprach die Prozentzahl an Zellen den Konzentrationen an Luciferase-Expressionen (1 und 3). Bei Mäusen ergaben die IVC-Injektionen die höchsten Prozentsätze an β-Galactosidase-positiven Zellen, wobei 7% der Hepatozyten positiv waren (3B). Bei Ratten ergaben die Pfortadern-Injektionen den höchsten Prozentsatz an β-Galactosidase-positiven Zellen, wobei 7% der Hepatozyten positiv waren (3C). In einigen Tieren betrug die Leberzellbeschädigung deutlich weniger als 5% der Zellen (zum Beispiel in 3A). Bei den Rattenlebern, denen in die Pfortader injiziert wurde, ist von Bedeutung, dass fast alle der positiv-gefärbten Zellen periazinär waren, mit wenigen positiven Zellen um die Zentralvene herum (3C).
• Wiederholte Gallengang-Injektionen:
• Die Gallengänge von Mäusen wurden kanüliert und einmal pro Woche wurde 100 μg pCMVhGH in 1 ml 15% Mannitol in normaler Salzlösung injiziert (4). Die Serum-Konzentrationen an hGH erhöhten sich einen Tag nach der schnellen Injektion und verringerten sich dann bis sieben Tage nach der Injektion auf Hintergrundkonzentrationen. Einen Tag nach der zweiten Injektion stiegen die hGH-Konzentrationen erneut an und gingen dann bis sieben Tage nach der zweiten Injektion auf Hintergrundkonzentrationen zurück. Nach der dritten Injektion kamen nur minimale Erhöhungen an hGH-Konzentrationen vor. Mäuse, die nach der ersten Injektion die höchsten Konzentrationen aufwiesen, wiesen nach der zweiten Injektion die geringsten Konzen trationen auf (Maus 3 und 6), und umgekehrt (Maus 1, 2 und 4). Bei einer anderen Reihe von Tieren (4 Mäuse) wurden die Gallengang-Injektionen mit pCMVhGH viermal wiederholt und dann wurde pCILuc injiziert. Die ersten drei pCMVhGH-Injektionen führten zu ähnlichen Erhöhungen bezüglich der hGH-Serumkonzentrationen wie in 4. Obwohl es nach der vierten Injektion nur geringe Erhöhungen an hGH-Serumkonzentrationen gab, erzielte die Injektion von pCILuc einen Durchschnittswert von 29,2 ng/Leber (± 7,1, n = 3). Die Leber in einer der vier Mäuse war extrem gelb und vernarbte infolge des Gallengang-Abbindens und exprimierte keine Luciferase.
• Diskussion:
• Dieser Bericht erweitert die Befunde der früheren Untersuchung, die nach afferenter intraportaler Lieferung pDNA-Expressionen zeigten, und zeigt nach der Lieferung über efferente Gefäße, wie der hepatischen Vene oder dem Gallengang, effiziente Plasmid-Expression. Wenn in eines der drei Gefäße injiziert wurde, war die Expression von Luciferase oder β-Galactosidase gleichmäßig über die ganze Leber verteilt. Das Kombinieren dieser operativen Ansätze mit verbesserten Plasmidvektoren ermöglichte ungewöhnlich hohe Konzentrationen an Fremdgen-Expression, wobei bei Mäusen über 15 μg Luciferaseprotein/Leber und bei Ratten über 50 μg produziert wurde (1 und 2). Gleich hohe Konzentrationen an β-Galactosidase-Expression wurde erhalten, da 7% der Hepatozyten bei nur einer Stunde X-GAL Inkubation intensive blaue Färbung aufwiesen (2). Diese Konzentrationen an Fremdgen-Expression zählen zu den höchsten mit nicht-vitalen Vektoren erhaltenen Konzentrationen und nähern sich dem, was mit vitalen Vektoren erreicht werden kann.
