DE69533701T2

DE69533701T2 - Gen-enthaltende zusammensetzungen

Info

Publication number: DE69533701T2
Application number: DE69533701T
Authority: DE
Inventors: Makoto Tsukamoto; T. -Cancer Cent. Res. Inst. Domitry- OCHIYA; Sho Yoshida; Takashi Sugimura; Masaaki Terada
Original assignee: Daiichi Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Daiichi Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1994-10-14
Filing date: 1995-08-31
Publication date: 2005-04-07
Anticipated expiration: 2015-09-01
Also published as: BR9509512A; NZ291892A; DE69533701D1; EP0782862A4; CN1166788A; EP0782862B1; CA2202529A1; AU710583B2; WO1996011713A1; ATE280589T1; DK0782862T3; US6471990B1; MX9702725A; PT782862E; EP0782862A1; ES2232827T3; JP3887017B2; US6060081A; AU3354795A; NZ334479A

Description

Technisches Gebiet:
Die vorliegende Erfindung betrifft Verwendung einer Gen-enthaltenden Zusammensetzung, und insbesondere einer Gen-enthaltenden Zusammensetzung zur Einführung eines Gens in von der schwangeren Mutter getragenen Feten zur Expression des Gens. Die Erfindung betrifft auch ein Mittel zur Einführung eines Gens in Feten, einschließlich solcher von Versuchstieren, Vieh und Nutztieren.
Stand der Technik
In neuester Zeit wurden verschiedene Methoden entwickelt, um fremde Gene direkt in tierische oder menschliche Körper einzuführen, in der Hoffnung, sie für eine Gen-Therapie zur Behandlung von durch genomische Abnormalitäten verursachten Erkrankungen applizieren zu können.
Durch kongenitale Gen-Abnormalitäten, wie z.B. einem kongenitalen Genmangel, verursachte Erkrankungen werden vorzugsweise im Pränatalstadium behandelt. Was die Einführung von Genen in pränatales Leben betrifft, ist die einzige Methode, die zur Zeit verfügbar ist, die Mikroinjektion in befruchtete Eier in Tierexperimenten [Palmitter, R.D. & Brinster, R.L.: Annu. Rev. Genet., 20, 465–499 (1986)].
Obwohl die an befruchteten Eiern angewandte Mikroinjektionsmethode den Weg zur Einführung von Genen in das frühe embryonale Stadium öffnete, wurden Wege zur Einführung fremder Gene in Feten bis jetzt noch nicht entwickelt. Außerdem kann die Mikroinjektionsmethode im Falle einer menschlichen Schwangerschaft nicht zur Gen-Therapie von Feten appliziert werden.
Eine Aufgabenstellung der vorliegenden Erfindung ist es deshalb, ein Verfahren zur Einführung von fremden Genen in Feten im Entwicklungsstadium zu entwickeln, und eine andere Aufgabenstellung der Erfindung ist es, eine Gen-enthaltende Zusammensetzung zur Verwendung in einem solchen Verfahren bereitzustellen.
Beschreibung der Erfindung
Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung führten verschiedene Untersuchungen von Wegen zur Verabreichung bestimmter Gene an Feten über den Körper der Mutter durch und fanden als Ergebnis, dass, wenn Gene einer Mutter zusammen mit einem spezifischen Transporter verabreicht werden, diese durch die placentale Basismembran (placental basement membrane) hindurchtreten können, die als Blutschranke zwischen den Feten und ihrem Mutterkörper dient, und dass Gene in Fetuszellen eingeführt werden können, um sich in situ zu exprimieren, was zur Vervollständigung der Erfindung führte.
Nach der vorliegenden Erfindung wird deshalb die Verwendung einer Gen-enthaltenden Zusammensetzung nach Anspruch 1 bereitgestellt.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Mittel nach Anspruch 3 bereit. Außerdem stellt sie nach Anspruch 6 die Verwendung eines Di-C_10–20-alkylamidglycylspermins bereit.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt die Ergebnisse der Southern-Blot-Analyse von genomischer DNA eines Fetus und der Mutterleber nach Verabreichung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung.
