JP2000516209A - カチオン性両親媒性物質／ｄｎａ複合体 - Google Patents

カチオン性両親媒性物質／ｄｎａ複合体

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ユー，ネルソン，エス．
ハリス，デビッド，ジェイ．
リー，エドワード，アール．
シーゲル，クレイグ，エス．
チャン，チャウ―ドウン
ハバード，シー．シャーリイ
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、生物学的活性（治療性）分子の細胞中への輸送を容易にする新規カチオン性両親媒性物質を提供する。この両親媒性物質は、ステロイドから、モノまたはジアルキルアミンから、あるいはアルキルまたはアシル基から誘導される親油性基および生理学的ｐＨでプロトン付与することができ、アミン、アルキルアミンまたはポリアルキルアミンから誘導されるカチオン性基を含有する。本発明はまた、治療組成物を提供し、この治療組成物は代表的に、１種または２種以上のカチオン性両親媒性物質の分散液を治療性分子と接触させることによって調製される。本発明の実施態様に従い細胞中に放出することができる治療性分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびポリペプチドを包含する。本発明の治療組成物の代表的用途は、遺伝子治療法を提供すること、およびアンチセンスポリヌクレオチドまたは生物学的活性ポリペプチドを細胞に放出することを包含する。遺伝子治療における治療組成物の場合、ＤＮＡは代表的に、カチオン性両親媒性物質と複合体を形成するプラスミドの形態で付与される。この新規な、格別に有効なプラスミド構築物はまた、炎症により複雑にされている臨床症状に対する遺伝子治療法の提供に実際に、有効である。さらにまた、本発明は、治療組成物の血管内投与による遺伝子治療する臓器に対するターゲティングに関する。

Description

【発明の詳細な説明】 カチオン性両親媒性物質／ＤＮＡ複合体 本出願は、１９９５年１０月１９日付けで出願され、「遺伝子治療用のカチオ ン性両親媒性物質／ＤＮＡ複合体の臓器特異性ターゲティング」（Ｏｒｇａｎ− Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ Ｃａｔｉｏｎｉｃ Ａｍｐｈｉ ｐｈｉｌｅ／ＤＮＡ Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ）と題する米国特許出願０８／５４５，４７３の継続出願である；この米国特許 出願それ自体は、１９９５年１０月１１日付けで出願され、「治療性分子を細胞 内に放出させるためのステロイド親油性基を含有するカチオン性両親媒性物質」 （Ｃａｔｉｏｎｉｃ Ａｍｐｈｉｐｈｉｌｅ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｓｔｅｒ ｏｉｄ Ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ Ｇｒｏｕｐｓ ｆｏｒ Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕ ｌａｒ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｓ）と題する米国特許出願０８／５４０，８６７の継続出願である；この米国特 許出願それ自体は、１９９４年１２月９日付けで出願された、「治療性分子を細 胞内に放出させるためのカチオン性両親媒性物質」（Ｃａｔｉｏｎｉｃ Ａｍｐ ｈｉｐｈｉｌｅ ｆｏｒ Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏ ｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）と題する米国特許出願０８ ／３５２，４７９の継続出願である。本出願はまた、（１）１９９５年９月２６ 日付けで出願され、「カチオン性脂質／ＤＮＡ複合体の分子モデル」（Ｍｏｌｅ ｃｕｌａｒ Ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｃａｔｉｏｎｉｃ Ｌｉｐｉｄ／ＤＮＡ Ｃｏ ｍｐｌｅｘｅｓ）と題する、Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｍａｉｌ Ｌａｂｅｌ ＴＢ７９ ８２２３１０７ＵＳとして同定されている米国予備特許出願（ｐｒｏｖｉｓｉｏ ｎａｌ ｐａｔｅｎｔ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）および（２）１９９５年９月 ２７日付けで出願され、「遺伝子治療用の治療性組成物の血管内放出」（Ｉｎｔ ｒａｖｅｎｏｕｓ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｃｏｍ ｐｏｓｉｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ）と題する、Ｅｘｐｒｅ ｓｓ Ｍａｉｌ Ｌａｂｅｌ ＥＦ１０９４３７０５１ＵＳとして同定されてい る米国予備特許出願に優先権を主張する出願である。 本出願はまた、１９９６年６月２０日付けで出願され、「遺伝子治療用のカチ オン性両親媒性物質／ＤＮＡ複合体の臓器特異性ターゲティグ」（Ｏｒｇａｎ− Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ Ｃａｔｉｏｎｉｃ Ａｍｐｈｉ ｐｈｉｌｅ／ＤＮＡ Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ）と題する、Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｍａｉｌ Ｌａｂｅｌ Ｎｏ．ＥＭ２８８７７８ ９７７ＵＳとして同定されている米国特許出願の継続出願である。 上記出願の全部の完全明細書、請求の範囲および図面を、それら全体を引用す ることによってここに組み入れる。 発明の背景 本発明は生物学的活性（治療性）分子の細胞内放出を容易にする新規カチオン 性両親媒性化合物に関する。本発明はまた、このようなカチオン性両親媒性物質 （ａｍｐｈｉｐｈｉｌｅｓ）を含有し、治療有効量の生物学的活性分子を患者の 細胞中に放出させるのに有用である医薬組成物に関する。本発明による新規カチ オン性両親媒性化合物は、遺伝子治療に関連して特に有用である。 かなりのタイプの生物学的活性分子の有効治療使用は簡単には達成することが できない。これは、そこでの処置が治療に有益である患者の特定の細胞中に、こ のような物質を治療有効量で放出させる方法が得られていないことによる。この ような分子を治療に充分な量で細胞中に有効放出することは、不可能ではないと しても、しばしば困難であった。これは、例えば細胞膜が選択的−透過性障壁を 提供するからである。さらにまた、生物学的活性分子の標的細胞への導入が成功 したとしても、これらの分子は、細胞の細胞質で直接分解されることがあり、あ るいは細胞中の構造体、例えば分解性プロセスに専従するリゾソーム区画に輸送 されさえすることがある。従って、治療効果を提供することができる、細胞に侵 入することができる物質の性質および最終的に細胞内の標的場所に到達するその 量の両方が、厳しく制限される。 このような選択性は一般に、適当な細胞機能を維持することができるためには 必要であるけれども、かなりの治療的に価値ある物質（またはその治療有効量） が排除されるという欠点をもたらす。さらにまた、複合体構造、挙動および生物 学的活性分子の細胞内放出の標的である完全組織がもたらす環境はしばしば、イ ンビトロで培養された細胞の増殖により示される場合に比較して、このような放 出を実質的に妨害する。 患者の組織に対する効果的なターゲティングがしばしば達成されない例には： （１）免疫グロブリン蛋白質を包含する多くの蛋白質、（２）ゲノムＤＮＡ、ｃ ＤＮＡまたはｍＲＮＡなどのポリヌクレオチド、（３）アンチセンス ポリヌク レオチド、および（４）ペプチドホルモンおよび抗生物質などの合成または天然 産出の多くの低分子量化合物がある。 多くの遺伝性疾病が付随する（あるいは種々の癌に包含される疾病危険因子を 意味する）欠陥遺伝子は単離され、確認されているが、このような遺伝子の正常 コピイを患者に付与することによって、これらの疾病状態それら自体を直す方法 （遺伝子治療の技術）が実質的に欠落していることは、現在の医療実施者が直面 している基本的挑戦の一つである。従って、そのための細胞内放出の改良方法の 開発は、医療上で格別に重要である。 遺伝子治療により処置することができる希望がある疾病の例には、遺伝性疾病 、例えば嚢胞性繊維症、ゴーシェ病、ファブリ病、および筋ジストロフィが包含 される。処置することができる後天性疾病の代表例には、（１）癌、多発性骨髄 腫、白血病、メラノーマ、卵巣悪性腫瘍および小細胞性肺癌；（２）心臓血管系 疾病、進行性心不全、再発狭窄症、および血友病；および（３）神経学的疾病、 外傷性脳損傷；がある。 遺伝子治療には、患者の標的細胞のトランスフェクションの成功が必要である 。トランスフェクションは一般に、発現性ポリヌクレオチド（例えば、遺伝子、 ｃＤＮＡまたはそこにパターン化されたｍＲＮＡ）を細胞中に導入する方法であ ると定義することができる。コード性ポリヌクレオチドの発現の成功は、正常蛋 白質の細胞内産生を導き、次いで異常遺伝子を付随する疾病状態の正常化を導く 。このような蛋白質を標的細胞に直接に供給することに基づく治療（蛋白質置き 換え治療）はしばしば、上記理由で無効である。 珍しくない致死的遺伝子障害である嚢胞性繊維症は、遺伝子治療の目標である 疾病の特別の例である。この疾病は、嚢胞性繊維症貫膜コンダクタンスレギュレ ーター（ｃｙｓｔｉｃ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｃｏ ｎｄｕｃｔａｎｃｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）（“ＣＦＴＲ”）として知れており 、肺上皮細胞を包含する上皮細胞の細胞膜を横切るイオンの移動（およびそのた めの流体の移動）を調節する、タンパク質をコードする遺伝子における一つまた は二つ以上の変異の存在によって発症する。気道細胞における異常なイオン輸送 は、異常な粘膜分泌、炎症および感染、組織損傷および究極的に死を導く。 遺伝子治療が、ある種の疾病状態のための長期間持続性で、予測できる形態の 治療を提供することが広く望まれており、これはまた、かなりの遺伝性疾病に適 する唯一の治療形態である。しかしながら、機能性遺伝子の細胞中への導入を容 易にし、この点に関する活性が遺伝子またはその他の生物学的活性治療性分子を 細胞内治療効果に充分な濃度でインビボ放出するのに充分である化合物を開発す るという臨床上の必要性が残されている。 報告されている開発 非極性および極性の両方の環境と（例えば、血漿膜、組織液体、細胞内の画室 および生物学的活性分子それ自体の中で、または上で）、相互作用しなければな らない生物学的活性分子の細胞内放出を容易にするためにデザインされている多 くの化合物において、このような化合物はタイプとして、非極性ドメインおよび 極性ドメインの両方を含有するようにデザインされる。このようなドメインの両 方を有する化合物は、両親媒性物質と称することができ、このような細胞内放出 （インビトロまたはインビボ用途）を容易にするために使用されるものとして開 示されている多くの脂質および合成脂質は、この定義に適合する。このような両 親媒性物質の一つの特に重要なクラスは、カチオン性両親媒性物質である。一般 に、カチオン性両親媒性物質は、生理学的ｐＨまたはその近くで、正に帯電する ことができる極性基を有し、この性質は、両親媒性物質がかなり多くの種類の生 物学的活性（治療性）分子、例えばＤＮＡなどの負に帯電したポリヌクレオチド を包含する分子とどのように相互作用するかを見定めるために当技術で重要であ ると理解されている。 非極性ドメインおよび極性ドメインの両方を有し、生物学的活性分子の細胞内 放出に関して有用であると述べられているカチオン性両親媒性化合物の例は、例 えば下記の刊行物に見出され、これらの刊行物はまた、（１）このような用途に 適するものとすることが当技術で理解されている性質、および（２）細胞内放出 が意図される治療性分子により、このような両親媒性物質を複合体化することに よって形成される、当技術で理解されている本来の構造にかかわる有用な討論、 を包含している。 （１）Ｆｅｌｇｎｅｒ等によるＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ Ａ， ８４，７４１３〜７４１７（１９８７）は、トランスフェクションに適する 脂質／ＤＮＡ複合体を形成するための、Ｎ-[1−（２，３−ジオレイルオキシ） プロピル]−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド（“ＤＯＴＭＡ” ）を包含する正に帯電した合成カチオン性脂質の使用を開示している。Ｆｅｌｇ ｎｅｒ等によるＴｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅ ｍｉｓｔｒｙ ，２６９（４），２５５０〜２５６１（１９９４）をまた参照でき る。 （２）Ｂｅｈｒ等によるＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８ ６，６９８２〜６９８６（１９８９）は、ジオクタデシルアミドグリシルスペル ミン（“ＤＯＧＳ”）を包含する多くの両親媒性物質を開示している。 （３）Ｅｐａｎｄ等に対する米国特許５，２８３，１８５は、“ＤＣ−ｃｈｏ ｌ”と称される３β−[Ｎ−(Ｎ1，Ｎ1−ジメチルアミノエタン）カルバモイル］ コレステロールを包含する追加のクラスおよび種類の両親媒性物質を開示してい る。 （４）生物学的活性分子の細胞中への輸送を容易にする追加の化合物は、Ｆｅ ｌｇｎｅｒ等に対する米国特許Ｎｏ．５，２６４，６１８に記載されている。Ｆ ｅｌｇｎｅｒ等によるＴｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ，２６９（４），２５５０〜２５６１（１９９４）をまた参 照でき、ここには“ＤＭＲＩＥ”、１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３− ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウムブロマイドを包含する追加の化合物が 記載されている（これについては以下で説明する）。 （５）生物学的活性分子の細胞内放出に適する両親媒性物質にかかわる情報は また、Ｇｅｂｅｙｅｈｕ等に対する米国特許Ｎｏ．５，３３４，７６１およびＦ ｅｌｇｎｅｒ等によるＭｅｔｈｏｄｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ ｏｇｙ），５，６７〜７５（１９９３）に見出される。 上記刊行物に挙げられている化合物は、生物学的活性分子の細胞中への導入を 容易にすることが証明されているけれども（しかし、かなりのこのような場合は 、インビトロのみである）、これにより提供される取り込み効率は多くの治療用 途、特に遺伝子治療を援助するには不充分である。さらに、上記化合物は、あま り大きくない活性のみを有するものと理解されるので、その実質的量はこのよう な化合物またはその代謝物の毒性を先ず考慮して使用されなければならない。従 って、治療の成功が達成できるのに充分に活性であるカチオン性両親媒性物質の 「第二世代」の開発が必要である。 発明の要旨 本発明は、生物学的活性分子の細胞中への輸送を容易にするのに特に有効なカ チオン性両親媒性物質を提供する。本発明によるカチオン性両親媒性物質は、４ つの（４）グループに分類されるが、かなりの両親媒性物質には、共通の或る構 造上および機能上の特徴が見出される。 従って、本発明は生物学的活性分子の細胞中への輸送を容易にすることができ るグループＩのカチオン性両親媒性物質を提供する（図１、パネルＡ、Ｂおよび Ｃ参照）。この両親媒性物質は下記構造式（Ｉ）を有する： 式中、 Ｚは、ステロイドであり； Ｘは、炭素原子または窒素原子であり； Ｙは、短い結合基であるか、またはＹは存在しておらず； Ｒ3は、Ｈであるか、あるいは飽和または不飽和の脂肪族基であり； Ｒ1は、−ＮＨ−、アルキルアミンまたはポリアルキルアミンであり； Ｒ4は、Ｈであるか、あるいは飽和または不飽和の脂肪族基であり； Ｒ2は、−ＮＨ−、アルキルアミンまたはポリアルキルアミンであり； そしてＲ1はＲ2と同一または相違する、ただしＲ1およびＲ2の両方が−ＮＨ− であることはできない。 好適態様の一つにおいて、ステロイド部分「Ｚ」は、３−ステロール類からな る群から選択され、このステロール分子は、その３−Ｏ−基により、またはその 代わりのＮ−によって、Ｙに結合している（またはＹが存在していない場合には 、Ｘに直接に結合している）。本発明のこの態様に従う特に有効な両親媒性物質 は、例えばスペルミジンコレステロールカルバメート（Ｎ4−スペルミジンコレ ステリルカルバメート、両親媒性物質Ｎｏ．５３）およびスペルミンコレステロ ールカルバメート（Ｎ4−スペルミンコレステリルカルバメート、両親媒性物質 Ｎｏ．６７）ならびにそこにパターン化された両親媒性物質を包含する。 もう一つの好適態様において、ステロイド基は、ステロイド核の環位置１７か ら（図１および２２参照）、あるいは多くのステロイドの位置１７から垂直に伸 びている腕から（図１のコレステロールの構造参照）、あるいは上記腕のいずれ かの短縮された形態から、Ｙに結合する（またはＹが存在していない場合には、 Ｘに直接に結合する）。 別の好適態様において、結合基Ｙ内には、それら自体がＸとＺとの間の共有結 合の架橋を形成している約３個または４個よりも多くない原子を含有する。本発 明の特に好適な態様において、Ｙは、この基の１個よりも多くない原子がＸおよ びＺの両方との結合を形成する結合基であるか、あるいはＹは存在していない。 グループＩにより提供される代表的両親媒性物質は、下記の化合物を包含する ： さらにまた、生物学的活性分子の細胞中への輸送を容易にすることができるグ ループＩＩ（図５参照）のカチオン性両親媒性物質が提供される。この両親媒性 物質は下記構造式（ＩＩ）を有する： 式中、 Ｚは、ステロイドであり； Ｘは、炭素原子または窒素原子であり； Ｙは、結合基であるか、またはＹは存在しておらず； Ｒ3は、アミノ酸、誘導体化アミノ酸、Ｈまたはアルキルであり； Ｒ1は、−ＮＨ−、アルキルアミンまたばポリアルキルアミンであり； Ｒ4は、アミノ酸、誘導体化アミノ酸、Ｈまたはアルキルであり； Ｒ2は、−ＮＨ−、アルキルアミンまたはポリアルキルアミンであり； そしてＲ1はＲ2と同一または相違する、ただしＲ1およびＲ2の両方が−Ｎ Ｈ−であることはできない。 グループＩＩに従い提供される代表的両親媒性物質は、下記の化合物を包含す る： さらにまた、生物学的活性分子の細胞中への輸送を容易にすることができるグ ループＩＩＩ（図６参照）のカチオン性両親媒性物質が提供される。この両親媒 性物質は下記構造式（ＩＩＩ）を有する： 式中、 Ｚは、そのＮ原子によりＹに（あるいはＹが存在していない場合は、Ｘに直接 に）結合しているアルキルアミンまたはジアルキルアミンであり、Ｚがジアルキ ルアミンである場合、そのアルキル基は同一または相違することができ； Ｘは、炭素原子または窒素原子であり； Ｙは、短い結合基であるか、またはＹは存在しておらず； Ｒ3は、Ｈであるか、あるいは飽和または不飽和の脂肪族基であり； Ｒ1は、−ＮＨ−、アルキルアミンまたはポリアルキルアミンであり； Ｒ4は、Ｈであるか、あるいは飽和または不飽和の脂肪族基であり； Ｒ2は、−ＮＨ−、アルキルアミンまたはポリアルキルアミンであり； そしてＲ1はＲ2と同一または相違する、ただしＲ1およびＲ2の両方が−ＮＨ− であることはできない。 構造式（ＩＩＩ）に従い提供される両親媒性物質についてはまた、結合基Ｙ内 に、それら自体がＸとＺとの間の共有結合の架橋を形成している約３個または４ 個よりも多くない原子を含有すると好ましい。本発明の特に好適な態様において 、Ｙは、結合基、例えば＞Ｃ＝Ｏであり、この基の１個よりも多くない原子がＸ およびＺの両方との結合を形成しており、あるいはＹは存在していない。 グループＩＩＩに従い提供される代表的両親媒性物質は、下記の化合物を包含 する： さらにまた、生物学的活性分子の細胞中への輸送を容易にすることができるグ ループＩＶ（図７参照）のカチオン性両親媒性物質が提供される。この両親媒性 物質は下記構造式（ＩＶ）を有する： 式中、 ＡおよびＢは独立して、Ｏ、ＮまたはＳであり： Ｒ5およびＲ6は独立して、アルキルまたはアシル基であり、この基は飽和され ていてもよく、あるいは不飽和部位を含有していてもよく； Ｃは、−ＣＨ2−、＞Ｃ＝Ｏおよび＞Ｃ＝Ｓからなる群から選択され； Ｅは、炭素原子または窒素原子であり； Ｄは、−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）−または−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−などの結合基であり、ある いはＤは存在しておらず； Ｒ3は、Ｈであるか、あるいは飽和または不飽和の脂肪族基であり； Ｒ1は、−ＮＨ−、アルキルアミンまたはポリアルキルアミンであり； Ｒ4は、Ｈであるか、あるいは飽和または不飽和の脂肪族基であり； Ｒ2は、−ＮＨ−、アルキルアミンまたはポリアルキルアミンであり； そしてＲ1はＲ2と同一または相違する、ただしＲ1およびＲ2の両方が−ＮＨ− であることはできない。 グループＩＶの代表的両親媒性物質は、下記の化合物を包含する： 本発明はまた、１種または２種以上のカチオン性両親媒性物質および１種また は２種以上の生物学的活性分子を含有する医薬組成物を提供し、この組成物は治 療有効量の生物学的活性分子の患者の組織における細胞内放出を容易にする。本 発明の医薬組成物は、当該組成物を保存に対して安定にし、そして（または）生 物学的活性分子の細胞内放出を成功させるのに寄与する、１種または２種以上の 追加の生理学的に許容される物質を含有するように調剤することができる。 もう一つの態様において、本発明は生物学的活性分子の細胞中への輸送を容易 にする方法を提供し、この方法は本発明によるカチオン性両親媒性物質の分散液 を調製する段階、この分散液を生物学的活性分子と接触させ、上記カチオン性両 親媒性物質と上記分子との複合体を生成させる段階、および上記複合体を細胞と 接触させ、これにより上記生物学的活性分子の細胞中への輸送を容易にする段階 からなる。 医薬として使用する場合に、本発明によるカチオン性両親媒性物質は、当技術 で公知の物質を包含する１種または２種以上の追加のカチオン性両親媒性物質と ともに、あるいは中性補−脂質（ｃｏ−ｌｉｐｉｄ）、例えばジオレオイルホス ファチジルエタノールアミン（“ＤＯＰＥ”）とともに処方して、生物学的活性 分子の細胞への放出を容易にすることができる。さらにまた、１種または２種以 上の本発明によるカチオン性両親媒性物質を含有する組成物を使用して、生物学 的活性分子を組織培養中の植物細胞などの植物細胞に導入することができる。 さらにまた、本出願は、遺伝子治療により患者を処置するために、本発明によ るカチオン性両親媒性物質と複合体を形成し、これにより相当する治療性トラン スゲン（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）の高レベル発現を達成することができるのに適す る新規プラスミドを提供する。その代表例は、プラスミドｐＣＭＶＨＩおよびｐ ＣＦＬを包含する。ｐＣＦ１プラスミドは、サイトメガロウイルスの即時型初期 遺伝子からのエンハサー／プロモーター領域を含有する。このプラスミドはまた 、プロモーターとトランスゲンｃＤＮＡとの間に位置するハイブリッド イント ロンを含有する。ウシ成長ホルモン遺伝子のポリアデニル化シグナルは、このト ランスゲンから下流の配置について選択される。これらの特徴およびその他の特 徴は、このプラスミドを用いて達成できる改良されたトランスゲン発現に実質的 に寄与する。 