CN114315606B - 一种脂样分子及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种脂样分子及其应用，所述脂样分子具有式I、II、III、IV、V、VI所示的结构。本发明合成了一系列特定结构的脂样分子，这些脂样分子可通过制剂优化，形成纳米级到微米级的脂样纳米粒。这些脂样纳米递送系统具有批次之间稳定性好、载药量高、有效保护药物不被降解等特点，可实现核酸等药物的安全高效递送。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种脂样分子及其应用。
背景技术
核酸药物的递送问题制约着核酸药物在临床医学中的应用。核酸药物包括但不局限于siRNA、miRNA、反义核酸、适配体、DNA、信使RNA(mRNA)等。这里重点以mRNA为例，介绍一种脂样纳米递送系统及其制备方法和用途。mRNA在产生功能性蛋白或者抗体方面具有独特的优势，既可用于预防如流感等感染性疾病，也可用于治疗遗传性疾病、癌症等重大疾病。mRNA无需进入细胞核即可表达具有生物活性的蛋白，从而避免了整合到基因组的风险。但mRNA属于生物大分子，表面呈电负性难以透过细胞膜，且自身稳定性差、易被核酸酶降解，因此在很长一段时间认为难以成药。最近十几年，随着核酸化学及各种递送系统的不断发展，核酸药物尤其是mRNA药物的开发受到了广泛的关注。然而能否开发高效低毒的mRNA递送系统，是研制mRNA药物最首要的决定性因素之一。自新冠SARS-CoV-2疫情爆发以来，mRNA疫苗的研发收到了各方的高度重视，投入了大量的资金进行研发。
mRNA递送系统，主要包括病毒载体和非病毒载体，病毒载体存在整合到基因组的风险及产生不同程度的体液免疫或细胞免疫反应，因此在临床上的使用受到了限制。非病毒载体主要集中在脂质体、聚合物及蛋白质上，虽然上述方法，已经取得了重大发展，但在就mRNA递送系统的转染效率及安全性上，仍然需要开发出更高效、更安全的mRNA递送系统。例如，基于主成分中含有氮原子及脂肪链的多组分脂样纳米粒(lipid-likenanoparticles，LLNs)来递送mRNA，在体外获得了高效率mRNA转染，在体内实现了一定的转染效率。然而目前，该类型脂样纳米粒研究还有待进一步拓展。
目前脂质体作为核酸药物递送载体，可用于递送包括DNA、siRNA、microRNA、mRNA、CRISPR/Cas等核酸药物。脂质体递送siRNA较为成熟，且有一款药物已上市。而对于mRNA领域，脂质体技术仍然处于临床研究阶段，如美国Moderna公司采用脂质体纳米粒(LNP)递送技术、德国BioNTech公司利用脂质体运载Lipoplexes(LPX)技术等，但已公开的脂样纳米粒的种类有限，且递送的安全性和效率均有待提升。
因此，本领域亟待开发一种全新的基于脂样分子的脂样纳米粒，用于体外、体内安全高效递送药物。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种脂样分子。所述脂样分子所构建的脂样纳米粒(Lipid-like nanoparticles,LLNs)能够实现核酸药物、小分子药物、肽类药物和蛋白类药物的安全高效递送。
为达此目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供一种脂样分子，所述脂样分子具有式Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ或Ⅵ所示的结构；