2 zeigt die Ergebnisse der Southern-Blot-Analyse von genomischer DNA eines Fetus und der Mutterleber nach alleiniger Verabreichung eines Fremdgens.
3 zeigt die Ergebnisse der Southern-Blot-Analyse von genomischer DNA eines Fetus, wenn die Zusammensetzung an den Tagen 3, 6, 9, 12 und 15 postcoitus verabreicht wird.
4 zeigt die Ergebnisse der Southern-Blot-Analyse von genomischer DNA, die aus einem Mäusefetus, einer neugeborenen Maus und einer 1 Monat alten jungen Maus extrahiert wurde, wenn die erfindungsgemäße Zusammensetzung am Tag 9 postcoitus ihrem Mutterkörper verabreicht wurde.
5 zeigt die Ergebnisse einer Southern-Blot-Analyse von genomischer DNA, die aus den Organen der 1 Monat alten jungen Maus extrahiert wurde.
6 zeigt die Ergebnisse einer Northern-Blot-Analyse von aus einem Mäusefetus und einer neugeborenen Maus extrahierter RNA, wenn die erfindungsgemäße Zusammensetzung am Tag 9 postcoitus ihrem Mutterkörpern verabreicht wurde.
7 zeigt die CAT-Aktivität der Proteine, extrahiert aus einer Maus und einer neugeborenen Maus, in die SV40-CAT-Gen eingeführt wurde.
8 zeigt durch Anfärben mit X-Gal erhaltene histochemische Profile der Expression von β-Actin-lacZ, das durch Verabreichung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung an ihre Mütter am Tag 8,5 postcoitus in Feten eingeführt wurde.
9 zeigt Gewebeschnitte von Mäusefeten, in denen β-Actin-lacZ, das eingeführt wurde, exprimiert ist.
10 ist ein Diagramm, das die Zahl der Plättchen einer 2-Wochen-alten Maus und ihrer Muttermaus zeigt, denen SR-α-HST-1-Gen induziert wurde (wobei das Blut aus dem Herzen gewonnen wurde).
11 ist ein Diagramm, das die Zahl der Plättchen einer 3-Wochen-alten Maus und ihrer Muttermaus zeigt, deren SR-α-HST-1-Gen induziert wurde (wobei das Blut aus der Orbita-Vene gewonnen wurde).
12 ist ein Diagramm, das die HST-1-Protein-Konzentration in den Seren von 3-Wochen-alten Mäusen und ihrer Muttermäuse zeigt, denen SR-α-HST-1-Gen induziert wurde.
Beste Ausführungsform der Erfindung
In der vorliegenden Erfindung wird der Ausdruck "Transporter" verwendet, um auf Substanzen Bezug zu nehmen, die dem Gen helfen, in die Zielzellen transportiert zu werden. Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Transporter ist dazu fähig, Gene aus dem Körper einer Mutter in ihre Fetuszellen einzuführen. Detaillierter ausgedrückt kann der Transporter Gene in Fetuszellen einführen, wenn er einem schwangeren Körper, der den Fetus trägt, verabreicht wird. Der Transporter ist Di-C₁₀-C₂₀-alkylamidglycylspermin. Dioctadecylamidglycylspermine sind besonders bevorzugt.
Die erfindungsgemäß verwendeten Gene sind nicht besonders beschränkt, solange sie für Erkrankungen verwendet werden können, die vorzugsweise während des fetalen Stadiums behandelt oder denen vorgebeugt wird, oder für die Gen-Einführung zum Zwecke der Züchtung gewerblich verwendeter Nutztiere, wie z.B. Versuchstiere und Vieh, sowie für Haustiere, verwendet werden können.
Wenn es z.B. bestätigt wurde, dass einem Fetus ein bestimmtes Gen fehlt, oder wenn es klar ist, dass einem Fetus ein bestimmtes Gen aus seiner Familiengeschichte fehlt, so können solche Gene erfindungsgemäß verwendet werden. Zusätzlich können auch Gene zur Behandlung kongenitaler Erkrankungen, an denen Feten leiden, verwendet werden.