• Beim Verwenden des Pfortadern-Administrationswegs ist die Okklusion des Abflusses für die Expression kritisch. Die Abfluß-Okklusion erhöht die Expression bei den efferenten Verabreichungswegen, jedoch wurden erhebliche Expressionsmengen erhalten, selbst wenn die hepatische Vene nicht blockiert war. Höchstwahrscheinlich stellt die natürliche Blutflussrichtung eine ausreichende Triebkraft bereit, um den Austritt von Injektionsfluid zu verzögern und den hydrostatischen Druck zu erhöhen. Die Verwendung dieser efferenten Gefäße vereinfacht die Verabreichung für potentielle menschliche Applikationen, da sie leichter durch nicht-invasive Methoden zu erreichen sind. Wenn keine Okklusion verwendet wird, dann muß nur ein Gefäß erreicht werden. Diese efferenten Wege sollten auch für die Verabreichung viraler und nicht-viraler Vektoren in Erwägung gezogen werden, wie es beim Liefern adenoviraler Vektoren im Gallengang getan wurde [Vrancken Peeters, et al., 1996b; Vrancken Peeters, et al., 1996a; Yang et al., 1993].
• Der Mechanismus der pDNA-Aufnahme ist nicht bekannt, könnte aber natürliche zelluläre Aufnahmeprozesse einschließen (Budker, et al., 1996). Es ist von Interesse, dass hohe Konzentrationen an Luciferase-Expression gelegentlich erhalten werden könnten, wenn die DNA in kleinen Volumina isotonischer Lösungen ohne Okkludieren der IVC in den Gallengang injiziert wurde. Erhöhter osmolarer und hydrostatischer Druck könnte für die Aufnahme der pDNA durch Hepatozyten nicht kritisch sein, da sie sich nicht in Muskelzellen befinden (Wolff, et al., 1990; Wolff, et al., 1991; Wolff, et al., 1992a). Dies würde darauf hinweisen, dass der Mechanismus der pDNA-Aufnahme in der Tat endogene zelluläre Bahnen einschließen könnte. Erhöhte hydrostatische und osmotische Drücke könnten die Expression durch Verbessern dieser zellulären Internalisierungsprozesse erhöhen (Haussinger, 1996). Beispielsweise stimuliert die Hepatozytenschrumpfung die Replikation des Enten-Hepatitis-B-Virus (Offensperger, et al., 1994).
• Die erhöhten Drücke könnten auch die Lieferung der pDNA zur Hepatozytenoberfläche erhöhen – nicht nur bei der Blutgefäß-Verabreichungen (über die sinusoiden Fenster) sondern auch bei den Gallengang-Injektionen. Die erhöhten Drücke könnten die Gallensekretion vorübergehend abschwächen und dabei die Beseitigung (Clearance) der pDNA verringern (Stieger, et al., 1994). Beispielsweise sollte das hyperosmolare Mannitol Zellschrumpfung induzieren, was dafür bekannt ist, die Taurocholin-Ausscheidung in der Galle zu inhibieren (Haussinger, et al., 1992).
• Hepatozyten sind funktionell polarisierte Zellen, in welchen die basalen und apikalen Membranen verschiedene exozytische, endozytische und transzytotische Funktionen aufweisen (Hubbard, et al., 1994). Dieser Erfolg bei entweder Blutgefäß- oder Gallengang-Wegen könnte darauf hindeuten, dass sowohl die basale (sinusförmige) als auch die apikale (Gallenkanal) Membran sich einen gemeinsamen Pfad für den zellulären Eintritt von pDNA teilen. Allerdings kann der Durchgang der DNA zwischen den basal-lateralen und Gallenkanal-Räumen selbst unter den behutsameren Injektionsbedingungen nicht ausgeschlossen werden. Die in den Gallengang injizierte Plasmid-DNA könnte von der basal-lateralen Oberfläche der Hepatozyten nach Durchgang panzellulärer aufgenommen werden. Wenn nur die basallaterale Oberfläche die pDNA aufnimmt, dann könnten die erhöhten hydrostatischen und osmotischen Drücke die pDNA-Expression durch Aufbrechen der festen Verbindungsstellen zwischen Hepatozyten verbessern und dabei den Fluß von pDNA zwischen den gangartigen und basal-lateralen Räumen erhöhen (Desmet und De Vos., 1982).
