JP2006508896A - 核酸の送達法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2002年5月6日に提出された米国仮出願第60/378,191号の利益を請求する。
本発明は、核酸(例えば、DNA、RNA、ハイブリッド、ヘテロ二本鎖および修飾核酸)の細胞への送達のための方法および組成物に関する。本発明の核酸送達複合体は、生物活性のある核酸を、核酸が所望の生物学的機能を遂行することが可能となる様式および形態で、細胞および生物体にインビトロおよびインビボで送達することを可能にする。
1つの局面において、本発明は、核酸、エンドモリティック(endosomolytic)スペルミン(コレステロールまたは脂肪酸を含む)、および標的指向性(targeting)スペルミン(細胞表面分子に対するリガンドを含む)を含む組成物を特徴とする。組成物の正電荷と負電荷との比は0.5から1.5までの範囲にある;エンドモリティックスペルミンは組成物中のスペルミン含有分子の少なくとも20%を占める;さらに標的指向性スペルミンは組成物中のスペルミン含有分子の少なくとも10%を占める。正電荷と負電荷との比は0.8から1.2までの範囲(例えば、0.8から0.9までの範囲)であることが望ましい。
「核酸組成物」とは、1つまたは複数のリン酸分子が糖質(例えば、五炭糖または六炭糖)と結合し、その糖質がプリン由来の塩基(例えば、アデニン)およびピリミジン由来の塩基(例えば、チミン)と結合している、任意の1つまたは複数の化合物のことを意味する。具体的な天然の核酸分子には、ゲノム性デオキシリボ核酸(DNA)およびゲノム性リボ核酸(RNA)のほか、後者のいくつかの別の形態、例えば、メッセンジャーRNA(mRNA)、トランスファーRNA(tRNA)およびリボソームRNA(rRNA)が含まれる。また、種々のRNA分子に対して相補的な種々のDNA分子(cDNA)も含まれる。合成DNAまたはそれと天然のDNAとのハイブリッド、さらにはDNA/RNAハイブリッドおよびPNA分子(Gambari, Curr Pharm Des 2001 Nov;7(17): 1839-62)を用いることもできる。
本発明の組成物および方法にはさまざまな利点がある。例えば、本組成物は一般に、細胞における毒性(仮にあるとしても)をわずかしか引き起こさない。特に、本組成物は細胞培養物の細胞増殖速度にわずかな影響しか及ぼさず、このことは本組成物がほとんど毒性を引き起こさないことを意味する。スペルミン含有分子を標的指向性分子およびエンドモリティック分子として用いると、より多くのアミン基を有する他のポリアミンを用いた場合よりも生じる毒性が少ない。スペルミンよりも多数のアミン基を有するポリアミンはDNAとより高い親和性で結合するため、組成物中の核酸と結合したまま保たれ、細胞または動物に導入された後に核酸の所望の生物学的機能を抑制する可能性が高い。すなわち、スペルミンは、細胞および動物への機能的核酸の導入が容易になるような、核酸に対する(より望ましい)弱い親和性を有する。
本発明は、RNA、DNA、PNAおよびそれらのハイブリッドの送達のための方法および組成物を含む、核酸送達のための組成物および方法に関する。本発明の1つの局面において、本発明の核酸送達複合体は、標的遺伝子の組織特異的サイレンシングまたは動物個体における標的遺伝子のサイレンシング(RNAi)を目的として、二本鎖RNA(dsRNA)の送達を達成するために設計される。
効率的なインビボでのトランスフェクションは、核酸を用いる治療法にとって未だに課題である。「裸の」DNAを投与してインビボでの細胞のトランスフェクションのために用いることもできるが、これはほとんど成功せず、その原因となる問題は、DNAが負に荷電していて結合タンパク質および他の分子がカチオン性側鎖を有することの結果である可能性が高いと考えられる。さまざまなインビトロでの研究により、DNAは電荷の中和後に細胞内に入ることが示されている。多価カチオンおよび多数の配位圏を有するカチオン、例えばポリアミンならびにコバルトヘキサアミンおよびペンタアミンは、単にホスホリル基と塩橋を形成する以外にさまざまな様式でDNA分子と相互作用する。このようなカチオン性化合物はDNAの電荷を中和するだけでなく塩基との水素結合も形成し、DNAの凝縮を促す。すなわち、DNAの凝縮は効率的かつ予測性のあるトランスフェクションのための必要条件の1つであると考えられる。
カチオン性両親媒性物質は、親油性ドメインおよび親水性ドメインの両方を含むイオン対分子である。分子の疎水性成分およびイオン性成分の相対量により、その望ましい溶解性が決定される。水性環境において、単一の脂質鎖およびカチオン性頭部基を有するカチオン性両親媒性物質は、脂質鎖が内側の疎水性コアの方を向いたミセル構造を形成する傾向がある。ミセルには内容積がなく、このため薬物分子を意味のあるレベルで閉じ込めることができない。さらに、インビボの循環路に入ると、ミセルは肝臓内のクッパー細胞などのマクロファージ様細胞によって選好的に取り込まれる。このような細胞の厳しい細胞内環境ではDNAの急速な分解が起こると予想される。このため、核酸のミセル送達は望ましくない。
カチオン性脂質と比べて、水溶性両親媒性物質に由来する単純な構造は、一様かつ均一なトランスフェクション構造を形成する可能性が高く、これは効率、予測性および効力を高めると期待される。本発明者らは、局所麻酔薬(例えばブピバカイン)などの膜作用性のあるカチオン性両親媒性物質を選択した(米国特許第6,383,512号、「Vesicular complexes and methods of making and using the same」を参照されたい。これはブピバカインなどの局所麻酔薬および核酸分子を含む層状小胞を含む組成物を記載している)。詳細には、この参考文献はアンチセンス核酸分子、リボザイム核酸分子または三重鎖形成性核酸分子である核酸分子、ならびにタンパク質をコードする核酸分子(例えば、非免疫原性で治療効果のあるタンパク質、および宿主における所望の免疫応答を誘発するように設計された免疫原性タンパク質)の送達のための組成物および方法を記載している。RNAiを誘発しうるdsRNA発現構築物の送達のためにこのような小胞複合体を用いうるか否かを判定するために実験を行った。局所麻酔薬はカチオン性脂質とは異なり、膜と能動的に相互作用するほか、血清タンパク質との相互作用の減少および膜透過性の増大といった特性を保有するように開発されている。さらに、これらは現在ヒトに用いられており、その毒性/用量プロフィールは詳細に解明されている。これに対して、インビトロで効率的にトランスフェクションを行う脂質に付随する毒性は、インビボでのその使用の妨げになる可能性がある。しかし、局所麻酔薬などの水溶性カチオン性両親媒性物質は、(i)インビボでの効率的なトランスフェクションを実現するのに必要な濃度では毒性をほとんどまたは全く示さない、(ii)インビボの細胞をトランスフェクトさせる度合いが裸のDNAを上回る、および(iii)効力を高める、サイズおよび電荷分布が一様な均一な複合体を形成するように配置させることできる。方法の変更および制御された速度での集合化により、さまざまなタイプの複合体を調製することができる。局所麻酔薬と複合体を形成したDNAはインビトロでは細胞を効率的にトランスフェクトさせないことが観察されているが(リポフェクタミンによるトランスフェクション効率の1%未満)、このような複合体がトランスフェクトされたインビボの細胞での発現レベルはトランスフェクション用物質を伴わないDNAの3倍となる。裸のDNAはインビボの細胞をトランスフェクトさせるが、これはインビトロのトランスフェクションには無効であることが示されている。
本明細書に記載の方法は、(1)ポリアミンを基盤とする水溶性両親媒性物質であるコレステリルポリアミンのDNAとの複合体を開発するため、(2)プラスミドDNAとの複合体を利用し、コレステリルポリアミンを(インビトロおよびインビボで)利用するトランスフェクション法を開発するため、(3)これらの複合体の内部にタンパク質を閉じ込めることによりタンパク質をDNAとともに送達するため、ならびに(4)経口送達および筋肉などの組織中への送達を目的として油中に分配されるDNA複合体を開発するため、に用いることができる。
遺伝子の細胞内送達のための改良された方法が望まれている。特に、RNAi、アンチセンス療法、遺伝子治療および遺伝子ワクチンの用途を含むさまざまな治療的用途を目的として、核酸(これにはプラスミドDNA分子が含まれる)をインビボの細胞へと運搬および送達するための媒体が必要とされている。核酸治療薬の現在の進歩は、DNAおよびRNAの細胞内への送達能力により制限を受けている。マイクロエマルションは細胞内送達を向上させると予想される。核酸治療薬の商業的な将来性は、このような効率的な送達システムの成功と直接つながっている。
インビトロの細胞をトランスフェクトさせる安定な油中水型マイクロエマルションを作製することもできる。油中水型MEを用いる経口送達および筋肉内送達をマウスに行うことができる。DNAが油相中にある安定な水中油型マイクロエマルションを作製し、マウスで試験を行うこともできる。
油中水型マイクロエマルションは、油、サーファクタントおよびコサーファクタント(固定された割合)の混合物に対して水相を徐々に加え、混濁が生じる点を決定することによって作製しうる。このようにして調製されたマイクロエマルションが油中水型の性質を有することは、水中での非分散性、水溶性色素(カルセイン)の溶解性、導電度の低さおよびゼータ電位などの特性を観察することによって確認される。ME領域を特定するために複数の成分による相図を作成し、経口的/非経口的送達のために望ましいいくつかの配合を選択する。