Die Beziehung zwischen kongenitalen genetischen Erkrankungen und Produkten defizienter Gene ist in der folgenden Tabelle dargestellt. Tabelle 1

Kongenitale genetische Erkrankungen	Produkte mit defizienten Genen
Familiäre Hypercholesterolämie	Lipoprotein niedriger Dichte-Rezeptor
Metabolischer Fehler in Lipiden	Apoliprotein
Phenylketonurie	Phenylalaninhydroxylase
Hämophilie A	Faktor VIII
Hämophilie B	Koagulationsfaktor IX
Ornithintranscarbamoylase-Mangel	Ornithintranscarbamoylase
Gen-Tyrosinämie	Furmarylacetoacetat-Hydroxylase
Zystische Lungenfibrose	Transmembrane Conductance regulatory factor durch Zystische Lungenfibrose
Duchenne-Typ-Muskeldystrophie	Minidystrophin-Gen-Produkte
Li-Fraumeni-Syndrom	p53-Protein
Retinoblastom	RB-Protein
Lesch-Nyhan-Syndrom	Hypoxanthinguaninphosphoribosyl-Transferase
Adenosindeaminase-Mangel	Adenosindeaminase
Nieman-Pick-Krankheit	Sphingomyelinphosphodiesterase I
Tay-Sacks-Krankheit	Hexoaminidase A
α₁-Antitrypsin-Mangel	α₁-Antitrypsin
Antithrombin-III-Mangel	Antithrombin III
Carbamylphosphat-Synthetisierungs-Enzym-Mangel	Carbamylphosphat-Synthetisierungs-Enzym
Wachstumshormon-Mangel (Typ IA)	Wachstumshormon
Thyroglobulin-Mangel	Thyroglobulin
21-Hydroxylase-Mangel (kongenitale Nebennieren-Hyperplasie)	21-Hydroxylase
Pyruvatdehydrogenase-Mangel	Pyruvatdehydrogenase

Die Zusammensetzung und das Verfahren der vorliegenden Erfindung können in Gen-Einführungsmodellen verwendet werden, indem man sie Tieren mit spontanen genetischen Erkrankungen oder Knockout-Tieren (Tieren, denen künstlich Gen-Disfunktionen aufgezwungen werden) appliziert. Zusätzlich bei der Behandlung viraler Hepatitis oder maligner Tumore von Säuglingen mit Antisense-Oligonucleotiden, die virale Genprodukte in Gegenwart von viraler Hepatitis (A, B oder C) unterdrücken und anderen Antisense-Olignucleotiden, die die Expression von Onkogenen reprimieren, wie z.B. Wilms-Tumore und Neuroplastome, und Genen, die andere Erkrankungen verursachen.
Beispielhaft für Gene, die in tierische Körper eingeführt werden, sind (1) Gene zur Herstellung von Pharmazeutika in den tierischen Körpern, (2) Gene zur Verbesserung der Qualität von Fleisch, physikalischer Konstitution, Fell, Milch von Tieren, (3) Genmaterialien zur Untersuchung der Funktion eines Gens durch Til gen oder Einführen des Gens in ein lebendgebärendes Tier, und (4) Genmaterialien zur Wiederherstellung der Expression eines Gens in einem Tier mit Genmangel, der im Uterus einen Fetustod verursacht.
Die Feten umfassen solche von Säugern, ausgenommen Menschen, wie z.B. Hunden, Rindern, Pferden, Ziegen, Schafen, Affen, Katzen, Schweinen, Mäusen und Ratten, sowie die von Menschen.
Die Form der zu verwendenden Gene ist nicht besonders beschränkt. Im Hinblick auf die Leichtigkeit einer Einführung und Expression sind jedoch Plasmide, die so aufgebaut sind, dass sie Gene exprimieren, besonders bevorzugt. Eine Kombination eines starken Promotors und/oder Verstärkers und eines Gens ist besonders bevorzugt, weil die Expression gefördert wird. Wenn Promoter mit einer hohen organischen Spezifizität verwendet werden, kann auch ein sogenanntes Organ-Targeting möglich sein, bei dem Gene in einem spezifischen Organ exprimiert werden.
