JP2012509258A - 核酸送達系のための分岐カチオン性脂質 - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
本出願は、その内容が参照により本明細書に組み込まれている、2008年11月17日出願の米国仮特許出願第61/115,307号の優先権の利益を主張するものである。
R1はコレステロール又はその類似体であり、
Y1、Y2及びY5は独立にO、S又はNR4であり、
Y3及びY4は独立にO、S又はNR5であり、
L1は、一つ又は複数の炭素がNR6、O、S又はC(=Y)(YはO、S又はNR4である)で置き換えられている、置換、飽和又は不飽和、分岐又は直鎖のC3〜50アルキルを有するスペーサーであり、
(a)、(c)及び(e)は独立に0又は1であり、
(b)は0又は正の整数であり、
(d)は0又は正の整数であり、
XはC又はPであり、
Q1はH、C1〜6アルキル、NH2又は-(L11)d1-R11であり、
Q2はH、C1〜6アルキル、NH2又は-(L12)d2-R12であり、
Q3は(=O)、H、C1〜6アルキル、NH2又は-(L13)d3-R13であるが、
但し、
(i)XがCであるとき、Q3は(=O)ではなく、
(ii)XがPであるとき、(e)は0であり、
L11、L12及びL13は独立に選択される二官能性スペーサーであり、
(d1)、(d2)及び(d3)は独立に0又は正の整数であり、
R11、R12及びR13は独立に水素、NH2、
Y'4はO、S又はNR'5であり、
Y'5は独立にO、S又はNR'4であり、
(c')及び(e')は独立に0又は1であり、
(d')は0又は正の整数であり、
X'はC又はPであり、
Q'1はH、C1〜6アルキル、NH2又は-(L'11)d'1-R'11であり、
Q'2はH、C1〜6アルキル、NH2又は-(L'12)d'2-R'12であり、
Q'3は孤立電子対、(=O)、H、C1〜6アルキル、NH2又は-(L'13)d'3-R'13であるが、
但し、
(i)X'がCであるとき、Q'3は(=O)ではなく、
(ii)X'がPであるとき、(e')は0であり、
L'11、L'12及びL'13は独立に選択される二官能性スペーサーであり、
(d'1)、(d'2)及び(d'3)は独立に0又は正の整数であり、
R'11、R'12及びR'13は独立に水素、NH2、
R2〜7、R'2〜5及びR'7は水素、アミノ、置換アミノ、C1〜6アルキル、C2〜6アルケニル、C2〜6アルキニル、C3〜19分岐アルキル、C3〜8シクロアルキル、C1〜6置換アルキル、C2〜6置換アルケニル、C2〜6置換アルキニル、C3〜8置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、C1〜6ヘテロアルキル及び置換C1〜6ヘテロアルキルの中から独立に選択されるが、
但し、Q1〜3及びQ'1〜3の少なくとも一つ又は複数は、
を有する。
(i)式(I)のカチオン性脂質、
(ii)融合性脂質及び
(iii)PEG脂質
を含む。
1.概要
本明細書に記載のカチオン性脂質は、式(I):
R1はコレステロール又はその類似体であり、
Y1、Y2及びY5は独立にO、S又はNR4、好ましくはOであり、
Y3及びY4は独立にO、S又はNR5、好ましくはO又はNR5であり、
L1は、一つ又は複数の炭素がNR6、O、S又はC(=Y)(YはO、S又はNR、好ましくはOである)、好ましくはOで置き換えられている、置換、飽和又は不飽和、分岐又は直鎖のC3〜50アルキル(即ち、C3〜40アルキル、C3〜20アルキル、C3〜15アルキル、C3〜10アルキル等)を有するスペーサーであり、
(a)、(c)及び(e)は独立に0又は1であり、
(b)は0又は正の整数、好ましくは0又は約1〜約5(例えば0、1、2、3、4、5)の正の整数、より好ましくは0又は約1〜約3(例えば0、1、2、3)の整数であるが、
但し、(b)が0であるとき、(a)及び(c)が同時に正の整数であることはなく、
(d)は0又は正の整数、好ましくは0又は約1〜約5(例えば0、1、2、3、4、5)の正の整数であり、
XはC又はPであり、
Q1はH、C1〜6アルキル、NH2又は-(L11)d1-R11であり、
Q2はH、C1〜6アルキル、NH2又は-(L12)d2-R12であり、
Q3は(=O)、H、C1〜6アルキル、NH2又は-(L13)d3-R13であるが、
但し、
(i)XがCであるとき、Q3は(=O)ではなく、
(ii)XがPであるとき、(e)は0であり、
L11、L12及びL13は独立に選択される二官能性スペーサーであり、
(d1)、(d2)及び(d3)は独立に0又は正の整数、好ましくは0又は約1〜約9(例えば1、2、3、4、5、6)の整数、より好ましくは0又は約1〜約3(例えば1、2、3、4)の正の整数であり、
R11、R12及びR13は独立に水素、NH2、
Y'4はO、S又はNR'5、好ましくはO又はNR'5であり、
Y'5は独立にO、S又はNR'4、好ましくはOであり、
(c')及び(e')は独立に0又は1であり、
(d')は0又は正の整数、好ましくは0又は約1〜約10(例えば1、2、3、4、5、6)の正の整数、より好ましくは0又は約1〜約4(例えば1、2、3)の正の整数であり、
X'はC又はPであり、
Q'1はH、C1〜6アルキル、NH2又は-(L'11)d'1-R'11であり、
Q'2はH、C1〜6アルキル、NH2又は-(L'12)d'2-R'12であり、
Q'3は(=O)、H、C1〜6アルキル、NH2又は-(L'13)d'3-R'13であるが、
但し、
(i)X'がCであるとき、Q'3は(=O)ではなく、
(ii)X'がPであるとき、(e')は0であり、
L'11、L'12及びL'13は独立に選択される二官能性スペーサーであり、
(d'1)、(d'2)及び(d'3)は独立に0又は正の整数、好ましくは0、1、2、3、4であり、
R'11、R'12及びR'13は独立に水素、NH2、
R2〜7、R'2〜5及びR'7は水素、アミノ、置換アミノ、C1〜6アルキル、C2〜6アルケニル、C2〜6アルキニル、C3〜19分岐アルキル、C3〜8シクロアルキル、C1〜6置換アルキル、C2〜6置換アルケニル、C2〜6置換アルキニル、C3〜8置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、C1〜6ヘテロアルキル及び置換C1〜6ヘテロアルキル、好ましくはH、メチル、エチル及びプロピル、より好ましくはHの中から独立に選択されるが、
但し、Q1〜3及びQ'1〜3の少なくとも一つ又は複数(例えば一つ、二つ、三つ)は、
を有する。
Y6及びY7は独立にO、S又はNR29、好ましくはO又はNHであり
R21〜26及びR29は水素、C1〜6アルキル、C3〜12分岐アルキル、C3〜8シクロアルキル、C1〜6置換アルキル、C3〜8置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、C1〜6ヘテロアルキル、置換C1〜6ヘテロアルキル、C1〜6アルコキシ、フェノキシ及びC1〜6ヘテロアルコキシ、好ましくは水素、メチル、エチル及びプロピルの中から独立に選択され、
(t1)、(t2)、(t3)、(t4)及び(t7)は独立に0又は正の整数、好ましくは約1〜約10(例えば1、2、3、4、5)、より好ましくは1、2、3であり、
(t1)が2以上であるとき、R21及びR22は各発生時に独立に同一又は異なり、
(t2)及び(t7)が独立に2以上であるとき、R23、R24及びY7は各発生時に独立に同一又は異なり、
(t3)が2以上であるとき、R21、R22、R23、R24及びY6は各発生時に独立に同一又は異なり、
(t4)が2以上であるとき、R25及びR26は各発生時に独立に同一又は異なり、
全ての他の変数は上に定義されたとおりである]
を有する。
本発明の一態様において、スペーサーL1は、一つ又は複数の炭素がNR6、O、S又はC(=Y)(好ましくはO又はNH)で場合により置き換えられるが、置き換えられる炭素が70%を超えない(即ち、60%、50%、40%、30%、20%、10%未満)、置換、飽和又は不飽和、分岐又は直鎖のC3〜50アルキル(即ち、C3〜40アルキル、C3〜20アルキル、C3〜15アルキル、C3〜10アルキル等)を有する二官能性リンカーである。
-(CR21R22)t1-[C(=Y6)]e1-(Y4)c-(CR2R3)d-C(=Y5)e-、
-(CR21R22)t1Y7-(CR23R24)t2-(Y8)e2-[C(=Y6)]e1-(Y4)c-(CR2R3)d-C(=Y5)e-、
-(CR21R22CR23R24Y7)t3-[C(=Y6)]e1-(Y4)c-(CR2R3)d-C(=Y5)e-、
-(CR21R22CR23R24Y7)t3(CR25R26)t4-(Y8)e2-[C(=Y6)]e1-(Y4)c-(CR2R3)d-C(=Y5)e-、
-(CR21R22CR23R24Y7)t3(CR25R26)t4-(Y8)e2-[C(=Y6)]e1-(CR27R28)t1-(Y4)c-(CR2R3)d-C(=Y5)e-、
-[(CR21R22CR23R24)t5Y7]t6(CR25R26)t4-(Y8)e2-[C(=Y6)]e1-(Y4)c-(CR2R3)d-C(=Y5)e-、
-(CR21R22)t1-[( CR23R24)t2Y7]t7(CR25R26)t4-(Y4)c-(CR2R3)d-C(=Y5)e-、及び
-(CR21R22)t1-[( CR23R24)t2Y7]t7(CR25R26)t4-(Y8)e2-[C(=Y6)]e1-(Y4)c-(CR2R3)d-C(=Y5)e-
[式中、
Y6はO、NR29又はS、好ましくはOであり、
Y7〜8は独立にO、NR29又はS、好ましくはO又はNR29であり、
R21〜29は水素、C1〜6アルキル、C3〜12分岐アルキル、C3〜8シクロアルキル、C1〜6置換アルキル、C3〜8置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、C1〜6ヘテロアルキル、置換C1〜6ヘテロアルキル、C1〜6アルコキシ、フェノキシ及びC1〜6ヘテロアルコキシ、好ましくはH、メチル、エチル及びプロピル、より好ましくはHからなる群から独立に選択され、
(t1)、(t2)、(t3)、(t4)、(t5)、(t6)及び(t7)は各々独立に0又は正の整数(例えば1、2、3、4)であり、
各(c)、(e)、(e1)及び(e2)は独立に0又は1であり、
全ての他の変数は上に定義されたとおりである]
の中から独立に選択される。
-(CH2)4-C(=O)-、
