JPH07507450A - ｉｎｖｉｖｏ遺伝子治療のための方法及び組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

ｉｎ　ｖｉｖｏ遺伝子治療のための方法及び組成物本発明は、ｉｎ　ｖｉｖｏで 哺乳類、特にヒトの細胞への外因性遺伝物質の全身性導入のための方法及び組成 物に関する。 背景 異常な発現が生命を脅かすヒトの疾患に関連する遺伝子のかなり長い配列がクロ ーン化され同定されている。このようなりローン化遺伝子のヒトにおける発現能 は、多くの重要なヒトの疾患の予防及び／又は治療を最終的には可能にするであ ろう。このような疾患は、今、現在有効な治療法によってご（わずかに治療され るか又は治療不可能にある。例えば、ヒトの患者におけるコレステロール調節遺 伝子、ＩＴＩＶの複製を選択的に遮断する遺伝子又は腫瘍抑制遺伝子のｉｎ　ｖ ｉｖ。 発現は、各々心臓疾患、ＨＩＶ及び癌の治療を劇的に改良する。しかし、現在有 効な遺伝子送達（ｄｅｌ　１ｖｅｒｙ）戦略は、哺乳宿主への全身性投与の後で 、広範囲の組織におけるｉｎ　ｖｉｖｏでの高レベルの又は広汎性の注入遺伝子 （ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）発現をもたらことはできていない。この不可能性は、殆 どのヒトの疾患のための有効な遺伝子治療の開晃を妨げている。 遺１′ｉ、子治療の手法には、異なる到達点とこれらの到達点に達するための異 なる方法が共に含まれる。この到達点には、一般的に、遺伝子置換、遺伝子修正 及び遺伝子増大が含まれる。遺伝子置換では、変異遺伝子配列が、特異的にゲノ ムから取り出され、正常な機能的遺伝子と置換される。遺伝子修正では、変異遺 伝子配列が、標的ゲノムにおいて更に変化することなく修正される。遺伝子増大 では、欠陥細胞中の変異遺伝子の発現が、外来正常遺伝子配列を導入することに よって改変さＡする。 池のよって用いられる上記到達点に達するための方法には、標的細胞の“体外性 （ｅｘ　ｖｉｖ０）”トランスフェクションと、その後の宿主哺乳類における好 適器官へのトランスフオームされた細胞の導入が含まれる。ＥＸ　ｖｉｖｏ技術 には、裸のＤＮＡ又はＤＮＡリポソーム結合体によるｉｎ　ｖｉｔｒｏでの細胞 のトランスフェクションと、その後の宿主器官への導入（“ｅｘ　ｖｉｖｏ”遺 伝子治療）が含まれる。好適標的器官又は組織の基準には、容易にアクセス可能 であり、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで操作することができ、遺伝的改変方法が行いやすい 標的器官及び組織であること並びに、理想的には、非複製細胞又はサイクリング （細胞周期をまわっている）幹細胞を含み遺伝子修正を永続化できることが含ま れる。更に、遺伝的に改変された細胞を、機能的及び安定な形態で生物へ再移植 可能なことも必要である。この基準に適合する標的器官の例は、哺乳類の骨髄細 胞である。ｅｘ　ｖｉｖｏ遺伝子治療の更なるＪ、（ｉｌｌ＋、には、レトロウ ィルスベクターを用いる場合、細胞が有糸分裂前であることである。有糸分裂後 の細胞は、レトロウィルスベクターによる感染に無反応性である。これは報告さ れていないが、例えば、修正遺伝子産物が所望の効果で／標的細胞に、血液又は 他の体液において循環して分泌され影響を及ぼすならば、ｅｘＸ唱・０遺伝子治 療を用いて標的器官又は組織以外からの細胞をトランスフエフ１−＝ｉ丁「１ヒ となりｊ辱る。 ｅｘ　ｖｉｖｏ冶療には幾つかの欠点がある。例えば、分化し、複製中の細胞の みが感染すると、新たに導入された遺伝子機能は、その細胞が成熟して死滅すれ ば失われてしまう。ｅｘ　ｖｉｖｏ的手段は、また限られた数の細胞のトランス フェクションにしか利用てきず、生体から最初に取り出されたものでない細胞を トランスフェクトするためには利用できない。上記の方法は、一般的に細胞ゲノ ムへ新たな遺伝物質を組み込むことに関連しており、従って、永久的な変化を達 成する。 リボ゛ノームは、特に薬物、放射性治療剤、酵素、ウィルス、転写因子及び他の 細胞性エフェクターを種々の培養細胞株及び動物へ導入することに、効率的に用 いら一］でいる。導入させるだめの試薬は、普通、リポソーム、または詣質小胞 中に捕獲されているか、該試薬を該小胞の外側に結合させ得る。リポソーム仲介 薬物送達の効率を試験するための首尾よい臨床実験が完成している。いくつかの 戦−八か、特定の組織及び特定の細胞型にリボ′ノームを向けることによって、 リボソー／、仲介薬物送達の効率を上げることを提案している。しかし、リポソ ーム仲介ヘクターの使用のための基本的な方法論が十分に開発されている一方で 、この技術かｉｎｌ・ｉｖｏ遺伝子治療におけるリポソーム主体トランスフェク ションベクターに−）いては完成していない。 注入遺伝子のｅｘ　ｖｉｖｏ発現は、他によって報告されているように、注入遺 伝子の持定絹織・＼の直接的な注入、例えば裸のＤＮＡ又はＤＮＡ−陽イオン性 リポソーム複合体の直接的な気管内、筋肉内若しくは動脈内注入に、又は宿主細 胞のｅＸＩ下・ｏトランスフェクノコン及びその後の再注入に拘束されていた。 該発現は低く、＝一般に、ひとつの組織に制限さ第１、普通は注入された組織（ 例えば筋肉）か；静脈注入が用いられた場合のＩＩＩ臓若しくは肺か一気管内注 入が用いられた場合の肺かに限定さ第１、これらの組織内の全細胞の１％未満が トランスフェクトされた。ある場合には、細胞のトランスフェクションは、静脈 投与の部位に輸入性の組織においてもたらされる。 現（［「ｒ効な遺伝子送達の戦略は、ｉｎ　ｖｉｖｏでの高レベル及び／又は広 汎性の注入遺伝子発現をもたらずことに、一様に失敗している。従って、多くの ヒト疾患のｉｎ　ｖｉｖｏ治療、予防又は軽減のために、注入遺伝子の高レベル の転写及び／又は神々の細胞及び組織タイプでの発現のためのｉｎ　ｖｉｖｏ遺 伝子治療の組成物及び送達方法を開発することが興味の対象となっている。遺伝 子治療の他の方法としての遺伝子改変の使用もまた、興味の対象となっている。 遺伝子改変では、既に光現さＡまた遺伝子の発現を、外因性正常遺伝子配列を導 入することによって増大させ、アンチセンス遺伝子若しくは遺伝子断片（フラグ メント）を導入することによって、又は特定ｍＲＮＡを開裂できるリボザイムを もたらすことができるベクターを導入することによって減少させる。遺伝子改変 は、遺伝子発現を範囲を改変し、又は遺伝子産物のプロセッシング、構築若しく は分泌に影響するタンパク１４をコードする外因性正常遺伝子配列を導入するこ とによって達成することもてきる。 ｒ数の刊行物がｌ１ｉｎ！？ＬＥのｉｎ　ｖｉｖｏ及びｅｘｖｉｖｏ）ランスフ エクションに関連している。あるものは、注入遺伝子の転写が達成できたことの みであり、他のものは、低レベルの発現及び／又は限定数の組織若しくは細胞タ イプでの発現のみを示したデータを提示している。以下のものは、この領域の刊 行物の例である。 機能的な新規遺伝物質の細胞への導入のための種々の手段が、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ 及びｉｎ　ｖｉｖｏの両方で試みられた（フリートマン（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ） 、（１９８９）　５ｃｉｅｎｃｅ、２４４：１２７５−１２８０）。これらの手 段には、改変レトロウィルスへの発現すべき遺伝子の組み込ミ（フリート？　ン 、　（１９８９’）前出）；ローゼンバーグ（ＲｏｓｅｎｂｅｒｇＸＩ９９１） 　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｂ　５１（１８）、追）ＩＩＩ　：　５０７４ Ｓ−５０７９Ｓ）　；非レトロウィルスベクターへの組み込み（ローゼンフエル ド（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ）ら、（１９９２）　Ｃｅ１１．６８：１４３−１５５ 　：　ｒ３−ゼンフェルｌ’ら、（１９９１）　５ｃｉｅｎｃｅ、２５２：　４ ３１−４３−１）　；又は、リポソームを介した異種プロモーター−エンハンサ −要素に連結された注入遺伝子の送達（フリートマン、（１９８９）、前出、ブ リガムら、（１９８９）　Ａｍ、　Ｊ、　＆Ｉｅｄ、　Ｓｃｉ、　、　２９Ｂ＋ ２７８−２８１　；ナーベル（Ｎａｂｅ戟j ら、（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２−１９：１２８５−１２８８　：　ハジン スギ（ｌ（ａｚｉｎｓｋｉ）ら、（＋９９１）　Ａｍ、Ｊ、qｅ ５ｐ、ｃｃ１口１ｏ１ｅｃ、Ｂｉｏｌ、、４：２０６−２０９　；ワンとホアン （Ｉｌｕａｎｇ）、（＋９８７）、Ｐｒｏｃ、　Ｎａ　ｌ　h　、　Ａｃ ａｄ、　Ｓｃｉ、　、　ＵＳＡ、　、　８４　ニア８１５−７８５５）　；リガ ンド特異性、陽イオン主体輸送システムとの結合（ウー（Ｗｕ）及びウー、（１ ９８８）Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　、　２６３：１４６２１−１４６２４ ）又は襟のＤＮＡ発現発現ツクター重用（ナーベルら、（＋９９０）、前出）； つ＋ルア（Ｗｏｌｆｆ）う、（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ、’２Ｊ７・１１６５ −１４６８）が含まれる。注入遺伝子の組織への直接的な注入は、局所的な発現 のみをもたらす（ローゼンフェルド、（１９９２）前出）：ローゼンフェルトら 、（＋９９１）、前出、ブリガムら（＋９８９）、前出：ナーベル、（＋９９０ ）、前出：及び）Ｓ）ンスギら、（１９４１１）、前出）。ブリガムらのグルー プ（Ａｍ、　Ｊ、λｌｅｄ、　Ｓｃｉ、　（１９８９）２９８　：２７８−２８ １及びＣｌ１ｎｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　（１９９１）３９　（抄録））は 、ＤＮＡリポソーム複合物の静脈内又は気管内投与後でのマウスの肺のｉｎ　ｖ ｉｖｏ　）ランスフエクションのみを報告している。ヒト遺伝子治療手法の総説 記事の例には：アンダーマン（Ａｎｄｅｒｓｏｎ）、５ｃｉｅｎｃｅ　（１９９ ２）　２５６：８０８−８１３がある。 ＰＣＴ／ＵＳ９０１０１５１５（フエルナ−（Ｆｅｌｇｎｅｒ）ら）は、ｉｎ　 ｖｉｖｏでのを椎動物の細胞の内部・＼の医薬的又は免疫原的ポリペプチドをコ ードする遺伝子の送達方法に向けられている。注入遺伝子の発現は、注入組織に 限定されている。ＰＣＴ／　Ｕ　Ｓ　９０／　０５９９３（ブリガム）は、発現 コンストラクト（構築物）の静脈内又は気管内注入の後の噛れ類の肺細胞におけ る注入遺伝子の発現を得る方法に向けられている。Ｐ　ＣＴ８９１０２．＋６９ 及びＰ　ＣＴ　９０１０６９９７は、ｅｘ　ｖｊｖｏ遺伝子治療に向けらイ１、 これは、体内から取り出すことがてきる細胞例えばリンパ球における注入遺伝子 の発現に限定さ４１ている。Ｐ　ＣＴ８９／＋２１０９は、同様にｅｘ　ｖｉｖ ｏ遺伝子治１ｑに向けられている。Ｐ　ＣＴ９０／＋２８７８は、トランスフオ ームされた細胞株と、ｅＮ＼１１）０トランスフエクソヨンを用いたトランスジ ェニックマウスとの両方における高レベルな発現をＩＭ（！”する。Ｐ　ＣＴ　 ／　Ｕ　Ｓ　９２１０８８０６は、哺乳類の非接触細１１包の拉Ｔ仲介１−ラン スフ１−−メーンヨンに向けられている。ＥＰ出願９１３０１８１９．８は、絹 み換え技術を用いて嚢胞性ｗｉ、維症膜貫通盟コンダクタンス調節物質（ＣＦＴ Ｒ）を生成することに向けられている。 発明の概要 １口・ｉＸ・０て複数の哺乳類組織へ注入遺（ｉ子を導入するための方法及び組 成物をかＩＭ　（１’さ４する。該方法は、対象のヌクレオチド配列を含むトラ ンスフェクションカセットを、主として非組み込み型のプラスミドへ取り込む工 程、該プラスミドをＩｌ＋ｎ乳類宿主へ、特定組織−＼直接導入すること以外で によって導入する工程を含む。トラノスフヱクソ１ンカセットは、操作可能な結 合成分として、転写及び開始調節領域、対象核酸配列、並びに、転写終結調節領 域を含み、ここで、該調節領域は哺乳類宿主の細胞中で機能性であり、対象どな る核酸配列は、イントロンを含まない。任意には、転写カセットは、陽イオン性 脂質キャリアと複合化（錯体化）する。該方法は、哺乳細胞の表現型を変更する ために用いられる。 図面の説明 ｒｌ　Ｉ　Ａは、トランスフエタン９ンカセントで注入されたマウスからの、図 ＩＢでは対照ＩＴのマウスからの、マウス肺の切片のＩｊｌｌ＆鏡写真を示して いる。ＩＡの顕微鏡写真は、ｐＺＮ２７　：ＤＤＡＢ・コレステロール発現ベク ター−陽イオン１１、脂質キャリア複合体の静脈注入後４８時間のマウス肺の切 片を示している。プラスミドは、ＣＡＴ　（クロラムフェニコールアセデルトラ ンスフェラーゼ）の発現のための配列を含む。詣貿キャリア組成物は、１対１の ＤＤＡＢ＋コレステロールであった。キャリア：プラスミド比は、５μｍｏｌ陽 イオン性脂質対ｌμｇＤＮＡであった。１００μｇの投与量のＤＮＡを、マウス 毎に注入した。この視野では、Ｉｂ１ｉ　ｌｌａ及び肺胞管壁細胞が示さ第１て おり、この殆ど（５０〜７０％）が、抗ＣΔＴＩＩ’Ｌ：体てっり−にげ、アル カリホスファターゼを用いて視覚化をした場合に、ＣＡＴタンパク質の存（［に ついて、赤く陽性に染まる（矢印で表示）。処理された動物の１１ｉ１ｉは、ｌ ｌ＋ｌｉ胞及び１１１

【管内Ｉ支細１１ａに拡散して不均一に染まる。気道上皮 の染色は、また、気道細胞もトランスフェクトる。ＣＡＴタンパク質は、通常、 咄乳細胞には存在せず、従って、これらの細胞でのＣＡＴタンパク質の（ｒ在は 、ｉｎ　ｖｉｖｏてトランスフェクトされたものであることを示している。ＩＢ ての顕微鏡写真は、静脈注入された脂質キャリアのみで処理され、！えＣＡＴ抗 体でつり」二げられた対照１ｔマウスがらのマウス肺切片を示している。細胞は 、顕著には染色されないが、低レベルのバックグラウンドの染色か幾つかの肺胞 マクロファージて検出され（矢印で表示）、この細胞は、内因ｆ１のアルカリホ スファターゼ活性を有している。 １ｍ　２　Ａは、ＤＮＡ−陽イオン性脂質ギヤリア複合体の腹腔内（ｉｐ）注入 の４８時間後に単離されたマウス下リンパ球の位相差１１Ｊ１ｔｌｆｉ鏡写真を 示している。脂質キャリアは、ＤＤＡＢ　：　ＤＯＰＥ、１対１モル比であった 。ＤＮＡ−陽イオン性脂質キャリア；夏合体はＩｍｇのｐｃＩｓ−ＣＡＴと１μ ｍｏｌの陽イオン性脂質であった。ＩｍｇのＤＮＡをｉｐで注入した。細胞を抗 ＣＡＴマウスモノクローナル抗体と、その後にテキサスレッｌ”結合ヤギ抗マウ スＩｇＧど共にインキュベートした。１Δ２Ｂは、同一視野の蛍光顕微鏡写真を 示しており、これは、処理動物から取り出され、ｒｌ存する本質的に全てのＴ細 胞は、ＤＮＡ／陽イオン性脂質キ十り７複合体の１ｐ注入後でのトランスフェク トされたＣＡＴ遺伝子の発現を証明する免疫蛍光によって、赤く染色さ４１ｆこ 。図２０は、未注入の対照マウスから単離されたＴリンパ球の位相差［０１鏡写 真を示している。図２Ｄは、同一視野の蛍光顕微鏡写真を示し、これは、対照動 物群からのこれらのリンパ球ではＣＡＴ遺伝子発現がないことを示している。 図３Ａは、４８時間前にＤＮＡ：脂質キャリア複合体ＤＤＡＢ　＋コレステロー ノ１．：ｐＺＮ５１で処理したマウスからの造血系骨髄由来細胞を示している。 細胞を、図１のようにＣＡＴタンパク質について染めた。顕微鏡写真は、始原細 胞又は旧、ｒ細胞を含む約７０％の骨髄由来細胞が赤く染まり（矢印は芽球細胞 を示している）　、　ｉｎ　ｖｉｖｏでトランスフェクトされることを示してい る。脂質キャリアは１１のＤＤＡＢ・コレステロールであった。ＤＮＡ：陽イオ ン性脂質の比は、ＩＩＩｇのＤ　Ｎ　Ａ　ンｔ　５　ｎｍｏｌの陽イオン性Ｉｌ ？′ｒ１１Ｋであった。１００μｇのＤＮＡを各マウスパ＼１ｖて注入した。図 ３Ｂは、未処理の対照マウスからの単離骨髄細胞を示している。顕微鏡写真は赤 く染まらず、これは、未処理動物においてＣＡＴ遺伝遺伝１炉曳いことを示して いる。 １４４△−４Ｂは、培芥てのＣＡＴ発現プラスミド−ＤＮＡ１１合体によるヒｌ −Ｔ細１１０（ＣＤ４’）のトランスフエフソランを示している。脂質キャリア 組成物は、１１モル比のＤＤＡＢ　：　ＤＯＰＥの小車ラメラ小胞（ＳＵＶ）で あった。５゜ｎｍｏ　Ｉの陽イオン性脂質と環合化された２５μｇのｐＺＮ２７ は、培養中のｌｏ。 Ｏ万の細胞へ添加された。細胞を、抗ＣＡＴマウスモノクローナル抗体と、その 後に、テギザスレッド結合ヤギ抗マウスＩｇＧと共にインキュベートした。図４ Ａは、トランスフエクンヲン？＆４８時間の新鮮な単離ヒトＣＤ４’　Ｔリンパ 球の１・？ＮＩ差′ｇロｉ′：！ｌ繞写真を示している。図４Ｂは、同一視野の 蛍光顕微鏡写真を示し、こＡ１は、本質的に１００％のＴリンパ球がＣＡＴタン パク質のついて陽性に染め、即ち、これらはトランスフェクトされたことを証明 している。 ＩＡ５は、プラスミドｐＺＮ２０のコンストラクシクンを示している。 図６Ａは、ｌ−１−１ｃ　（Ｔｏｗｎｅ）の前初期エンハンサ−及びプロモータ ー領域の制限地図を示し、ＨＣＭＶ　（ＡＤ＋　６９）のものは図６０に示され ている。 １’４６Ｂは、２つのＨＣＭＶプロモータの配列比較を示している。Ｎｃｏ　１ 部位の位１１１Ｊ、アルタリスクで示しである。 ＶＪ７（パネルａ−ｆ）は、電子Ｉｆｆｆｆ耳鏡写真し、これの写真は、陽イオ ン性ｔｉｔ’Ｎ＃ヤ’Ｊ７：ＤＮＡ１合体（ＤＯＴＭＡ：ＤＯＰＥ；　ｐＲＳＶ −ＣＡＴ）が、細胞表面リセブターに結合した後、伝統的なりセブター仲介エン ドサイトシスを介してＣＶ−１（アフリカミドリザルの肝臓）細胞によって内在 化されることを５１１明している。ｐＲ３ＶＣΔＴのコンストラクションは、ボ ルマン（Ｇｏｒｍａｎ）ら、（１９８２）Ｐｒｏｃ、　Ｎａ　ｔｌ、　Ａｃａｄ 、　Ｓｃｉ、　、　ＵＳＡ、　、　７９　：６７７７−６７８１を参照のこと。 脂質キャ潟Aは １　：　Ｉ（Ｆ）ＤＯＴＭＡ　：ＤＯＰＥであった。２０　ｕ　ｇ（７）ＤＮＡ を２０ｎｍｏｌ（７）陽イオン１４．１脂質と１π合化して、２ＸＩＯ＠の細胞 に添加した。パネル（ａ）中の矢印はり・）スリン１７３７９小胞に結合してい る粒子を示し、パネル（ｂ）の矢印は、取り込ま４１てエンドソーム内にＣｒ− 在している粒子を示している。 図８Ａ−８Ｃは、ＣＭＶ−ＣＡＴ陽イオン性脂質キャリア：ＤＮＡ１１合体の静 脈注入を受けたＢ−１６メラノ一マ発生動物からの肺の組織学的解析の顕微鏡写 真を示している。脂質キャリアは１：１モル比のＤＯＴＡＰ　：コレステロール であった。