プラスミド挙動における追加の増強は、複製エピソームプラスミドを用意する ことによって可能にされる。さらに治療上の増強は、治療性トランスゲン発現が 、標的組織の炎症関連物質の濃度に対して感受性である転写プロモーターの制御 の下に置かれるプラスミドを用意することによって可能にされる。このようなプ ラスミドは、炎症が主要症状である臨床症状の処置に特に使用される。 本発明のさらにもう一つの態様において、特定の臓器または組織を、両親媒性 物質／トランスゲン複合体の血管内投与によって、このような複合体における両 親媒性物質とＤＮＡとの比率を調整することによって、およびその見掛け上の変 化またはゼータ電位を調整することによって、遺伝子治療用の標的にすることが できる。 本発明の追加の、そして代表的態様を、以下に示す発明の詳細な説明に従い説 明する。 図面の簡単な説明 図１は、代表的グループＩカチオン性両親媒性物質を示している。 図２は、代表的ステロイド親油性基性を示している。 図３は、代表的ステロイド親油性基性を示している。 図４は、トランスアシル化反応を示している。 図５は、代表的グループＩＩカチオン性両親媒性物質を示している。 図６は、代表的グループＩＩＩカチオン性両親媒性物質を示している。 図７は、代表的グルーブＩＶカチオン性両親媒性物質を示している。 図８は、スペルミジンコレステロールカルバメートの合成経路を提供している 。 図９は、スペルミンコレステロールカルバメートの合成経路を提供している。 図１０は、特定の条件下における或る両親媒性物質のインビボ トランスフェ クション効率の比較を示すしている。 図１１は、特定のカチオン性両親媒性物質にかかわるＤＮＡ濃度の関数として のインビボ トランスフェクション効率を示すグラフである。 図１２は、特定のカチオン性両親媒性物質にかかわるＤＮＡ濃度の関数として のインビボ トランスフェクション効率を示すグラフである。 図１３は、グループＩ両親媒性物質の相対的トランスフェクション効率を示し ている。 図１４は、グループＩＩ両親媒性物質の相対的トランスフェクション効率を示 している。 図１５は、グループＩＶ両親媒性物質の相対的トランスフェクション効率を示 している。 図１６は、ｐＣＭＶＨＩ−ＣＡＴプラスミドのマップを示している。 図１７は、ｐＣＭＶＨＩ−ＣＡＴのハイブリッド イントロンを示している。 図１８（パネルＡ）は、ｐＣＦ１−ＣＡＴプラスミドのマップを示している。 図１８（パネルＢ）は、ｐＣＦ２／ＣＡＴプラスミドのマップを示している。 図１９（パネルＡ）は、嚢胞性繊維症患者からのｐＣＭＶ−ＣＦＴＲトランス フェクション鼻ｐｏｌｙｐ上皮細胞における修正クロライドイオン輸送を示す図 解図である。 図１９（パネルＢ）は、ｐＣＭＶ−β−ガラクトシダーゼ対照を使用するクロ ライドイオン輸送を示す図解図である。 図２０は、ｐＭｙｃ４−ＣＦＴＲプラスミドのマップを示している。 図２１は、心臓および肺の血管内ターゲティングを証明している。 図２２は、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける血管内投与後のＳＥＡＰの発現を証明 している。 発明の詳細な説明 本発明のカチオン性両親媒性物質の構造に関する情報 本発明は、カチオン性両親媒性物質およびこれらを含有する組成物を提供し、 これらは生物学的活性分子の細胞への輸送を容易にするために有用である。この 両親媒性物質は、生物学的活性ポリヌクレオチドの細胞中への、特に遺伝子治療 の目的で患者の細胞中への輸送を容易にするのに特に有用である。 本発明の実施態様に従うカチオン性両親媒性物質は、数種の新規特徴を有する 。これらの特徴は、例えばＥｐａｎｄ等に対する米国特許Ｎｏ．５，２８３，１ ８５に記載されているもののようなカチオン性両親媒性構造体に比較して［この 特許の代表的構造体は、“ＤＣ−ｃｈｏｌ”として−般に知られている、３β− ［Ｎ［（Ｎ1，Ｎ1−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロールで ある］およびＢｅｈｒ等によりＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ，８６，６９８２〜６９８６（１９８９）に記載されているものに比較して［こ の刊行物の代表的構造体は、ジオクタデシルアミドログリシルスペルミン（“Ｄ ＯＧＳ”）である］、見ることができる。 本発明のカチオン性両親媒性物質は、示差的構造特徴を有する、すなわち（１ ）それら自体がアミノ、アルキルアミノまたはポリアルキルアミノ基を有する２ 個のカチオン性基（下記参照）に、直接にまたは結合基を経て結合しており、こ れにより総合的に、また新規な「Ｔ−型」構造を形成する親油性基の存在、およ び（２）かなりの場合に、そして多くの当技術で認識されている両親媒性物質と 比較して、両親媒性物質の親油性領域およびカチオン性領域を密接に近接させて いる比較的短い結合基の使用。理論に制限されることはないが、これらの特徴は 、これらの化合物のトランスフェクション−増進能力に実質的に寄与するものと 信じられる。この例として、下記図１０は、２種の十分に認識されているトラン スフェクタント（ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｎｔ）であるＤＣ−ｃｈｏｌおよびＤＭ ＲＩＥに比較した、スペルミジンコレステロールカルバメート（本発明の新規両 親媒性物質）の非常に実質的なインビボ トランスフェクション−増進能力を証 明している。 本発明の実施に関連して、「カチオン性」の用語は、本明細書で定義されてい るＲ基が生理学的ｐＨまたはその付近のｐＨを有する溶液中で１個または２個以 上の正電荷を有することを意味する。このようなカチオン性特性は、両親媒性物 質と治療性分子（例えば、核酸）との、あるいは細胞構成体（例えば、血漿膜糖 蛋白質）との相互反応を増進させ、治療性分子の細胞中への侵入の成功に寄与す るか、あるいはその構成部分（例えば、核）内におけるプロセッシングに寄与す ることができる。この点に関して、読み手は、カチオン性両親媒性物質のトラン スフェクション−増進機能にかかわる当技術の多くの理論を参照することができ る（これらの理論は本発明の実施態様を制限するものと理解されるべきではない ）。 本発明の実施態様に従い細胞中への輸送を容易にすることができる生物学的分 子は、例えばゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡまたはＤ ＮＡ、ポリペプチドおよび低分子量医薬またはホルモン類を包含する。その代表 例は本発明の治療（医薬）組成物の説明に関連して以下に挙げられている。 本発明の重要な態様において、生物学的活性分子は、患者の細胞に置かれると 発現し、代謝欠損の修正を導くコード性ポリヌクレオチドである。特に重要な例 では、このポリヌクレオチドは、ヒト嚢胞性繊維症貫膜レギュレーター（“ＣＦ ＴＲ”）のアミノ酸配列に十分に重複するアミノ酸配列を有するポリペブチドを コードし、上皮細胞アニオンチャンネルを調節する生物学的性質を有することを 可能にする。 前記したように、本発明の両親媒性物質の特性および新規特徴は、第一に、２ 個のカチオン性アミン基を親油性基に結合する結合基が非常に短いか、または全 く存在していないこと、および第二に、生成した２個のカチオン性Ｒ基の親油性 基への結合が、例えば構造体（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）および（ＩＶ）に示 されているように、原子“Ｘ”（炭素または窒素原子）の位置から見て、Ｔ−型 構造を形成していることにある（原子“Ｅ”参照）。 本発明のカチオン性両親媒性物質の例として、スペルミジンコレステロールカ ルバメート（Ｎ4−スペルミジンコレステリルカルバメート）およびスペルミン コレステロールカルバメート（Ｎ4−スペルミンコレステリルカルバメート）は 両方共に、別段では等量のカチオン性アルキルアミン構造を有する非Ｔ−型構造 を有する両親媒性物質と比較して、インビボで優れたトランスフェクタントであ ることが証明された。この優れた挙動（例３をまた参照できる）は、 を、例えば と比較して証明された。 さらにまた、この優れた挙動は、 を、例えば および と比較して証明された。 本出願人はまた、本発明のカチオン性両親媒性物質が、天然産出ポリアミン類 、例えばスペルミンまたはスペルミジン（Ｎ−原子空間を包含する）と共通する 構造上の特徴を有することに気付いた。この点に関して、両親媒性物質５３、６ ７、９０および９１の構造は代表的である。図１３、１４および１５のデータの 検討から見ることができるように、両親媒性物質の極性先行基中の窒素原子が３ 個または４個の炭素原子の１種または２種以上の組合わせにより分離されている ように配置していると、そこに複合体化されたプラスミド トランスゲンに対し て高いインビボ トランスフェクション効率が導かれる。本出願人はまた、これ らの共通の構造が両親媒性物質のＤＮＡへの結合に対して、および細胞表面ポリ アミンレセプターとの相互反応に対して、有用な効果を有することがあることに 気付いた。このような細胞のＤＮＡ複製要件はこのようなレセプターの高レベル 発現を導くことができることから、この細胞ポリアミンレセプターとの相互反応 は、遺伝子治療による癌の処置に関して特に重要であることができる。グループＩ両親媒性物質 本発明のグループＩ両親媒性物質のデザインに関して、下記の考察に留意すべ きである。これらのデサインの特徴の多くを、本発明の別種の両親媒性物質、す なわちグループＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶに分類される両親媒性物質と関連して説 明する。 従って、生物学的活性分子の細胞中への輸送を容易にすることができるグルー プＩカチオン性両親媒性物質が提供される（図１、パネルＡ、ＢおよびＣ参照） 。この両親媒性物質は下記構造式（Ｉ）を有する： 式中、 Ｚは、ステロイドであり； Ｘは、炭素原子または窒素原子であり； Ｙは、短い結合基であるか、またはＹは存在しておらず； Ｒ3は、Ｈであるか、あるいは飽和または不飽和の脂肪族基であり； Ｒ1は、−ＮＨ−、アルキルアミンまたはポリアルキルアミンであり； Ｒ4は、Ｈであるか、あるいは飽和または不飽和の脂肪族基であり； Ｒ2は、−ＮＨ−、アルキルアミンまたはポリアルキルアミンであり； そしてＲ1はＲ2と同一または相違する、ただしＲ1およびＲ2の両方が−ＮＨ− であることはできない。結合基 親油性基を２個のカチオン性Ｒ基に結合する結合基は好ましくは、比較的短い 。結合基Ｙ内に約３個または４個よりも多くない原子を含有し、これらの原子は それら自体がＸとＺとの間の共有結合の架橋部を形成していると好ましい。Ｙ基 の例には、−（ＣＨ2）2−；−（ＣＨ2）3−；−（ＣＨ2）−（Ｃ＝Ｏ）−；− （ＣＨ2）ｎ−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−（ここで、ｎは好ましくは４またはそれ以下 である）が包含される。本発明の実施態様で有用な追加の結合基は、グリシニル 、アラニル、ベーターアラニル、セリニルなどのような小型アミノ酸上にパター ン化されたものである。 上記代表例にかかわり、その左側は図示されているように、原子“Ｘ”に結合 する傾向を有するものであり、そしてその右側は基“Ｚ”に結合する傾向を有す るものである（構造式Ｉ参照）。 本発明の或る好適態様において、Ｙは結合基であり、この基中に存在する１個 よりも多くない原子が“Ｘ”および“Ｚ”の両方と結合を形成している。好適結 合基の例は、−ＣＨ2−、＞Ｃ＝Ｓおよび＞Ｃ＝Ｏを包含する。別様に、この結 合基Ｙは、全く存在していなくてもよい。 前記したように（直前に記載されている構造式Ｉ参照）、“Ｘ”は両親媒性物 質の連結点を形成しており、ここにはまた、２個のカチオン性Ｒ基が結合する。 ここで見ることができるように（図１をまた参照できる）、“Ｘ”を代表する窒 素原子の配置は、分子を確実にＴ−型構造にする。ステロイド親油性基 本発明の実施態様に従うカチオン性両親媒性物質は、親油性基として種々の構 造体を包含することができる。ステロイドは、このような構造体の好適基の代表 例である。 本発明の実施態様に従う親油性基としてのステロイドのデザインおよび配向（ ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）に関して、下記の考察に留意すべきである。ステロイ ドは動物、微生物および植物界に広く分布している。これらは、代表的に、それ らの基本骨格として、ペルヒドロシクロペンテノフェナントレン環系の形態で配 置されている１７炭素原子を含有する固形アルコール化合物であると定義するこ とができる。従って、このような化合物は、胆汁酸、コレステロールおよび関連 物質、ビタミンＤ、或る種の昆虫脱皮ホルモン、或る種の性ホルモン、コルチコ イドホルモン、或る種の抗生物質、および追加の環が付加されているか、または 環が基本構造から削除されている上記全部の誘導体を包含することができる［当 技術でステロイドであると理解されている広い種類の分子の追加の詳細について は、Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｋ．Ｎａｋａｎ ａｓｈｉ等編集、Ａｃａｄｍｉｃ出版社，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９７４），１巻 、６章を参照することができる］。 さらに、本発明の目的にかかわり、ステロイドの用語は、複数のイソプレノイ ド単位、例えばビタミンＥから誘導される関連分子を広く包含して使用されてい る。本発明の実施に有用な代表的ステロイドは図１、２、３および５に示されて いる。 以下で説明するように、本発明の或る好適両親媒性物質は、３−ステロール類 からなる群から選択されるステロイド成分“Ｚ”を包含し、このステロール分子 は、その３−Ｏ−基により、またはその代わりに、Ｎ−により、Ｙに結合する（ 図１参照）。このような構造体には、例えばスペルミジンコレステロールカルバ メート、スペルミンコレステロールカルバメート、スペルミジン７−デヒドロコ レステリルカルバメート、リジン３−Ｎ−ジヒドロコレステリルカルバメート、 スペルミジンコレスタミン尿素、およびＮ−３−アミノプロピル−Ｎ−４−アミ ノブチルコレスタミンが包含される。 もう一つの好適態様において、ステロイド基は、ステロイド核の環位置１７か ら（図１および３参照）、あるいはかなりのステロイドにおいて、位置１７から 垂直に伸びている腕から（図１および３参照）、あるいは上記腕のいずれか短縮 されたものから、Ｙに（またはＹが存在していない場合には、Ｘに直接に）結合 している。 本発明の両親媒性物質に包含されるものとしてのステロイドの選択に関して、 分子が、その使用用量で無毒であり、かつまた身体により代謝されることができ る構造を有すると好ましい。実質的に無毒であり、また生物学的に正常な立体特 異性を有し、これにより患者におけるそれらの安全な代謝を促進する、コレステ ロールおよびエルゴステロールなどのステロイドは好適である。本発明の実施態 様で有用な追加のステロイドには、例えばエルゴステロールＢ１、エルゴステロ ールＢ２、エルゴステロールＢ３、アンドロステロン、コール酸、デスオキシコ ール酸、ケノデスオキシコール酸、リソコール酸、および例えば図２および３の 表に示されているようなその各種誘導体が包含される。 ステロイド親油性基の配向、すなわちこの基が両親媒性物質のカチオン性（ア ルキル）アミン基に、（結合基を経て、または結合基を経ることなく）、どのよ うに結合しているかに関して、下記の追加の情報に留意すべきである。ステロイ ド上のすべての置換基または環位置は一般に、結合地点として使用することがで きる。しかしながら、（１）複雑な化学合成を簡単にし、かつまた（２）ステロ イド分子のどちらかの末端近くに位置する、例えば環位置３の近くの位置または 環位置１７の近くの位置（またはそこから特徴的に伸びている腕）である結合地 点を使用すると好ましい。このような位置は、二重層形成を促進し、そして（ま たは）ミセル形成を促進し、そして（または）標的細胞中に運ばれる生物学的活 性分子との相互反応を安定化する両親媒性物質構造体の残りの部分に対する配向 をステロイドに付与する。その環位置１７から伸びている腕を経るステロイド親 油性基へのカチオン性（アルキル）アミン基の結合を示す代表的構造は、図３（ パネルＡ、Ｂ）に示されている。このタイプの構造に関して、ステロイド上のい ずれかの極性基、例えば環位置３に結合することができる極性基は、潜在的に脱 安定性の二重層またはミセル構造を回避するために、取り除くか、または遮蔽す ると好ましい（例えば、メトキシとしてのヒドロキシ）。 そのステロイド親油性基がステロイド環位置１７を経てカチオン性（アルキル ）アミン基に結合している、図３に示されているカチオン性両親媒性物質は本発 明の例である。同様に、そのステロイド親油性基がステロイド環位置３を経てカ チオン性（アルキル）アミン基に結合している、図１〜４に示されているカチオ ン性両親媒性物質も本発明の例である。上記したように、結合地点として、いず れのステロイド環位置（またはそこから伸びている部分または分枝）も、本発明 の実施態様の範囲内にある。 本発明の実施態様に従う基“Ｚ”として使用するのに好適なステロイドは下記 のステロイドを包含する：３−ステロール（コレステロールから誘導） ３−Ｎ−ステリル基（コレステロール上にパターン化） エルゴステロールおよび誘導体 エルゴステロール上にパターン化されており、そして本発明のカチオン性両親 媒性物質の構造を定めるために使用することができるステロイドの代表例には、 エルゴステロール（示されているとおりの二重結合）：エルゴステロールＢ１（ Δ８、９；Δ１４、１５；Δ２２、２３）；エルゴステロールＢ１（Δ６、７； Δ８、１４；Δ２２、２３）；エルゴステロールＢ１（Δ７、８；Δ１４、１５ ；Δ２２、２３）；およびルミステロール（エルゴステロールの９ｂ−Ｈ異性体 ）が包含される。コール酸および誘導体 コール酸上にパターン化されており、そして本発明のカチオン性両親媒性物質 の構造を定めるために使用することができるステロイドの代表例には、γ1およ びγ2＝ＯＨであるコール酸；γ1＝Ｈおよびγ2＝ＯＨであるデソキシコール酸 ；およびγ1＝ＯＨおよびγ2＝Ｈであるケノデソキシコール酸；およびγ1およ びγ2＝Ｈであるリトコール酸が包含される。アンドロステロンおよびその誘導体 基Ｒ1 、Ｒ2 、Ｒ3およびＲ4の選択 Ｒ3 およびＲ4について： 本発明の実施態様に従い、Ｒ3およびＲ4は独立して、Ｈであるか、あるいは飽 和または不飽和の脂肪族基である。この脂肪族基は分枝鎖状または非分枝鎖状で あることができる。代表的基は、アルキル、アルケニルおよびシクロアルキルを 包含する。Ｒ1 およびＲ2について： Ｒ1およびＲ2は、アミン、アルキルアミン（一級、二級および三級アミンを包 含する）または本明細書で「ポリアルキルアミン」と称されている、その拡大さ れた基として、当技術で認識されている構造を表わす。本明細書で定義されてい るものとして、アルキルアミン基およびポリアルキルアミン基は１個または２個 以上の炭素−炭素二重結合を含有することができ、従ってこのようなアルケニル アミンの使用は本発明の実施態様の範囲内にあるものと理解する。 代表的アルキルアミンは、（ａ）−ＮＨ−（ＣＨ2）Z−（ここで、ｚは０以外 である）；（ｂ）−［［ＣＨ3（ＣＨ2）Y］Ｎ］−（ＣＨ2）Z−（ここで、ｚは ０以外である）；および（ｃ）−［［ＣＨ3（ＣＨ2)X］［ＣＨ3（ＣＨ2）Y］］ Ｎ−（ＣＨ2）Z−（ここで、ｚは０以外である）を包含する。 Ｒ1およびＲ2の一方または両方が上記構造（ｃ）で表わされるような三級アミ ンである場合について、相当する場合に、Ｒ3またはＲ4のどちらかに相当する水 素原子は、存在していてもよく、あるいは存在していなくてもよいものと理解す る。この理由は、このような水素原子がそのプロトン化レベルがｐＨにより変化 するＮ：Ｈ（＋）構造に相当することによる。 本明細書で使用されているものとして、「ポリアルキルアミン」の用語は、少 なくとも２個のアルキルアミンが結合しているポリマー構造体を表わす。このよ うに結合しているアルキルアミン単位は、一級または二級であることができ、ま た生成したポリアルキルアミンは一級、二級または三級Ｎ−原子を含有すること ができる。このアルキルアミン（付属）単位は、飽和されていてもよく、または 不飽和であってもよく、従って「アルキルアミン」の用語は、本発明の記載にお いてアルケニルアミンを包含する。 代表的生成ポリアルキルアミンは、（ｄ）−［ＮＨ−（ＣＨ2）(Z)］ｑ−（こ こで、ｚは０以外であり、そしてｑは２または３以上である）；（ｅ）−［ＮＨ −（ＣＨ2）(Y)］P−［ＮＨ−（ＣＨ2）(Z)］ｑ−（ここで、ｙおよびｚはそれ ぞれ、０以外であり、そしてｐおよびｑはそれぞれ、０以外である）；（ｆ）− ［ＮＨ−（ＣＨ2）(X)］ｎ−［ＮＨ−（ＣＨ2）(Y)］P−［ＮＨ−（ＣＨ2）(Z) ］ｑ−にこで、ｘ、ｙおよびｚはそれぞれ、０以外であり、そしてｎ、ｐおよび ｑはそれぞれ、０以外である）；（ｇ）−［ＮＨ−（ＣＨ2）(W)］ｍ−［ＮＨ− （ＣＨ2）(X)］ｎ−［ＮＨ−（ＣＨ2）(Y)］P−［ＮＨ−（ＣＨ2）(z)］ｑ−（ ここで、ｗ、ｘ、ｙおよびｚはそれぞれ、０以外であり、そしてｍ、ｎ、ｐおよ びｑはそれぞれ、０以外である）；（ｈ）−［ＮＨ−（ＣＨ2）(W)］ｍ−［ＮＨ −（ＣＨ2）(X)］ｎ−［［ＣＨ3（ＣＨ2）Y］Ｎ］−（ＣＨ2）(Z)−（ここで、 ｘ、ｎおよびｚはそれぞれ、０以外である）；（ｉ）−［ＮＨ−（ＣＨ2）(W)］P −［［ＣＨ3（ＣＨ2）X］Ｎ］−（ＣＨ2）Y−［ＮＨ−（ＣＨ2）(Z)］ｑ−（こ こで、ｗ、ｐ、ｙ、ｚおよびｐはそれぞれ、０以外である）；および（ｊ）−［ ＮＨ−（ＣＨ2）(V)］1−［ＮＨ−（ＣＨ2）(W)］ｍ−［ＮＨ−（ＣＨ2）(X)］ ｎ−［ＮＨ−（ＣＨ2）(Y)］P−［ＮＨ−（ＣＨ2）(Z)］ｑ−（ここで、ｖ、ｗ 、ｘ、ｙおよびｚはそれぞ れ、０以外であり、そしてｌ、ｍ、ｎ、ｐおよびｑはそれぞれ、０以外である） を包含する。 上記したように、Ｒ1およびＲ2は独立して、−ＮＨ−、アルキルアミンまたは ポリアルキルアミンであることができ、そして相互に同一または相違することが できる、ただし（１）生成化合物が「Ｔ−型構造」を示すために、そして（２） その安定性を得るために、Ｒ1およびＲ2の両方は−ＮＨ−であることはできない 。組合わされている場合、Ｒ3Ｒ1（またはＲ4Ｒ2）の組合わせ幹鎖の長さは、約 ４０原子よりも少ない窒素および炭素であると好ましく、さらに好ましくは約３ ０原子よりも少ない窒素および炭素である。 Ｒ3に隣接しているＲ1基が（またはＲ4に隣接しているＲ2が）、第三の中心を 定めている末端窒素原子を含有している場合において、Ｒ3が脂肪族基である場 合、四級アミンが形成され（Ｒ1の窒素原子の部位で）、そしてＲ3がＨである場 合は、三級アミンにとどまる（Ｒ1の窒素原子の部位で）。従って、このような 生成したＲ3Ｒ1またはＲ4Ｒ2構造について、代表的各式は下記のとおりである： （ｋ）Ｈ−（ＣＨ2）(W)−［［ＣＨ3（ＣＨ2）X］［ＣＨ3（ＣＨ2）Y］Ｎ］− （ＣＨ2）Z−（ここで、ｗおよびｚはそれぞれ、０以外である）；および（１） Ｈ−［［ＣＨ3（ＣＨ2）X］［ＣＨ3（ＣＨ2）Y］Ｎ］−（ＣＨ2）Z−（ここで、 ｚは０以外である）。 本明細書に記載の構造式を解釈する際に、Ｒ3Ｒ1−（またはＲ4Ｒ2−）構造の 原子“Ｘ”への結合は、Ｒ3Ｒ1−の右手側を経て（図示されているとおり）、す なわちＣＨ2−部分を経ているものと解釈する。本明細書に記載されているもの として、係数（すなわち、ｖ、ｗ、ｘ、ｙおよびｚならびにｌ、ｍ、ｎ、ｐおよ びｑ）は全部が完全数を表わす。本発明の目的にかかわり、「完全数」の用語は 、別段の制限がないかぎり、０および自然数１、２、３、４、５、６までを意味 する。 式（ａ）〜（ｌ）により表わされる化合物を包含する、本発明による両親媒性 物質にかかわり、上記構造式（Ｉ）により示されているように、原子“Ｘ”が窒 素原子であるか、または炭素原子であるかに依存して、このような基のデザイン について或る好適条件が存在する。