-(CH2)5-C(=O)-、
-(CH2)6-C(=O)-、
-CH2CH2O-CH2O-C(=O)-、
-(CH2CH2O)2-CH2O-C(=O)-、
-(CH2CH2O)3-CH2O-C(=O)-、
-(CH2CH2O)2-C(=O)-、
-CH2CH2O-CH2CH2NH-C(=O)-、
-(CH2CH2O)2-CH2CH2NH-C(=O)-、
-(CH2CH2O)2-CH2CH2NH-C(=O)-CH2NHC(=O)-、
-(CH2CH2O)2-CH2CH2O-C(=O)-、
-CH2-O-CH2CH2O-CH2CH2NH-C(=O)-、
-CH2-O-(CH2CH2O)2-CH2CH2NH-C(=O)-、
-CH2-O-CH2CH2O-CH2C(=O)-、
-CH2-O-(CH2CH2O)2-CH2C(=O)-、
-(CH2)4-C(=O)NH-、
-(CH2)5-C(=O)NH-、
-(CH2)6-C(=O)NH-、
-CH2CH2O-CH2O-C(=O)-NH-、
-(CH2CH2O)2-CH2O-C(=O)-NH-、
-(CH2CH2O)3-CH2O-C(=O)-NH-、
-(CH2CH2O)2-C(=O)-NH-、
-(CH2CH2O)2-CH2C(=O)-NH-、
-CH2CH2O-CH2CH2NH-C(=O)-NH-、
-(CH2CH2O)2-CH2CH2NH-C(=O)-NH-、
-CH2-O-CH2CH2O-CH2CH2NH-C(=O)-NH-、
-CH2-O-(CH2CH2O)2-CH2CH2NH-C(=O)-NH-、
-CH2-O-CH2CH2O-CH2C(=O)-NH-、
-CH2-O-(CH2CH2O)2-CH2C(=O)-NH-、
-(CH2CH2O)2-、
-(CH2CH2O)3-、
-CH2CH2O-CH2O-、
-(CH2CH2O)2-CH2CH2NH-、
-(CH2CH2O)3-CH2CH2NH-、
-CH2CH2O-CH2CH2NH-、
-(CH2CH2O)2-CH2CH2NH-、
-CH2-O-CH2CH2O-CH2CH2NH-、
-CH2-O-(CH2CH2O)2-CH2CH2NH-、
-CH2-O-CH2CH2O-、及び
-CH2-O-(CH2CH2O)2-
の中から選択される。
別の実施形態において、二官能性スペーサーL11〜13及びL'11〜13は、グアニジン、DBU、DBN等のカチオン性部分に結合できる末端二官能性リンカーである。二官能性リンカーL11〜13及びL'11〜13は、
-(CR'21R'22)q1(Y'8)v'[C(=Y'9)]v(CR'23R'24)q2-、
-(CR'21R'22)q1(Y'8)v'[C(=Y'9)]vY'10(CR'23R'24)q2-、
-(CR'21R'22)q1(Y'8)v'[C(=Y'9)]v(CR'23R'24)q2-Y'11-(CR'23R'24)q3-、
-(CR'21R'22)q1(Y'8)v'[C(=Y'9)]vY'10(CR'23R'24)q2-Y'11-(CR'23R'24)q3-、
-(CR'21R'22)q1(Y'8)v'[C(=Y'9)]v(CR'23R'24CR'25R'26Y'12)q4(CR'27CR'28)q5-、
-(CR'21R'22)q1(Y'8)v'[C(=Y'9)]vY'10(CR'23R'24CR'25R'26Y'12)q4(CR'27CR'28)q5-、及び
Y'8及びY'10〜12は独立にO、NR'30又はS、好ましくはO又はNR'30であり、
Y'9は独立にO、NR'31又はS、好ましくはOであり、
R'21〜31は各発生時に水素、C1〜6アルキル、C3〜12分岐アルキル、C3〜8シクロアルキル、C1〜6置換アルキル、C3〜8置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、C1〜6ヘテロアルキル、置換C1〜6ヘテロアルキル、C1〜6アルコキシ、フェノキシ及びC1〜6ヘテロアルコキシ、好ましくは水素、メチル、エチル及びプロピルの中から独立に選択され、
(q1)、(q2)、(q3)、(q4)、(q5)及び(q6)は独立に0又は約1〜約10、好ましくは1、2、3、4、5、6の正の整数であり、
(v)及び(v')は独立に0又は1である]
の中から独立に選択される。
-CH2-、
-(CH2)2-、
-(CH2)4-、
-(CH2)3-、
-O(CH2)2-
-C(=O)O(CH2)3-、
-C(=O)NH(CH2)3-、
-C(=O)(CH2)2-、
-C(=O)(CH2)3-、
-CH2-C(=O)-O(CH2)3-、
-CH2-C(=O)-NH(CH2)3-、
-CH2-OC(=O)-O(CH2)3-、
-CH2-OC(=O)-NH(CH2)3-、
-(CH2)2-C(=O)-O(CH2)3-、
-(CH2)2-C(=O)-NH(CH2)3-、
-CH2C(=O)O(CH2)2-O-(CH2)2-、
-CH2C(=O)NH(CH2)2-O-(CH2)2-、
-(CH2)2C(=O)O(CH2)2-O-(CH2)2-、
-(CH2)2C(=O)NH(CH2)2-O-(CH2)2-、
-CH2C(=O)O(CH2CH2O)2CH2CH2-、及び
-(CH2)2C(=O)O(CH2CH2O)2CH2CH2-
の中から独立に選択される。
本明細書に記載の式(I)のカチオン性脂質を調製する方法は、アミン官能化コレステロール(官能化コレステロール)と1H-ピラゾール-1-カルボキサミジンとを反応させて、グアニジン部分を得ることを含む。コレステロールに結合しているアミンは第1級及び/又は第2級アミンであってよく、1H-ピラゾール-1-カルボキサミジン中のアミンは非置換又は置換であってよい。
1.概要
本発明の一態様において、ナノ粒子組成物は、式(I)のカチオン性脂質を含有する。
本発明の一つの好ましい態様において、式(I)のカチオン性脂質は、ナノ粒子組成物中に含まれる。本発明のこの態様によれば、核酸(即ち、オリゴヌクレオチド)の送達のためのナノ粒子組成物は、融合性脂質及びPEG脂質を更に含むことができる。
N-[1-(2,3-ジオレオイルオキシ)プロピル]-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド(DOTMA);
1,2-ビス(オレオイルオキシ)-3-3-(トリメチルアンモニウム)プロパン又はN-(2,3-ジオレオイルオキシ)プロピル)-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド(DOTAP);
1,2-ビス(ジミルストイルオキシ)-3-3-(トリメチルアンモニア)プロパン(DMTAP);
1,2-ジミリスチルオキシプロピル-3-ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロミド又はN-(1,2-ジミリスチルオキシプロパ-3-イル)-N,N-ジメチル-N-ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド(DMRIE);
ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド又はN,N-ジステアリル-N,N-ジメチルアンモニウムブロミド(DDAB);
3-(N-(N',N'-ジメチルアミノエタン)カルバモイル)コレステロール(DC-コレステロール);
3β-[N',N'-ジグアニジノエチル-アミノエタン)カルバモイルコレステロール(BGTC);
2-(2-(3-(ビス(3-アミノプロピル)アミノ)プロピルアミノ)アセトアミド)-N,N-ジテトラデシルアセトアミド(RPR209120);
1,2-ジアルケノイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン(即ち、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン及び1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン);
テトラメチルテトラパルミトイルスペルミン(TMTPS);
テトラメチルテトラオレイルスペルミン(TMTOS);
テトラメトリテトララウリルスペルミン(TMTLS);
テトラメチルテトラミリスチルスペルミン(TMTMS);
テトラメチルジオレイルスペルミン(TMDOS);
2,5-ビス(3-アミノプロピルアミノ)-N-(2-(ジオクタデシルアミノ)-2-オキソエチル)ペンタンアミド(DOGS);
2,5-ビス(3-アミノプロピルアミノ)-N-(2-(ジ(Z)-オクタデカ-9-ジエニルアミノ)-2-オキソエチル)ペンタンアミド(DOGS-9-エン);
2,5-ビス(3-アミノプロピルアミノ)-N-(2-(ジ(9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニルアミノ)-2-オキソエチル)ペンタンアミド(DLinGS);
N4-スペルミンコレステリルカルバメート(GL-67);
(9Z,9'Z)-2-(2,5-ビス(3-アミノプロピルアミノ)ペンタンアミド)プロパン-1,3-ジイル-ジオクタデカ-9-エノエート(DOSPER);
2,3-ジオレイルオキシ-N-[2(スペルミンカルボキサミド)エチル]-N,N-ジメチル-1-プロパンアミニウムトリフルオロアセテート(DOSPA);
1,2-ジミリストイル-3-トリメチルアンモニウム-プロパン;1,2-ジステアロイル-3-トリメチルアンモニウム-プロパン;
ジオクタデシルジメチルアンモニウム(DODMA);
ジステアリルジメチルアンモニウム(DSDMA);
N,N-ジオレイル-N,N-ジメチルアンモニウムクロリド(DODAC);それらの薬学的に許容される塩及び混合物が挙げられる。
本発明の別の態様において、ナノ粒子組成物は融合性脂質を含有する。融合性脂質としては、中性で帯電していない両性イオン性及びアニオン性の脂質等の非カチオン性脂質が挙げられる。本発明の目的のために、「融合性脂質」及び「非カチオン性脂質」という用語は互換的である。
1,2-ジラウロイル-sn-グリセロール(DLG);
1,2-ジミリストイル-sn-グリセロール(DMG);
1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロール(DPG);
1,2-ジステアロイル-sn-グリセロール(DSG);
1,2-ジラウロイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジン酸(DLPA);
