WO1996011713A1

WO1996011713A1 - Genetic material containing composition

Info

Publication number: WO1996011713A1
Application number: PCT/JP1995/001734
Authority: WO
Inventors: Makoto Tsukamoto; Takahiro Ochiya; Sho Yoshida; Takashi Sugimura; Masaaki Terada
Original assignee: Daiichi Pharmaceutical Co., Ltd.
Priority date: 1994-10-14
Filing date: 1995-08-31
Publication date: 1996-04-25
Also published as: DE69533701T2; CA2202529A1; US6060081A; BR9509512A; DE69533701D1; AU3354795A; DK0782862T3; US6471990B1; PT782862E; ATE280589T1; CN1166788A; MX9702725A; EP0782862B1; JP3887017B2; EP0782862A4; AU710583B2; NZ334479A; EP0782862A1; ES2232827T3; NZ291892A

Description

明細書遺伝子物質含有組成物技 i l分野

本発明は遺伝子物質含有組成物に関し、更に詳細には妊娠母体中の胎児に遗伝子を導入し、当該遺伝子を発現させるための遺伝子物質含有組成物並びに実験動物、家畜及び産業用動物も含めた胎児への遗伝子の導入方法に関する。背景技術

近年、ヒトを含む動物個体へ直接外来遺伝子を導入するための種々の方法が開発され、遺伝子異常に起因する疾患に対する遺伝子治療等への応用が期待されている。

一方、先天性遺伝子欠損症等の先天性遺伝子異常に基づく疾患は、出生前に治療されることが望ましい。ところで、出生前の個体に対する遺伝子導入法については、動物実験において受精卵へのマイクロインジヱクシヨン

CP a l m i t e r, R. D. & B r i n s t e r, R. L. ： Ann u. Rev. Gen e t. , 2_0_, 465 - 499 ( 1 986) 〕が知られているだけである。

この受精卵へのマイクロインジヱクシヨン法は、初期胚における遗伝子導入を可能にしたものの、より発生の進んだ段階における胎児への外来遗伝子の導入手段は存在せず、また、ヒトにおける妊娠の場合の胎児への遺伝子治療には適用できない。

従って、本発明の目的は、発生のより進んだ段階で胎児に外来遺伝子を導入する方法の開発と、それを可能にする遺伝子物質含有組成物を提供することにある発明の開示

そこで本発明者は目的の遺伝子を母体を介して胎児に投与する手段について種々検討してきたところ、遺伝子を特定のトランスポーターとともに母体に投与すれば、胎盤における母体と胎児の血液関門である基底膜を通過し、遺伝子が胎児細胞内に導入でき、当該遺伝子が胎児細胞内で発現することを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は遣伝子及び母体から胎児細胞へ当該遺伝子を導入し得るトランスポーターを含有する遺伝子物質含有組成物を提供するものである。

また、本発明はこの遺伝子物質含有組成物を母体に投与して胎児細胞内に遺伝子を導入する方法を提供するものである。

図面の簡単な説明

図 1 は、本発明組成物を投与した場合における母体肝臓及び胎児のゲノム DN Aのサザンブロッティングの結果を示す図である。

図 2は、外来遺伝子のみを投与した場合における母体肝臓及び胎児のゲノム DNAのサザンプロッティングの結果を示す図である。

図 3は、本発明組成物を妊娠 3、 6、 9、 1 2、 1 5日目に投与した場合における眙児のゲノム DNAのサザンプロッティング結果を示す図である。

図 4は、妊娠 9日目の母体に本発明組成物を投与した時の胎児、新生児及び生後 1ヶ月の子マウスより採取したゲノム DNAのサザンプロッティング結果を示す図である。

図 5は、図 4で示した生後 1ヶ月の子マウスの各臓器から採取したゲノム DNAのスロットブロッティング結果を示す図である。

図 6は、妊娠 9日目の母体に本発明組成物を投与した時の胎児及び新生児マウスより採取した RNAのノザンプロッティング結果を示す図である。

図 7は、 SV4 0— CAT遺伝子が導入された胎児及び新生児マウスより採取した蛋白質の CAT活性を示す図である。

図 8は、妊娠 8. 5日目の母体に本発明組成物を投与し、胎児に導入された^ ーァクチン一 l a c Zの発現を X— g a 1を用いた染色により示す図である。図 9は、導入された /8—ァクチン一 1 a c Zが発現している胎児マウスの組織切片を示す図である。