• Der Gallengang wurde kanülisiert, um zu bestimmen, ob wiederholte Injektionen durchgeführt werden könnten. Nach den ersten beiden Injektionen wurden erhebliche hGH-Konzentrationen erhalten (3). Bis eine Woche nach jeder Injektion fielen die hGH-Konzentrationen beträchtlich, vermutlich aufgrund einer Immunantwort auf das fremde Protein. Das Unvermögen, hGH nach den dritten oder vierten Injektionen zu detektieren, lag höchstwahrscheinlich an einer schnelleren Antwort der auf hGH sensibilisierten Immunantwort. Die Fähigkeit, danach Luziferasse-Expression zu erhalten, spricht gegen eine Immunantwort gegen die pDNA, die Expression verhindert. Frühere Studien haben es nicht vermocht, nach der Verabreichnung nackter pDNA Anti-DNA-Antikörper zu detektieren (Nabel, et al., 1992; Jiao, et al., 1992). Die Fähigkeit, wiederholt nackte pDNA zu verabreichen, ohne eine Immunantwort gegen den Vektor zu induzieren, ist ein deutlicher Vorteil von nackter pDNA gegenüber viralen Vektoren und einigen Arten von nicht-viralen Vektoren.
• Andere Studien, die in unserem Labor im Gange sind, deuten darauf hin, dass die Unterdrückung des Immunsystems anhaltendere Expression ermöglicht. Bei post-mitotischen Myofasern können die Plasmide extrachromosomal bestehen und für mindestens zwei Jahre exprimieren, vermutlich, weil die pDNA nicht infolge von Zellteilung verloren geht (Wolff, et al., 1992b; Herweijer, et al., 1995). In Hepatozyten, die bei Nagern und Menschen eine Halbwertszeit von bis zu einem Jahr aufweisen, würde die pDNA ziemlich wahrscheinlich langsam verloren gehen (Webber, et al., 1994; Leffert, et al., 1988). Wenn dem so ist, dann könnten leberbasierte genetische Krankheiten wie Hämophilie durch Injektionen alle sechs Monate behandelt werden. Der Gallengang könnte wiederholt durch obere gastrointestinale Endoskopie angesteuert werden. Gleichermaßen könnte die hepatische Vene über periphere oder zentrale Venen nichtinvasiv angesteuert werden. Zusätzlich könnte der Gentransfer an Neugeborene über die Nabelschnurgefäße geliefert werden, um diese über eine Neugeborenen-Stoffwechselkrise zu bringen, wie sie bei der organischen Acidunase und den Harnstoffzyklus-Defekten auftritt.
• Oft funktionieren Gentransfer-Techniken, die bei Mäusen funktionieren, nicht bei größeren Tieren. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Technik bei Ratten funktioniert, die etwa zehnmal größer als Mäuse sind. Die Hunde-Ergebnisse zeigen, dass die Leber großer Nicht-Nager-Säuger nackte pDNA exprimieren kann. Obwohl erhebliche Konzentrationen an Luciferaseaktivität erhalten wurden, wird weitere Optimierung der Injektionsbedingungen benötigt, um die Effizienz der Expression zu erhöhen, so dass sie mit denen bei Nagern vergleichbar sind. Die Untersuchungen zur Bestimmung der Beziehung zwischen intraparenchymalem Druck und Luciferase-Expression bei Ratten sind der erste Schritt zu diesem Ziel. Bei den Nagern trat ein minimaler Leberzellschaden auf – wie durch die Serum-Chemikalien und Histologie bewiesen –, aber die Injektionen waren gegenüber den Hepatozyten bei Hunden zerstörender. Vermutlich ist das effiziente Liefern der pDNA an die Hepatozyten-Oberfläche bei minimaler zellulärer oder Gewebe-Zerstörung der Schlüsselfaktor (2).