1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジン酸(DMPA);
1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジン酸(DPPA);
1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジン酸(DSPA);
1,2-ジアラキドイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DAPC);
1,2-ジラウロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DLPC);
1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DMPC);
1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン(DPePC);
1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン又はジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC);
1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン又はジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC);
1,2-ジラウロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DLPE);
1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン又はジミリストイルホスホエタノールアミン(DMPE);
1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン又はジパルミトイルホスファチジル-エタノールアミン(DPPE);
1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン又はジステアロイルホスファチジル-エタノールアミン(DSPE);
1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン又はジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE);
1,2-ジラウロイル-sn-グリセロ-3-ホスホグリセロール(DLPG);
1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホグリセロール(DMPG)又は1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-sn-1-グリセロール(DMP-sn-1-G);
1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホグリセロール又はジパルミトイルホスファチジルグリセロール(DPPG);
1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホグリセロール(DSPG)又は1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-sn-1-グリセロール(DSP-sn-1-G);
1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-L-セリン(DPPS);
1-パルミトイル-2-リノレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(PLinoPC);
1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン又はパルミトイルオレオイルホスファチジルコリン(POPC);
1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホグリセロール(POPG);
1-パルミトイル-2-lyso-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(P-lyso-PC);
1-ステアロイル-2-lyso-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(S-lyso-PC);
ジフィタノイルホスファチジルエタノールアミン(DPhPE);
1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン又はジオレオイルホスファチジルコリン(DOPC);
1,2-ジフィタノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DPhPC)、
ジオレオイルホスファチジルグリセロール(DOPG);
パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン(POPE);
ジオレオイル-ホスファチジルエタノールアミン4-(N-マレイミドメチル)-シクロヘキサン-1-カルボキシレート(DOPE-mal);
16-O-モノメチルPE;
16-O-ジメチルPE;
18-1-trans PE;1-ステアロイル-2-オレオイル-ホスファチジエタノールアミン(SOPE);
1,2-ジエライドイル-sn-グリセロ-3-ホホエタノールアミン(transDOPE);及びそれらの薬学的に許容される塩及びそれらの混合物の中から選択される。融合性脂質の詳細は、米国特許出願公開第2007/0293449号及び第2006/0051405号に記載されている。
1,2-ジデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DDPC、C10:0、C10:0);
1,2-ジラウロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DLPC、C12:0、C12:0);
1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DMPC、C14:0、C14:0);
1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DPPC、C16:0、C16:0);
1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DSPC、C18:0、C18:0);
1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DOPC、C18:1、C18:1);
1,2-ジエルコイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DEPC、C22:1、C22:1);
1,2-ジエイコサペンタエノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(EPA-PC、C20:5、C20:5);
1,2-ジドコサヘキサエノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DHA-PC、C22:6、C22:6);
1-ミリストイル-2-パルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(MPPC、C14:0、C16:0);
1-ミリストイル-2-ステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(MSPC、C14:0、C18:0);
1-パルミトイル-2-ステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(PMPC、C16:0、C14:0);
1-パルミトイル-2-ステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(PSPC、C16:0、C18:0);
1-ステアロイル-2-ミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(SMPC、C18:0、C14:0);
1-ステアロイル-2-パルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(SPPC、C18:0、C16:0);
1,2-ミリストイル-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(MOPC、C14:0、C18:0);
1,2-パルミトイル-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(POPC、C16:0、C18:1);
1,2-ステアロイル-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(POPC、C18:0、C18:1)、及びそれらの薬学的に許容される塩及びそれらの混合物が挙げられる。
1-ミリストイル-2-lyso-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(M-LysoPC、C14:0);
1-パルミトイル-2-lyso-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(P-LysoPC、C16:0);
1-ステアロイル-2-lyso-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(S-LysoPC、C18:0)、及びそれらの薬学的に許容される塩及びそれらの混合物が挙げられる。
水素化大豆ホスファチジルグリセロール(HSPG);
非水素化卵ホスファチジルグリセロール(EPG);
1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホグリセロール(DMPG、C14:0、C14:0);
1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホグリセロール(DPPG、C16:0、C16:0);
1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホグリセロール(DSPG、C18:0、C18:0);