図 1 0は、 SR—ひ一 h s t - 1遺伝子が導入された生後 2週児マウス及びその母マウスの血小板数を示す図である（心臓より採血した）。

図 1 1は、 S R—ひ一 h s t— 1遺伝子が導入された生後 3週児マウス及びその母マウスの血小板数を示す図である（眼窩静脈より採血した）。

図 1 2は、 S R—ひ一 h s t— 1遺伝子が導入された生後 3週児マウス及びその母マウスの血清中 h s t— 1 夕ンパク質濃度を示す図である。発明を実施するための最良の形態

本発明において、トランスポーターとは、遺伝子が目的とする細胞に移入するのを補助する物質をいう。本発明で使用されるトランスポーターは、母体から胎児細胞へ遺伝子を導入し得るものであり、より詳細には妊娠母体に投与することにより胎児細胞中へ遺伝子を導入し得るものである。かかるトランスポーターとしては、カチオン化リボポリアミンが挙げられる力 \ このうちジ C _{1 0}— C _{2 0}アルキルアミドグリシルスペルミンが好ましく、ジォクタデシルアミドグリシルスべルミンが特に好ましい。

本発明に用いられる遺伝子は、胎児の時期に治療又は予防するのが望ましい疾患のための遺伝子、又は実験動物、家畜を含む産業用動物及び愛玩用動物等の品種改良において動物個体への遺伝子導入に用いられる全ての遺伝子であれば特に制限されない。

例えば、胎児が欠損していることが判明している遺伝子、家族歴よりその胎児が欠損していることが明らかな遺伝子、胎児が羅つている先天性疾患の治療のための遗伝子等が挙げられる。

かかる先天性遺伝子疾患と欠損遺伝子産物との関係を次表に示す。表 1 先天性遺伝子疾患欠損遺伝子産物

家族性高コレステロール血症低比重リボ蛋白質受容体脂質代謝異常アポリポ蛋白質

フエ二ルケトン尿症フエ二ルァラニンヒドロキシラーゼ

血友炳 A 第 VI I I因子

血友病 B 凝固第 IX因子

オルニチントランスカルバモイラ一ゼオルニチントランス力ルバモイ欠損症ラーゼ

遺伝子チロシン血症フマリルァセトアセテートヒドロキシラー

囊疱性肺織維症囊疱性肺繊維症膜貫通コンダク夕ンス調節因子

Duchenne型筋ジストロフィーミニジス卜ロフィン遺伝子産物リフラウメ二症候群 (Li-Fraumeni Syndrome) P 5 3タンパク質

レチノブラストーマ（網膜芽腫） R Bタンパク質

Lesc -Nyhan 症候群ヒボキサンチングァニンホスホリボシルトランスフェラーゼアデノシンデァミナーゼ欠損症アデノシンデァミナーゼ

Ni emari - Pi ck 病スフィンゴミエリンホスホジェステラーセ 1

Tay-Sachs 病へキソサミニダーゼ A ひ ,—アンチトリプシン欠損症ひ ,一アンチトリプシンアンチトロンビン]! [欠損症アンチトロンビン II

力ルバミルリン酸合成酵素欠損症カルバミルリン酸合成酵素成長ホルモン欠損症 I A型成長ホルモン

Thyroglobul in 欠損症 Thyroglobul in

21 -水酸化酵素欠損症 21 -水酸化酵素

(先天副肾過形成）

ピルビン酸脱水素酵素欠損症ピルビン酸脱水素酵素また、自然発生の遺伝子疾患動物や人工的に作成された遺伝子機能不全動物ックアウトアニマル）に対する遺伝子導入モデルに利用できる他、ウィルス肝炎又は小児悪性腫瘻の治療に、ウィルス肝炎（A， B, C) に感染した際のゥィルス遗伝子産物を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチド、あるいはウィルムス腫癌、神経芽腫等の小児悪性腫瘍を起こすがん遺伝子、又はその他の疾患の原因となる遺伝子の発現を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチドも利用できる。