所述R1选自饱和链状烷烃基、不饱和链状烷烃基、饱和环烷烃基、含杂原子的饱和环烷烃基、含芳香环的饱和环烷烃基、不饱和环烷烃基、含杂原子的不饱和环烷烃基、含芳香环的不饱和环烷烃基中的任意一种；所述R2和R3各自独立地选自氢原子、饱和链状烷烃基、不饱和链状烷烃基、饱和环烷烃基、含杂原子的饱和环烷烃基、含芳香环的饱和环烷烃基、不饱和环烷烃基、含杂原子的不饱和环烷烃基、含芳香环的不饱和环烷烃基中的任意一种；所述n为0-10的整数，例如2、3、4、5、6、7、8、9等；
所述X—为阴离子。
本发明提供了一系列特定结构的脂样分子，这些脂样分子构建的脂样纳米粒(LLNs)可从纳米级到微米级，且能够实现核酸药物、小分子药物、肽类药物和蛋白类药物的安全高效递送。
本发明中，单键划过苯环的表示方法代表相应的基团可以取代在苯环的任意可取代位置，示例性地，式Ⅲ中，苯环上的两个取代基可以处于邻位、间位或对位，式Ⅳ同理。
本发明中，所述饱和链状烷烃基可以为C1-C50(例如C2、C5、C10、C12、C15、C18、C20、C24、C28、C30、C34、C38、C40、C45、C48等)的直链或支链饱和烷烃基，优选C6及以上，包括但不限于十八胺、十六胺、十四胺。
本发明中，所述不饱和链状烷烃基可以为C1-C50(例如C2、C5、C10、C12、C15、C18、C20、C24、C28、C30、C34、C38、C40、C45、C48等)的直链或支链不饱和烷烃基，优选C6及以上，包括但不限于油胺、亚油胺、棕榈油胺或反油胺。
本发明中，所述饱和环烷烃基可以为C3-C50(例如C2、C5、C10、C12、C15、C18、C20、C24、C28、C30、C34、C38、C40、C45、C48等)饱和环烷烃基，优选C6及以上，包括但不限于环庚烷胺、金刚烷胺、双环[2.2.1]庚-2-胺或双环[3.1.0]己-3-胺。所述含杂原子的饱和环烷烃基、含芳香环的饱和环烷烃基即为在饱和环烷烃基上引入杂原子或芳香环后形成的基团，其中的饱和环烷烃基的意义与前述相同。
本发明中，所述不饱和环烷烃基可以为C3-C50(例如C2、C5、C10、C12、C15、C18、C20、C24、C28、C30、C34、C38、C40、C45、C48等)不饱和环烷烃基，优选C6及以上，包括但不限于2-苯乙胺、2-萘-2-乙胺、环己烯乙胺或4-(1-环己烯基)苯胺。所述含杂原子的不饱和环烷烃基、含芳香环的不饱和环烷烃基即为在不饱和环烷烃基上引入杂原子或芳香环后形成的基团，其中的不饱和环烷烃基的意义与前述相同。
本发明中，所述杂原子包括但不限于N、P、O或S。
优选地，所述X—为Br—、I—、Cl—、OH—或NO3 —，优选为I—。
优选地，所述R1、R2和R3各自独立地选自如下基团中的任意一种：
其中，波浪线标记处代表基团的连接键。
优选地，所述n为1。
优选地，所述脂样分子具有如下结构中的任意一种：
本发明的目的之二在于提供一种目的之一所述的脂样分子的合成方法，所述合成方法包括如下步骤：
(1)化合物A、C或E与H2N-R1反应，得到化合物B、D或F，反应式如下：
(2)化合物B、D或F通过还原反应，得到化合物K、L或M，反应式如下：
(3)化合物K、L或M与R2X反应，得到式Ⅰ、Ⅲ或Ⅴ的脂样分子，反应式如下：
(4)式Ⅰ、Ⅲ或Ⅴ的脂样分子与R3X反应，得到式Ⅱ、Ⅳ或Ⅵ的脂样分子，反应式如下：
所述n、R1、R2、R3和X—均具有与前文相同的选择范围。
优选地，所述n为1，步骤(3)和步骤(4)具体包括如下步骤：
(3)化合物Kn＝1、Ln＝1或Mn＝1与R2X反应，得到式Ⅰn＝1、Ⅲn＝1或Ⅴn＝1的脂样分子，反应式如下：
(4)式Ⅰn＝1、Ⅲn＝1或Ⅴn＝1的脂样分子与R3X反应，得到式Ⅱn＝1、Ⅳn＝1或Ⅵn＝1的脂样分子，反应式如下：
所述R1、R2、R3和X—均具有与前文相同的选择范围。
优选地，所述化合物C包括邻苯二甲醛(oB)、间苯二甲醛(mB)、对苯二甲醛(pB)。