最近の発見により、本発明者らが新たなエマルションを作製することが可能になった。カチオン性両親媒性物質と複合体を形成したプラスミドDNAは非極性溶媒中に分配されることが示されている。DNA分子が疎水性溶媒中に抽出されうることにより、「水中油型」(o/w)エマルションの油相中へのDNAの区画化をもたらす技術を開発することが可能になる。このようなエマルションは、経口投与された場合に、DNAに対してさらなる保護(特に胃酸に対する)を与えると予想される。また、これらの粒子は酵素の到達性を低下させることによってDNAに安定性を付与するとも予想され、含まれるDNAをより長期間にわたってより緩徐に緩徐に放出することもできる。
遺伝子の細胞内送達のための新規アプローチが望まれる。特に、凝縮によって圧縮されてインビボの当該細胞へと送達されるプラスミドDNA分子を運ぶ媒体は、遺伝子治療、遺伝子サイレンシングおよび遺伝子ワクチンの用途のために必要である。
ポリアミンならびにコバルトヘキサアミンおよびペンタアミンは、単にDNAの電荷を中和するだけでなく、塩基との水素結合も形成させる。凝縮DNAはトランスフェクションのための必要条件の1つであり、細胞内でのDNA凝縮はポリアミン相互作用によって媒介される。DNAのカチオン性ポリペプチドとの複合体もDNAを効率的に凝縮させ、インビトロおよびインビボで細胞をトランスフェクトさせる。しかし、DNAのある種のポリペプチド複合体は動物において免疫原性があることが示されている。このため、ポリアミンはトランスフェクション目的でのDNAの凝縮に対してある種の利点をもたらす。例えば、それらは生物物理学的および生化学的な反応性のある付属物を含むように化学的に修飾可能であり、それらは細胞内の生理的な対イオンであり、それらは一般に非毒性であり、それらは細胞内の酸化酵素によって容易に代謝される。さらに、スペーサーアームを介した第二級アミンの修飾はDNAに対するポリアミンの静電結合親和性に大きな影響を及ぼさない。マンノシルスペルミンまたはコレステリルスペルミンなどの誘導体化されたスペルミンと複合体を形成した場合には、プラスミドDNAのゲルリターデーションが生じる。
DNAおよび他の核酸の標的指向性送達および能動的送達は、より高いトランスフェクション効率を生じさせる望ましいトランスフェクション方法であるように思われる。能動的トランスフェクションはトランスフェクションおよび細胞関与の両方の時点でDNAが確実に保存される可能性が高い。この目的で、細胞および動物への核酸の導入、ならびにエンドソーム小胞からの核酸の放出を容易にするためにポリアミン由来の低分子を基盤とする標的指向性試薬を開発した。
多機能性標的指向性システムは、細胞の細胞質中に容易に入り込むウイルスなどの粒子的の機能的要素を刺激するための試みの一つである。特定の機能を生み出す構造的要素および粒子の構築様式が知られていないため、本発明者らは、複数のポリアミン分子を用いてDNAの共同複合体(co-complex)が生成される条件をデザインした。多機能性共同複合体が得られる配合および条件がインビボでの反復スクリーニングにより同定された。本発明者らは、マンノース受容体およびアシアロ糖タンパク質受容体を標的とする単一リガンド性スペルミン複合体が、エンドソーム小胞内へのDNAの迅速な内部取込みを引き起こすことを示した。しかし、受容体結合および内部取込みだけでなくエンドソーム回避も可能にするために複数の機能性を含むように、これらの複合体をさらにデザインした。これらの多機能性共同複合体は、標的細胞種をトランスフェクトさせることに関して、インビボおよびインビトロともに効率的かつ特異的であった。
DNAを凝縮させるために、モノマンノシルスペルミンおよびビスマンノシルスペルミンを、コレステリルスペルミン分子とともに用いた。本発明者らの以前の研究によれば、内部に取り込まれたエンドソームからの回避を、それがリソソームへと成熟する前に可能とするには、コレステロール部分(または他の膜活性物質)を含めることが必要であると考えられる。コレステロールは膜の剛性を誘導する。コレステロールによる小胞膜の流動性の低下は裏返し(eversion)を誘導することが示されている。このため、コレステロールはエンドソーム成熟の妨げとなってDNAを細胞質中に放出させることが予想された。少量ながらも比例した量の細胞質性DNAが核内に移行し、それによって核内転写が促進される。スペルミンを基盤とするエンドソーム攪乱物質(例えば、コレステロール、低pH界面活性剤‐LPHD)を標的指向性スペルミン誘導体(APCに対してはビスマンノシル、肝細胞に対してはトリラクトシルアミン)およびプラスミドDNAと共同複合化させることによって調製された多機能性トランスフェクション用粒子を用いることができる。
トリラクトシルオリゴヌクレオチドおよびトリラクトシル化モノクローナル抗体は、肝細胞によって迅速に(数分で、単回通過により)取り込まれる。DNAを肝細胞内に送達するために、ラクトシル基を含むスペルミン誘導体が開発されている。予備的な実験で、標識ラクトシル化オリゴヌクレオチドのHepG2細胞への非飽和的な取込みが示されている。マンノシル-コレステリルスペルミン共同複合体に類似した共同複合体を調製し、インビボの肝細胞をトランスフェクトさせるために用いてもよい。いずれかの標的指向性システムの共同複合体から得られた情報は、能動的トランスフェクションおよび標的指向性トランスフェクションに利用しうる。
標的細胞への受容体を介した送達は、当技術分野で周知であり、これには例えば、米国特許第5,837,533号(その教示内容は参照として本明細書に組み入れられる)がある。これらのアプローチは、細胞内に存在する、天然の受容体を介したエンドサイトーシス経路を利用している。いくつかの細胞受容体が、薬物、特に本発明が関係するタイプの遺伝物質の担体として役立つ巨大分子および分子結合物の特異的ターゲティングのために望ましい作用因子として同定されている。これらの細胞受容体は、特定組織に局在することにより、特定組織に対する結合活性が高いことにより、または特定組織における活性が高いことにより、特異的ターゲティングを可能にする(例えば、BodmerおよびR.T. Dean、Meth. Enzymol., 112, 298-306 (1985))。このことは、低用量による、または望ましくない副作用が著しく少ないことによる利点をもたらす。
本発明の1つの局面において、その目標は、マクロファージなどの抗原提示細胞を標的として核酸送達を行わせる多機能性粒子を開発することにある。マクロファージ細胞膜はマンノース受容体を含む。このため、マンノースを標的指向性リガンドとして含むリガンド性スペルミンを設計した。合成が容易になるように、ビス-マンノース-スペルミンを最初に調製した。本発明者らはコレステロールをエンドソーム破壊性部分として選択した。上述の通り、生体膜は平衡状態にある。添加した脂質に定常状態の膜を破壊する能力がなくても、エンドソーム膜はエンドソームが成熟してリソソームになる際に変化を来す。膜を破壊する能力は、成熟過程にあるエンドソームのように膜が再配列する場合にみられる。コレステロールは通常、膜と会合している。コレステロールなどの平面分子は、それがなければ流動的である膜の環境に局所的な剛性を与える。しかし、膜内にコレステロールが過剰に存在することは、それが側方流動性の妨げとなるために破壊的である。このため、本発明者らはコレステリルスペルミンをエンドモリティックポリアミン物質として選択した。コレステロールは、6〜10個の炭素原子からなるスペーサーを介したスペルミンの第二級窒素との結合(カルバモイル結合またはアミド結合)により、スペルミン分子の3-3-OH位に付加された。質量分析およびNMRにより、この化合物の純度は98%を上回ることが示された。元素分析も行われた。
細胞種の同定には、規定の細胞表面マーカーに対する標識抗体を用いた。トランスフェクトされた細胞の大部分(>95%)はマクロファージであった。樹状細胞もいくつかトランスフェクトされた。しかし、マクロファージのうちトランスフェクトされたのは約80%に過ぎず、これはおそらく一部のものがマンノシル受容体を有していなかったため、またはこれらの細胞が複合体と接触不能であったためと考えられる。標識DNAを用いたところ、検討したすべての比で、マンノースをリガンドとするスペルミンを含む粒子が内部に取り込まれたことが示された。しかし、内部に取り込まれたプラスミドからの発現が観察されたのは、コレステリルスペルミンをDNAポリアミン粒子の構成に含めた場合、および十分な量が粒子中に存在する場合のみであった。この結果は、マンノーススペルミンはそれと複合体を形成したDNAの受容体特異的な細胞内取込みを引き起こすが、DNAがエンドソームから細胞内に放出されてそこで発現が起こるためには、DNA複合体が十分な量のコレステリルスペルミンを含む必要があることを示唆している。