また、動物個体への遺伝子導入に用いられる遺伝子としては、（ 1 ) 動物体内で医薬品等を生産させるための遺伝子、（2) 動物の肉質、体質、毛皮、乳汁等の改善のための遺伝子、（3) 胎生動物において、ある遺伝子を欠損又は導入することにより当該遺伝子の働きを検討するための遺伝子材料、（4) 子宮内胎児死亡をおこす遺伝子欠損動物への遺伝子発現回復のための遺伝子材料等が挙げられる。

なお、胎児には、ィヌ、ゥシ、ゥマ、ャギ、ヒッジ、サル、チンパンジー、ネコ、ブ夕、マウス及びラット等のヒト以外の哺乳類並びにヒトが含まれる。用いる遺伝子の形態は特に制限されないが、導入、発現のさせやすさを考慮すれぱ、当該遺伝子が発現し得るように構築されたプラスミドが特に好ましい。 .また、遺伝子に強いプロモーター及び又はェンハンサーを連結して用いた場合には、当該プロモーター及び又はェンハンサ一により発現が増大するためより好ましい。更に、このプロモータ一として、臓器選択性の高いプロモーターを用いた場合には、 ¾伝子を特定の臓器において発現させる、いわゆる臓器夕ーゲティングも可能である。

また、本発明遺伝子物質含有組成物においては、遺伝子とトランスポーターは単に混合物として存在していてもよいし、ミセルを形成したトランスポーターと遺伝子が混合された形態でもよいし、さらにリボソームを形成したトランスボー夕一と遺伝子が混合された形態でもよい。トランスポーターがリボソームを形成している場合、遺伝子は当該リボソームの中、膜中及びノ又は膜の表面に存在していることが好ましい。リボソームの形成法としては、機械的振動 (Vo r t ex i ng) 法、超音波処理（Son i c a t i on) 法、逆相蒸発 (Rev e r s e-Pha s e Evap o r a t i on) 法、凍結乾燥法、加温法、多価アルコール法、メカノケミカル法、脂質溶解法及び噴霧乾燥法等が挙げられる。リボソームを調製するにあたっては、更に膜搆成成分として、ジミリホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールァミン、ホスファチジルイノシトール並びにホスファチジン酸等のリン脂質、コレステロール、ひ一トコフエロール、ジセチルホスフェート及びステアリルァミン等を添加することができる。

遺伝子とトランスポーターの配合比は、その種類により異なるが通常 DNA 1 L gに対し 1〜 1 0 Omnol、特に 5〜 1 Onmolトランスポーターを配合するのが好ましい。

本発明組成物の投与方法は、妊娠中の母体に注射、特に動脈又は静脈注射する方法が好ましい。更に母体血管内にカテーテルを用いて投与する方法も挙げられる。また、投与時期は、妊娠中であれば特に制限されないが、器官形成期が特に好ましい。

本発明組成物は、母体に投与された後胎盤の基底膜を通過し、臍帯を経て胎児細胞中に遺伝子を導入する。この導入された遺伝子は、出産後の子の細胞中にも存在し、発現していることが確認されている。

従って、本発明の組成物は、胎児への遺伝子導入実験、及び遺伝子欠損児出生予防又は胎児の遺伝子欠損症予防及び治療に有用である。また、産業用動物、愛玩用動物（ぺット）などの動物の品種改良にも有用である。実施例

次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれにより何ら制限されるものではない。

実施例 1

(1) 導入用プラスミド

S V 40—クロラムフエ二コールァセチルトランスフェラーゼ（CAT) プラスミド〔4752bp, プロメガ社〕を使用した。

(2) トランスポーター

ジォク夕デシルァミドグリシルスペルミン（DOGS) CP r 0 c . Na t l . Ac a d. S c i. USA 8 6 ( 1 989) p. 6983〕（トランスフエクタム， B i o s ep r a I n c. ) を使用した。

( 3 ) 本発明組成物の調製

SV4 0— CAT プラスミド 1 3 3〃 gに 0. 3 M塩化ナトリゥ厶水溶液 250 1を加え、プラスミド溶液を調製した。また、 DOGS 500〃に 96 %エタノール 20 1を加え、室温で 5分間ィンキュベートし、更に精製水 1 80 1を加え、 DOGS溶液を調製した。 DOGS溶液 200 1に精製水 250 / 1を加えた溶液に、先に調製したプラスミド溶液を加え、ボルテックスミキサーにて直ちに機械的振動を与えて本発明組成物を調製した。

