KR102008787B1 - 신규한 양이온 리피드를 포함하는 유전자 전달체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 유전자 전달 효율이 우수한 양이온 리피드 또는 상기 양이온 리피드를 이용하여 제조된 리포좀을 포함하는 유전자 전달 복합체 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 양이온 리피드 또는 리포좀은 종래 유전자 전달체와 비교하여 월등히 향상된 유전자 전달 효율을 갖는다. 또한, 본 발명의 양이온 리피드 또는 리포좀은 세포독성이 매우 낮아 효과적인 유전자 전달체로 개발될 수 있다.

Description

신규한 양이온 리피드를 포함하는 유전자 전달체{Gene Delivery System Comprising a New Cationic Lipid}
본 발명은 양이온 리피드를 포함하는 유전자 전달 복합체 및 그의 제조방법에 관한 것이다.
인간유전체 연구가 활발한 가운데 질병의 원인 및 기전에 대한 연구를 비롯하여 유전자 치료제에 대한 연구가 활발히 진행되고 있으나 세포 또는 조직으로 유전자의 효율적 전달의 어려움으로 인해 효율적인 유전자 전달체 개발에 대한 요구가 매우 커지고 있다.
일반적으로 유전자 전달체는 바이러스성 벡터와 비바이러스성 벡터로 나누어지는데 바이러스성 벡터로는 레트로 바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), AAV(adeno-associated virus), 렌티바이러스(lentivirus), 백시나바이러스(vaccina virus) 등이 있으며, 이들은 유전자 전달 효율은 높으나 분자량이 큰 DNA는 전달하기가 어렵고, 바이러스의 재감염, 면역반응 유발 혹은 발암유전자의 활성화와 같은 심각한 문제점이 있어 유전자 치료제 전달을 위한 벡터로 사용하기에는 어려움이 있다(Smith, Annu. Rev. Microbiol. 49, 807-838, 1995; Yibin Wang et al., Adenovirus technology for gene manipulation anf functional studies. DDT. 5(1), 2000; Kremer et al., Br. Med. Bull. 51, 31-44, 1995).
이러한 바이러스성 벡터를 사용하지 않는 유전자 벡터로는 화학적 합성이 가능한 양이온성 폴리머로 이루어진 양이온성 리포좀(Liposome), 폴리에틸렌 이민(polyethyleneimine, PEI), 덴드리머(dendrimer) 등이 있으며 이들 중 양이온성 리포좀을 이용한 벡터가 가장 널리 사용되고 있다. 비바이러스 벡터와 DNA 분자 복합체는 여전히 전체적인 양이온을 띠고 있어 음이온계 세포막에 접근하여 지질로 구성된 막의 구조를 불안정하게 하면서 융합되어 세포안으로 들어감으로써 유전자 전달을 일으키게 된다. 비바이러스성 벡터들은 특별한 면역반응이 없고, DNA 크기에 제한 받지 않으며, 대량생산이 가능하다는 장점이 있으나(Eur.J.Pharm.Biopharm.50, 101-119, 2000; Ch.Garcia-Chaumont et al., Pharmacol. Ther. 76, 151-1601, 2000; Colin W Pouton et al., Adv.Drug Deliv.Rev.46, 187-203, 2001), 바이러스성 벡터에 비해 전달효율이 낮고, 세포주 종류에 따라 세포 내 전달효율이 일정하지 않으며, 세포막에 손상을 입혀 독성을 나타내는 문제점이 있다(Amarnath Sharma et al., International journal of pharmaceutics, 154, 123-140, 1997; Saghir Akhtar et al., Adv.Drug Deliv.Rev. 44, 3-21, 2000). 따라서 비바이러스성 벡터의 이와 같은 문제점을 보완 및 개선하여 유전자 전달 효율을 높인 비바이러스성 벡터 개발이 요구되고 있다.
최근 비바이러스성 벡터로서 진핵세포막의 이중층 구조를 이루고 있는 콜레스테롤 성분을 응용하고자 하는 연구가 진행되고 있다. 진핵 막은 이중층 구조를 가지며 주로 인지질, 스핑고리피드 및 콜레스테롤로 이루어지며, 콜레스테롤 또는 콜레스테롤-유사 스테롤은 진행 막에서 가장 풍부한 화학종이다. 유리 콜레스테롤은 인지질과 함께 리포좀 조성물의 성분으로서 사용되어 왔다. 그러나 유리 콜레스테롤 및 인지질로 이루어진 리포좀이 다른 생물학적 지질 및 혈청을 함유하는 생물학적 유체 중에 존재하게 되면, 유리 콜레스테롤은 리포좀으로부터 생물학적 지질로 신속하게 이동된다. 이와 같이 리포좀으로부터 유리 콜레스테롤이 손실되면 일반적으로 지질 이중층의 안정성 감소가 야기되고 이후에 피막에 둘러싸인 내용물이 리포좀으로부터 손실된다. 추가로, 혈청이 존재하면 혈청 지단백질에 의한 유리 콜레스테롤의 흡수로 인해 유리 콜레스테롤이 리포좀으로부터 단백질로 전달되어 리포좀의 누출이 유의하게 증가될 것이다. 따라서 양친매성 지질체와 보다 안정적인 구조형성이 가능하도록 콜레스테롤을 변형시켜 양이온성 콜레스테롤 유도체에 대한 연구가 진행되고 있다(Biochem.Biophys. Res. Commun. vol. 337, pp387-388, 1991; Biochem. Biophys.Res.Commun. vol. 221, p82-88. 1996; International journal of Pharmaceutics. 353, p260-269, 2008); WO 2009/064696). 그러나 아직까지 다양한 세포주에 광범위한 전달효율을 나타내는 벡터가 개발되지 아니하였으므로, 보다 전달 효율을 높일 수 있는 방법에 대한 연구가 요구되는 실정이다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 생체 내 독성이 적으며, 유전자 전달 효율을 높일 수 있는 전달체를 개발하기 위하여 노력하였다. 그 결과 콜레스테롤로부터 유래된 양이온 리피드가 세포독성이 적으며, 종래 유전자 전달체와 비교하여 유전자 전달 효율이 월등히 향상된다는 것을 발견함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 양이온 리피드를 포함하는 유전자 전달 복합체를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 유전자 전달용 양이온 리피드를 제조하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 양이온 리피드를 이용하여 리포좀을 형성하는 단계를 포함하는 유전자 전달 복합체의 제조 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 양이온 리피드를 포함하는 유전자 전달 복합체를 투여하는 단계를 포함하는 유전자 전달 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 하기 화학식 1의 양이온 리피드를 포함하는 유전자 전달 복합체를 제공한다.