陽イオン性脂’！’ｊ：ＤＮＡ比は、６μｍｏｌ　：　ｌμｇＤＮＡ であった。用いたプラスミドはｐＺＮ２０　（図５参照）であった。マウス当た り１００８ｇ　ＤＮＡを注入した。ＣＡＴタンパク質の免疫組織化学的解析は、 多くの集中した実質のＩｌｌ瘍の強い赤の染色（図８八では矢印で表示）と、血 管内の腫瘍塞栓（図８Ｂでは矢印で表示）とを示し、これは、！１ｌｌｉにおけ る多くのＢＩ６メラノーマＩＩ！瘍細胞力軸り管杼山転移（ｂｌｏｏｄ−ｈｏｒ ｎｅ　ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ）と同様に、静脈注入後にトランスフェクトされる ことを示している。図８０は、ＤＮＡ−脂質キャリア複合体の注入を受けなかっ たＢ１６メラノ一マ発生マウスからの組織において、ＣＡＴタンパク質が、周囲 の正常肺又は腫１ｌｆＩ瘍細胞のいずれにも存在しないことを示している。 図９は、ＣＡＴをコードしているプラスミドｐＺＮ２７の横築を示している。 図１０Ａ及び図１０Ｂは、ヒトＩＬ−２をコードしているプラスミドｐＺＮ４Ｇ のｌ＃ｌ築を示している。 図１１は、ヒトＣＦＴＲをコードしているプラスミドｐＺＮ３２の構築を示して いる。 図１２Ａ−１２Ｅは、ｐＺＮ３２：陽イオン性脂質キャリア複合体又は脂質キャ リアのみ（対照群マウス）の静脈投与で処理されたマウスからの肺組織の免疫組 織的に（ＣＦＴＲタンパク賀の対して）染色された凍結切片の顕微鏡写真を示し ティる。図１２Ａ、１２Ｃ及び１２Ｅは、各’＋５０Ｘ、ｔｏｏｘ及び２５０Ｘ の（ａ率によるＤＮＡ脂質キャリア覆合体で処理されたマウスからの肺切片であ る。 図１２Ｂ及び＋２Ｄは、５０Ｘ及び１００Ｘの倍率による対照マウスからの肺切 片であり、これは、対照マウスの肺には検出可能なＣＦＴＲ発現がないことを示 している。＠質ギヤリアは１：１モルのＤＤＡＢ：コレステロール（ＳＵＶ）で あ−た。、脂質ギヤリアーＤＮＡＩＩ合体は、５μｍｏｌの陽イオン性脂質体ｌ μｇのＤＮＡであった。マウスに対して１００μｇのＤＮＡを注入した。動物を 、注入後２４時間で犠牲死させた。これらの図は、気道及び気道管壁細胞の両方 の＞７００６か強く赤く染まることを示し、これはこれらの細胞が、ＣＦＴＲ遺 伝子を発現していることを示している。 図１３は、ＣＡＴをコードしているプラスミドｐＺＮ５１の構築を示している。 １４１４は、全てｃＡＴをコードしティるプラスミドｐＺＮ６０．ｐＺＮ６１゜ ｐ　Ｚ　Ｎ　６２及びｐＺＮ６３の１カ築を示している。図１４Ａ及び１４Ｂは 、中間体ブーラスミドｐＺＮ５２、ｐＺＮ５４、ｐＺＮ５６及びｐＺＮ５Ｂの構 築を示している。図１４ｃは、中間体からの最終プラスミドｐＺＮ６０からＩ） ＺＮ６３の構築を示している。 図１５は、マウスに静脈注入された６つの異なるプラスミドについてのＣＡＴア ッセイの薄層クロマトグラフィのオートラジオグラフを示している。レーン１− １２は、肺組織のＣＡＴ活性を示し、レーン１３−２４は、肝組織のＣＡＴ活１ ′１を示し、レーン１．２．１３．１４はｐＺＮ５１であり、レーン３．４．１ ５．１１’１１１ｐＺＮ６０ｔｒあり、レーン５．６．１７．１８はｐＺＮ６１ であり、レー／７．８．１９．２０１１ｐＺＮ６２てあり、レーン９．１０．２ １．２２はｐＺＮ６３てあり、レーン１１．１２．２３．２４はｐＺＮ２７であ る。脂質キャリアはＤＤＡＢ・コレステロール（１：　ｌ）であった。脂質キャ リアーＤＮＡ１１合体は５μｍｏｌの陽イオン性脂質対ＩｕｇのＤＮＡであった 。マウス当たり１００８ｇのＤＮＡを注入した。動物を４８時間後に犠牲死させ た。各レーンは１匹マウスを表す。クロマトグラフィを、示されているように図 の下部から上部に向けて流している。［Ｆ＋５の中カッコに示されるように、未 反応のＩＣクロラムフエニフールは、ＴＬＣプレートの原点から短い距離だけ移 動している。′４Ｃアセチル化クロラムフェニコールＩは、中カッコによって示 されるようにプレートの更にににＣＡＴ酵素活性によって移動する。 図１６Ａ−１６Ｅは、ＣＡＴタンパク質について免疫組織化学的に染色された／ ＩＪ！　ＩＩ′；　ｌ１ｉｌｉ切片の顕微鏡写真を示している。マウスには、尾 静脈からｐＺＮ２７（１６Ａ）が注入され、これは、ＣＡＴについての赤い陽性 染色が肺内部の内皮細胞、肺胞、気道細胞であることを示している。これに対し て、天然ＣＦＴＲプロモータに連結されたＣＡＴ遺伝子（ｐＢＥ３．８ＣＡＴ） のリポソーム複合体は、主として気道上皮細胞にＣＡＴ発現を示した（１６Ｂ） 。未注入の対照動物からの肺切片は、赤い染色を示さず、これは、未トランスフ ェクト細胞でのＣＡＴ発現かないことを示している（１６Ｃ）。図１６Ｄは、Ｉ ）ＺＮ２７処理マウスからのＩｊｌｉ胞の高倍率の顕微鏡写真を示し、これは、 肺胞及び上皮細胞の両方におけるＣＡＴ遺伝子産物についての高レベルの陽性赤 染色を示している。図１６Ｅは、ｐＢＥ３．８ＣＡＴ注入マウスからの肺胞の高 倍率の顕微鏡写真を示し、これは、肺胞又は内皮細胞には、いずれも顕著なＣＡ Ｔ遺伝子発現がないことを示している。１００μｇのプラスミドを、ＳＵＶとし てのＤＤＡＢ：コレステロールと複合化して静脈注入した。動物を２４時間後の 犠牲死させた。 図１６　Ｆ　−１６Ｋ１．ｔ、未処［（７）マウス（１／−：／ｌ−３）　、Ｉ ）ＢＦ２．８ＣＡＴ（チュウ（Ｃｈｏｕ）ら、（１９９１）Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　 Ｃｈｅｍ、　、　２６６＋２４４７１−２４４７６）をｉｖ注入されたマウス（ レーン４−６）又はｐｃｌｓ−ＣＡＴを注入したマウス（レーン７−９）からの 組織であって、心臓（１６Ｆ）、リンパ節（１６Ｇ）、神職（１６８）、腎Ｎｉ ！（１６１）、肺（１６Ｊ）及び肝臓（＋６１０中（７）ＣＡＴ活性の薄層クロ マトグラフィのオートラジオグラフを示している。脂質ギヤリアは、ＤＤＡＢ　 ：コレステロール、Ｉ　：　ｌ５ＵＶ　（１，ｃｚｇＤＮＡ対５ｎｍｏｌ陽イオ ン性脂質）であって、マウス当た１）１００μｇを注入した。 ｌＡ１７はマウスＧＭ−Ｃ３ＦをコードしているプラスミドｐＺＮ８４の構築を 示している。 図１８はヒトＣＦＴＲをコードしているプラスミドｐＺＮ１０２の横築を示して いる。 ［Ｊ１９Ａは、ＴＬＣブレー１・のオートラジオグラフであり、これは、全ての 脂質キャリアを伴わないｐＺＮ２７の注入後の動物におけるＣＡＴ活性を示して いる。Ｉｍｇを４時間にわたって２回＋Ｖて注入した。マウスを２４時間後に犠 牲死させた。試験された種々の組織を各レーンの下に示す。 図１９Ｂは、ＴＬＣプレートのオートラジオグラフであり、これは、脂質キ十リ アと１！合化されたｐＺＮ２７を注入された動物におけるＣＡＴ活性を示してぃ Ｌ！＋　ｔｉｌｌ　ｔ＆に＋Ａｔｔ、死させた。試験された種々の組織を各レー ンの下に示す。 １・′ラノスフエクトされているかを証明する。 ｌＡ２１は、ヒトｌ１ｉｌ癌細胞株のトランスフェクションを示している。ＴＬ Ｃブレー１・のオートラジオグラフは、隨々の陽イオン性リポソームを用いてト ランスフェクトについてアッセイした。 １４２２は、ＤＤＡＢ・コレステロールリポソームと複合化したＩｍｇのＧＭ− Ｃ３Ｆプラスミド（ｐＺＮ８４）（Ｉ　ｊｉｇプラスミド対１ｎｍｏｌ脂質）を ｉｖで注入さオ］た１匹のヤギにおける血清マウスＧＭ−Ｃ３Ｆレベルを示して いる。血清試料を、注入後０、Ｉ２．２４，４８．７２、Ｉ６８及び８４０時間 で採取した。 マウスＧＭ−Ｃ３Ｆレベルを市販のキット（エンドゲン）を用いてＥＬＩＳＡに よって測定した。 特定具体例の説明 本発明によって、調製方法及び用途と共に核酸コンストラクトがもたらされ、こ ４１は、該核酸によって接触された組織及び細胞のトランスフエフシリンが起き るために十分な投与量て哺乳類宿主へコンストラクトを導入した後、該宿主の複 数の組織において細胞の表現型のｉｎ　ｖｉｖｏ変化及び／又は改変をもたらす 。トランスフエクシ９ンベクターの成分は、一般に、転写の方向で連結された操 作可能な成分として、転写開始領域、対象となるＤＮＡ配列及び転写集結領域を 含み、転写調節領域は、トランスフエフシリンの標的とされる宿主の哺乳類中で 機能する。ｌＩ：！ｆｆ：には、イントロンを、該コンストラクトに好ましくは コード化配列の５゜木端に含み１する。一般に、該コンストラクトは、宿主細胞 ゲノム中へ組み込まれるようにならず、主として染色体外に文はエピソーム形懇 で維持される非組み込みプラスミドの一部として賎宿主へ導入される。該コンス トラクトは、裸の核酸にらｌ１ｌｌｒ貿キヤリアと会合した核酸にもすることが できる。十分な投与量とは、所望の９３ｒ　里、例えば動物又はヒトの疾患の予 防、緩和及び／又は治療、又は対象となる薬物の内因性レベルの改変をもたらし １０ることを意味する（”ｉｎ　ｖｉｖｏ”遺伝＋’ｉｆｒ＋ＩＩ）。この改変 は広汎性であり＃す、即ち、多数の細胞型若しくは組織においてｅ）られ、又は 、この改変は選択的に、例えば選択された細胞若しくは組織型にのみにおいて及 び／又はそこに誘導可能にし得る。 宿主・＼の該核酸コンストラクトの導入部位にのみ又はこれに対して輸入性部分 以外の複数の１１穐及び細胞のトランスフェクションが得られ、発現が高レベル で多数の細胞及び細胞型において起こる。トランスフオームされ得る組織には、 正常な動物の肺、心臓、肝臓、骨髄、膵臓、リンパ節、腎臓、胸腺、骨ｒ＆筋、 卵巣、子宮、胃、小腸、大腸、膵臓及び脳と、腫瘍発生哺乳類の転移性腫瘍及び 脈管内１）１１１１塞詮とが含まれる。トランスフェクトされる特定細胞には、 マクロファージ、肺胞１型及び１１型細胞、肝細胞、気道上皮細胞、血管内皮細 胞、心臓筋細胞、骨髄芽球、赤芽球、Ｂリンパ球及びＴリンパ球が含まれる。投 与の経路は、普通は、循環性体液例えば血液、脳を髄液中であるが、投与の他の 経路も用いることができる。該コンストラクトは、裸の核酸にも脂質キャリアと 会合している核酸にもする二とがてきる。任意には、脂質キャリア分子及び／又 はコンストラクトは、特定細胞型の（１的化及び／又はそこに発現をもたらし得 る。 核酸コンストラクトを、合成、天然的に誘導又はこれらの組み合わせである核酸 配列から調製することができる。この配列を、意図されているレシピエンド宿主 と相同なドナー宿主から得ることができ、又は該核酸配列の性質に基づいて、宿 」：の好ましいコドンを有する配列を合成することもできる。宿主の好ましいコ ドンは、対象となる特定宿主に大量に発現されているタンパク質に高頻度なコド ンから決定され１！）る。クローニングが細菌宿主系において成されている場合 には、コドンｉ！！ｔＲを変えてこの細菌性宿主系における安定性を促進するこ とが有益である。、ａ図される用途が、感染生物による疾患を治療することであ る場合には、配ｐＨの適当な供給源は、ＲＮＡ又はＤＮＡのいずれかのウィルス 性の核酸とし得る。 遺伝子は高分子量であり、ポリカチオンであるので、キャリア仲介送達は、過充 、培養においてもｉｎ　ｖｉｖｏにおいても、細胞のＤＮＡ）ランスフェクショ ンに必ずしも必要でない。陽イオン性脂質キャリア例えばリポソームを用いて、 転写調節タンパク質を送達することができる。更に、リポソームそれ自身は、（ ウィルスヘクターと異なり）　ｉｎ　ｖｉｖｏで非免疫原のようである。リポソ ーム配合物には、陽イオン性脂質を有するものが包含され、ヒト患者において安 全であり、よく寛容化さ第１ることが示されている（トリー）（Ｔｒｅａｔ）ら 、（＋９９０）　Ｊ、Ｎａｔｌ、Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔｉｌ　８２：ｌ７０６ −１７１０）。多様なトランスフ上クシ３ン技術か、培養細胞における注入遺伝 子の高レベルの発現をもたらすことができるが、このような方法のご＜１１かに は、リポソームを用いたものも含まれるが、これらはｉｎ　ｖｉｖｏ遺伝子送達 にも適用できる。陽イオン性リポソーム又は裸のＤＮＡのいずれかを用いた印（ ・口・ｏトランスフェクションを得る既存の試みは、１つの組織のトランスフェ クション及び／又は外因性ＤＮＡを導入した組織のみのトランスフェクションを らたらしている。トランスフェクソヨンのこのパターンは、正常細胞性機構によ り取り込まれるＤＮＡ及び／又はリポソームよりもむしろ、導入の組織中の細胞 が、導入方法によって傷つけられ、その後に導入される外因性ＤＮＡのいくつか を取り込むことができる。 出願人は、蔦くべきことに、広範囲の組織及び細胞型のトランスフェクションと 、哺乳類宿主への全身性投与後の高レベルの注入遺伝子の発現とを共にもたらす 変更を発見した。これらの変化には、ＤＮＡ：陽イオン性脂質キャリア複合体の 使用であって、ＤＮ八へ脂質キャリアの陽イオン性脂質の比はｉｎ　ｖｉｖｏ発 現の）引τｔにかなり作用できる；以前用いられているよりも多くの量の複合体 の使用：適当なプロモータ成分の使用例えば、強く且つ継続的な活性のもの例え ばＨＣＭ＼７−ＩＥＩ成分であり、これはｉｎ　ｖｉｖｏで多くの細胞型におい て増進された発現をもたらすために望ましい；並びに、注入遺伝子のコード化領 域の５°側の１００ｂｐ以上のイントロンの置換又は、所望遺伝子産物の生成に 利用される全てのイントロンの除去が含まれる。更に、驚くべきことに、肺、肝 臓、膵臓、腎臓、リンパ節及び心臓を含む多数の組織を、高投与量の裸のＤＮＡ を循環性体液例えは、面液又は脳を髄液へ直接投与した後にトランスフオームす ることができることを発見した。或いは、選択的な発現を、特定細胞及び組織型 において所望に時期に（即ち、発現は誘導性である）、成分特に用いたコンスト ラクトのプロモータ及び／又はエンハンサ−を変更することによって、又は、リ ポソームの漂的部分を１史用することによって、得ることができる。 殆との遺伝子治療戦略は、レトロウィルス性又はＤＮＡウィルスベクターへの注 入遺伝子挿入に依存している。レトロウィルスの潜在的欠点には、裸のＤＮＡ又 は陽イオン性脂質キャリアの使用に対して、レトロウィルスのｉｎ　ｖｉｖｏ　 （ｅｘ　ｖｉｖＯとは逆に）注入遺伝子発現の制限された仲介能；レトロウィル スベクターの非分裂細胞に対するトランスフェクト無能性；感染性レトロウィル スをもたらす復製欠陥レトロウィルスベクターにおける組み換え現象の可能性： 注入遺伝子の宿主細胞ゲノムＤＮＡへのランダム挿入による癌遺伝子（オンコシ ン）の活性化又は腫瘍抑制遺伝子の阻害可能性：サイズの制限、即ち、普通１５ ｋｂ未膚のＤＮＡをレトロウィルスベクターにパッケージすることができる；並 びに、ベクターに対する宿主の免疫応答を誘発する潜在的な免疫原性が含まれる 。更に、すべてのｅｘ％＋ｉｖｏ手段は、トランスフェクトされる細胞を体外へ 取り出し、一定期間培養系に維持することを必要とする。培養中では、細胞は有 害又は潜在的に危険な表Ｆ！ｉｕ的及び／又は遺伝子型的変更を実行するかしれ ない。アデノウィルス及び他のＤＮＡウィルスベクターは、上記の潜在的制限の 幾つかを共有する。従って、アデノウィルス若しくは他のＤＮＡウィルスベクタ ーを使用しない本発明は、既存の技術を越える幾つかの利αを有する。更に、本 発明は、投与の容易さと他の方法によって達成できない結果とを約束する。 本発明の用いられるコンストラクトには、当該コンストラクトの用途に応じて幾 つかの形がある。従って、該コンストラクトには、ベクター、転写カセット、発 現カセット及びプラスミドが含まれる。転写及び翻訳開始領域（時として“プロ モータ”とも呼ばれる）は、転写開始調節領域と翻訳されない５゛側配の翻訳開 始調節領域、リボ゛ノームへのｍＲＮＡの結合及び翻訳開始に寄与する”リボノ ーム結合部位“が入っていることが望ましい。開始制御領域の転写及び翻訳機能 要素は、同一の遺伝子から由来又はこれから入手可能であることが望ましい。 ある具体例では、プロモーターはエンハンサ−などの配列の追加、又は必須でな い及び／又は望ましくない配列の削除によって改変される。“入手可能”とは、 対ΦＤＮＡの転写の所望な特異性を提供するために、本来のプロモーターと十分 類似しているＤＮＡ配列を有するプロモーターを意図している。これには、天然 配列と合成配列、更には合成配列と天然配列の組合せによる配列が含まれる。 転写開始領域、即ちプロモーター要素については、対象ＤＮＡ配列の所望のレベ ルの転写を与えることを条件に、どの領域を使われ得る。転写開始領域は、宿主 細胞に及び／又は転写されるへきＤＮＡ配列に、本来のもの若しくは相同なもの 、又は宿主細胞に固有でない及び／又は転写されるべきＤＮＡ配列にとって外来 の若しくは異種のものとし得る。宿主細胞にとって固有でないとは、転写開始領 域を含むコンストラクトが挿入されるべき宿主に、転写開始領域が正常では見つ からないということを意味する。ＤＮＡ配列にとって外来とは、対象ＤＮＡ配列 に正常では伴わない転写開始領域のことを意味する。転写開始のための効率のよ いプロモーター要素には、５Ｖ４０（シミアンウィルス４０）初期プロモーター 、Ｒ３Ｖ（ラウス肉腫ウィルス）プロモーター、アデノウィルスメジャー後期プ ロモーター、及びヒトＣＭＶ　（サイトメガロウィルス）前初期１プロモーター か含まれる。 誘導プロモーターも、転写のタイミングを制御するのが望ましい本発明で有用で ある。このプロモーターの例には、β−インターフェロン遺伝子、熱シヨツク遺 伝子、メタロチオネイン遺伝子由来或いはエクジソンリセブターをコードするら のなと昆虫の遺伝子を含むステロイドホルモン反応性遺伝子由来のもの等が含ま れる。このような誘導プロモーターは、インターフェロン又はグルココルチコイ ドなと外部刺激を利用した注入遺伝子の転写を調節するために用いることができ る。真核プロモーター要素の編成はかなり柔軟性があるので、構成的要素と誘導 要素との組合せを使用することもてきる。２つ以上の誘導プロモーター要素の縦 列配置ては、単一の誘導要素て達成できるベースライン上の誘導レベルと比べた 場合に、Ｊ工せられる転写ベースライン上の誘導レベルを上げ得る。 一般に、転写調節配列は遺伝子の転写開始の５°側に約１．５ｋｂまでのＤＮＡ を含むか、これよりはるかに小さくすることもできる。必要があれば、この調節 配列は、部位特異的突然変異誘発により（クンケル（Ｋｕｎｋｅｌ）Ｔ　Ａ、　 １９８５、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｊｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　、　ＵＳＡ、　８ ２．４８８−４９２）　、又は適当な制限部位がＮ末端コドン近くで見つかれは 、連結反応（ライゲーション）によって都合のよいリンカ−オリゴヌクレオチド を導入することにより、希望するタンパク質の最初のコドンに対応する位置で修 飾され得る。