DNA発現構築物を利用する必要のある用途では、プラスミドが望ましい態様であり、超らせん状DNAも同様である。DNAは開環状でも剪断状でもよい。望ましい正電荷と負電荷との比は0.5から1.5までの範囲にある。正電荷と負電荷との比は0.8から01.2までの範囲にあることが望ましい。標的指向性スペルミン(望ましくはマンノシルスペルミン、ラクトシルスペルミン、葉酸スペルミンまたはビオチン化スペルミン)とエンドモリティックスペルミン(例えば、LPHDスペルミンまたはコレステリルスペルミン)との最適な比は0.35 : 0.65(モル比)である。標的指向性スペルミンとエンドモリティックスペルミンとの比の許容範囲は0.10:0.90から0.50:0.50までである。混合物は、例えば30mMクエン酸塩を含む緩衝液(pH 6.9)中にて調製しうる(緩衝剤は例えば、クエン酸塩、コハク酸塩またはリン酸塩であってよく、5〜50mMおよびpH 6.0〜8.2の範囲でありうる)。EDTAを0.1mM(または最大5mM)含んでよく、NaClを1mM〜200mM含んでよい。最終的なDNA濃度は1mg/mLであることが望ましく、この範囲は10ug/mL〜10mg/mLでありうる。注射容量は100uLであることが望ましく、この範囲は10uL〜1.0mLでありうる。本発明による核酸組成物を含む多機能性分子複合体は、一般に約1ng〜約1000μgのDNAを含むことが好都合である。いくつかの望ましい態様において、複合体は10ngから800μgまでの範囲のDNAを含む。より望ましい態様において、複合体は0.1μgから500μgまでの範囲のDNAを含む。さらにより望ましい態様において、複合体は1μgから350μgまでの範囲のDNAを含む。さらにより望ましい態様において、複合体は25μgから250μgまでの範囲のDNAを含む。最も望ましい態様において、複合体は約100μgのDNAを含む。望ましい投与方法は腹腔内、静脈内、筋肉内、皮内、皮下および吸入である。他の配合変化物と併用する場合、またはエマルション中で用いる場合には、複合体を経口的に送達することもできる。
ビス-マンノシルスペルミンの調製
以下は、「ビス-マンノシルスペルミン」、すなわちN4,N8-ビス(5-N-(α-3'-プロピオンアミドチオマンノシド)ペンチル)-スペルミン四酢酸の合成法である。これは、マクロファージのトランスフェクション用の標的指向性物質としての初期試験のための材料の調製に用いた方法である。
スペルミン(23.8g)を水(250mL)に溶解した溶液を37%v/vのホルムアルデヒド溶液(18.7gまたは6.9gホルムアルデヒド)で処理し、室温で20時間攪拌した。そのごく少量をクロロホルム中に抽出し、溶媒を真空下で除去して蝋状物質を得た(質量は測定せず)。この少量分をNMRによる生成物の構造の確認に用いた。残りの水溶液は次の工程にそのまま用いた。
前工程によるN'-(4-(N'-ヘキサヒドロピリミジル)ブチル)-ヘキサヒドロピリミジン(26.7gと仮定)の水溶液を、テトラヒドロフラン(125mL)、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(62mL)およびジ-tertブチルジカーボネート(56.5g)により室温で22時間処理した。THFを除去し、水性混合物をクロロホルム中に抽出した。溶媒を真空下で除去して油状物質を得た。この油状物質をシリカゲルで精製し、クロロホルム中でのメタノールの勾配によって溶出させた。生成物を含む画分(TLC Rf 0.58、CHCl3/メタノール9:1)を一つにまとめ、溶媒を除去して30.1gのN1-(4-(N3-tert-ブチルオキシカルボニル-N1-ヘキサヒドロピリミジル)-N3-tert-ブチルオキシカルボニル-ヘキサヒドロピリミジンを蝋状物質として得た。
N1-(4-(N3-tert-ブチルオキシカルボニル-N1-ヘキサヒドロピリミジル)-N3-tert-ブチルオキシカルボニル-ヘキサヒドロピリミジン(30.1g)をエタノール(250mL)に溶解した溶液を、ピリジン(46mL)およびマロン酸(44.05g)で処理し、5時間環流した。溶媒を真空下で除去し、残留物を水(pH 5)で希釈してクロロホルムで洗浄した。水層をpH 12に調整してクロロホルム中に抽出した。溶媒を除去してN1,N12-ビス(tert-ブチルオキシカルボニル)スペルミン(23.1g)を粉末として得た。
5-アミノ-1-ペンタノール(20.07g)およびN,N-ジイソプロピルエチルアミン(75mL)をテトラヒドロフラン300mLに溶解した溶液をクロロギ酸ベンジル(31ml)により0℃で1.5時間処理し、室温で18時間おいた。溶媒を真空下で除去し、残留物をクロロホルム中に抽出した。クロロホルムを真空下で除去して蝋状物質を得た上で、それを酢酸エチルおよびヘキサンから結晶化させてN-CBZ-5-アミノ-1-ペンタノール(26.2g)を結晶質固体として得た。
トリフェニルホスフィン(11.05g)、臭化リチウム(10.98g)および臭素(2.2mL)を0℃の塩化メチレン中に溶解した溶液を、N-CBZ-5-アミノ-1-ペンタノール(10.0g)およびN,N-ジイソプロピルエチルアミン(17mL)を塩化メチレン中に溶解した溶液の滴下により処理した。室温で20時間攪拌した後に、混合物を水で洗浄し、塩化メチレン中に抽出した。溶媒を真空下で除去して蝋状物質を得た。この蝋状物質をシリカゲルで精製し、ヘキサン中での酢酸エチルの勾配によって溶出させた。生成物を含む画分(TLC Rf 0.94、EtOAc/Hex 1:1)を一つにまとめ、溶媒を除去して7.23gのN-CBZ-5-アミノ-1-ブロモペンタンを油状物質として得た。
N1,N12-ビス(tert-ブチルオキシカルボニル)スペルミン(2.0g)をアセトニトリル30ml中に溶解した溶液をN-CBZ-5-アミノ-1-ブロモペンタン(化合物2;1.49g)により処理し、3時間環流した。溶媒を除去して油状物質を得た上で、それをシリカゲルで精製し、N,Nジイソプロピルエチルアミン(0.2%)を含むクロロホルム中でのメタノールの勾配によって溶出させた。生成物を含む画分(TLC Rf 0.35、CHCl3メタノール9:1+0.4%DIEA)を一つにまとめ、溶媒を除去して生成物(1.41g)を油状物質として得た。
N4,N8-ビス(N-CBZ-5'-アミノペンチル)-N1,N12-ビス(tert-ブチルオキシカルボニル)スペルミン(2.04g)をメタノール50mLに溶解し、2.04gの20%Pd/Cおよび50PSIGのH2により室温で3.5時間処理した。Pd/Cを珪藻土による濾過によって除去し、濾液から溶媒を真空下で除去してN4,N8-ビス(5'-アミノペンチル)-N1,N12-ビス(tert-ブチルオキシ-カルボニル)スペルミン(0.79g)を油状物質として得た。
D-マンノース(20g)をピリジン(75mL)に溶解した溶液を無水酢酸(75mL)により室温で20時間処理した。ピリジンおよび無水酢酸の大部分を真空下で除去した。残留物をクロロホルムに溶解し、水で洗浄した。溶媒の除去により油状/蜜状物質を得た上で、これをシリカゲルで精製し、クロロホルム中での2-プロパノールの勾配によって溶出させた。生成物を含む画分(TLC Rf 0.7、CHCl3/2-プロパノール9:1)を一つにまとめ、溶媒を除去してマンノース五酢酸(31.7g)を硬い油状物質として得た。
マンノース五酢酸(19.0g)を0℃の塩化メチレン75mL中に溶解した溶液を、30%HBrを含む酢酸(75mL)により1.5時間処理した。この溶液を直接クロロホルム中に抽出し、炭酸水素ナトリウム飽和溶液で洗浄した。溶媒を真空下で除去して生成物(18.0g)を油状物質として得た。
アセトブロモマンノース(18.0g)およびチオ尿素(3.33g)をアセトン(200mL)中に溶解した溶液を3時間環流した。水(200mL)、3-ヨードプロパン酸(9.63g)、無水炭酸カリウム(20g)およびメタ亜硫酸カリウム(9.73g)を添加し、室温で4時間攪拌した。この溶液を水で700mLに希釈し、クロロホルムで洗浄した。水層を37%HClでpH 2に酸性化し、クロロホルム中に抽出した。溶媒の除去後に残った粗油状物質をシリカゲルで精製し、ヘキサン中での酢酸エチルの勾配によって溶出させた。生成物を含む画分(TLC Rf 0.36、EtOAc/hex 1:2)を一つにまとめ、溶媒を除去して生成物をガラス状物質として得た。
S-α-3'-プロピオニルテトラ-O-アセチルチオマンノシド(2.94g)をテトラヒドロフラン(100mL)中に溶解した溶液を、N-ヒドロキシスクシンイミド(0.78g)およびN,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド(1.39g)により処理した。この溶液を室温で20時間攪拌し、その後に4℃で0.5時間保存した。沈殿物を濾過して除去し、濾液から溶媒を真空下で除去してスクシンイミジルS-α-3'-プロピオニルテトラ-O-アセチルチオマンノシド(3.80g)を白色固体として得た。
N4,N8-ビス(5'-アミノペンチル)-N1,N12-ビス(tert-ブチルオキシカルボニル)スペルミン(0.79g)をテトラヒドロフラン(75mL)中に溶解した溶液を、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(0.64mL)およびスクシンイミジルS-α-3'-プロピオニルテトラ-Oアセチル-チオマンノシド(1.32g)により処理し、溶液を室温で24時間攪拌した。溶媒を真空下で除去してガラス状物質を得た。このガラス状物質をシリカゲルで精製し、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(0.2%)を含むクロロホルム中でのメタノールの勾配によって溶出させた。生成物を含む画分(TLC Rf 0.30、CHCl3/メタノール9:1+0.4%DIEA)を一つにまとめ、溶媒を除去してN4,N8-ビス(5-N-(α-3'-プロピオンアミドテトラ-O-アセチルチオマンノシド)ペンチル)-N1,N12-ビス(tert-ブチルオキシカルボニル)スペルミン(0.69g)をガラス状物質として得た。
N4,N8-ビス(5-N-(α-3'-プロピオンアミドテトラ-O-アセチルチオマンノシド)ペンチル)-N1,N12-ビス(tert-ブチルオキシカルボニル)スペルミン(0.69g)をトリフルオロ酢酸(20mL)に溶解し、室温で1時間攪拌した。溶媒を真空下で除去し、残留物をクロロホルムに溶解した上で、溶媒を除去し(2×20mL)、0.78gのN4,N8-ビス(5-N-(α-3'-プロピオンアミドテトラ-O-アセチルチオマンノシド)ペンチル)スペルミン四酢酸を油状物質として得た。