화학식 1
Figure 112013045743775-pat00001
상기 화학식에서,
X는 트리플루오로아세트산염, 아세트산염 및 메탄술포닐산염으로 구성된 군으로부터 선택되는 유기산염 또는 탄산염, 염산염, 황산염, 초산염, 인산염, 불산염, 과염소산염 및 차아염소산염으로 구성된 군으로부터 선택되는 무기산염이며;
m은 1-2의 정수이며;
n은 1-5의 정수이다.
본 발명자들은 생체 내 독성이 적으며, 유전자 전달 효율을 높일 수 있는 전달체를 개발하기 위하여 노력하였다. 그 결과 콜레스테롤로부터 유래된 양이온 리피드가 우수한 유전자 전달 효율을 나타내는 것을 발견함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 양이온 리피드는 유기산 또는 무기산과 염의 형태를 이루어 -NH3 +의 양이온 형태로 존재하는 특징을 갖는다. 염을 구성하는 유기산 또는 무기산은 상기 양이온 리피드 염을 구성할 수 있는 능력을 갖는 다양한 산을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 트리플루오로아세트산염, 아세트산염, 메탄술포닐산염 등의 유기산 또는 탄산염, 염산염, 황산염, 초산염, 인산염, 불산염, 과염소산염, 차아염소산염 등의 무기산이 이용될 수 있으며, 보다 바람직하게는 트리플루오로아세트산염 또는 아세트산염이 이용될 수 있다.
본 발명의 양이온성 리피드는 소수성 리피드 부분과 친수성 양이온성 아민부위로 구성된 양친매성 화합물로서 콜레스테롤의 3번 위치의 히드록시기를 아민으로 치환시켜 아미노알킬화 반응을 통해 합성함이 바람직하다. 상기 아미노알킬화 반응을 통하여 다양한 탄소수의 알킬이 결합될 수 있으며, 바람직하게는 상기 n은 1-5의 정수인 것이 세포 내로의 트랜스펙션효율과 경제성을 고려할 때 좋으며, 보다 바람직하게는 1-2의 정수인 것이다.
본 발명의 양이온성 리피드는 음전하를 띄고 있는 유전자와 복합체를 형성할 수 있는 능력을 갖는다.
본 발명에서 양이온성 리피드와 복합체를 형성하는 유전자는 단일사슬 또는 이중사슬의 DNA, 플라스미드 또는 RNA일 수 있으며, RNA는 mRNA, tRNA, rRNA 뿐만 아니라 임의의 세포의 타겟 DNA 또는 RNA 서열과 상보적인 안티센스 RNA, siRNA, miRNA 및 리보자임(Rybozyme)을 포함한다. 임의의 단백질 또는 질병의 치료 또는 진단과 관련된 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자는 상기 플라스미드에 삽입될 수 있으며, 이러한 폴리펩타이드로는 각종 호르몬, 조직적합성 항원, 세포부착단백질, 사이토카인, 각종 항체, 세포 수용체, 세포내 또는 세포외 효소 및 이들의 절편 등이 포함될 수 있다.
또한 상기 유전자로는 유전자발현조절인자, 예를 들면 전사프로모터, 인헨서, 사일렌서, 오퍼레이터, 터미네이터, 어테뉴에이터 및 기타 발현조절인자 등을 포함하는 것이 바람직하다.
상기 복합체에서 DNA:양이온성 리피드의 적절한 전하비는 1:1-1:20, 바람직하게는 1:1-1:10이며, 상기 전하비의 범위를 초과한 경우에는 유전자의 전달효율이 감소하는 문제점이 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 양이온성 리피드는 리포좀의 형태를 갖는 것이다.
본 명세서에서 용어“리포좀(liposome)”은 폐쇄된 지질 이중막을 형성함으로서 만들어지는 지질 운반체를 말한다. 리포좀은 지질 이중막으로 생체 친화적이며 양쪽 친매성을 가지고 있어 내부의 친수성 물질을 포함한 채로 소수성 막을 통과할 수 있다. 리포좀은 내부에 약제학적으로 유용한 각종 물질을 표적세포까지 운반하는 기능을 수행할 수 있다. 상기 리포좀을 약제학적으로 사용하는 경우에 지질막이 서서히 용해되기 때문에 서방성 의약품을 제조할 수 있고, 경구투여나 주사로도 체내의 흡수를 촉진할 수 있으며, 표적기관이나 조직의 주변에만 의약품의 농도를 증대시킬 수 있는 이점도 있다.
본 발명의 양이온성 리포좀은 상기 본 발명의 양이온성 리피드만을 이용하여 구성할 수도 있으며, 다른 종류의 리피드를 추가적으로 포함하여 구성할 수도 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 다른 종류의 리피드는 중성 리피드이다.