理想的な具体例では、互換性のある制限部位を持つコーディング配 列が、遺伝子のコドン＃１に対応する位置で連結され得る。この置換物は、元の コーディング配列に完全に置き換えるようにして挿入され得、従って置換さ′４ また配列は、その３°末端で遺伝子ターミネータ−及びポリアデニル化シグナル と隣接する。 転写エンハンサ−要素は、任意的には転写又は発現カセットに含まれ得る。”転 写エンハンサ−要素”とは、転写活性の基本的な調節因子であり、プロモーター 要素によって転写を増大するように作用でき、しかも一般に転写活性を増強する ためにプロモーターに対して５°方向にしなくてもよいＤＮＡ配列を意図してい る。特定のカセット中に使用されるプロモーター及びエンハンサ−要素の組合せ は、特定作用を最大限発揮させる技術に精通している者によって選択することか できる。様々なエンハンサ−要素を、多様な組織や細胞型における所望レベルの 注入遺伝子の転写及び／又は発現を実現するために用いることができる。例えは 、ヒトＣＭＶ前初期プロモーター−エンハンサ−要素を、ｉｎ　ｖｉｖｏで様々 な組織において高レベルの注入遺伝子の転写及び発現をもたらすために用いるこ とがてきる。 多くの踵からの多様な細胞型中で、連結された遺伝子に高レベルの転写をもたら す池のエンハンサ−要素の例には、ＳＶ４０及びＲ３Ｖ−ＬＴＲからのエンハン ザ−か含まれる。ＳＶ４０及びＲ３Ｖ−ＬＴＲは、必須な構成成分である。二１ １らは特異的作用を有する他のエンハンサ−と組み合わせることもでき、特異的 エンハンサ−を単独で使用することもできる。従って、転写の特異的制御が所望 さイするときは、組織、発達段階又は細胞特異性様式でのみ活性な有効エンハン サ−要素には、例えば免疫グロブリン、インターロイキン−２（Ｈ，−２）及び β−グロビンエンハンサ−が含まれる。組織、発達段階又は細胞に特異的なエン ハンサ−を使って、例えば８９２８球や１９２８球などの特定の細胞型、或いは ミニロイドηしくは赤血球前駆細胞中で注入遺伝子の転写及び／又は発現をもた らすことかできる。或いは、高レベルの転写と組織特異性注入遺伝子転写との両 方をｉ；するために、ヒト嚢胞性線維層膜貫通型コンダクタンス調節物質（ＣＦ ＴＲ）遺伝子に由来のものなと組織特異性プロモーターを、きわめて活性が高く 異種のエンハンサ−要素、例えばＳＶ４０エンハンサ−に融合することができる 。更に、Ｌ　ＣＫのような組織特異性プロモーターの利用は、注入遺伝子転写を １９２８球に向けることを可能にする。１１人遺伝子の組織特異性転写は、標的 組織以外の組織で注入遺伝子の転写か生しると有害な場合に、特に重要である。 ２つ以上のエンハンサ−要素又はエンハンサ−要素の組合せの縦列（タンデム） 反復は、単一のコピーのエンハンサ−要素の使用と比べて注入遺伝子の発現を有 意に増大し得る：それ故、エンハンサ−要素は発現カセットにおいて有用である 。 単一プロモーターに隣接する若しくはその内部にある、同−又は異なる供給源か らの２つのエンハンサ−要素の使用は、ある場合では、個々のエンハンサ−が単 独で効果を有する各組織中ての注入遺伝子発現をもたらすことができ、それによ って転写か達成される組織の数が増加する。他の場合では、２つの異なるエンハ 〉サー要素の存在が、エンハンサ−効果の沈黙化（サイレンジング）を起こす。 特別に希望する発現の効果又は組織について、エンハンサ−要素の特定の組合せ 方を評価することは、当該技術分野のレベル内である。 一般には転写及び／又は発現カセットにイントロンを含める必要はないが、静脈 内又は腹腔内投与された注入遺伝子の高レベルで且つ広範囲のｉｎ　ｖｉｖｏ転 写及び／又は発現を得るために十分な介在配列によって離間された５°スプライ ス部位（供与接合部）及び３′スプライス部位（受容接合部）を含むイントロン を、任意的に含めることもてきる。概して、約１００ｂｐの介在配列は、希望す る発現パターン及び／又はレベルをもたらすが、希望する結果を得るために、必 要に応して配列の大きさを変えることができる。任意的なイントロンをコーディ ング配列の５°側に置くと、注入遺伝子の高レベルで且つ広範囲なｉｎ　ｖｉｖ ｏ発現がもたらされるが、発現をｉＪ）るためには一般に必要ない。最適なのは 、ｍＲＮＡ配列が誤ってスプライスされる結果をもたらす潜在スプライス部位を ５゛イントロンが特異的に欠損していることである。 これか用いられた場合、それぞれ５°から３°に編成されたイントロン・スプラ イス供与部位とスプライス受容部位が、転写開始部位と翻訳開始コドンの間に配 置される。或いは、介在配列は翻訳終結コドン及び転写ターミネータ−の３゛側 叉はコーディング領域の内に配置し得る。イントロンは、介在配列との混成イン トロン又はゲノムコーディング配列から取ったイントロンとすることができる。 コーディング領域の３゛側のイントロン、ｌｏｏｂｐ未満のもの或いは潜在スプ ライス部位を含む全てのイントロンは、一定の条件下でｉｎ　ｖｉｖｏでもたら される注入遺伝子発現のレベルを実質的に低下し得る。しかし、イントロンを欠 くベクターを用いると、予期せずして、注入遺伝子の高レベルのｉｎ　ｖｉｖｏ 発現を達成する二とができる。従って、１０ｖＩｖＯトランスフエクシヨンでは 、このようなベクターは特に関心がもたれる。 転写及び／又は翻訳開始調節領域の下流で且つその制御下には、対象の核酸配列 を挿入するための多重クローニング部位があり、対象の核酸配列は、宿主の表現 型の１以上の変更をもたらし、例えば、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、嚢 胞性繊維症、癌、心臓疾患、自己免疫疾患及び多くの生命危機の感染に要求され る治療を劇的に改良する。便宜上、多重クローニング部位は、有効な方法で核酸 配列の多様性のために使用できる。クローニング部位に挿入される核酸配列は、 リホザイム配列をコートすることができ、又はポリペプチド例えば、酵素活性を 有するタンパク質をコードすることができるが、但し、コード化配列がペプチド をコートする場合に、適当なｍＲＮＡ分子の生成を遮断し、及び／又は異常なス ブチイス若しくは異常なｍ　ＲＮ　Ａ分子をもたらしてしまう潜在スプライス部 位をり（く・＼きである。ポリペプチドは、細胞内的に活性があるもの、膜通過 型タンパク質とすることができ、また分泌タンパク質とし得る。変異タンパク質 例えば、Ｉｔ（’？’：’＋につ）泌さ第１るが、細胞内的に作用するように変 更されているものにもすることかてきる。核酸配列はＤＮＡにすることができる ；ゲノム配列に相補的な配列（゛アンチセンス配列“）とすることもてき、ここ で、該ゲノム配列は１以上のオーブンリーディングプレー１６、インＩ・ロン、 非コード化リーダー配列又は相）１１ｉ的配列か転写、伝令ＲＮＡプロセッシン グ例えばスプライシング若しくは翻訳をｆ’Ｊｌ害し得る他の配列とすることも てきる。 Ａ　Ｉ　Ｄ　Ｓ　（））１１３療０）ｆ：メニ、ｆＡＬＴＡＴ、ＲＥＶ、ＴＡＲ 又１！他（Ｄｆｆｉ要ｆ、ＣＩんＨＩＶ配列を、特に、Ｔリンパ球、マクロファ ージ及び単球において適当なコード配列の発現のために用いることができ、これ を、適当なコード配列のｉｖ投与後に達成することがてきる。Ｉ、て、ｍＲＮＡ 　（ＨＩＶ−ＲＥＶ若しくはＢＣＲ−ＡＢＬ配列にン１するもののようなアンチ センス又はリボザイム配列）をコードするＤＮＡ配列又はヒト細胞において、Ｈ ＩＶ遺伝子の宿主細胞ゲノムＤＮＡへの組み仏み、Ｉ−（Ｉ　Ｖ配列の複製、Ｈ ＩＶタンパク質の翻訳、ＨＩＶｍＲＮＡのプロセッシング又はウィルスバッケー シングを特異的に妨害するトランスドミナント負方向変異体（けａｎｓｄｏｍｉ ｎａｎｔ　ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｍｕｔａｎｔ）のようなタンノくり質をコードす るＤＮＡ配列を■いることができる。 野ｅＪ’、ｓ”；のコンダクタンス調節物質（ＣＦＴＲ）遺伝子の嚢胞性繊維症 患者の肺における発現は、嚢胞性繊維症の治療に用いることができる（コリンズ （Ｃｏｆｆｉｎｓ）、（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５６＋７７４−７８３を 参照のこと）、ＣＦＴＲのｃＤＮＡは、ミシガン大学のフリンス博士とトロン！ ・病気小児病院（Ｔｒｏｎｔｏ　５ｉｃｋ　Ｃｈｉ　１ｄｒｅｎ’　ｓ　Ｈｏ５ ｐｉ　ｔａｌ）からｉ（することがてきる。 野１’、Ｌ％！！　ｐ　５３の遺伝子がない又は異常に発現している癌患者の腫 瘍における野１９！ｌＩ′！ｐ　５３の発現は、これらの患者の治療の方法とし て用いられることができる。 ｐ５３は、ジョン・ホブキンス大学の）第一ゲルシュタイン（Ｖｏｇｅｌｓｔａ ｉｎ）博士から人丁可能である。癌治療の他の方法には、過剰発現しトランスフ オームしている癌遺伝子例えば、腫瘍中のｍｙｃ又はｒａｓに対するアンチセン ス配列の転写か含１イする。 ・″ノイルス性肺炎は、かなりの若年及び老年層の死及び障害の主な原因となっ ている。タンパク１ｑ例えば穎ｗ球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−Ｃ ３Ｆ）は、免疫無防備状態の患者の告髄からの白■酊球の生成を刺激するもので あり、こイ１は、ウィルス感染の進行を調節することにを川どなり得る。特に、 遺伝子移入により誘導されるＧＭ−Ｃ３Ｆは、ウィルス性肺炎の発生の危険性に 対する予防条件及びこの感染の治療のための治療的条件どして作用するであろう 。ＧＭ−Ｃ３Ｆはまた顕著な抗腫瘍活性ら有する。 λ１象となる核酸配列の池の例には、ＬＤＬ　（低密度リポタンパク質）リセブ ターをコートするもの、これは特に１６１清コレスプロールを下げ、血清フレス テロールしベルの」１昇に伴う患者の心臓発作の危険性を減らすことができる； 肺血症、慢性間＋ｉリウマチ及び喘壱、を含む感染に関する状態の治療としての ＩＬ−１リセプターをダウンしギュレートするアンチセンスＩＬ−１リセブター のような配列、循環しベルが冠状動脈疾患（ＣＡＤ）の危険に関連するアポ（ａ ）をコードしている遺伝子のダウンレギュレータ１ン：並びに、多発性硬化症に おけるミニリン又は自己免疫疾患における他の標的を攻撃する活性化Ｔ細胞クロ ーンの活性を；！１ＩＪｉする遺伝子が含まれる。ミニリンをｕ！熾して攻撃す るように活性化されるＴ細胞リンパ球クローンは、アンチセンス配列、リボザイ ム配列又は、ミニリン鞘′ｍＩ胞の認識及び／又は攻撃を仲介するＴ細胞リセブ ター成分のＴ細胞上での表面発現を特異的に遮断するトランスドミナント負方向 変異体コードする注入遺伝子を用いることによって、標的化することがてきる。 他の有効な治療用核酸配列は、本発明を用いてｉｎ　ｖｉｖｏで適当な細胞にお いて発現することができ、これには、スーパーオキサイドジスムターゼ活性又は カタラーゼ活性を有し、酸化剤障害から肺を１象謹する分子をコードする核酸配 列；ブロスタザイクリン及びプロスタグランジンＥ２を生成する内皮性プロスタ グランジンシンターゼ；並びに、アンチプロテアーゼα−１了ン千トリプシン、 及びエリスロボイエチンが含まれる。 用いられる終結領域は、終結領域が比較的交換可能のようであるため、都合のよ いものとする。終結領域は、意図された対象核酸配列本来のものでも、他の供給 源から誘導したものでもよい。都合のよい終結領域が利用でき、遺伝子ターミネ ータ−の３°末端及び、５゛側の調節領域を得た同一遺伝子からのポリアデニル 化ツク′ナルを或いは、異なる遺伝子からのターミネータ−及びポリアデニル化 シグナルをＩｌｌ用しても同し１工な結果が得らＪｔｌＱる。転写後ｍＲＮＡの 安定性を調節する特定配列をｌｆ：Ｌ！的に含み得る。例えば、特定のポリＡ配 列（ヴオロック及びホウスマン、（ｅｌｆ　（１９８１）２３：５０９−５１４ ）及びβ−グロビンｍＲＮ八へ素はｍＲＮＡの安定＋’ｔを高めることができ、 一方、ｍＲＮＡ中の特定のＡＵ富裕配列は、ｍＲＮＡの安定性を下げることがで きる（シューら、Ｇｅｎｅｓ　ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌ、　（＋９８０）　３：６Ｏ −７２）。更に、特定の用途においてｍＲＮＡの半減期が短いほうが好ましい場 合には、３°非コード化領域のＡＵ領領域便ってｍＲＮＡを不安定にしてもよい 。 該コンス１−ラクトには、選別のための配列として、例えばネオマイシン耐性遺 伝子若しくはンしトロ葉酸しダクターゼ遺伝子及び／又は、異なる細胞性成分を １７的どじ若しくは野性間の配列がない場合には分泌する組換えタンパク質を発 生ずるためのノブナル配列を含み得る。様々なシグナル配列が全て用いられ、こ れは’ｉｔＲによく知られている。シグナル配列は、新たなワクチン戦略の形成 を可能にし、又はトランスフオームした癌遺伝子のような特異的再表面リセブタ ーに向かう可溶性拮抗剤を製造し辱る。選別のための配列は、別のプラスミドに 置くことかてき、治療性核酸を運ぶプラスミドと共に同時トランスフェクトする こともてきる。キャリアを使用する場合には、選別プラスミドを異なるキャリア と又は治療性プラスミドと同一のキャリアと複合体し得る。 ある場合には、高しベルて宿主細胞ゲノムＤＮＡへ注入遺伝子の組み込みによっ て又は安定なエピソーム形態でｉｎ　ｖｉｖｏで細胞の核での注入遺伝子の永続 化に、よって、ｉｎ　ｖｉｖｏで長期にわたる注入遺伝子効果をもたらすコンス トラクトを使用することが望ましい。所望する場合、ｉｎ　ｖｉｖｏで宿主細胞 のゲノムＤＮＡへの注入１！伝子の組み込みは、直鎖形態て注入遺伝子（コード 領域のみても、５°及υ・３゛側節配列を１１！うコード領域でもよいが、プラ スミド配列の存在は伴わない）をｆ’Ｊ！フすることによって利用さ第１得る。 精製レトロウィルス酵素例えば、ＨＩＶ−Ｉインテグラーゼ酵素を脂質キャリア ーＤＮＡ複合体へ取り込むことによって、ゲノムＤＮＡ−＼の注入遺伝子組み込 みの発生率を更に増加し得る。適当な隣接（フランキング）配列が、注入遺伝子 ＤＮＡの５°及び３゛末端に置かれる。これらの７ランキング配列が、１−１１ 　Ｖ　−１インテグラーゼの存在下て宿主細胞ゲノムＤＮＡ−＼ＨＩＶ−１のＤ ＮＡの組み込みを仲介することが示されている。或いは、ウィルス例えばニスブ タイン−バールウィルスの非ｌ・ランスフォーミング配列並ひに、咄乳動物細胞 において異ｆ！ＲＤＮＡをプラスミドとして複製させるために十分ど思われるｏ ｒｉＰ及びＥＢＮ八−１のような配列を含むコンストラクトを使用することて、 ｉｎ　ｖｉｖｏにおける外来核酸の発現の持続期間を延長することができる（ブ ハンス（Ｂｕｈａｎｓ）ら、Ｃｅ１ｌ　（１９８６）　５２：９５５）。 宿主への導入後に宿主細胞への直接的なりＮＡ取り込みでの使用のために、５゜ 末端でプロモータ及び調節配列と３゛末端でターミネータ及び調節配列とに隣接 している組換えツー１’配列は、好適なりローニングブラスミド（例えば、ｐＵ Ｃ１８、ｐＳＰ７２）へ導入され得る。宿主へ導入されるときに裸の核酸が、血 液中の脂質キャリア例えばカイロミクロンど会合することによって、ヌクレアー ゼによる分解（消化）から作置されるということが、本発明の理論である。従っ て、より効率的なトランスフエフシコンは、血中の脂質が食物の消化後で上昇し たしベルにあるときに；！成される。 （シ酸フンストラクトは、キャリア例えば脂質キャリア特に、陽イオン性脂質キ ャリアと複合化（錯体化）して、１Ｍ合体を形成し得る。複合体とは、発現カセ ット又は転写カセットを含むプラスミドのような核酸コンストラクトと脂質混合 物との間での会合を意図する。複合体の物理的形態は、リポソームの外側に複合 化するか若しくはリポソームの内部に取り込まれた核酸を有するリポソーム、又 は間に挿入さらだ脂質及び核酸の形態とし得、或いは、上記物理形態の幾つかの 若しくは全ての混合物とし得る。静脈投与のために、一般には、該混合物を、使 用さ第１る脂質混合物を音波処理し、その後、音波処理済混合物と該核酸とを適 当なりＮＡ　脂質比て生理的に許容可能な希釈剤中で、使用の直前に混合して調 製する。該脂質キャリアは、神々の陽イオン性脂質から製造されることができ、 これには、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＴＭＡ、ＤＤＡＢ、Ｌ−ＰＥ等が含まれる。陽イオ ン性脂質例えば、　゛リボフエクチン”として知られるＮ［Ｉ−（２，３−ジオ レイロギノ）プロピル］　−Ｎ、　Ｎ、　Ｎ−）リエチルアンモニウムクロライ ド（ＤＯＴＭＡ）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムフ゛ロマイド（ＤＤＡ Ｂ）、１．２−７オ１・オイロキノ−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン（ ＤＯＴＡＰ）又はリノニルホスファチノルエタノールアミン（Ｌ−ＰＥ）と、ｖ ｃ２脂質例えばジオしオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）又は コレステロール（Ｃｈ　ｏ　Ｉ　）とを含有する脂質ギヤリアは、特に対象とな る。ＤＯＴＭＡ合成はフエルナー（Ｆｅｌｇｎｅｒ）らＰｒｏｃ、　Ｎａｊｌ、 Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　、　ＵＳＡ、　、　（１９８７）　８４ニア４１３−７ ４１７■L載され ている。ＤＯＴＡＰ合成はスタマタトス（Ｓｔａｍａｔａｔｏｓ）ら、Ｂｉｏｃ ｈｅｍｉｓｔｒｙ　（１９８８）２７１３９＋７に記載されている。ＤＯＴＭＡ ：ＤＯＰＥ脂質キャリアは例えばＢＲＬン１から購入てきる。ＤＯＴＡＰ　：Ｄ ＯＰＥ脂賀キャリアはベーリンガー・マンハイＬ？１から購入できる。コレステ ロール及びＤＤＡＢはシグマ社から市販されている。ＤＯＰＥはアバンチ・ポー ラ−・リピド（Ａｖａｎｔｉ　Ｐｏ１ａｒ　Ｌｉｐｉｄｓ）社から市販されてい る。ＤＤＡＢ＋ＤＯＰＥはプロメガ社から購入できる。生分解性陽イオノｔ１両 親媒物らまた、使用することができる（例えば、同時係属ＰＣＴ出願、代理人整 理番号ＭＥＢ＋−００２１００ＷＯ１１９９２年１２月１７日出願を参照のこと ）。 脂質ギヤリア例えは陽イオン性リポソームは、核酸を培養系で広範囲の細胞へ送 ｉｔすることによって、注入ｊｎｎ吊子はｍＲＮＡの高レベルでの細胞性発現を 仲介することができる。特定の陽イオン性脂質の使用は、ｉｎ　ｖｉｖｏ送達の ための特殊ｌｉ利点を確立てきる。