“Ｘ”が窒素である場合、Ｎ原子で終わるＲ3 −Ｒ1（またはＲ4−Ｒ2）を含有する両親媒性物質［すなわち、式（ｅ）におい て、ｚが０に等しくそしてｑ＝１である物質；式（ｈ）において、ｚが０に等し い物質］は好ましくない。この理由は、生成する位置Ｘを含むＮ−Ｎ結合が、不 安定であることがあり、そして（または）製造が困難であることがある両親媒性 物質をもたらすことにある。製造が困難であり、そして（または）不安定である 構造を有する追加の基は、例えばＲ配列（Ｒ1にあるか、またはＲ1とＲ3との架 橋部にある）、−ＮＨ−ＣＨ2−ＮＨ−ＣＨ2−で表わされる。従って、本発明の 実施態様において、このような構造基［すなわち、式（ａ）において、ｚが１に 等しい基、式（ｅ）において、ｙおよびｚの一方または両方が１に等しい基］の 使用は好ましくない。 カチオン性両親媒性物質に含まれる構造のデザインについて（例えば、上記構 造）、さらに下記の考察に留意すべきである。アミンとアルキルアミンとが交互 に組合わされている構造は全部が本発明の範囲内にあるＲ構造を構成する。ポリ アルキルアミンは、例えば上記式で表わされるが、多くのさらに別の構造（この ような構造はまた、本発明の範囲内にある）を、両親媒性物質の構造内のアルキ ルアミン付属単位の数、またはタイプまたは組合わせを拡大することによって、 示すことができる。このような変更をなすことができることは、当業者にとって 明白である。 非常に長いポリアルキルアミン基（または生成するＲ3Ｒ1基）は、例えば生成 する両親媒性物質の溶解を妨害することがあり、あるいは細胞内放出用に選択さ れた生物学的活性分子とのその安定した相互反応能力を妨害することがあること に留意すべきである。この点に関して、約４０個の窒素および炭素原子幹鎖長さ を有するポリアルキルアミン基（または生成するＲ3Ｒ1基）を両親媒性物質中に 含ませることは適当ではない。しかしながら、このような提案された各構造にか かわり、その性質は実験により測定することができ、またそれでもまだ、その使 用は本発明の実施態様の範囲内にある。 従って、特定のアルキルアミン構造およびポリアルキルアミン構造について、 下記の構造がもたらされる：表 １ Ｒ1および（または）Ｒ2について （１）−ＮＨ− （２）−ＮＨ−（ＣＨ2）(2)− （３）−ＮＨ−（ＣＨ2）(3)− （４）−ＮＨ−（ＣＨ2）(4)− （５）−ＮＨ−（ＣＨ2）(6)− （６）−ＮＨ−（ＣＨ2）(3)−ＮＨ−（ＣＨ2）(4)− （７）−ＮＨ−（ＣＨ2）(2)−ＮＨ−（ＣＨ2）(2)− （８）−ＮＨ−（ＣＨ2）(4)−ＮＨ−（ＣＨ2）(3)− （９）−ＮＨ−（ＣＨ2）(Y)−ＮＨ−（ＣＨ2）(Z)− （１０）−ＮＨ−（ＣＨ2）(X)−ＮＨ−（ＣＨ2）(Y)−ＮＨ−（ＣＨ2）(Z)− （１１）−ＮＨ−（ＣＨ2）(W)−ＮＨ−（ＣＨ2）(X)−ＮＨ−（ＣＨ2）(Y)−Ｎ Ｈ−（ＣＨ2）(Z)− （１２）−ＮＨ−（ＣＨ2）(V)−ＮＨ−（ＣＨ2）(W)−ＮＨ−（ＣＨ2）(X)−Ｎ Ｈ−（ＣＨ2）(Y)−ＮＨ−（ＣＨ2）(Z)− （１３）−［ＮＨ−（ＣＨ2）(W)］ｍ−［ＮＨ−（ＣＨ2）(X)］ｎ−［［ＣＨ3 （ＣＨ2）Y］Ｎ］−（ＣＨ2）(Z)− （１４）−［ＮＨ−（ＣＨ2）(X)］ｎ−［［ＣＨ3（ＣＨ2）Y］Ｎ］−（ＣＨ2）(Z) − （１５）−［ＮＨ−（ＣＨ2）(W)］ｍ−［ＮＨ−（ＣＨ2）(X)］ｎ−［［ＣＨ3 （ＣＨ2）Y］Ｎ］−（ＣＨ2）(Z)− （１６）−［［ＣＨ3（ＣＨ2）X］［ＣＨ3（ＣＨ2）Y］Ｎ］−（ＣＨ2）(Z)− （１７）−ＮＨ−（ＣＨ2）(Z)−ＮＨ− （１８）−ＮＨ−（ＣＨ2）(Y)−ＮＨ−（ＣＨ2）(Z)−ＮＨ− （１９）−ＮＨ−（ＣＨ2）(Y)−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ2）(Z)− （２０）−［ＮＨ−（ＣＨ2）(W)］P−［［ＣＨ3（ＣＨ2）Ｘ］Ｎ］−（Ｃ Ｈ2）Y−［ＮＨ−（ＣＨ2）(Z)］ｑ−Ｒ3および（または）Ｒ4について、 （１）Ｈ− （２）ＣＨ3− （３）ＣＨ3−（ＣＨ2）2− （４）ＣＨ3−（ＣＨ2）4− （５）ＣＨ3−（ＣＨ2）Z− （６）ＣＨ3−［ＣＨ3−（ＣＨ2）Z］ＣＨ− （７）ＣＨ3−［ＣＨ3−（ＣＨ2）2］ＣＨ− （８）ＣＨ3−［［ＣＨ3（ＣＨ2）Y］［ＣＨ3−（ＣＨ2）(Z)］］Ｃ− （９）ＣＨ3−（ＣＨ2）Z−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ2− （１０）ＣＨ3−［ＣＨ3（ＣＨ2）Y−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ2）Z］ＣＨ− （１１）ＣＨ3−［［ＣＨ3（ＣＨ2）W−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ2）X］［ＣＨ3（Ｃ Ｈ2）Y−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ2）Z］］ＣＨ− （１２）ＣＨ3−［ＣＨ3（ＣＨ2）Y］−ＣＨ−（ＣＨ2）Z−グループＩＩ両親媒性物質 生物学的活性分子の細胞中への輸送を容易にすることができるグループＩＩの カチオン性両親媒性物質（図５参照）がさらに提供され、この両親媒性物質は下 記構造式（ＩＩ）を有する： 式中、 Ｚは、ステロイドであり； Ｘは、炭素原子または窒素原子であり； Ｙは、結合基であるか、またはＹは存在しておらず； Ｒ3は、アミノ酸、誘導体化アミノ酸、Ｈまたはアルキルであり； Ｒ1は、−ＮＨ−、アルキルアミンまたはポリアルキルアミンであり； Ｒ4は、アミノ酸、誘導体化アミノ酸、Ｈまたはアルキルであり； Ｒ2は、−ＮＨ−、アルキルアミンまたはポリアルキルアミンであり； そしてＲ1はＲ2と同一または相違する、ただしＲ1およびＲ2の両方が−ＮＨ− であることはできない。 グループＩＩにより提供される代表的両親媒性物質は、両親媒性物質８７、９ １、９３、９５、９７、９９、１００および１０３を包含する。これらの両親媒 性物質およびグループＩＩのその他の両親媒性物質の構造特徴について、下記の 点を考慮すべきである。 ステロイド基は、グループＩ両親媒性物質について上記定義の要件に従い選択 することができる。従って、好適両親媒性物質は、３−ステロール類から選択さ れるものを包含し、このステロール分子は、その３−Ｏ−基により、またはその 代わりに、Ｎにより“Ｙ”に結合している。 グループＩＩ両親媒性物質の結合基Ｙは、Ｎ−アシルアミノ酸（またはその誘 導体）からなるか、あるいは当該基の１個よりも多くない原子が“Ｘ”および“ Ｚ”の両方と結合を形成する基（例えば、＞Ｃ＝Ｏまたは＞Ｃ＝Ｓ）からなる。 代表的Ｎ−アシルアミノ基は、Ｎ−アシルセリン（Ｎｏ．８７）、Ｎ−アシルグ リシン（Ｎｏ．９１）およびＮ−アシルアスパラギン酸（Ｎｏ．１０３）を包含 する。両親媒性物質Ｎｏ．１０３におけるＮ−アシルアスパラギン酸の使用に関 して、そのガンマカルボキシルはまた、追加のアルキルアミン基に誘導体化され るという条件を有することに留意すべきである。 Ｒ1およびＲ2の選択条件は、グループＩ両親媒性物質について記載されている とおりである。Ｒ3およびＲ4は、Ｈまたはアルキルを表わし、あるいは天然また は合成アミノ酸であることができ、これにはこれらのどちらかの誘導体が包含さ れる。Ｒ3またはＲ4アミノ酸基の代表例は、トリプトファンから（Ｎｏ．９７） およびアルギニンから（Ｎｏ．９５）から誘導される基を包含する。グループＩＩＩ両親媒性物質 さらにまた、生物学的活性分子の細胞中への輸送を容易にすることができるグ ループＩＩＩのカチオン性両親媒性物質が提供され、この両親媒性物質は下記構 造式（ＩＩＩ）を有する： 式中、 Ｚは、そのＮ原子によりＹに（あるいはＹが存在していない場合は、直接Ｘに ）結合しているアルキルアミンまたはジアルキルアミンであり、Ｚがジアルキル アミンである場合、そのアルキル基は同一または相違することができ； Ｘは、炭素原子または窒素原子であり； Ｙは、短い結合基であるか、またはＹは存在しておらず； Ｒ3は、Ｈであるか、あるいは飽和または不飽和の脂肪族基であり； Ｒ1は、−ＮＨ−、アルキルアミンまたはポリアルキルアミンであり； Ｒ4は、Ｈであるか、あるいは飽和または不飽和の脂肪族基であり； Ｒ2は、−ＮＨ−、アルキルアミンまたはポリアルキルアミンであり； そしてＲ1はＲ2と同一または相違する、ただしＲ1およびＲ2の両方が−ＮＨ− であることはできない。 アルキルアミンまたはジアルキルアミンを親油性基として含有する本発明の実 施態様に従う代表的カチオン性両親媒性物質は、例えばＮ，Ｎ−ジオクタデシル リジンアミド；Ｎ1，Ｎ1−ジオクタデシル−１，２，６−トリアミノヘキサン； Ｎ，Ｎ−ジドデシルリジンアミド；Ｎ，Ｎ−ジデシルリジンアミド；スペルミジ ン−Ｎ，Ｎ−ジオクタデシル尿素；Ｎ−ミリスチルリジンアミド；およびＮ−（ ジオクチルデシルアミノエチル）−リジンアミドを包含する。代表的両親媒性物 質は、両親媒性物質４３、４７、５６、６０および７３として表わされる（図６ ）。これらの両親媒性物質およびグループＩＩＩのその他の両親媒性物質の構造 特徴について、下記の点が考慮されるべきである。 親油性アルキルアミンまたはジアルキルアミン基“Ｚ”の選択に関して、下記 表２は代表的構造を示している。 表 ２ “Ｚ”について、 （１）ＣＨ3−（ＣＨ2）13−ＮＨ− （２）ＣＨ3−（ＣＨ2）Z−ＮＨ− （３）［［ＣＨ3（ＣＨ2）17］［ＣＨ3（ＣＨ2）17］］Ｎ− （４）［［ＣＨ3（ＣＨ2）11］［ＣＨ3（ＣＨ2）11］］Ｎ− （５）［［ＣＨ3（ＣＨ2）9］［ＣＨ3（ＣＨ2）9］］Ｎ− （６）［［ＣＨ3（ＣＨ2）X］［ＣＨ3（ＣＨ2）Y］］Ｎ− （７）［［ＣＨ3（ＣＨ2）X］［ＣＨ3（ＣＨ2）Y−ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）Z］］Ｎ − （８）［［ＣＨ3（ＣＨ2）W］［ＣＨ3（ＣＨ2）X−ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ2）Y−ＣＨ ＝ＣＨ（ＣＨ2）Z］］Ｎ− 本発明の両親媒性物質中の位置Ｚに含有される適当なアルキルアミンまたはジ アルキルアミンの選択に関して、この基のアルキル鎖は、この基が両親媒性物質 の溶解を妨害するほどの、あるいはプラスミドＤＮＡとの相互反応する、その能 力を妨害するほどの、大きい分子量を有するべきではない。さらにまた、アルキ ルアミンまたはジアルキルアミンのアルキル鎖は、１個または２個以上の不飽和 地点を含有することができる。 Ｒ基、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4の選択は、グループＩ両親媒性物質について説 明したとおりであり、これらのＲ基はまた、例えば表１から選択される。結合基 Ｙは、グループＩ両親媒性物質と同様に選択することができ、その好適例には、 −ＣＨ2−および＞Ｃ＝Ｏが包含される。グループＩＶ両親媒性物質 さらにまた、生物学的活性分子の細胞中への輸送を容易にすることができるグ ループＩＶのカチオン性両親媒性物質が提供され（図７）、この両親媒性物質は 下記構造式（ＩＶ）を有する： 式中、 ＡおよびＢは独立して、Ｏ、ＮまたはＳであり； Ｒ5およびＲ6は独立して、アルキルまたはアシル基であり、この基は飽和され ていてもよく、あるいは不飽和部位を含有していてもよく； Ｃは、−ＣＨ２−、＞Ｃ＝Ｏおよび＞Ｃ＝Ｓからなる群から選択され； Ｅ（構造Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩにおける“Ｘ”に類似する）は、炭素原子または窒 素原子であり： Ｄは、−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）−または−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−などの結合基であり、ある いはＤは存在しておらず； Ｒ3は、Ｈであるか、あるいは飽和または不飽和の脂肪族基であり； Ｒ1は、−ＮＨ−、アルキルアミンまたはポリアルキルアミンであり； Ｒ4は、Ｈであるか、あるいは飽和または不飽和の脂肪族基であり； Ｒ2は、−ＮＨ−、アルキルアミンまたはポリアルキルアミンであり； そしてＲ1はＲ2と同一または相違する、ただしＲ1およびＲ2の両方が−Ｎ Ｈ−であることはできない。 グループＩＶの代表的両親媒性物質は、Ｎｏ．６４、Ｎｏ．７６、Ｎｏ．８５ 、Ｎｏ．８９、Ｎｏ．９４、Ｎｏ．９６、Ｎｏ．１０２、Ｎｏ．１０５、Ｎｏ． １１０およびＮｏ．１１１を包含する。これらの両親媒性物質およびグループＩ Ｖのその他の両親媒性物質の構造特徴について、下記の点が考慮されるべきであ る。 Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4の選択に関して、グループＩ、ＩＩおよびＩＩＩ両親 媒性物質にかかわり提供されている教示が当てはまる。前記したように、基“Ｅ ”は、炭素原子または窒素原子を表わす。 Ｒ5およびＲ6は独立して、好ましくは約８個〜約３０個の炭素原子を含有する アルキル基またはアシル基であり、これらの基は１個または２個以上の不飽和地 点を有することができる。 基Ｄの選択に関して、−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）−または−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−などの結合 基が好適であり、その左手側は“Ｃ”に結合するものとして、そして右手側は“ Ｅ”に結合するものとして、描くことができる。任意に、基Ｄは存在していなく てもよい（両親媒性物質Ｎｏ．９４）。さらに別の結合基は、上記グループＩ、 ＩＩおよびＩＩＩ両親媒性物質にかかわり示されている教示に基づき、そしてま た誘導されたインビボ試験データに基づき選択することができ（図１５）、結合 基Ｄは短いか、または存在していないと好ましい。補−脂質（ｃｏ−ｌｉｐｉｄ） １種または２種以上のカチオン性両親媒性物質と混合するために、本発明の実 施態様に従い有用である補−脂質は、ジオレオイルホスファチジルエタノールア ミン（“ＤＯＰＥ”）、ジフィタノイルホスファチジルエタノールアミン、リソ −ホスファチジルエタノールアミン、その他のホスファチジルエタノールアミン 、ホスファチジルコリン、リソ−ホスファチジルコリン、およびコレステロール を包含する。代表的に、カチオン性両親媒性物質と補−脂質との好適モル比は、 約１：１である。しかしながら、この比を変えることも本発明の実施態様の範囲 内にあり、相当な範囲がまた包含される。 一般に、カチオン性両親媒性物質を補−脂質（特に天然補−脂質）との複合体 として製造すると、両親媒性物質のトランスフェクション能力を増進させるもの と当技術で信じられている。この補−脂質により増進された性能は、多くの本発 明の両親媒性物質について見出だされているが、本発明の両親媒性物質は、補− 脂質を含有していなくても、トランスファクタントとして活性である。従って、 本発明の実施態様は、細胞内放出メカニズムにおける補−脂質の共有にかかわる 理論に制限されるものと考えられるべきではなく、また補−脂質の包含を要件と するものでもない。 トランスアシル化反応 従来、当技術で認識されていたが、或る種の補−脂質が、共−保存条件下に、 或るタイプのカチオン性両親媒性物質と化学的に反応し、新規種類の分子を生成 させることができることがまた証明された。このような新種の発現は、トランス アシル化（ｔｒａｎｓａｃｙｌａｔｉｏｎ）などのメカニズムを介して生じるも のと信じられる。この点に関して、図４を参照でき、この図４にはスペルミンコ レステロールカルバメート（Ｎｏ．６７）およびＤＯＰＥを包含するトランスア シル化反応、およびリソＰＥ種の分子および複数のタイプの特定のアシル−カチ オン性両親媒性物質（Ｎｏ．８０と称されている）の生成が示されている。 このような反応について、次の所見は重要である。両親媒性物質Ｎｏ．６７を 使用する場合、クロロホルム溶媒中において、両親媒性物質とＤＯＰＥとの混合 物は、このような反応に関係するものとは見做されないことが見出された。しか しながら、リポソームなどの二重層−含有構造体を形成することができる、水性 溶液中で両親媒性物質と補−脂質とを用意すると、トランスアシル化が可能であ る。さらにまた、両親媒性物質と補−脂質とを、例えばクロロホルムから、薄膜 に乾燥させた場合これにより２種の成分が密に接触して配置される）、多分エン トロピー効果の結果として、トランスアシル化がまた生じる。これらの現象はま た、親油性にされた両親媒性物質／ＤＯＰＥ配合物に当てはまるものと予想され る。 従って、このような両親媒性物質／ＤＯＰＥ配合物は、非常に冷たい温度、例 えば−７０度Ｃに維持すると、格別に好ましい。モノ、ジまたはトリ酢酸塩とし て、両親媒性物質Ｎｏ．６７配合物は、トランスアシル化を示すことが証明され た。 本発明による治療上で有効な医薬組成物は、このようなトランスアシル化副生 成物またはその他の副生成物を含有していてもよく、または含有していなくても よく、またこのような副生成物の存在は、これらを含有する組成物の治療におけ る使用を妨害するものではないことが理解されるべきである。むしろ、このよう な組成物の使用は、本発明の実施態様の範囲内にあり、従って、このような組成 物およびその新種の分子は、明確に特許請求されている。 医薬組成物の調製およびその投与 本発明は、治療有効量の生物学的活性分子の細胞内放出を容易にする医薬組成 物を提供する。本発明による医薬組成物は、生物学的活性分子の組織および臓器 、例えば胃粘膜、心臓、肺および固形腫瘍中への導入を容易にする。従って、本 発明による医薬組成物は、インビトロで保持されている細胞中への生物学的活性 分子の導入を容易にする。本発明の化合物の両親媒性物性は、これらが細胞膜、 その他の細胞表面分子、および組織表面の脂質と会合することを可能にし、また そこに融着または付着することを可能にする。両親媒性物質により生成させるこ とができる構造の１タイプは、多少球形の二重層に形成されている小胞であるリ ポソームであり、これは生物学的液体中で安定であり、生物学的活性分子を細胞 内放出に標的を定めて取り込むことができる。細胞膜に融着することによって、 このようなリポソーム組成物は、そこに担持されている生物学的活性分子がエン ドサイトーシスおよびピノサイトーシス（食作用）を包含する１種または２種以 上の細胞プロセスを経て細胞内部に取り込まれることを可能にする。しかしなが ら、治療組成物における使用が提案されている多くの種類の両親媒性物質または その他の脂質様分子の場合とは異なり、本発明のカチオン性両親媒性物質は、有 効であるために、高度に組織化した小胞を形成する必要はなく、また実際に、広 く種々の粗く組織化された構造（ここに、生物学的活性分子が結合している）を 有するものと見做される。このような構造体はいずれも本発明による医薬組成物 に存在させることができ、その効果に寄与する。 本発明の両親媒性物質を用いて治療量を細胞内に放出することができる生物学 的活性分子は、 （ａ）当技術で知られている治療的に有用な蛋白質をコードするゲノムＤＮＡ 、 ｃＤＮＡおよびｍＲＮＡ （ｂ）リボソームＲＮＡ； （ｃ）遺伝子の転写生成物の不活性化に有用であり、また例えば、悪性細胞の 増殖を調節する治療剤として有用であるアンチセンス ポリヌクレオチド（ＲＮ ＡまたはＤＮＡ）；および （ｄ）リボザイム； を包含する。 −般に、そしてそこからの内容物の漏出の可能性があるために、多くのカチオ ン性両親媒性物質から形成された小胞またはその他の構造体は、当業者により低 分子量生物学的活性分子の放出には好ましくないものとされている。本発明の好 適態様ではないけれども、このような低分子量生物学的活性分子の放出も本発明 の実施態様の範囲内にある。放出することができる低分子量生物学的活性分子の 代表種には、ホルモン類および抗生物質がある。 本発明による種類のカチオン性両親媒性物質は、その２種または３種以上を組 み合わせて用いて、生物学的活性分子の標的細胞中へのおよび（または）その付 属細胞構成成分中への導入を容易にするように、配合することができる。このよ うな使用において、本発明によるカチオン性両親媒性物質はまた、当技術で公知 の両親媒性物質と配合することもできる。本発明による治療組成物の用量は、例 えば生物学的活性分子の半減期、生物学的活性分子の効力、両親媒性物質（１種 または２種以上）の半減期、両親媒性物質（１種または２種以上）のいずれかの あるいはその分解生成物の潜在的有害作用、投与経路、患者の状態などの因子に 依存して変わる。このような因子は当業者により決定することができる。 種々の投与方法を使用して、本発明の医薬組成物の格別に正確な用量を得るこ とができる。このような製剤は、経口投与、非経口投与、局所投与、経粘膜投与 により、あるいは患者の体腔中への製剤の注入により、あるいは生体分解性物質 を含有する持続放出性製剤を使用することにより、あるいは追加のミセル、ゲル およびリポソームを用いるオンサイト（ｏｎｓｉｔｅ）放出により投与すること ができる。ネブライザー器具、粉末吸入およびアエロゾル溶液は、このような製 剤を呼吸器官に投与するために用いることができる代表的方法である。 さらにまた、本発明の治療組成物は一般に、賦形剤（例えば、炭水化物、乳糖 、トレハロース、ショ糖、マンニトールまたはガラクトース）を用いて調剤する ことができ、また使用前に、このような賦形剤の存在下に凍結乾燥させることが できる（次いで再水和することができる）。本発明による各両親媒性物質に最適 の調剤は、調剤技術の当業者により決定することができる。一例として、スペル ミジンコレステロールカルバメート（両親媒性物質Ｎｏ．５３）の場合、両親媒 性物質／ＤＮＡ凝集物の形成、特にその中のＤＮＡの濃度が増加するのに従う凝 集物の形成を防止するために、マンニトールよりもショ糖を使用する方が好まし い。このような賦形剤の添加は、保存期間中の凍結乾燥した医薬組成物の粘稠度 を維持し、また凍結乾燥状態からの再水和の際にまた生じることがある、凝集ま たは不溶解などの問題を防止する。 従って、本発明の本質的態様は、生物学的活性分子（例えば、ポリヌクレオチ ド）および１種または２種以上の両親媒性物質（任意に補−脂質を含有するもの を包含する）からなる組成物を用意し、次いでこの組成物を１種または２種以上 の上記賦形剤の存在下に保持することを包含する。生成した組成物は液体形態ま たは固体形態（好ましくは、凍結乾燥されたもの）であり、（１）生物学的活性 分子の治療活性を実質的に保存し；（２）両親媒性物質（または両親媒性物質／ ＤＮＡ複合体）のトランスフェクション−増進性を保持するようにされている。 理論に制限されることはないが、これらの賦形剤は、 （１）容器表面との相互反応を最低にする； （２）複合体の不可逆的凝集を防止する；および （３）両親媒性物質／ＤＮＡ複合体を化学的に安定状態に維持する、すなわち 酸化および（または）加水分解を防止する、 ことを包含する１種または２種以上の作用により、両親媒性物質と生物学的活性 分子との相互反応（複合体）を安定化するものと信じられる。 本発明の医薬組成物中の賦形剤の存在は、当該組成物を安定化し、かつまたそ の保存および取扱いを容易にするが、中程度の濃度の多くの賦形剤は、これらを 含有する医薬製剤のトランスフェクション−増進能力を妨害することがある。こ の点に関して、本発明による両親媒性物質の追加の、有用な特徴は、本発明によ る両親媒性物質のインビボ活性が当技術で公知の両親媒性化合物と比較して、格 別に増強されることにより、このような潜在的有害作用の全部を最低にすること ができることにある。理論に制限されることはないが、浸透圧（低い総溶質濃度 における）がポリヌクレオチドの細胞中へのインビボトランスフェクションを成 功させるのに積極的に関与することができるものと信じられる。このような浸透 圧は、非緩衝水中に存在するという条件で、医薬組成物が標的細胞に接触した際 に生じさせることができる。従って、このような別段では好適な組成物の使用は 、嚢胞性繊維症の患者の肺組織を損傷するようなストレスが既に加えられている 標的組織の処置には適応できない。