중성 리피드를 추가적으로 포함할 경우, 상기 양이온성 리포좀에 사용되는 화학식(1)의 양이온 리피드 화합물과 보조의 중성 리피드의 혼합비율은 바람직하게는 1:1-10:1(wt:wt)이며, 보다 바람직하게는 1:1-5:1(wt:wt)이다.
상기 양이온성 리포좀은 리피드 분자를 수용액내에서 부유한 후 초음파를 처리함으로써 매우 균질한 사이즈의 구형 소포(vesicle)을 형성 가능하며, 또한 에탄올내의 리피드 용액을 물과 급속한 혼합에 의하여 형성하는 것도 본 발명의 실시에 있어 바람직하다.
상기 다른 종류의 리피드는 당업계에 알려진 다양한 리피드를 이용할 수 있으며, 바람직하게는 중성 리피드, 보다 바람직하게는 콜레스테롤, DOPE(dioleoylphosphatidylethanolamine), DOPC(dioleoylphosphatidylcholine)등의 중성 리피드를 추가하여 본 발명의 양이온성 리포좀을 구성할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 유전자 전달용 양이온 리피드를 제조하는 방법을 제공한다:
(a) 콜레스테롤의 3-히드록시기에 토실기를 도입하는 단계;
(b) 상기 단계(a)에서 생성된 화합물의 토실기를 아자이드기로 치환하는 단계;
(c) 상기 단계(b)에서 생성된 화합물의 아자이드기를 아민기로 환원하는 단계;
(d) 상기 단계(c)에서 생성된 화합물의 아민기에 아민 보호기가 결합된 알킬아민을 도입하는 단계; 및
(e) 상기 단계(d)에서 생성된 화합물에 유기산 또는 무기산을 처리하여 아민 보호기를 제거하고 리피드 염의 형태로 수득하는 단계.
본 발명의 방법은 상술한 본 발명의 유전자 전달용 양이온 리피드를 제조하기 위한 공정이기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 반복 기재에 따른 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 발명의 양이온성 리피드는 도 1에 도시한 바와 같이 콜레스테롤의 3-히드록시기를 아민기로 치환한 후 아미노 알킬그룹과 결합함으로써 이루어진다. 하지만 본 발명의 양이온성 리피드가 상기 방법에 의해 제조되는 것으로 한정적으로 해석되어져서는 안 되고 당업자라면 본 발명의 방법과 다른 절차에 의해 상기 본 발명의 양이온성 리피드를 제조하는 것도 가능하다.
본 발명의 양이온성 리피드를 제조하기 위한 본 발명의 방법을 단계별로 상세하게 설명하면 다음과 같다:
(a) 콜레스테롤의 3-히드록시기에 토실기 도입
우선, 콜레스테롤에 토실기를 도입한다.
상기 토실기의 도입은 다양한 방법에 의해 가능하며, 바람직하게는 콜레스테롤을 유기용매에 녹이고 피리딘을 가한 후 톨루엔술포닐클로라이드를 가하여 콜레스테롤의 3-히드록시기에 톨루엔술포닐기를 도입하여 이루어진다.
상기 방법을 통하여 2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카히드로-10,13-디메틸-17-(6-메틸헵탄-2-일)-1H-시클로펜타[a]페난트렌-3-일-4-메틸벤젠술포네이트를 얻을 수 있다.
(b) 토실기를 아자이드기로 치환
다음으로, 상기 단계 (a)에서 생성된 화합물의 토실기를 아자이드기로 치환한다.
상기 아자이드기로의 치환은 다양한 방법에 의해 가능하며, 상기 단계 (a)에서 생성된 화합물이 2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카히드로-10,13-디메틸-17-(6-메틸헵탄-2-일)-1H-시클로펜타[a]페난트렌-3-일-4-메틸벤젠술포네이트일 경우, 보론트리플루오라이드 디메틸에테르와 트리메틸실란아자이드를 가하여 치환시킬 수 있다.
상기 방법을 통하여 3-아지도-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카히드로-10,13-디메틸-17-(6-메틸헵탄-2-일)-1H-시클로펜타[a]페난트렌을 얻을 수 있다.
(c) 아자이드기를 아민기로 환원
그 다음으로, 상기 단계 (b)에서 생성된 화합물의 아자이드기를 아민기로 환원시킨다.
상기 아민기로의 환원은 다양한 방법에 의해 가능하며, 상기 단계 (b)에서 생성된 화합물이 3-아지도-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카히드로-10,13-디메틸-17-(6-메틸헵탄-2-일)-1H-시클로펜타[a]페난트렌인 경우, 적절한 유기용매에 녹인 후 환원제를 가하여 아자이드기를 아민기로 환원시킬 수 있다. 바람직한 환원제로는 리튬알루미늄보로하이드라이드 등이 있다.
상기 방법을 통하여 2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카히드로-10,13-디메틸-17-(6-메틸헵탄-2-일)-1H-시클로펜타[a]페난트렌-3-아민을 얻을 수 있다.
(d) 아민 보호기가 결합된 알킬아민 도입
다음으로, 상기 단계 (c)에서 생성된 화합물의 아민기에 아민 보호기가 결합된 알킬아민을 도입시킨다.
상기 아민 보호기는 당업계에 알려진 다양한 종류의 보호기를 이용할 수 있으며, 바람직하게는 t-부톡시카보닐(Boc), 9H-플로렌-9-일메톡시카보닐(Fmoc), 트리틸(trityl), 벤질, 클로로아세틸, 벤질옥시카보닐, p-메톡시벤질옥시카보닐, 포밀, 트리플루오로아세틸, p-톨루엔술포닐, 벤젠술포닐, 메탄술포닐, p-니트로벤질옥시카보닐, 2,2,2-트리클로로에톡시카보닐 등의 보호기로 아민이 보호된 알킬아민을 도입할 수 있다.