In der erfindungsgemäßen Gen-enthaltenden Zusammensetzung können ein Gen und ein Transporter in Form einer Mischung vorliegen. Alternativ können sie in der Form vorliegen, dass ein Transporter, der sich in einem micellaren Zustand befindet, und ein Gen gemischt werden. Außerdem können auch ein Transporter, der ein Liposom ausgebildet hat, und ein Gen gemischt werden. Wenn ein Transporter ein Liposom ausgebildet hat, ist es bevorzugt, dass die Gene im inneren Liposom in seiner Membran oder in der Oberfläche der Membran vorhanden sind. Beispiele für Methoden zur Ausbildung von Liposomen umfassen Vortex-Behandlung, Beschallung, Umkehrphasen-Verdampfung, Gefriertrocknen, Befeuchten, Methoden unter Verwendung von Polyolen, mechanochemische Methoden, Lipid-lösende Methoden und Sprühtrocknen. Wenn Liposome hergestellt werden, können Phospholipide, wie z.B. Dimyristoylphosphatidylglycerole, Phosphatidylcholine, Phosphatidylethanolamine, Phosphatidylinositole, Phosphatidinsäure usw., Cholesterine, α-Tocopherole, Dicetylphosphate und Stearylamine als Membran-bildende Komponenten zugegeben werden.
Der Anteil an Gen und Transporter variiert abhängig von ihrer Beschaffenheit. Im allgemeinen ist es bevorzugt, dass ein Transporter in einer Menge von 1 bis 100 nmol, und insbesondere 5 bis 10 nmol, pro μg DNA eingebaut wird.
Die erfindungsgemäße Zusammensetzung wird einem schwangeren Körper vorzugsweise durch Injektion verabreicht, und insbesondere durch arterielle Injektion oder intravenöse Injektion. Die Zusammensetzung kann auch über einen Katheter in ein Blutgefäß der Mutter verabreicht werden. Die Zeit der Verabreichung ist nicht besonders beschränkt, wenn sie während der Schwangerschaft stattfindet. Besonders bevorzugt ist es jedoch, dass die Zusammensetzung während der organogenen Periode verabreicht wird.
Die erfindungsgemäße Zusammensetzung tritt nach Verabreichung an einen Mutterkörper durch die Basismembran der Placenta, dann durch die Nabelschnur und schließlich in den Fetus, wodurch Gene in Fetuszellen eingeführt werden. Es wurde bestätigt, dass die so eingeführten Gene in Zellen des Neugeborenen nach dem Transfer vorhanden sind und exprimiert werden.
Die erfindungsgemäße Zusammensetzung ist deshalb in Versuchen zur Einführung von Genen in Feten brauchbar, und zur Vorbeugung und Behandlung von Genmangel von Feten. Die Zusammensetzung ist auch bei der Züchtung von Nutz- und Haustieren brauchbar.
Beispiele:
Die vorliegende Erfindung wird als nächstes detaillierter durch Beispiele beschrieben, die die Erfindung aber keinesfalls beschränken sollen.
Beispiel 1

(1) Plasmid zur Verwendung bei der Einführung Es wurde SV40-Chloramphenicol-Acetyltransferase(CAT)-Plasmid [4752bp, Produkt von Promega] verwendet.
(2) Transporter Es wurde Dioctadecylamidoglycylspermin (DOGS) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989), S. 6983] (Transfectum, Produkt von Biosepra Inc.) verwendet.
(3) Herstellung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung Zur Herstellung einer Plasmidlösung wurden zu 133 μg eines SV40-CAT-Plamids 250 μl einer wässerigen 0,3 M NaCl-Lösung zugegeben. Getrennt wurden 20 μl 96% Ethanol zu 500 μg DOGS zugegeben und bei Raumtemperatur 5 Minuten lang inkubiert. Zur Herstellung einer DOGS-Lösung wurden zu der resultierenden Lösung 180 μl gereinigtes Wasser zugegeben. Zu einer Lösung, die 200 μl der DOGS-Lösung und 250 μl gereinigtes Wasser enthielt, wurde die Plasmidlösung zugegeben. Die Mischung wurde mechanisch in einem Vortex-Mischer geschüttelt und die erfindungsgemäße Zusammensetzung erhalten.