例えば、ＤＯＴＡＰ含有リポソーす若しくは エチルホスファチジルコリン（Ｅ−ＰＣ）脂質キャリアに複合化した核酸の静脈 注入は、主として肺に注入遺伝子の発現を向けることができる。その上、ＤＯＴ ＡＰと、Ｌ−ＰＥ及びコレステロールエステルβ−アラニン（ＣＥＢＡ）とは、 細胞によって十分に代謝されるが、ＤＯＴＭＡは細胞によって十分に代謝されな い。従って、ＤＯＴＡＰ、Ｅ−ＰＣ及びＬ−ＰＥは、ＤＯＴＭＡと異なり、哺乳 宿主への反復１４：人に適している。更に、陽イオン性脂質と第２脂質とを含む 脂質キャリアを用いる場合、特にコレステロール又はＤＯＰＥがｉｎ　ｖｉｖｏ での注入遺伝子の発現をｎ大にする二とができる。また、ステロイド例えばコレ ステロールをＤＯＰＥの代わりにＤＯＴＡＰ、ＤＯＴＭＡ若しくはＤＤＡＢと混 合することは、実質的にｉｎ＼甲・０における注入遺伝子の発現を増加する。 投与の経路及び投与の部位に依存して、特定の細胞及び組織が標的にされ得る。 例えは、＋ｍ流の方向て注入部（！ｒに最ら近い組織のトランスフェクションは 、如何なる特殊な標的化もなくトランスフェクトされ得る。更に、所望するなら ば、部質−１゛−ヤリアは部位Ｉｆｆ向性分子（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｉｎｇ 　ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）を用いて特定の型の細胞へ該複合体を指向するように改 変され得る。従って、特定のりセブター又は他の細胞表面タンパク質に対するＩ Ｊ＋、体又はリガンＦが、特定の表面タンパク質と会合さ４また標的細胞と共に 用いられ得る。例えばＡＩＤＳウィルスは主としてＣＤ４表面タンパク質を有す る細胞に向かう。脂質ギヤリアの表面に結合した抗ＣＤ４抗体をｔ！！持するこ とによって、核酸脂質キャリア複合体はＴヘルパー細胞に主どして向くことがて きる。 １ν定リガンド又はｌ＋’ｃ体は、部位指向性分子をｌ１ｔｔ’ｌ’ｌに結合す ることによって、又は部位１行向性成分の機能性部位（【聞ｃｊｉｏｎａｌ目ｙ ）を連結するために該二重膜に存（ｆ：する１１ケ質−ヒの連結１ｋをｔＪＬ（ ｊｌすることによって、慣用の方法により脂質に結合さ第１ることができる。こ のような技術は当業者にはよ（知られている。リガント′指向＋１　Ｄ　Ｎ　Ａ −多価間イオン１ｙ合体が、静脈注入後に肝臓の肝細胞へトランスフェクトする ことが示されている：この手段によって他の細胞型又は組織型をトランスフェク トする能力は、糺明されていない。 非陽イオン性脂質キャリア、特にｐＨ感受性リポソームは、ｉｎ　ｖｉｖｏ遺伝 子治療のための池の魅力的な手段の可能性を提供する。しかし、陽イオン性リポ ソームに比−＼て、ｐＨ感受性リポソームは、ＤＮＡの被包化及び細胞内でのＤ ＮＡの送達において効率か劣り、血清のｒｔ存在下不活化し得るので、静脈内に おける使用が制限さイする。 多数の因子は、トランスフェクトされた組織における発現量に作用することがで き、従って、特定の目的に合うように発現のレベルを変更するために用いられｉ ｑる。高レベルの発現が望ましい箇所では、全ての因子を最適化することができ 、わずかな発現が望ましい箇所では、１以上のパラメータを変更して所望のレベ ルの発現を得ることができる。例えば、高い発現が治療範囲（ｔｈｅｒａｐｅｕ ｔｉｃ　ｗｉｎｄｏｗ）を越える場合には、最適よりも少ない条件を採用するこ とができる。変更することかできる因子は以下のものがある： 注入さ第１る複合体の脂質組成又は脂質キャリアの平均直径（粒子形状例えばり ボ゛ノームの場合）は、ｉｎ　ｖｉｖｏでもたらされる注入遺伝子発現のレベル に劇的にず′１川することができる。従って、リポソーム脂質組成物は、一般に 、非陽イオン性脂質に対して５０９６モル比の組成の陽イオン性脂質を有するが 、５％から１００Ｑ６のＷもとることができる。脂質キャリアの直径は、一般に 、１１００ｎから１０μｍの範囲内にするべきである。脂質キャリア範囲がＩｏ ｏｎｍから数μｍの直（Ｖの陽イオン性賭質キャリアーＤＮＡ複合体は、哺乳類 宿主への全身性膜Ｃ−１後に、かなりのレベルの注入；！１伝子発現をもたらす ことができる。 ５００ｎｍを越える脂質キャリアの使用（言い換えれば多重ラメラ小胞（ＭＬ＼ ７）又は大半ラメラ小１１ｆｉ（ＬＵＶ））は、小車ラメラ小胞（ＳＵＶ）と比 較した場合、ある場合には、哺乳宿主において達成される注入遺伝子の発現のレ ベルを有意に増加することができる。ＭＬＶ及びＬＵＶは乾燥脂質フィルムに水 性物質をｌｆＳ　ＩＪＩＩ　した後に、音波粉砕よりもむしろポルテックス処理 によって製造される。粒子を１！２用しようとするならば、得られた脂質キャリ アを、決まったサイズのポリｈ−ホネート膜を通して高圧下て押し出して、特定 の用途のためにより均一なサイズ分布に達することがてきる。 特定の咳酢対脂質キャリア比の使用は、また、トランスフェクションの景及び／ 叉は＞ｌ象となる核酸配列の転写及び／又は発現のレベルを増加することもてき る。用いられる比が、注入遺伝子がｉｎ　ｖｉｖｏで発現するか否か及びそのレ ベルを規定し、従ってこれを最適化することができ、これはフンストラクトの性 質、脂質キャリアのサイズ及び脂質組成物並びに、ＭＬＶかＳＵＶか、投与の経 路及び宿主哺乳動物を含む陳々の因子に１Δ存する。例えば、リポータ−遺伝子 であるＣＡＴ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）を用いれば 、約Ｉ：１（０，５：Ｉから２＝１の範囲）のＤＮＡ対脂質キャリア比（μｇＤ ＮＡ対ｎｍｏ１の陽イオン性脂Ｖｔ＞は、ｌＩｗ腔投与後の全ての器官において 、マウスで最も高い遺伝子発現をもたらし、約１＝４比（２：ｌからｌニアの範 囲）は、静脈投与後の全ての器官において最も高いレベルの遺伝子発現をもたら す。最適条件を用いた広範囲の組織での高いレベルの注入遺伝子発現の達成に加 えて、肺、神職、す／バ節及び骨髄に存在する全ての細胞の大部分は、心臓に存 在する全ての内皮細胞の大部分と同様に、ｉｎ　ｖｉｖｏでトランスフェクトさ れる。 ＤＮＡ−脂質キャリア比は、注入遺伝子が該複合体の全身性投与後の哺乳宿主に おける発現レベルを決定する。いくつかの因子が、所望の特定発現レベルのため のＤＮＡ　：脂質キャリア比を最適化するので重要である。従って、特定のＤＮ Ａ　脂質キャリア比が、ｍいられた個々の脂質キャリアサイズ毎と、用いられた 陽イオン性脂質のタイプ１１に必要である。用いられた脂質キャリア組成物毎に 、ｎ人発現を最適化するため、ＤＮＡは、ＤＮＡ・脂質キャリアｍ合体の凝集を もたらす比を最初に決定するために、６：１から１：１０（μｇのＤＮＡ対ｎｍ ｏｌの陽イオン性脂質）の範囲となる、１３！数の異なる率で脂質キャリアど共 に混合される。凝集をもたらす比は、ｉｎ　ｖｉｖｏでは用いることができない 。凝集をもたらさない比は、１ｎｖｉν０での所望の注入遺伝子の発現レベルを 確保するＤＮＡ：脂質キャリア比を決定するために、動物モデルにおいて試験さ れる。例えば、ＤＯＴＮ＝Ｉ△：ＤＯＰＥ、ＤＤＡＩ３：ＤＯＰＥ、ＤＯＴＡＰ ・ＤＯＰＥＳＤＯＴＡＰ：コレステロール、Ｌ−ＰＥ　：ＣＥＢＡＳＤＤＡＢ　 ：コレステロール及びＬ−ＰＥ：ＤＯＰＥ＋、：おけ６ＳＵＭ）ｉ適ＤＮＡ：脂 質ギ−？す７比は、各々、１：４．１゜３、（全ての比てかなり低い活性）、ｌ ：６、ｌ：ｌ、ｌ：５及び２：１である。 ＤＮＡ　脂質キャリア１ｙ合体は適当な生理学的溶液中で作製されなければなら ない。ＤＮＡ　脂質キャリアｍ合体は、それ自ｌＤＮＡ−脂質キャリア複合体の 凝集を誘導しない生理溶液（約２９０ミリ浸透圧モル）に混合される。この溶液 は、水又は通常の生理塩水中に５％のデキス１−ロースを含む。陽イオン性脂質 キャリアの対する細胞表面リセブターは、ｐ１ｎ乳類宿主における注入遺伝子発 現の標的細胞特異性を調節及び提供を共にするために用いられ得る。陽イオン性 脂質キャリア　Ｄ　Ｎ　Ａ　１１合体は、陽イオン分子に対して特異的な結合部 位を含み且つこれを吸収することができる細胞表面リセブターを用いて、伝統的 なりセブター仲介エン１−ザイトンスによって細胞に取り込まれる（図７参照） 。従って、薬剤例えばサイトカイン、成長因子、他の可溶性タンパク質及び特定 の薬物を用いると、選択的にニオ１らの陽イオン結合リセブターをアップ又はダ ウンレギュレートすることか可能になる。適当な薬剤によるこれらリセプターの アップ又はダウンレギュレーノ９ンの速度は、特定細胞のｉｎ　ｖｉｖｏにおけ るトランスフェクションのレベルの」−げ下げの選ＩＲを可能にする。裸のＤＮ Ａに対する細胞表面リセブターは、１１＋Ｔｉ　ｆＬ動物宿４−内の遺伝子導入 発現における漂的細胞特異性を、調節及び確保を共にするために用いらねること がてきる。 ブ→スミトＩ）ＮＡに複合化された、単及び多重ラメラ脂質ギヤリアのいずれか であるｌ）　（］　’ｒ　ｌ＼・！Ａ脂貿−１−ヤリアと、種々の細胞型（例え ばＣＶ−１サル腎臓細胞、Ｕ９３７ヒト骨髄１１１球白血病細胞、Ｋ　５６２、 ＭＥＬ（マウス赤芽球白血病細胞）、：）ノド袖胞＼・タロファージ及び肺胞１ １！Ｓ！細胞）どの間の最もよく起こる相互作用は、脂質キャリアトｊｒ１及び 吸収によるしのである。この相互作１旧」、リセブター仲介エンド４Ｊイトソス のよく研究されている例に共通している。陽イオン性脂質２１゛１り了　＋）　 Ｎ　Ａ　Ｌ！会合体１と触するような全ての細胞が、形質膜への該複合体の結合 後に複合１トをｊＨ取する。これらの細胞型の全てか、同一の伝統的リセブター 仲介エンド（ノイトンス的な吸収経路を証明している。 哺乳動物宿主は、全ての動物、特に遺伝子関連疾患又は、遺伝子関連治療を受け ることか可能な感染疾＋１−の症状を有する動物てあり得る。従って、適用対象 は、家畜、＆１育！ＩＪｌ物例えばウシ、ヒツジ、ブタでも、霊長類特にヒトで も使用される。 ＩＩＩＩｉ？Ｌ！ｌｌｌ１１１１１宿−１−は妊娠さ４１（１、遺伝子関連治療 の意図されたレシピエンＩ・は、妊娠したメス及び胎児のいずイ１か又は両方と し得る。　本発明の方法では、ｉｎ　ｖｉｖ。 １・うンスフェタノｊンは、ｌｆｉ療川転用又は発現ベクターを哺乳動物宿主へ 、裸のＤＮＡと脂質キｔ・リア特に陽イオン性脂質キャリアと複合されたＤＮＡ とのいず１１かを尋人することによって得られる。コンストラクトＨ１持叉はｉ ｆ：入選１云子のエピソーム発現のために、宿主細胞ゲノムへ組み込むためにＩ Ｊ，＋１４１，されＩＱる。Ｉｌ＋１乳動物宿主への導入はいくつかの経路のい ずれかによってさ４１ｉ！７、これには、静脈（桑試は腹腔注入、気管内的、鞘 内的、腸管外的、動脈内的、の腔内的、筋肉内的、局所的、経皮的、全ての粘膜 表面からの投入、角膜点滴等が含まれる。１ｈ療ＩＩＩ発現ベクターのｉｌｉ’ ｉ環体液又は休日若しくは体腔例えば肺、大腸、膣等・＼の導入が特に対象とな る。従って、静脈投与及び気管内投与は、ベクターかこのような投与経路の後に 広く拡散し得るので特に対象となり、また、工了ロノ゛ル投与は休日又は体腔へ の導入に用いられる。全て生理学的に許容可能なりｙ：　ｆ．ＩかＤＮＡ又は脂 質キャリアの投与のために用いられ得、これには、例えば脱イオン水、生理塩水 、リン酸緩衝液、５％デキス］・ロース水溶液等が含まれ、こイ１らは投１ｊ杆 路に依存する。池の成分がこの配合に含まれ得、例えば緩衝液、安定剤、殺生物 剤等である。これらの成分は、文献において広く例示が認められ、特にユニでの 説明の必要はない。エムＮ合体の凝集の原因となる全ての希釈剤又はＫｉＴＩ＜ 削成分は、避けるへきてあり、こ川こは、高濃度塩類、キレート剤等が含まねる 。 用いら４する裸のＤＮＡ又はＩＸ！合体の瓜は、ＤＮＡ又は複合体が血流へ侵入 した後、１１Ｕ　／７の組織への適当な散布がもたらされるために、及びトラン スフェクトされた組織における治療的なレベルの発現をもたらすために、十分な ものとする。 治療レベルの発現は、宿主咄乳類の疾患又は感染を予防、処置又は緩和するため に１分な量の発現である。更に、用いられる核酸ベクターの量は、ｉｎ　ｖｉｖ ｏにおいてに１象の組織での所望のレベルでの注入遺伝子発現をもたらすために 十分なものどしなければならず、例えば２１ｍｇの発現プラスミドのみを、マウ スへ注入すると、多数の組織においてＣＡＴ遺伝子の高レベル発現がもたらされ る。他のＤＮＡ配列例えばアデノウィルスＶＡ遺伝子は、投与媒体に含有される ことができ、ン・１象Ｊｎ伝子と共にトランスフェクトされることができる。ア デノウィルス■Δ逍伝了をコーＩ・する遺伝子の存在は、これか所望されれば、 プラスミドから転写さ，１またｍＲＮへの翻訳を有意に促進し得る。 組み換え遺伝子の発現のレベル及び組織は、ｍＲＮＡレベルで及び／又はポリペ プチド若しくはタンパク質のレベルで測定され得る。遺伝子産物は、組織におけ る生物活性を測定することによって定量され得る。例えば、酵素活性は、生物学 的アッセイ又は、免疫染色技術例えば該遺伝子産物若しくは発現カセットに存在 するりポーター遺伝子産物を特異的に認識する抗体を用いたブロービング（釣り 上げ）によってトランスフェクトされた細胞中の遺伝子産物を同定することによ ーって、測定されることかできる。或いは、該遺伝子産物の潜在的治療効果は、 例えは対象ＤＮＡ配列がＧＭ−ＣＳＦをコードする場合には、ＧＭ−ＣＳＦ注入 遺伝子を発現する致死量被爆動物の生き残りにおける遺伝子発現の効果を測定す ることによって、測定することができる。注入遺伝子産物の有意量の生成は、こ れらのマウスの生き残りを実質的に延長する。 ポリペプチド／タンパク質の発現又はｍＲＮ八自へさえも、宿主における変化し た生化学的表現Ａ２を確保する場合、新しい表現型の存在又は古い表現型の欠失 はｌ？ｉ″Ｉ＋ｌＩｉされｆｑる：例えば宿主細胞のトランフエクションの結果 として、以前に不１分な晴で生成されていた既Ｃγの所望産物の生成が増進され 得、又は、アンチセンス、リポザイム又はＪ（同１１１１制技術を用いて望まし くない遺伝子産物の減少又は史なる１１１１制が起こりｉ！する：抑制の場合で は、遺伝子産物の減少が測定され得る。 ζｔ，′通、治療カセットは、宿主細胞ゲノム・＼組み込まれない。必要であれ ば、治療は、達成さイする結果にｌ＆ｒｒした１旧ｉ’ｊ＋＝応して、繰り返さ れることができる。治療か繰り返される場合、ＩＩ＋ｌｉ乳！ｌｌＩＪ物宿主（ 封ｔｉ療）こ対する不利な免疫応答又は他の応答かないことを確保するためにモ ニターされる。 例えは、１．５定の疾患状態を治療することが望まれている臨床環境では、治産 様式の４し物学的効能と臨ｉｙ的効能とか、可能であれば共に評価されることが 必要である。１９１１えは、嚢胞性ｍ１１１．症の治療では、広汎性上皮性機能 不全があり、これは、気」ｎ．汗腺、腸及び生殖路並びに膵臓の管腔液又は“分 泌物”の電解質及び水分含１ｋにおＩＪＩる異常としてそれ自身が示される。従 って、遺伝子治療の生物学的体１１ヒは、例えは治療１１１１及び）１１互作用 後に、上皮間の電位の差を測定することによって、５・「摘することができる。 評価は、鼻細胞のトランスフェクション後に及び肺細胞のトランスフェクト・Ｊ ン後に実行され得る。呼吸上皮と嚢胞性繊維を横切って１物ＴＬ泣の差を測定す るために用いることができる技術の例には、ノウレス（Ｋｎｏｌｖｌｅｓ）ら、 （１９８１）Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｇｅｎｅｒａｌ　ｏｒ　Ｍｅｄｉｃｉｎ ｅ　３０５：１４８９−１４９５　：mウレ スら、（１９８３’）　Ｇｅｎｅｒａｌ　ｏｆ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｌｎｖａｓ ｌｉｇａＬｉｏｎ　７１：１４１０−１４１７　；ノウレス轣A （１９８３）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２１＋１０（ｉ７−１０７０に記載されている ものがある。臨床的効能は、注Ｌ」される欠陥の治療か疾患の遜り８を変えるこ とに有効であるかどうかであり、こ４１を測定することは更に困難になり得る。 生物学的効能の評価が臨床的効能のための代わりの終点として実行されているが 、最終的なものではない。従って、例えは６力月の肺機能のｆｆｔ＋票となるい わゆる”肺活量測定“因子のような臨床的な終点をｉｌｌ．ｌ＋定することは、 治療レジメンの臨床的効能の指標となり得る。典型的なδ１１定には、Ｉｌｌｌ ｉの努力肺活．ｆｉ　（ＦＶＣ）及び１秒間の最大努力吸気肺活１（ＦＥＶ）か 含まねる。嚢胞性繊維症のための遺伝子治療の効能を評価するために実行できる 臨床研究のタイプの１例は、肺疾患及び嚢胞性繊維症の治療のためにアミロライ ）・について使用されているものである；ノウレスら、（１９９θ）　Ｎｅｒ　 Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｇｅｎｅｒａｌ　ｏ口１ｅｄｉｃｉｎｅ　３２２：１１８９− １１９４。同様に、当業者は、特定遺伝子治療のプロトコールの牛．物学的及び 臨床的体Ｃ１ヒを！ｌｆｌ＋ＩＩｉすることができる。 本組成物は、東以上の手順の使用に提供されることができる。キ・シトには通常 、ＤＮＡが裸のＤＮＡ又は脂質キャリアと複合化されて含まれる。更に、脂質キ ヤ旧′は、ｌｌｊ　（１１、されたＤＮＡと複合化させるために、別容器で提供 され得る。直接投与及び脂質キャリアとの複合化のいずれかのためのＤＮＡ又は 脂質キャリア／ＤＮへ■合体は、使用前に更に希釈され得るＩＩＩ縮物として存 在し得、又は使用濃邸て提（！（され得るが、この場合にはバイアルは、１回以 上の投与量を含み得る。 都合ｌ−、医師又は獣医師がシリンジを直接用い得るように、単一投与量がシリ ンジてＩＪＨ！（され得、これは滅菌容器中に含まれている。ここで、該シ１ル ジは所望の量及び濃度の試薬を有する。従ってキットには、適正な比率の量のＤ ＮＡ又はＤＮＡ／脂質キャリア複合体を含む）Ｘｌｎのシリンジが入っている。 該シリンジが＋１’．ｆ　ｌ＆　Ｉ・ｖｌｌｌのための配合を含む場合、通常、 本方法による使用の際に他の使用試薬を必要としない。 本発明は、多くの疾唐，のｉｎ　ｖｉｖｏ予防、治療及び／又は緩和に使用され る。遺伝子のｉｎ　ｖｉｖｏ　ＩＩ換は、例えば相同組み換え又は異常な遺伝子 の初期ハックアウト及び次の所望注入遺伝子との置換の技術によって達成される ことができる。本発明を用いたｉｎ　ｖｉｖｏて適当な細１１＆における核酸の 発現による更なる利益は、コード化されたタンパク質が、正しい方法でプロセッ シングされて転写後の改変（二ｆ・１さＡすることである。 １記の例は、説明をｎ図したしのであり、これに限定されるものではない。 