N4,N8-ビス(5-N-(α-3'-プロピオンアミドテトラ-O.-アセチルチオマンノシド)ペンチル)スペルミン四酢酸(0.78g)をメタノール25mLに溶解し、水25mLおよび炭酸ナトリウム(1.56g)を添加した。この溶液を室温で5時間攪拌した。溶媒を真空下で除去し、残留物を6mLの1%酢酸に溶解して、2mLずつの3つのアリコートを3つのSephadex (商標) G-25媒体カラム(各12mL)にかけて精製した上で1%酢酸により溶出させた。生成物を含む画分を一つにまとめ、凍結乾燥を行って0.31gのN4,N8-ビス(5-N-(α-3'-プロピオンアミドチオマンノシド)ペンチル)-スペルミン四酢酸を白色固体として得た。
D-マンノースを無水酢酸(ピリジン中)を用いてアセチル化してマンノース五酢酸を生成させた。このアノマー性酢酸塩をHBr/酢酸(塩化メチレン中、0℃)によって臭化物に変換させ、テトラアセトブロモマンノースを得た。この臭化物をチオ尿素を加えたアセトン中で環流した後に、水、3-ヨードプロピオン酸、炭酸カリウムおよびメタ亜硫酸カリウムと反応させ、酸性化によりS-(-3'-プロピオニルテトラ-O-アセチルチオマンノシドを得た。この生成物は、N-ヒドロキシスクシンイミドおよびN,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド(テトラヒドロフラン中)を用いてスクシンイミドエステルに容易に変換された。DIEAを含むテトラヒドロフラン中での5-アミノ-1-ペンタノールとの反応により、このアルコールのテトラアセトマンノシルアミド誘導体が得られた。このアルコールを上記の通りに対応する臭化物に変換させた(トリフェニルホスフィン、臭素、臭化リチウム)。ビス-BOCスペルミン(上記の手順を参照のこと)との反応により、モノ誘導体化およびビス誘導体化を受けた(保護された)マンノシルスペルミンが得られた。これらのスペルミンを、0.2%DIEA(N,N-ジイソプロピルエチルアミン)を含むクロロホルム中でのメタノールの勾配を用いるシリカフラッシュクロマトグラフィーにより分離した。BOC基を4N HCl(ジオキサン中)を用いて除去した。アセチル保護基を炭酸ナトリウム(メタノールおよび水に溶解、pH 12)を用いて除去した。この生成物は合計9%の収率で得られ、その特徴をプロトンNMR(300MHz FT-NMR)、FAB質量分析、元素分析および薄層クロマトグラフィーにより分析した。最後から2番目の(penultimate)生成物に関してはアセトニトリル勾配(0.1%TFA/水中)を用いるC-18 HPLCによって特徴を分析した。
N4-(5-(トリラクトシルリシルリシル)アミドペンチルスペルミン三酢酸または「トリラクトシルスペルミン」を、ビス-マンノシルスペルミンと同様に調製した。後者の化合物の場合と同じく、トリラクトシルスペルミンの調製に用いた方法を、同様の化合物の収率を改善した、および/またはその調製における工程の数を減らした、想定される変形物とともに、詳細に記載している。
スペルミン(20.29g)を水(50mL)に溶解した溶液を40%v/vのホルムアルデヒド溶液(10.28g)で処理して24時間攪拌した。この混合物をクロロホルム中に抽出し、溶媒を除去して生成物(15.55g)を蝋状物質として得た。
N1-N4-メチレンスペルミン(15.55g)およびN,N-ジイソプロピルエチルアミン(52mL)をテトラヒドロフラン(300mL)中に溶解した溶液をジ-tert-ブチルジカーボネート(48.10g)で処理し、室温で3.5日間攪拌した。溶媒を真空下で除去し、残留物を酢酸エチルに溶解した。この溶液を5%NaOH溶液で、さらに続いて水で洗浄した。溶媒を真空下で除去して油状物質を得た。この油状物質をシリカゲルで精製し、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(0.2%)を含むヘキサン中での酢酸エチルの勾配によって溶出させた。生成物を含む画分(TLC Rf 0.17、EtOAc/ヘキサン2:3+0.2%DIEA)を一つにまとめ、溶媒を除去して生成物(22.06g)を油状物質として得た。
N1-N8-ビス(tert-ブチルオキシカルボニル)-N1-N4-メチレンスペルミン(18.28g)をエタノール(300mL)中に溶解した溶液を、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(12.82mL)およびマロン酸(19.69g)で処理した。この混合物を24時間環流した上で溶媒を真空下で除去した。残留物を水(pH 4)で希釈し、塩化メチレンで洗浄した。炭酸水素ナトリウムで水層のpHを9に調整し、塩化メチレン中に抽出した。溶媒の除去によって蝋状物質を得た上で、それをシリカゲルで精製し、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(0.2%)を含むクロロホルム中での2-プロパノールの勾配によって溶出させた。生成物を含む画分(TLC Rf 0.21、2-プロパノール/クロロホルム3:7+0.25%DIEA)を一つにまとめ、溶媒を除去して生成物(5.60g)を蝋状物質として得た。
N1-N8-ビス(tert-ブチルオキシカルボニル)-スペルミン(5.60g)、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(10.2mL)、ヨウ化カリウム(8.07g)および5-クロロバレロニトリル(5.472mL)をアセトニトリル(300mL)中に溶解した溶液を20時間環流した。溶媒を除去し、残留物をクロロホルムに溶解して水で洗浄した。溶媒を真空下で除去して油状物質を得た。この油状物質をシリカゲルで精製し、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(0.4%)を含むヘキサン中での酢酸エチルの勾配によって溶出させた。生成物を含む画分(TLC Rf 0.20、酢酸エチル/ヘキサン4:1+0.4%DIEA)を一つにまとめ、溶媒を除去して生成物(4.42g)を油状物質として得た。
N4-(4-シアノブチル)-N1-N8-ビス(tert-ブチルオキシカルボニル)-スペルミン(0.77g)を酢酸中に溶解し、0.1gの5%Pd/Cおよび50PSIGのH2により室温で2.75時間処理した。Pd/Cを珪藻土による濾過によって除去し、濾液から溶媒を真空下で除去して油状物質を得た。この油状物質をシリカゲルで精製し、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(0.4%)を含むクロロホルム中でのメタノールの勾配によって溶出させた。生成物を含む画分(TLC Rf 当初の値、メタノール/クロロホルム3:7+0.4%DIEA)を一つにまとめ、溶媒を除去して生成物(0.32g)油状物質として得た。
BOC-Lys(BOC)ONp(10.0g)、N-e-t-BOC-L-リシン(5.27g)およびN,N-ジイソプロピルエチルアミン(13mL)をジメチルホルムアミド(400mL)および水(100mL)に溶解した溶液を室温で48時間攪拌した。溶媒を真空下で除去し、残留物をクロロホルム中に溶解した。この溶液を希HCl溶媒で洗浄して乾燥させ、溶媒を除去して油状物質を得た。この油状物質をシリカゲルで精製し、酢酸(0.5%)を含むクロロホルム中での2-プロパノールの勾配によって溶出させた。生成物を含む画分(TLC Rf 0.23、2-プロパノール/クロロホルム1:19+0.5%HOAc)を一つにまとめ、溶媒を除去してビス(N-α,ε-t-BOC)リシル-N-ε-t-BOCリシン(13.1g)を油状物質として得た。
ビス(N-α,ε-t-BOC)リシル-N-ε-t-BOCリシン(12.2g)をトリフルオロ酢酸(20mL)により処理し、室温で1時間攪拌した。溶媒を真空下で除去して、残留物をクロロホルム中に溶解し、溶媒を除去して(3×20mL)L-リシル-L-リシン酢酸塩(12.09g)を油状物質として得た。この油状物質を0.1N HCl中に溶解し、凍結乾燥を行ってL-リシル-L-リシン塩酸塩(2.88g)を固体として得た。
この中間生成物は、マンノース五酢酸(ビスマンノシルスペルミンの説明における化合物8)と同様に調製した。この生成物は硬い油状物質であった。
この中間生成物はアセトブロモマンノース(ビスマンノシルスペルミンの説明における化合物9)と同様に調製した。粗ガラス状物質を酢酸エチル/ヘキサンから再結晶させ、生成物を固体として得た。この化合物は室温では不安定なため、冷凍保存しなければならない。
この中間生成物はS-α-3'-プロピオニルテトラ-O-アセチルチオマンノシド(ビスマンノシルスペルミンの説明における化合物10)と同様に調製した。この生成物はTLC Rf 0.12 EtOAc/ヘキサン1:1+0.7%HOAcにて白色固体として認められた。TLC、NMR、元素分析およびFAB質量分析に加えて、逆相HPLCを用いた特徴分析もこの材料に対して行った。YMC-Pack ODS-A、A303-10カラム(250×内径4.6mm)を、100%Aから100%Bへの直線的勾配によって(A=0.1%TFA水溶液、B=0.1%TFA、80%CH3CN)、2mL/分で20分間かけて溶出させた。検出はPDA検出器を200〜300nmで用いることによって行った。この生成物は14.5分の時点で認められた。
この中間生成物はスクシンイミジルS-α-3'-プロピオニルテトラ-O-アセチルチオマンノシド(ビス-マンノシルスペルミンの説明における化合物11)と同様に調製した。この生成物を2-プロパノールから白色固体として再結晶させた。化合物10の説明における逆相HPLCの条件を参照されたい。この生成物は15.4分の時点で認められた。