従って、そして例としてショ糖を用いる場合 に、約１５ｍＭ〜約２００ｍＭの範囲にある賦形剤の濃度を選択することによっ て、（１）医薬組成物の保存に対する安定化という目標と（２）組成物中の高濃 度の溶質がトランスフェクション現象に対して有することができるいずれかの作 用の最低化という目標との妥協が達成される。 特定の組成物に対する特定の賦形剤の最適濃度の選択は、実験対象であるが、 このような各組成物について当業者により決定することができる。 本発明のもう一つの態様は、プロトン付加状態のカチオン性両親媒性物質に関 し、このような両親媒性物質を次いで、プラスミドＤＮＡと接触させ、治療組成 物を形成する。このような治療組成物を生成させるために、完全にプロトン付加 されている、部分的にプロトン付加されている、または遊離塩基形態の両親媒性 物質を利用することも、本発明の実施態様の範囲内にある。両親媒性物質Ｎｏ． ６７（スペルミンコレステロールカルバメート）に関して、この両親媒性物質を ＤＯＰＥ（それ自体が双極性イオンを有する）とのトランスフェクション性組成 物として提供する場合、トランスゲン発現には遊離塩基が最良であるが、両親媒 性物質が酢酸塩として製造された場合には、好適性は減少される。活性は、モノ およびジ酢酸塩により段階的に減少され、トリ酢酸塩の場合に最低になる。上記 状況下に、両親媒性物質と接触させるために用意されるプラスミドＤＮＡは、水 中でナトリウム塩として製造される（緩衝剤は用いない）。血管系のトランスフェクション 本発明のもう一つの態様は、血管系のトランスフェクションを包含する。血管 系のトランスフェクションの用語は、治療組成物（１種または２種以上のカチオ ン性両親媒性物質、治療性ポリヌクレオチド、および任意に、１種または２種以 上の補−脂質からなる）を、患者の血管に配置し、これにより血管細胞に分布さ せることを意味する。本発明を実施する際に、この用途に適する血管は、動脈、 静脈、または毛細管系を包含する。本発明の実施によりトランスフェクションす ることができる血管細胞はまた、動脈、静脈、または毛細管系を包含する。 リンパ細胞系として同定される管系の細胞のトランスフェクションも、本発明 の実施態様の範囲内にある。 本発明のカチオン性両親媒性物質（本明細書でグループＩ、ＩＩ、ＩＩＩおよ びＩＶにより定義されているものを包含する）は、補−脂質およびポリヌクレオ チドとともに、このような治療用途用に調剤することができる。 患者の管系を、カチオン性両親媒性物質および治療性物性を有する蛋白質をコ ードするポリヌクレオチドを含有する組成物と接触させ、これによりこの管系を トランスフェクションし、次いでこのポリヌクレオチドから当該蛋白質を発現さ せる。好適態様において、この蛋白質は通常、細胞から分泌されるものであり、 そしてコード性ポリヌクレオチドは、例えばプレ−またはプロ−ペプチド、また はグリコシル化させるアミノ酸にかかわる配列を包含する。この場合、コードさ れた蛋白質は、患者の血管循環中に分泌され、その後、分泌された蛋白質がトラ ンスフェクションされる血管細胞の遠隔または近接部位で治療効果を提供する。 本発明によるこの態様に従い患者で発現させることができる治療性蛋白質の例に は、アデノシンデアミナーゼ、グルコセレビダーゼが包含され、さらにまた、成 長ホルモン類、インシュリンなどの多くの蛋白質ホルモン類が包含される。この ような蛋白質の効果的な発現および分泌は、例１１で証明されている。合成方法 下記の方法は、本発明による或る種のカチオン性両親媒性物質の製造を例示す るものである。これらの化合物を製造するための、およびまたその他の本発明の 化合物を製造するための別の方法は、当業者に認識されている。グループＩ両親媒性物質 （Ａ）Ｎ4−スペルミジンコレステリルカルバメート スペルミジンコレステロールカルバメート（図５、Ｎｏ．５３）を、図８に概 略が示されている下記の方法に従い合成した。Ｎ1，Ｎ8−ジＣＢＺ−Ｎ4−スペルミジンコレステロールカルバメートの合成 Ｎ1，Ｎ8−ジカルボベンゾキシスペルミジン（収率：６１％、融点：１０４〜 １０５℃）を、Ｓ．Ｋ．Ｓｈａｒｍａ、Ｍ．Ｊ．ＭｉｌｌｅｒおよびＳ．Ｍ．Ｐ ａｙｎｅの方法［Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１９８９，３２，３５７〜３６７］ に従い製造した。このＮ1，Ｎ8−ジカルボベンゾキシスペルミジン（２５ｇ、６ ０．５ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（２５ｍｌ、１７８ｍｍｏｌ）を、無 水メチレンクロライド６２５ｍｌ中に溶解し、０〜４℃に冷却し、次いでＮ2雰 囲気下に撹拌した。コレステリルクロロホーメート（２７．２ｇ、６０．６ｍｍ ｏｌ）をメチレンクロライド２５０ｍｌ中に溶解し、次いで上記反応混合物に２ ０分かけて添加した。添加すると、白色沈殿が形成された。添加が完了した後、 この反応混合物を０〜４℃で１０分間、次いで室温で１．５時間、撹拌した。こ の時点で、白色沈殿は完全に溶解した。この反応混合物を次いで、溶離液として ヘキサン／酢酸エチル６／４を使用するＴＬＣに付す（生成物Ｒｆ＝０．２５） 。この反応混合物に、メチレンクロライド６２５ｍｌおよび水６２５ｍｌを添加 した。次いで、層を分離させた。その有機層をＭｇＳＯ4上で乾燥させ、次いで 濾過した。この濾液を減圧濃縮し、得られた油状物の減圧乾燥を一夜にわたり行 った。この粗製生成物は、グル状粘稠度を有していた。この粗製生成物を、カラ ムクロマトクラフイにより精製し（シリカゲル２ｋｇ、溶離液：ヘキサン／酢酸 エチル６／４）、３−β−［Ｎ4−（Ｎ1，Ｎ8−ジカルボベンゾキシスペルミジ ン）カルバモイル］コレステロール（本明細書において、この化合物は、Ｎ1， Ｎ8−ジＣＢＺ−Ｎ4−スペルミジンコレステロールカルバメートの名称でも記載 されている）４６．８ｇを、９３％の収率で得た。スペルミジンコレステロールカルバメートの最終合成 活性炭上１０％パラジウム６．０ｇに、Ｎ2雰囲気下に、エタノール１リット ル中の３−β−［Ｎ4−（Ｎ1，Ｎ8−ジカノレボベンゾキシスペルミジン）カル バモイル］コレステロール３０ｇの溶液を添加した（図１３参照）。この反応混 合物をＮ2で浄化し、次いでＨ2雰囲気下に（大気圧）、１８時間撹拌した。こ の混合物をＮ2で浄化し、次いでセライト１０ｇ床に通して濾過した。この濾過 ケーキをエタノール中１０％トリエチルアミン２リットルで洗浄し、濾液を集め 、減圧濃縮し、ゲルを得た。この生成物を次いで、一夜にわたり減圧乾燥させ、 粘着性固形物を得た。この粗製生成物を、カラムクロマトクラフイにより精製し （シリカゲル２ｋｇ、溶離液：クロロホルム／メタノール９５／５の４リットル 、次いでクロロホルム／メタノール／イソプロピルアミン９５／５／５の３０リ ットル、Ｒｆ＝０．２４）、所望のスペルミジンコレステロールカルバメート１ ３．１ｇを６４％の収率で得た。この生成物のＨＰＬＣ分析は９９．２％の純度 、および０．８％のレベルで７−デヒドロコレステロール類縁体の存在を示した （Ｃ−１８逆相カラム、線状勾配溶離プロフィール：メタノール／イソプロパノ ール／水／トリフルオロ酢酸６０／２０／２０／０．１からメタノール／イソプ ロパノール／トリフルオロ酢酸７０／３０／０．１に、メタノール／イソプロパ ノール／クロロホルム／トリフルオロ酢酸６０／２０／２０／０．１に）。 この例および下記の例に関連して、全部のＴＬＣ板をホスホモリブデン酸によ り可視化したことに留意すべきである。 （Ｂ）Ｎ4−スペルミンコレステリルカルバメート スペルミンコレステロールカルバメート（図１、Ｎｏ．６７）を、図９に概略 が示されている下記の方法に従い合成した。Ｎ1，Ｎ12−ジＣＢＺ−スペルミン ベンジルクロロホーメート（１．７６ｇ、１．５ｍｌ、１０．３６ｍｍｏｌ） をメチレンクロライド（５ｍｌ）中に溶解し、次いで窒素雰囲気下に、三ッ頚フ ラスコに入れた。イミダゾール（１．４ｇ、２０．６ｍｍｏｌ）をメチレンクロ ライド（２０ｍｌ）中に溶解し、次いで添加ロートに入れた。この三ッ頚フラス コを０℃に冷却し、次いでイミダゾール溶液を２０分かけて徐々に添加した。こ の混合物を室温で１時間撹拌し、次いでメチレンクロライド（２５ｍｌ）および クエン酸（１０％、２５ｍｌ）を添加した。層を分離させ、その有機層をクエン 酸（１０％、２５ｍｌ）で洗浄した。この有機部分を硫酸マグネシウム上で乾燥 させ、次いで減圧濃縮した。この残留物を高圧下に室温で１時間乾燥した。 この残留物に、ジメチルアミノピリジン（３５ｍｇ）、メチレンクロライド （２５ｍｌ）を添加し、この混合物を窒素雰囲気下に０℃に冷却した。添加ロー トに、メチレンクロライド（２５ｍｌ）中のスペルミン（１ｇ、４．９４ｍｍｏ １）の溶液を添加する。このスペルミン溶液を、15分間かけて徐々に添加した。 この反応混合物を室温で一夜にわたり撹拌し、次いで減圧濃縮した。この残留物 を酢酸エチル（８０ｍｌ）に溶解し、次いで水（１５ｍｌ）で３回洗浄した。こ の有機層を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、次いで減圧濃縮し、粗製白 色固形物を得た。この生成物をフラッシュクロマトグラフイにより精製し（シリ カゲル６５ｇ、１００：１００：１０ ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ：ＮＨ4ＯＨ、生成 物Ｒｆ=０．３３）、高減圧下に乾燥させた後に、生成物１．０１ｇ（２．１４ ６ｍｍｏｌ、収率：４３％）を得た。Ｎ1，Ｎ12−ジＣＢＺ−Ｎ4−スペルミンコレステリルカルバメート コレステリルクロロホーメート（９６４ｍｇ、２．１５ｍｍｏ１）をクロロホ ルム（１０ｍｌ）に溶解し、次いで冷却した（０℃）Ｎ1，Ｎ12−ジＣＢＺ−ス ペルミン（１．０１ｇ、２．１５ｍｍｏｌ）、クロロホルム（１０ｍｌ）中のト リエチルアミン（１ｍｌ）の溶液に滴下して添加した。この反応混合物を室温ま で温め、次いで２時間撹拌した。この反応溶液に、水（２５ｍｌ）およびクロロ ホルム（２５ｍｌ）を添加した。層を分離させ、有機フラクションを硫酸マグネ シウム上で乾燥させた。この溶液を減圧濃縮し、得られた粗製生成物をフラッシ ュクロマトグラフイにより精製し（シリカゲル６８ｇ、ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ3１ ／４、生成物Ｒｆ＝０．３６）、生成物１．２３ｇ（１．３９ｍｍｏｌ、収率： ６５％）を得た。最終Ｎ4−スペルミンコレステリルカルバメートの合成 Ｎ1，Ｎ12−ジＣＢＺ−Ｎ4−スペルミンコレステリルカルバメート（２６２ｍ ｇ、０．３００ｍｍｏｌ）を、酢酸５ｍｌに溶解し、次いでＣ上１０％Ｐｄ４５ ｍｇを添加した。この溶液を窒素で浄化し、次いで水素雰囲気下に大気圧で撹拌 した。この水素添加分解は７時間進行させた。この反応混合物を濾過し、触媒を 酢酸エチル／酢酸９／１ ４０ｍｌにより洗出し、この濾液を減圧濃縮し、残留 物を得た。この粗製生成物を１Ｎ ＮａＯＨ ３５ｍｌに溶解し、次いでクロロ ホルム／メタノール９／１ ４０ｍｌにより３回抽出した。有機フラクショ ンを集め、水２０ｍｌで洗浄し、次いでＮａ2ＳＯ4上で乾燥させた。この溶液を 濾過し、減圧濃縮し、次いで減圧乾燥させ、所望の生成物１２５ｍｇを６７％の 収率で得た。 上記方法に関して、触媒毒を最低にするために、水素添加分解は酸性条件下に 行うべきであることに注意する。 尿素類縁化合物、例えばスペルミンまたはスペルミジンコレスタミン尿素は、 有機合成の技術に精通した者に周知の一連の反応により製造することができる。 一例として、アミンを等モル量のカルボニルジイミダゾールで処理し、次いで第 二のアミンを添加し、所望の尿素化合物を得ることができる。 （Ｃ）Ｎ，Ｎ−ビス（３−アミノプロピル）−Ｏ−コレステリル−３−カルバ メート Ｎ，Ｎ−ビス（３−アミノプロピル）−Ｏ−コレステリル−３−カルバメート （図１、Ｎｏ．６９）を下記の方法に従い製造した。 反応剤として、スペルミンの代わりにＮ−（３−アミノプロピル）−１，３− プロパンジアミンを用いることを除いて、Ｎ1，Ｎ12−ジＣＢＺ−スペルミンに ついて上記した方法を用い、ビス（３−ＣＢＺ−アミノプロピル）アミンを製造 した。この純粋生成物は、溶剤として、ＣＨＣｌ3／ＭｅＯＨ／ＮＨ4ＯＨ ８０ ／２０／０．５を用いるシリカゲル フラッシュクロマトグラフイにより、３４ ％の収率で単離された。 このようにして製造されたビス（３−ＣＢＺ−アミノプロピル）アミンを次い で、Ｎ1，Ｎ8−ジＣＢＺ−Ｎ4−スペルミジンコレステリルカルバメートについ て上記した方法に従い、コレステリルクロロホーメートと反応させた。純粋生成 物［Ｎ，Ｎ−ビス（３−ＣＢＺ−アミノプロピル）−Ｏ−コレステリル−３−カ ルバメート］が、７３％の収率で得られた。 Ｎ，Ｎ−ビス（３−アミノプロピル）−Ｏ−コレステリル−３−カルバメート の合成は、Ｎ4−スペルミジンコレステリルカルバメートの合成について上記し た方法に従い、Ｎ，Ｎ−ビス（３−ＣＢＺ−アミノプロピル）−Ｏ−コレステリ ル−３−カルバメートからＣＢＺ基を水素添加分解することによって完了させた 。生成物は、シリカゲルクロマトグラフイ精製を行うことなく、２３％の収率で 得 られた。 （Ｄ）Ｎ，Ｎ−ビス（６−アミノヘキシル）−Ｏ−コレステリル−３−カルバ メート Ｎ，Ｎ−ビス（６−アミノヘキシル）−Ｏ−コレステリル−３−カルバメート （図１、Ｎｏ．７０）を下記の方法に従い製造した。 最初に、Ｎ1，Ｎ12−ジＣＢＺ−スペルミンについて上記した方法を用いるが 、反応剤として、スペルミンの代わりにビス（ヘキサメチレン）トリアミンを用 いて、ビス（６−ＣＢＺ−アミノヘキシル）アミンを製造した。 このビス（６−ＣＢＺ−アミノヘキシル）アミンを次いで、Ｎ1，Ｎ8−ジＣＢ Ｚ−Ｎ4−スペルミジンコレステリルカルバメートの合成について上記した方法 に従い、コレステリルクロロホーメートと反応させた。生成物［Ｎ，Ｎ−ビス（ ６−ＣＢＺ−アミノヘキシル）−Ｏ−コレステリル−３−カルバメート］が、ヘ キサン／酢酸エチル７／３を用いるシリカゲル フラッシュクロマトグラフイに より、４０％の収率で単離された。 （Ｅ）リジン ３−Ｎ−ジヒドロコレステリルカルバメート リジン ３−Ｎ−ジヒドロコレステリルカルバメート（図１、パネルＣ）を下 記の方法に従い製造した。 窒素雰囲気下に０℃で撹拌されている、ＴＨＦ（２０ｍｌ、Ａｌｄｒｉｃｈ） 中のジヒドロコレステロール（５．０ｇ）１２．９ｍｍｏｌ、Ａｌｄｒｉｃｈ） 、フタルイミド（２．０ｇ）１３．６ｍｍｏｌ、Ａｌｄｒｉｃｈ）およびトリフ ェニルホスフィン（３．８ｇ）１３．６ｍｍｏｌ、Ａｌｄｒｉｃｈ）の溶液に、 ジエチルアゾジカルボキシレート（２．３ｍｌ、１４．５ｍｍｏｌ、Ａｌｄｒｉ ｃｈ）を滴下して添加した。添加が完了した時点で、この反応混合物を室温まで 温め、次いで一夜にわたり撹拌した。この反応混合物を、残留物に減圧濃縮した 。この残留物を、ヘキサン／酢酸エチル９５／５の５０ｍｌ中に溶解し、沈殿を 生成させた。この混合物を濾過した。この濾液を減圧で濃縮乾燥させ、ヘキサン ／酢酸エチル９５／５の２５ｍｌ中に溶解し、次いでシリカゲル２００ｇにおけ るクロマトグラフイに付した（溶離液：ヘキサン／酢酸エチル９５／５の２リッ トル、次いでヘキサン／酢酸エチル９０／１０の１リットル）。所望の３−フタ ルイミドコレスタン（５．４３ｇ）が７６％の収率で得られた。 ３−フタルイミドコレスタン（５．４０ｇ）９．７５ｍｍｏｌ）を、メタノー ル６０ｍｌ中に溶解し、次いで無水ヒドラジン（３．１ｍｌ、９９ｍｍｏｌ）を 添加した。この反応混合物を撹拌し、次いで窒素雰囲気下に４時間、加熱還流さ せた。この混合物を室温まで冷却し、濃ＨＣｌ ３．１ｍｌを添加し、生成する 混合物を一夜にわたり加熱還流させた。室温まで冷却させ、ジエチルエーテル１ ００ｍｌおよび１Ｎ ＮａＯＨ ５０ｍｌを添加し（最終ｐＨ：１０．１）、層 を分離させた。この水性層をジエチルエーテル５０ｍｌにより抽出し、集めた有 機フラクションを濾過した。この濾液を減圧濃縮し、この残留物をシリカゲルク ロマトグラフイ（クロロホルム／メタノール９０／１０）により精製し、３−ア ミノコレスタン２．２４を５９％の収率で得た。 Ｌ−Ｎα，Ｎε−ジＢＯＣリジン Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ ２８６ｍｇ、０．６４４ｍｍｏｌ、Ｓｉｇｍａ）および３−アミノコレスタン（ ２５０ｍｇ、０．６４４ｍｍｏｌ）を、メチレンクロライド５ｍｌ中に溶解し、 トリエチルアミン０．１ｍｌを添加し、次いで生成する溶液を、窒素雰囲気下に 室温で、一夜にわたり撹拌した。この反応混合物に、水１０ｍｌおよびメチレン クロライド２５ｍｌを添加し、次いで層を分離させた。この水性層を、メチレン クロライド２５ｍｌで抽出し、集めた有機フラクションを、ＭｇＳＯ4上で乾燥 させ、次いで濾過した。この濾液を減圧濃縮し、次いでこの残留物を、シリカゲ ル２５ｇにおけるクロマトグラフイにより精製した（溶離液：ヘキサン／酢酸エ チル６／４、試料はヘキサン／酢酸エチル９／１中で適用した）。この精製した 生成物をクロロホルム２５ｍｌに溶解し、次いでこの溶液に、ＨＣｌ気体を２時 間、泡立てて通し、次いで窒素を１０分間通した。この溶液を減圧濃縮し、所望 の生成物２９９ｍｇを二塩酸塩として、７９％の収率で得た。 （Ｆ）Ｎ1，Ｎ8−ビス（３−アミノプロピル）−Ｎ4−スペルミジンコレステ リルカルバメート Ｎ1，Ｎ8−ビス（３−アミノプロピル）−Ｎ4−スペルミジンコレステリルカ ルバメート（図１、Ｎｏ．７５）を下記の方法に従い合成した。 Ｎ4−スペルミジンコレステリルカルバメート（１．１４ｇ、２．０４ｍｍｏ ｌ）を、ＭｅＯＨ（５ｍｌ）に溶解した。新しく蒸留したアクリロニトリル(O. ２８ｍｌ、４．２９ｍｍｏｌ）を添加し、次いでこの溶液を室温で１８時間撹拌 した。溶媒を減圧で濃縮し、油状物を得た。次いで、減圧乾燥を一夜にわたり行 った。この粗製生成物を、カラムクロマトグラフイにより精製し（シリカゲル１ ２５ｇ、溶離液：ＣＨＣｌ3／ＭｅＯＨ １／９）、Ｎ1，Ｎ8−ビス（シアノエ チル−Ｎ4−スペルミジンコレステリルカルバメート１．１５ｇ（８５％）を得 た。 ラネイニッケル50％スラリイ（１．２ｇ、Ａｌｄｒｉｃｈ）を、パールボンベ に９５％ＥｔＯＨ中の１Ｍ ＮａＯＨ（５０ｍｌ）とともに入れた。Ｎ1，Ｎ8− ビス（シアノエチル）−Ｎ4−スペルミジンコレステリルカルバメートを、Ｅｔ ＯＨ（３５ｍｌ）に溶解し、次いでボンベに入れた。この小胞を、３回、脱気し 、アルゴン圧力下（８０〜１００ｐｓｉ）に置き、次いで３回、脱気し、水素圧 力下（１００ｐｓｉ）に置いた。この反応混合物を、水素圧力下（１００ｐｓｉ ）に室温で７２時間撹拌した。この小胞を、脱気し、アルゴン圧力下に置い た。触媒を濾過により除去した。この濾液を減圧濃縮した。生成した油状物を、 ２：１ ＣＨ2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ（１００ｍｌ）に溶解し、次いでＨ2Ｏ（３５ｍ ｌおよび２５ｍｌ）で洗浄した。この有機層をＮａ．ＳＯ4上で乾燥させ、次い で濾過した。この濾液を減圧濃縮し、残留物をシリカゲル１００ｇ上でクロマト グラフイにより精製した（溶離液：ＣＨＣｌ3／ＭｅＯＨ／濃ＮＨ4ＯＨ４０／２ ５／１０、試料はＣＨＣｌ3／ＭｅＯＨ４０／２５中で適用した）。精製した生 成物を、ｉＰｒＯＨ（３×５０ｍｌ）およびＣＨ2Ｃｌ2（３×５０ｍｌ）ととも に減圧濃縮し、次いで減圧乾燥させ、Ｎ1，Ｎ8−ビス（３−アミノプロピル）− Ｎ4−スペルミジンコレステリルカルバメート９８６ｍｇ（８５％）を得た。 （Ｇ）Ｎ−（Ｎ4−３−アミノプロピル−スペルミジン）コレステリルカルバ メート Ｎ−（Ｎ4−３−アミノプロピル−スペルミジン）コレステリルカルバメート （図１、Ｎｏ．７８）を下記のとおりに製造した。 Ｎ1，Ｎ8−ジカルボベンゾキシスペルミジン（１．０ｇ、２．４ｍｍｏｌ）を 、ＭｅＯＨ（１０ｍｌ）に溶解した。新しく蒸留したアクリロニトリル（０．３ ｍｌ、４．５ｍｍｏｌ）を添加し、次いでこの反応混合物を室温で１８時間撹拌 した。溶媒を減圧で濃縮し、油状物を得た。この粗製生成物を、カラムクロマト グラフイにより精製し（シリカゲル１００ｇ、溶離液：ＣＨＣｌ3／ＭｅＯＨ １／１９）、Ｎ4−２−シアノエチル−Ｎ1，Ｎ8−ジカルボベンゾキシスペルミ ジン１．１０ｇ（９７％）を得た。 Ｎ4−２−シアノエチル−Ｎ1，Ｎ8−ジカルボベンゾキシスペルミジン（０． ５ｇ、１．０７ｍｍｏｌ）を、ＭｅＯＨ（５ｍｌ）に溶解し、次いでＣｏＣｌ2 （２８０ｍｇ、２．１５ｍｍｏｌ、Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加した。この青色溶液 を、氷浴中で冷却し、次いでＮａＢＨ4（４０５ｍｇ、１０．７ｍｍｏｌ、Ａｌ ｄｒｊｃｈ）を、１５分かけて少しづつ添加した。生成する黒色溶液を室温で１ 時間撹拌した。この黒色溶液は、この時間の間に青色に戻った。この反応混合物 に、ＣＨ2Ｃｌ2／ＭｅＯＨ ２／１（３０ｍｌ）を添加した。黒色沈殿が形成さ れた。これに、Ｈ2Ｏ（２０ｍｌ）を添加し、この混合物を濾過した。生成す る層を分離させ、この有機層をＭｇＳＯ4上で乾燥させた。乾燥剤を濾別し、濾 液を減圧で濃縮し、油状物を得た。この粗製生成物をカラムクロマトグラフイに より精製し（シリカゲル５０ｇ、溶離液：ＣＨＣｌ3／ＭｅＯＨ／濃ＮＨ4ＯＨ １００／１００／５）、Ｎ4−３−アミノプロピル−Ｎ1，Ｎ8−ジカルボベンゾ キシスペルミジン３０９ｍｇ（６２％）を得た。 ＣＨ2Ｃｌ2に溶解したＮ4−３−アミノプロピル−Ｎ1，Ｎ8−ジカルボベンゾ キシスペルミジン（３００ｍｇ、０．６６ｍｍｏｌ）に、Ｎ2雰囲気下に、Ｂｔ3 Ｎを添加した。コレステリルクロロホーメート（３２６ｍｇ、０．７２６ｍｍｏ ｌ、Ａｌｄｒｉｃｈ）をＣＨ2Ｃｌ2に溶解し、反応混合物に滴下して添加した。 この混合物を室温で２４時間撹拌した。ＣＨ2Ｃｌ2（２５ｍｌ）およびＨ2Ｏ（ １０ｍｌ）を添加した後に、層を分離させた。この有機層をＭｇＳＯ4上で乾燥 させ、次いで濾過した。この濾液を減圧濃縮し、粗製生成物６４０ｍｇを得た。 この残留物をシリカゲル８０ｇ上でクロマトグラフイにより精製した（溶離液： ＣＨＣｌ3／ＭｅＯＨ ９０／１０、試料はＣＨＣｌ3／ＭｅＯＨ９０／１０中で 適用した）。この精製した生成物を減圧濃縮し、次いで減圧乾燥させ、Ｎ−（Ｎ4 −３−アミノプロピル−Ｎ1，Ｎ8−ジカルボベンゾキシスペルミジン）コレス テリルカルバメート３２９ｍｇ（５７％）を得た。 カーボン上１０％Ｐｄ（６５ｍｇ、Ａｌｄｒｉｃｈ）に、酢酸（２５ｍｌ）中 のＮ−（Ｎ4−３−アミノプロピル−Ｎ1，Ｎ8−ジカルボベンゾキシスペルミジ ン）コレステリルカルバメート（３００ｍｇ）の溶液を添加した。この反応混合 物をＨ2雰囲気下に置き、室温で一夜にわたり撹拌した。Ｎ2雰囲気下に置た後に 、この反応混合物を濾過した。触媒をＥｔＯＡｃ中１０％酢酸（５０ｍｌ）で洗 浄した。この濾液を減圧濃縮し、油状物を得た。この油状物を、２／１ ＣＨ2 Ｃｌ2／ＭｅＯＨ（３５ｍｌ）に溶解し、次いで１Ｍ ＮａＯＨ（１５ｍｌ）で 洗浄した。この有機層を、ＭｇＳＯ4を用いて乾燥させ、次いで濾過した。この 濾液を減圧濃縮し、次いで減圧乾燥させ、Ｎ−（Ｎ4−３−アミノプロピルスペ ルミジン）コレステリルカルバメート１９６ｍｇ（９３％）を得た。 （Ｈ）Ｎ−［Ｎ1，Ｎ4，Ｎ8−トリス（３−アミノプロピル）スペルミジン］ コレステリルカルバメート Ｎ1，Ｎ8−ビス（３−アミノプロピル）−Ｎ4−スペルミジンコレステリルカ ルバメートの製造について記載したとおりにして、Ｎ−［Ｎ1，Ｎ4，Ｎ8−トリ ス（３−アミノプロピル）スペルミジン］コレステリルカルバメート（図１、Ｎ ｏ．９６）を、Ｎ−（Ｎ4−３−アミノプロピルスペルミジン）コレステリルカ ルバメートとアクリロニトリルとを反応させ（収率：９０％）、引き続いてジ付 加物をラネイニッケルにより還元する（収率：７５％）ことによって製造した。 （Ｉ）Ｎ，Ｎ−ビス（４−アミノブチル）コレステリルカルバメート Ｎ，Ｎ−ビス（４−アミノブチル）コレステリルカルバメート（図１、Ｎｏ． ８２）を下記のとおりに製造した。 ｎ−ブタノール（５０ｍｌ）中のベンジルアミン（２．０ｇ）１８．６ｍｍｏ ｌ、Ａｌｄｒｉｃｈ）、Ｎａ2ＣＯ3（４．