(4) Einführung in ein Gen i) Die wie vorstehend beschrieben hergestellte Zusammensetzung wurde in die Schwanzvene jeder schwangeren weiblichen Maus (Körpergewicht: ca. 30 g, Charles River Co.) am Tag 9,5 postcoitus (P.C.) injiziert. 7 Tage nachher (am Tag 16,5 P.C.) wurde die Mutterleber entnommen. Der Fetus wurde durch Kaiserschnitt ebenfalls isoliert. Aus Leber und Fetus wurde genomische DNA extrahiert und einer Southern-Blot-Analyse auf Gegenwart der CAT-Gene unterworfen. Die genomische DNA wurde gemäß dem in Proc. Natl. Acd. Sci. USA 83, 4993–4997 (1986) beschriebenen Verfahren gewonnen. Die DNA, die durch das Restriktionsenzym Sall vollständig digestiert wurde, und die, die nicht digestiert wurde, wurden durch Elektrophorese an 1% Agarose-Gel getrennt und dann auf eine Hybond-N+Nylon-Membran (Produkt von Amersham) übertragen. Die Blots wurden unter Verwendung eines mit ³²P markierten SV40-Fragments (1908 bP, Hind III-Fragment) als Sonde hybridisiert. Die spezifischen Banden wurden an einem Autoradiogramm bestimmt. Als ein Ergebnis wurde, wie in 1 gezeigt, bestätigt, dass ein Fremd-Gen, SV40-CAT-Plasmid, in Fetuszellen eingeführt wurde. In 1 stammen die Bahnen 1 und 2 von genomischer DNA aus SV40-CAT-Kontrollplasmiden (33 pg), die Bahnen 3 und 4 aus unbehandelten Mutterlebern, die Bahnen 5 und 6 aus unbehandelten Feten, die Bahnen 7 und 8 aus Mutterlebern, denen die erfindungsgemäße Zusammensetzung verabreicht worden war, und die Bahnen 9 und 10 aus behandelten Feten. ii) Die Ergebnisse sind in 2 dargestellt, die in einem Experiment erhalten wurden, in dem SV40-CAT-Plasmid schwangeren Mäusen auf eine ähnliche Art, wie vorstehend in i), aber nicht gemischt mit einem Transporter, verabreicht wurde. Aus 2 ist es ersichtlich, dass SV40-CAT-Plasmide in Fetuszellen in Abwesenheit eines Transporters nicht effektiv eingeführt werden können. In 2 stammen die Bahnen 1 und 2 aus genomischer DNA von SV40-CAT-Kontrollplasmiden (33 pg), die Bahnen 3 und 4 aus Leber von Müttern, denen nur Plasmide verabreicht wurden, und die Bahnen 5 und 6 aus ihren Feten. iii) 3 zeigt die in einem zu dem vorstehend unter i) beschriebenen ähnlichen Experiment erhaltenen Ergebnisse, wobei die Zusammensetzung zu verschiedenen Zeiten verabreicht wurde. Aus 3 ist es ersichtlich, dass fast keine Gene eingeführt wurden, wenn die Zusammensetzung während des Zeitraums von Tag 3 bis Tag 6 P.C. verabreicht wurde, dass Gene nach ca. Tag 9 P.C. eingeführt wurden, und dass die Effizienz der Einführung von Genen am höchsten bei ca. Tag 9 P.C. war. In 3 stammen die Bahnen 1 und 2 aus genomischer DNA von SV40-CAT-Kontrollplasmiden (33 pg), die Bahnen 3 und 4 aus Feten, denen das Gen am Tag 3 P.C. eingeführt wurde, die Bahnen 5 und 6 aus solchen am Tag 6 P.C., die Bahnen 7 und 8 aus solchen am Tag 9 P.C., die Bahnen 9 und 10 von solchen am Tag 12 P.C. und die Bahnen 11 und 12 von solchen am Tag 15 P.C.

Beispiel 2:
Auf ähnliche Weise wie in Beispiel 1 beschrieben, wurde die in Beispiel 1 (3) erhaltene erfindungsgemäße Zusammensetzung an Mäuse am Tag 9 P.C. verabreicht. Genomische DNA wurde extrahiert aus Feten am Tag 16,5 P.C., neugeborenen Mäusen und 1 Monat alten Mäusen. Es wurde eine Southern-Blot-Analyse durchgeführt.