( 4 ) 遺伝子の導入

i ) 上記の組成物を、交尾後 9. 5日目の妊娠雌性マウス（体重約 30 g, チャ一ルスリバ一社）の尾静脈に注射した。 7日後（妊娠 1 6. 5日）に母体の肝臓を採取し、更に胎児を帝王切開にて摘出した。肝臓及び胎児からゲノム DN A を採取し、サザンプロッティングにより CAT遺伝子の存在の有無をチエツクした。ゲノム DNAの採取はP r o c. Na t l . Ac a d. S c i. USA 8 3, 4 9 9 3 - 4 9 9 7 ( 1 9 8 6 ) に従って行った。 DN Aは制限酵素 S a 1 Iで完全消化したものと、未消化のものを 1 %ァガロースゲル上で電気泳動にて分離し、ハイボンド一 N +ナイロン膜（アマシャム社）に転写した。ブロットは³² Pラベルした SV 4 0— CATフラグメント（ 1 9 0 8 b p， H i n dll【フラグメント）をプローブとしてハイプリダイズさせ、オートラジォグラムにより特異バンドの検出を行った。

その結果、図 1に示すように胎児細胞のゲノム DN A中に外来遺伝子である S V 40—CATプラスミドが導入されていることが判明した。

図 1中レーン 1及び 2はコントロールの SV40— CATプラスミド（33 pg) 、レーン 3及び 4は未処置母体肝臓、レーン 5及び 6は未処置胎児、レーン 7及び 8は本発明組成物を投与された母体の肝臓、レーン 9及び 1 0はその胎児より採取されたゲノム DN Aである。

ii) また、 SV40— CATプラスミドをトランスボーターと混合せず、そのまま妊娠マウスに i) と同様に投与して実験を行った結果を図 2に示す。図 2から明らかに、 SV4 0— CATプラスミドは、トランスボー夕一が存在しなければ胎児細胞中に効率良く導入されないことがわかる。なお、図 2中、レーン 1及び 2はコントロールの SV4 0— CATプラスミド（ 3 3 p g) 、レーン 3及び 4はプラスミドのみを投与した母体の肝臓、レーン 5及び 6はその胎児より採取されたゲノム DNAである。

iii) また、 i ) と同様の実験を投与時期を変化させて行った結果を図 3に示す。図 3から妊娠 3日及び 6日までの投与ではほとんど遺伝子が導入されず、妊娠 9日目頃以降から遺伝子が導入され、妊娠 9日目付近が最も導入効率が高いことが判明した。なお、図 3中、レーン 1及び 2はコントロールの SV 4 0— C ATプラスミド（ 3 3 p g) 、レーン 3及び 4は妊娠 3日、レーン 5及び 6は妊娠 6日、レーン 7及び 8は妊娠 9日、レーン 9及び 1 0は妊娠 1 2日、レーン 1 1及び 1 2は妊娠 1 5日目に遺伝子を導入された胎児のゲノム DN Aを示す。実施例 2

実施例 1 と同様に妊娠 9日目に実施例 1 (3) で得た本発明組成物を投与し、妊娠 1 6. 5日目の胎児、新生児マウス及び生後 1ヶ月後の子マウスからゲノム DNAを採取し、サザンブロッテイングを行った。

その結果、図 4に示すように、いずれの場合にも導入遺伝子が存在していることが確認された。図 4中、レーン 1及び 2はコントロールの SV4 0— CATプラスミド（3 3 p g：) 、レーン 3及び 4は妊娠 1 6. 5日胎児、レーン 5及び 6 は新生児マウス、レーン 7及び 8は生後 1ヶ月の子マウスのゲノム DN Aを示す _c 更に、生後 1ヶ月後の子マウスについて各臓器からゲノム DNAを採取し、スロットブロッテイングを行った結果、図 5に示すように広範囲の臓器に遺伝子が導入されていることが判明した。図 5中、レーン 1は脳、レーン 2は甲状腺、レーン 3は胸腺、レーン 4は心臓、レーン 5は肺、レーン 6は肝臓、レーン 7は脾臓、レーン 8は眸臓、レーン 9は腎臓、レーン 1 0は小腸、レーン 1 1は子宮、レーン 1 2は筋から採取されたゲノム DNAをそれぞれ示す。