実施例１　１ｎｖｉｖｏ遺伝子治療のためにプラスミドの調製ｐＲ３ＶＣＡＴ ｐ５’　ＰＲＬ３　ＣＡＴ ｐｓｉｓ−ＣＡＴ １）ＺＮ２０（図５参照） ｐＺＮ２７（図９参照） ｐＺＮ４６（図１０Δ、Ｂ参照） ｐＺＮ３２（図１１参照） ｐＺＮ５１（図１３参照） ｐＺＮ６０、ｐＺＮ６１ＳｐＺＮ６２、ｐＺＮ６３（図１４Ａ、ＢＳＣ参照） １）ＣＩＳ−ＣＡＴ １７１ｊｌｌｉ’ＴＩ　２　脂質ギヤリア及び脂質ギヤリアとの複合化したＤＮ Ａの調製脂質ギヤリアの調製 プラスミド調製 脂質キャリアープラスミドの調製 ＋Ｎ複合 Ｗ娩（９１１３ｐＺＮ２７−ＤＤＡＢ：コレステロール脂質キャリア複合体（図 １参照）の静脈（１ｖ）注入後のｌｌ＋ｌｉにおけるＣΔＴ遺伝子の発現の免疫 組織化学による証明 実施例４　ｐｃＩｓ−ＣＡＴの腹腔投与後の発現実施例５　ｐ５’　ＰＲＬ３− ＣＡＴ：Ｌ−ＰＥ：ＣＥＢＡ複合体の静脈（ｉｖ）注入後のｌＩｌ、ｌｉにおけ るＣＡＴ遺伝子発現の証明ＷＡａｉｌＰＩ６　ＤＯＴＭＡ：ＤＯＰＥ−ｔ−ｐｓ ｉｓ−ＣＡＴプラスミドの注入は、明らかに団ｖｉｖｏて検出可能なＣＡＴ遺伝 子発現をもたらさない。 去Ｍｍｆ？Ｉ　７　Ｄ　Ｎ　Ａ・脂質キャリ判ｙ合体と細胞表面リセブターとの 相互作用（同図２Ａ、Ｂ参照） ’ＪＪｌ１９　マウス造血系骨髄由来細胞がｉｎ　ｖｉｖｏでトランスフェクト されることの証明 実施例１ｏ　正常トナーがら新たに単離したヒトＣＤ４”　−ルパ球がトランス フェクトされることの３１「明（１４４参照）火ｈｂ　（９＋Ｉ±±　ＤＮＡの 陽イオン性リポソーム仲介送達を用いた種々のヒト肺癌細胞味の効率的なトラン スフェクション（図２１参照）四嬶興ニス　陽イオン性脂質ギｔ・リア＝ＤＮＡ １合体の静脈注入によるマウスでの０１１１癌細胞のトランスフェクション（図 ８Ａ、Ｂ参照）’ＪＪｌｆｆｉｌｌ１３　ｐＺＳＮ２７（７）み又ｔｔｐＺＮ２ ７：ＤＤＡＢ：コレステロール５ＵＶ）１合体の静脈（ｉｖ）注入後の、多重組 織における高レベルＣＡＴ遺伝子発現の証明 実施例＋４ｃＭＶ−インターロイキン−２遺伝子と複合化した陽イオン性脂質キ ャリアの静脈注入によるマウスの胛臓及びリンパ節における高レベルのヒトイン ターロイキン−２の誘導 犬膿興±５　ｐＺＮ３２　陽イオン性脂質キャリア複合体のｉｖ投与によって処 置さイまたマウスにおけるヒ！・ＣＦＴＲ遺伝子の高レベル発現の誘導（図１２ Ｅ参照） 方施珂±旦　異なるＣＡＴ遺伝子含有プラスミドの静脈注入後の肺及び腎臓にお けるＣＡＴ遺伝子発現の証明（図１５参照）実施例１７　ＣＭＶ−ＣＡＴ−’Ｊ ボソーム又１；ｔｃＦＴＲ−ＣＡＴ−リポソーム１１合体の各ｉｖ圧注入よって もたらされる広汎性と組織及び細胞型特異性とのＣＡＴ遺伝子発現（図１６Ａ− に参照）実施例１８　プラスミドのみのｉ　ｖ注入と、脂質キャリアと複合化さ れたプラスｉｆ−人は、ｇｒｉ著なｌＩＬ腫瘍効果をしたらすｐＺＮ８４（図１ ７参照） ｊ＝、＆Ｉ＋ｔｌｉ１９１＋　２０　Ｄ　ＤΔＢ、コレステロール（１：Ｉ）リ ポソームに複合化されたｐＺＮ８４のヤギ・＼の静Ｋ（ｉｖ）注入後のｉｎ　ｖ ｉｖｏでの延長された高レベルのマウスＧＭ−Ｏ９Ｆ遺伝子発現（図２２．２３ 参照）愚迦億１シＩ　マウスにおける実験的なウィルス性１４ｉ炎の進行におけ るリポソーム−Ｇｈ・ｌ−Ｃ３ＦプラスミドＩＮ！合体の影響ν通例２２　中枢 神経系への直接的なりＮＡのみ又はＤＮＡ−陽イオン性リボソー７、；ｙ合体の 注入によってもたらされるマウス脳におけるＣＡＴ遺伝子の高レベルの発現（Ｉ Ｎ２０参照） 来車ｔｐ＋＝＞　ｐＲ３Ｖ−ＣＡＴ：Ｌ−ＰＥ：ＣＥＢＡ複合体の静脈（ｉｖ） 注入後の肺におけるＣΔＴ遺伝子発現の証明客棟興竺ユ　ｐＺＮ２０−ＣＡＴ： 　ＤＤＡＢ　：ＤＯＰＥ複合体の静脈（ｉｖ）注入？檻の多重組織にむけるＣＡ ＴＩｆｉ伝了−発現の証明咄ｊＬ埴細胞のトランスフェクションに用いたプラス ミドの詳細は以下の通りである。 ■梗μｓ−さｌＣΔＴ　このブラスミ！・の溝築は、ボルマン（Ｇｏｒｍａｎ） ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａ　ｒ　ｌ。 Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　、　ＵＳＡ、　、　（１９８２）、　７９：６７７７− ６７８１に記載されている。このｐＲ３ＶＣ八Ｔプラへミドには、３’−Ｒ３Ｖ ＬＴＲが、ＣＡＴコーディング配列の上流にプロモータどして並置されている。 ＬＴＲ転写開始部位とＣへＴ開始コドン（關始部位の１：流の最初のＡＵＧ）ど の距離は約７０ｂｐである。 ｐ５’　ＰＲＬ３　ＣＡＴ　このプラスミドの横築は、サカイら、Ｇｅｎｅｓ　 ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｌ　（１９８８）２：１１４４−１１５４に記載 されている。 １）ＳＩＳ”ＣＡＴ・このプラスミドの横築は、ホアン及びボルマン、Ｎｕｃｌ ｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　（！９９０’）　１８：９３７−９４８ に記載されている。 ｐＺＮ２０二のブラスミ！’の構築は、図５に説明されている。このプラスミド は下記のようにして調製した。ｐＣΔＴｗｔ７６０（スティンスキ（Ｓｔｉｎｓ ｋｉ）とロウアー（Ｒｏｅｈｒ）、（１９８５）　Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、、５５：４ ３１−４４１）をＨｉｎｄｌｌｌで処理し、ＨＣＭＶ　ＩＥＩエンハンザ−及び プロモーター要素を含むフラグメントを精製した。 ぞの後、単離フラグメンＩ−を、ｐＳＰ？２　（プロメガ）のｔｌｉｎｄｌ１１ 部位へクローン化してｐＺＮ９を作製した。エンハンサ−及びプロモーター要素 が図５に示さイ１ているクローンをスクリーン（選抜）した。ｐＺＮ９の部分的 Ｈｉ口ｄ］１１消化の後、平滑末端にＤＮＡポリメラーゼＩクレノウフラグメン トを添加した。得られたクローンＩ）ＺＮ１２は、エンハンサ−及びプロモータ ー要素の５′の１ｌｉｎｄｌ１１部位を失っていた。その後ｐＺＮ１２をＮｅｏ 　Ｉ及びＨｉｎｄ［ｌ［で処理し、大きいＮｃｏ　ｌ　−１１ｉｎｄｌｌ１７ラ グメントをｔ＾製し、ｐＢＣｌ　２／ＣＭＶ／ＩＬ−２（クーレフ（〔゛（市ｅ ｎ）、Ｃｅ１ｌ　（１９８６＞　４６：９７３−９８２）由来の精製された小さ いＮｅｏ　Ｉ　−Ｈｉｎｄ１１１フラグメン１−に連結した（ライゲーション） 。ｐＢｃＩ２／ＣＭＶ／ＩＬ−２はＡ　Ｄ　ｌ　６９　ｔ！ｔｌＪＩ来のＨＣＭ Ｖプロモーターを含む。得られたクローンをｐＺＮ１３とした。Ｉ）ＺＮ１３を Ｂａｍ１（ｌて部分消化し、ＤＮＡポリメラーゼＩクレノウフラグメントを添ｔ ｕｔ　Ｌ、得られたクローンをエンハンサ−及びプロモーター要素の５′末端で Ｂａｍ旧部１立を失っているクローンをスクリーンした。得られたクローンをｐ ＺＮ１７と呼んだ。ｐＺＮ１７をＨｉｎｄｌｌｌ及びＢａｍＨＩて処理し、ｉｆ ）ら４またＨｉｎｄｌｌｔ　−Ｂａｍ）（１大フラグメントを精製し、ｐＳＶ２ −ＣＡＴ　（ボルマンら、（１９８２０１ｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏ ｌｏｇｙ、２：１０４４−１０５１）から得られた情製小Ｈｉｎｄ１１１−Ｂａ ｍＨｌフラグメントと連結した。得られたクローンをＩ）ＺＮ２０とした。 ＨＣＭＶ　（Ｔｏｗｎｅ）の完全制限地図は図６Ａに示されている。ＨＣＭＶ　 （ＡＤ＋６９）は図６Ｃに示されている。２つのプロモーターの比較は図６Ｂに 示されている。Ｔｏｗｎｅ抹山米のら由来炊いてＡＤ株由来のプロモータを用い た場合に、実質的により高い発現が得られる。ｐＺＮ２０はＮｃｏ　１部位の５ ′側にＴｏｗｎｅの配列とＮｅｏ　１部位の３′側にＡＤ＋６９の配列とを有す る複合プロモーターを含む。ＮＣＯ１部位は、図６Ｂでアスタリスクによって表 示されている。 ｐＺＮ２０はこの複合ＨＣＭ　Ｖプロモーターと、その後にＣＡＴ遺伝子、ＳＶ ４０のｔ−イントロン及びＳＶ４０のポリＡ　Ｉ−ｆ加部位とを有する。 ０ポリｌ＼（１加部位を含む。ｐＺＮ６１はｐＺＮ６０と同一であるが、イント ロンさイ］たらのと同一の１１抽配列である。 −Ｉ）ＣＩＳ−ＣＡＴ　このプラスミドは、ＣＭＶプロモータ及び混成イントロ ン配列を、ブラスミｌ”ｐＭＬ、１．　ＣＡＴ、ボルマンら、（１９９０）　Ｄ ＮＡ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇ、　Ｔｅｃｈ、　、　２：３−１０中のＳＶ４０ プロモータに代えて使用した以外は、ファン（Ｈｕａｌｌｇｌ、Ｍ、　Ｔ、Ｆ　 及びゴルフ：／、　ｃ、　Ｍ、、（１９９０）　Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ 、１Ｂ：９３７−９４７に記載されているように作製した。 陽イオン性脂質例えはＮ　（１−２−３−ジオレイロキシ）プロピル］−Ｎ、Ｎ 。 Ｎ−トリエヂルアンモニウムクロライド（ＤＯＴＭＡ）　、ジメチルジオクタデ シルアンモニウムプロマイト（ＤＤＡＢ）又は１．２−ジオレオイロキシ−３− （トリメＦルアンモニオ）プロパン（ＤＯＴＡＰ）又はリシニルーホスファチジ ルエタノールアミン（Ｌ−ＰＥ、）と、第２脂質例えばジオイルホスファチジル エタノールアミン（ＤＯＰＥ）又はコレステロールとを含む脂質キャリアが下記 のように調製された。 脂質キャリアの調製 １１旨貿ｆｉｌえば、ＤＤＡＢ、Ｌ−ＰＥ、コレステロール−エステル−β−ア ラニン（ＣＥＢＡ）　、ＤＯＴＡＰと、コレステロール（Ｃｈｏｌ）とを、クロ ｏホルムに溶解した。各脂質の好適なｆｆ１（最終脂質ギヤリア配合物における 各脂質の所望のモル比によって規定され、通常１対１モルの陽イオン性脂質対非 陽イオン性脂質であるが、５〜ｌ対１〜５の範囲を採る）を共に混合して、回転 式蒸発器によって乾燥するまで蒸発させた。その後、該脂質フィルムを、水又は 脂質キャリアＦｉｊａｒ液（２５ｍＭのｉ−リス−ＨＣｌ、ｐＨ７，４，１００ μＭのＺｎＣ１ｔ、ＮａｃＩに等張）中５％のデキストロースを付加した後にポ ルテックス処理によってｒｌｒ　Ｐ濁した。最終脂質濃度２０ｍＭの多重ラメラ 小胞（ＭＬＶ）を作製するためにである。小さい単ラメラ小胞（ＳＵＶ）の調製 には、その後、この混合物をｉＳ＋ＩＭ　＋５）砕Ｉｆｊ中で１５分間、音波粉 砕し、脂質キャリアを使用まで４℃アルゴン下てｌ’＋’、　（Ｙ　した。 プラスミド調製。 プラスミドを運ぶＥ、ｃｏｌｉｆ朱１（Ｂｌｏｔを３７℃でＴＨにおいて成育さ せた。ブーラスミド精製方法は、サムブロックらＱｌｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏ ｎｉｎｇ、第２版、１９８９、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ− ・プレス社）によって記述されている”アルｈすｚ８解”及び°゛ポリエチレン グリコール用いた沈殿によるプラスミドＤＮＡのｈｆｆ製”の改変手法とする。 この改変はＰＥＧによるＤＮへの沈殿を古いていることである。最終ＤＮＡ調製 物は、ｌｏｍＭのＴｒ　１　ｓ　−）ＩＣＩ　ｐＨ８，＋１に溶解した。 脂質キトリアープラスミド プラスミドを所望の濃度（通常、ｌＡｔｇ／μｌ）に５％デキストロース水溶液 に別途希釈した。脂質ギｒリアしプラスミドど同一の容量に５％デキストロース 本に５１１１更した。 ｌｔ川さイする脂質キャリアの爪は、脂質ｎｍｏ　Ｉ対添加ブラスミＦμｇの比 に基づいて規定さ第１、例えば脂質キャリア：プラスミド＝１；ｌであり、１ナ ノモルの陽イオン性脂質を１μｇのプラスミドＤＮＡと混合した。その後、プラ スミドと脂’ｉ’ｊ４＝ヤリアとを共に混合してＤＮＡ　脂質キャリア複合体を 形成した。 没勺吊注入　少なくとし５０℃ｇであり、規則的には陽イオン性脂質キャリアに １１合化されたプラスミドＩ）ＮＡ１００μｇをマウス当たりに注入した。プラ スミドのみの注入には、少なくとし５００μｇ及び規則的には２ｍｇのプラスミ ドＤＮＡをマウス当たりに尾静脈によって注入した。 実施例３ ｐＺＮ２７−ｔ）ＤＡＢ　Ｐレスチロール脂質キャリア複合体の静脈（口ｒ）注 入後の肺におけるＣＡＴ遺伝子発現の免疫組織化学による証明脂質キトリア　Ｄ ＤＡＢ　コレステロール＝１０、脂質キャリア緩衝液中２ＯｍＭて保存。 プラスミド：　ｐＺＮ２７ ＤＮＡ　脂質キャリア比：　脂質キャリア：プラスミド＝５ｒｕａｏｌ陽イオン 性脂質、１μｇＤＮＡ 見ドへ竪りｍ．：　５％デキストロース水溶液２００μｌ中１００μｇプラスミ ドＤＮＡをマウス当たり尾静１派からｉｖて注入した。 ヱ之冬：　ＩｃＲ，　メス、２５ｇ０ 方法：　ｐＺＮ２７−ＤＤＡＢ；コレステロール複合体の注入後４８時間で、肺 を取り出し、３３％のＯＣＴ包埋媒体（ミルス社）で還流し、ＯＣＴ中で包埋し てスナップ凍結した。凍結組織は６μｍに切り、ガラススライド上へ回収して４ °Ｃアセ１−ンて１０分間固定して、その後０．２％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００ 中に配置ｙ；シて膜を透過性にした。その後、切片を１２〜４８時間、適当な希 釈率でモノクローナル１にＣ　ＡＴＩん体（アリシナ大学のパーカー・アンティ ン（Ｐａｒｋｅｒ　Ａ口ｔ１１１）博士からＯ’＜！：Ｊされた）又はネガティ ブ対照用アイソタイプ抗体と共にインキュへ−１・した。洗浄後、−次抗体に直 接対するビオチン化抗体（ザイメッド社、Ｓ。 リンフランシスコ）を６０分間作用させ、その後、ストレブトアビジンーアルカ リポスファターゼ讃合物（ザイメッド社）を６０分間添加した。その後、製造社 の取扱書によって酵素Ｉ識に好適な基質色素源を添加した。スライドを検査のた めに水溶性マウント用媒体へオーバースライドさせた。 持里．　結果は図１に示され、これは肺の拡散染色を証明している。染色は肺胞 璧に局在し、このことは、肺胞管壁細胞と共に、Ｉ型及び１■型細胞並びに肺胞 マクロフ７−ノを含めて７０％を越える肺胞管壁細胞がＤＮＡ脂質キャリア讃合 体の単回ｉｖｉＪ：入によってトランスフェクトされることを示す。更に、有意 な数の細気管支気道管壁細胞が、ＣＡＴタンパク質に対してポジティブに染色し 、従って、脂質キャリアニＤＮΔ複合体のｉｖ注入によってｉｎ　ｖｉｖｏでト ランスフェクトされる。従って、肺の全参謀の大多数がｐＺＮ２７−ＤＤＡＢ　 ：Ｃｈｏ　ｌ複合１）、のｉＸ’ｉＪ：人によってトランスフェクｉした。 す曇工四ＣＡＴ遺伝子発現のレベルにおけるｉｐ注入されたｐＣＩＳ−ＣＡＴ− 陽イオン性脂質キャリア痕合体の量の効果メスＩＣＲＴウスを、０．０１．０． １若しくはｔμｍｏｔのＤＤＡＢ　：ＤＯＰＥ脂質キャリアに複合さ４また各７ １０．０１．０．１．ＩｍｇのｐｃＩｓ−ＣＡＴ発現ブンスニトを含む５９６デ キストロ一ス水溶液１ｍｌで１復腔注入した。マウスを４８１１’ｉ間後の犠牲 化させ、器官を摘出してハントベルトのホモジナイザを用いて組織を０．２５Ｍ の！・リス−ＨＣｌ　ｖｉｊｆｉ液ｐＨ７，８中でホモジナイズした。細胞質抽 出物を作製しタンパク質含量で五牟化して、その後、ＣＡＴタンパク質のレベル を測定した。実験は３匹を１１１とし、結果は了セチル化クロラムフェニコール の平均ｄｐｍ＋ＳＥＭて表す。 ／１法：ＤＤＡＢを含む脂質４−ヤリアをＤＯＰＥに対してｌ：１モル比で下記 の、ようにして調製した：クロロホルム溶解ＤＯＰＥＩＯμｍｏｌ　とエタノー ル溶解陽イオン性脂質１０μｍｏｌ　とを回転式蒸発器で乾燥状態まで蒸発させ た。滅菌水１ｍｌを添加して、混合物を音波扮砕博（ラボラトリ−・サプライ社 、ヒックスビル、ニューヨークツ１１）中で２０分間音波粉砕した。脂質キャリ アは約１００±２５１１１１の平均径を有していた。ＣＡＴアッセイのために細 胞抽出物を作製し、そのタンパク質含量を、クツジーブルーアッセイ（バイオラ ド社、リッチモンド、カリフォルニア州）によって測定した。肺、肺臓、肝臓及 び心臓抽出物からの１１００ｔ１のタンパク質及びリンパ節抽出物からの５０Ｍ ｇのタンパク質を、既述（ボルマン、前出）のように、”　Ｃ標識化クロラムフ ェニコールと反応させて、クロマトグラフィーにかけた。ｄｐｍの算出のため、 アセチル化物と非アセチル化物とを共にＴＬＣブレー１・から切出し、シンチレ ーションカウンタで放射物活性を３１測した。 結果　ｉｎ　ｖｉｖｏでの潜在的投与量反応性相関を評価するために、１群につ き３匹の動物に、０．　Ｏｌ　ｕｍｏｌ　、０．　ｌ　μｎ＋ｏｌ又は１μｍｏ ｌのＤＤＡＢ　：ＤＯＰＥ脂７１ギャリ了に１ν合さ第１た各’ＩＯ，ｏ１ｍｇ 、Ｏ，１ｍｇ又は１ｍｇのｐｃｌｓ−ＣＡＴブラスミＥを注入した。Ｏ，Ｉｍｇ 及び１ｍｇＤＮＡ投与量は共に、アッセイされた全ての器官において高い有意な レベル（ｐ＜０．００５）のＣへＴタンパク質を生成した。各器官におけるＣＡ Ｔ遺伝子発現の最高レベルは１ｍｇのＤＮ八へ句量てらたらさ第１、ＤＮＡ−脂 質ギャリア量の１０倍増加は、リンパ節ＣＡＴレベルを約２倍増加させ、肝臓て は３倍増加させた。 脂質キャリア：　Ｌ−ＰＥ：ＣＥＢＡ＝ｌ：ｌ、脂質キャリア緩衝液に２０ｍＭ て保（ｔ。 ブラスミＩ’：　ｐ５’　ＰＲＬ３　ＣＡ′ｒ　（サカキら、（＋９８８）　Ｇ ｅｎｅｓ　ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｌ　２：１１４−１−１１５４）ＤＮ Ａ　：脂質キャリア比・　脂質キャリア：プラスミド−１μｍｏｌｊｊ％イオン 性脂質：　１８ｇプラスミドＤＮＡ ＤＮＡ投与ＨＬ　５％デギストロース水溶液２００μｍ中２００μｇのプラスミ ドＤＮＡをマウス当たり尾静脈から注入した。 −ｚ’ｙＸ　：　Ｂａ　ｌ　ｂ／ｃ、メス、２５ｇ組織摘出手順：　尾静脈注入 後４８時間で、マウスを犠牲化させ、全肺臓を１ｍｌの０．２５Ｍのトリス−Ｈ ＣＬ　ｐＨ７，８，５ｍＭのＥＤＴ八、８０Ｍｇ／ｍ１のＰＭＳＦ中にホモジナ イズして、得られた抽出物を遠心分離し、その後上清を３サイクルの凍結−溶解 操作にけし、その後２０分間６５°Ｃに加熱した。 ＣＡＴアッセイ手順　１００μｌの抽出物＋ｌＯμｌの２０ｍＭアセチルＣｏＡ ＋４μｌの”Ｃ−クロラムフェニコール（２５μＣｉ／ｍｌ、５５ｍＣ４／皿＋ ｏｌ、アマジャム社）を共に、３７℃６時間でインキュベートした。３時間で、 更にｌＯμｌのアセチルＣｏＡを添加した。 結果　この実験は、有意なレベルのＣＡＴ活性が処理動物の肺臓抽出物にあった か、脂質キｔ・リアのみで注入さ第１た動物から得られた対照肺臓の抽出物には なかったことを示した。 