• Im Forschungslabor werden die beschriebenen Techniken ermöglichen, Nager genau so wie immortalisierte und primäre Leberzellkulturen zu verwenden, die jetzt für Gen- und zelluläre Untersuchungen von Leberfunktionen genutzt werden. Der Gentransfer in Zellen in Kulturen war ein entscheidend wichtiges Werkzeug für das Entschlüsseln der Genfunktionen und für das Untersuchen der Wirkung von exprimierten Proteinen auf zellu läre Prozesse. Üblicherweise wird das zu untersuchende Gen in einem Plasmid-Vektor platziert und vorübergehend in die geeignete Zellkultur transfiziert. Isoforme und Mutationsformen der zu untersuchenden Gene können schnell in Plasmidexpressionsvektoren platziert und untersucht werden. Unsere Befunde deuten darauf hin, dass ein ähnlicher, Plasmid-basierter Ansatz verwendet werden könnte, um die Wirkungen von Genfunktionen in Hepatozyten in situ zu untersuchen. Unter der Annahme, dass die hohen Konzentrationen an Expression in diesem System transient sind, dann wäre es das Beste, wenn diese Wirkungen innerhalb weniger Tage auftreten würden. Die Verwendung von pDNA vermeidet die arbeitsreichen Schritte, die zur Produktion vitaler Vektoren oder Bildung transgener Mäuse notwendig sind, und ermöglicht dabei viele verschiedene Gene und deren verwandte mutierte Formen schnell zu untersuchen. Es wird erlauben, Mechanismen der Genexpression und deren Wirkungen auf die Leberfunktion im Kontext eines vollständigen Säugerorganismus schnell zu untersuchen.
• Beispiel 12
• Auch die intravaskuläre Lieferung nackter pDNA an Muskelzellen hat ihren Reiz. Ein Muskel weist eine hohe Dichte an Kapillaren auf (Browning, 1996), und die Kapillaren stehen in engem Kontakt mit den Myofasern (Lee, 1995). Allerdings besteht das Endothel in Muskelkapillaren aus der kontinuierlichen, nicht-gefensterten Art und weist besonders gegenüber großen Makromolekülen eine niedrige Durchlässigkeit gegenüber einer gelösten Substanz auf (Taylor, A.E. und D.N. Granger, Exchange of macromolecules across the microcirculation. In: Handbook of Physiology. The Cardiovacular System. Microcirculation.; Bethesda, MD: Am. Physiol. Soc., 1984, sect. 2, vol. IV, chapt. 11, p. 467). Der Mechanismus von transendothelialen Makromolekül-Transporten ist noch wenig verstanden. Zellbiolo gen haben vorgeschlagen, dass dieser Transport bei Transzytose, die plasmalemmale Vesikel einschließt oder bei konvektivem Transport durch transiente transendotheliale Kanäle, die durch die Fusion von Vesikeln gebildet werden, auftritt (Michel C.C., Cardiovascular Res., 1996). Physiologen haben das Muskelendothel modelliert, da es eine große Anzahl kleiner Poren mit Radien von 4 nm und eine sehr geringe Anzahl großer Poren mit Radien von 20–30 nm aufweist (Rippe B., Physiological Rev., 1994). Obwohl der Gyrationsradius von 6 kb pDNA –100 nm beträgt (Fishman, D.M., Biopolymers, 38, 535–552), weist supergeknäuelte DNA in plektonemischer Form Superhelix-Abmessungen von etwa 10 nm auf (Rybenkov, V.V.J., Mol. Biol. 267, 299–311, 1997). Dies impliziert, dass pDNA eine Möglichkeit hat, die mikrovaskulären Wände durch Fadenziehen durch deren lange Poren zu durchqueren. Wir nahmen an, dass die Geschwindigkeit der pDNA-Extravasation durch Verbessern der Fluidkonvektion durch diese langen Poren durch Erhöhen des Druckunterschieds über die Wände in ausgewählten Bereichen erhöht werden könnte. Dieser Bericht zeigt, dass intravaskuläre pDNA-Injektionen unter hohem Druck in der Tat zu hohen Konzentrationen an Fremdgen-Expression in Muskeln über die ausgewählten Hinterläufe einer adulten Ratte führen kann.