実施例 3

実施例し i ) のようにして導入された遗伝子 SV 4 0— CATの発現をノザンブロッティングにより確認した。すなわち、実施例 1. i ) と同様にして遺伝子導入された胎児又は新生児マウスの全身よりイソゲン（二ツボンジーン社）を用いて RNAを抽出した。 RNA

(2 0〃 g) を 1 %ァガロースゲルで電気泳動にて分離し、ニトロセルロース膜

(ニトロプラスセルロース膜，ミクロンセパレ一シヨンズインク. ）に転写し、実施例 1 と同様にして³² Pラベルした SV 4 0— CATフラグメントをプローブとしてハイプリダイズさせ、ォ一トラジオグラムにより特異バンドの検出を行つた。その結果、図 6に示すように、胎児及び新生児のマウスのいずれにおいても導入遗伝子から RNAへの転写が行われていることが判明した。図 6中、レーン

1は未処置胎児、レーン 2は遺伝子が導入された胎児、レーン 3は遺伝子が導入された新生児マウスを示す。

また、実施例 i ) と同様にして遺伝子を導入された胎児又は新生児マウスの全身より蛋白質を採取し、外来遺伝子の発現、すなわち CATの酵素活性をァッセィした。すなわち、各サンプルの蛋白質を等しくし、 6 0°Cで 5分間加熱処理することにより CATの内因性阻害因子を不活化し、公知の手段（Z h u, N . ， L i g g i t t , D . ， L i u , Y . & D e b s , R . 、 S c i e n c e 2 6 1 , 2 0 9 - 2 1 1 ( 1 9 9 3 ) 及び G o rma n, C. M. , Mo f f a t , L. F. & Howa r d, B. H. ， Mo 1. C e l l . B i o l . 2, 1 0 4 4 - 1 0 5 1 ( 1 9 8 2 ) ) により C AT活性をアツセィした。なお、酵素活性測定は、 0. 1 C iの¹⁴ Cでラベルしたクロラムフエ二コール（ 5 5 mC i Zmmol) を最終量 1 5 0〃 1に対し 2 0 Onmolのァセチルコェンザィム Aを添加して行った。

その結果、図 7に示すように胎児及び新生児のマウスのいずれにおいても導入された遺伝子が発現し、 CAT蛋白質が産生していることが判明した。図 7中、レーン 1は未処置胎児、レーン 2は外来遣伝子を投与された胎児、レーン 3は外来遺伝子を投与された新生児マウス、レーン 4は 0. 2 Uのコントロール CATを示す。

実施例 4

導入用プラスミドとして、ニヮトリの yS—ァクチンプロモータ一を含む l a c Zプラスミド（S a k u r a, H. e t a 1. , P r o c. Na t l . Ac a d. S c i. U. S. A. 86, 5758 - 5762 ( 1 989) ) を用いた。 1 a c Zプラスミド 1 33 u g及び DOGS 40 Onmolを用いて、実施例 1 (3) と同様にして本発明組成物を調製した。

得られた組成物を、交尾後 8. 5日目の妊娠雠性マウスの尾静脈に注射して遺伝子導入した。妊娠 1 0. 5日目の胎児を摘出し、チェンらの方法（Ch e ng, T. C. ， Wa l l a c e, M. C. , Me r 1 i e, J. P. & O l s ow, E. N. , S c i en c e 26 1, 2 1 5 - 2 1 8 ( 1 993) ) に従ってーァクチン一 1 a c Z活性を X— g a 1を用いて染色して検出した。凍結切片は、染色した胎児を 4。Cの 20%シュクロース及び 0. 2 %デキストロースを含むリン酸緩衝生理食塩水中に浸漬した後作成した。また、連続切片は、 30 tzmの厚さに切断し、適当な切片を核ファスト赤で対染色して観察した。