L-リシル-L-リシン塩酸塩(化合物7;0.48g)およびN,N-ジイソプロピルエチルアミン(0.654mL)をアセトニトリル/水(150mL)の1:1混合物中に溶解してpH 9とした。この溶液をS-(スクシンイミジル3'-プロピオニル)チオヘプタ-O-アセチルラクトース(化合物11;3.60g)によって処理し、pHを低下させた。pHをモニタリングし、pH 8〜9に維持するために必要に応じてさらにN,N-ジイソプロピルエチルアミンを添加した。室温で24時間おいた後に、アセトニトリルを真空下で除去し、水溶液を希HClでpH 5に調整した。この混合物をクロロホルム中に抽出し、乾燥させた上で溶媒を除去してガラス状物質を得た。ガラス状物質をシリカゲルで精製し、酢酸(1%)を含むクロロホルム中での2-プロパノールの勾配によって溶出させた。生成物を含む画分(TLC Rf 0.25、2-プロパノール/クロロホルム1:9+1%HOAc)を一つにまとめ、溶媒を除去して生成物(0.76g)をガラス状物質として得た。逆相HPLCにはメソッド開発カラム:YMC PACK ODS-A、A313-10(6.0×内径250mm)を用い、90%Aから100%Bへの直線的勾配により(A=0.1%TFA水溶液、B=0.1%TFA、80%CH3CN)、2mL/分で20分間かけて溶出させた。検出はPDA検出器を200〜300nmで用いることによって行った。この生成物は20.4分の時点で認められた。
トリ-(アセチルラクトシル)リシルリシン(1.0g)を2-プロパノール/クロロホルムの1:1混合物(20mL)中に溶解し、N-ヒドロキシスクシンイミド(48.1mg)およびジシクロヘキシルカルボジイミド(86.2mg)により処理した。この溶液を室温で19時間攪拌した後、4℃で3時間保存した。沈殿物を濾過して除去し、濾液から溶媒を真空下で除去した。残留物を2-プロパノールから再結晶させて生成物(0.76g)を白色固体として得た。化合物10の説明における逆相HPLCの条件を参照されたい。この生成物は17.2分の時点で認められた。
N4-(5-アミノペンチル)-N1-N8-ビス(tert-ブチルオキシカルボニル)スペルミン(化合物5;87mg)を塩化メチレン(20mL)に溶解した溶液に対して、スクシンイミジル-トリ-(アセチルラクトシル)リシルリシン(化合物13;0.5g)を塩化メチレンに溶解した溶液を添加した。この溶液を室温で18時間攪拌し、溶媒を真空下で除去して固体を得た。この固体をシリカゲルで精製し、クロロホルム中での2-プロパノールの勾配によって溶出させた。生成物を含む画分(TLC Rf 0.16、2-プロパノール/クロロホルム1:4+0.5%HOAc)を一つにまとめ、溶媒を除去して生成物(0.38g)を白色固体として得た。化合物10の説明における逆相HPLCの条件を参照されたい。この生成物は18.1分の時点で認められた。
N4-(5-(アセチル化トリ-ラクトシルリシルリシル)アミドペンチル-N1,N8-ビス(tert-ブチルオキシカルボニル)スペルミン(化合物14;0.17g)をトリフルオロ酢酸(5mL)中に溶解し、室温で2.5時間攪拌した。溶媒を真空下で除去し、残留物をクロロホルム中に溶解した上で溶媒を除去して(4×20mL)0.19gの生成物を粘着性固体として得た。化合物10の説明における逆相HPLCの条件を参照されたい。この生成物は15.8分の時点で認められた。
N4-(5-(アセチル化トリ-ラクトシルリシルリシル)アミドペンチルスペルミントリフルオロ酢酸塩(化合物15;0.17g)をメタノール中に溶解し、この溶液に対して水(40mL)および炭酸ナトリウム(0.37g)を添加した。室温で4時間攪拌した後に溶媒を真空下で除去し、残留物を取り出して3mLの1%酢酸中に入れた。この溶液をSephadex(商標) G-25媒体カラム(16mL)にかけて精製し、1%酢酸により溶出させた。生成物を含む画分を一つにまとめ、凍結乾燥を行って、62.7mgのN4-(5-(トリラクトシルリシルリシル)アミドペンチルスペルミン三酢酸を粘着性固体(極めて含水性が高い)として得た。
DNAと複合体を形成したカチオン性両親媒性物質の膜貫通性通過の機序は詳細には解明されていないが、受動的な細胞膜破壊と細胞による能動的エンドサイトーシスとの何らかの組み合わせが関与すると考えられている。後者の機序はエンドソームを最終的にリソソームへと推移させ、これに伴ってpHは約7.2から5.0に低下する。分解作用のあるリソソーム酵素はpHの低下によって活性化され、pH 5.0付近で最も活性が高くなる。いくつかのエンドソーム破壊性物質が、低pHおよびリソソーム酵素の両者に起因するDNAの損傷を最小限に抑えるために、エンドソーム膜を介したDNAの拡散を促進させる目的で用いられている。本発明者らは、界面活性剤に似た活性を低pHでは獲得するが高pHでは獲得しない一群の分子を開発した。これらの「低pH界面活性剤」(LPHD)はpH 5〜6では親油性をもたらす。DNAの負に荷電したホスホジエステル骨格とイオン性に結合してそれを中和することにより、複合体は全体としてもさらに親油性となる。もう1つの特質は、非共有的なイオン結合によってLPHDの多数のコピーを単一のDNA分子に結合することが可能となり、エンドソーム膜の脂質二重層への挿入のために必要な内部特性が得られることである。
以下は、「低pH界面活性剤」(LPHD)の1つ、すなわちN4,N9-ビス(12'-ドデカン酸)-スペルミンテトラ塩酸塩の合成法である。
これはビス-マンノシルスペルミン合成の中間生成物(1)と同じ化合物である。
これはビス-マンノシルスペルミン合成の中間生成物(2)と同じ化合物である。
これはビス-マンノシルスペルミン合成の中間生成物(3)と同じ化合物である。
12-ブロモドデカン酸(5g)、トルエンスルホン酸(0.5g)および3.73mLのベンジルアルコールをトルエン(100mL)中に溶解した溶液をほぼ乾燥するまで蒸留し、新たなトルエン(100mL)を加えた上で蒸留を再び行った。残ったトルエンを真空下で除去し、粗材料を酢酸エチル中に溶解して炭酸水素ナトリウム飽和溶液で洗浄した。有機層を乾燥させ、溶媒を除去して、純度の低い油状物質(8.61g)を生成物および未反応ベンジルアルコールの混合物として得た。この混合物はこれ以上精製しなかった。
N1,N12-ビス(tert-ブチルオキシカルボニル)スペルミン(2.0g)をアセトニトリル(100mL)中に溶解した溶液を、酢酸(0.268mL)および12-ブロモドデカン酸ベンジル(6.66g)により処理した。この溶液を3時間環流し、続いて室温で18時間攪拌した。溶媒をロータリー蒸発装置で除去し、残留物を取り出してクロロホルム中に入れ、炭酸水素ナトリウム溶液で洗浄した。有機層を乾燥させ、溶媒を真空下で除去して10.11gの粗材料を得た。この粗材料をシリカゲルで精製し、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(0.2%)を含むクロロホルム中でのメタノールの勾配によって溶出させた。生成物を含む画分(TLC Rf 0.23、CHCl3/メタノール9:1+0.2%DIEA)を一つにまとめ、溶媒を除去して生成物(0.62g)を油状物質として得た。
N4-(ベンジル12'-ドデカノイル)-N1,N12-ビス(tert-ブチルオキシカルボニル)スペルミン(0.29g)をメタノール30mL中に溶解し、0.03gの10%Pd/Cおよび50PSIGのH2により室温で1.5時間処理した。Pd/Cを珪藻土による濾過によって除去した。濾液から溶媒を真空下で除去してN4-(12'-ドデカン酸)スペルミンテトラ塩酸塩を油状物質(0.19g)として得た。
N4-(12'-ドデカン酸)-N1,N12-ビス(tert-ブチルオキシカルボニル)スペルミン(0.19g)をトリフルオロ酢酸(10mL)中に溶解し、室温で1時間攪拌した。溶媒を真空下で除去し、残留物をクロロホルム中に溶解した上で溶媒を除去して(3×25mL)油状物質を得た。この油状物質を0.1N HCl中に溶解し、凍結乾燥を行って0.18gのN4-(12'-ドデカン酸)スペルミンテトラ塩酸塩を得た。
スペルミンおよびホルムアルデヒドのヘキサヒドロピリミジン環付加物を生成させ、ジ-tert-ブチルジカーボネート、(BOC)2O水溶液およびTHFを用いてこの第二級アミンをジ-tert-ブトキシカルボニル(BOC)誘導体に変換させた。以前の報告の通りに、メチレン架橋を除去して(マロン酸、ピリジン、エタノール中)ビス-BOCスペルミン中間生成物を得た。クロロギ酸コレステリルを、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(DIEA)を含む塩化メチレン中で5-アミノ-1-ペンタノールと反応させて、所望のカルバメート結合を形成させた。冷却した塩化メチレン中でトリフェニルホスフィン、臭素、臭化リチウムおよびDIEAを用いて、このアルコールを対応する臭化物に変換させた。塩化メチレン中での炭酸カリウムの存在下におけるビス-BOCスペルミンによるコレステリル臭化物への求核付加反応により、一置換型および二置換型のコレステリルスペルミンが生成された。DIEAを含むクロロホルム中でのメタノール勾配を用いるシリカフラッシュクロマトグラフィーにより、これらは容易に分離された。ジオキサン中での4N HClによるBOC基の脱保護により、最終的にモノ-コレステリルスペルミン生成物が塩酸塩として得られた。この生成物は合計16%の収率で得られ、その特徴をプロトンNMR(300MHz FT-NMR)、FAB質量分析、元素分析および薄層クロマトグラフィーにより分析した。
マンノシルスペルミンおよびコレステリルスペルミンが動物体内への核酸の送達を促進する能力を示すために、以下の実験を、本質的には以下に述べる通りに行った。