実施例６ ＤＯＴＭＡ　：　ＤＯＰＥ＋ｐＳ　第５−ＣへＴプラスミドの注入は１リドらか に検出可能な団ｖｉｖｏにおけるＣＡＴ遺伝子の発現をもたらさない脂質４’　 Ｉ−リア：　ＤＯＴＭＡ・ＤＯＰＥ＝ｌ　：　ｌ、５９６デキストロース水溶液 中プラスミド・　ｐｓＩｓ−ＣＡＴ（ホ７ン、Ｍ、Ｔ、Ｆ、及びＣ，Ｍ、ボルマ ン、１９９０、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　１８：９３７ −９４７）比　陽イオン性脂質、プラスミド−４μｍｏ１：ｊμｇ、投与！ｌ： ２００μｌの５９６′Ｆキストロ一ス水溶液中！００μｇＤＮＡ１１織採取及び 加工処理、　マウスを２０目及び６１］目で犠牲化にして、肺、１ｌＩＩＩ臓、 １１１臓及び心臓を採取した。器官全体を、肝臓以外は０．５ｍｌの、肝臓は２ ．０ｍ１の、０．２５Ｍのトリス−ＨＣＬ　ｐＨ７，８，５ｍＭのＥＤＴ八、２ μｇ／ｍ１のアプロチニン、１μｇ／ｍｌのＥ−６４及び０．５μｇ／ｍｌのロ イベブチノ（全てのプロテアーゼ阻害剤はベーリンガーマンハイム社から購入） 中にホモジナイズした。抽出物を３サイクルの凍結−溶解操作に付し、その後１ ０分間６５℃に加熱した。 ＣΔ１’アッセイ手順：　アッセイのための抽出物１００μｍと０．３μＣ１（ ｒ）１４０−クロラムフェニコール及び１０μｍ０２０ｍＭアセチルＣ〇八とア セチル化物５時間か２４．５時間かてイン４−ユベートシ、その後、該物質をエ チルアセテートを用いて抽出し、ＴＬＣブレート上て解析した。 結果 処理動物からの抽出物を、対！１ｒ（動物からのものとを比較することによって 測定したどきに、アセチル化りロラムフェニコール種は認められなかった。従っ て、高レベルのｐＺＮ２７の発現がもたらされるものと同様の実験上の条件下で ｐＳＩｓ−ＣＡＴ発現ベクターの使用は、ｉｎ　ｖｉｖｏでアッセイされた全て の組織における検出可能な連結ＣＡＴ遺伝子の如何なる発現も生じない。ｉｎ　 ｖｉｖｏでのｐＳＩＳ−ＣＡＴの発現の欠落は、高レベルのｉｎ　ｖｉｖｏ発現 を発揮するＩ）ＺＮ２７ベクターと比較すると、異なるプロモーター−エンハン サ−要素（ＳＶ４０）のためプへ異なるイン）・ロン配列のためかであろう。 細胞及び細胞培養：ＣＶ−１（アフリカミトリ猿、肝臓）、Ｕ９３７（ヒト、骨 髄性白＋１ｗ病）、マウス赤白頭痛（ＭＥＬ）細胞、及びに５６２細胞（ヒト、 赤白１１１１病細胞）をアメリノＪン・タイプ・カルチャー・コレクション（ロ ツクヴイル、メリーランド州）から得た。ＣＶ−１及びＭＥＬ細胞を、５％ウシ 胎児血清（ＦＢＳ）添ＩＩ（１ダルベツコ最少必須培地ＤＭＥ−８２１中に、３ ７°Ｃ及び７％ＣＯ２て第１１持した。クツｌ−軸胞１１　！！呻１１胞及びラ ット肺胞マクロファージを既述のように単離して精製した（デプス（Ｄｅｂｓ） ら、Ａｍｅｒ、Ｒｅｖ、Ｒｅ５ｐｉｒａｔｏｒｙ　Ｄｉｓｅａｓｅ　（１９８７ ）　１３５ニア３１−７３７　；　Ｉ”ｙブス（Ｄｏｂｂｓ）、＾ｍｅｒ、Ｒｅ ｖ、Ｒｅ５ｐｉｒａｔｏｒｙ　Ｄｉｓｅａｓｅ　（１９８６）　１３S：１４１ −１４５）。ＩＩ型細胞を５％ＦＢＳ添加ＤＭＥ−ト１１６中に、３７°Ｃ及び ７％ＣＯ１て維持した。２０目ｍｏｌのＤＯＴＭＡ：ＤＯＰＥ脂質キャリアと２ ０ＭｇのｐＲ３Ｖ　−ＣＡ　ＴプラスミドＤＮＡとの複合体を、６０ｍｍファル コンプラスチックディノシュ中で成長している２ＸＩＯ’細胞に添加して（ＳＵ Ｖ及びＭＬＶのいずれか）、その後１５分から２時間の時点でのＥＭのために固 定した。 電子顕微鏡のための固定及び処理 ＤＯＴＭＡ脂質キャリアと組織培養中の又は血液若しくは肺胞から新たに単離し た細胞とを、Ｉ９６シユークロースを含有する０、１モルのカコジル酸ナトリウ ム０１衝液、ｐＨ７，４、中の１　、５　％グルタルアルデヒドに、１時間室温 で固定した。タンニン酸及びウラニルアセテート増加の後、組織をアルコールの 段階シリーズ中で脱水し、エポキシ８１２１１１１脂（アーネストＦ、フラム（ Ｅｒｎｅｓｊ　Ｆ、Ｆｕｌｌａｍ）インクン［、ラサム、ニューヨーク化）に包 埋し、ダイアモンドナイフを用いてＭＴ２ミクロト−ムにおいて切片を作製し、 ８０ｋＶで操作したジョエル１００ＣＸ透過梨７「子顕徹鏡て試験した。Ｃｌ− １ザル腎臓細胞中の脂質覆合体の取り込みの電１″−顕微鏡写ｒＬは、１１１７ に示されている。パネル（ａ）中の矢印は、クラスリノ）戎頂小胞に結合してい る粒子を示し、パネル（ｂ）中の矢印は、エンドソー１．中に取り込ま４Ｒｉイ １−シている粒子の場所を示している。 プラスミドＤＮＡに１！合した単−又は多重ラメラ脂質キャリアのＤＯＴＭＡ脂 ＋ｔｌキトリアと神々の細胞型（ＣＶ−１サル腎臓細胞、Ｕ９３７ヒト骨髄単球 白血病細胞、ｌ＜５６２、ＭＥＬ赤芽球白血病細胞、ラット肺胞マクロファージ 及びＩＩ堅１１＋ｌｉ　ＩＩＱ細胞）との高頻度１１万作用は、脂質ギヤ１フ１ ４着と典型的な被覆小胞経路におけるインターナライセーンヨンのしのである（ 図７ａ−ｆ）。この相互作用は、すしブター仲介エンド→Ｊイトンスのよく研究 された例に共通しているものである。陽イオンｔ［脂？７キヤリア・Ｄ　Ｎ　Ａ 　ＩＸ［合物と接触するように見える全ての細１厄は、形？ｌ７ＩＩ＋２への結 合後に３６１３１合物を取り込む。これらの全ての細胞型（げっ歯類、→Ｊル及 びヒト細胞＋１＋＊）は、同一のインターナライゼーションの伝統的なりＵ７ｆ ター仲介エンＩ・サイトンス経路を証明する。ＤＮＡ−陽イオン性リポソーム） Ｍ合１（・は、一般に、非ヒト及び同様の系統にある特定のげっ歯類細胞と同じ 位又はそイ１以上、に、ヒト細胞によって取り込まれる。 メスＩＣＲ７１″ノス（こ、１μｍｏｌのＤＤＡＢ：ＤＯＰＥ　（１：　１モル 、５ｔＪＶ）脂質；トヤリアに複合化されたｐＺＮ２７ブラスミド１ｍ（Ｈを含 む５％デキストロース水溶液１ｍｌを１ｐ注入した。マウスを４８時間後に犠牲 死させ、肺臓及びリンパ節を摘出し、血清含有培ｉ液中でホモジナイズすること によって単細胞懸濁１（ｌｉにした。その後、細胞をＦＩＴＣ結合抗Ｔｈｙ−１ ，２抗体（Ｊ、ベック博士、→Ｊ’／Ｔ７ランシスコ退役軍人局医７Ｌンターか ら入手）と共にインキュベートしてＦ　Ａ　ＣＳて゛ノート（選択分離）した。 Ｔｈｙ−１，２９Ｔリンパ球分画を顕微鏡スライド−１，にサイトスパンして固 定し、０．２５％のトライトンＸ−１００を用いて細胞を透過性にした後に内在 化ＣＡＴタンパク質の存在について釣り上げた。 細胞を抗Ｃ△′Ｆモノクローナル抗体（Ｐ、アンティン（Ａｎｔｉｎ）博士、ア リシナ大’７からの噌！−ｊ）と共に、２０°Ｃてインキュベートして、その後 、テキサスレッド結合Ａ・ギ１にマウスＩｇＧて１時間、２０°Ｃで染色した。 図２Ａは、位相差ｉｌａ微鏡による１゛リンパのｔ見野を示し、２Ｂは、蛍光顕 微鏡による同一視野が示されている。これらの結果は、７０９６以上のＴｈｙ− １，２０Ｔリンパ球が、ｐＺＮ２７　＋ＤＤＡＢ：ＤＯＰＥ複合体の１回のｉｐ 注入によって、ｉｎ　ｖｉｖｏでトランス７７Ｊ、り１・される（赤い蛍光によ って示されるように）ことを証明している。未処理マウスからのＴｈ）＝−１， ２°リンパ球は、図２Ｄに示されているように免疫蛍光染色を示さない、同一視 野の位相差顕微鏡写真は２Ｃに示されている。 メス１ｃＲ７ウスに、１μｍｏｌのＤＤＡＢ：ＤＯＰＥ　ＳＵＶ脂質キャリアに Ｎ倉出されたｐＺＮ２７ブラスミド１ｍｇを含む５％デキストロース水溶液１ｍ ｌをｉｐで注入した。マウスを４８時間後に犠牲死させ、それから、ＲＰＭＩ− １６４０培地で大腿腔を洗い流すことによって骨髄由来造血細胞を得て、その後 、小塊をホモジナイズして単細胞懸濁液を得た。その後、骨髄細胞をガラススラ イ１’−Ｌに向けて遠心し、実施例８で記述したように蛍光染色した。この実験 では、約２０９６のマウス骨髄造血細ｌｌｉ！１（形懇に基づいた初期の骨髄芽 球及び赤芽球前駆体細胞である細胞を含む）が、ｐＺＮ２７　：ＤＤＡＢ：ＤＯ ＰＥ複合体の１回の１ｐ投与によって、ｉｎ　ｖｉｖｏでトランスフェクトされ たことを証明した。 実施例１Ｏ 正常トナーから新たに単離されたヒトＣＤ４″″Ｔ細胞がｉｎ　ＶｉｔｒＯでト ランスフェクトされることの証明ハフィコ−１・調製物を、密度勾配遠心分離に よって正常ヒトドナーから新たに１．１１離した。その後、細胞をｔＡｘｃＤ３ （ベクトンーディッキンソン社、マウンテンデユー、カリフォルニア州）モノク ローナル抗体を用いてパニングしてＣＤ３”１゛リンパＩｌ１画を単離した。そ の後、これらの細胞を下記のプロトコールを用いてｌ・ランスフエクトした。　 １１１１ぢ、ｌ０ＸＩＯ’の細胞を１０１００ｎのディツシュ上にｉｌｉき、ぞ の後、５０％ｍｏｌのＤＤＡＢ　＋ＤＯＰＥ　（１：　１）ＳＵＶ脂質キャリア に＋Ｕ合化さイまた２５μｇのｐＺＮ２７を４８時間添加した。対照群の細胞は 、トランスフエフ１−されなかった。その後、この細胞を、ＦＩＴＣ結合モノク ローナルｌ１ＬＣＤ４抗体（ベクトンーディッキンソン社）とインキュベ−１− ｔ、てＦＡＣ３により゛ノートシた。ＮｌらイまたＣＤ４°Ｔリンパ球を、顕微 鏡スライド上にサイ：・スパンして固定し、０．２５％のトライトンＸ−１００ を用いて細胞を透過性化した後、細胞内ＣＡＴタンパク質の存在について釣り上 げた。細胞を、抗ＣＡＴモノクローナル抗体で１時間２０°Ｃでインキュベート して、テキサスレッド結合ヤギ１ｆＬマウス１ｇＧを用いて１時間２０°Ｃて染 色した。 机拳、−１巳 結果は［４４に示されており、これは、少なくとも７０％の新たに単離されたヒ トＣＤ４”　Ｔ１２３球が、ｌ１４Ｂて細胞の赤い蛍光によって示されるように 、培養系てｐＺＮ２７　：ＤＤＡＢ　：ＤＯＰＥ複合体に晒された後トランスフ ェクトさイまたことを証明している。対照群の未処理細胞は蛍光を示さなかった 。これらの結果は、この手段が、ΔＩＤｓ及び癌を含む疾患の治療を劇的に改良 し得ることを・ｉ−唆している。 １記の結果か示すように、高レベルの注入遺伝子発現が、全身性（ｉｖ又はｉｐ ）の１１ニ入遺伝子投与後に、心臓、腎臓、リンパ節、骨髄細胞、肝臓、肺及び 肝臓において達成された。成人への全身性（ｉｖ又はｉｐ）注入遺伝子投与後の 独立した心臓、腎臓、リンパ節又は骨髄細胞のトランスフェクションは、以前に は達成さ１１ていｌｊい。ＤＮＡの全身性投与によるＴ１２３球、肺気道若しく は肺胞細１１江望、冠状内皮管壁細胞及び冠状筋肉細胞、並びに、骨髄造血系前 駆体細胞の１１１＼″１（０てのトランスフェクションは、以６１１に示されて いない。特に、５０％を越える′「リンパ球、１１１１ｉ気道」−皮、肺胞及び ｍ［管内皮細胞型、冠状内皮管壁細胞及び骨髄造血前駆体細胞（約７０％の腎細 胞を含む）は、ＣＡＴ発現プラスミド−陽イオン性脂質キャリア複合体の１回の ｉｐ若しくはｉｌ）注入の後に、ｉｎ　ｖｉｖ。 てトランスフェクトされる。全ての単−組織中に存在する高パーセントの全細胞 のトランスフェクションは、以前には報告されていなかった。 実施例１１ ＤＮＡの陽イオン性リポソーム仲介送達を用いた種々のヒト肺癌細胞株の効率的 なトランスフェクション方法。 細胞培ｉ：　ＮＣｌ−Ｈ６９、ＮＣｌ−Ｈ８２及びＮＣｌ−Ｈ５２０細胞を用い た。Ｈ６９及びＨ５２０細胞を、１０９６のウシ胎児血清（ＦＢＳ）含有ＲＰＭ Ｉ−１６４０中で成育させ、Ｈ８２細胞を、ｌＯ％ＦＢＳ含有のダルベツコ最小 必須）１゛τＩｌｌ！（ＤＭＥ）−Ｈ２１中で成育させた。 リボリーム調製：　リボ′ノームは下記のようにして調製した。即ち、クロロホ ルｌ、（にはエタノール（ＤＤＴＭ八））に懸濁された総量４μｍｏｌの脂質を 、回転式エバポレータで乾燥状態まて蒸発させた。５０ｍＭのトリス、０．５ｍ ＭのＥＤＴＡ、５０ｍＭのＮａＣ１，１００μＭのＺｎＣ１ｔ１１ｉ液１ｍｌを ２０＋ｎ＋ｎｏｌの脂質毎に添加し、混合物を音波処理槽（ラボラトリ−・サプ ライ社、ヒ・ツクスピル、ニューヨーク化）中で２０分間音波処理した。得られ たりボッ−１、は、約１　１００±２５ｎｍの平均直径である。下記のリポソー ム調製物を用いた。即ち、ｒ＋’ｒ’１２　Ｄ　ＯＴ　Ｍ　Ａ、２〜１モル比（ ７）ＤＯＴＭＡ　：　：１　レステｏ−／Ｉ／、精製Ｌ−ＰＥ又は６〜４モル比 のＬ−ＰＥ：ＣＥＢΔてあった。 細胞性トランスフェクション：　細胞のトランスフェクションのために、４ｍｌ の熊＋ＩＩｌ清培地中の２刈ｏ１の細胞を１００ｍｍのプラスチックディツシュ （ファルコン社、十ノクスナード、カリフォルニア州）に置いた。プラスミドＤ ＮＡ−リポソ−ム調製物を、まず、１）ＤＮＡに、その後、２）リポソームに添 加して、ゆっくりと混合することによって調製した。その後、該混合物を１ｍｌ の無血清培地に懸濁して、細胞へ添加した。４時間後に、細胞を２回洗浄し、１ ０ｍ１の血清含ｈ　’Ａ地に再懸濁し、続いて４４時間後に採取した。採取の直 前に、細胞を２回洗浄し、その後、このプレートをラバーポリスマンで掻き取っ た。細胞を１０００　×ｇで５分間遠・シ１分離して、Ｏ，１３５ｍ１の０．２ ５Ｍのトリス緩衝液、ｐ）（７，５，５ｍｍのＥＤＴＡを各沈殿物に添加した。 細胞を３回、凍結溶解して、６５°Ｃて１０分間加熱し、１２５００Ｘｇで１０ 分間回転させた。上清をタンパク質についてγノセイし、試料出たり２０Ｍｇの 上清タンパク質を用いて、実施例４て記述したようにＣΔＴ活性を測定した。 結果　結果は、２つの異なるヒト小細胞肺癌細胞（Ｈ６９及びＨ８２）並びに偏 １１ε」二皮細胞肺癌抹（Ｈ５２０）の高レベルのトランスフェクションに対す る陽イオン性すボ′ノームの仲介能を証明している。３つの株の全ては、３つの 異なる陽イオン性リポソーム配合物に対して複合化した場合に、Ｒ３Ｖ−ＣへＴ によってかなり効率的にトランスフェクトされたく図２１）。これらヒト細胞株 は、比較条件下でＩ・ランスフェクトされたげっ歯類のＨ瘍細胞株と同等又はそ れよりも効率的にｌ・ランスフエクトされた。 実施例１２ 陽イオン性脂質キャリア：ＤＮＡ１合体の静脈注入によるマウスにおける肺癌細 胞のトランスフェクションマウス：　Ｃ５７／ｂｌａｃｋ　６、メス、２５Ｍ癌 　Ｂ１６、肺に対してかなり転移性であるマウスメラノーマ株である。該細胞（ １、を、５９６ウシ胎児唾清を添加したＰＲＭＩ　１６４０中で成育させた。 脂質キャリア：　ＤＯＴ八Ｐへコレステロール＝ｌ、！、５％デキストロース水 Ｉ合１１ｋ［ｉ　ｌ　ＯｍＭ プラスミｌ”：　ｐＺＮ２０ 比　陽イオン性脂質：ＤＮＡ＝６ｎｍｏｌ：　１μｇ、２００μ＋の５％デキス トロース水溶液中に１００μｇを、マウス毎に尾静脈から注入した。 マウス・＼の癌細胞株のｔ＆ｆｌ及びＣΔＴ発現プラスミド−陽イオン性脂質キ ャリア８１６細胞をトリプシン処理してプレートから剥がし、マウス当たり５０ ００（）細胞を尾静脈へ静脈ｒｔ人で各マウスに接種した。接種後２週間で、陽 イオン性脂質キャリアーＤＮＡ複合体を尾静脈から注入した。肺を注入後４８時 間で採取してトライアイス−エタノール槽中の凍らせた３３％のＯＣＴで浸潤さ せ、凍結り川にして、細胞内ＣＡＴタンパク質を検出するために免疫組織化学的 解析のために処理した。 免疫ＩＪＩ＃＆学的解析学的解析 ９官順取り出し、適当に整えて、ＯＣＴ中に包埋し、スナップ凍結した。凍結組 織を６μｍで切片にして、ガラススライド上に集めて４°Ｃアセトン中で１０分 間固定して、その後、０．２９６１−ライドンＸ−１００に置いて透過性化した 。その後、切片を１２−４８時間、モノクローナル抗ＣＡＴＩ７Ｌ体と又はアイ ソタイプ陰性え１照１に休ど共に、適当な希釈率でインキュベートした。洗浄後 、−次抗体にχ１するヒオチン化ＩＡ、体（ザイメッド社、Ｓ、サンフランシス コ）を最低６０分間ＵＩＩＬ、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ複合体（ ザイメツド社）を６０分間＋１１１えて、その後、用いた酵素標識に適当な基質 −色素源を適用した。その後、スーライ１−を希釈ヘマトキンリン中で対応染色 して、又は未染色のままで、検査のために水溶性マウント媒体中てｈバーガラス を載せた。 結果・ 免疫組織化学的解析は図８に示されており、これはＢ−１６メラノーマ肺腫瘍（ ８Ａ、矢印で表示）と管内腫瘍塞栓（８Ｂ１矢印で表示）とは、ＤＮＡ−脂質キ ャリア複合体のｉｖ注入後に効率的にトランスフェクトされることを証明してい る。ｔｈｌｉ　１１Ｍ瘍と管内ｌ１１瘍塞栓とは共に強く染色されており、ｉｎ 　ｖｉｖｏで効率よい１＝ＩＹｔ性Ｉ・ランスフエクンヨンを示している。腫瘍 発生マウスは、ＤＮＡ−脂質キャリア複合体の注入を受けてないが、肺又は全て の肺＠瘍細胞にＣＡＴ活性が示さＡ１ていない（８Ｃ）。クローン化した遺伝子 の全身性投与による哺乳宿主内に（ｒ−（ＪＥする腫瘍のトランスフェクト能は 、以前には証明されていなかった。 実施例１３ ｐＺＳＮ２７のみ又はｐＺＮ２７　：ＤＤＡＢ：コレステロールＳＵＶ複合体の 静Ｋ　（ｉ　Ｘ・）注入後の、多重組織における高レベルＣへＴ遺伝子発現の証 明脂ｌｒｉキ１リア：　ＤＤＡＢ：コレステロール＝１　：　ｌ、５％デキスト ロース水溶液中ＩＧｍＮ・電で保存。５９６デギストロースを乾燥脂質形態に添 加後、ＳＵＶを２０分間７’ｒ波処理漕中て音波処理して調製した。 ブーシスミ１８・　ｐＺＮ２７ Ｉ）Ｎ八　脂質キャリア比　陽イオンｌ！ｌ　Ｉｌｉ貿、プラスミドＤＮＡ＝　 ５μｍｏｌ　：　Ｉ　ｔｔｌ）ＺＮ２７のみ　ＩＩＡＪ　ＩＩのマウスは、尾静 脈注入により５％デキストロース水ｌＦｉ　ｉｆシ２００μｌ中のｐＺＮ２７を 、５００μｇ、１ｍｇ１２ｍｇ又は５００７１ｇ。 ＋１１！１間後に２回［Ｉの５００μｇ投！Ｅ５酊で受けた。 脂質キャリアに複合化したｐＺＮ２７：　２００μｍの５％デキストロース水ｌ ｓ、（ｋ中の５００μｍｏｌのＴ））ｔ）へＢ；コレステロールＳＵＶ脂質キャ リアに複合化された１００μｇのブラスミｌ？’ｌ）Ｎ八を、マウス当たり尾静 脈により注入した。 マ・リス　ｌ　ＣＲ、メス、２５ｇ０ Ｊ、１Ｔｏｌ抽ｌｊ方法　３２Ｆｊ官を０．３ｍｌの０．２５Ｍ）リス−ＨＣＬ 　ｐＨ７，８，５ｍＮＩ　ＥＤＴＡ中にホモ′）ｊ−イズして、得られた抽出物 を遠心分離し、その後、Ｊニー　ｉｉ’＋を３回、凍結−溶角￥操作にか（ｌ、 その後、６５°Ｃで２０分間加熱した。 ＣＡＴＴノセイ方法　各１１ｖ＆抽出物のタンパク質濃度を、クマジーブルー」 １体り〉バク賀アッセイ（パイ−４・→１・；Ｌ、リッヂモンド）を用いて定量 し、各組織抽出物からの等σの総クンバク質を、３７°Ｃ１３時間、１０７１１ の２０ｒｎＭアセｆルＣｏ　、Ａ　＋−ｌ　２　μｌの１４（：−クロラノ、） １ニコール（２５μＣｉ／ｍｌ、５５ｍＣ１／曲ｎｏｌ、アマノド）、＞、＋１ 　）と」（に、ＣへＴアッセイに添加した。 ４１１７里 がζりのし＼ルのＣへｉ”　ｉｌｌ伝了−発現が、１）ＺＮ２７のみ、又はＤＤ ＡＢ、コレスｙ−（」−ル脂１シトヤリアに＋′Ｓ１合化されたｐＺＮ２７の注 入後に、アッセイされた１’、ｉ　−：Ｉの”！