• Hydrostatischer Druck
• 475 μg pCILux in normaler Salzlösung (NSS) wurde in die Oberschenkelarterien adulter Sprague-Dawley Ratten bei blockiertem Bluteinfluß- und -Abfluß injiziert. Die Injektion von pCILux, einem Luciferase-Expressionsvektor, der den CMV-Promoter (von HGT akzeptierter LEBER II-Promoter) verwendete, wurde ausgeführt, nachdem sowohl die Oberschenkelarterie als auch -vene für 10 min okkludiert wurden. Zwei Tage nach den pDNA-Injektionen wurden in allen Muskeln des Hinterlaufs die Luciferase- Aktivitäten gemessen (5). Die höchsten Konzentrationen an Luciferase-Expression wurden erreicht, wenn die pCILux in 9,5 ml normaler Salzlösung innerhalb 10 Sek. injiziert wurde. Injektionsvolumina von weniger als 9,5 ml führten zu erheblich geringeren Expressionen (5(a)). Injektionszeiten von mehr als 10 Sek. führten ebenfalls zu viel geringerer Expression (5(b)). Diese kritische Abhängigkeit vom Volumen und der Injektionsgeschwindigkeit deutet darauf hin, dass für effiziente Expression entweder erhöhter hydrostatischer Druck oder schneller Fluß benötigt wird. Arterieninjektionen, die ohne Okkludieren der Oberschenkelvene durchgeführt wurden, führten zu etwa 200-fach geringerer Expression (1,8 ± 1,2 ng Luciferase für alle Hinterlaufmuskeln).
• Andere Faktoren
• Es wurden weitere Untersuchungen durchgeführt, um die Wirkung von Ischämie auf die Expression der intravaskulär injizierten pCILux zu bestimmen. Die Ischämiezeit wurde durch Variieren der Zeit eingestellt, so dass sowohl die Oberschenkelarterie als auch -vene vor der pDNA-Injektion okkludiert wurden (5(c)). Obwohl die höchste Konzentration an Expression mit 10 min Ischämie erhalten wurde, waren die Expressions-Konzentrationen bei kürzeren oder längeren Ischämiezeiten nur geringfügig geringer. Dies legt nahe, dass Ischämie zum Ermöglichen des Austritts der pDNA aus dem intravaskulären Raum kein kritischer Faktor ist. Allerdings wurde der Blutfluß für den Null-Ischämiezeitpunkt für ~30 Sek. unterbrochen, und dies könnte ausreichend sein, um vaskuläre Durchlässigkeit zu bewirken. Ischämie könnte die Expression entweder durch kapillare Rekrutierung und Vasodilatation oder Verbessern der Durchlässigkeit erhöhen (Mathieu-Costello O., Int. J. Microcirc. 1995, 15, 231–237). Zusätzlich könnte Ischämie möglicherweise die pDNA-Expression durch Beeinflussen der Transkription oder der Translation erhöhen. Ischämie kann vom Muskel für 2 oder 3 Stunden toleriert werden (Gidlof A., Int. J. Microcirc. Clin. Exp., 1987, 7, 67–86). Die histologische Analyse des Muskels ließ keine Hämorrhagie oder Myofaserbeschädigung erkennen.