아민 보호기로 부톡시카보닐을 이용할 경우, 상기 2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카히드로-10,13-디메틸-17-(6-메틸헵탄-2-일)-1H-시클로펜타[a]페난트렌-3-아민에 tert-부틸(2-브로모에틸)카바메이트 또는 tert-부틸(2-브로모프로필)카바메이트를 반응시켜 아미노 알킬기를 도입시킬 수 있다.
상기 방법을 통하여 tert-부틸 2-(2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카히드로-10,13-디메틸-17-(6-메틸헵탄-2-일)-1H-시클로펜타[a]페난트렌-3-일아미노)에틸카바메이트 또는 tert-부틸-3-(2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-?라데타히드로-10,13-디메틸-17-(6-메틸헵탄-2-일)-1H-시클로펜타[a]페난트렌-3-일아미노)프로필카바메이트를 얻을 수 있다.
(e) 아민 보호기의 제거 및 리피드 염 수득
마지막으로, 상기 단계 (d)에서 생성된 화합물의 아민 보호기를 제거하여 리피드 염 형태의 본 발명의 양이온성 리피드을 수득한다.
상기 아민 보호기의 제거는 당업계에 알려진 다양한 유기산 또는 무기산을 이용할 수 있다. 유기산을 이용할 경우 트리플루오로아세트산, 아세트산, 메탄술포닐산 등을 이용할 수 있으며, 무기산을 이용할 경우 탄산, 염산, 황산, 초산, 인산, 불산, 과염소산, 차아염소산 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
유기산으로 트리플루오로아세트산을 이용할 경우, 상기 단계 (d)에서 생성된 화합물, 바람직하게는 tert-부틸 2-(2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카히드로-10,13-디메틸-17-(6-메틸헵탄-2-일)-1H-시클로펜타[a]페난트렌-3-일아미노)에틸카바메이트 또는 tert-부틸-3-(2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-?라데타히드로-10,13-디메틸-17-(6-메틸헵탄-2-일)-1H-시클로펜타[a]페난트렌-3-일아미노)프로필카바메이트은 N-(2-아미노에틸)- 2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카히드로-10,13-디메틸아민-17-(6-메틸헵탄-2-일)-1H-시클로펜타[a]페난트렌-3-아민 트리플로로아세트산 염 또는 N-(2-아미노프로필)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카히드로-10,13-디메틸아민-17-(6-메틸헵탄-2-일)-1H-시클로펜타[a]페난트렌-3-아민 트리플로로아세트산 염을 수득할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 방법에 따라 제조된 양이온 리피드 또는 양이온 리피드에 중성 리피드를 추가하여 리포좀을 형성하는 단계를 포함하는 유전자 전달 복합체의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 양이온성 리피드 또는 이를 포함하는 리포좀을 포함하는 유전자 전달 복합체의 타겟 세포내로의 이행 기작으로는 엔도사이토시스 또는 세포막과 리포좀 또는 복합체와의 융합에 의해 이루어진다. 엔토사이토시스 경우에는 세포내에서 엔도좀을 형성하는 과정을 거쳐 유전자 전달이 일어나며, 융합의 경우 리포좀의 막은 타겟 세포막과 일체화되고 리포좀내의 내용물은 세포질내로 이행이 이루어지는 과정을 통하여 타겟세포로 유전자 전달을 하게 된다.
또한 본 발명에서 전달 대상이 되는 유전자는 그 크기(size)와 형태에 상관없이 사용될 수 있으며, 상기 양이온성 리피드 또는 이를 포함하는 리포좀과 혼합하여 유전자를 포함시킬 수 있다. 바람직한 유전자:리포좀의 전하비는 1:1 내지 1:10이다.
상기 포함되는 유전자가 올리고뉴클레오타이드 형태의 DNA인 경우에는 15-120 bases 크기의 핵산체를 사용하는 것이 바람직하고, 플라스미드 벡터 형태의 DNA인 경우에는 3-8 kb 크기인 것이 바람직하다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 양이온 리피드를 포함하는 유전자 전달 복합체를 투여하는 단계를 포함하는 유전자 전달 방법을 제공한다.
본 발명의 유전자 전달 복합체는 유전자 전달 능력을 높일 목적으로 투여될 수 있으며, 인간을 포함하는 포유동물에게 투여될 수 있다. 바람직한 포유동물은 인간을 제외한다.
본 발명의 유전자 전달 복합체는 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 바람직하게는 비경구 투여이고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.
본 발명의 유전자 전달 복합체는 종래의 리포펙타민(lipofectamine)과 비교하여, 1.2배 이상, 바람직하게는 2 배 이상의 유전자 전달 효율을 갖는다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 루시퍼라제(Luciferase) 또는 GFP(green fluorecence protein) 유전자를 포함하는 플라스미드 벡터를 사용하여 MCF-7 세포 또는 HEK293 세포에서 유전자의 발현량을 측정함으로써 펩타이드의 세포 내 전달 효율이 리포펙타민과 비교하여 월등히 향상되었음을 확인할 수 있었다.
본 발명의 양이온성 리피드 또는 리포좀을 이용한 유전자 전달체는 도 2 및 3에서와 같이 종래의 유전자 전달체에 비하여 우수한 유전자 전달체이며 독성이 현저히 낮은 특성이 있어 유전자 전달체로서 매우 우수하다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(i) 본 발명은 유전자 전달 효율이 우수한 양이온 리피드 또는 상기 양이온 리피드를 이용하여 제조된 리포좀을 포함하는 유전자 전달 복합체 및 이의 제조방법을 제공한다.