ｌ　／、ｊる組織（肺、心臓、 肝臓、腎臓、神職及びリンパ節）の各々で示された。Ｊ’ｌ！の発現プラス］・ の全身性成り後に、ｉｎ　ｖｉｖｏでの多重組織における注入遺伝子の発現は以 前に証明されていなかった。 実施例１４ ＣＭ　ｖ−インターロイキン−２遺伝子と複合化した陽イオン性脂質キャリアの 静脈注入によるマウスのｌ１ｆｆ、ｌｉ！及びリンパ節での高レベルのヒトイン ターロイキン−２の誘導マウス：　Ｃ５７／Ｂｌａｃｋ　６、メス、２５Ｍ癌　 １”３１１３、肺に対してかなり転移性であるマウスメラノーマ株である。該細 胞１１を、５９６ウシ胎児血清を添加したＰＲＭＩ　１６４０中で成育させた。 脂質キャリア　ＤＤＡＢ、コレステロール−！：１．５％デキストロース水溶、 Ｉ！ｌ！中１０ｍＭて保存。 ブラスミ１〜　ｐＺＮ４６（ヒトインターロイキン−２をコード化する配列に融 合さ４またＨ　ＣＭ　Ｖプロモータエンハンサ−）比　陽イオン性脂質・ＤＮＡ ＝注入当たりに投！・ｊされた２００μｍ０５％デキストロース水溶液中、５μ ｍｏｌ　：　ｌ　μｇＤＮＡ腫瘍細１１：メ１１、のマウス・＼の接神とヒｉ・ インターロイキン−２発現プラスミドー陽イオン性脂質キャリア複合体の投与 ＢＩ６細胞をトリプシン処理してプレートから剥がし、５ＸＩＯ’細胞を尾静脈 ・＼静０鉛１［人によってδ〜マウスに接神した。腫瘍細胞注入後２０目に開始 して、陽イオン性脂質キャリアーＤＮＡ複合体を過に２回で合計２週間、尾静脈 から注入（７た。動物を腫瘍細胞１１人の２週間後に犠牲化させ、神職及びリン パ節を摘出し、組織粉砕器を用いて単細胞懸濁液にして、その後、３７°Ｃの培 ＩＩ器中で１００ｍ１ηのプラスヂノタディソソユに［）Ｍｌ−１６４０，１０ ％ウシ胎児血１１ｉ中で２４Ｒ１ｉ間培養した。２４時＋１１１後（二、１清を 回収して、土、清中のヒトインターロイキン−２の濃度をヒトＩＬ−２ＥＬＩＳ Δを用いて測定した。 Ｘ１１．宋 ｐＺＮ４６−ＤＤＡＢ　コレステロール脂質キャリア複合体を注入したマウスか らの貯線細胞せ濁液中には、ｎ１１当たり＋ｏｏｐｇのヒトＩＬ−２／ｍｌが、 リンパ節細胞懸濁液には”　ｐｇ／ｍｌのＩＬ−２が存在していた。ヒトＩＬ− ２は、Ｂ−１０メラノーマ細胞の同一の注入を受けたが、ｐＺＮ４６−ＤＤＡＢ コしスヂロール脂貿４−ヤリア１ν合体の注入を受けなかったマウス由来の神職 細胞又はリンパ節細胞懸濁液には検出されなかった。従って、ＨＣＭＶ発現プラ スミドにおけるＣΔＴ逍伝子コート領域に対するヒ１−ＩＬ−２遺伝子コード領 域の置換は、マウスにおける１０〜翳ｏてのＩＬ−２遺伝子の高レベルでの発現 と産生Ｗ、ｌ！ヒトＩＬ−２タンパク質の大皿の生成どをもたらした。 実施例１５ ｐＺＮ３２・陽イオン性脂質キャリア複合体のｉ　ｖ没！ｊによって処置された マウスにおけるヒｌ−ＣＦ　Ｔ　Ｒ遺伝子の高レベル発現の誘導子ごＬ７．：　 ＩＣＲメス、２５ｇ 脂貿脂質キャリア比ＤＤＡＢ　コレステロール＝Ｉ：Ｉ　ＳＵＶ、５％デキスト ロース水溶液中１０ｍＭ０ プラスＥ　ｌ”：　ｐＺＮ３２　（Ｌｌ・ＣＦＴＲ＝１−ド配列に融合されたＨ ｃＭＶプロモータエンハンサ−） 焦　陽イオン１１脂’ＩＩ：ＤＮ八へ　５ｎｍｏｌ　：　１　μｇプラスミドＤ ＮＡ投！う量　口・尾静脈注入当たり投与された２００μｌの５％デキストロー ス水溶液中、総量１００μｇのブラスミｌ’ＤＮＡ方法　ｉｔ人後４８時間で、 マウスを犠牲孔させ、肺を摘出して整え、ＯＣＴに包埋して、スナップ凍結した 。凍結組織を６μｍの切片にして、ガラススライド１に集め、４％アセトン中で １０分間固定した。その後、ＣＦＴＲの免疫局在をアフィニティ１＾製ウサギモ ノクローナル抗ＣＦＴＲ抗体、α−１４６８、コーン（Ｃｏｈ１１’ｌら、（１ ９９１’ｌ　Ｂｉｏｃｈｅ＋＋＋、Ｂｉｏｐｂｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍ、　１８１ ：３６−４３）を用いて行った。この方法は、ｆ記の変更を有するが、マリン（ Ａｌａｒｉｎｏ）ら、（１９９１）　Ｊ、　ＣＩ　ｉｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　８ ８ニア１２に記載さイ１ているらのと同一てあった。洗浄後、ウザギボリクロー ナル抗体に対するヒオチン化抗体（サイメット）を、６０分間添１＋ｎ　Ｌ、そ の後、ストレプトアヒノンホスファターゼ＋ｎ合体（ザイメッド）を６０分間添 ハロして、その後、基質−色素源を添加した。それから、スライドに、検査のた めに水溶性マウント媒体中でｈバーガラスを載せた。 結果。 ｐＺＮ３２−ＤＤＡＢ、コレステロール（１：　Ｉ）リポソーム複合体について １ｖ注入した後４８時間のマウス肺と未処理対照群の肺との凍結切片の顕微鏡写 真（違う倍率の視野）を図１２Ａ−Ｅに示す。ポリクローナル抗ＣＦＴＲ抗体、 αＬｌ（ｉ８による強い染色によって示されるように、圧倒的多数の気道が、ヒ トＣＦＴＩ；！　ｉｉｉ　１ｉ子によってトランスフェクトのこと。視覚的検査 により、トランスフェクトされた気道中の本質的に全ての細胞か陽性に染まり、 これは、気道細胞の圧倒的多数が、処理されたＤＤＡＢ　：コしステロール（１ 　：　Ｉ）リポソームに覆合化されたｐＺＮ３２の１回の投与で、ｉｎ　ｖｉｖ ｏてヒｌーＣＦＴＲ遺伝子により！ーランスフェクトされ、対照動物は組織学的 に区別てきないことを証明している。ヒトＣＦＴＲ遺伝子の顕著な発現は、ＤＤ ＡＢ−コレステロール（１　：　ｌ）リポソームに複合化されたｐＺＮ３２の１ 回のｉ　ｖ投与後生なくとも６０日で、マウス肺において、少な（とも５０％の 全ての気道及び、少なくとも５０％の全ての気道管壁細胞（視覚的検査）に存在 する。 対照動物からのマウス肺の凍結切片（１　２Ｂ及び１２Ｄ）は、ＣＦＴＲについ てに１】同なる検出可能な染色も示さず、これは、１２Ａ，１２Ｃ及び！２Ｈに 示されているＣＦＴＲ発現全てが、ヒトＣＦＴＲ遺伝子による肺細胞のトランス フェクト（ンのためであることを証明している。 上記の結果に示されるように、亀回のｉｖ投与の発現コンストラクトは、対象と なる遺伝子を含むと共に、陽イオン性リポソームに複合化されたものであり、こ ４］は、Ｉｌ＋ｌｉの誘導気道に沿った細胞の殆どをトランスフェクトし、該遺 伝子産物は、少なくとも６０日間肺に存在し、この発現は、気道細胞に特異的の ようであり、暴露後に損傷の組織的な証拠は認められない。これは、リポソーム が十分に寛容化さイ１て、非免疫原性であるので重要である。更に、複合化され たｐＺＮ３２・ＤＤＡＢ−コレステロール（ＩＩＩ）の静脈注入で処理されたマ ウスの外見、挙動及びＪｆ命は、正常のよってあり、未処理の正常対照マウスと 何ら区別することかできない。これらの動物からの広範囲の組織の外見、挙動、 寿命及び詳細な組織学的解析の解析により証明されるように、この毒性の欠如は 、ｐＺＮ３２−Ｄ　Ｄ　Ａ　Ｂ　コレステロール複合体のｉｎ　ｖｉｖｏ送達に よりもたられる毒性の欠如を２、＋１明している。史に、ＤＮ八へリボ′ノーム Ｉ夏合体の反復ｉｖ投与の影響は、効果的１１つＪ１４　ｉｆｉ性である。ｉ　 ｖ注入による陽イオン性リポソーム仲介ＤＮＡ送達は、団＼・１Ｎ・０て高レベ ルてＩＩＩＩＩ特異性注入遺伝子発現をもたらす。 実施例１６ 異なるＣＡＴ遺伝子含有プラスミドの静脈注入後の肺及び肝臓におけるＣΔＴ遺 伝子発現の証明脂質−日・リア　ＤＤＡＢ：コレステロール＝ｌ：１５％デキス トロース水溶１１に中５ｒｎＭて１ｖ仔。 ブうスミ１−・　プラスミドは以下に示す。 ＤＮＡ−脂質キャリア比；　陽イオン性脂質ニブラスミドＤＮＡ＝ｌｎｍｏｌ　 ：　１μｍンｕｔ雇　ｉｖ尾静ＷＸｄ−人により静脈注入された２００μｍ容ｌ 中、１００μｍ方法　動物を注入後２４時間で犠牲孔させた。組織抽出方法及び ＣＡＴア・ソセイは、ＣＡＴアソ七イを３時間３７°Ｃてインキュベートして， ２．０ｍＭのバラ第４−ソン（ライ（Ｌａｉ）ら、（１９８８）Ｃａｒｃｉｎｏ ｇｅｎｅｓｉｓ　９：Ｉ２９５−１３０２）を肝臓試料に添ＩＪＩ比だ以外は、 実施例４て記述したようにした。結果を図１５に示す。レーン１−１２は肺試１ １てあり、レーン＋３−２４は肝臓試料である。レーン１，２、１３、Ｉ　４１ ｉｐＺＮ５　１　；　レ−：／３、４、１５、１　６はｐＺＮ６０　；　レーン ５、６、１７、１８はｐＺＮ６１；レーン７、８、１９、２０はｐＺＮ６２；レ ーン９、１（］、２１、２２はｐＺＮ６３：レーンＩＩ，＋２、２３、２４はｐ ＺＮ２７である。 ４１＋１里。 ｐＺＮ５１はインＩ・ロンを含まないものであり、これはコード配列の３°又は ５°側のいずれかのイントロンを含むプラスミドと同様に又はそれ以上に発現す る。 各ｉｖ注入によってもたらされる 広汎性と組織及び細胞型特異性とのＣＡＴ遺伝子発現マウス：　ＩｃＲ　メス、 Ｑ５ｇ リボ′ノーム．　ＤＤＡＢ・コレステロール＝Ｉ：ｌ　ＳＵＶ，５％デキストロ ース水溶，ｆｋ中１０ｍＭ。 ！乏７Ｅ）し　ｌ）ｐＺＮ２７又は、２）ｐＢＥ３．８ＣＡＴ　（構築は、チュ ウ（Ｃｈｏｕ）ら、（１９９１）　Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．　２６６：２４４ ７１−２４４７６を参照のこと）実験条件・　１１１につき３匹のマウスに、（ ａ）未処理、又は（ｂ）ＣＡＴ遺伝子に融合されたヒｌ−　Ｃ　Ｆ　Ｔ　Ｒ遺伝 子の５°上流側領域の３．８ｋｂ配列１００μｇに複合化されたＤＤＡＢ　：コ レステロールリポソームの１回のｉｖ尾静脈注入、又は（ｃ）ｐＺＮ２７を与え た。マウスを２４時間後に犠牲孔させ、実施例４で記述したように、肺、肝臓、 胛臓、リンパ節、腎臓及び心臓においてＣＡＴ活性をアッセイした。各群のマウ ス各々のからの肺切片の免疫組織化学的解析を、実施例３て記述したように実施 した。 結果 こイ１らのマウスからの凍結肺切片の免疫組織化学染色は、ＣＭＶ−ＣＡＴリポ ソーム１夏合体のｉｙ注入が高レベルの赤い染色をもたらすことを示し、これは 、肺内部の内皮、肺胞及び気道細胞におけるＣＡＴ遺伝子発現を示している（１ ６八）。これに対して、ＣＦＴＲ−ＣＡＴ−リポソーム複合体は、気道上皮細胞 に主として局在化したＣＡＴｉｌ伝子発現金子発現した（１８Ｂ）。これは、ｉ ｎｓ目Ｕハイブリダイセーンコン研究によって検出されたように（トレザイズ（ Ｔｒｅｚｉｓｅ）どブノヂワルｌ”（Ｂｕｃｌ＋ｗａｏｄ）、（１９９１）Ｎａ ｔｕｒｅ　３５３：４３４−４３７）、ラット肺における内抱ニノミｒｒ、（［ すルコトヲ示し−ｃいる（図＋　６Ｃ）、　図１０ＤＩ；Ｌ、ＣＭＶ−ＣＡＴ処 理マウスからの肺胞の高倍率の顕微鏡写真であり、これは肺胞細胞と肺内皮細胞 との両方で高レベルのＣＡＴ遺伝子発現を示している。ＣＦＴＲ−ＣΔＴ処理マ ウスからのＨφ鞄の高倍率の顕微鏡写真（図１６Ｅ）は、肺胞でも内皮細胞でも ｙｎ　’；ｙなＣへＴ遺伝子発現が認められないことを示し、これは、ＣＦＴＲ プロモータか注入遺伝子発現の標的を気道上皮細胞にしていることを示している 。これは、ｉｖ？１人後に、出孔（’Ｌと用いられた調節要素に依存した細胞型 特異的様式とのいずイ１かで、マウス師内部において注入遺伝子を発現すること ができることの、最初の証明である。 の写真は、図１６（Ｆ−Ｋ）に示されている。従って、ＣＭＶプロモータは広範 囲の組織における連結遺伝子の発現を誘導し、一方、ヒトＣＦＴＲ遺伝子の５゜ に１ｈ向する。 １ｖ注入に注目したトランスフェクションの比較ＤＮＡ・脂’１７キヤリア比・ 　リポソームを用いないでプラスミドＤＮＡのみを注入した。 見違、へηノΣ匹、５％デキストロース水溶ｉ１に２００μｍ中１ｍｇのプラス ミドＤＮＡを、マウス当たり尾静脈から４時間にわたって２回注入した。マウス を２４時間後に犠牲化させ、１７の異なる組織をＣへＴ遺伝子活性についてアッ セイした。 三λ各：　ＩｃＲ，メス、２５　ｇ ！倶帽卯邑方込　各器官を０．３ｍｌの０．２５Ｍ１−リス−ｔ（ＣＬ　ｐＨ７ ，８，５ｍＭ　ＥＤＩ−Ａ中にホモジナイズして、１ｑられた抽出物を遠心分離 し、その後、１゛清を３回、凍結−溶解操作にかけ、その後、６５°Ｃで２０分 間加熱した。 ＣＡＴアッセイ方法、　各組織抽出物のタンパク質濃度を、ニンヒドリン主体タ ンパク質アッセイ（バイオ・ラド社、リッチモンド）を用いて定量し、各組織抽 出物からの左上の総タンパク質を、３７℃１３時間、ＩＯμｌの２０ｍＭアセチ ルＣｏＡ＋１２μｌの１″Ｃ−クロラムフェニコール（２５μＣｉ／ｍ＋、５５ ｍＣｉ　／ｎ＋ｔ＋＋ｏｌ、了マシャム社）と共に、ＣＡＴアッセイに添加した 。　。 位黒　この実験のオートラジオグラフは、１９八に示されている。対照レベル（ レーンｌ）と比較して、ｐＺＮ２７のみの【Ｖ注入は、下記の組織において、か なり高レベルのＣＡＴ遺伝子発現をもたらした：肺、胸腺、食道、心臓、肝臓、 ＋１１１’臓、胃、小腸、盲腸、卵巣、膣、骨格筋、膵臓及びリンパ節。従って 、ｐＺＮ２７発現プラスミドのみのｉ　ｖ注入は、体内のかなり多種多様な組織 を効率的にトランスフェクト リポソーム：　ＤＤＡＢ：コレステロール＝ｌｌ、５％デキストロース水溶液中 １０ｍＭで保存 ＤＮＡ。脂質キャリア比：　リポソーム：プラスミド、５ｎｍｏｌ　：　Ｉμｇ ＤＮＡ投与量．５％デキストロース水溶液２００μｌ中１００μｇのプラスミド ＤＮＡを、マウス当たり尾静脈から注入した。マウスを２４時間後に犠牲化させ 、１７の異なる組織をＣＡＴ遺伝子活性についてアッセイした。 ヱ之．Ｒ：　ＩＣＲ、メス、２５ｇ できる。 顕著な抗腫瘍効果をもたらす ヱ’ｙｙ，：　Ｃ５７／ｂｌａｃｋ　６、メス、２５ｇ旌：ＢＩ６、肺に対して かなり転移性であるマウスメラノーマ株である。 該細１１ｆｉ１１、を、５９６ウシ胎児血ｔ’Ｒを添加したＰＲＭＩ　１６４０ 中で成育させＩこ。 〃ボッ−ノー：　ＤＤＡＢ：コレステロール−１：ｌ、５％デキストロース水＋ Ｆｒｉ（ｋｌ　ｌ　Ｏ　ｍＭて保ｆｆ０２５０００のＢ−１６細胞を尾静脈がら ｉｖ注入しプラスミド　ｐＺＮ８４（図１７に示されるように、マウスＣ；Ｍー ＣＳＦコード配列に融合されたＨＣＭＶプロモータエンハンサ−）世：　陽イオ ン性脂質：ＤＮＡ＝５ｎｍｏｌ：Ｉμｇｏ　５％デキストロース水溶ｉ＆２００ μｌ中、合計１００μｇのプラスミドＤＮＡを注入毎に投与した。 実験戦略：　１群につき８匹のマウスは、２．５ＸＩＯ’のＢ−１６ミラノーマ 細胞のｉ　ｖ尾静脈注入を１回受けた。グループｌは未処理であり、グループ２ はＤＤＡＢ：コレステロールリポソームにＩ！合化されたｐＺＮ８４１００μｇ を週２回受け、実験は腫瘍細胞注入の４０前に始めて、腫瘍注入後２週間まで続 けた。 全てのマウスを腫瘍注入ｉ＆３週間で犠牲化させ、表面肺腫瘍節は黒色であり、 解バ１１顕微鏡を用いて顕微鏡上てカウントした。 結果　対照マウスはｌｂｌｉ当たり６４．５±＋　９．　７　（Ｓ．　Ｅ．Ｍ． ）の小節を有していた。これに対して、ＧＭ−ＣＳＦ−リポソーム処理動物は、 肺当たり１１．９±３。 ６（ステニープントのｔ試験によるｆｆ’ｌ’１１１ｉで対照群に対してｐ＜ｏ ．ｏｌ）の腫瘍小節を打していた。従って、サイトカイン遺伝子のｉｖ注入は、 かなり顕著な抗腫瘍効果をもたらした。これは、遺伝子のｉｖ注入が抗腫瘍活性 をｉｎ　ｖｉｖｏでもたらす二とができることの最初の証明である。 動１勿　ヤギ　メス、１１０ボンド プラスミド：　ｐＺＮ８４ リポソーム＋　ＤＤＡＢ：コレステロール−１：Ｉ，５％デキストロース水溶液 中１０ｍＭで保存 ＤＮＡ　脂質キャリア比　リボノーム．プラスミドー５：ｌＤＮＡ投与量．　５ ％デギストロース水溶液５ｍｌ中１．０ｍｇのプラスミドＤＮＡを、ヤギ当たり 頚静脈からｔ主人した。 血液採取　血液をｐＺＮ８４リポソーム複合体の注入の直前と、注入後１２、２ ・１．４Ｂ、７２．１６８及び８４０時間で抜き出した。 ごアワＧＭ−Ｃ，ＳＦ　ＥＬ　Ｉ　ＳＡアッセイ手順；　マウスＧＭ−ＣＳＦを 、エン（・しくＥｎｄｏｇｅｎ　’）から入手した市販マウスＧＭ−Ｃ３Ｆ　Ｅ ＬＩＳＡキットを用いて、こ４１らの＋［Ｕ清拭ト１中て測定した。ＥＬＩＳ八 によるヤギとマウスのＣ；Ｍ−Ｃ３Ｆ間に相互反応はない。 とらン］人後１６８時間、高く継続された循環レベルのマウスＧＭ−ＣＳＦタン パたらすことがてきる。 内因性サイトカインは、ウィルス感染に対する宿主応答に包含されると考えら４ ］ている。従って、単一のサイトカインＧＭ−Ｃ３Ｆの増大された発現が、ウィ ルス性ｎ１１１炎の時間的進行に影響するかを測定することは興味があるところ である。 センダイウィルス試行に対する宿主応答において、マウスＧＭ−Ｃ３Ｆプラスミ ト−リボノーム複合体の２つの異なる経路を経た送達の影響を試験しｔこ。プラ スミド−リポ°）　−１，複合体を、マウスのおる群にはｉｖで、次の群には鼻 腔内（ｉｎ）で送達した。投与量、送達時間、ウィルス試行投与量及び終了点は 、両群共に同一する。プラスミド−リポソーム複合体の投与量は、１００μｇ／ マウス／（文月とする。両方の方法の投与は、下記のスケジュールで行う。 ｉｖ経路　３Ｂ日　０日１１　０日目 ３．７．１０日０ ｌ夏１経路　３日日　θ日目　０８目 ３．７、ｌＯ日Ｏ ＰＬ”−プラスミド−リポソーム 各実験肝は、下記のように構成されている：マウスＧＭ−Ｃ３Ｆプラスミドーリ ポソーム士ウィルス］３匹Ｃ八Ｔプラスミド−リポソーム士つィルス：３匹未処 理士ウィルス：３匹 これは、各時点、当たり９匹のマウス（各実験につき合計２７匹、全部で５４匹 のマウス）となった。全ての動物実験は、適当な無痛法の使用を含むＮＩＨ及び ＡＡＡ　１．ＡＣガイドラインに従って実施される。 ウィルス試行は、センダイウィルス株７７１０７６による鼻腔的投与であり、二 の菌１１ζは、マウスにおいて病原性であることが知られて（％る。終了点で１ よ、下記のことが含まれる（これらは、センダイ肺炎の終了点として有用である と示さイ１ている）。 １、肺重量対体重及び脳重量 ２、１Ｉｌｌｉ組織病理 ３　ウィルス回収量 ４、センダイ特異的抗体反応 ５、肺ＧＭ−Ｃ３Ｆ ６、肺ＴＮＦ 実施例２２ す１イソー７−＋：　ＤＤ八へ　：ＤＯＰＥ　（１：　ｌ）各マウスの右脳室へ 定トγ的に注入した。 ブうスミト　リボソーｌ、＝　１　＋　３　（１ｍｇＤＮＡ　：　３μｍｏｌ　 ＤＯＴＭＡ）ブ→スミＩ・、リポソーム＝ｌ　：　４　（１ｍｇＤＮＡ：　４　 μｍｏｌ　ＤＯＴＭＡ）ブ→スミト、リボ′ノームｌ：　Ｇ　（１ｍｇＤＮ八： 　６へμｍｏｌ　ＤＯＴＭＡ）マウスを注入後４８時間でＩＦＬ牲死させた。脳 を取り出し、左と右の脳室に分けた。各１１ｉ；室を、２５０μ＋の０．２５Ｍ ＋−リスｐ）！？、８．５ｍＭ　ＥＤＴΔ中に４−モノナイズして、その後、凍 結−溶解操作を３回繰り返し、１０分間６５°Ｃにｆｌ　しｌこ。 