Als Ergebnis wurde bestätigt, dass in allen Fällen, wie in 4 gezeigt, eingeführte Gene vorhanden waren. In 4 stammen die Bahnen 1 und 2 aus genomischer DNA von SV40-CAT-Kontrollplasmiden (33 pg), die Bahnen 3 und 4 aus Feten am Tag 16,5 P.C., die Bahnen 5 und 6 von neugeborenen Mäusen, die Bahnen 7 und 8 von 1 Monat alten Mäusen. Als nächstes wurde die genomische DNA aus einer Vielzahl von Organen der 1 Monat alten Mäuse extrahiert und einer Slot-Blot-Analyse unterworfen. Es wurde gefunden, dass die Gene in verschiedene Organe eingeführt waren. In 5 stammt die Bahn 1 aus genomischer DNA aus dem Gehirn, die Bahn 2 aus der Schilddrüse, Bahn 3 aus der Thymusdrüse, Bahn 4 aus dem Herzen, Bahn 5 aus der Lunge, Bahn 6 aus der Leber, Bahn 7 aus der Milz, Bahn 8 aus dem Pankreas, Bahn 9 aus der Niere, Bahn 10 aus dem Dünndarm, Bahn 11 aus dem Uterus und Bahn 12 aus dem Muskel.
Beispiel 3:
Die Expression des wie in Beispiel 1-i) eingeführten SV40-CAT-Gens wurde durch Northern-Blot-Analyse bestätigt.
RNA wurde aus dem Gesamtkörper von Feten oder neugeborenen Mäusen, denen das Gen auf eine der in Beispiel 1-i) ähnlichen Weise unter Verwendung von Isogen (Produkt von Nippongene) eingeführt wurde, extrahiert. Die RNA (20 μg) wurde durch Elektrophorese an 1% Agarose-Gel getrennt und dann auf eine Nitrocellulose-Membran (Nitroplus-Cellulose-Membran, Produkt von Micron Separations Inc.) übertragen. Auf ähnliche Weise wie in Beispiel 1 beschrieben, wurde eine Hybridisierung durchgeführt unter Verwendung eines mit ³²P markierten SV40-CAT-Fragments als Sonde. Als Ergebnis wurde eine Transkription aus dem eingeführten Gen zu RNA in allen Feten und neonatalen Mäusen festgestellt. In 6 bezieht sich Bahn 1 auf unbehandelte Feten, Bahn 2 auf Feten, in die das Gen eingeführt wurde, und Bahn 3 auf neugeborene Mäuse, in die das Gen eingeführt wurde.
Als nächstes wurden Protein-Proben aus den Gesamtkörpern von Feten und neugeborenen Mäusen, denen das Gen, wie in Beispiel 1-i) beschrieben, eingeführt wurde, und sie wurden auf die Expression eines Fremdgens untersucht, d.h., die enzymatische Aktivität von CAT. Die Menge an Protein in jeder Probe wurde mit jeder anderen in Übereinstimmung gebracht, und die Proben wurden einer Hitzebehandlung bei 60°C während 5 Minuten unterworfen, um den Intrinsic Inhibitory-Faktor von CAT zu deaktivieren. Die Aktivität von CAT wurde mittels bekannter Wege (Zhu, N., Liggitt, D., Liu, Y. & Debs, R., Science 261, 209–211 (1993); und Gorman, C.M., Moffat, L.F. & Howard, B.H., Mol. Cell. Biol. 2, 1044–1051 (1982)) untersucht. Die enzymatische Aktivität wurde gemessen durch Zugeben von 200 nmol Acetyl-Coenzym A zu einer Endmenge von 150 μl Chloramphenicol, das mit 0,1 μCi ¹⁴C (55 mCi/mmol) markiert war.
Als Ergebnis wurde in allen Feten und neugeborenen Mäusen eine Expression des eingeführten Gens festgestellt, was zeigt, dass CAT-Protein gebildet wurde. In 7 bezieht sich Bahn 1 auf unbehandelte Feten, Bahn 2 auf Feten, in die das Fremdgen eingeführt wurde, Bahn 3 bezieht sich auf neugeborene Mäuse, in die das Fremdgen eingeführt wurde, und Bahn 4 auf Kontroll-CAT mit 0,2 μU CAT als Kontrolle.