(ⅱ) 본 발명의 양이온 리피드 또는 리포좀은 종래 유전자 전달체와 비교하여 월등히 향상된 유전자 전달 효율을 갖는다.
(ⅲ) 또한, 본 발명의 양이온 리피드 또는 리포좀은 세포독성이 매우 낮아 효과적인 유전자 전달체로 개발될 수 있다.
도 1은 콜레스테롤로부터 아미노스테롤 유도체를 합성하는 합성단계의 일 예시를 나타낸 그림이다.
도 2는 DNA:리포좀의 전하비가 1:3 또는 1:5로 혼합되어 제조된 유전자 전달 복합체로 트랜스펙션시킨 MCF-7 세포에서의 루시퍼라제 활성을 비교한 그래프이다.
도 3은 DNA: 리포좀의 전하비가 1:3 또는 1:5로 혼합되어 제조된 유전자 전달 복합체로 트랜스펙션시킨 HEK293 세포에서의 루시퍼라제 활성을 비교한 그래프이다.
도 4는 DNA와 리포좀의 전하비가 1:3 또는 1:5로 혼합되어 제조된 유전자 전달 복합체 트랜스펙션시킨 HEK293 세포에서의 세포에 대한 독성 실험결과를 나타내는 그래프이다.
도 5는 DNA:리포좀의 전하비가 1:3 또는 1:5로 혼합되어 제조된 유전자 전달 복합체로 트랜스펙션시킨 MCF-7 세포에서의 GFP(Green Fluorescent Protein) 형광 발현 정도를 확인한 사진이다.
도 6은 DNA:리포좀의 전하비가 1:3 또는 1:5 로 혼합되어 제조된 유전자 전달 복합체로 트랜스펙션시킨 HEK293 세포에서의 GFP(Green Fluorescent Protein) 형광 발현 정도를 확인한 사진이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1 : 신규한 리피드의 합성
1-1: 2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17- 테트라데카히드로 -10,13-디메틸-17-(6-메틸헵탄-2-일)-1H- 시클로펜타[a]페난트렌 -3-일-4- 메틸벤젠술포네이트 (화합물 2) 합성
콜레스테롤(1 g, 2.59 m㏖)을 피리딘(8 ㎖)에 녹인 후 실온에서 톨루엔포닐클로라이드(1.48 g, 7.76 m㏖)를 서서히 가하였다. 반응용액을 실온에서 24시간 동안 교반하여 반응이 완료된 후 반응용액의 온도를 0℃로 냉각하고 10%-NaHCO3 수용액(10 ㎖)을 천천히 가하였다. 생성된 흰색고체를 감압여과한 후 증류수(50 ㎖)로 세척한 후 진공 건조하여 흰색 고체의 2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카히드로-10,13-디메틸-17-(6-메틸헵탄-2-일)-1H-시클로펜타[a]페난트렌-3-일-4-메틸벤젠술포네이트(1.19 g)를 얻었다(수율 85%).
1H-NMR (400MHz, CDCl3) δ (ppm): 0.65(s, 3H), 0.92(d, 3H), 0.97(d, 3H),1.05-1.55(m, 28H), 1.67 (d, 2H), 1.79-2.01(m, 7H), 2.08(d, 1H), 2.42(s, 3H), 4.20(t, 1H), 5.26(d, 1H), 7.35(d, 2H), 7.80(d, 2H).
1-2: 3-아지도-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카히드로-10,13-디메틸-17-(6-메틸헵탄-2-일)-1H-시클로펜타[a]페난트렌(화합물3) 합성
2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카히드로-10,13-디메틸 -17-(6-메틸헵탄-2-일)-1H-시클로펜타[a]페난트렌-3-일-4-메틸벤젠술포네이트(1 g, 2.15 m㏖)를 메틸렌클로라이드(20 ㎖)에 녹인 후 0℃로 냉각하고 보론 트리플루오라이드 디메틸에테르(0.578 ㎎, 4.3 m㏖)를 서서히 적가하였다. 반응용액에 트리메틸실란아자이드(0.372 ㎎, 3.22 m㏖)를 서서히 가한 후 실온에서 3시간동안 교반한 다음 반응이 완료되면 증류수(10 ㎖)를 가하여 반응을 종결하였다. 메틸렌클로라이드 층을 분리하여 감압 하에 농축한 후 칼럼 크로마토그래피(헥산:에틸아세테이트, 10:1, v:v)로 정제하여 아이보리색의 3-아지도-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카히드로-10,13-디메틸-17-(6-메틸헵탄-2-일)-1H-시클로펜타[a]페난트렌 (0.79 g)을 얻었다(수율 89%).
1H-NMR (400MHz, CDCl3) δ (ppm): 5.38(s, 1H), 3.26-3.15(m, 1H), 2.28(d, 2H), 2.05-0.85(m, 38H), 0.68(s, 3H).
1-3: 2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카히드로-10,13-디메틸-17-(6-메틸헵탄-2-일)-1H-시클로펜타[a]페난트렌-3-아민(화합물 4) 합성
3-아지도-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카히드로-10,13-디메틸-17-(6-메틸헵탄-2-일)-1H-시클로펜타[a]페난트렌(1.5 g, 3.64 m㏖)을 테트라히드로푸란(20 ㎖)에 녹인 후 0℃로 냉각하고 리튬알루미늄보로하이드라이드(64 ㎎, 5.46 m㏖)를 용액에 서서히 가하였다. 반응용액을 실온에서 24시간 동안 교반한 후 반응이 완료되면 1N-NaOH 수용액으로 반응을 종결하였다. 반응용액에 메틸렌클로라이드(30 ㎖)를 가하여 2번 추출한 후, 유기용매를 감압하에 농축하였다. 얻어진 잔사를 칼럼크로마토그래피(메틸렌클로라이드:메탄올, 8;1, v:v)로 정제하여 노란색 오일의 2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카히드로-10,13-디메틸-17-(6-메틸헵탄-2-일)-1H-시클로펜타[a]페난트렌-3-아민(1.11 g)을 얻었다(수율 80 %).