1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホグリセロール(DOPG、C18:1、C18:1);
1,2-ジエルコイル-sn-グリセロ-3-ホスホグリセロール(DEPG、C22:1、C22:1);
1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホグリセロール(POPG、C16:0、C18:1)、及びそれらの薬学的に許容される塩及びそれらの混合物の中から選択される。
1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジン酸(DMPA、C14:0、C14:0);
1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジン酸(DPPA、C16:0、C16:0);
1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジン酸(DSPA、C18:0、C18:0)、及びそれらの薬学的に許容される塩及びそれらの混合物が挙げられる。
水素化大豆ホスファチジルエタノールアミン(HSPE);
非水素化卵ホスファチジルエタノールアミン(EPE);
1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DMPE、C14:0、C14:0);
1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DPPE、C16:0、C16:0);
1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DSPE、C18:0、C18:0);
1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DOPE、C18:1、C18:1);
1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DEPE、C22:1、C22:1);
1,2-ジエルコイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(POPE、C16:0、C18:1)、及びそれらの薬学的に許容される塩及びそれらの混合物が挙げられる。
1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-L-セリン(DMPS、C14:0、C14:0);
1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-L-セリン(DPPS、C16:0、C16:0);
1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-L-セリン(DSPS、C18:0、C18:0);
1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-L-セリン(DOPS、C18:1、C18:1);
1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-3-ホスホ-L-セリン(POPS、C16:0、C18:1)、及びそれらの薬学的に許容される塩及びそれらの混合物が挙げられる。
ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)、
ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン(DSPE)、
パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン(POPE)、
卵ホスファチジルコリン(EPC)、
ジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)、
ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC)、
ジオレオイルホスファチジルコリン(DOPC)、
パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン(POPC)、
ジパルミトイルホスファチジルグリセロール(DPPG)、
ジオレオイルホスファチジルグリセロール(DOPG)、
ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン4-(N-マレイミドメチル)-シクロヘキサン-1-カルボキシレート(DOPE-mal)、コレステロール、それらの薬学的に許容される塩及び混合物が挙げられる。
本発明の別の態様において、本明細書に記載のナノ粒子組成物はPEG脂質を含有する。PEG脂質は、本明細書に記載のナノ粒子の循環を延長し、身体からのナノ粒子の早期排出を防ぐ。PEG脂質は、免疫原性を減少させ、ナノ粒子の安定性を高める。
−O−(CH2CH2O)n−
(式中、(n)は、PEG脂質のポリマー部分が約200〜約100000ダルトン、好ましくは約200〜約20000ダルトンの数平均分子量を有するように、約5〜約2300、好ましくは約5〜約460の正の整数である)で一般に表される。(n)は、ポリマーの重合度を表し、ポリマーの分子量に依存する。
−Y71−(CH2CH2O)n−CH2CH2Y71−、
−Y71−(CH2CH2O)n−CH2C(=Y72)−Y71−、
−Y71−C(=Y72)−(CH2)a2−Y73−(CH2CH2O)n−CH2CH2−Y73−(CH2)a2−C(=Y72)−Y71−及び
−Y71−(CR71R72)a2−Y73−(CH2)b2−O−(CH2CH2O)n−(CH2)b2−Y73−(CR71R72)a2−Y71−
[式中、
Y71及びY73は独立にO、S、SO、SO2、NR73又は結合であり、
Y72はO、S又はNR74であり、
R71〜74は水素、C1〜6アルキル、C2〜6アルケニル、C2〜6アルキニル、C3〜19分岐アルキル、C3〜8シクロアルキル、C1〜6置換アルキル、C2〜6置換アルケニル、C2〜6置換アルキニル、C3〜8置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、C1〜6ヘテロアルキル、置換C1〜6ヘテロアルキル、C1〜6アルコキシ、アリールオキシ、C1〜6ヘテロアルコキシ、ヘテロアリールオキシ、C2〜6アルカノイル、アリールカルボニル、C2〜6アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、C2〜6アルカノイルオキシ、アリールカルボニルオキシ、C2〜6置換アルカノイル、置換アリールカルボニル、C2〜6置換アルカノイルオキシ、置換アリールオキシカルボニル、C2〜6置換アルカノイルオキシ及び置換アリールカルボニルオキシ、好ましくは水素、メチル、エチル又はプロピルから独立に選択され、
(a2)及び(b2)は独立に0又は正の整数、好ましくは0又は約1〜約6(即ち、1、2、3、4、5、6)の整数、より好ましくは1又は2であり、
(n)は約5〜約2300、好ましくは約5〜約460の整数である]
で表すことができる。
本明細書に記載のナノ粒子組成物は、様々な核酸を細胞又は組織に送達するために使用できる。核酸としては、プラスミド及びオリゴヌクレオチドが挙げられる。好ましくは、本明細書に記載のナノ粒子組成物は、オリゴヌクレオチドの送達のために使用される。
LNA(ロック核酸);
PNA(ペプチド骨格を有する核酸);
低分子干渉RNA(siRNA);
マイクロRNA(miRNA);
ペプチド骨格を有する核酸(PNA);
ホスホロジアミデートモルホリノオリゴヌクレオチド(PMO);
トリシクロ−DNA;
デコイODN(二本鎖オリゴヌクレオチド);
触媒RNA(RNAi);
リボザイム;
アプタマー;
シュピーゲルマー(L−立体配座オリゴヌクレオチド);
CpGオリゴマー等、例えば、
その内容が参照により本明細書に組み込まれている、Tides 2002, Oligonucleotide and Peptide Technology Conferences, May 6-8, 2002, Las Vegas, NV及びOligonucleotide & Peptide Technologies, 18th & 19th November, 2003, Hamburg, Germanyにて開示されているものが挙げられる。
(i)アンチセンススルビビンLNAオリゴ-1(配列番号1)
mCs-Ts-mCs-As-as-ts-cs-as-ts-gs-gs-mCs-As-Gs-c;
大文字はLNAを表し、「s」はホスホロチオエート骨格を表す。
SENSE5'-gcaugcggccucuguuugadTdT-3'(配列番号2)
ANTISENSE3'-dTdTcguacgccggagacaaacu-5'(配列番号3)
dTはDNAを表す。
ts-cs-ts-cs-cs-cs-as-gs-cs-gs-ts-gs-cs-gs-cs-cs-cs-as-t
小文字はDNAを表し、「s」はホスホロチオエート骨格を表す。
5'-TsGsGscsasasgscsastscscsTsGsTsa-3'
大文字はLNAを表し、「s」はホスホロチオエート骨格を表す。
5'-TsAsGscscstsgstscsascststsCsTsCs-3'
大文字はLNAを表し、「s」はホスホロチオエート骨格を表す。
5'- TAGcttgtcccattmCTmC-3'
の配列を有し、
大文字はLNAを表し、mCはメチル化シトシンを表し、インターヌクレオチド結合はホスホロチオエートである。
場合により/好ましくは、本明細書に記載のナノ粒子組成物は、特定の細胞型又は組織型に対する標的リガンドをさらに含む。標的基は、リンカー分子、例えばアミド(amide)、アミド(amido)、カルボニル、エステル、ペプチド、ジスルフィド、シラン、ヌクレオシド、脱塩基ヌクレオシド、ポリエーテル、ポリアミン、ポリアミド、ペプチド、炭水化物、脂質、ポリ炭化水素、リン酸エステル、ホスホルアミデート、チオホスフェート、アルキルホスフェート、マレイミジルリンカー又は光解離性リンカーを用いてナノ粒子組成物(好ましくは融合性脂質及びPEG脂質)の任意の成分に結合できる。当技術分野で公知の任意の技法は、過度に実験するまでもなくナノ粒子組成物の任意の成分に標的基を結合させるのに使用できる。
C−TAT:(配列番号:8)CYGRKKRRQRRR;
C−(Arg)9:(配列番号:9)CRRRRRRRRR;
RGDは、直鎖又は環状の
葉酸は