Beispiel 4:
Als einzuführendes Plasmid wurde ein lacZ-Plasmid, das einen Hühner-β-Aktin-Promotor (Sakura, H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 86, 5758–5762 (1989)) enthielt, verwendet. Eine erfindungsgemäße Zusammensetzung wurde auf ähnliche Weise wie in Beispiel 1 (3) beschrieben hergestellt unter Verwendung von 133 μg eines lacZ-Plasmids und 400 nmol DOGS.
Die so erhaltene Zusammensetzung wurde in die Schwanzvene jeder schwangeren weiblichen Maus am Tag 8,5 P.C. injiziert, um das Gen einzuführen. Der Fetus wurde am Tag 10,5 P.C. isoliert. Zur Bestimmung der β-Aktin-lacZ-Aktivität wurde die Methode nach Cheng verwendet durch Anfärben mit X-gal (Cheng, T.C., Wallace, M.C., Merlie, J.P. & Olsow, E.N., Science 261, 215–218 (1993)). Nach Tränken des angefärbten Fetus in 4°C-Phosphat-gepufferter Salzlösung, die 20% Sucrose und 0,2% Dextrose enthielt, wurden gefrorene Schnitte hergestellt. Kontinuierliche Schnitte wurden auf eine Dicke von 30 μm geschnitten, und geeignete Schnitte wurden für die Zählanfärbung mit Kern-Echtrot ausgewählt. Die angefärbten Profile wurden überprüft.
Die Ergebnisse der Gesamtkörper-Anfärbung von Gen-eingeführten Mäusen sind in 8 dargestellt, und die Ergebnisse von Schnittfärbungen sind in 9 dargestellt. Wie in diesen Figuren gezeigt, wurde eine β-Aktin-lacZ-Aktivität in verschiedenen Organen der Feten stark exprimiert. 8, a bis e, zeigt Feten, in die das Gen eingeführt wurde, und f zeigt einen unbehandelten Kontrollfetus. In 9 zeigt g einen Schnitt des Gesamtkörpers eines Fetus, geschnitten in Längsrichtung, h zeigt einen Stirnschnitt des Gesamtkörpers eines Fetus durch das Herz, i zeigt einen Schnitt des rechten Augenvesikels (optical vesicle) (vergrößert), j zeigt einen Schnitt des Pankreasansatzes (vergrößert), k zeigt einen Schnitt des linken Vorderbeinansatzes (vergrößert), FB bezeichnet das Vorderhirn, H bezeichnet das Herz, MT bezeichnet die mesonephronalen Kanälchen (mesonephric tubules), Nc bezeichnet den Rückenstrang (notochord), IRS bezeichnet den intraretinaten Raum (intra-retinal space), PB bezeichnet den Pankreasansatz (pancreatic bud), D bezeichnet die Rückenansicht (dorsal aspect) und V bezeichnet die Vorderansicht (ventral aspect).
Beispiel 5:
Als einzuführendes Gen wurde ein HST-1-Gen verwendet. Bei der Verwendung wurde ein rekombinanter Expressionsvektor, der Hast-1-cDNA und SR-α-Promotor enthält, hergestellt und einem weiblichen Körper verabreicht. Die Mäuse-Nachkommenschaft wurde daraufhin untersucht, ob das HST-1-Gen exprimiert war. Da das HST-1-Gen-Produkt bekannt dafür ist, die Zahl von Plättchen zu erhöhen, wurde die Gegenwart oder Abwesenheit der Expression durch das Zählen der Zahl der Plättchen bestimmt.

(1) Einzuführendes Gen Es wurde ein Expressions-Plasmid, das ein mit einem SR-α-Promotor legiertes HST-1-Gen enthielt, verwendet.
(2) Herstellung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung Das Verfahren des Beispiels 1-(3) wurde wiederholt, mit der Ausnahme, dass 133 μg des SR-α-HST-1-Gens verwendet wurden.