1H-NMR (400MHz, CDCl3) δ (ppm): 5.38(s, 1H), 2.82-2.96(m, 1H), 2.28(d, 2H), 2.05-0.85(m, 38H), 0.68(s, 3H).
1-4: tert-부틸 2-(2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카히드로-10,13-디메틸-17-(6-메틸헵탄-2-일)-1H-시클로펜타[a]페난트렌-3-일아미노)에틸카바메이트(화합물 5-1) 합성
2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카히드로-10,13-디메틸-17-(6-메틸헵탄-2-일)-1H-시클로펜타[a]페난트렌-3-아민(400 ㎎, 0.934 m㏖)을 DMF (5 ㎖)에 녹이고, 포타슘카보네이트(322 ㎎, 2.33 m㏖)를 가하여 교반하였다. 반응용액의 온도를 90℃로 올린 후 tert-부틸(2-브로모에틸)카바메이트(174 ㎎, 0.78 m㏖)를 서서히 가하였다. 반응용액의 온도를 서서히 60℃로 내린 후 5시간동안 교반하였다. 반응용액의 온도를 실온으로 냉각하고 감압하에 여과한 다음 유기용매를 감압 하에 농축하였다. 농축 잔사를 칼럼 크로마토그래피(메틸렌클로라이드:메탄올, 5:1, v:v)로 정제하여 연한 노란색 오일의 tert-부틸 2-(2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카히드로-10,13-디메틸-17-(6-메틸헵탄-2-일)-1H-시클로펜타[a]페난트렌-3-일아미노)에틸카바메이트(310 ㎎)를 얻었다(수율 64 %).
1H-NMR (400MHz, CDCl3) δ (ppm): 5.26(d, 1H), 5.22(br, 1H), 4.41(t, 1H), 3.60(t, 1H), 3.23(t, 2H), 2.81(m, 2H), 2.45(m, 1H), 2.05-2.25(m, 2H), 1.95(m, 2H), 1.82(m ,3H), 1.2-1.65(m, 21H), 0.65-1.4(m, 25H), 0.65(s, 3H) ; MS (M+H) m/z 530.
1-5: tert -부틸-3-(2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17- 테라데타히드로 -10,13-디메틸-17-(6- 메틸헵탄 -2-일)-1H- 시클로펜타[a]페난트렌 -3- 일아미노 ) 프로필카바메이트 (화합물 5-2) 합성
2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카히드로-10,13-디메틸-17-(6-메틸헵탄-2-일)-1H-시클로펜타[a]페난트렌-3-아민(400 ㎎, 0.934 m㏖), tert-부틸(2-브로모프로필)카바메이트(184 ㎎, 0.78 m㏖)를 사용하여 실시예 1-4와 동일한 방법으로 합성하여 연한 노란색 오일의 tert-부틸-3-(2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-?라데타히드로-10,13-디메틸-17-(6-메틸헵탄-2-일)-1H-시클로펜타[a]페난트렌-3-일아미노)프로필카바메이트(275 ㎎)를 얻었다(수율 55%).
1H-NMR (500MHz, CDCl3) δ (ppm): 5.36(d, 1H), 5.10(br, 1H), 3.21(m, 2H), 2.65(t, 2H), 2.43(m, 1H), 2.31(m, 1H), 2.05(m, 4H), 1.65-1.85(m, 4H), 1.25-1.65(m, 29H), 0.85-1.25(m, 30H), 0.65(s, 3H) ; MS (M+H) m/z 544.
1-6: N-(2- 아미노에틸 )-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17- 테트라데카히드로 -10,13-디메틸아민-17-(6-메틸헵탄-2-일)-1H- 시클로펜타[a]페난트렌 -3-아민 트리플로로아세트산 염(화합물 6-1, Chol - NEN ) 합성
tert-부틸 2-(2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카히드로-10,13-디메틸-17-(6-메틸헵탄-2-일)-1H-시클로펜타[a]페난트렌-3-일아미노)에틸카바메이트 (100 ㎎, 0.189 m㏖)를 메틸렌클로라이드(2 ㎖)에 녹인 후 트리플루오로아세트산(2 ㎖)을 서서히 가한 다음 실온에서 3시간동안 교반하였다. 반응용액을 감압하에 농축한 다음 칼럼 크로마토그래프(메탄올:클로로포름, 10:1, v:v)로 정제하여 연한 노란색 오일의 N-(2-아미노에틸)- 2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카히드로-10,13-디메틸아민-17-(6-메틸헵탄-2-일)-1H-시클로펜타[a]페난트렌-3-아민 트리플로로아세트산 염( 92 ㎎)을 얻었다(수율 80%).
1H-NMR (400MHz, CDCl3) δ (ppm): 5.26(d, 1H), 3.05(s, 4H), 2.23(t, 2H), 1.60-1.81(m, 5H), 1.35-1.51(m, 7H), 0.75-1.25(m, 40H), 0.65(s, 3H) ; MS (M+H) m/z 430.