DNA(GFP発現プラスミド、EGFP、Clontech, CA)を、上記の通りに合成したマンノシルスペルミンおよびコレステリルスペルミンの混合物と混合する。代表的には、2mg/mLのDNA 1mLを2mg/mLのスペルミン混合物1mLと混合する。スペルミン混合物は、2種類のスペルミン分子:標的指向性スペルミン分子(マンノシル、ラクトシル、葉酸またはビオチン化スペルミン)をコレステリルスペルミンを混合することによって調製する。分子の比は、例えば、コレステリルを65%とし、マンノシル、ラクトシル、葉酸またはビオチン化スペルミンを35%に保つ。DNAおよびスペルミン混合物を併せて混合すると、この両方の修飾スペルミン分子とDNAとの共同複合体が形成される。指定濃度で得られる電荷の比は約0.8(正/負)である。複合体は両方のスペルミン分子を含むが、それらは粒子電荷の分布および結合したスペルミン誘導体の比のいずれの点でも異質である。複合体の組成は、2種類のスペルミンの濃度、濃度、電荷比および相対量を反映する。これらの溶液を混合し、150mM塩化ナトリウムを含む最終的なクエン酸緩衝液(30mM、pH 6.8)に混入する。スペルミン-DNA溶液混合物における正電荷と負電荷との比が0.5〜1.2の範囲でさまざまな、DNAの他の複合体も調製する。2種類のスペルミンの他の比についてもDNAとの混合物として調製し、35%がマンノシル、ラクトシル、ビオチン化、または葉酸指向性スペルミンで65%がコレステリルスペルミンであるDNA混合物と比較する。
種々の配合物のそれぞれに関して、混合物を5匹のマウスの腹腔内に注射する(100uL)。インビボでのプラスミド発現がピークとなる注射5日後に腹腔液を採取する。腹腔液100μlをスライドに載せ、3000rpmでの遠心処理によりサイトスポット化する。GFP蛍光を検出するためにスライドをUV蛍光顕微鏡によって観察する。蛍光量およびトランスフェクトされた細胞の数を定量的に決定するために腹腔液の一部をFLOW分析(Beckman-Coulter)に供する。腹腔液由来の細胞の別の一部をFITCまたはローダミン結合MAC1抗体(R&D Systems)で染色し、さらに別の腹腔液の一部をFITCまたはローダミン標識マンノシル化BSA(ウシ血清アルブミン)で染色する(Sigma Cemical Co. St. Louis, MI)。対照マウスには、複合体形成剤を添加していないDNA、およびマンノシルスペルミンまたはコレステリルスペルミンのいずれかのみと複合体を形成させたDNAを投与する。
マンノシルスペルミンおよびコレステリルスペルミンに関して実施例1に記載したものと同様の実験を、他の任意のスペルミン含有化合物が動物体内への核酸の送達を促進する能力を検証するために用いることができる。範例となる方法を以下に述べる。
DNA(βガラクトシダーゼ発現プラスミド-Clontech, CA)を、ラクトシルスペルミン(モノラクトシル化またはトリラクトシル化)およびコレステリルスペルミンの混合物と混合する。代表的には、2mg/mLのDNA 1mLを2mg/mLのスペルミン混合物1mLと混合する(正電荷と負電荷とのおおよその比は0.8)。スペルミン混合物は、2種類のスペルミン分子、標的指向性スペルミン分子(ラクトシルスペルミン)をコレステリルスペルミンと混合することによって調製する。分子の比はコレステリル65%、およびラクトシルスペルミン35%に保つ。DNAおよびスペルミン混合物を併せて混合すると、この両方の修飾スペルミン分子とDNAとの共同複合体が形成される。指定濃度で得られる電荷比は約0.8(正/負)である。複合体は両方のスペルミン分子を含むが、それらは粒子電荷の分布および結合したスペルミン誘導体の比のいずれの点でも異質である。複合体の組成は、2種類のスペルミンの濃度、電荷比および相対量を反映する。これらの溶液を混合し、150mM塩化ナトリウムを含む最終的なクエン酸緩衝液(5mM、pH 6.8)に混入する。スペルミン-DNA溶液混合物における正電荷と負電荷との比が0.5〜1.2の範囲でさまざまな、DNAの他の複合体も調製する。2種類のスペルミンの他の比についてもDNAとの混合物として調製し、35%がラクトシル、65%がコレステリルスペルミンであるDNA混合物と比較する。
種々の配合物のそれぞれに関して、混合物を5匹のマウスに静脈内注射する(100uL)。種々の配合物には異なる電荷比のものが含まれ、ラクトシルスペルミンとコレステリルスペルミンの比もさまざまである。インビボでのプラスミド発現がピークとなる注射5日後に、マウスを屠殺して肝臓を摘出し、組織学的分析のために急速凍結する。主要な血管および胆管の近傍部および遠隔部の両方の肝臓組織からのいくつかの切片をパラフィン中に包埋し、ミクロトームを用いて切片化する。組織切片をX-gal(βガラクトシダーゼの酵素基質)を用いて染色する。肝臓組織切片を、肝細胞(アシアロ糖タンパク質受容体)を識別するための交差染色剤としての標識ラクトシル化BSAを用いて染色する。標識蛍光を検出するためにスライドをUV蛍光顕微鏡下で観察し、β-gal染色は光学顕微鏡下で観察する。対照マウスに対しては、複合体形成剤を添加していない「裸の」DNA、およびラクトシルスペルミンまたはコレステリルスペルミンのいずれかのみと複合体を形成させたDNAを投与する。
実施例1の結果に基づくと、スペルミンおよびDNAを電荷比0.8で含み、ラクトシル化スペルミンおよびコレステリルスペルミンを35%対65%という比で含む配合物を注入したマウスは、10%ラクトシルおよび90%コレステリルの配合物を用いて発現されるレベルを上回るレベルでβ-ガラクトシダーゼを発現すると予想される。肝組織中の肝細胞におけるβ-ガラクトシダーゼの発現は、蛍光標識ラクトシル化BSAによる染色後に組織切片の蛍光顕微鏡検査を行うことによって分析しうる。肝細胞におけるβ-ガラクトシダーゼの発現は、アシアロ糖タンパク質受容体を用いたDNA内部取込みによって導かれるインビボでの肝細胞の標的指向性トランスフェクションが成功したこと、およびコレステリルスペルミンをエンドソーム/リソソーム遮断物質として用いることが成功したことを示す指標である。この結論をさらに裏づけるために、細胞を共焦点顕微鏡検査によって分析することが可能である。
トリラクトシルスペルミンならびにモノ-およびビス-マンノシルスペルミンが核酸の送達を促進する能力を示すために、以下の実験を、本質的には以下に述べる通りに行った。
β-ガラクトシダーゼ発現プラスミドを含む細菌を、グルコースを唯一の炭素源として含む最小M9培地(Miller, CSHS laboratory Press)中で一晩増殖させる。細胞を遠心処理によって最小培地中にて3回洗浄し、炭素源を含まないM9培地中に再懸濁した上で、均一に14C標識されたリボース(NEN, MA)およびデオキシヌクレオシド(NEN, MA)を含むM9中に再懸濁して3時間おく。細胞を回収し、Qiagenミニプレップカラム(Qiagen, Inc., CA)を用いてプラスミドを単離する。標識プラスミドを非標識プラスミドと混合して、比活性が300万CPM/100ugプラスミドとなるようにする。
以前の2つの実施例で述べた通りに、DNAとスペルミンとの複合体を、最適な電荷比である0.8で、モノラクトシル、トリラクトシルまたはマンノシル(モノおよびビス)スペルミンのいずれかを用いて、5mMクエン酸緩衝液および150mM NaCl中での最終的なDNA濃度が1.0mg/mLとなるように形成させる。
1群当たり5匹のマウスに対して尾静脈から静脈内注射を行う(100uL)。指定された種々の時点でマウスを屠殺し、血中クリアランスの決定のためのプラスミドDNAの血清分析を行う。血中のプラスミド量を決定するためには、各試料に付随するCPMを定量するために血清1mLをフッ素とともに液体シンチレーションカウンターに入れる。組織分布の決定のためには、種々の臓器を第5日(以前の試験による発現のピーク)に採取して急速凍結する。動物から全臓器を採取し、5匹の群のうち3匹からの肝臓を弱アルカリ(100mM KOH)中で粉砕し、酸(HCl)で中和した後にシンチレーション計数を行う。残りの2匹からの肝臓は、実施例2に記載した通りにパラフィンに包埋して切片化し、記載の通りにβガラクトシダーゼ活性に関して染色する。
静脈内投与後のDNAの分布および血中クリアランスを評価する試験では、標識DNAを別個に修飾スペルミンと複合体化させる(この試験にはいずれか1つのスペルミンとの単一複合体(monocomplex)のみを用いる)。これらの複合体にはマンノース(モノおよびビス)およびラクトース(モノおよびトリ)スペルミンを別個に用いる。非修飾スペルミンおよびDNAとのスペルミジン複合体を対照として用いる。予想に一致して、最も速いクリアランスはトリラクトシルスペルミンを用いた場合である(曲線の外挿により、数分での取込みが示唆される)。同様にモノラクトシル誘導体も血中から急速に消失するが、トリラクトシルスペルミン複合体よりも約10倍緩徐である。対照複合体は細胞標的指向性を一切有していないと予想され、このため、これらは血中にはるかに長い期間にわたって存在する。その結果から、細胞表面タンパク質への標的指向性が存在しなければプラスミドDNAの血中レベルは数時間にわたって変化しないことが示されている。トリラクトシル化分子は、タンパク質と結合(共有結合および非共有結合)させて静脈内に投与すると肝細胞を標的とすることが以前に示されている。組織学的分析では細胞標的指向性(肝細胞とクッパー細胞との対比)をさらに詳細に取り扱う。ビスマンノシルスペルミン複合体も血中からDNAを急速に消失させるが、トリラクトシルスペルミン複合体よりも約50〜100倍緩徐である。別の試験では、ビスマンノシルスペルミン複合体が静脈内投与後にマクロファージおよび樹状細胞系譜の細胞(クッパー細胞、ランゲルハンス細胞ならびに脾および肺のマクロファージ―実施例1)のみによって取り込まれることが示されている。