(i)C−diTAT(配列番号11)=CYGRKKRRQRRRYGRKKRRQRRR−NH2;
(ii)直鎖RGD(配列番号12)=RGDC;
(iii)環状RGD(配列番号13)=c−RGDFC;
(iv)RGD−TAT(配列番号14)=CYGRKKRRQRRRGGGRGDS−NH2及び
(v)Arg9(配列番号15)
本明細書に記載のナノ粒子は、過度に実験するまでもなく当技術分野で公知の方法で調製できる。
式(I)のカチオン性脂質、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルエタノールアミンに結合したPEG(PEG−PE)及びコレステロールと、
式(I)のカチオン性脂質、ジアシルホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミンに結合したPEG(PEG−PE)及びコレステロールと、
式(I)のカチオン性脂質、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミンに結合したPEG(PEG−PE)及びコレステロールと、
式(I)のカチオン性脂質、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミドに結合したPEG(PEG−Cer)及びコレステロールと、又は
式(I)のカチオン性脂質、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルエタノールアミンに結合したPEG(PEG−PE)、セラミドに結合したPEG(PEG−Cer)及びコレステロールと
の混合物を含む。
本明細書に記載のナノ粒子は、単独で、又は他の療法と組み合わせて、細胞又は組織における標的遺伝子の発現レベルに関連しているか、又はそれに反応する任意の特質、疾患又は状態を予防するか、抑制するか、低減するか又は治療するための治療において使用できる。該方法は、本明細書に記載のナノ粒子を、それを必要とする哺乳動物に投与することを含む。
本明細書に記載のナノ粒子を含む医薬組成物/医薬製剤は、薬学的に使用できる製剤への活性化合物の加工を促進する賦形剤及び補助剤を含む、一つ又は複数の生理学的に許容される担体と共に製剤化できる。適切な製剤は、選択される投与経路、即ち、局所治療であるか、又は全身治療であるかに依存する。
一つ又は複数の予め選択された遺伝子の発現を抑制するのに適した用量、例えば臨床状況における治療有効量の決定は、特に本明細書の開示内容に照らして、十分当業者の能力の範囲内である。
以下の実施例は、本発明の更なる理解を得るために利用されるが、本発明の有効な範囲を制限することを何ら意味するものではない。
別段の指示がない限り、Varian Mercury 300NMR分光計及び溶媒として重水素化クロロホルムを用いて300MHzで1H NMRスペクトル及び75.46MHzで13C NMRスペクトルを得た。化学シフト(δ)を、テトラメチルシラン(TMS)からのダウンフィールドで100万分の一(ppm)で報告する。
細胞を完全培地(F-12K又はDMEM、10%FBSで補足)中で維持する。各ウェル中に2.5×105細胞を含有する12ウェルプレートを37℃で終夜インキュベートする。細胞をOpti-MEM(登録商標)で1回洗浄し、Opti-MEM(登録商標)400μLを各ウェルに加える。次いで、細胞を、核酸を封入するナノ粒子溶液又は対照としてナノ粒子なしでの遊離核酸溶液(裸のオリゴヌクレオチド)で処理する。細胞を4時間インキュベートし、次いで各ウェルに培地600μLを加え、24時間インキュベートする。処理の24時間後、ヒトErbB3等の標的遺伝子及びGAPDH等のハウスキーピング遺伝子の細胞内mRNAレベルを、RT-qPCRで測定する。mRNAの発現レベルをGAPDHのmRNAの発現レベルに対して正規化する。
無水ジクロロメタン(DCM)250mL及びTHF200mL中の2,2'-(エタン-1,2-ジイルビス(オキシ))ジエタンアミン(101.2g、683mmol)の溶液に、無水DCM150mL中のジ-tert-ブチルジカーボネート(59.6g、273mmol)の溶液を、0℃にて1.5時間かけて徐々に加えた。混合物を室温で16時間撹拌した。溶媒を除去し、残渣を水300mL中に取り出し、DCM(2×300mL)中に抽出した。有機層を合わせ、0.5N HCl(2×250mL)で抽出した。次いで、水層を4N水酸化ナトリウム溶液でpH8まで塩基性化し、DCM(2×300mL)で抽出した。有機層を合わせ、無水硫酸マグネシウムで乾燥させて、濾過し、濃縮し、40℃にて真空下で乾燥させて、生成物28.5g(収率42%)を生成した:13C NMR δ 155.43, 78.42, 73.05, 69.74, 41.37, 39.92, 28.06。
無水DCM70mL中の化合物1(3.52g、14.2mmol)の溶液に、DIEA(2.48mL、14.2mmol)、次いでコレステリルクロロホルメート(5.8g、12.9mmol)を加えた。反応混合物を室温で2.5時間撹拌し、0.5N HCl(60mL)で処理した。生成物をDCM(2×60mL)中に抽出した。合わせた有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、濃縮した。得られた固体を35℃にて真空下で乾燥させて、生成物8.05g(収率94%)を生成した: 13C NMR δ 155.99, 155.80, 139.71, 122.36, 79.26, 76.57, 74.35, 70.29, 70.2, 56.71, 56.16, 50.04, 42.35, 40.74, 40.42, 39.78, 39.57, 38.62, 37.05, 36.61, 36.22, 35.85, 31.94, 28.48, 28.29, 28.23, 28.07, 24.35, 23.91, 22.88, 22.63, 21.12, 19.43, 18.80, 11.95。
無水DCM55mL中の化合物2(8.05g、12.2mmol)の溶液に、TFA24mLを0℃で加えた。反応混合物を室温で1時間撹拌した。反応が完了した後、溶媒を乾燥させて除去し、TFA塩として9.15g(定量的収率)を生成した。この化合物を更なる精製なしに使用した: 13C NMR δ 161.31, 160.77, 160.24, 159.72, 157.90, 139.17, 122.82, 120.84, 117.04, 113.24, 109.45, 70.05, 69.97, 66.14, 66.08, 56.72, 56.22, 50.06, 42.36, 40.79, 40.09, 39.80, 39.60, 38.33, 36.90, 36.56, 36.27, 35.88, 31.92, 28.31, 28.07, 27.98, 24.35, 23.95, 22.84, 22.59, 21.11, 19.25, 18.78, 14.51, 11.92。
無水DCM100mL中の化合物3(9.15g、13.6mmol)の溶液に、Boc-Lys(Boc)-OH(10.7g、20.4mmol)、次いでDMAP(2.5g、20.4mmol)及びEDC(3.92g、20.4mmol)を加えた。混合物を室温で終夜撹拌した。反応物をDCM100mLで希釈し、0.5N NaHCO3(2×70mL)及び0.1N HCl(2×70mL)で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、濃縮した。粗物質を、DCM/メタノール(9:1、v/v)の混合物を用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、生成物5.1g(収率42%)を生成した: 13C NMR δ 171.90, 156.04, 155.84, 155.43, 139.54, 122.30, 79.76, 78.89, 74.25, 70.23, 70.09, 69.59, 56.59, 56.05, 54.37, 53.36, 49.94, 42.25, 40.63, 40.01, 39.67, 39.46, 39.19, 38.53, 36.94, 36.50, 36.13, 35.74, 32.31, 31.83, 29.64, 28.44, 28.33, 28.19, 28.15, 27.96, 24.26, 23.80, 22.81, 22.65, 22.55, 21.02, 19.31, 18.70, 11.86。
無水DCM35mL中の化合物4(5.1g、5.7mmol)の溶液に、TFA15mLを0℃で加えた。反応混合物を室温で1.5時間撹拌した。混合物をDCM50mLで希釈し、水層がpH約5に達するまで飽和NaHCO3溶液を徐々に加えた。有機層を分離し、無水MgSO4で乾燥させ、濾過し、濃縮し、乾燥させて、TFA塩として生成物3.8g(73%)を生成した: 13C NMR δ 169.29, 156.33, 139.70, 122.40, 76.57, 74.35, 70.06, 56.72, 56.24, 50.03, 42.37, 39.79, 39.56, 38.69, 37.03, 36.61, 36.28, 35.90, 31.94, 28.29, 28.08, 24.38, 24.02, 22.90, 22.64, 21.17, 19.47, 18.83, 11.98。
無水クロロホルム13mL中の化合物5(1.3g、1.88)の溶液に、1H-ピラゾール-1-カルボキサミジンHCl(1.10g、7.5mmol)、次いでDIEA(1.31mL、7.5mmol、d0.74)を室温で加えた。反応物を16時間還流した。溶液を室温まで冷却し、アセトニトリル15mLを加えることにより沈殿させた。固体を遠心分離で単離した。単離した固体を、水/ACN(1:1、v/v)14mLに再溶解させた。溶解後、ACN14mLを加え、固体を沈殿させた。固体を遠心分離し、乾燥させて、生成物950mg(66%)を生成した:13C NMR δ 171.06, 157.05, 156.43, 139.62, 122.39, 74.42, 70.03, 56.69, 56.24, 49.99, 42.32, 40.64, 39.76, 39.53, 38.63, 37.05, 36.57, 36.25, 35.87, 31.92, 28.26, 28.04, 24.35, 23.99, 22.87, 22.61, 21.13, 19.44, 18.80, 11.97。