• Andere Faktoren wurden untersucht, um die Konzentration der Expression zu untersuchen. Hypotonische (6, Bedingung 2) oder hypertonische (6, Bedingung 3) Injektionslösungen führten zu weniger Expression. Obwohl die Wirkung der hypertonischen Injektionslösung (normale Salzlösung mit 15% Mannitol) durch die langsamere Injektionsgeschwindigkeit (über 30 Sek. anstatt von 10 Sek.), die von dessen erhöhter Viskosität herrührt, vermindert worden sein könnte. Die Vorinjektion mit Kollagenase führte zu einer 3,5-fachen Erhöhung auf 1.332 ng/Gesamtmuskeln (6, Bedingung 4). Die Kollagenase wurde verwendet, um die Basalmembran der Kapillaren zu zerstören und dabei den pDNA-Austritt zu erhöhen. Sie könnte die Expression auch durch Zerstören der extrazellulären Matrix im Muskel erhöht haben. Weitere Untersuchungen sind in Vorbereitung, um die optimalen Bedingungen für die Kollagenase-Verabreichung ohne Verursachen von Hämorrhagie zu bestimmen.
• Verteilung der Fremdgen-Expression
• Die Luciferase-Expression wurde unter allen Muskelgruppen im Bein verteilt (Tabelle 1). Die geringeren Konzentrationen im unteren Unterschenkel und Fuß liegen wahrscheinlich an deren hohem Gehalt an Sehnen und der geringen Menge an Muskeln. Die Konzentrationen nach intravaskulärer Injektion waren bis zu 40-mal höher als die Konzentrationen nach intramuskulärer Injektion.
• Die Art und der Prozentsatz der transfizierten Zellen im Muskel wurde unter Verwendung des β-Galactosidase-Reportersystems ermittelt. Unter Verwendung der besten Injektionsbedingung (Bedingung 4 in 6) exprimierten etwa 10–50% der Myofasern β-Galactosidase.
• Diese Expressionsergebnisse stellen den indirekten Beweis bereit, dass pDNA-Extravasatation auftrat. Ein noch direkterer Beweis wurde unter Verwendung von Fluoreszenz-markierter DNA erhalten, die in die Oberschenkelarterie injiziert wurde (Bedingung 1 in 6). Die markierte DNA wurde extravaskulär in alle Extremitäten-Muskeln verteilt und umgab das meiste der Myofasern (Daten nicht gezeigt).
• Schlußfolgerung
• Diese Ergebnisse zeigen, dass das intraarterielle Liefern von pDNA zum Muskel stark verbessert werden kann, wenn mit einem großen Volumen schnell injiziert wird und wenn alle Blutgefäße, die in und aus den Hinterläufen führen, okkludiert werden. Diese Bedingungen erhöhen vermutlich den intravaskulären hydrostatischen Druck und erhöhen dabei den konvektiven Abfluß, der die pDNA mit Myofasern in Kontakt bringt. Der hohe intravaskuläre Druck kann die Anzahl, Größe und Durchlässigkeit der mikrovaskulären Poren erhöhen (Rippe B., Acta Physiol. Scand., 125, 453–459, 1985) (Wolf M.B. Am. J. Physiol., 257, H2025–H2032, 1989). Vorläufige Untersuchungen unter Verwendung von Kollagenase legen nahe, dass die enzymatische Zerstörung der Gefäß-Basismembran oder der extrazellulären Muskelmatrix das Liefern der pDNA an die Myofasern ebenfalls erhöhen könnte. Ischämie erhöhte die Expression ebenfalls mäßig. Außerdem wird erwartet, dass andere Enzyme wie Hylaronidase ähnlich wie Kollagenase arbeiten werden.
• Die Untersuchung zeigt, dass der intravaskuläre Ansatz die Expression im Muskel im Vergleich zur intramuskulären Injektion bis zu 40-fach erhöht. Dies ist der erste Beweis, dass nackte Plasmid-DNA in Muskeln von adulten Tieren, die größer als Mäuse sind, effizient exprimiert werden kann. Dies ist ebenfalls der erste Bericht eines intravaskulären, nicht-viralen Gentransfer-Ansatzes für Muskeln. Weitere Untersuchungen bei größeren Tieren werden die klinische Relevanz dieser Untersuchung bestimmen.