得られた遺伝子導入マウスの全身染色の結果を図 8に、切片の染色の結果を図 9に示す。その結果、 8 -ァクチン— 1 a c Z活性が胎児の広範囲の臓器中で発現していることが判明した。図 8中、 a〜eは遺伝子が導入された胎児であり、 f は未処置のコントロール胎児である。図 9中、 gは胎児全身の縦方向（矢状断）切片、 hは胎児全身の心臓を通る前額断切片、 iは右眼胞の切片（拡大）、 jは脾臓芽の切片（拡大）、 kは左前肢芽の切片（拡大）であり、 FBは前脳、 Hは心臓、 MTは中腎管、 NCは脊索、 I RSは網膜内空間、 PBは脾臓芽、 Dは背側部、 Vは腹側部を示す。

実施例 5

導入用遺伝子として h s t一 1遺伝子を用い、プロモータ一として SR— プ口モーターを連結した遺伝子を妊娠母体に投与し、生後の仔マウスで h s t - 1 遺伝子が発現するか否か検討した。 h s t - 1遣伝子の産物は血小板を増加することが知られているので、発現の有無は血小板数を測定することにより判断した。

( 1 ) 導入用遺伝子

SR— αプロモーターに連結した h s t - 1遺伝子を含む発現プラスミドを用いた。

(2) 本発明組成物の調製

SR—ひ一 h s t - 1遺伝子 1 33 gを用いる以外は実施例 1 (3) と同様にして調製した。

(3) 遺伝子の導入

得られた組成物を、交尾 1 0. 5日目の妊娠雌性マウスの尾静脈に注射して遺伝子導入した。生後 2週及び 3週に仔マウスの血小板数を測定した。また、同時に母マウスの血小板数も測定した。結果を図 1 0及び図 1 1に示す。なお、図 1 0は心臓より採血し、図 1 1は眼窩静脈より採血した。

その結果、 h s t— 1遺伝子を導入された仔マウスの血小板数は、コントロールマウスのそれに比べて高値を示しており、仔マウスに h s t— 1遺伝子が導入され、その遺伝子が仔マウスの体内で発現しことがわかる。

また、生後 3週の仔マウスの血清中の h s t— 1タンパク質を EL I SA法を用いて測定した。すなわち、生後 3週の仔マウスから採取した血清 50 を用いて公知の手段（P r 0 c. Na t l . Ac a d. S c i . USA, Vo l . 9 1, pp. 1 2368- 1 2372, De c emb e r 1 994 ) に従って EL I SA法により h s t— 1タンパク質を測定した。その結果を図 1 2に示す _c その結果、 h s t— 1遺伝子を導入した母体から得られた仔マウスの血中に h s t一 1夕ンパクが検出された。産業上の利用可能性

本発明組成物を用いれば、それを母体に投与することにより遺伝子欠損症児の出生を防止でき、また妊娠中に遣伝子欠損症の治療ができる。また動物実験において、未知の遺伝子を胎生期に導入することにより、発生における当該遺伝子の機能を解明できる。また、動物体内で医薬品等の生理活性物質を生産させたり、その生産量を増大させることもでき、更に動物の体質、肉質、乳汁及び毛皮の改善などの動物の品種改良にも応用できる。

Claims

請求の範囲

1 . 遣伝子及び母体から胎児細胞へ当該遺伝子を導入し得るトランスポーターを含有する遺伝子物質含有組成物。

2 . 母体に投与して胎児に遺伝子を導入するためのものである請求項 1記載の遺伝子物質含有組成物。

3 . トランスポーターが、ジじ ,。一 C _{2 0}アルキルアミドグリシルスペルミンである請求項 1又は 2記載の遺伝子物質含有組成物。

4 . トランスポ一夕一力く、ジォク夕デシルアミドグリシルスペルミンである請求項 1又は 2記載の遺伝子物質含有組成物。

5 . 遺伝子欠損児出生予防、胎児の遺伝子欠損症予防及び治療、動物の品種改良用である請求項 1〜 4のいずれかの項記載の遺伝子物質含有組成物。

6 . 母体に投与して胎児細胞内に遺伝子を導入するための遺伝子物質含有組成物であって、遺伝子含有溶液とジォクタデシルアミドグリシルスペルミン含有溶液を混和し、機械的振動を与えて調製した溶液。

7 . 請求項 1〜 6のいずれかの項記載の遺伝子物質含有組成物を母体に投与して胎児細胞内に遺伝子を導入する方法。