無水DCM140mL中のコレステロール(14.2g、36.8mmol)の溶液に、2-(2-(2-Boc-アミノエトキシ)エトキシ)酢酸(5.1g、18.4mmol)、次いでDMAP(6.7g、54.8mmol)及びEDC(7.1g、36.8mmol)を0℃で加えた。混合物を室温で18時間撹拌した。反応混合物をDCM50mLで希釈し、0.5N NaHCO3(2×80mL)及び0.1N HCl(2×80mL)で洗浄した。合わせた有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、濃縮した。粗物質を、25%EtOAc/ヘキサンの混合物を用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、生成物8.5g(72%)を生成した: 13C NMR δ 169.57, 155.78, 139.16, 122.75, 79.05, 74.62, 70.76, 70.29, 70.24, 68.73, 56.64, 56.11, 49.99, 42.31, 40.39, 39.72, 39.52, 38.07, 36.92, 36.56, 36.19, 35.78, 31.91, 31.86, 28.43, 28.23, 28.02, 27.76, 24.30, 23.86, 22.85, 22.59, 21.05, 19.33, 18.75, 11.90。
無水DCM80mL中の化合物7(8.5g、13.4mmol)の溶液に、TFA20mLを0℃で加えた。反応物を室温で1.5時間撹拌した。反応が完了した後、溶媒を乾燥させて除去し、TFA塩として生成物10g(定量的収率)を生成した。この化合物を更なる精製なしに使用した:13C NMR δ 171.10, 160.78, 160.24, 138.74, 123.22, 116.93, 113.14, 77.42, 76.23, 70.54, 69.80, 68.21, 66.62, 56.66, 56.15, 49.98, 42.35, 40.10, 39.74, 39.56, 37.85, 36.78, 36.54, 36.23, 35.85, 31.88, 28.29, 28.07, 27.57, 24.34, 23.91, 22.87, 22.61, 21.08, 19.28, 18.78, 11.93。
無水DCM100mL中の化合物8(10g、15.5mmol)の溶液に、Boc-Lys(Boc)-OH(20.4g、38.8mmol)、次いでDMAP(5.6g、38.8mmol)及びEDC(7.27g、38.8mmol)を0℃で加えた。混合物を室温で終夜撹拌した。反応物をDCM100mLで希釈し、0.5N NaHCO3(2×80mL)及び0.1N HCl(2×80mL)で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、濃縮した。粗物質を、DCM/メタノール(9:1、v/v)の混合物を用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、生成物6.2g(47%)を生成した: 13C NMR: δ 172.00, 169.82, 155.93, 139.15, 122.88, 78.98, 77.42, 74.92, 74.85, 70.90, 70.20, 70.10, 69.69, 68.78, 68.64, 68.53, 56.67, 56.12, 54.35, 49.99, 42.34, 40.16, 39.85, 39.75, 39.55, 39.27, 38.08, 36.94, 36.60, 36.21, 35.83, 32.64, 31.94, 31.89, 29.68, 28.51, 28.42, 28.26, 28.07, 27.99, 27.91, 27.82, 24.33, 23.99, 23.87, 22.88, 22.68, 22.62, 21.08, 19.36, 18.78, 11.93。
無水DCM50mL中の化合物9(6.2g、7.2mmol)の溶液に、TFA20mLを0℃で加えた。反応物を室温で1.5時間撹拌した。反応混合物をDCM60mLで希釈し、水層がpH約5に達するまで飽和NaHCO3溶液を徐々に加えた。有機層を分離し、無水MgSO4で乾燥させ、濾過し、濃縮し、乾燥させて、TFA塩として生成物4.8g(86%)を生成した: 13C NMR δ 176.88, 171.39, 162.97, 140.68, 123.68, 116.13, 75.85, 71.82, 71.21, 71.03, 70.40, 69.67, 69.35, 64.65, 58.10, 57.69, 55.66, 51.54, 43.57, 41.17, 40.79, 40.62, 40.17, 39.16, 38.28, 37.77, 37.54, 37.25, 35.35, 33.21, 33.12, 29.48, 29.22, 28.84, 28.76, 25.47, 25.33, 25.25, 23.52, 23.44, 23.21, 22.28, 19.96, 19.58, 12.66。
無水クロロホルム12mL中の化合物10(1g、1.48mmol)の溶液に、1H-ピラゾール-1-カルボキサミジンHCl(0.87g、5.9mmol)、次いでDIEA(1.03mL、5.9mmol、d0.74)を室温で加えた。反応物を16時間還流した。溶液を室温まで冷却した。混合物をACN15mLで沈殿させ、粗固体を遠心分離で単離した。固体を、水/ACN(1:1)の溶液14mLに再溶解させた。溶解後、ACN14mLを加え、固体を沈殿させた。固体を遠心分離し、乾燥させて、生成物400mg(36%)を生成した: 13C NMR δ 171.18, 170.05, 157.01, 139.15, 122.85, 74.91, 70.60, 69.73, 69.10, 68.42, 56.66, 56.24, 55.03, 49.98, 42.36, 41.34, 39.75, 39.55, 38.06, 36.93, 36.61, 36.27, 35.91, 31.91, 28.30, 28.09, 27.80, 24.36, 24.04, 22.90, 22.65, 21.13, 19.40, 18.82, 11.99。
無水DCM100mL中のコレステロール(6.0g、15.5mmol)の溶液に、Boc-Lys(Boc)-OH(20.4g、38.8mmol)、次いでDMAP(5.6g、38.8mmol)及びEDC(7.27g、38.8mmol)を0℃で加える。混合物を室温で終夜撹拌する。反応物をDCM100mLで希釈し、0.5N NaHCO3(2×80mL)及び0.1N HCl(2×80mL)で洗浄する。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、濃縮する。粗物質を、DCM/メタノール(9:1、v/v)の混合物を用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、生成物を生成する。
無水DCM80mL中の化合物12(9.6g、13.4mmol)の溶液に、TFA20mLを0℃で加える。反応物を室温で1.5時間撹拌する。反応が完了した後、溶媒を乾燥させて除去し、TFA塩として定量的収率で生成物を生成する。この化合物を更なる精製なしに使用する。
無水クロロホルム12mL中の化合物13(762mg、1.48mmol)の溶液に、1H-ピラゾール-1-カルボキサミジンHCl(0.87g、5.9mmol)、次いでDIEA(1.03mL、5.9mmol、d0.74)を室温で加える。反応物を16時間還流する。溶液を室温まで冷却する。混合物をACN15mLで沈殿させ、粗固体を遠心分離で単離する。固体を、水/ACN(1:1)の溶液14mLに再溶解させる。溶解後、ACN14mLを加え、固体を沈殿させる。固体を遠心分離し、乾燥させて、生成物を生成する。
本実施例において、様々な核酸、例えばLNA含有オリゴヌクレオチドを封入するナノ粒子組成物を調製する。例えば、化合物6、DOPE、Chol、DSPE-PEG及びC16mPEG-セラミドを、90%エタノール10mL中で18:60:20:1:1のモル比で混合する(総脂質30μmol)。LNAオリゴヌクレオチド(0.4μmol)を20mMトリス緩衝液(pH7.4〜7.6)10mLに溶解させる。37℃まで加熱した後、二つの溶液をデュアルシリンジポンプにより混合し、次いで混合溶液を20mMトリス緩衝液(300mM NaCl、pH7.4〜7.6)20mLで希釈する。混合物を37℃で30分間インキュベートし、10mM PBS緩衝液(138mM NaCl、2.7mM KCl、pH7.4)で透析する。透析により混合物からエタノールを除去した後、安定な粒子が得られる。ナノ粒子溶液を遠心分離により濃縮する。ナノ粒子溶液を15mLの遠心分離濾過装置(Amicon Ultra-15、Millipore、USA)に移す。遠心分離速度は3000rpmであり、遠心分離中の温度は4℃である。濃縮懸濁液を所与の時間後に収集し、0.22μmのシリンジフィルター(Millex-GV、Millipore、USA)による濾過により滅菌する。
Cen(μg/ml)=A260×OD260単位(μg/mL)×希釈係数(μL/μL) (1)
希釈係数は、アッセイ体積(μL)を試料貯蔵体積(μL)で割ることにより得られる。
ナノ粒子の安定性は、構造的完全性をPBS緩衝液中で4℃にて経時的に保持するその能力として定義される。ナノ粒子のコロイド安定性は、平均径の変化を経時的にモニターすることにより評価される。表6の試料番号NP1で調製したナノ粒子を、10mM PBS緩衝液(138 mM NaCl、2.7 mM KCl、pH 7.4)中に分散させ、4℃にて貯蔵する。所与の時間で、ナノ粒子懸濁液約20〜50μLを取り出し、最大2mLまで純水で希釈する。ナノ粒子のサイズを25℃にてDLSで測定する。
本明細書に記載のナノ粒子に封入された核酸(LNAオリゴヌクレオチドオリゴ-2)の細胞取込み効率は、前立腺癌細胞(15PC3細胞株)等のヒト癌細胞で評価される。試料NP2のナノ粒子を、実施例16に記載の方法を用いて調製する。LNAオリゴヌクレオチド(オリゴ-2)を、蛍光顕微鏡試験のためにFAMで標識する。