この試験の第2のパートでは、主要臓器のいくつかにおけるDNAの分布を静脈内投与から5日間にわたり評価する。単純な組織破砕およびシンチレーション計数を行う。分析対象に選択した組織(肺、心臓、腎臓、脾臓および肝臓)には広範に毛細血管床がみられる。最終的に取り込まれた95%を上回るDNA(定量的PCRを用いた以前の試験による)は静脈内投与後にこれらの臓器(心臓を除く)に認められる。投与したDNAの大半(>90%)は通常、48時間以内に分解されて排泄される。しかし、ラクトシル化スペルミンおよびマンノシル化スペルミンの複合体を用いた場合のDNAの保持率はそれぞれ30%および85%であった。臓器のすべてを総合したCPMの合計量には大きな差がみられる。
マイクロエマルションが動物体内への核酸の送達を促進する能力を示すために、以下の実験を、本質的には以下に述べる通りに行った。
背景および理論的根拠
本発明はまた、麻酔薬(例えばブピバカイン)およびdsRNAを含む組成物、ならびに麻酔薬とdsRNAとの複合体を細胞内または動物体内に送達するための方法も特徴とする。このため、ブピバカインがdsRNAの送達を促進する能力を示すための以下の実験を行った。実験は転写後遺伝子サイレンシング(PTGS)またはRNAi自体を誘発するように設計するのではなく、免疫応答の非存在下でのマウスにおけるDNAベクターの発現動態を追跡するように設計した。その結果から、dsRNAを介したPTGSを示唆する、非免疫的に媒介される遺伝子特異的なサイレンシング機構の存在が示されている。プラスミドDNAを基盤とする発現ベクターの使用はdsRNAを作製するには効率的でないやり方であるが、それでもこれは植物および細胞培養下でのPTGS誘導のために必要な十分なレベルのdsRNAを生じさせることが示されている。この結果と、プラスミドDNAを注入した動物でdsRNA種の存在が観察されていることは、dsRNAを介した遺伝子サイレンシングと合致する。dsRNAが生成される能力は種々のプラスミドによって異なり、これは一部には潜在性プロモーター因子の存在によって決まる。これらの試験のために用いた発現ベクターではサイレンシングは数カ月間起こらないが、他のベクターはサイレンシングをこれよりも早く誘発する可能性があり、また別のものは全く誘発しない可能性もある。これに対して、dsRNAを急速に生成するように特に設計されたベクターはサイレンシングを誘導した。
マウスIL-12を発現するプラスミドをマウスに筋肉内接種することにより、マウスIL-12の発現がベースライン発現レベルよりも増強されることが示されている。マウスIL-12導入遺伝子の発現は、HCMV IEプロモーターおよびSV40ポリアデニル化シグナルを含むベクターによって行った。血清IL-12 p40レベルに関するELISAにより、投与したDNAの発現レベルおよび有効性を分析するための簡単なシステムが得られる。p40はIL-12を含む2種類のポリペプチド鎖のうち1つである。
血清中でのマウスIL-12 p40の発現を、100ugのマウスIL-12発現プラスミドを筋肉内注射したSCIDマウス、または注射を行わなかった未処置SCIDマウス対照においてモニタリングした。マウスには第0日および第60日の時点で初回注射および追加注射を行った。マウス5匹の平均値を比較した。観察されたばらつきは20%未満であった。サイレンシングはSCIDマウスの方が早く起こるように思われる。
第0日の時点で、第3群および第4群に対して、IL-12特異的dsRNAまたはIL-12特異的dsRNA発現ベクターを筋肉内注射によって投与した。対照である第1群および第4群には第0日に注射を行わなかった。第5日の時点で第2群、第3群、および第4群にIL-12発現ベクターを筋肉内注射し、第13日にすべてのマウスから採血して血清IL-12レベルを測定した。HSVgD-2 RNA発現ベクターおよびHSVgD-2 dsRNA発現ベクターを注射した対照群にIL-12発現に対する影響はみられなかった。
第1群の血清は内因性基礎レベルのIL-12である200pg/mlを示している。800pg/mlという第4群の血清IL-12レベルは、内因性IL-12および発現ベクター由来のIL-12の両方を含むIL-12の合計に相当する。dsRNAの前投与(第2群)は、RNAを投与しなかった群(第4群)よりもIL-12レベルを低下させる。しかし、細胞内dsRNA合成を可能にするベクターの前投与(第3群)ではIL-12は検出されない。対照HSVgD-2 dsRNAまたはdsRNA発現ベクターの前投与はIL-12発現に対して影響を及ぼさなかった。これらの結果は、IL-12サイレンシングが、IL-12特異的dsRNAの注射、およびIL-12特異的dsRNA発現ベクターの注射のいずれによっても媒介されることを示している。IL-12発現に対して影響を及ぼしたのはIL-12特異的dsRNAおよびIL-12特異的dsRNA発現ベクターのみであり、HSVgd-2のdsRNAおよび発現ベクターはIL-12発現に対して測定可能な影響を及ぼさなかったことからみて、サイレンシングは配列特異的である。さらに、これらの結果は、ベクターを介したdsRNAの細胞内発現の方がdsRNAの投与よりも効果が大きいことを示している。しかし、第2群におけるdsRNAの効果の最大限の能力はここで用いた送達条件下では認められず、別の送達方法または用量ではさらに効果が大きいという可能性もある。また、本発明者らが第13日よりも後に観察していれば第2群のIL-12レベルはさらに低下していた可能性もある。第3群では第13日にIL-12が検出されず、内因性IL-12およびベクター由来IL-12のいずれの発現の抑制も認められたことは興味深い。dsRNAおよびdsRNA発現ベクターの注射に対するインターフェロン応答についても実験の第1週にモニタリングした。IL-12特異的およびHSVgD-2特異的なdsRNAの注射は顕著なインターフェロン応答を誘導し、これは急速に誘導されたが3日間という短期間しか続かなかった。dsRNA発現ベクターを注射した動物ではインターフェロン応答は検出されなかった。この結果は細胞培養モデルで得られた結果と一致する。
以上の説明により、本明細書に記載された発明に対して種々の用法および条件を採用するための変更および改変を加えうることは明らかであると考えられる。このような態様も以下の特許請求の範囲内にある。
Claims (99)
- 核酸、エンドモリティックスペルミン(コレステロールまたは脂肪酸を含む)および標的指向性スペルミン(細胞表面分子に対するリガンドを含む)を含む組成物であって、該組成物の正電荷と負電荷との比が0.5から1.5までの範囲にあり、エンドモリティックスペルミンが該組成物中のスペルミン含有分子の少なくとも20%を占め、かつ標的指向性スペルミンが該組成物中のスペルミン含有分子の少なくとも10%を占める、組成物。
- 正電荷と負電荷との比が0.8から1.2までの範囲にある、請求項1記載の組成物。
- 核酸がDNAを含み、かつエンドモリティックスペルミンが組成物中のスペルミン含有分子の40%から90%までの範囲を占める、請求項1記載の組成物。
- 核酸がDNAを含み、かつ標的指向性スペルミンが組成物中のスペルミン含有分子の10%から60%までの範囲を占める、請求項1記載の組成物。
- 核酸がRNAであり、かつエンドモリティックスペルミンが組成物中のスペルミン含有分子の20%から90%までの範囲を占める、請求項1記載の組成物。
- 核酸がRNAであり、かつ標的指向性スペルミンが組成物中のスペルミン含有分子の10%から80%までの範囲を占める、請求項1記載の組成物。
- 標的指向性スペルミンが組成物中のスペルミン含有分子の30%から40%までの範囲を占め、かつエンドモリティックスペルミンが組成物中のスペルミン含有分子の60%から70%までの範囲を占める、請求項1記載の組成物。
- 標的指向性スペルミンが組成物中のスペルミン含有分子の35%を占め、かつエンドモリティックスペルミンが該組成物中のスペルミン含有分子の65%を占める、請求項7記載の組成物。
- コレステロール、脂肪酸または細胞表面分子に対するリガンドを含まないスペルミン含有分子をさらに含む、請求項1記載の組成物。
- 組成物のイオン強度が、50mMから240mMまでの範囲のナトリウムを含む溶液のイオン強度と等しい、請求項1記載の組成物。
- 組成物のイオン強度が、125mMから175mMまでの範囲のナトリウムを含む溶液のイオン強度と等しい、請求項10記載の組成物。
- pHが6から8までの範囲にある、請求項1記載の組成物。
- pHが6から7までの範囲にある、請求項12記載の組成物。
- pHが6.5から6.8までの範囲にある、請求項13記載の組成物。
- 核酸がDNA、RNA、DNA/RNAハイブリッド、またはペプチド核酸である、請求項1記載の組成物。
- 核酸が直鎖状である、請求項1記載の組成物。
- 核酸が環状である、請求項1記載の組成物。
- 核酸が超らせん状である、請求項1記載の組成物。
- 核酸が一本鎖である、請求項1記載の組成物。
- 核酸が二本鎖である、請求項1記載の組成物。
- 核酸の長さが45キロベース未満である、請求項1記載の組成物。
- 核酸の長さが10キロベース未満である、請求項21記載の組成物。
- 核酸の長さが100ベース未満である、請求項22記載の組成物。
- 1〜50μgの核酸を含む、請求項21記載の組成物。
- 1つのエンドモリティックスペルミンが、2つのコレステロール、2つの脂肪酸、または1つのコレステロールと1つの脂肪酸を含む、請求項1記載の組成物。
- 脂肪酸が同一である、請求項25記載の組成物。
- 脂肪酸が異なる、請求項25記載の組成物。
- 標的指向性スペルミンが細胞表面分子に対するリガンドを2つ含む、請求項1記載の組成物。