1-7: N-(2-아미노프로필)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17- 테트라데카히드로 -10,13-디메틸아민-17-(6-메 틸헵 탄-2-일)-1H- 시클로펜타[a]페난트렌 -3-아민 트리플로로아세트산 염(화합물 6-2, Chol - NPN ) 합성
tert-부틸-3-(2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-?라데타히드로-10,13-디메틸-17-(6-메틸헵탄-2-일)-1H-시클로펜타[a]페난트렌-3-일아미노)프로필카바메이트(100 ㎎, 0.184 m㏖)를 실시예 1-6과 같은 방법으로 반응하여 노란색 오일의 N-(2-아미노프로필)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카히드로-10,13-디메틸아민-17-(6-메틸헵탄-2-일)-1H-시클로펜타[a]페난트렌-3-아민 트리플로로아세트산 염( 82 ㎎)을 얻었다(수율 72%).
1H-NMR (400MHz, CDCl3) δ (ppm): 5.46(d, 1H), 3.05(s, 4H), 2.23(m, 2H), 1.80-2.11(m, 10H), 1.45-1.61(m, 10H), 0.85-1.40(m, 44H), 0.65(s, 3H) ; MS (M+1) m/z 443.
실시예 2 : 리포좀의 제조
상기 실시예 1에 의해 제조된 화합물 6-2와 DOPE(dioleoylphosphatidylethanolamine)(wt:wt, 1:1 ~ 1:3)을 클로로포름에 녹여 혼합한 후 질소 가스로 불어서 클로로포름을 제거한 다음, 진공하에 건조하였다(표 1). 건조된 혼합물에 증류수를 적당량 넣어 흔들어서 골고루 현탁 시킨 다음, 실온에서 초음파기(sonicator)를 이용하여 수 분 정도 처리하여 리포좀을 형성하였다. 리포좀 용액을 200 nM의 카본막을 수회 통과시켜 균질화하여 사용하였다.
화합물 6-2 및 DOPE의 질량비
No 리포좀 조성 (Chol-NPN : DOPE, wt : wt)
1 3:1
2 1:1
실시예 3 : 유전자 전달 복합체 제작 및 DNA 전달 효율
3-1 : 세포 및 세포배양
본 실시예에서는 MCF-7(breast cancer cell line)를 사용하였다. 세포주의 배양액은 RPMI 164(Welgene, Korea)이며, 배양액에 10% heat-inactivated FBS (Welgene)와 2 mM L-글루타민e, 100 units/㎖ 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신streptomycin(Welgene)을 첨가하여 37℃, 5% CO₂세포 배양기에서 배양하였다. 실험에 사용된 모든 세포는 배양 과정에서 적정한 세포 농도를 유지하도록 유의하였으며, 실험에 사용될 세포는 전날 신선한 배양액으로 교체한 후 사용하였다.
3-2 : 리포터 플라스미드 벡터 ( Reporter plasmid vector )의 제작
루시퍼라제(Luciferase) 또는 GFP(green fluorecence protein) 유전자를 각각 포함하는 재조합 플라스미드(pcDNA-Luc, pCMVTnT-CFP)를 XL1-Blue E. Coli를 사용하여 증식시킨 후 maxi-kit(Qiagen Inc., USA)으로 분리하여 사용하였다(참조: J. Microbiol. Biotechnol. (2011), 21(1), 93-99 Synthesis and Optimization of Cholesterol-Based Diquaternary Ammonium Gemini Surfactant (Chol-GS) as a New Gene Delivery Vector).
3-3 : 핵산체 및 양이온 리포좀 복합체의 형성
핵산체로서 상기 리포터 플라스미드 pcDNA3 벡터와 상기 실시예 2에서 제조된 양이온 리포좀을 사용하여 유전자 전달 복합체를 제조하였다. 상기 유전자 전달 복합체는 혈청이 있는 TOM 배지(Welgene)에서 제작하였다.
혼합 시, 리포터 플라스미드 pcDNA3 벡터와 양이온 리포좀과 혼합하여 상온에서 15분간 반응시켜 유전자 전달 복합체를 얻었으며, DNA : 리포좀의 전하비가 1:3 및 1:5가 되도록 조절하였다.
한편 대조구로는 리포펙타민을 사용하여 비교 실험을 진행하였다.
3-4 : 유전자 전달 복합체의 트랜스펙션( Transfection )
실험 하루 전날 배양된 MCF-7 또는 HEK293 세포주를 48-웰 플레이트에 적당량 분주한 후 상기 유전자 전달 복합체를 처리하여 세포에 트랜스펙션 시킨 후 37℃에서 24시간 동안 배양하였다.
3-5 : 유전자 전달 복합체의 전달 효율
루시퍼라제(Luciferase) 활성은 하기와 같이 측정되었다. 상기 트랜스팩션된 세포들을 PBS 완충액으로 2번 세척하고, 100 ㎕의 1× CCLR (cell culture lysis reagent, 25 mM Tris-phosphate (pH 7.8), 2 mM DTT, 2 mM 1,2- diaminocyclohexane-N'N'N'-tetraacetic acid, 10% glycerol, 1% Triton X-100) 용액으로 용해시켰다. 이를 통하여 얻은 세포 용해액을 12,000 g에서 1분간 원심분리한 후, BCATM Protein Assay(PIERCE, USA)로 단백질 정량하여 루시퍼라제 활성을 측정하였다. 상기 세포 용해액에 루시퍼라제 분석 버퍼(25 mM Glycylglycine pH7.8, 15 mM Potassium Phosphate pH 7.8, 15 mM MgSO4, 4 mM EGTA, 2 mM ATP, 1 mM DTT)를 100 ㎕ 가한 후, 20 ㎕의 루시퍼린(luciferin)을 첨가하였다. 루시퍼라제 활성은 형광 루미노메터(Luminometer, Berthold Detection Systems, Germany)로 10초간 측정하였으며, 그 결과를 도 2 및 3에 나타내었다.