(3) Einführung des Gens Die vorstehend hergestellte Zusammensetzung wurde in die Schwanzvene jeder schwangeren weiblichen Maus am Tag 10,5 P.C. injiziert, um das Gen einzuführen. Die Zahl der Plättchen der Mäuse-Nachkommenschaft wurde bei Woche 2 und Woche 3 nach ihrer Geburt gemessen. Zur gleichen Zeit wurde ebenfalls die Zahl der Plättchen ihrer Mütter gemessen. Die Ergebnisse sind in den 10 und 11 dargestellt. 10 zeigt die Ergebnisse an aus dem Herzen gewonnenen Blut, 11 zeigt jene des aus der Orbita-Vene gewonnenen Bluts. Aus diesen Ergebnissen ist es klar, dass die Zahl der Plättchen der jungen Mäuse, in die HST-1-Gen eingeführt wurde, höher war als die der Kontrollmäuse. Das zeigt, dass das HST-1-Gen in die jungen Mäuse eingeführt wurde, und dass das Gen in den Mäusen exprimiert wurde. Das HST-1-Protein im Serum von 3 Wochen alten Mäusen wurde mittels ELISA gemessen. Unter Verwendung von 50 μl von aus jeder 3 Wochen alten Maus erhaltenem Serum und bekannten Methoden wurde ELISA durchgeführt, um die Menge des HST-1-Proteins zu bestimmten (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Band 91, S. 12358–12372, Dezember 1994). Die Ergebnisse sind in 12 dargestellt. Die Daten der 12 zeigen, dass das HST-1-Protein im Blut junger Mäuse festgestellt wurde, in deren Mütter das HST-Gen eingeführt wurde.

Industrielle Anwendbarkeit
Wenn die erfindungsgemäße Zusammensetzung einem schwangeren Körper verabreicht wird, kann der Genmangel während der Schwangerschaft behandelt werden. In Tierversuchen kann, wenn ein unbekanntes Gen Tieren während ihres embryonalen Stadiums eingeführt wird, die Funktion des Gens in der Ontogenese untersucht werden. Darüber hinaus kann die Zusammensetzung verwendet werden, um physiologisch aktive Substanzen, wie z.B. Pharmazeutika, in Tierkörpern zu erzeugen oder die Produktion solcher Substanzen zu erhöhen. Es ist somit möglich, Tiere unter Verbesserung ihrer physikalischen Konstitution, Fleischqualität, Milch und Fell zu züchten.

Claims

Verwendung einer Gen-enthaltenden Zusammensetzung, umfassend (a) ein Gen und (b) Di-C_10–20-alkylamidglycylspermin als Transporter, der zum Transport des Gens von einem Mutterkörper zu Fetuszellen fähig ist, zur Herstellung eines einem schwangeren Körper verabreichten Mittels, – zur Vorbeugung und Behandlung eines Genmangels eines Fetus oder – zur Züchtung nicht-menschlicher Tiere, mit der Maßgabe, dass Verfahren zur Modifizierung der genetischen Keimidentität von Menschen und Verfahren zur Modifizierung der genetischen Identität von Tieren, die ihnen wahrscheinlich Leiden ohne wesentlichen medizinischen Nutzen für Mensch und Tier zufügen, ausgenommen sind.
Verwendung nach Anspruch 1, worin der Transporter Dioctadicylamidglycylspermin ist.
Mittel zur Injektion in einen schwangeren Körper, der einen Fetus trägt, zum Transport eines Gens aus dem schwangeren Körper in Fetuszellen, wobei das Mittel umfasst (a) ein Gen und (b) Di-C_10–20-alkylamidglycylspermin als Transporter, der zum Transport des Gens von einem Mutterkörper zu Fetuszellen fähig ist, wobei der Transporter in einer Menge von 1 bis 100 nmol pro μg DNA enthalten ist.
Mittel nach Anspruch 3, erhältlich durch Mischen einer Gen-enthaltenden Lösung und einer Dioctadecylamidglycyclspermin-enthaltenden Lösung und Schütteln unter mechanischem Schütteln.
Mittel nach Anspruch 3 oder 4, worin das Di-C₁₀-C₂₀-alkylamidglycylspermin Dioctadecylamidglycyclspermin ist.
Verwendung von Di-C_10–20-alkylamidglycylspermin zur Herstellung eines Mittels nach einem der Ansprüche 3 bis 5.