本明細書に記載のナノ粒子の有効性は、ヒト表皮癌細胞(A431細胞株)で評価される。A431細胞は、上皮細胞増殖因子受容体(EGFR)を過剰発現する。細胞は、アンチセンスErbB3オリゴヌクレオチドを封入するナノ粒子(試料番号NP5)で処理される。細胞を、対照としてスクランブル配列を有するオリゴヌクレオチドを封入するナノ粒子(試料番号NP6)又はプラセボ空ナノ粒子(試料番号NP7)でも処理する。ナノ粒子を、実施例17(表7)に記載の方法を用いて調製する。ErbB3発現のダウンレギュレーションに対する各ナノ粒子のインビトロでの有効性を、実施例2に記載の方法で測定する。
本明細書に記載のナノ粒子の有効性を、様々な癌細胞、例えばヒト胃癌細胞(N87細胞株)、ヒト肺癌細胞(A549細胞株)、ヒト前立腺癌細胞(15PC3細胞株又はDU145細胞株)、ヒト乳癌細胞(MCF7細胞株)、ヒトKB癌細胞(KB細胞株)で評価する。細胞を、以下のもの:アンチセンスErbB3オリゴヌクレオチドを封入するナノ粒子(試料番号NP5)、スクランブル配列を有するオリゴヌクレオチドを封入するナノ粒子(試料番号NP6)又はプラセボ空ナノ粒子(試料番号NP7)の内の一つで処理する。ErbB3発現のダウンレギュレーションに対する各ナノ粒子のインビトロでの有効性を、実施例2に記載の方法で測定する。
本明細書に記載のナノ粒子のインビボでの有効性をヒト前立腺癌異種移植マウスにおいて評価する。15PC3ヒト前立腺腫瘍を、5×106細胞/マウスを右脇腹に皮下注射することによりヌードマウスにおいて確立する。腫瘍が平均体積100mm3に達しとき、マウスを1グループ5匹に無作為に分類する。各グループのマウスをアンチセンスErbB3オリゴヌクレオチド(試料番号NP5)又は対応する裸のオリゴヌクレオチド(オリゴ2)を封入するナノ粒子で処理する。ナノ粒子を、15mg/kg/用量、5mg/kg/用量、1mg/kg/用量又は0.5mg/kg/用量でq3d×4にて12日間静脈内(i.v.)に投与する。投与量は、ナノ粒子中のオリゴヌクレオチドの量に基づくものである。裸のオリゴヌクレオチドを、30mg/kg/用量で腹腔内(i.p.)、又は25mg/kg/用量若しくは45mg/kg/用量で静脈内にq3d×4にて12日間投与する。マウスを最終投与の24時間後に屠殺する。血漿試料をマウスから採取し、-20℃で貯蔵する。腫瘍試料及び肝臓試料もマウスから採取する。腫瘍及び肝臓のmRNA KDについて試料を分析する。
本明細書に記載のナノ粒子のインビボでの有効性を、ヒト結腸癌異種移植マウスにおいて評価する。本明細書に記載のナノ粒子(試料番号NP5)を、12日間q3d×4でヒトDLD-1腫瘍を有するマウスに腫瘍内注入により投与する。裸のオリゴヌクレオチド(オリゴ2)、スクランブルオリゴヌクレオチド(オリゴ3)及びスクランブルオリゴヌクレオチドを含有するナノ粒子(試料番号NP6)もマウスに投与する。各試験群のマウス由来の腫瘍試料を採取し、mRNAのダウンレギュレーションについてqRT-PCRを用いて分析した。
本明細書に記載のナノ粒子のインビボでの有効性を、肝臓への転移を伴うヒト癌異種移植マウスにおいて評価する。A549癌細胞を脾臓内に注射し、次いで脾臓を摘出し、転移性肝臓疾患を確立する。脾臓摘出の2日後、各群のマウスに、q3d×10で0.5mg/kg/用量にてアンチセンスErbB3オリゴヌクレオチド(試料番号NP5)又はスクランブルオリゴヌクレオチド(試料番号NP6)を封入するナノ粒子を静脈内投与する。裸のアンチセンスErbB3オリゴヌクレオチド(オリゴ2)をq3d×4で35mg/kg/用量にて静脈内投与する。動物の生存を観察する。
Claims (44)
- 式(I)のカチオン性脂質:
R1はコレステロール又はその類似体であり、
Y1、Y2及びY5は独立にO、S又はNR4であり、
Y3及びY4は独立にO、S又はNR5であり、
L1は、一つ又は複数の炭素がNR6、O、S又はC(=Y)(YはO、S又はNR4である)で置き換えられている、置換、飽和又は不飽和、分岐又は直鎖のC3〜50アルキルを有するスペーサーであり、
(a)、(c)及び(e)は独立に0又は1であり、
(b)は0又は正の整数であるが、但し、(b)が0であるとき、(a)及び(c)は両方が同時に正の整数であることはなく、
(d)は0又は正の整数であり、
XはC又はPであり、
Q1はH、C1〜6アルキル、NH2又は-(L11)d1-R11であり、
Q2はH、C1〜6アルキル、NH2又は-(L12)d2-R12であり、
Q3は(=O)、H、C1〜6アルキル、NH2又は-(L13)d3-R13であるが、
但し、
(i)XがCであるとき、Q3は(=O)ではなく、
(ii)XがPであるとき、(e)は0であり、
L11、L12及びL13は独立に選択される二官能性スペーサーであり、
(d1)、(d2)及び(d3)は独立に0又は正の整数であり、
R11、R12及びR13は独立に水素、NH2、
Y'4はO、S又はNR'5であり、
Y'5は独立にO、S又はNR'4であり、
(c')及び(e')は独立に0又は1であり、
(d')は0又は正の整数であり、
X'はC又はPであり、
Q'1はH、C1〜6アルキル、NH2又は-(L'11)d'1-R'11であり、
Q'2はH、C1〜6アルキル、NH2又は-(L'12)d'2-R'12であり、
Q'3は(=O)、H、C1〜6アルキル、NH2又は-(L'13)d'3-R'13であるが、
但し、
(i)X'がCであるとき、Q'3は(=O)ではなく、
(ii)X'がPであるとき、(e')は0であり、
L'11、L'12及びL'13は独立に選択される二官能性スペーサーであり、
(d'1)、(d'2)及び(d'3)は独立に0又は正の整数であり、
R'11、R'12及びR'13は独立に水素、NH2、
R2〜7、R'2〜5及びR'7は水素、アミノ、置換アミノ、C1〜6アルキル、C2〜6アルケニル、C2〜6アルキニル、C3〜19分岐アルキル、C3〜8シクロアルキル、C1〜6置換アルキル、C2〜6置換アルケニル、C2〜6置換アルキニル、C3〜8置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、C1〜6ヘテロアルキル及び置換C1〜6ヘテロアルキルの中から独立に選択されるが、
但し、Q1〜3及びQ'1〜3の少なくとも一つは、
- Y1がOである、請求項1に記載の化合物。
- Y2がOであり、Y5がOである、請求項1に記載の化合物。
- L1が、(Y4)c-(CR2R3)d-C(=Y5)eの一部分と結合している場合、
-(CR21R22)t1-[C(=Y6)]e1-(Y4)c-(CR2R3)d-C(=Y5)e-、
-(CR21R22)t1Y7-(CR23R24)t2-(Y8)e2-[C(=Y6)]e1-(Y4)c-(CR2R3)d-C(=Y5)e-、
-(CR21R22CR23R24Y7)t3-[C(=Y6)]e1-(Y4)c-(CR2R3)d-C(=Y5)e-、
-(CR21R22CR23R24Y7)t3(CR25R26)t4-(Y8)e2-[C(=Y6)]e1-(Y4)c-(CR2R3)d-C(=Y5)e-、
-(CR21R22CR23R24Y7)t3(CR25R26)t4-(Y8)e2-[C(=Y6)]e1-(CR27R28)t1-(Y4)c-(CR2R3)d-C(=Y5)e-、
-[(CR21R22CR23R24)t5Y7]t6(CR25R26)t4-(Y8)e2-[C(=Y6)]e1-(Y4)c-(CR2R3)d-C(=Y5)e-、
-(CR21R22)t1-[(CR23R24)t2Y7]t7(CR25R26)t4-(Y4)c-(CR2R3)d-C(=Y5)e-、及び
-(CR21R22)t1-[(CR23R24)t2Y7]t7(CR25R26)t4-(Y8)e2-[C(=Y6)]e1-(Y4)c-(CR2R3)d-C(=Y5)e-
[式中、
Y6はO、NR29又はSであり、
Y7〜8は独立にO、NR29又はSであり、
R21〜29は水素、C1〜6アルキル、C3〜12分岐アルキル、C3〜8シクロアルキル、C1〜6置換アルキル、C3〜8置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、C1〜6ヘテロアルキル、置換C1〜6ヘテロアルキル、C1〜6アルコキシ、フェノキシ及びC1〜6ヘテロアルコキシからなる群から独立に選択され、
(t1)、(t2)、(t3)、(t4)、(t5)、(t6)及び(t7)は各々独立に0又は正の整数であり、
各(c)、(e)、(e1)及び(e2)は独立に0又は1であり、
全ての他の変数は上に定義されたとおりである]
からなる群から独立に選択される、請求項1に記載のカチオン性脂質。 - L1が、(Y4)c-(CR2R3)d-C(=Y5)eの一部分と結合している場合、
-(CH2)4-C(=O)-、
-(CH2)5-C(=O)-、
-(CH2)6-C(=O)-、
-CH2CH2O-CH2O-C(=O)-、
-(CH2CH2O)2-CH2O-C(=O)-、
-(CH2CH2O)3-CH2O-C(=O)-、
-(CH2CH2O)2-C(=O)-、
-CH2CH2O-CH2CH2NH-C(=O)-、
-(CH2CH2O)2-CH2CH2NH-C(=O)-、
-(CH2CH2O)2-CH2CH2NH-C(=O)-CH2NHC(=O)-、
-(CH2CH2O)2-CH2CH2O-C(=O)-、
-CH2-O-CH2CH2O-CH2CH2NH-C(=O)-、
-CH2-O-(CH2CH2O)2-CH2CH2NH-C(=O)-、
-CH2-O-CH2CH2O-CH2C(=O)-、
-CH2-O-(CH2CH2O)2-CH2C(=O)-、
-(CH2)4-C(=O)NH-、
-(CH2)5-C(=O)NH-、
-(CH2)6-C(=O)NH-、
-CH2CH2O-CH2O-C(=O)-NH-、
-(CH2CH2O)2-CH2O-C(=O)-NH-、
-(CH2CH2O)3-CH2O-C(=O)-NH-、
-(CH2CH2O)2-C(=O)-NH-、
-(CH2CH2O)2-CH2C(=O)-NH-、
-CH2CH2O-CH2CH2NH-C(=O)-NH-、
-(CH2CH2O)2-CH2CH2NH-C(=O)-NH-、
-CH2-O-CH2CH2O-CH2CH2NH-C(=O)-NH-、
-CH2-O-(CH2CH2O)2-CH2CH2NH-C(=O)-NH-、
-CH2-O-CH2CH2O-CH2C(=O)-NH-、
-CH2-O-(CH2CH2O)2-CH2C(=O)-NH-、
-(CH2CH2O)2-、
-(CH2CH2O)3-、
-CH2CH2O-CH2O-、
-(CH2CH2O)2-CH2CH2NH-、
-(CH2CH2O)3-CH2CH2NH-、
-CH2CH2O-CH2CH2NH-、
-(CH2CH2O)2-CH2CH2NH-、
-CH2-O-CH2CH2O-CH2CH2NH-、