４ｇ、４２ｍｍｏｌ）およびＫＩ（１ ．４ｇ、９．５ｍｍｏｌ）の混合物に、窒素雰囲気下に、４−クロロブチロニト リル（４．０ｍｌ、９５ｍｍｏｌ）を添加した。この反応混合物を窒素雰囲気下 に、４８時間加熱還流させた。室温に冷却した後に、ジエチルエーテル（５０ｍ ｌ）を添加し、次いで沈殿を濾別した。この濾液を、油状物に減圧濃縮した。ト ルエン（１００ｍｌ）を添加し、この溶液を減圧濃縮した。クロロホルム（１０ ０ｍｌ）を添加し、この溶液を再度、減圧濃縮し、次いで２８時間、減圧乾燥さ せた。生成する油状物をクロロホルム（１００ｍｌ）に溶解し、濾過し、次いで 減圧濃縮した。この粗製生成物をカラムクロマトグラフイにより精製し（シリカ ゲル２５０ｇ、溶離液：ヘキサン／ＥｔＯＡｃ ６０／４０）、Ｎ，Ｎ−ビス（ ３−シアノプロピル）ベンジルアミン３．７５ｇ（９７％）を得た。 Ｎ，Ｎ−ビス（３−シアノプロピル）ベンジルアミン（３．７ｇ、１７．８ｍ ｍｏｌ）を、ＥｔＯＨ（１５０ｍｌ）に溶解し、次いで酢酸（４ｍｌ）を添加し た。この溶液を、Ｎ2雰囲気下に、カーボン上１０％Ｐｄ（４００ｍｇ）に添加 した。この混合物を、Ｈ2雰囲気下に置き、この反応混合物を室温で１８時間撹 拌した。この反応混合物をＮ2雰囲気下に置いた。触媒を濾別し、次いでＥｔＯ Ｈ（１５０ｍｌ）で洗浄した。この濾液を減圧濃縮し、クロロホルム（５０ｍｌ ）を添加し、次いで再度、減圧濃縮した。生成する油状物を０．５時間、減圧乾 燥させ、引き続く反応に直接に使用した。ＣＨ2Ｃｌ2（１００ｍｌ）に溶解した 、 この油状物に、Ｎ2雰囲気下に、Ｅｔ3Ｎ（５ｍｌ、３５ｍｍｏｌ）を添加し、こ の溶液を氷浴中で冷却した。コレステリルクロロホーメート（６．２ｇ、１３． ８７ｍｍｏｌ）をＣＨ2Ｃｌ2（１００ｍｌ）に溶解し、この溶液を、上記反応混 合物に１０分間かけて滴下して添加した。冷却浴を取り除き、この反応混合物を Ｎ2雰囲気下に室温で、１８時間撹拌した。ＣＨ2Ｃｌ2（１００ｍｌ）およびＨ2 Ｏ（１００ｍｌ）を添加し、生成する層を分離させた。この有機層を、ＭｇＳＯ4 を用いて乾燥させ、次いで濾過した。この濾液を減圧濃縮し、次いで１時間減 圧乾燥させた。この粗製生成物をカラムクロマトグラフイにより精製し（シリカ ゲル６００ｇ、溶離液：ヘキサン／ＥｔＯＡｃ ６０／４０）、Ｎ，Ｎ−ビス（ ３−シアノプロピル）コレステリルカルバメート１．０５ｇ（１０％）を得た。 ラネイニッケル５０％スラリイ（１．２ｇ）を、パールボンベに９５％ＥｔＯ Ｈ中の１Ｍ ＮａＯＨ（５０ｍｌ）とともに入れた。Ｎ，Ｎ−ビス（３−シアノ プロピル）コレステリルカルバメート（１．０ｇ、１．７７ｍｍｏｌ）を、Ｅｔ ＯＨ（１００ｍｌ）に溶解し、次いでボンベに入れた。この小胞を、３回、脱気 し、アルゴン圧力下（８０〜１００ｐｓｉ）に置き、次いで３回、脱気し、水素 圧力下（１００ｐｓｉ）に置いた。この反応混合物を、水素圧力下（１００ｐｓ ｉ）に室温で４日間撹拌した。この小胞を、脱気し、アルゴン圧力下に置いた。 触媒を濾過により除去した。この濾液を減圧濃縮した。生成した油状物を、２： １ ＣＨ2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ（２５０ｍｌ）に溶解し、次いでＨ2Ｏ（７５ｍｌお よび５０ｍｌ）で洗浄した。この有機層をＮａ2ＳＯ4上で乾燥させ、次いで濾過 した。この濾液を減圧濃縮し、残留物をシリカゲル１１０ｇ上でクロマトグラフ イにより精製した（溶離液：ＣＨＣｌ3／ＭｅＯＨ／ｉＰｒＮＨ2 ９５／５／５ 、試料はＣＨＣｌ3／ＭｅＯＨ ９５／５中で適用した）。この精製した生成物 を、減圧濃縮し、Ｎ，Ｎ−ビス（４−アミノブチル）コレステリルカルバメート ９００ｍｇ（８５％）を得た。 （Ｊ）Ｎ，Ｎ−ビス（Ｎ−３−アミノプロピル−４−アミノブチル）コレステ リルカルバメート Ｎ，Ｎ−ビス（Ｎ−３−アミノプロピル−４−アミノブチル）コレステリルカ ルバメート（図１、Ｎｏ．８３）を、Ｎ1，Ｎ8−ビス（３−アミノプロピル）− Ｎ4−スペルミジンコレステリルカルバメートの製造について記載したとおりに して、Ｎ，Ｎ−ビス（３−アミノブチル）コレステリルカルバメートを、アクリ ロニトリルと反応させ（収率：８１％）、引き続いてジアクリロニトリル付加物 をラネイニッケルにより還元する（収率：８１％）ことによって製造した。 （Ｋ）Ｎ4−スペルミジンコレステリルカルバメート Ｎ4−スペルミジンコレステリルカルバメート（図１、Ｎｏ．９０）を下記の とおりに製造した。 ＴＨＦ（５０ｍｌ）中のコレステリルクロライド（５．０ｇ、１２．３ｍｍｏ １）の溶液を還流させながら、ＴＨＦ（２５ｍｌ）中のマグネシウム片（３９０ ｍｇ）に、０．５時間かけて滴下して添加した。先ず、一つまみのヨウ素および ３滴のヨウドメタンを添加して、反応を開始させた。３時間還流させた後に、こ の反応混合物を室温まで冷却した。この混合物を、ドライアイス（１０ｇ）上に 注ぎ入れ、次いで１時間撹拌した。この溶液を氷浴中で冷却し、次いで氷冷した １Ｍ Ｈ2ＳＯ4（１００ｍｌ）に添加した。５分間撹拌した後に、塩化ナトリウ ム（１ｇ）およびジエチルエーテル（１００ｍｌ）を添加した。層を分離させ、 この水性層をジエチルエーテル（１００ｍｌ）により抽出した。集めた有機層を Ｈ2Ｏ（３０ｍｌ）中のチオ硫酸ナトリウム５水化物（１２０ｍｇ）の溶液で洗 浄した。この有機層を減圧濃縮し、次いで１８時間、減圧乾燥させた。この粗製 固形物をヘキサン（２５ｍｌ）とすり混ぜた。濾過後、この固形物を冷たいヘキ サン（１０ｍｌ）で洗浄した。この固形物を１時間、減圧乾燥させた。得られた コレステリルカルボン酸（３．０ｇ、５９％）は、約９０％の純度を有し、さら に精製することなく使用した。 コレステリルカルボン酸（５００ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）およびＮ−ヒドロキ シスクシンイミド（１４０ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）を、ＣＨ2Ｃｌ2に溶解した。 この溶液に、ジシクロヘキシルカルボジイミド（２７５ｍｇ、１．３２ｍｍｏｌ ）を添加し、この反応混合物をＮ2雰囲気下に、２時間撹拌した。Ｎ1，Ｎ8−ジ カルボベンゾキシスペルミジン（４７４ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）およびＥｔ3Ｎ （１．０ｍｌ、７．１ｍｍｏｌ）を添加し、この反応混合物をＮ2雰囲気下に、 ７２時間撹拌した。この反応混合物を濾過し、次いで沈殿をＣＨ2Ｃｌ2（５０ｍ ｌ）で洗浄した。この濾液をＨ2Ｏ（２５ｍｌ）で洗浄した。分離した有機層を ＭｇＳＯ4上で乾燥させ、次いで濾過した。この濾液を減圧濃縮し、次いで残留 物を、シリカゲル１５０ｇ上でクロマトグラフイにより精製した（溶離液：ヘキ サン／ＥｔＯＡｃ １／１）。この精製した生成物を、減圧濃縮し、次いで減圧 乾燥させ、Ｎ1，Ｎ8−ジカルボベンジルオキシ−Ｎ4−スペルミジンコレステリ ルカルボキシアミド６８０ｍｇ（７０％）を得た。 Ｎ4−スペルミジンコレステリルカルバメートの製造において記載したとおり にして、Ｎ1，Ｎ8−ジカルボベンジルオキシ−Ｎ4−スペルミジンコレステリル カルボキシアミドから、カルボベンゾキシ基を除去した。精製された生成物、Ｎ4 −スペルミジンコレステリルカルボキシアミドが、５３％の収率で得られた。グループＩＩ両親媒性物質 （Ａ）Ｎ1，Ｎ8−ビス（アルギニン−カルボキシアミド）−Ｎ4−スペルミジ ンコレステリルカルバメート Ｎ1，Ｎ8−ビス（アルギニン−カルボキシアミド）−Ｎ4−スペルミジンコレ ステリルカルバメート（図５、Ｎｏ．９５）を下記のとおりに製造した。 ＣＨ2Ｃｌ2（２５ｍｌ）中のＮ(a)，Ｎ(e)，Ｎ(e)（アルファ，エプシロン， エプシロン）−トリカルボベンゾキシアルギニンに、Ｎ−ヒドロキシスクシンイ ミド（１００ｍｇ、０．８９ｍｍｏｌ）およびジシクロヘキシルカルボジイミド （２４０ｍｇ、０．８９ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物を、Ｎ2雰囲気下に 室温で、７２時間撹拌した。Ｎ4−スペルミジンコレステリルカルバメート（２ ５０ｍｇ、０．４４８ｍｍｏｌ）およびＥｔ3Ｎ（０．２５ｍｌ、１．８ｍｍｏ ｌ）を添加し、この反応混合物を、Ｎ2雰囲気下に室温で７２時間、撹拌した。 この反応混合物を濾過し、次いで沈殿をＣＨ2Ｃｌ2（２０ｍｌ）で洗浄した。こ の濾液をＨ2Ｏ（２０ｍｌ）で洗浄した。分離した有機層をＭｇＳＯ4上で乾燥さ せ、次いで濾過した。この濾液を減圧濃縮し、次いで残留物を、シリカゲル７０ ｇ上でクロマトグラフイにより精製した（溶離液：ＣＨＣｌ3／ＭｅＯＨ ９５ ／５）。この精製した生成物を、減圧濃縮し、次いで減圧乾燥させ、Ｎ1，Ｎ8− ビス（Ｎ(a)，Ｎ(e)，Ｎ(e)−トリカルボベンゾキシアルギニンカ ルボキシアミド）−Ｎ4−スペルミジンコレステリルカルバメート５３３ｍｇ（ ７１％）を得た。 Ｎ−（Ｎ4−３−アミノプロピルスペルミジン）コレステリルカルバメートの 製造において記載したとおりにして、Ｎ1，Ｎ8−ビス（Ｎ(a)，Ｎ(e)，Ｎ(e)− トリカルボベンゾキシアルギニンカルボキシアミド）−Ｎ4−スペルミジンコレ ステリルカルバメートから、カルボベンゾキシ基を除去した。生成物、Ｎ1，Ｎ8 −ビス（アルギニンカルボキシアミド）−Ｎ4−スペルミジンコレステリルカル バメートが、２７％の収率で得られた。グループＩＩＩ両親媒性物質 （Ａ）Ｎ，Ｎ−ジオクタデシルリジンアミド Ｎ，Ｎ−ジオクタデシルリジンアミド（図６、Ｎｏ．７３）を下記のとおりに 製造した。 Ｎ，Ｎ−ジオクタデシルアミン（１．３５ｇ、２．５８ｍｍｏｌ，Ｆｌｕｋａ ）およびＬ−Ｎα，Ｎε−ジＢＯＣリジン Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエス テル（１．００ｇ、２．５８ｍｍｏｌ，Ｓｉｇｍａ）をメチレンクロライド１５ ｍｌ中で配合し、トリエチルアミン２ｍｌを添加した。この反応混合物を短時間 加熱し、溶解を完了させ、次いで室温で一夜にわたり撹拌した。この反応混合物 に、水（２０ｍｌ）およびメチレンクロライド（５０ｍｌ）を添加し、層を分離 させた。この水性フラクションを、メチレンクロライド５０ｍｌで２回抽出した 。有機フラクションを集め、ＭｇＳＯ4上で乾燥させ、濾過し、次いで減圧濃縮 した。この残留物をカラムクロマトグラフイにより精製した（シリカゲル１５０ ｇ、溶離液：ヘキサン／酢酸エチル ８／２）。この精製した生成物、Ｎ，Ｎ− ジオクタデシル−Ｎα，Ｎε−ジＢＯＣリジンアミド（１．５９ｇ）を、クロロ ホルム２５ｍｌ中に溶解し、次いでこの溶液に気体状ＨＣｌを泡立てて通しなが ら２時間撹拌した。この溶液をＮ2で浄化し、次いで減圧濃縮した。Ｎ，Ｎ−ジ オクタデシルリジンアミド（１．３４ｇ、が２ＨＣｌ塩として、６８％の収率で 得られた。 （Ｂ）Ｎ1，Ｎ1−ジオクタデシル−１，２，６−トリアミノヘキサン Ｎ1，Ｎ1−ジオクタデシル−１，２，６−トリアミノヘキサン（図６、Ｎｏ． ４７）を下記のとおりに製造した。 室温で撹拌されている無水ＴＨＦ（３０ｍｌ）中のＮ，Ｎ−ジオクタデシル− Ｎα，Ｎε−ジＢＯＣリジンアミド（７６０ｍｇ、０．８３２ｍｍｏｌ）に、Ｌ ｉＡｌＨ4（１８５ｍｇ、４．８７ｍｍｏｌ）を少しづつ添加した。この反応混 合物を、窒素雰囲気下に室温で一夜にわたり撹拌した。この反応を、水２ｍｌの 滴下添加により静め、生成する溶液を減圧濃縮した。この残留物に、１Ｍ ＨＣ ｌ（１０ｍｌ）、メチレンクロライド（５０ｍｌ）および１Ｍ ＮａＯＨ（最終 ｐＨ１０）を、この順序で添加した。層を分離させ、水性層をメチレンクロライ ド５０ｍｌにより２回抽出した。有機層を集め、ＭｇＳＯ4上で乾燥させ、濾過 した。この濾過ケーキをメチレンクロライド５０ｍｌで洗浄した。濾液を集め、 減圧濃縮し、粗製生成物７００ｍｇを得た。この粗製生成物をカラムクロマトグ ラフイにより精製した（シリカゲル８０ｇ）溶離液：ヘキサン／酢酸エチル ７ ／３）。精製生成物を含有するフラクションを集め、次いで減圧濃縮し、ジＢＯ Ｃ誘導体として保護されている生成物４９０ｇを得た。このジＢＯＣ誘導体２０ ０ｇに、クロロホルム４ｍｌおよびＴＨＦ １ｍｌを添加した。生成する反応混 合物を室温で２時間撹拌し、次いで減圧濃縮した。この残留物を水２５ｍｌおよ びメチレンクロライド２５ｍｌに溶解し、次いで約２ｍｌの濃水酸化アンモニウ ムによりｐＨ１０に調整した。層を分離させ、この水性層をメチレンクロライド ２５ｍｌにより２回抽出した。有機フラクションを集め、Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥さ せ、次いで減圧濃縮した。生成する残留物をジエチルエーテル１０ｍｌに溶解し 、この溶液に、２分間、気体状ＨＣｌを泡立てて通し、この溶液を次いで、一夜 にわたり４℃に冷却した。沈殿した生成物を濾過により採取し、冷たい（４℃） ジエチルエーテルで洗浄し、次いで減圧乾燥させ、所望の生成物１６０ｍｇを６ ７％の収率で得た。グループＩＶ両親媒性物質 （Ａ）１−（Ｎ4−スペルミン）−２，３−ジラウリルグリセロールカルバメ ート １−（Ｎ4−スペルミン）−２，３−ジラウリルグリセロールカルバメート （図７、Ｎｏ．８９）を下記のとおりに製造した。 ＴＨＦ（２０ｍｌ）中の３−ベンジルオキシ−１，２−プロパンジオール（１ ．００ｇ、５．４９ｍｍｏｌ）の溶液を、ＴＨＦ（３０ｍｌ）中の水素化ナトリ ウム（油中６０重量／重量％、５５０ｍｇ、１３．７２５ｍｍｏｌ）の懸濁液に 添加し、次いで乾燥窒素雰囲気下に一夜にわたり還流させた。ＴＨＦ（２０ｍｌ ）中のドデシルメタンスルホネート（３．３９ｇ、１２．０７８ｍｍｏｌ）の溶 液を添加し、この反応混合物をさらに２日間還流させた。室温まで冷却させた後 、この反応混合物をセライト床に通して濾過し、ＴＨＦですすいだ、この濾液を 減圧で、黄色油状物に減量し、この油状物をジエチルエーテル（１００ｍｌ）に 溶解した。このエーテル溶液を、０．１Ｎ ＮａＯＨ（３０ｍｌ)およびｄＨ2Ｏ （２×３０ｍｌ）で洗浄した。有機層を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し 、次いで赤−褐色油状物に減量した。この粗製生成物を、カラムクロマトグラフ イにより精製した（シリカゲル３００ｇ、溶離液：３％酢酸エチル／ヘキサン） 。所望の生成物が淡黄色油状物として単離され、1Ｈ ＮＭＲにより、３−ＯＢ ｎ−１，２−ジラウリルグリセロール（１．７０ｇ、６０％）であるものと確認 された。エタノール（１００ｍｌ）中の３−ＯＢｎ−１，２−ジラウリルグリセ ロール（１．７０ｇ、３．２８ｍｍｏｌ）を、水素雰囲気下に２４時間、１０％ Ｐｄ／Ｃ（２５０ｇ、１５重量％）とともに撹拌した。この反応混合物を窒素に より浄化し、次いでセライトに通して濾過し、エタノールですすぎ、触媒を除去 した。この濾液を減圧で固形物に減量した。この粗製生成物を、フラッシュカラ ムクロマトグラフイに付し（シリカゲル１４０ｇ）、１０％酢酸エチル／ヘキサ ンにより溶離した。所望の生成物が白色固形物として単離され、1Ｈ ＮＭＲに より、１，２−ジラウリルグリセロール（１．２３ｇ、８８％）であるものと確 認された。 メチレンクロライド（１００ｍｌ）中の１，２−ジラウリルグリセロール（５ ８０ｍｇ、１．３５ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０ ．２６ｍｌ、１．４９ｍｍｏｌ）の溶液に、トルエン中のホスゲンの１．９３Ｍ 溶液（０．７７ｍｌ、１．４９ｍｍｏｌ）を添加し、一夜にわたり撹拌した。６ ０：２５：４のクロロホルム／メタノール／水（８０ｍｌ)中のＮ1，Ｎ12−ジＣ Ｂｚ−スペルミン・２ＨＣｌ（７３４ｍｇ、１．３５ｍｍｏｌ）の溶液を添加し た。 ３時間後、さらに等量のＮ，Ｎ−ジイソブロピルエチルアミン（０．２６ｍｌ） １．４９ｍｍｏｌ）を添加した。３時間後、追加の等量の半分の量のＮ，Ｎ−ジ イソプロピルエチルアミン（０．１３ｍｌ、０．７５ｍｍｏｌ）を添加し、この 反応混合物を窒素雰囲気下に室温で一夜にわたり撹拌した。この反応混合物を１ Ｍ ＮａＯＨ（２０ｍｌ）およびｄＨ2Ｏ（１５ｍｌ）で洗浄した。有機層を分 離し、硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、次いで減圧で、白色固形物に減 量した。この粗製生成物を、フラッシュカラムクロマトグラフイに付し（シリカ ゲル１２５ｇ）、９０：１０：０．５のクロロホルム／メタノール／水酸化アン モニウムにより溶離した。所望の生成物が油状物として単離され、1Ｈ ＮＭＲ により、１−（Ｎ4−（Ｎ1，Ｎ12−ジＣＢｚ−スペルミン）−２，３−ジラウリ ルグリセロールカルバメート（１８８ｍｇ、１５％）であるものと確認された。 １−（Ｎ4−（Ｎ1，Ｎ12−ジＣＢｚ−スペルミン）−２，３−ジラウリルグリ セロールカルバメート（１８８ｍｇ、０．２０３ｍｍｏｌ）を氷酢酸（１０ｍｌ ）に溶解し、水素雰囲気下に５時間、１０％Ｐｄ／Ｃ（４５ｍｇ、２４重量％） とともに撹拌した。触媒を減圧濾過し、１０％酢酸／酢酸エチル（１０ｍｌ）に よりすすぐことによって除去した。この濾液を、回転蒸発器において、油状物に 減量した。生成する油状物を１０％メタノール／クロロホルム（８５％）に溶解 し、次いで１Ｍ ＮａＯＨ（１５ｍｌ）およびｄＨ2Ｏ（１０ｍｌ）で洗浄した 。有機層を分離し、硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、次いで減圧で、油 状物に減量した。この生成物は、1Ｈ ＮＭＲにより、１−（Ｎ4−スペルミン） −２，３−ジラウリルグリセロールカルバメート（１２５ｍｇ、９４％）である ものと確認された。 本発明によるその他の両親媒性物質は、当業者の知識の範囲内にある方法に従 い製造することができる。 例 下記の例は本発明の実施態様を例示するものである。例１−細胞トランスフェクション試験 スペルミジンコレステロールカルバメート（両親媒性物質Ｎｏ．５３）の試料 の各３．３５μｍｏｌおよび中性脂質ジオレオイルホスファチジルエタノールア ミン（“ＤＯＰＥ”）をそれぞれ、原材料としてクロロホルムに溶解した。これ らの溶液を配合した後、減圧（２０ｍｍＨｇ）で蒸発させることによって、この 混合物からクロロホルムを除去して薄膜を形成した。この薄膜を、さらに２４時 間減圧（１ｍｍＨｇ）乾燥させた。上記したように、本発明による両親媒性物質 の中の数種は、ＤＯＰＥなどの補−脂質とのトランスアシル化反応に関与するか 、あるいはその分解を生じさせることができる別の反応に付される。従って、両 親媒性物質／補−脂質組成物は、使用時まで、−７０℃などの低温で保存するこ とが好ましい。 分散懸濁液を調製するために、上記脂質薄膜を無菌の脱イオン水（１ｍｌ）に より１０分間水化し、次いで１分間、渦巻き状に撹拌した（バスソニケーターに おける１０〜２０秒間の音波処理を使用することもでき、そしてこの音波処理は 、ＤＣ−ｃｈｏｌなどの別種の両親媒性物質用に有用であることが証明されてい る）。生成する懸濁液を次いで、水４ｍｌで稀釈し、カチオン性両親媒性物質６ ７０μＭおよび中性補−脂質６７０μＭを含有する溶液を生成した。 スペルミンコレステロールカルバメート（両親媒性物質Ｎｏ．６７）およびそ の他の両親媒性物質を用いる試験をまた行った。スペルミンコレステロールカル バメートを用いる場合、試験条件下における両親媒性物質対ＤＯＰＥの最適モル 比は、１：２であり、１：１ではないことが測定された。かなりの本発明による 両親媒性物質の最適比は図１３、１４および１５に示されており、当業者により 容易に決定される。 トランスフェクション用の溶液を調製するために、β−ガラクトシダーゼをコ ードするＤＮＡ（ｐＣＭＶβ，ＣｌｏｎＴｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ） を、ＯｐｔｉＭＥＭ培養培地（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ Ｎｏ．３１８８５−０１３ ）に溶解した。生成する溶液は、９６０μＭのＤＮＡ濃度を有していた（コード ＤＮＡのヌクレオチドの平均分子量は３３０ダルトンであると見做される）。 下記の方法を使用し、ＤＯＰＥと組合わされているカチオン性両親媒性物質、 スペルミジンコレステロールカルバメートの１：１モル混合物を試験した。各凹 部にＯｐｔｉＭＥＭ（１６５μｌ）を含有する９６凹部プレートの８個の別々の 凹に、補−脂質（６７０μＭ）をまた含有するスペルミジンコレステロールカ ルバメート（６７０μＭ）の各１６５μｌ等量をピペットで入れた。生成する３ ３５μＭ溶液を次いで、順次７回稀釈し、３３５μＭ〜２．６３μＭの範囲の濃 度で両親媒性物質を含有する８種の別々の溶液を生成した。生成した各溶液は、 １６５μｌの容積を有するようにする。このようにして、全部で６４種の溶液を 調製した。８種の相違する両親媒性物質／ＤＯＰＥ濃度のそれぞれについて、８ 個の凹部を存在させる。 独立して、ＤＮＡ溶液（１６５μｌ、９６０μＭ）を、ＯｐｔｉＭＥＭ（１６ ５μｌ）を含有する８個の凹部にピペットで入れ、生成する４８０μＭ溶液を次 いで、順次７回稀釈し、４８０μＭ〜３．７５μＭの範囲の凹部内ＤＮＡ濃度を 有する各凹部から８種の別々の１６５μｌ溶液を生成した。 これらの６４種の試験溶液（カチオン性両親媒性物質：中性脂質）を次いで、 ６４種のＤＮＡ溶液と組合わせ、６４の凹部に別々の混合物を生成した。この６ ４の凹部はそれぞれ、一方の軸に沿って２４０μＭ〜１８７５μＭの範囲のＤＮ Ａ濃度および他方の軸に沿って１６７μＭ〜１．32μＭの範囲の脂質濃度をもっ て、３３０μｌの容積をする。このようにして、全部で６４種の溶液を調製した 。これらの溶液はそれぞれ、相違する両親媒性物質：ＤＮＡ比および（または） 濃度を有する。ＤＮＡ溶液および両親媒性物質溶液は、１５〜３０分間放置し、 複合体を形成させた。 インビトロ試験には、北カロライナ大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｎｏ ｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ，Ｃｈａｐｅｌ Ｈｉｌｌ）のＤｒ．Ｊａｍｅｓ Ｙ ａｎｋａｓｋａｓにより提供されたＣＦＴ−１細胞系（パピローマウイルスによ り感作されたヒト嚢胞性繊維症気管支上皮細胞）を使用した。これらの細胞は、 嚢胞性繊維症貫膜コンダクタンス レギュレーター（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎ ｅ ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）（“ＣＦＴＲ”）蛋白質を コードする遺伝子の変異対立遺伝子（位置５０８でフェニルアラニンが欠落して いる、以下でこれを△Ｆ５０８と記す）に対して同型接合（ｈｏｍｏｚｙｏｕｓ ）である。ＣＦＴＲは、ｃＡＭＰ−調節クロライド（Ｃｌ-）チャンネル蛋白質 である。ＣＦＴＲ遺伝子の変異は典型的に、例えば影響を受けた上皮組織の細胞 膜を横切るＣｌ-チャンネル活性の完全喪失（または少なくとも実質的な損傷） を もたらす。 △Ｆ５０８変異体は、嚢胞性繊維症に付随する最も共通の変異体である。△Ｆ ５０８変異体の性質および嚢胞性繊維症の遺伝について検討するためには、特に Ｃｈｅｎｇ等によるＣｅｌｌ，６３，８２７〜８３４（１９９０）を参照できる 。また、Ｒｉｏｒｄａｎ等によるＳｃｉｅｎｃｅ，２４５，１０６６〜１０７３ （１９８９）；Ｇｒｅｇｏｒｙ等による、公開番号０４４６０１７Ａ１を有する 公開ヨーロッパ特許出願Ｎｏ．９１３０１８１９．８；およびＧｒｅｇｏｒｙ等 によるＮａｔｕｒｅ，３４７，３８２〜３８５（１９９０）を参照することがで きる。 細胞は、２％ウシ胎児血清（“ＦＢＳ”、Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉ ｃ，Ｎｏ．３０００）および７種の追加の補給剤が補足されているＨａｍｓ Ｆ １２栄養培地（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ Ｎｏ．３１７６５−０２７）で培養した。 