- リガンドが同一である、請求項28記載の組成物。
- リガンドが異なる、請求項24記載の組成物。
- 少なくとも2つの異なるエンドモリティックスペルミンおよび/または少なくとも2つの異なる標的指向性スペルミンを含む、請求項1記載の組成物。
- 1つのエンドモリティックスペルミンが1つのコレステロールを含み、1つのエンドモリティックスペルミンが1つの脂肪酸を含む、請求項31記載の組成物。
- 脂肪酸部分よりもコレステロール部分を多く含む、請求項32記載の組成物。
- リガンドがペプチド、抗体、ビオチン、葉酸受容体リガンド、ラクトース、フコース、またはマンノース部分である、請求項1記載の組成物。
- ペプチドが最大10個のアミノ酸を含む、または該ペプチドがRGDモチーフを1つ含む、請求項34記載の組成物。
- リガンドがスペルミン中の第二級アミンとリンカーを介して結合している、および/またはコレステロール中のC3位の酸素がスペルミン中の第二級アミンとリンカーを介して結合している、請求項1記載の組成物。
- 脂肪酸がスペルミン中の第二級アミンと直接結合しており、かつ遊離COOH基を有する、請求項1記載の組成物。
- リンカーが3個から12個までの範囲の炭素原子を含む、請求項36記載の組成物。
- リンカーがC3からC12までの範囲の飽和型または不飽和型の炭化水素部分を含む、請求項38記載の組成物。
- リンカーが炭素原子を3個または4個含んでおり、かつ二重結合は含まない、請求項38記載の組成物。
- リンカーが炭素原子を5個または6個含んでおり、かつ二重結合を最大1個含む、請求項38記載の組成物。
- リンカーが7個から12個までの範囲の炭素原子を含んでおり、かつ二重結合を最大2個含む、請求項38記載の組成物。
- リンカーが炭素原子を5個含む、請求項38記載の組成物。
- リンカーが末端のカルボキシル、アミノ、ヒドロキシル、スルフヒドリル、アルキル、カルボキサミド、カルバメート、チオカルバメートまたはカルバモイル架橋基を介してスペルミンの第二級アミン基と結合している、請求項38記載の組成物。
- 脂肪酸が4個から12個までの範囲の炭素原子を含む、請求項1記載の組成物。
- リンカーがC4からC12までの範囲の飽和型または不飽和型の炭化水素部分である、請求項45記載の組成物。
- 脂肪酸がエステル基を含む、請求項45記載の組成物。
- 該脂肪酸が炭素原子を6個含む、請求項45記載の組成物。
- 脂肪酸のカルボキシル基のpKaが最大6である、請求項45記載の組成物。
- 請求項1〜49のいずれか一項記載の組成物および薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
- pHが5から8までの範囲にある、請求項50記載の組成物。
- pHが6から7.5までの範囲にある、請求項51記載の組成物。
- ヒト血液の電解質濃度に対して等張である、請求項50記載の組成物。
- 1〜30μgの核酸を含む、請求項50記載の組成物。
- 水中油型エマルション中にてカチオン性両親媒性物質と複合体を形成した核酸を含む組成物であって、該複合体の少なくとも10%が該エマルションの油相中にある組成物。
- 核酸の少なくとも25%がエマルションの油相中にある、請求項55記載の組成物。
- 核酸の少なくとも50%がエマルションの油相中にある、請求項56記載の組成物。
- 核酸の少なくとも75%がエマルションの油相中にある、請求項57記載の組成物。
- 核酸の少なくとも90%がエマルションの油相中にある、請求項58記載の組成物。
- カチオン性両親媒性物質がカチオン性脂質、修飾スペルミンもしくは非修飾スペルミン、ブピバカイン、または塩化ベンザルコニウムである、請求項55記載の組成物。
- カチオン性両親媒性物質が、(i)正電荷と負電荷との比が1から5までの範囲にあるブピバカイン;(ii)正電荷と負電荷との比が0.5から1.5までの範囲にある非修飾スペルミンもしくは修飾スペルミン;(iii)正電荷と負電荷との比が0.5から5.0までの範囲にあるカチオン性脂質;(iv)正電荷と負電荷との比が0.5から2.0までの範囲にあるリポフェクタミン;または(v)正電荷と負電荷との比が0.01から0.2までの範囲にある塩化ベンザルコニウムである、請求項55記載の組成物。
- 油が植物油または動物油である、請求項55記載の組成物。
- pHが6から8までの範囲にある、請求項55記載の組成物。
- pHが6から7までの範囲にある、請求項63記載の組成物。
- pHが6.5から6.8までの範囲にある、請求項64記載の組成物。
- 核酸がDNA、RNA、DNA/RNAハイブリッド、またはペプチド核酸である、請求項55記載の組成物。
- 核酸が直鎖状である、請求項55記載の組成物。
- 核酸が環状である、請求項55記載の組成物。
- 核酸が超らせん状である、請求項55記載の組成物。
- 核酸が一本鎖である、請求項55記載の組成物。
- 1〜50μgの核酸を含む、請求項55記載の組成物。
- 請求項55〜71のいずれか一項記載の組成物および薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
- pHが5から8までの範囲にある、請求項72記載の組成物。
- pHが6から7.5までの範囲にある、請求項73記載の組成物。
- ヒト血液の電解質濃度に対して等張である、請求項72記載の組成物。
- 1〜30μgの核酸を含む、請求項72記載の組成物。
- 目的のRNA分子またはタンパク質分子を細胞内で発現させるための方法であって、細胞を請求項1、50、55、または72記載の組成物と、該組成物中の核酸によりコードされる目的のRNAまたはタンパク質の発現を可能にする条件下で接触させる工程を含む方法。
- 細胞が内因型の目的のRNAまたはタンパク質の内部に疾患または障害と関連のある変異を有し、かつ核酸が疾患または障害と関連のない型の該RNAまたはタンパク質をコードしている、請求項77記載の方法。
- 目的のRNAまたはタンパク質が病原体に由来し、かつ方法が目的のRNAまたはタンパク質に対する免疫応答を引き起こす、請求項77記載の方法。
- 細胞における標的核酸の発現を抑制するための方法であって、細胞を請求項1、50、55、または72記載の組成物と、該組成物中の核酸によりコードされるリボザイムの発現を可能にする条件下で接触させる工程を含む方法であり、ここで該リボザイムが疾患、障害、または感染と関連のある、細胞内の標的核酸を切断する方法。
- 細胞における標的核酸の発現を抑制するための方法であって、細胞を請求項1、50、55、または72記載の組成物と接触させる工程を含む方法であり、ここで該組成物が、標的核酸のある領域に対する実質的な配列同一性を有しかつ標的核酸の発現を特異的に抑制する第1の二本鎖RNA(dsRNA)または第1の二本鎖dsRNAをコードする核酸を含む方法。
- 短い第2のdsRNAまたは短い第2のdsRNAをコードする核酸を細胞内に導入する工程をさらに含む方法であって、第2のdsRNAがdsRNAにより媒介される毒性を抑制する、請求項81記載の方法。
- 動物における疾患、障害、または感染を治療、安定化、または予防するための方法であって、動物を請求項1、50、55、または72記載の組成物と接触させる工程を含む方法であり、ここで該組成物が、疾患、障害、または感染と関連のある標的核酸のある領域に対して実質的な配列同一性を有しかつ該標的核酸の発現を特異的に抑制する第1のdsRNA、または第1の二本鎖dsRNAをコードする核酸を含む方法。
- 短い第2のdsRNAまたは短い第2のdsRNAをコードする核酸を細胞内に導入する工程をさらに含む方法であって、第2のdsRNAがdsRNAにより媒介される毒性を抑制する、請求項83記載の方法。
- 細胞における標的核酸の発現を抑制するための方法であって、細胞を請求項1、50、55、または72記載の組成物と接触させる工程を含む方法であり、ここで該組成物が、標的核酸のある領域に対して実質的な配列同一性を有しかつ標的核酸の発現を特異的に抑制するアンチセンス核酸を含む方法。
- 動物における疾患、障害、または感染を治療、安定化、または予防するための方法であって、動物を請求項1、50、55、または72記載の組成物と接触させる工程を含む方法であり、ここで該組成物が、疾患、障害、または感染と関連のある標的核酸のある領域に対して実質的な配列同一性を有しかつ標的核酸の発現を特異的に抑制するアンチセンス核酸を含む方法。
- 標的核酸が病原体に関連する、請求項83または86記載の方法。
- 病原体がウイルス、細菌、酵母、または感染性因子である、請求項87記載の方法。
- 第2のdsRNAにおける二本鎖領域が11ヌクレオチドから30ヌクレオチドまでの範囲を含む、請求項82または84記載の方法。
- 第1のdsRNAにおける二本鎖領域が11ヌクレオチドから30ヌクレオチドまでの範囲を含む、請求項81または83記載の方法。
- 第1のdsRNAにおける二本鎖領域が30ヌクレオチドを上回るものを含む、請求項81または83記載の方法。
- 第1のdsRNAにおける二本鎖領域が200ヌクレオチドを上回るものを含む、請求項91記載の方法。
- 細胞が脊椎動物細胞である、請求項77、80、81、83、85、または86記載の方法。
- 細胞が哺乳動物細胞である、請求項93記載の方法。
- 細胞がヒト細胞である、請求項94記載の方法。
- 細胞が哺乳動物の体内にある、請求項77、80、81、83、85、または86記載の方法。
- 細胞がヒトの体内にある、請求項96記載の方法。
- 動物が哺乳動物である、請求項83または86記載の方法。
- 動物がヒトである、請求項98記載の方法。
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