-CH2-O-(CH2CH2O)2-CH2CH2NH-、
-CH2-O-CH2CH2O-、及び
-CH2-O-(CH2CH2O)2-
からなる群から独立に選択される、請求項1に記載のカチオン性脂質。 - L11〜13及びL'11〜13が、
-(CR'21R'22)q1(Y'8)v'[C(=Y'9)]v(CR'23R'24)q2-、
-(CR'21R'22)q1(Y'8)v'[C(=Y'9)]vY'10(CR'23R'24)q2-、
-(CR'21R'22)q1(Y'8)v'[C(=Y'9)]v(CR'23R'24)q2-Y'11-(CR'23R'24)q3-、
-(CR'21R'22)q1(Y'8)v'[C(=Y'9)]vY'10(CR'23R'24)q2-Y'11-(CR'23R'24)q3-、
-(CR'21R'22)q1(Y'8)v'[C(=Y'9)]v(CR'23R'24CR'25R'26Y'12)q4(CR'27CR'28)q5-、
-(CR'21R'22)q1(Y'8)v'[C(=Y'9)]vY'10(CR'23R'24CR'25R'26Y'12)q4(CR'27CR'28)q5-、及び
Y'8及びY'10〜12は独立にO、NR'30又はSであり、
Y'9は独立にO、NR'31又はSであり、
R'21〜31は水素、C1〜6アルキル、C3〜12分岐アルキル、C3〜8シクロアルキル、C1〜6置換アルキル、C3〜8置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、C1〜6ヘテロアルキル、置換C1〜6ヘテロアルキル、C1〜6アルコキシ、フェノキシ及びC1〜6ヘテロアルコキシからなる群から独立に選択され、
(q1)、(q2)、(q3)、(q4)、(q5)及び(q6)は独立に0又は約1〜約10の正の整数であり、
(v)及び(v')は独立に0又は1である]
からなる群から独立に選択される、請求項1に記載のカチオン性脂質。 - L11〜13及びL'11〜13が、
-(CH2)4-、
-(CH2)3-、
-O(CH2)2-
-C(=O)O(CH2)3-、
-C(=O)NH(CH2)3-、
-C(=O)(CH2)2-、
-C(=O)(CH2)3-、
-CH2-C(=O)-O(CH2)3-、
-CH2-C(=O)-NH(CH2)3-、
-CH2-OC(=O)-O(CH2)3-、
-CH2-OC(=O)-NH(CH2)3-、
-(CH2)2-C(=O)-O(CH2)3-、
-(CH2)2-C(=O)-NH(CH2)3-、
-CH2C(=O)O(CH2)2-O-(CH2)2-、
-CH2C(=O)NH(CH2)2-O-(CH2)2-、
-(CH2)2C(=O)O(CH2)2-O-(CH2)2-、
-(CH2)2C(=O)NH(CH2)2-O-(CH2)2-、
-CH2C(=O)O(CH2CH2O)2CH2CH2-、及び
-(CH2)2C(=O)O(CH2CH2O)2CH2CH2-
からなる群から独立に選択される、請求項1に記載のカチオン性脂質。 - 式(Ia)
Y6及びY7は独立にO、S又はNR29、好ましくはO又はNHであり、
R21〜26及びR29は水素、C1〜6アルキル、C3〜12分岐アルキル、C3〜8シクロアルキル、C1〜6置換アルキル、C3〜8置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、C1〜6ヘテロアルキル、置換C1〜6ヘテロアルキル、C1〜6アルコキシ、フェノキシ及びC1〜6ヘテロアルコキシの中から独立に選択され、
(t1)、(t2)、(t3)、(t4)及び(t7)は独立に0又は正の整数であり、
(t1)が2以上であるとき、R21及びR22は各発生時に独立に同一又は異なり、
(t2)及び(t7)が独立に2以上であるとき、R23、R24及びY7は各発生時に独立に同一又は異なり、
(t3)が2以上であるとき、R21、R22、R23、R24及びY6は各発生時に独立に同一又は異なり、
(t4)が2以上であるとき、R25及びR26は各発生時に独立に同一又は異なり、
全ての他の変数は上に定義されたとおりである]
を有する、請求項1に記載のカチオン性脂質。 - 請求項1に記載の式(I)のカチオン性脂質を含むナノ粒子組成物。
- 融合性脂質及びPEG脂質を更に含む、請求項13に記載のナノ粒子組成物。
- 前記融合性脂質が、DOPE、DOGP、POPC、DSPC、EPC及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項14に記載のナノ粒子組成物。
- 前記PEG脂質が、PEG-DSPE、PEG-ジパルミトイルグリカミド、C16mPEG-セラミド及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項14に記載のナノ粒子組成物。
- コレステロールを更に含む、請求項14に記載のナノ粒子組成物。
- 式(I)のカチオン性脂質、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルエタノールアミンに結合したPEG(PEG-PE)及びコレステロール、
式(I)のカチオン性脂質、ジアシルホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミンに結合したPEG(PEG-PE)及びコレステロール、
式(I)のカチオン性脂質、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、ジアシルホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミンに結合したPEG(PEG-PE)及びコレステロール、
式(I)のカチオン性脂質、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミドに結合したPEG(PEG-Cer)及びコレステロール、並びに
式(I)のカチオン性脂質、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルエタノールアミンに結合したPEG(PEG-PE)、セラミドに結合したPEG(PEG-Cer)及びコレステロール
の混合物の群から選択される、請求項14に記載のナノ粒子組成物。 - 前記カチオン性脂質が、ナノ粒子組成物中に存在する総脂質の約10%〜約99.9%の範囲のモル比を有する、請求項18に記載のナノ粒子組成物。
- 前記カチオン性脂質が、ナノ粒子組成物中に存在する総脂質の約15%〜約25%の範囲のモル比を有する、請求項18に記載のナノ粒子組成物。
- カチオン性脂質と、非コレステロール系融合性脂質と、PEG脂質と、コレステロールとのモル比が、ナノ粒子組成物中に存在する総脂質の約15〜25%:20〜78%:0〜50%:2〜10%である、請求項18に記載のナノ粒子組成物。
- 請求項18に記載のナノ粒子組成物で封入された核酸を含むナノ粒子。
- 前記核酸が一本鎖又は二本鎖のオリゴヌクレオチドである、請求項24に記載のナノ粒子。
- 前記核酸がデオキシヌクレオチド、リボヌクレオチド、ロック核酸(LNA)、低分子干渉RNA(siRNA)、マイクロRNA(miRNA)、アプタマー、ペプチド核酸(PNA)、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴヌクレオチド(PMO)、トリシクロ-DNA、二本鎖オリゴヌクレオチド(デコイODN)、触媒RNA(RNAi)、アプタマー、シュピーゲルマー、CpGオリゴマー及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項24に記載のナノ粒子。
- 前記オリゴヌクレオチドがアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項25に記載のナノ粒子。
- 前記オリゴヌクレオチドがホスホロチオエート結合を有する、請求項25に記載のナノ粒子。
- 前記オリゴヌクレオチドがLNAを含む、請求項25に記載のナノ粒子。
- 前記オリゴヌクレオチドが約8個〜約50個のヌクレオチドを有する、請求項25に記載のナノ粒子。
- 前記オリゴヌクレオチドが、癌遺伝子、プロ血管新生経路遺伝子、プロ細胞増殖経路遺伝子、ウイルス感染因子遺伝子及びプロ炎症経路遺伝子の発現を抑制する、請求項25に記載のナノ粒子。
- 前記オリゴヌクレオチドが、アンチセンスHIF-1αオリゴヌクレオチド、アンチセンススルビビンオリゴヌクレオチド、アンチセンスErbB3オリゴヌクレオチド、βカテニンオリゴヌクレオチド及びアンチセンスβcl-2オリゴヌクレオチドからなる群から選択される、請求項25に記載のナノ粒子。
- 前記オリゴヌクレオチドが、配列番号1、配列番号2及び3、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号5及び配列番号6に示される8個以上の連続ヌクレオチドを含む、請求項25に記載の化合物。
- 前記カチオン性脂質と前記核酸との電荷比が約1:1〜約20:1の範囲である、請求項24に記載のナノ粒子。
- 前記ナノ粒子が、約50nm〜約150nmの範囲のサイズを有する、請求項24に記載のナノ粒子。
- 請求項24に記載のナノ粒子組成物をそれを必要とする哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物における疾患を治療する方法。
- 細胞と請求項24に記載のナノ粒子とを接触させることを含む、細胞にオリゴヌクレオチドを導入する方法。
- ヒト細胞又はヒト組織と請求項24に記載のナノ粒子とを接触させることを含む、ヒト細胞又はヒト組織における遺伝子発現を抑制する方法。
- 前記細胞又は組織が癌細胞又は癌組織である、請求項38に記載の方法。
- 有効量の請求項24に記載のナノ粒子をそれを必要とする哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物における遺伝子発現をダウンレギュレートする方法。
- 癌細胞と請求項24に記載のナノ粒子とを接触させることを含む、癌細胞の増殖又は成長を抑制する方法。
- 化学療法剤を投与することを更に含む、請求項40に記載の方法。
- 有効量の請求項15に記載のナノ粒子をそれを必要とする哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物における癌を治療する方法。
- 前記癌が肝臓への転移性である、請求項42に記載の方法。
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