これらの細胞を次いで、９６凹部組織培養プレートに、約７，５００細胞／凹部 の密度でプレートに形成した。試験に使用する前に、集密パターンが得られるま で、細胞を５〜７日の期間かけて増殖させた。 一定の期間後、ＣＦＴ−１細胞を含有する３枚の９６凹部プレートを吸引し、 増殖培地を除去する。種々の濃度のＤＮＡ−脂質複合体（各１００μｌ等量）を ３枚の９６凹部プレートのそれぞれに移し、ＤＮＡ−脂質複合体をそれぞれ、細 胞と接触させた。これら３枚のプレートの中の１枚にはまた、ＤＮＡのみ／細胞 および脂質のみ／細胞の対照凹部を作った。 ＤＮＡ−脂質複合体の１００μｌ溶液を、この細胞上に６時間保持し、その後 、３０％ＦＢＳ（ＯｐｔｉＭＥＭ中）５０μｌを、各凹部に加えた。さらに２０ 時間のインキュベーション期間後、追加の１００μｌのＯｐｔｉＭＥＭ中１０％ ＦＢＳをまた加えた。さらに２４時間のインキュベーション期間後、細胞をβ− ガラクトシダーゼおよび蛋白質の発現について評価した。 この分析において、生成した培養液をプレートから除去し、細胞をリン酸塩緩 衝塩類溶液で洗浄した。細胞溶解緩衝液［５０μｌ、２５０ｍＭ トリス（Ｔｒ ｉｓ）−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、０．１５％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００ ］を次いで、添加し、これらの細胞を３０分間溶解させた。９６凹部プレートを １０分間、注意して渦巻き状に動かし、細胞を移動させ、次いで各凹部から、細 胞破片および５μｌ容積のライゼートを、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｐｌｕｓ（登録 商品名）蛋白質分析試薬（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｎｏ．２３２３６） １００μｌを含有するプレートに移した。この蛋白質分析プレートを、各分析毎 に蛋白質標準曲線を用いて、５９５ｎｍフィルターを備えたＢｉｏ−Ｒａｄ Ｍ ｏｄｅｌ ４５０プレートリーダーにより読み取った。 残留するライゼートにリン酸塩緩衝塩類溶液（５０μｌ）を添加し、次いでク ロロフェノール レッド ガラクトピラノシド（１００μｌ、１ｍｇ／ｍｌ、Ｃ ａｌｂｉｏｃｈｅｍ Ｎｏ．２２０５８８）、６０ｍＭリン酸水素二ナトリウム （ｐＨ８．０）、１ｍＭ硫酸マグネシウム、１０ｍＭ塩化カリウムおよび５０ｍ Ｍ ２−メルカプトエタノールからなる緩衝した溶液を添加することによって、 各凹部のβ−ガラクトシダーゼ活性レベルを測定した。酵素（β−ガラクトシダ ーゼ）加水分解の後に、クロロフェノール レッド ガラクトピラノシドは赤色 を呈し、５７０ｎｍフィルターを備えたプレートリーダーにより、この色を検出 した。各分析を基準化するために、β−ガラクトシダーゼ（Ｓｉｇｍａ Ｎｏ． Ｇ６５１２）標準曲線を用いた。 バックグランド読みを控除した後、プレートリーダーにより測定された光学デ ータは、β−ガラクトシダーゼ活性および蛋白質含有量の測定を可能にする。公 知トランスフェクタント、例えばＤＭＲＩＥ（１，２−ジミリスチルオキシプロ ピル−３−ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロマイド）により発現され るβ−ガラクトシダーゼの量に比較して、本発明の化合物は、気道上皮細胞のト ランスフェクションおよびそこでのβ−ガラクトシダーゼ発現の誘発について、 特に有効である。ＤＭＲＩＥ：ＤＯＰＥ（１：１）に比較して、スペルミジンコ レステロールカルバメート：ＤＯＰＥ混合物（また、１：１）は、約５のファク ターで改良されたトランスフェクション効率を示した（例えば、図１３、１４お よび１５参照）。例２ −ヒト嚢胞性繊維症貫膜コンダクタンスレギュレーター蛋白質をコードする 遺伝子のトランスフェクション 本発明のカチオン性両親媒性物質の細胞をトランスフェクションする能力およ びそこで生化学的修正を誘発させる能力を、別のインビトロ分析法により証明し た。不動化したヒト嚢胞性繊維症気道細胞（上記のＣＦＴ−１）を使用した。 この分析用に用意するために、この細胞をガラス カバースリップ上で、約６ ０％密集まで増殖させた。この細胞を次いで、スペルミジンコレステロールカル バメート：ＤＯＰＥ（１：１）複合体および野生型ヒトＣＦＴＲをコードするｃ ＤＮＡ含有プラスミド（ｐＣＭＶ−ＣＦＴＲ）を用いて、トランスフェクション した。ｐＣＭＶ−ＣＦＴＲプラスミドは、ＤＦＴＲをコードする配列および引き 続く調節要素、ＣＭＶプロモーターおよびエンハサー、およびＳＶ４０ポリアデ ニル化シグナル配列を有する構築物である。本例の実施に適する追加の構築物は 、ｐＭＴ−ＣＦＴＲを包含する［Ｃｈｅｎｇ等によるＣｅｌｌ，６３，８２７〜 ８３４（１９９１）］。使用した複合体は、ヌクレオチドに基づき、１０．５μ ｍｏｌｅのスペルミジンコレステロールカルバメート（また、ＤＯＰＥの１０． ５μｍｏｌｅ）および３０μｍｏｌｅのｐＣＭＶ−ＣＦＴＲであった。 ４８時間の両親媒性物質媒介トランスフェクション後に、６−メトキシ−Ｎ− （３−スルホプロピル）キノリニウム（“ＳＰＱ”）分析法を用いて、この細胞 をｃＡＭＰ−刺激Ｃｌ−チャンネル活性について試験した。分析法に関する追加 の情報は、Ｓ．Ｃｈｅｎｇ等によるＣｅｌｌ，６６，１０２７〜１０３６（１９ ９１）を参照することができる。この分析法において、“ＳＰＱ”（Ｍｏｌｅｃ ｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇｏｎから）、ハライド感受性 発蛍光団を用いて、ｃＡＭＰ−依存Ｃ-チャンネル活性を分析した。ハライド透 過性が増加するに従い、ＳＰＱ蛍光はより急速に増大する。Ｃｌ-透過性の分析 では、この変化の速度は（蛍光の絶対的変化よりも）、重大な変化値である。背 景情報に関しては、Ｒｉｃｈ等によるＮａｔｕｒｅ，３４７，３５８〜３６３（ １９９０）を参照することができる。 反転顕微鏡、Ｎｉｃｏｎ、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｉｍａｇｉｎｇからのデジタ ル造影装置およびＩＣＣＤカメラ、Ｈａｍａｍａｔｓｕ，Ｉｎｃ．を用いて、各 細胞におけるＳＰＱ分子の蛍光を測定した。細胞は、蛍光特徴にかかわるそれら の予測される変化の速度（ｒａｔｅ−ｏｆ−ｃｈａｎｇｅ）の従来の知識を用い ずに分析用に選択した。 各試験において、９０〜１００細胞の５までの顕微鏡視野を指定日に検査し、 次いで各条件下に実験を少なくとも３回、相違する日に反復した。ＣＦＴＲの発 現は不均質であるから（すなわち、細胞は同一量のＣＦＴＲを生成しないから） 、提供されたデータは、最大応答を示す各視野の細胞の２０％にかかわるもので あった。 予想されたように、模擬トランスフェクションされた細胞は、ｃＡＭＰ−刺激 ハライド蛍光にかかわるいかなる測定可能な増加も示すことに失敗した。これに 対して、野生型ＣＦＴＲｃＤＮＡによりトランスフェクションされた細胞は、ｃ ＡＭＰアゴニストにより刺激されると、ＳＯＱ蛍光の急速な増加を示した。この ことは、アニオンに対する透過性の増加を示している。分析された細胞の約６０ ％は、測定可能なｃＡＭＰ−刺激Ｃｌ-チャンネル活性を示した。従って、スペ ルミジンコレステロールカルバメートおよびその他の同様に試験された本発明に よるカチオン性両親媒性物質は、ＣＦＴＲ−コードプラスミドを不動化したＣＦ 気道細胞中への輸送に有効である。例３ −ＣＡＴ試験 Ａ部 この試験を用いて、生存している試料からインビボで細胞をトランスフェクシ ョンする能力について、本発明のカチオン性両親媒性物質の能力を試験した。こ の試験において、ｂａｌｂ／ｃマウスの肺に、カチオン性両親媒性物質：ＤＮＡ 複合体１００μｌを鼻内注入した（この方法はまた、気管経路で行うこともでき る）。この複合体は下記の方法に従い、投与前の１５分の間に生成させた。両親 媒性物質（補−脂質と予め混合しておく、下記参照）を、水中で１０分間（この 時間は要求される最終濃度の２倍の濃度の懸濁液を生成させるのに十分な時間で ある）、水化させた。これを２分間、渦巻き状にかき混ぜ、次いで注入する各マ ウスに対し５５マイクロリッター量が得られるように等量に分けた。同様に、リ ポーター（ＣＡＴ）遺伝子をコードするＤＮＡを、要求される最終濃度の２倍の 濃度にまで水で稀釈し、次いで注入する各マウスに対し５５マイクロリッター量 が得られるように等量に分けた。このＤＮＡを脂質と穏やかに混合し（ポリスチ レン製管中で）、次いで１５分間かけて複合体を生成させ、その後、これをマウ スに注入した。 使用したプラスミド（ｐＣＭＶＨＩ−ＣＡＴ、例４参照）は、クロラムフェニ コール トランスフェラーゼ酵素をコードするＤＮＡを備えている。両親媒性物 質：ＤＮＡ複合体にかかわる詳細は、以下で説明する。 トランスフェクション後の２日目に、マウスを犠牲にし、その肺および気管を 取り出し、重量を測定し、次いで緩衝溶液（２５０ｍＭトリス、ｐＨ７．８、８ ．５ｍＭ ＥＤＴＡ）中で均質化した。このホモゲネートを、遠心分離により透 明にし、次いで７０℃で１０分間加熱処理することによって、その中のデアセチ ラーゼを不活性化した。ライゼートを、アセチル補酵素ＡおよびＣ14−クロラム フェニコールとともに一夜にわたりインキュベートした。薄層クロマトグラフイ （“ＴＬＣ”）、引き続く酢酸エチルによる抽出により、ＣＡＴ酵素活性を目に 見えるようにした。ＣＡＴ標準曲線との比較により、酵素活性を定量した。 酵素ＣＡＴの存在は、アセチル補酵素ＡからＣｌ14−クロラムフェニコールに 輸送されるアセチル基を生じさせる。ＴＬＣプレート上で、アセチル化／放射性 標識したクロラムフェニコールは、より迅速に移動し、従って、その存在を検出 することができる。測定量のアセチル化クロラムフェニコールを生じさせるのに 必要であったＣＡＴの量を次いで、標準から計算した。 スペルミジンコレステロールカルバメート（両親媒性物質Ｎｏ．５３）の活性 を、ＣＡＴ分析法により、認識されているトランスフェクション試薬ＤＭＲＩＥ およびＤＣ−Ｃｈｏｌと比較して測定した。図１０は、スペルミジンコレステロ ールカルバメートのインビボにおける細胞トランスフェクション能力を劇的に証 明している（ｎｇＣＡＴ活性／組織１００ｍｇとして）。この増強は、この分析 において、約２０倍またはそれ以上である。この分析法において、活性は、ｎｇ ＣＡＴ酵素／肺組織１００ｍｇとして測定した。比較として、この分析法におい て、周知のトランスフェクタントであるＤＭＲＩＥは、ＤＯＰＥとの１：１モル 混合物として製造し、次いでプラスミドＤＮＡ（１．７ｍＭ ＤＭＲＩＥ、１． ７ｍＭ ＤＯＰＥ、ヌクレオチドとして測定して、１．２ｍＭ プラスミドＤＮ Ａ）と複合体形成した場合に、約１〜２ｎｇ活性／肺組織１００ｍｇを示した。 図１０に示されている比較に関して、次の点を考慮する。スペルミジンコレス テロールカルバメートのトランスフェクション用の溶液は、ヌクレオチドの濃度 として測定して、６ｍＭのＤＮＡおよび１．５ｍＭのカチオン性両親媒性物質を 含有していた。例１の方法に一般的に従い、各両親媒性物質はそれぞれ、この場 合は１：１モル比で、またＤＯＰＥと予備混合した。ＤＣ−ｃｈｉｌによるトラ ンスフェクションの場合、ＤＣ−ｃｈｉｌ対ＤＯＰＥのモル比は、３：２であり 、そしてカチオン性両親媒性物質の濃度およびＤＮＡの濃度（ヌクレオチドとし て）はそれぞれ、１．３ｍＭおよび０．９ｍＭであった。ＤＭＲＩＥによるトラ ンスフェクションの場合、ＤＭＲＩＥ対ＤＯＰＥのモル比は、１：１であり、そ してカチオン性両親媒性物質の濃度およびＤＮＡの濃度はそれぞれ、１．７ｍＭ および１．２ｍＭであった。各両親媒性物質ならびに補脂質およびＤＮＡにかか わる、これらの濃度（および濃度比）は、各両親媒性物質にかかわるトランスフ ェクションに最適であることが測定されており、従って、本明細書に記載の比較 の基礎として用いた。 スペルミジンコレステロールカルバメート（両親媒性物質Ｎｏ．５３）の場合 、最適化実験をまた行い、特定の両親媒性物質濃度に対するプラスミドの好適濃 度を測定し（図１１参照）、また特定のプラスミド濃度に対する同一両親媒性物 質の好適濃度を測定した（図１２参照）。トランスフェクション効率は、１．５ ｍＭの両親媒性物質濃度（ＤＯＰＥをまた、１．５ｍＭで存在させる）、および 約６ｍＭ（ヌクレオチドとして）のプラスミドで、あるいは１：４の比率で最適 であった。しかしながら、約０．７５ｍＭの両親媒性物質濃度および３．０ｍＭ のプラスミド濃度は、標的細胞に対してほとんど無毒であった。 カチオン性両親媒性物質としてスペルミジンコレステロールカルバメートを使 用するが、補脂質としてコレステロールを使用して、マウスにおいて、ｐＣＭＶ ＨＩ−ＣＡＴベクターによる鼻内トランスフェクションをまた行った。この実験 において、被験スペルミジンコレステロールカルバメートの濃度は、１．０〜１ ． ５ｍＭであった（各場合に、コレステロールを１：１モル比で存在させ、両親媒 性物質と補脂質との混合は上記のとおりに行った）。ＤＮＡ濃度（ヌクレオチド 濃度として測定）は、４．０〜６．０ｍＭであった。トランスフェクション効率 （また、ｎｇＣＡＴ／１００ｍｇ組織として測定した）は、補脂質としてＤＯＰ Ｅを用いた場合よりも低かったが、このトランスフェクションは、ＤＣ−Ｃｈｏ ｌ／ＤＯＰＥを用いて達成された効率に比較して、実質的により有効であった。Ｂ部 図１、５および７に記載されているカチオン性両親媒性物質のトランスフェク ション効率を、インビボで比較するために、追加の実験を行った。その結果はそ れぞれ、図１３、１４および１５に示されている。化合物は、１２〜１５匹のマ ウス／化合物を用いて鼻内投与した。上記Ａ部と同様に、ｎｇＣＡＴ活性を組織 １００ｍｇについて測定した。しかしながら、改良されたベクター（ｐＣＦ１／ ＣＡＴおよびそのほぼ均等なｐＣＦ２／ＣＡＴ）を使用した。改良されたベクタ ーの性能から部分的に生じるものとして、ライゼートのアセチル補酵素Ａおよび Ｃ14−クロラムフェニコールのインキュベーションは、３０分間のみ行った。ｐ ＣＦ１／ＣＡＴおよびｐＣＦ２／ＣＡＴの構築は、以下の例４に記載されている 。 図１３、１４および１５に示されているインビボデータは一般的に、下記の規 則に従っていた。上記したように、図１０および１１は、両親媒性物質Ｎｏ．５ ３の完全インビボ最適化からのデータを示している。両親媒性物質Ｎｏ．６７は 、同様の部分的最適化に付された。ここに示されているその他のカチオン性両親 媒性物質の全部に関して、多くの構造上の類似点の利点を考慮して、インビボ試 験用に最適化された構成を、インビトロ結果から外挿した。これは、多数の両親 媒性物質および実施されない場合に、広く得られる比較データのスクリーニング を容易にした。Ｎｏ．５３およびＮｏ．６７以外の全部の両親媒性物質について 、そのインビボ試験用の両親媒性物質濃度対ＤＯＰＥ濃度の比は、両親媒性物質 濃度対ＤＯＰＥ濃度の最適比として、インビトロ実験から得た（例１参照）。従 って、これらの両親媒性物質の場合、インビボ試験濃度は、１ｍＭに固定した。 これにより補脂質の濃度も固定される。［広く、両親媒性物質対補脂質ＤＯＰＥ のモル比は、１：２（例えば、スペルミンコレステロールカルバメート Ｎｏ． ６ ７の場合）から、１：１（例えば、スペルミジンコレステロールカルバメートＮ ｏ．５３の場合）を経て、約２：１（例えば、両親媒性物質Ｎｏ．７５の場合） までの範囲にあった］。プラスミドＤＮＡの濃度は被験両親媒性物質のそれぞれ の種について変え、インビトロで測定された最適化両親媒性物質／ＤＮＡ比を反 復した。Ｃ部 本発明による新規両親媒性物質が当技術に重要に寄与することは、インビボト ランスフェクション エンハサーとしてのそれらの性能を、新規Ｔ型構造に欠け ている密接に関連するカチオン性両親媒性物質の性能と比較することによって、 直ちに見ることができる。スペルミジンコレステロールカルバメートは、そのカ チオン性アルキルアミン部分に同一数の炭素原子および窒素原子を有するが、「 Ｔ型」ではない、Ｎ1−スペルミジンコレステロールカルバメートに比較して、 かなり高い増強レベルを有することが測定された。 例３のＢ部の方法に一般的に従い、またそれぞれ６ｍＭ（ヌクレオチドとして ）、１．５ｍＭおよび１．５ｍＭのＤＮＡ濃度、両親媒性物質濃度および補脂質 濃度を用いる試験において、Ｎ1−スペルミジンコレステロールカルバメートに 比較して、スペルミジンコレステロールカルバメート（両親媒性物質Ｎｏ．５３ ）により提供されるトランスフェクション増強は、約３０倍であることが測定さ れた。 例３のＢ部の方法に一般的に従い、またそれぞれ４ｍＭ（ヌクレオチドとして ）、１ｍＭおよび２ｍＭのＤＮＡ濃度、両親媒性物質濃度および補脂質濃度を用 いる試験において、スペルミンコレステロールカルバメートにまた密接に関連す るＮ1−テルモスペルミンコステリルカルバメートおよびＮ1−スペルミンコステ リルカルバメートに比較して、スペルミンコレステロールカルバメート（両親媒 性物質Ｎｏ．６７）により提供されるトランスフェクション増強は、少なくとも 約３０倍であることが測定された。例４ ベクターの構築 前記の通り、本発明に係る陽イオン性、両親媒性物質の一種以上を含有する治 療組成物においては、多くの型の生物活性分子を細胞中に輸送することができる 。本発明の一つの重要な具体例における生物活性高分子はコード化ＤＮＡである 。標的細胞中で、このようなコード化ＤＮＡの発現を促進するために特に適当な 新規ベクター（プラスミド）の説明を以下に述べる。 Ａの部−ｐＣＭＶＨＩ−ＣＡＴ ｐＣＭＶＨＩ−ＣＡＴは、本発明の実施に有用なプラスミド構成体の代表例で ある。プラスミドはリポーター遺伝子（例３参照）を運ぶ形で提供されるが、治 療上の有用性をもつ導入遺伝子もその中に含めることができる。 ｐＣＭＶＨＩ−ＣＡＴベクターは市販ベクターｐＣＭＶβ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ ）に基礎を置いている。ｐＣＭＶβ構成体はｐＵＣ１９バックボーンをもち（Ｊ ．Ｖｉｅｉｒａ等、Ｇｅｎｅ、１９、２５９−２６８、１９８２）、これは本来 ｐＢＲ３２２から誘導された原核の複製開始点を含む。ｐＣＭＶＨＩ−ＣＡＴプ ラスミド（ＣＡＴをコード化するヌクレオチド配列を含むように構成）の基本的 特徴は次の通りである。時計方向に進んで−ヒトサイトメガロウイルス前初期遺 伝子プロモーターおよびエンハンサー、アデノウイルスから生じた融合三分節系 リーダーおよびハイブリッドイントロン、リンカー配列、ＣＡＴ ｃＤＮＡ、そ の他のリンカー配列、後期ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、およびｐＵＣ複製 開始点およびアムピシリン耐性に対する遺伝子を含むバックボーン。 ヒトサイトメガロウイルス前初期遺伝子プロモーターおよびエンハンサーは、 ヌクレオチド１−６３９からその領域がつながっている。これは転写開始部位（ ＋１）に関して−５２２から＋７２までの領域に相当し、最初Ｂｏｓｈａｒｔ等 、Ｃｅｌｌ、４１：５２１−５３０） １９８５により定義されたように、−５ ２４から−１１８までの殆ど全エンハンサー領域を含む。ＣＡＡＴボックスはｐ ＣＭＶＨＩ−ＣＡＴにおいてヌクレオチド４８７−４９１に位置し、ＴＡＴＡボ ックスはヌクレオチド５２２−５２６のところにある。ＣＡＴの写しは、ＣＭＶ プロモーターの転写開始部位であるヌクレオチド５４９のところで開始すること が予想される。三分節系リーダー−ハイブリッドイントロンは、ＩｇＧ遺伝子か ら誘導される５’スプライス供与体シグナルと３’スプライス受容体シグナルを 含むアデノウイルスから生ずる融合三分節リーダーから構成される。イントロン の要素は次の通りである：第一のリーダー、第二のリーダー、第三リーダーの一 部、第一リーダーからのスプライス供与体配列およびイントロン領域、およびマ ウス免疫グロブリン遺伝子スプライス供与体配列。イントロンの長さは２３０ヌ クレオチドである。ＣＡＴコード化領域はヌクレオチド１２５７−１９１３から なる。ＳＶ４０ポリＡシグナルはヌクレオチド２０２０から２２４９へ伸びてい る。 従って、ｐＣＭＶＨＩ−ＣＡＴプラスミドの構築は次のように進む。ベクター ｐＣＭＶβ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）をＮｏｔＩで消化 してβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を切除する。β−ガラクトシダーゼ遺伝子を欠 いたベクターフラグメントを単離し連結してｐＣＭＶを形成させる。 ハイブリッドイントロン（図１７）はプラスミドｐＡＤβ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ ）から得られた。このハイブリッドイントロンは、ｐ９１０２３（Ｂ）の６９５ 塩基対ＸｈｏＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントから単離された〔Ｗｏｎｇ等、Ｓｃｉ ｅｎｃｅ 、２２８、８１０−８１５（１９８５）参照〕。ハイブリッドイントロ ンは、アデノウイルスからの融合三分節系リーダー、三分節系リーダーの第一の セグメントからの供与体部位、およびＩｇＧ遺伝子からの受容体部位を含み、２ ３０ｂｐの長さをもつ。 ｐＡＤβをＰｍｌＩおよびＮｏｔＩで消化し、−５００塩基対（ｂｐ）フラグ メントを単離し、次にｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIＫＳ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅ ｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）のＮｏｔＩ部位に連結させてｐＢｌｕｅII−Ｈ Ｉをつくった。 ｐＢｌｕｅII−ＨＩをＸｈｏＩおよびＮｏｔＩで消化してハイブリッドイント ロン断片を切除した。このフラグメントをｐＣＭＶのＸｈｏｌおよびＮｏｔＩ部 位に連結し、ＳＶ４０イントロンを置き換えてｐＣＭＶＨＩを生成させた。 ＣＡＴ遺伝子はクロラムフェニコール アセチルトランスフェラーゼＧｅｎ Ｂｌｏｃｋ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）から得た。こ の７９２ｂｐ ＨｉｎｄIIIフラグメントをＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフ ラグメントでブラントし、次に各端にＮｏｔＩリンカー（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎ ｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）をつないだ。ＮｏｔＩで消化してＮｏｔＩの粘着端を露出 させた後、ｐＣＭＶのＮｏｔＩ部位中にサブクローニングしてｐＣＭＶＨＩ−Ｃ ＡＴを形成させた。ｐＣＭＶ−ＣＡＴをＮｏｔＩで消化してＣＡＴフラグメント を切除した。このＣＡＴフラグメントをｐＣＭＶＨＩ中に連結して図１６に描与 されたｐＣＭＶＨＩ−ＣＡＴを生成させた。Ｂの部 −ｐＣＦ１およびｐＣＦ２ ｐＣＭＶＨＩは、治療上の移入に適当であるが、それ以上の性能向上（導入遺 伝子の発現増加を含めて）が、ｐＣＦ１とｐＣＦ２のプラスミドにより提供され る。ｐＣＦ１／ＣＡＴの地図を図１８、パネルＡに、またｐＣＦ２／ＣＡＴの地 図をパネルＢに示す。 手短かに言えば、ｐＣＦ１はサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の前初期遺伝子 からのエンハンサー／プロモーター領域を含む。ハイブリッドイントロンはプロ モーターと導入遺伝子ｃＤＮＡとの間に位置する。ウシ成長ホルモン遺伝子のポ リアデニル化シグナルを、導入遺伝子から下流に配置するために選んだ。このベ クターはまたアミノグリコシダーゼ３’−ホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ト ランスポゾンＴｎ９０３から誘導、Ａ．