ＣＡ　Ｔアッセイに用いた抽出物の■をタンパク質レベルで標準化した。０．３ Ｉη１の１４Ｃ−クロラムフェニコールを各アッセイに用いた。アッセイを３７ °Ｃて一晩実行した。反応生成物を、実施例４て記述したように、ＴＬＣプレー ト上で分＾「させ、フィルムに露光した。 結果　これらの結果は、異ＰｌｉＪｆｉ仏子の高レベルの発現を、中枢神経系へ 直接ＤＮＡ−リポソ−ム複合体（ｌｌＩ！ｉ当な割合で）の注入によって、脳全 体にもたらす二どかてすることを証明している。これらはまた、発現プラスミド のみの注入が、脳において顕著な注入遺伝子発現をしたらずことができることを 証明している。 結！１−は１１０に示されている。 実施例２３ Ｉｆｆｆｆ中リア：　Ｉ、−ＰＥ　：ＣＥｌＩＡ＝Ｉ　：　Ｉ、脂質キャリア緩 衝液中２０ｍＭで保存 プラスミド：　ｐＲ３Ｖ−ＣＡＴ ＤＮＡ：脂質キャリア比：　脂質キ中すア：プラスミド＝ｌｎｍｏｌ陽イオン性 脂質：１μｇプラスミドＤＮＡ ＤＮＡ投与１ｉｔ：５％デキストロース水溶液２００μｍ　ｒｌ＋　１００μｇ のプラスミドＤＮＡを、マウス当たり尾静脈から注入した。 マウス：　Ｂａ１ｂ／ｃ、メス、２５ｇ組織抽出方法方法用静脈注入？＆４８時 間で、動物を犠牲死させ、全部を１ｍｌの０．２５Ｍ１−リス−ＩＴＣＩ、ｐｔ ｔ７．８．５ｍＭ　ＥＤＴ八、８０！ｇ／ｍｌ　ＰＭＳＦ中にホモジナイズして 、得られた抽出物を遠心分離し、その後、上清を３回、凍結−溶解操作にかけ、 その後、６５℃で２０分間加熱した。 ＣへＴ了ツセイ方法：　１００μｍの抽出物＋１０μｍの２０ｍＭアセチルＣＯ Ａ＋４μｌのｌ″Ｃ−クロラムフェニコール（２５ｕＣｉ／ｍ　Ｌ　５５ｍＣｉ ／＋ｔ＋ｍｏ１、アマジャム社）とを共に、３７℃６時間、インキュベートした 。３時間で、更に１０μｌの了セチルＣｏＡを添ＩＪＩＩ　ｔ、た。 結果：　この実験は、顕著なレベルのＣＡＴ活性（注入遺伝子の発現として表示 ）が、脂質キャリア：ＤＮＡ複合体を用いて注入した動物の肺に存在したが、対 照動物からの肺には存在しなかったことを示した。 脂質キャリア：　ＤＤＡＢ：ＤＯＰＥ＝ｌ：Ｉ、５％デギス１−ｏ−ス中１０ｍ ＭＤＮＡ−脂？’（４−ヤリア比、　脂質キトリア・プラスミド＝　（Ａ）　３ 与ｍｏｌ陽イオン性脂？’？：ｔｕｇブラスミＦＤＮ八（ＳＵＶ）。（Ｂ）　６ 与ｍｏｌ陽イオン性脂質：１μｇプラスミドＤＮＡ　（ＭＬＶ） 旦鉄Ａ１貨Ｉｊ吊：　５９６デギストロ一ス水溶液２００μｍ中１００μｇのプ ラスミドＤＮＡを、マウス当たり尾静脈から注入した。３匹のマウス各々は、こ のｌのＭＬＶ　：　ｐＺＮ２０を、３匹ツマウス（７）各々は、このｕ（７）Ｓ ＵＶ：　Ｉ）ＺＮ２０を受けた。 組織抽出方法；　各器官を０．３ｍｌの０．２５Ｍ　）リス−Ｉ■ＣＩ、ｐＨ７ ，８，５ｍＭｒ’：ＤＴΔ中にホモジナイズして、得られた抽出物を遠心分離し 、その後、」−浦を３回、凍結−溶解操作にかけ、その後、６５°Ｃで２θ分間 加熱した。 ＣＡＴ了ソセイ力法；　各組織ｔｌｌｌｉｌ’ｌ物のタンパク質濃度をクマジー ブルー主体タンパク質アッセイ（バイオ・う口］６、リッチモンド、ノＪリフオ ルニア州）を用いて定量し、各組織抽出物からの同拳の総タンパク質を、ＩＯ＃ Ｉの２０ｍＭ了しチルＣｏ八十１２４１のｌＩＣ−クロラムフェニコール（２５ μＣ４／ｍｌ、５５ｍＣ１／ｍｍｏｌ、アマジャム社）と」着、に、３７°ＣＩ ３時間、ＣＡＴアッセイに添加ｌこ。 鯖ｙ１　この実験は、ｐＺＮ２０：ＤＤＡＢ：ＤＯＰＥ複合体のｉｖ注入が、肺 、心臓、肝臓、神域、腎臓及びリンパ節を含む６つの異なる組織の各々てＩＩＩ 著なレベルのＣＡＴ遺伝子発現をもたらすことを証明した。更に、ＭＬＶ脂質キ ャリアは、同−脂質から構成されるＳＵｖ脂質キャリアよりも、同等か又はより 高いレベルのｉｎ　ｖｉｖｏ　？ＩＥ人遺伝子発現を仲介した。 本発明は、種々の疾ルのための、ｉｎ　ｖｉｖｏでのワクチンの製造において一 般的に使用され得る。顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−Ｃ３Ｆ ）に連結さ第１たギメラな、遺１ｉｋ的に設記されたタンパク質（ｇｅｎｅｊｉ ｃａｌ　ｌｙ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄｐｒｏｔｅｉｎｓ）の抗原フラグメント、 増強ＩＪ′し原提示及びｉｎ　ｖｉｖｏで？ｆｉ人されたときに抗原に対する増 加免疫応答は示されている（タネ（Ｔａｏ）及びレヴイ（Ｌｅｖｙ）、（１９９ ３）、Ｎａｔｕｒｅ　３Ｇ２ニア５５−７５８）　ａ従って、特定抗原をコード する核酸配列を、ＧＭ−Ｃ３Ｆをコートする核酸に融合して、本発明を用いてｉ ｎ　ｖｉｖｏで適当な細胞に発現し得る。この手段は、癌治療における悪性Ｉｌ ！瘍の増殖の調節を劇的に改良することができる。池の用途には、種々のウィル ス性及び池の感染性疾患に幻する１ｎｖｉｖｏワクチン製造が含まれ、特に、こ れらの疾患には、免疫応答が慣用のワクチン戦略ではうまくいかない又は弱いよ うな疾患が含まれる。特に、ＩＩＩＶのような超可変域によってタンパク質が特 徴付けられているような疾患に興味が引かれる。神々の潜（１゛的超可変域配列 をコードする核酸配列は、ＧＭ−Ｃ３Ｆに融合して１０％＋ｉｖｏで同時に発現 させ、多くの異なる株のウィルスに対する免疫応答を引き出すことかてきる。 タンパク質５３をコードするような核酸配列は、腫瘍増殖を治療することに有用 となり得る。腫瘍抑制タンパク質ｐ５３をコードする配列を、適当な発現ベクタ ー−脂質複合体を用いてｉｎ　ｖｉｖｏで細胞内に発現することができる。この ような複合体は、便宜上、この脂質複合体に結合された適当な抗体又はリガンド によって、腫瘍細胞を襟的とすることができる。細胞のトランスフェクションを 伴う初期感染は、培養細胞例えばｗｋｆｔＡ細胞株に５６２を用いて発生する。 ｐ５３遺伝子発現がＫ　５６２において一度確認され、最適なベクターが同定さ れると、１ｎｖｉｖｏ抗腫瘍実験が実施される。５ＣＩＤマウスにマウス当たり 約２５ＸＩＯ’のに５６２細胞が腹腔注入によって与えられる。注入後約３週間 で、１０匹の腫瘍発生マウスは、下記のものを与えられる：未処理／対照群；静 脈注入によるｐ５３ベクターリポソーム複合体；腹腔注入によるｐ５３ベクター リポソーム複合体；報告済みの遺（Ｌ子ベクターリポソーム萬合体。ｐ５３の発 現の抗腫瘍効果は、その後、マウスの生き残りに基づいてアッセイされる。 実施例２７ 赤血球生成は、赤血球の生成てあり、細胞崩工側；至るまでの連続的な全体の生 涯を生しさせることができる。赤血球生成は、かなり正確に調節された生理機構 であり、適当な組織酸素付与のために血液中に十分に利用できる鳳の赤血球を有 するが、細胞が循環を妨げられる泣多い量ではない。赤血球の形成は骨髄で起こ り、ホルモン、エリスロボイエチンの調節下にある。エリスロボイエチンは赤血 ＩＦ形成の過Ｆ７．ｌ二必「１であるので、このホルモンは、低い又は不完全な 赤血球の生成によって特徴１ｊけられる血液障害の両方の治療の診断のための適 用に使用することか可能である。エリスロボイエチンのコード配列を使用した遺 伝子治療は、種々の疾患状態、障害及び、貧面を含む血液異常の状態特に、慢性 腎不全等に関連するタイプの貧血の修復において使用される。ＥＰＯ活性を有す るポリペプチドをコートするｔｆｆｉ　Ａｔ配列は、適当な転写又は発現カセッ トへ挿入され、裸のＤＮＡ又は適当な脂質、Ｖヤリアと複合化されて宿主哺乳類 へ導入される。活性ＥＰＯポリペプチドの生成のモニターを、Ｕ　Ｓ　Ｐ　Ｎ４ ．７０３．００８号の実施例で記述されたように実施することができる。 上記の結果に示されるように、Ｎ数の組織が、脂質キャリアと複合化しても、襟 の咳へ餐としても、注入遺伝子の全身性投与の後にトランスフオームされること かできる。陽イオン性鮨貿キャリア／外因性ＤＮＡ１合体の哺乳類宿主への静脈 ？１人後の外因性ＤＮへの発現は、１９２８球、転移性腫瘍及び管内腫瘍塞栓を 含む多重の組織において示された。網内系のものを含むこれら多重の異なる組織 における外因性ＤＮＡの発現は、裸のＤＮＡとして発現プラスミドを静脈注入し たｉ＆にｔＱられた。ｉｎ　ｖｉｖｏての１９２８球のトランスフェクト能は、 ＡＩＤＳ、癌、多発性硬化症及び関節炎の治療に劇的な影響力を存する。心臓内 皮細胞のｉｎ　ｖｉｖ。 トランスフェクションは、心臓疾患及び心臓発作の治療に劇的な影響力を有する 。 肺細胞のｉｎ　ｖｉｖｏ　トランスフェクションは、嚢胞性繊維症、喘息、気腫 及び肺癌の治療に劇的な影響力を有する。骨髄細胞のｉｎ　ｖｉｖｏ　トランス フェクションは、癌、血液疾患及び感染に劇的な影響力を有する。 上述したようなｉｎ　ｖｉｖｏ遺伝子治療送達技術は、動物において非毒性であ り、注入遺伝子発現は１回の投与後、少なくとも６０日間持続することが示され た。 注入選１云子はサザン解析による測定でｉｎ　ｖｉｖｏにおいて検出可能なレベ ルで宿主細胞ＤＮＡへ組み込まれるようであり、これは、遺伝子治療のためのこ の技術が、癌発生オンコシンを活性化する正常細胞性遺伝子の発現の変更、又は 癌を予防するｌ１ｆＩｆｔＡ抑制遺伝子をオフにすることによる宿主哺乳類に対 する問題を引き起こさないてあろうということを示唆している。更に、ＤＮＡ発 現ベクターのみの全身性投与後の注入遺伝子の発現が示され；注入遺伝子発現は 、キャリアシステムを伴うことな（、ＤＮＡ発現ベクターの１回の投与後少なく とも３週間、肺にもたらされた。 異種遺伝子の成体動物への全身性投与は、広範囲の組織においてかなり高レベル の発現をもたらし、上述したように、これらの組織の多くに存在する全ての細胞 の大部分（〉７０％）をトランスフエフｌ−できる。これに対して、既存の研究 は、成体動物への異種遺伝子の直接的な転移を試みているものであり、１又はわ ずかな８１織に限られたトランスフェクション、これらの組織における低いレベ ルの注入遺伝子発現及び（組織化学解析が含まれる場合全て）トランスフェクト された組織において存在する細胞の１％未満の細胞に限定されたトランスフェク ションを報告していた。 肺にｒｒ在する全ての細胞の大部分とトランスフェクトすることに加えて、上記 の方法及びフンストラクトを用いて、高レベルの注入遺伝子発現は広範囲の他の 組織及び細胞型にもたらされた。これらには、以下のことが含まれる：・神域及 びリンパ節に存在する全ての細胞の大部分のトランスフェクションであり、これ には全ての１９２８球の７０％以上のトランスフェクションが含まれる。ｉｎ　 ｖｉｖｏての１９２８球の効率的なトランスフエフ１−能は、抗１１！Ｖ冶療及 び免疫応答の選択的改変の両方に対する最初の特異性分子手段を可能にする。 ・腫瘍発生宿主へのＤＮＡのｉ　ｖ注入後の内ｖｉｔｍ瘍及び管内腫瘍塞栓の効 果的な治療。以前は、癌に関する遺伝子転移研究は、ｅｘ　ｖｉｖｏ手段にのみ 拘束されていた。ここで我々の仕事は、腫瘍発生宿主において、腫瘍抑制物、抗 オンコシン及び／又はＩＩ瘍内部の抗転移活性をもたらす注入遺伝子を用し）だ 直ｔ＆的トランスフエクソヨンを可能にする。 ・異種遺伝子の全身性送達による、心臓血管内皮細胞の大分部と骨髄に存在する 芽球細胞のかなり大部分を含む骨髄由来造作細胞との大部分のトランスフエクシ ７ン。これらにより、分子レベルでの虚血性心疾患及び造血を調節する劇的な及 び新たな方法を創りだす。 ・ヒトＣＦＴＲ，ＩＬ−２及びＧＭ−Ｃ３Ｆに例示されるような、種々の生物学 的に重要な注入道（ミニ−の高レベルのｉｎ　ｖｉｖｏ発現の発生能の証明多く の刊行物及び特許出願は、個々の刊行物又は特許出願各々が援用されて本文の記 載の一部となることを特別に及び側割的に指示している場合には、同一の範囲で 、ここに援用されて本明細書の一部とする。 本発明はここて十分に説明されたので、当１Ｌ昔にとって、多くの変更及び改変 か添イ１のクレームの精神又は範囲を逸脱することなく、行うことができるとい うことは明らかであろう。 ＦＩＧＵＲＩＥ　ｌＡ １１Ｇ【取１．１１１　■ｊｊｌｌ。 位相差　Ｔ・ＩＧＵＲＥ　２Ａ 蛍光　Ｈにｔ；Ｉ＜ｉ、　２１！ 位相差　ＦＩＧＵＲＥ２Ｃ対照群 ＦＩＧＵＲＥ３Ａ ＦＩＧＵ赴３Ｂ　、７．１ｉｊ４１ｊｉ位相差　ｒ”ｌＧＵ旺４Ａ ↑イ日ｌＩ−＞）７７しＴ−ぜ部位の１、′Ｌ戸（固ｎ部位にＬ睨）ｎｃａ′ｕ ６ム（１） 利叩工＋１・７　「チー４２部１１用φ川ｔ［ｌ′ｔｎ（Ｘｆｕ　ＭＡ（４１ ｅｌ　ｌ　ｌｆｌ冒：二）：：＝会ｏｗｎｓ’：’：ｎ　：：：　：：：：、、 ：：：、：、：　：ｌ司ｎαルＪ！　６Ｂ（１） １＋１１工、）ヌクレアーゼ部位の位置鳳固有郭位に下線）１’１ｃｌＪＲｚ６ （、ＬＩＩ ｎｃＵｕ６Ｃ（２１ ト記（“嬶’ＩＦ＋！二゛、、１”７１下−七については部１、ｕ・見つからな か−、ｔこＦＩＣＩＩ［６Ｃｆ　’、＋１ しＸ′−１匍泡にもける１）漱１ＤＮＡ　復音体のインターナライセーノヨンＦ ＩＧＵＲ）：Ｔ ＦＩＧＩＪＲＩＥｌｌｌｔＩ３ １・ＴＧｔＪＲＨ８Ｃ対照Ｉ：１ う嘱１０Ａ ＦＩＧｔＪＲＥ１２Ａ　５０Ｘ トＩＧＵＲＪ二１２１３　７．ｉＱ＠ｌＰ　５０ＸＦＩＧＵ１２．Ｅ　１２Ｃ１ ００Ｘ ）ＩＧＩＪＲ「、＋２１）　スキ９伐１１阜　１００Ｘ・　ｔ　・２７．−′・ ’　、′：Ｊ１６’、ｌ−−ｈロー＋、゛−一′ ＦＩＧｔＪＲｒＥ　１２１”、　２５０Ｘ特表平７−５０７４５０　（２６） Ｆ４？１−　ノゴ ！：″ｌＧｔ、ｌｐｐ、　Ｉ’５ ＦＩＧＬＩＲＥ　１６Ａ ＦＩＧＴＪＲＥ１６Ｂ ＦＩＧＵＲＥ　１６Ｃ対照１！＋ ）ＩＧＵＲＥＪ６Ｄ ｐにＭ、Ｃ３Ｆ Ｒ５ｕｒｃ−ノぎ３ ・儂　・−−１１＋層−１１ ・、・１−　やｔｒ７＋ＩＩ ・嗜　・−一、１．（１゜ ・噛　・−一、１１ 書　・−一　完！１ｔｌＡ ・　媚寵−■−一−−・　申１１ 鴫−−−■■−−Ｈ）；１）１・ｉＩＪ日ＧＵＲＥＩ９Ａ ・・　ｅ　・−１鴨 ・　Ｊ　・−ｍ　、、、、。 ＠　噛−Ｔｈ　、：Ｌ曲パど；；（− ト・　・−１ｈ、１．Ｌ！ 日Ｇｕｔ旺１９Ｂ 、嗣胃製ヲ賛１■１１．１，１．１お。Ｌｂｌ＋−４，ｒ、・−１″ユヘーノ′ ヨノ（％”）ｌｌｉ間（時１ｉＪ免疫応答ＧＮ・ｌ−Ｃ３Ｆ （イレキュ・＼−−７コノ１ｉｉｉの値との山陵て表示）イレキュへ一ノヨノｊ ＆の時間（時間）フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，６識別記号　庁内整理番号Ｃ０７Ｈ２１１０４Ｂ　 ８６１５−４Ｃ（３１）優先権主張番号　９９２，６８７（３２）優先臼　１９ ９２年１２月１７日（３３）優先権主張国　米国（ＵＳ） ＦＩ （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。 ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ） 、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＬ　ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＮＥ 、ＳＮ。 ＴＤ、ＴＧ）、ＡＴ、ＡＵ、ＢＢ、ＢＧ、ＢＲ，ＣＡ。 ＣＨ，ＣＺ、ＤＥ、ＤＫ、ＥＳ、ＦＩ、ＧＢ、ＨＵ、ＪＰ、ＫＰ、ＫＲ，ＬＫ、 ＬＵ、ＭＧ、ＭＮ、ＭＷ、ＮＬ、Ｎｏ、ＮＺ、ＰＬ、ＰＴ、ＲＯ，ＲＵ、ＳＤ、 ＳＥ。 ＳＫ、ＵＡ、ＵＳ （７２）発明者　ツー、ニン アメリカ合衆国　９４１１６　カリフォルニア州　サンフランシスコ　セブンテ ィーンスアベニュ　２１３７

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. １．操作可能に結合された成分として、転写及び翻訳開始調節領域、対象となる 核酸配列並びに転写終結調節領域であると共に、該調節領域が哺乳類宿主の細胞 において作用するものと、任意には陽イオン性脂質キャリアと、を含み、且つ該 対象となる核酸配列がイントロンを含まない発現カセットの複合体。
2. ２．前記イントロンが前記核酸配列の５′側に配置されている請求の範囲第１項 記載の複合体。
3. ３．前記転写及び翻訳開始領域の５′側が少なくとも１つのエンハンサー配列及 びイントロンである請求の範囲第１又は２項記載の複合体。
4. ４．前記転写開始領域が組織特異性発現をもたらす前掲の請求の範囲のいずれか １項に記載の複合体。
5. ５．前記陽イオン性脂質キャリアがＤＤＡＢ、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、コレステ ロール及びＬ−ＰＥ、ＤＯＴＡＰ並びにＣＥＢＡから成る群より選択される１以 上の脂質により調製される前掲の請求の範囲のいずれか１項に記載の複合体。
6. ６．前記対象となる核酸配列がＣＦＴＲ又はインターロイキン２である前掲の請 求の範囲のいずれか１項に記載の複合件。
7. ７．前記発現カセットがｐＣＩＳ−ＣＡＴ、ｐＺＮ２７、ｐＺＮ５１、ｐＺＮ３ ２、ｐＺＮ４６である請求の範囲第１項に記載の複合体。
8. ８．操作可能に結合された成分として、転写開始調節領域、対象となる核酸配列 及び転写終結調節領域であると共に、該調節領域が哺乳類宿主の細胞において作 用するものと、任意には陽イオン性脂質キャリアと、を含む転写カセットの複合 体。
9. ９．前記対象となる核酸配列がアンチセンス配列である請求の範囲第８項に記載 の複合体。
10. １０．前掲の請求の範囲のいずれか１項に記載の複合体を含む医薬組成物。
11. １１．ヒト又は動物の体の治療方法における用途のために請求の範囲第１〜９項 のいずか１項の複合体又は請求の範囲第１０項の組成物。
12. １２．前記治療方法が複合体又は組成物の体内への全身性導入を含む請求の範囲 第１１項の用途の複合体又組成物。
13. １３．全身性遺伝子治療によるヒト若しくは動物の体の治療用薬剤の製造におけ る請求の範囲第１〜７項のいずか１項で規定される発現カセット又は請求の範囲 第８〜９項のいずれか１項に記載の転写カセットの用途。
14. １４．全身性遺伝子治療によるヒト若しくは動物の体の治療用薬剤の製造におけ る請求の範囲第１〜９項のいずか１項で規定される複合体の用途。
15. １５．肺又は肝臓に加えて少なくとも１つの細胞型又は組織が、哺乳類又はその 哺乳類の先祖へ全身的に導入された組換え遺伝子配列を含む非ヒトトランスジェ ニック哺乳類。
16. １６．組換え遺伝子配列が請求の範囲第１〜７項のいずか１項で規定される発現 カセット又は請求の範囲第８〜９項のいずれか１項に規定される転写カセットを 含む請求の範囲第１５項記載の非ヒトトランスジェニック哺乳類。
17. １７．前記細胞型又は組織が、脾臓、リンパ節、心臓、腎臓、骨髄及びＴリンパ 球から成る群より選択された１以上の細胞型又は組織である請求の範囲第１５又 は１６項記載の非ヒトトランスジェニック哺乳類。