한편, GFP의 검출은 세포주룰 PBS 완충액으로 2번 세척한 후, 형광 도립현미경으로 세포 내 GFP 유전자 발현 양상을 확인함으로써 이루어졌다. 형광 도립현미경을 통한 유전자 발현 양상을 도 4 내지 5에 나타내었다.
상기 도 2 내지 5 에서 보는 바와 같이 대조군에 비하여 현저하게 우수한 활성을 나타내었다. 결국 상기 실험 결과를 통하여 상기 유전자 전달 복합체가 우수한 세포 내로의 DNA 전달 능력이 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 4 : HEK293 세포에 대한 독성 실험
HEK293 세포를 48 웰 플레이트에서 6 x 104개씩 seeding한 후 10% FBS(fetal bovine serum)을 함유하는 MEM(minimum essential medium) 배지 하에 37℃, 5% 이산화탄소 조건에서 배양한 다음, DNA 와 양이온성 리포좀 복합체(DNA:리포좀, 1:3 또는 1:5)를 첨가하였다. 24시간 동안 세포를 배양한 다음, 각 웰에 5 ㎎/㎖ 농도의 MTT(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl tetrazonium bromide)를 10 ㎕씩 첨가한 후 2시간 가량 더 배양한 후 배지를 제거한다. DMSO(dimethyl sulfoxide) 250 ㎕를 각 웰에 첨가하여 반응물을 녹인 후 98 웰 플레이트에 200 ㎕씩 분취하여 550 ㎚에서 흡광도를 측정하여 대조군과 비교하였다.
상기 도 6에서 보는 바와 같이 리포좀 1, 2가 대조군에 비하여 세포독성이 매우 낮은 것으로 나타났다. 따라서 우수한 유전자 전달체로 개발 가능함을 확인 할 수 있었다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (17)

  1. 하기 화학식 1의 양이온 리피드를 포함하는 유전자 전달 복합체:
    화학식 1
    Figure 112013045743775-pat00002

    상기 화학식에서,
    X는 트리플루오로아세트산염, 아세트산염 및 메탄술포닐산염으로 구성된 군으로부터 선택되는 유기산염 또는 탄산염, 염산염, 황산염, 초산염, 인산염, 불산염, 과염소산염 및 차아염소산염으로 구성된 군으로부터 선택되는 무기산염이며;
    m은 1-2의 정수이며;
    n은 1-5의 정수이다.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 복합체는 콜레스테롤, DOPE(dioleoylphosphatidylethanolamine) 및 DOPC(dioleoylphosphatidylcholine)로 구성된 군으로부터 선택되는 중성 리피드를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 복합체.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 복합체는 양이온 리피드 및 중성 리피드를 1:1 내지 10:1의 질량비로 포함하는 것을 특징으로 하는 복합체.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 X는 트리플루오로아세트산염 또는 아세트산염인 것을 특징으로 하는 복합체.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 복합체는 전달하고자 하는 유전자:양이온 리피드를 1:1 내지 1:10의 전하비로 포함하는 것을 특징으로 하는 복합체.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 유전자는 DNA, RNA 또는 플라스미드인 것을 특징으로 하는 복합체.
  7. 다음의 단계를 포함하는 유전자 전달용 양이온 리피드를 제조하는 방법:
    (a) 콜레스테롤의 3-히드록시기에 토실기를 도입하는 단계;
    (b) 상기 단계(a)에서 생성된 화합물의 토실기를 아자이드기로 치환하는 단계;
    (c) 상기 단계(b)에서 생성된 화합물의 아자이드기를 아민기로 환원하는 단계;
    (d) 상기 단계(c)에서 생성된 화합물의 아민기에 아민 보호기가 결합된 알킬아민을 도입하는 단계; 및
    (e) 상기 단계(d)에서 생성된 화합물에 유기산 또는 무기산을 처리하여 아민 보호기를 제거하고 리피드 염의 형태로 수득하는 단계.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 토실기의 도입은 콜레스테롤을 유기용매에 녹이고 피리딘을 가한 후 톨루엔술포닐클로라이드를 가하여 콜레스테롤의 3-히드록시기에 톨루엔술포닐기를 도입하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 7 항에 있어서, 상기 아자이드기의 아민기로의 환원은 상기 단계(b)에서 생성된 화합물을 유기용매에 녹인 후 환원제를 가하여 아자이드기를 아민기로 환원하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 7 항에 있어서, 상기 아민 보호기는 t-부톡시카보닐(Boc), 9H-플로렌-9-일메톡시카보닐(Fmoc), 트리틸(trityl), 벤질, 클로로아세틸, 벤질옥시카보닐, p-메톡시벤질옥시카보닐, 포밀, 트리플루오로아세틸, p-톨루엔술포닐, 벤젠술포닐, 메탄술포닐, p-니트로벤질옥시카보닐 또는 2,2,2-트리클로로에톡시카보닐인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 7 항에 있어서, 상기 유기산은 트리플루오로아세트산, 아세트산 또는 메탄술포닐산인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 7 항에 있어서, 상기 무기산은 탄산, 염산, 황산, 초산, 인산, 불산, 과염소산 또는 차아염소산인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 7 항의 방법에 따라 제조된 양이온 리피드를 이용하여 리포좀을 형성하는 단계를 포함하는 유전자 전달 복합체의 제조 방법.
  14. 제 13 항에 있어서, 상기 리포좀의 형성은 양이온 리피드와 중성 리피드를 혼합하여 형성하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 13 항에 있어서, 상기 방법은 유전자와 리포좀을 혼합하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 15 항에 있어서, 상기 유전자:리포좀의 전하비는 1:1 내지 1:10인 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 1 항의 양이온 리피드를 포함하는 유전자 전달 복합체를 투여하는 단계를 포함하는 인간을 제외한 동물에 유전자를 전달하는 방법.
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