０ｋａ等、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏ ｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ 、Ｎ１４７、２１７−２２６、１９８１）をコ ード化する薬剤耐性マーカーを含み、それによりカナマイシンに対する耐性が与 えられる。ｐＣＦ１構造についてのこれ以上の詳細をすぐ下に示す。これはのう 胞性繊維症トランスメンブレンコンダクタンス調節物質（ＣＦＴＲ）タンパク質 をコード化するｃＤＮＡ配列の説明を包含する。 ｐＣＦ１ベクターは、市販のベクターｐＣＭＶβ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を基礎 としている。ｐＣＭＶβ構成体はｐＵＣ１９バックボーンをもち（Ｊ．Ｖｉｅｉ ｒａ等、Ｇｅｎｅ、１９、２５９−２６８、１９８２）、このものは本来ｐＢＲ ３２２から誘導された原核の複製開始点を含む。 ｐＣＦ１−プラスミド（ＣＦＴＲをコード化するヌクレオチド配列を含むよう に構成される）の基本的特徴は次の通りである。時計方向に進んで−ヒトサイト メガロウイルス前初期遺伝子プロモーターおよびエンハンサー、アデノウイルス から生じた融合三分節系リーダーおよびハイブリッドイントロン、リンカー配列 、ＣＦＴＲｃＤＮＡ、その他のリンカー配列、ウシ成長ホルモンポリアデニル化 シグナル、ｐＵＣ複製開始点およびバックボーン、およびカナマイシン耐性遺伝 子。ｐＣＦ１−ＣＦＴＲプラスミドは両方の鎖について完全に配列が決定されて いる。 ヒトサイトメガロウイルス前初期遺伝子プロモーターおよびエンハンサーは、 ヌクレオチド１−６３９からその領域がつながっている。これは転写開始部位（ ＋１）に関して−５２２から＋７２までの部位に相当し、最初Ｂｏｓｈａｒｔ等 、Ｃｅｌｌ、４１、５２１−５３０（１９８５）により定義されたように、−５ ２４から−１１８までの殆ど全エンハンサー領域を含む。ＣＡＡＴボックスはｐ ＣＦ１−ＣＦＴＲにおいてはヌクレオチド４８６−４９０に位置し、ＴＡＴＡボ ックスはヌクレオチド５２１−５２５のところにある。ＣＦＴＲの写しは、ＣＭ Ｖプロモーターの転写開始部位であるヌクレオチド５４８のところで開始するこ とが予想される。 ハイブリッドイントロンは、ＩｇＧ遺伝子から誘導される５’スプライス供与 体シグナルと３’スプライス受容体シグナルを含むアデノウイルスから生ずる融 合三分節リーダーから構成される。イントロンの要素は次の通りである：第一の リーダー（ヌクレオチド７０５−７４５）、第二のリーダー（ヌクレオチド７４ ６−８１６）、第三のリーダー（一部、ヌクレオチド８１７−８７７）、第一リ ーダーからのスプライス供与体配列およびイントロン領域（ヌクレオチド８７８ −１０４２）、およびマウス免疫グロブリン遺伝子スプライス供与体配列（ヌク レオチド１０４３−１１３８）。供与体部位（Ｇｌ ＧＴ）はヌクレオチド８８ ７−８８８のところであり、受容体部位（ＡＧＩＧ）はヌクレオチド１１２８− １１２９のところ、そしてイントロンの長さは２３０ヌクレオチドである。ＣＦ ＴＲコード化領域はヌクレオチド１１８３−５６２２からなる。 ｐＣＦ１−ＣＦＴＲのＣＦＴＲ−コード化ｃＤＮＡ内に、最初に発表された予 想ｃＤＮＡ配列（Ｊ．Ｒｉｏｒｄａｎ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４５、１０６６− １０７３、１９８９）とは異なる二点がある；即ち（１）最初に発表された配列 の誤りを補正したＣＦＴＲｃＤＮＡの位置１９９０のところのＡからＣへの変更 、および（２）位置９３６に導入されたＴからＣへの変更である。位置９３６の ところの変更は部位特異的変異誘発により導入され、目立った変化はないが、細 菌プラスミド中で広がったときｃＤＮＡの安定性を著しく増加させる（Ｒ．Ｊ． Ｇｒｅｇｏｒｙ等、Ｎａｔｕｒｅ、３４７、３８２−３８６、１９９０）。予想 されるＣＦＴＲ写しの３’−非翻訳領域は、ＣＦＴＲｃＤＮＡの３’−非翻訳領 域の５１ヌクレオチド、リンカー配列の２１ヌクレオチドおよびＢＧＨポリＡシ グナルの１１４ヌクレオチドからなる。 ＢＧＨポリＡシグナルは、保存されたＡＡＵＡＡＡに隣接する配列（５’）の ９０ヌクレオチドおよびＡＡＵＡＡＡモチーフに隣接する配列（３’）の１２９ ヌクレオチドを含む。一次ＣＦＴＲ転写物は、ヌクレオチド５８０８におけるＢ ＧＨポリアデニル化シグナルの下流で開裂することが予想される。この開裂部位 に対し位置＋４６のところでｐＣＦ１−ＣＦＴＲに欠失があるが、この欠失は、 Ｅ．Ｃ．Ｇｏｏｄｗｉｎ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６７、１６３３０− １６３３４（１９９２）の研究に基づき、ポリアデニル化の能率あるいは開裂部 位の正確さのいずれをもたらすかは予想されない。ポリＡ尾部の添加後、生じた 転写物の大きさは約５．１ｋｂである。 ｐＣＦ２プラスミド（図１８（Ｂ））は最初のエンハンサーと縦に並んで第二 のＣＭＶエンハンサーを含む。ｐＣＦ１またはｐＣＦ２からの導入遺伝子の発現 促進は、強力なプロモーター、高度に能率的なポリアデニル化シグナルの存在、 翻訳を促進するリーダー配列、およびメッセージの安定性を増加させるイントロ ンの共同作用から起こる。例５ 陽イオン性、両親媒性物質で媒介された遺伝子伝達による、のう胞性繊維症患者 の鼻ポリープ上皮細胞における塩化物イオン輸送欠如の矯正 成人男子のう胞性繊維症患者から得た初代鼻ポリープ細胞（非永久増殖細胞） （△Ｆ５０８変異に対し同型接合）を、コラーゲン被覆した透過性フィルター支 持体（Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ）上で培養して分極した融合上皮細胞単層を形成させ た。一旦この単層を電気的に密着させると（接種後約５日から７日、細胞シート を横切る抵抗の出現により示される）、先端面を陽イオン性、両親媒性物質：Ｄ ＮＡ複合体の組成物に暴露できるようになる。 この場合、両親媒性物質（スペルミジンコレステロールカリバメート）をＤＯ ＰＥとの１：１（モルで）混合物として与え、次にこの混合物をｐＣＭＶ−ＣＦ ＴＲプラスミドベクター（野生型ヒトのう胞性繊維症トランスメンブレン コン ダクタンス調節タンパク質をコード化する構成体、上記参照）と複合体形成させ た。最終混合物における濃度は、スペルミジンコレステロールカルバメート（ま たＤＯＰＥの）４２μモルそしてプラスミド発現ベクター６０μモル（ヌクレオ チドのモル濃度に基づく）とした。 ＣＦＴＲの発現は、ｃＡＭＰで刺激された経上皮塩化物分泌を修飾Ｕｓｓｉｎ ｇチャンバー〔Ｚａｂｎｅｒ等、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、６、７５− ８３（１９８４１）〕中で測定することにより決定した。上皮の粘膜側を、０． ９５％とＣＯ2５％で通気したリンゲル重炭酸塩溶液中に浸した。粘膜下組織溶 液の組成は、粘膜の溶液と同様であるが、ただしグルコン酸ナトリウムの代りに 塩化ナトリウムを用いた。経上皮電圧を０ｍＶに制限し、短絡電流を記録した。 先端浴中にアミロリド（１０μＭ）を適用し、次いでフオルスコリンとＩＢＭＸ （各１００μＭ）を粘膜溶液へ添加した。次に５−ニトロ−２−（３−フエニル プロピルアミノ）安息香酸（「ＮＰＰＢ」）、ＣＦＴＲ塩化物チャンネルの抑制 剤、を１０から３０μＭで粘膜溶液へ添加した。 塩化物分泌（即ち、上皮細胞から粘膜溶液への塩化物移動）は上方へのふれと して示される（図１９Ａ参照）。同じプラスミドベクター（ただし、リポーター 遺伝子を含む）を負の対照として用いた（１９Ｂ）。ｃＡＭＰで刺激された電流 （０．５から２．５μアンペアー／ｃｍ2）が野生型ＣＦＴＲ遺伝子を移入され た単層に観察された。ｐＣＭＢ−β−ガラクトシダーゼ対照の場合には電流が検 知されなかった。例６ 陽イオン性、両親媒性物質で媒介された遺伝子伝達による、のう胞性繊維症患者 の気道上皮細胞における塩化物イオン輸送欠如の矯正 ヒト患者におけるのう胞性繊維症を治療するための、本発明医薬組成物の処方 と使用に推奨される手順は次の通りである。 例１に説明された手順に一般的に従い、スペルミジンコレステロールカルバメ ート（両親媒性物質Ｎｏ．６７）とＤＯＰＥがモル比１：２で存在する薄いフィ ルム（クロロホルムから蒸発）を調製した。この両親媒性物質含有フィルムを注 射用水の中で穏やかに回しながら再水和させ、生ずる両親媒性物質の濃度を約３ ｍＭとした。しかし、エーロゾルにより均一相として安定に投与できる両親媒性 物質／ＤＮＡ複合体の量を増加させるために（例えば、Ｌｅｎｅｘａ Ｍｅｄｉ ｃａｌ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、Ｌｅｎｅｘａ、ＫＳから得られるＰｕｒｉｔａｎ Ｂｅｎｎｅｔｔ Ｒａｉｎｄｒｏｐ ネブライザーあるいはＰＡＲＩ Ｒｅｓｐ ｉｒａｔｏｒｙ Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ、Ｉｎｃ．、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＶＡから 得られるＰＡＲＩ ＬＣ ＪｅｔTMネブライザーを使用）、最終両親媒性物質／ ＤＮＡ組成物を安定化する作用のある一種以上の更に別の成分を含めることが、 両親媒性物質含有フィルムの調節に有利かもしれない。従って、現在では両親媒 性物質含有フィルムを、両親媒性物質Ｎｏ．６７、ＤＯＰＥ、およびＰＥＧ(500 0) −ＤＭＰＥの１：２：０．０５モル混合物として調製することが好ましい。〔 ＰＥＧ−ＤＭＰＥ、ポリエチレングリコール５０００−ジミリストイルホスファ チジルエタノールアミンの適当な給源は、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉ ｄｓ、Ａｌａｂａｓｔｅｒ、ＡＬから得られるカタログＮｏ．８８０２１０であ る〕。ＰＥＧ−ＰＥの更にもう一つの脂肪酸類を代りに使用してもよい。 理論に関して制約を受けることはないが、ＰＥＧ(5000)−ＤＭＰＥは、生じた 両親媒性物質／ＤＮＡ複合体の凝集を防止することにより治療組成物を安定化す ると考えられる。更にまた、ＰＥＧ(2000)−ＤＭＰＥは本発明の実施において有 効でないことが判った。 ｐＣＦ１−ＣＦＴＲプラスミド（ヒトのう胞性繊維症トランスメンブレンコン ダクタンス調節剤のコート化配列を含む、例４参照）は、ヌクレオチドとして測 定して４ｍＭの濃度で注射用の水に入れて提供される。 次にプラスミドおよび両親媒性物質の二溶液を１０分間おだやかに接触させる ことによりこれら二物質の複合体形成を進行させる。 現在のところ、エーロゾル化したＤＮＡを肺へ約２から約１２ｍＭの濃度（ヌ クレオチドとして）で投与するのがよい。一般に、ＣＦＴＲ−コード化遺伝子の △Ｆ５０８変異に対して同型接合である成人患者の肺に対する一回のエーロゾル 投与には、約１０から約４０ｍｌの試料で十分である。 この手順（両親媒性物質／ＤＮＡの新しく調製した試料を使用）は約２週間の 間隔で繰り返す必要があることが予想されるが、これは患者の応答、移入ＤＮＡ からの発現持続期間、および炎症といった潜在的悪影響の出現に相当に依存し、 そしてこれらのすべては各個の患者について決定できそして患者の医師により考 慮されることである。 本発明に係る陽イオン性、両親媒性物質の一つの重要な利点は、それらが現在 入手可能な他の両親媒性物質よりも実質的に有効であり（生体内）、従って公知 の陽イオン性、両親媒性物質より実質的に低濃度で使用できることである。この 結果として、他の手段では遺伝子治療の成功に悪影響を及ぼすかも知れない副作 用（例えば、両親媒性物質の毒性、炎症反応）を、実質的に最小にできる可能性 が出てくる。 本発明に係る両親媒性物質の多くの使用に関連した更に一つの特別な利点を再 び述べねばならない。本発明に係る両親媒性物質の多くは、その代謝が生物学的 に隔和しうる比較的無害な成分へ向かって迅速に進むように設計されている。こ れに関して、高度に活性な両親媒性物質５３、６７、および７５が特別に注目さ れる。両親媒性物質／コーリピド組成物調製の別法 臨床投与に適した物質を処方するためには、陽イオン性、両親媒性物質とコー リピド（ｃｏ−ｌｉｐｉｄ）を一緒に調製するときに、クロロホルムの使用を避 けることが好ましいかも知れない。例として、両親媒性物質６７（Ｎ4−スペル ミンコレステリルカルバメート、図１Ａ）の処方を用いてこのような組成物を製 造する一つの別法が示唆されている。 陽イオン性、両親媒性物質、中性コーリピドＤＯＰＥ、およびＰＥＧ(500)− ＤＭＰＥをびんに秤り入れ、各々を回しながらｔ−ブタノール：水９：１に溶か し、次いで一つのメスフラスコに移した。各脂質の適量を選んで陽イオン性、両 親媒性物質対ＤＯＰＥ対ＤＭＰＥ−ＰＥＧのモル比１：２：０．０５を得た。得 られた溶液を攪拌し、必要に応じｔ−ブタノール：水９：１で更に希釈して求め る濃度を得た。次に滅菌濾過器（０．２ミクロン、ナイロン）を用いて濾過した 。 次に、得られた１：２：０．０５濾過溶液１ｍｌをピペットで個々のびんに採 った。びんを二脚ブチル栓で不完全に施栓し、凍結乾燥用トレー上に置いた。約 −５℃の温度で２から４日間にわたり凍結乾燥することによりｔ−ブタノール： 水９：１溶液を除いた。次に凍結乾燥機を、滅菌０．２ミクロン濾過器に通過さ せたアルゴンで満した。次に栓をびんに完全に挿入し、次にびんをアルミニウム のクリンプ−トップでふたをした。次にびんを使用まで−７０℃に保った。 例７遺伝子治療のためのプラスミド計画における更なる向上策： エピソームプラスミド複製 前記計画の特徴は、入手可能なプラスミドの使用特性を実質的に高めるもので あるが、このようなプラスミドと陽イオン性、両親媒性物質からなる治療組成物 が遺伝子治療に対して最適な性能をもつように更に修飾することが望ましい。 遺伝子治療用プラスミドは患者の細胞中で複製できることも望ましい。それは 長期間にわたりプラスミドが継続して存在すると遺伝的欠損の矯正の問題が出て くるからである（のう胞性繊維症の場合には、肺上皮細胞または他の細胞の細胞 膜中に機能するＣＦＴＲタンパク質を欠く）。現行技術の代表的プラスミド（即 ち、患者の標的細胞中で複製できないもの）は、比較的短期間患者体内に維持さ れた後分解されるので、過度の繰り返し投与が必要になるという心配がある。 長期矯正は、恐らくは、患者の標的細胞中で染色体中に合体するように設計さ れたベクター（例えば、レトロウイルスを模倣したベクター）を用いることでよ り達成できるであろう。しかし、このような方策は、（１）ベクターが染色体の 必須領域中に組み込まれること、あるいは（２）ベクターが癌遺伝子に隣接して 合体しそしてそれを活性化すること、を含めて複数の危険を含んでいる。 従って、他の手段により標的細胞中での遺伝子治療ベクター（プラスミド）の 継続した維持に備えることが望ましい筈であろう。一つのこのような方法は、標 的細胞の核の中で別々に維持されうる、しかも核の中で複製できるプラスミド （エピソーム）を構築することである。 本発明のこの面に従って提供されるプラスミドは、次のように構築できる。ヒ トのｃ−ｍｙｃ遺伝子のエキソン１に対してすぐ５’に存在する２．４ｋｂ Ｈ ｉｎdIII−ＸｈoＩフラグメントが複製開始点を含むことが決定された（Ｃ．Ｍ ｃＷｈｉｎｎｅｙ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１８， １２３３−１２４２，１９９０）。次にこのフラグメントをプラスミド中にクロ ーン化した。このプラスミドは、もしＨｅＬａ細胞中に移入したとき、薬物選択 の下で３００世代より多くの間細胞内で存続することが示されたものである。複 製は半保存的であることが示された（Ｃ．ＭｃＷｈｉｎｎｅｙ等）。これらの実 験で薬物選択無しに一細胞世代当りプラスミド集団の約５％が失なわれたが、そ れにも拘らずこの結果は、遺伝子治療に適する治療用プラスミドの設計に関して 実質的安定化が有利になるであろうことを実証している。 従って、複製性エピソームベクターの一例として、ｐＣＦ１−ＣＦＴＲ（また はｐＣＦ１−ＣＡＴ）の変異体を構築できる。この変異体においては、２．４ｋ ｂ ＨｉｎdIII−ＸｈｏＩフラグメントのコピーがｐＣＦ１バックボーンのＣＭ Ｖエンハンサー／プロモーター領域に対して丁度５’に位置している。他方、２ と約４−縦に並んで−の間に２．４ｋｂフラグメントのコピーが同様に位置しう る。２．４ｋｂフラグメント（あるいはその倍数のコピー）の挿入の結果起こる プラスミドの大きさの増加は、もう一つの利益を提供する、即ちプラスミドの巻 きもどしを促進する（従ってＤＮＡポリメラーゼの活動を促進する）ことが予想 される。 この複製開始点あるいはその多重コピーを使用すると、その結果生ずるプラス ミドがヒトの細胞中で能率的に複製できるようになる。また他の複製開始点を含 む他のＤＮＡ配列も使用できる（例えば、ヒトβ−グロブリン遺伝子、またはマ ウスＤＨＦＲ遺伝子に見出される）。 本発明のこの面に従って構築することができ、そして次の成分、即ちサイトメ ガロウイルス プロモーターとエンハンサー、イントロン、ＣＦＴＲ ｃＤＮＡ 、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル、カナマイシン耐性トランスポゾン 、Ｔｎ９０３、およびヒトｃ−ｍｙｃ遺伝子の２．４ｋｂ５’隣接領域の４コピ ー、 を含むプラスミドを図２０に示す。 例８遺伝子治療のためのプラスミド設計における更なる向上策： 遺伝子治療における導入遺伝子の発現 を修飾するためのサイトカインプロモーターの使用 慢性的炎症は遺伝子治療により治療できる数多くの病気状態と関連する。この ような病気状態の代表例は、のう胞性繊維症（ＣＦＴＲを使用）、気管支炎、成 人呼吸困難症候群（アルファー１アンチトリプシンを使用）、および転移癌（ｐ ５３、ＴＩＭＰ−１、およびＴＩＭＰ−２の増加作用により）である。炎症状態 は、典型的には多くの相関連する過程を含み（例えば、多くの型の免疫系細胞お よび肝臓タンパク質による複雑な状態）、それによって身体は損傷を受けた、あ るいは感染した、組織を治そうと試みる。しかし、未解決の状態の結果として存 続する慢性的炎症は、のう胞性繊維症により侵された肺組織や関連する未解決の 肺感染症に関する場合がそうであるように、永久的組織損傷へと導くことがある 。事実、のう胞性繊維症患者の肺組織に対する永久的損傷は、彼等の死亡率の主 たる原因となっている。標的となる病気状態と関連した炎症症状を治療するよう に遺伝子療法を提供することが望ましい筈である。 従って、本発明の更に一つの面は、遺伝子治療ベクターの構築であり、この場 合治療用導入遺伝子を、サイトカイン遺伝子（あるいは他の同様な調節タンパク 質をコード化する遺伝子）から得られるＲＮＡポリメラーゼプロモーター、例え ばインターロイキン２、インターロイキン８、インターロイキン１、インターロ イキン１１、インターロイキン６、エンドテリン−１、単球化学誘引性タンパク 質−１、１Ｌ−１ｒａ（リポーター作働物質）のいずれかに対するプロモーター 、またはＧＭ−ＣＳＦに対するプロモーターの制御下に置く。 サイトカインはホルモン様の細胞間シグナルタンパク質として定義でき、この ものは細胞増殖、分化、および機能、例えば造血やリンパ生成に関する機能の調 節に与かる。インターロイキンは、本発明の実施に役立つプロモーターを有する 特別な一群のサイトカインである。インターロイキンは典型的には非関連起原の タンパク質であり、免疫反応性細胞間の反応を媒介する細胞間シグナルとして作 用する。しかし、多くの「インターロイキン」は内皮細胞、上皮細胞、および繊 維芽細胞を含めて更に別の細胞型に対して効果をもつことは明らかである。 多くのサイトカインの濃度は、存在する炎症のレベルに応じて患部で増加作用 を受けるので、遺伝子治療ベクターは、一部は、存在する炎症のレベルにより設 計できる（発現した治療用導入遺伝子のレベルが決定される）。一例として、主 としてインターロイキン８遺伝子の特性を用いることによりこのようなベクター を如何に設計するかを以下に説明する。 数多くの生物活性分子が、炎症状態の重篤さと共に増加する濃度で組織中に存 在する（例えば、腫瘍壊死因子「ＴＮＦ」および潜在的転写因子、例えばＮＦ− ｋＢ、ＡＰ−１、ＮＦ−ＩＬ６および８量体結合タンパク質）。インターロイキ ン８、ＭＷ８，５００のポリペプチド、は炎症により増加作用を受け、炎症反応 にそれ自身関与するＴリンパ球および好中球に対し強力な化学誘引物質として作 用することも決定された。インターロイキン８遺伝子は主として転写レベルで調 節され、そしてＴＮＦは気管支上皮細胞中容器内でインターロイキン８の転写を ３０倍より多く増加させうることも決定された（Ｈ．Ｎａｋａｍｕｒａ等、Ｊｏ ｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ 、２６６、１９ ６１１−１９６１７，１９９１）。従って、上記事項を利用する遺伝子治療ベク ターの説明を以下に述べる。 ｐＣＦ１と実質的に同様な、即ち細菌由来複製開始点とカナマイシンに対する 耐性を与える遺伝子を含むｐＵＣプラスミドから誘導された、プラスミドを構築 できる。得られたプラスミドはまたＣＭＶエンハンサー、プロモーター、ハイブ リッドイントロン、ＣＦＴＲをコード化するｃＤＮＡ配列、およびウシ成長ホル モンポリアデニル化シグナルを連続して含んでいる。ＲＮＡポリメラーゼプロモ ーターとして、インターロイキン８プロモーターの−３３５から＋５４領域が選 ばれた。この領域は、プロモーター活性＋ＴＮＦ／−ＴＮＦ（Ｎａｋａｍｕｒａ 、１９９１）に関して最高の比を与えた。 このようなプラスミドは特に貴重な使用特性を有する。のう胞性繊維症に侵さ れた肺の中で炎症が増すにつれて（そのため、遺伝子治療による肺の治療の必要 性も増す）、種々な炎症関連分子（例えば、ＴＮＦ）の濃度が増すであろう。治 療用プラスミドのＣＦＴＲ−コード化ｃＤＮＡを、それ自身細胞と接触している 炎症関連物質の濃度に敏感な転写プロモーター（例えば、インターロイキン８の それ）の制御下に置くことによって、このプロモーターは有益なＣＦＴＲ転写の 量が炎症量に合わせて調整されるように天然遺伝子スイッチとして機能するであ ろう。前記の通り、他の前記遺伝子から誘導されたＲＮＡポリメラーゼプロモー ター配列も本発明の実施に有用である。例９ 導入遺伝子の静脈内投与 幾つかの病気状態、例えばのう胞性繊維症に対しては、肺へ導入遺伝子を供給 することが望ましい。エーロゾルによる投与はこの目標を達成するための最も直 接的な方法である。しかし、肺以外の器菅（例えば、のう胞性繊維症については 膵臓）を標的とする潜在的必要性と共に、エーロゾルの投与には本来具なわって いる困難があるので、非エーロゾル投与形式を用いる肺への投与の可能性を評価 することが大切である。従って、リポーター導入遺伝子の静脈内投与がマウスモ デルを用いて行なわれ、静脈内器官を標的とすることの成否が評価された。肺と 心臓への投与の実行可能性について比較を行なった。 リポータープラスミドｐＣＦ−１ ＣＡＴ（例４）を用い、そして内毒素（＜ １ＥＵ／ｍｇ ｐＤＮＡ）およびまた染色体ＤＮＡ汚染（＜２％）を最小にする よう精製した。両親媒性物質Ｎｏ．５３（ＤＯＰＥと１：１）／ＤＮＡ複合体を 例３の手順に従い調製した。両親媒性物質は遊離塩基として得られ、プラスミド は水中ナトリウム塩として調製し、ＤＯＰＥは双性イオン形で与えられた。 動物モデルはＢＡＬＢ／Ｃマウスとした。６−８週齢の体重１６−１８ｇの雌 へ、５頭／群を用いて、尾の静脈を利用して静脈内注射した。用いた脂質：ｐＤ ＮＡ複合体の体積は全実験で１００μｌであった。特に断らない限り、複合体の 投与後４８時間でマウスを殺した。直ちに器官をドライアイス上で凍らせ、その 後の分析に備えて貯蔵した。 ＣＡＴ酵素活性に対し放射化学検定を用いてクロラムフェニコールトランスフ ェラーゼ（ＣＡＴ）の発現を定量した。器官を秤量し、プロテアーゼ阻害剤を含 む溶解緩衡液中氷上で均質化した。溶解物を凍結−融解（３Ｘ）し、遠心し、６ ５℃に加熱してデアセチラーゼを不活性化した後、これを１４Ｃ−クロラムフェ ニコールを含む反応混合物へ加えた。