• Beschreibung der Injektionen
• Bei 150–200 g adulten Sprague-Dawley-Ratten, die mit 80 mg/mg Ketamin und 40 mg/kg Xylazin anästhesiert wurden, wurde eine 4 cm lange abdominale Mittellinien-Ektomie durchgeführt. Mikrogefäß-Clips (Edward Weck, Inc., Research Triangle Park, NC) wurden am externen Iliakal, der kaudalen Bauchdeckenvene, dem internen Iliakal und den efferenten Gallenarterien und -venen platziert, um sowohl den Abfluß als auch den Einfluß des Bluts zum Bein zu blockieren. In die externe Iliakalarterie wurde eine 27 g-Schmetterlingsnadel eingebracht und die DNA-Lösung wurde per Hand injiziert. Tabelle 1. Verteilung der Luciferase-Expression unter den unterschiedlichen Hinterlauf-Muskelgruppen zwei Tage nach intraarterieller Injektion mit 475 μg pCILux in 9,5 ml NSS über 10. Für 6 Tiere werden Mittelwerte und deren Standardabweichungen gezeigt.

  Injektionsart	Muskelgruppe	Gesamtmenge Luciferase [ng]	Luciferasekonz. [ng/g Gewebe]
  Intravaskulär	Vorderer Ober-schenkel	149,1 ± 51,2	109,2 ± 37,5
  	Hinterer Ober-schenkel	74,6 ± 36,0	43,4 ± 20,9
  	Medialer Oberschenkel	88,7 ± 63,7	61,6 ± 44,5
  	Hinterer Unterschenkel	114,5 ± 89,7	66,0 ± 51,7
  	Vorderer Unterschenkel	3,0 ± 1,0	5,4 ± 1,7
  	Fuß	0,5 ± 0,2	4,1 ± 1,4
  Intramuskulär	Vorderer Oberschenkel	3,7 ± 0,9	2,8 ± 0,8

• Das Vorangehende wird nur bezüglich der Prinzipien der Erfindung als veranschaulichend erachtet. Ferner, da dem Fachmann ohne weiteres viele Modifikationen und Änderungen einfallen, ist es nicht erwünscht, die Erfindung auf die exakte Ausführung und den Arbeitsablauf, die gezeigt und beschrieben sind, einzuschränken.

Claims (9)

1. Verwendung eines Polynukleotids, das in der Lage ist, eine therapeutische zelluläre Änderung bereitzustellen, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer parenchymalen Zelle in der Leber eines Säugers durch Gentherapie, wobei die Gentherapie durch Transportieren des Polynukleotids in ein efferentes Gefäß der Leber, das ausgewählt ist aus der aus der unteren Hohlvene, der hepatischen Vene und dem Gallengang bestehenden Gruppe, bewirkt wird.
2. Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei das Polynukleotid aus DNA oder RNA ausgewählt ist.
3. Verwendung gemäß Anspruch 2, wobei das Polynukleotid einen Code zur Expression eines Polypeptids innerhalb der parenchymalen Zelle bereitstellt.
4. Verwendung gemäß Anspruch 3, wobei das Polynukleotid ein Protein ist.
5. Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei das Polynukleotid in die untere Hohlvene oder die hepatische Vene transportiert wird.
6. Verwendung gemäß Anspruch 5, wobei die Durchlässigkeit eines Blutgefäßes innerhalb der Leber erhöht wird, um dem Polynukleotid zu erlauben, noch effizienter geliefert zu werden.
7. Verwendung gemäß Anspruch 6, wobei die Durchlässigkeit durch eine Methode erhöht wird, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die besteht aus: Erhöhen des hydrostatischen Drucks auf die Blutgefäßwand innerhalb der Leber, Erhöhen des osmotischen Drucks auf die Blutgefäßwand innerhalb der Leber und Einführen eines biologisch wirksamen Moleküls in die Blutgefäßwand innerhalb der Leber.
8. Verwendung gemäß Anspruch 7, wobei der osmotische Druck erhöht wird durch Einführen einer hypertonischen Lösung in die Blutgefäße innerhalb der Leber.
9. Verwendung gemäß Anspruch 7, wobei der hydrostatische Druck ferner durch Blockierung eines afferenten Blutgefäßes der Leber erhöht wird.