３７℃でインキュベーション後、混合物を 酢酸エチルで抽出し、濃縮し、ＴＬＣプレート上にスポットし、ＣＨＣＬ3／Ｍ ｅＯＨで溶離した。アシル化反応生成物に対応するスポットを定量し（Ｂｅｔａ ｇｅｎ）、直正ＣＡＴ標準物質を用いてｎｇＣＡＴ活性へ変換した。 治療組成物中の両親媒性物質／ＤＮＡのモル比（ヌクレオチドとして測定して 一定ＤＮＡ濃度０．９ｍＭにおいて）を変えることにより、心臓を標的とする方 法が実質的に改善できたことが意外にも決定された。この情報は、冠状動脈疾患 のような心臓に対する遺伝子治療に関して貴重である。しかし肺を標的とする方 法は、すべて一定のＤＮＡ濃度においてある両親媒性物質／ＤＮＡ比範囲にわた り比較的一定に留まった（図２１）。 約０．５未満のモル比において、器官分布は肺に向かって強く重味がかかるこ とが分かった。このモル比で複合体のゼータ電位は負（約−３０ｍＶ）である。 それは、一部では、両親媒性物質と比較してＤＮＡからの過剰の負電荷によるか らである。しかし、１．２５の両親媒性物質／ＤＮＡ比においては、複合体は正 のゼータ電位（約＋３０ｍＶ）を有し、器官分布は著しく変化し、実質的な発現 が心臓に見出された（図２１）。 試料のゼータ電位はＭａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ４（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｓｏｕｔｈｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ．）とゼータ電池 （ＡＺ−１０４電池、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｃｏ．）を用 いて測定できる（典型的には、一試料当り５測定）。陽イオン性脂質とＤＯＰＥ を含む乾いた脂質フィルムを蒸留水（ｄＨ2Ｏ）中で水和した。ＤＮＡは典型的 にはｄＨ2Ｏ中約３００μＭの濃度に希釈しなければならない。次にこのＤＮＡ 溶液(1．５ｍｌ）を等容の陽イオン性脂質小のうに加え、室温で１０分インキュ ベートした。十分量のＮａＣｌ（例えば、４ｍＭ原液）を加えて最終濃度を１ｍ Ｍ ＮａＣｌとした。必要に応じ、試料を更に１ｍＭ ＮａＣｌで希釈し（光電 子増倍菅信号を４０００カウント／秒より下に保つため）、ＮａＣｌ溶液の代り に蒸留水を使用できる。 本発明のこの面によると、両親媒性物質Ｎｏ．５３およびＮｏ．６７はとりわ け心臓の静脈内標的化への使用に好ましく、グループＩとIIから選ばれる多くの 他の両親媒性物質も同様である。例１０ 追加実験手順 （Ａ）Ｎ4−スペルミンコレステリルカルバメート、両親媒性物質Ｎｏ．６７の 追加合成手順 （Ｎ1、Ｎ12−ジＣｂｚ−スペルミン＝ＨＣｌ塩の合成） ベンジルクロロホルメート（１５ｍｌ、１０５ミリモル）を窒素雰囲気下で塩 化メチレン（３３５ｍｌ）に溶かし、三頚プラスコに入れた。イミダゾール（１ ４ｇ、２０６ミリモル）を塩化メチレン（２００ｍｌ）に溶かした。氷−水浴を 用いて三頚フラスコを０−２℃に冷却し、イミダゾール溶液を３０分にわたり徐 除に加えた。冷却浴を除き、混合物を室温で１時間かきまぜた。この混合物へ塩 化メチレン（２５０ｍｌ）とクエン酸水溶液（１０％、２５０ｍｌ）を加えた。 層を分け、有機層をクエン酸水溶液（１０％、２５０ｍｌ）で洗浄した。有機層 を硫酸マグネシウム上で乾燥し、真空で濃縮した。生じた油状物を室温で２時間 真空乾燥した。この油状物ヘジメチルアミノピリジン（５３０ｍｇ、４．３ミリ モル）と塩化メチレン（２５０ｍｌ）を加えた。混合物を０−２℃に冷却し、窒 素雰囲気下に保った。塩化メチレン（２５０ｍｌ）中スペルミン（１０ｇ、４９ ミリモル）の溶液を、１５分間にわたり反応温度を０−２℃に維持しつつ徐々に 加えた。反応混合物を室温で一晩かきまぜ、次に真空で濃縮した。得られた物質 へ１Ｍ塩酸（６７ｍｌ）とメタノール（４００ｍｌ）とを加えた。この溶液を４ ℃で一晩冷却して白色沈殿を得た。Ｗｈａｔｍａｎ＃１濾紙を用いて真空濾過に より沈殿を単離した。このようにして得られたＮ1、Ｎ12−ジＣｂｚ−スペルミ ン＝ＨＣｌ塩（１３．３８ｇ、２４．７ミリモル、収率５０％）を室温で１７時 間真空下で乾燥した。 （Ｎ1、Ｎ12−ジＣｂｚ−Ｎ4−スペルミンコレステリルカルバメートの合成） クロロホルム、メタノールおよび水の比６５：２５：４の混合物（９４０ｍｌ ）にＮ1、Ｎ12−ジＣｂｚ−スミルミン＝ＨＣｌ塩（１３．３８ｇ、２４．７ミ リモル）を溶かした。溶液を室温でかきまぜ、コレステリルクロロホルメート （１１ｇ、２４．５ミリモル）を加えた。溶液を室温で１．５時間かきまぜ、次 に１Ｍ水酸化ナトリウム溶液（１６５ｍｌ）で希釈した。有機層と水層とを分け 、生成物を含む有機層を水（１１０ｍｌ）で洗浄した。有機部分を硫酸ナトリウ ム上で乾燥し、真空で濃縮し、真空乾燥した。粗製油状物をシリカゲル（６０Å 、１ｋｇ）を用いるクロマトグラフィーにより精製した。シリカを１０％ＭｅＯ Ｈ／ＣＨＣｌ3で詰め、カラムを２５％ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ3で溶離した。９００ ｍｌのフラクションを集め、薄層クロマトグラフィーにより分析した。生成物を 含むフラクション（Ｒｆ＝０．５、２０％、ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ3）を合わせ、 真空で濃縮した。得られた油状物を真空下に１７時間乾燥して８．５ｇ（９．６ ７ミリモル、収率３９％）の生成物を得た。 （Ｎ4−スペルミンコレステリルカルバメートの合成） Ｎ1、Ｎ12−ジＣｂｚ−Ｎ4−スペルミンコレステリルカルバメート（８．５ｇ 、９．６ミリモル）を２００ｍｌの酢酸に溶かし、炭素上１０％Ｐｄ１．６６ｇ を加えた。溶液を窒素で掃気し、大気圧で水素下にかきまぜた。水素ガスを満し た風船を用いて反応フラスコへ水素を供給した。この水素化分解を３時間進めた 。反応混合物をＷｈａｔｍａｎ＃１濾紙に通して濾過し、触媒を酢酸エチル中１ ０％酢酸２５０ｍｌで洗浄した。濾液を真空で濃縮して残留物を得、クロロホル ムと共同蒸発させて酢酸の除去を促進した。粗製生成物へ１Ｍ水酸化ナトリウム 溶液（４００ｍｌ）を加え、溶液を１０％ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ3（７００ｍｌ） で三回抽出した。合わせた有機フラクションを水（６００ｍｌ）洗し、硫酸ナト リウム上で乾燥した。溶液を濾過し、真空で濃縮し、室温で４８時間真空乾燥し た。粗製物質をシリカゲル（５００ｇ）上でクロマトグラフィーにより精製した 。カラムを４０：２５ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ3で充填し、４０：２５ＭｅＯＨ／Ｃ ＨＣｌ3で、次に４０：２５：１０ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ3：ＮＨ4ＯＨで溶離した 。集めたフラクションを薄層クロマトグラフィーにより分析し、生成物を含むフ ラクションを合わせて真空で濃縮した（残留水と共沸させるため、イソ−プロパ ノールの添加により水の蒸発を早めた）。この物質を室温で４８時間真空乾燥し てＮ4−スペルミンコレステリルカルバメート（４ｇ、６５ミリモル、収率６７ ％）を得た。 （Ｂ）Ｎ4−（Ｎ’−コレステリルカルバメートグリシンアミド）−スペルミン （両親媒性物質Ｎｏ．９１） Ｎ−ｔ−ＢＯＣ−グリミン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（０．５ ｇ、１．８３ミリモル）を６５／２５／４クロロホルム／メタノール／水（５０ ｍｌ）中ジＣｂｚ−スペルミン２ＨＣｌ（１．０ｇ、１．９４ミリモル）および Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．３ｍｌ、１．７２ミリモル）の溶液 へ加えた。溶液を室温で一晩かきまぜた。ＴＬＣ（２０％メタノール／クロロホ ルム）による反応物の分析は新しいスポットの存在を示した。反応物を先ず１Ｍ ＮａＯＨ（１０ｍｌ）で、次にＨ2Ｏ（１０ｍｌ）で洗浄した。有機層を分離し 、硫酸ナトリウム上で乾燥し、真空濾過し、真空で濃縮して油状物とした。この 粗製物質を、２０％メタノール／クロロホルムで溶離するフラッシュカラムクロ マトグラフィー（シリカゲル８５ｇ）により精製した。望む生成物を単離し、1 ＨＮＭＲによりＮ1、Ｎ12−ジＣｂｚ−Ｎ4−（Ｎ’−ｔ−ＢＯＣ−グリシンアミ ド）−スペルミン（４０２ｍｇ、０．６５ミリモル、３５％）として同定した。 ベンジルクロロホルメート（１００ｍｇ、０．５８ミリモル）を、塩化メチレ ン（２０ｍｌ）中Ｎ1、Ｎ12−ジＣｂｚ−Ｎ4−（Ｎ’−ｔ−ＢＯＣ−グリシンア ミド）−スペルミン（２２０ｍｇ、０．３５４ミリモル）およびトリエチルアミ ン（４滴）の溶液へ加えた。反応物を室温で一晩かきまぜた。ＴＬＣ（２０％、 メタノール／クロロホルム）による反応物の分析は、より高く移動する新しいス ポットの存在を示した。１Ｍ ＨＣｌ（５ｍｌ）の添加により反応を失活させた 。有機層を単離し、Ｈ2Ｏ（５ｍｌ）で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾 過し、真空で濃縮した。 得られた粗製物質をクロロホルム（３０ｍｌ）に溶かし、溶液中に無水ＨＣｌ ガスを２時間通じた。ＴＬＣ（１０％メタノール／クロロホルム）による反応の 分析は出発原料の完全な消失を示した。反応物を乾燥窒素で掃気し、１Ｍ Ｎａ ＯＨ（２×１０ｍｌ）およびｄ Ｈ2Ｏ（１０ｍｌ）で洗浄した。有機層を分離 し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、真空で濃縮してＮ1、Ｎ9、Ｎ12−トリ Ｃｂｚ−Ｎ4−グリシンアミド−スペルミン（２１９ｍｇ、０．３３ミリモル、 二工程に対する収率９３％）を得た。 コレステリルクロロホルメート（１４８ｍｇ、０．３３ミリモル）を、塩化メ チレン（３０ｍｌ）中Ｎ1、Ｎ9、Ｎ12−トリＣｂｚ−Ｎ4−グリシンアミド−ス ペルミン（２１９ｍｇ、０．３３ミリモル）およびトリエチルアミン（０．３ｍ ｌ、２．１５ミリモル）の溶液へ加えた。反応物を室温で３時間かきまぜた。反 応物をＨ2Ｏ（１０ｍｌ）で洗浄した。有機層を分離し、硫酸ナトリウム上で乾 燥し、濾過し、真空で濃縮した。粗製物質を６５％酢酸エチク／ヘキサンで溶離 するフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル３０ｇ）により精製した 。望む生成物を分離し、1Ｈ ＮＭＲによりＮ1、Ｎ9、Ｎ12−トリＣｂｚ−Ｎ4− （Ｎ’−コレステリルカルバメート グリシンアミド）−スペルミン（２２１ｍ ｇ、０．２ミリモル、収率６２％）として同定した。 Ｎ1、Ｎ9、Ｎ12−トリＣｂｚ−Ｎ4−（Ｎ’−コレステリルカルバメート グ リシンアミド）−スペルミン（２２１ｍｇ、０．２ミリモル）を、氷酢酸（１０ ｍｌ）中水素雰囲気下で１０％Ｐｄ／Ｃ（５０ｍｇ）と２．５時間かきまぜた。 ＴＬＣ（６５％酢酸エチル／ヘキサン）により反応物を分析したところ、出発物 質が完全に消失したことが示された。フラスコを窒素で掃気し、触媒を濾紙に通 す真空濾過により除去し、１０％酢酸／酢酸エチル（２０ｍｌ）ですすいだ。濾 液を真空で濃縮して油状物とし、これを１０％メタノール／クロロホルム（１０ ０ｍｌ）に溶かし、１Ｍ ＮａＯＨ（２０ｍｌ）およびＨ2Ｏ（１５ｍｌ）で洗 浄した。有機層を分離し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、真空で濃縮した 。単離された生成物は、1Ｈ ＮＭＲにより、Ｎ4−（Ｎ’−コレステリル カル バメートグリシンアミド）−スペルミン（１２８ｍｇ、０．19ミリモル、収率９ ５％）として特徴づけられた。（Ｃ）Ｎ4−スペルミジン−２，３−ジラウリルオキシプロピルアミン、両親媒 性物質Ｎｏ．９４の合成 ２，３−ジミリストイルグリセリン（６００ｍｇ、１．４ミリモル）をピリジ ンに溶かし、溶液を０℃に冷却した。溶液を窒素雰囲気下でかきまぜ、ｐ−トル エンスルホニルクロリド（３００ｍｇ、１．５７ミリモル）を加えた。溶液を室 温まで温め、次に室温で一晩かきまぜた。この溶液へ塩酸（２．５Ｍ、２０ｍｌ ）を加え、溶液を塩化メチレン（２５ｍｌ）で三回抽出した。合わせた有機 抽出液を硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、真空で濃縮して粗製油状物を得た 。この油状物を５％酢酸エチル／ヘキサンで溶離するフラッシュクロマトグラフ ィー（シリカゲル、６０Å、５０ｇ）により精製した。フラッシュクロマトグラ フィーにより得られた油状物を高真空下に室温で乾燥して、２，３−ジミリスト イルグリセリンートシレート（６３０ｍｇ、収率７７％）を得た。 ２，３−ジミリストイルグリセリンートシレート（３００ｍｇ、０．５１ミリ モル）とＮ1、Ｎ8−ジＣｂｚスペルミジン（１．５ｇ、３．６ミリモル）をトル エン（１５ｍｌ）に溶かした。溶液を窒素雰囲気下でかきまぜ、還流加熱（１１ ０℃）した。反応物を還流温度で５日間加熱した。反応物を室温に冷却し、次に Ｗｈａｔｍａｎ＃１濾紙を通して濾過した。濾液を真空で濃縮した。残留物をク ロロホルム（５０ｍｌ）に溶かし、水酸化ナトリウム溶液（１Ｍ、１０ｍｌ）お よび水（１０ｍｌ）で洗浄した。有機部分を硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し 、真空で濃縮した。粗製物質を５％メタノール／クロロホルムで溶離するフラッ シュクロマトグラフィー（シリカゲル、６０Å、３０ｇ）により精製した。生成 物を含むフラクションを真空濃縮した。この物質を、５０％酢酸エチル／ヘキサ ンで溶離する二番目のフラッシュクロマトグラフィーカラム（シリカ、６０Å、 ２０ｇ）により精製した。このクロマトグラフィーにより、生成物を高真空下に 室温で乾燥後、Ｎ4−（Ｎ1、Ｎ8）−ジＣｂｚ−スペルミジン−２，３−ジラウ リルオキシプロピルアミンが油状物（１４２ｍｇ、収率３５％）として得られた 。 氷酢酸（５ｍｌ）中Ｎ4−（Ｎ1、Ｎ8）−ジＣｂｚ−スペルミジン−２，３− ジラウリルオキシプロピルアミン（１４２ｍｇ、０．１８ミリモル）を１０％Ｐ ｄ／Ｃ（５０ｍｇ）と共に水素雰囲気下で２時間かきまぜた。Ｗｈａｔｍａｎ＃ １濾紙を通して真空濾過により触媒を除いた。触媒を酢酸エチル／ヘキサン（１ ０％、１０ｍｌ）で洗浄した。濾液を真空で濃縮し、高真空下で２時間乾燥した 。この残留物へ水酸化ナトリウム溶液（１Ｍ、８ｍｌ）を加え、溶液をメタノー ル／クロロホルム（１０％、２０ｍｌ）で三回抽出した。合わせた有機抽出液を 硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、真空で濃縮し、高真空下で乾燥の後、Ｎ4 −スペルミジン−２，３−ジラウリルオキシプロピルアミン（５２ｍｇ、収率５ ２％）を得た。（Ｄ）Ｎ4−スペルミン−２，３−ジラウリルオキシプロピルアミン、両親媒性 物質Ｎｏ．１０２の合成 Ｎ1、Ｎ12−ジＣｂｚスペルミン（０．８７ｇ、１．８５ミリモル）および２， ３−ジミリストイルグリセリン−トシレート（２８０ｍｇ、０．４８ミリモル） をトルエン（２５ｍｌ）に溶かし、還流温度（１１０℃）で３日間加熱した。溶 液を真空で濃縮し、得られた物質を１０％メタノール／クロロホルムで溶離する フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、６０Å、３０ｇ）により精製した 。単離された物質をメタノール／クロロホルム（１０％、８５ｍｌ）に溶かし、 水酸化ナトリウム溶液（１Ｍ、１５ｍｌ）および水（１０ｍｌ）で二回洗浄した 。有機フラクションを硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、真空で濃縮した。こ の物質を高真空下に室温で一晩乾燥してＮ4−（Ｎ1、Ｎ12−ジＣｂｚ−スペルミ ン）−２，３−ジラウリルオキシプロピルアミン（１８０ｍｇ、収率４３％）を 得た。 氷酢酸（１０ｍｌ）中、Ｎ4−（Ｎ1、Ｎ12−ジＣｂｚ−スペルミン）−２，３ −ジラウリルオキシプロピルアミン（１８０ｍｇ、０．２ミリモル）を１０％Ｐ ｄ／Ｃ（５０ｍｇ）と共に水素雰囲気下で３時間かきまぜた。Ｗｈａｔｍａｎ＃ １濾紙を通して真空濾過することでより触媒を除去した。触媒を酢酸エチル／ヘ キサン（１０％、３０ｍｌ）で洗浄した。濾液を真空で濃縮し、高真空下で２時 間乾燥した。この残留物へメタノール／クロロホルム（１０％、８５ｍｌ）を加 え、有機層を水酸化ナトリウム溶液（１Ｍ、１５ｍｌ）および水（１０ｍｌ）で 二回洗浄した。有機フラクションを硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、真空で 濃縮し、高真空下での乾燥後に、Ｎ4−スペルミン−２，３−ジラウリルオキシ プロピルアミン（５０ｍｇ、収率４０％）を得た。例１１ 血管組織から分泌されるタンパク質の発現 ヒト分泌アルカリ性ホスファターゼ（ＳＥＡＰ）が、コード化ｃＤＮＡを含む プラスミドの静脈内投与後に、ＢＡＬＢ／Ｃマウスの血清中に検出された。一般 に、例１および例３の手順に従い、陽イオン性、両親媒性プラスミド組成物を調 製した。ヒトＳＥＡＰに対する配列をコード化するｃＤＮＡをｐＣＦ１プラスミ ド中に置く（例４参照）。両親媒性物質Ｎｏ．６７（０．７５ｍＭ）、ＤＯＰＥ （１．５ｍＭ）およびｐＣＦ１プラスミド２ｍＭ（ヌクレオチドとして）を含む ように移入組成物を調製した。従って両親媒性物質／ＤＮＡ比は１：４であり、 それにより負のゼータ電位を得た。 図２２に示したように、両親媒性物質／ＤＮＡ複合体の尾部静脈投与後、ＢＡＬ Ｂ／Ｃマウスの血清中にＳＥＡＰタンパク質の実質的発現が検出された。コード 化ｃＤＮＡを有するｐＣＦ１プラスミドを対照として使用し、誤差バーを示す。 同様な結果が両親媒性物質Ｎｏ．５３を用いて得られた（特に適当な手順につい ては例３参照）。両親媒性物質／ＤＮＡ複合体は、両親媒性物質Ｎｏ．５３ ０ ．５ｍＭ、ＤＯＰＥ０．５ｍＭ、およびｐＣＦ１プラスミド２ｍＭ（ヌクレオチ ドとして）として与えられた。 本発明の特に適当な具体例についての上記説明は、当業者に本発明を例示する ために提出したのである。これら具体例は開示された精密な形式に本発明を除去 しようとするものではない。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 47/18 Ａ６１Ｐ 7/00 47/28 9/00 Ａ６１Ｐ 7/00 11/00 9/00 21/00 11/00 25/00 21/00 35/00 25/00 Ａ６１Ｋ 37/02 35/00 37/24 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，Ｆ Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ， ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，Ｍ Ｘ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 イーストマン，サイモン，ジェイ. アメリカ合衆国01752 マサチューセッツ 州マールボロ，ロイヤル クレスト ドラ イブ ナンバー10 13 (72)発明者 チェン，セン，エイチ. アメリカ合衆国02181 マサチューセッツ 州ウェルスリイ，ウォール ストリート 50 (72)発明者 マーシャル，ジョン アメリカ合衆国01757 マサチューセッツ 州ミルフォード，ウエスト ウォルナット ストリート 45 (72)発明者 ユー，ネルソン，エス. アメリカ合衆国01568 マサチューセッツ 州ウエスト アップトン，ロックデール ヒル サークル 25 (72)発明者 ハリス，デビッド，ジェイ. アメリカ合衆国02173 マサチューセッツ 州レキシントン，イースタン アベニュー (72)発明者 リー，エドワード，アール. アメリカ合衆国02169 マサチューセッツ 州クインシイ，リンカン ハイツ，センタ ー ストリート 175―ジェイ (72)発明者 シーゲル，クレイグ，エス. アメリカ合衆国01801 マサチューセッツ 州ウォバーン，ブラドフォード ロード 15 (72)発明者 チャン，チャウ―ドウン アメリカ合衆国02173 マサチューセッツ 州レキシントン，ミドルバイ ロード ７ (72)発明者 ハバード，シー．シャーリイ アメリカ合衆国02178 マサチューセッツ 州ベルマンス，ウィリイ ロード 26

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．血管系インビボトランスフェクション方法であって、第一に、（１）細胞か ら選択される治療性蛋白質のコード配列を含有するＤＮＡ分子および（２）下記 グループＩ、ＩＩ、ＩＩＩまたはＩＶから選択されるカチオン性両親媒性物質を 含有する治療組成物を用意し、次いで第二に、この組成物を患者の血管系または リンパ系に投与することからなる、血管系インビボトランスフェクション方法： 式中、 Ｚは、ステロイドであり； Ｘは、炭素原子または窒素原子であり； Ｙは、短い結合基であるか、またはＹは存在しておらず； Ｒ3は、Ｈであるか、あるいは飽和または不飽和の脂肪族基であり； Ｒ1は、−ＮＨ−、アルキルアミンまたはポリアルキルアミンであり： Ｒ4は、Ｈであるか、あるいは飽和または不飽和の脂肪族基であり； Ｒ2は、−ＮＨ−、アルキルアミンまたはポリアルキルアミンであり； そしてＲ1はＲ2と同一または相違する、ただしＲ1およびＲ2の両方が−ＮＨ− であることはできない； 式中、 Ｚは、ステロイドであり； Ｘは、炭素原子または窒素原子であり； Ｙは、結合基であるか、またはＹは存在しておらず； Ｒ3は、アミノ酸、誘導体化アミノ酸、Ｈまたはアルキルであり； Ｒ1は、−ＮＨ−、アルキルアミンまたはポリアルキルアミンであり； Ｒ4は、アミノ酸、誘導体化アミノ酸、Ｈまたはアルキルであり； Ｒ2は、−ＮＨ−、アルキルアミンまたはポリアルキルアミンであり； そしてＲ1はＲ2と同一または相違する、ただしＲ1およびＲ2の両方が−ＮＨ− であることはできない； 式中、 Ｚは、そのＮ原子によりＹに（あるいはＹが存在していない場合は、Ｘに直接 に）結合しているアルキルアミンまたはジアルキルアミンであり、Ｚがジアルキ ルアミンである場合、そのアルキル基は同一または相違することができ； Ｘは、炭素原子または窒素原子であり； Ｙは、短い結合基であるか、またはＹは存在しておらず； Ｒ3は、Ｈであるか、あるいは飽和または不飽和の脂肪族基であり； Ｒ1は、−ＮＨ−、アルキルアミンまたはポリアルキルアミンであり； Ｒ4は、Ｈであるか、あるいは飽和または不飽和の脂肪族基であり； Ｒ2は、−ＮＨ−、アルキルアミンまたはポリアルキルアミンであり； そしてＲ1はＲ2と同一または相違する、ただしＲ1およびＲ2の両方が−ＮＨ− であることはできない；および 式中、 ＡおよびＢは独立して、Ｏ、ＮまたはＳであり； Ｒ5およびＲ6は独立して、アルキルまたはアシル基であり、この基は飽和され ていてもよく、あるいは不飽和部位を含有していてもよく； Ｃは、−ＣＨ2−、＞Ｃ＝Ｏおよび＞Ｃ＝Ｓからなる群から選択され； Ｅは、炭素原子または窒素原子であり； Ｄは、−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）−または−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−などの結合基であり、ある いはＤは存在しておらず； Ｒ3は、Ｈであるか、あるいは飽和または不飽和の脂肪族基であり； Ｒ1は、−ＮＨ−、アルキルアミンまたはポリアルキルアミンであり； Ｒ4は、Ｈであるか、あるいは飽和または不飽和の脂肪族基であり； Ｒ2は、−ＮＨ−、アルキルアミンまたはポリアルキルアミンであり； そしてＲ1はＲ2と同一または相違する、ただしＲ1およびＲ2の両方が−ＮＨ− であることはできない。
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