优选地，步骤(1)中，所述化合物A与H2N-R1的摩尔比1:(1～1.5)，优选1:1.2。
优选地，步骤(1)中，所述化合物C与H2N-R1的摩尔比1:(1～1.5)，优选1:1.2。
优选地，步骤(1)中，所述化合物E与H2N-R1的摩尔比1:(1～1.5)，优选1:1.2。
优选地，步骤(1)中，所述反应的溶剂包括乙醇和二氯甲烷的组合。
优选地，步骤(1)中，所述反应的体系中还含有无水硫酸钠。
优选地，步骤(1)中，所述反应的温度为30～50℃，例如32℃、36℃、38℃等，优选35℃。
优选地，步骤(1)中，所述反应的时间为16～48h，例如21h、22h、23h、24h等，优选24h。
优选地，步骤(2)中，所述还原反应的原料包括NaBH4或NaBH(OAc)3。
优选地，步骤(2)中，所述还原反应的溶剂包括乙醇和二氯甲烷的组合。
优选地，步骤(2)中，所述还原反应的温度为室温。
优选地，步骤(2)中，所述还原反应的时间为16-48h，例如21h、22h、23h、24h、25h等，优选24h。
优选地，步骤(3)中，所述反应在碱性条件下进行，优选在Cs2CO3存在下进行。
优选地，步骤(3)中，所述反应的溶剂包括四氢呋喃。
优选的，步骤(3)中，所述反应的时间为10～15h，例如11h、12h、13h、14h等，优选12h。
优选地，步骤(4)中，所述反应在缚酸剂的存在下进行。
优选地，步骤(4)中，所述缚酸剂包括K2CO3。
优选地，步骤(4)中，所述反应的时间为2～3天，优选2天。
优选地，所述合成方法还包括：对反应产物依次进行提纯、浓缩和干燥。
优选地，所述提纯的方法包括萃取和/或色谱纯化。
优选地，所述色谱纯化的系统参数为：λ1＝216nm、λ2＝254nm。
优选地，所述色谱纯化的流动相包括二氯甲烷和甲醇的组合。
优选地，所述浓缩为减压浓缩。
本发明的目的之三在于提供一种脂样纳米粒，所述脂样纳米粒由目的之一所述的脂样分子构成，或者由目的之一所述的脂样分子与脂质分子共同构成，所述脂质分子的结构与目的之一所述的脂样分子的结构不同。
本发明的脂样纳米粒中可以含有一种目的之一所述的脂样分子，也可以含有多种目的之一的脂样分子。
本发明提供的脂样纳米粒通过自组装而成，其用于药物递送时具有如下优势：
(1)转染效率优异
以tB-UC18为例，该LLNs经过多轮配方优化后，其转染效率在同等条件下，优于赛默飞的Lipofectamine 2000。
(2)批次之间的稳定性好
先前报道的LNPs或者LLNs主要由4种或以上组分组成，而本申请涉及的LLNs可通过简单的单组分或者二组分的调节及优化，即可获得高效的转染效率，这有利于保持批次之间的质量稳定性。
(3)递送材料用量少
先前报道的LNPs或者LLNs用于递送mRNA时，阳离子脂质或可离子化脂质与mRNA的质量比(wt:wt)通常维持在10:1。本LLNs经优化后，递送等量的mRNA所需要的脂样分子的质量比其它报道的脂质低4倍以上，这有利于减少递送载体的用量。
(4)可长时间有效保护mRNA不被降解
本LLNs在10％血清中，至少在80分钟内未发生明显的聚集；在10％血清或10ng/mLRNase A条件下，本LLNs至少在12～24小时内可有效的保护mRNA不被降解；另外，本LLNs与50000ng/mL RNase A孵育10分钟条件下，仍可有效的保护mRNA不被降解。
(5)获得快速、长久的mRNA蛋白翻译
LLNs递送的mRNA可快速(6小时内)而持续(至少72小时)的表达具有生物活性的蛋白。
优选地，所述脂样分子和脂质分子的摩尔比为1:(0.125～8)，例如1:0.5、1:1.5、1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4、1:4.5、1:5、1:5.5、1:6、1:6.5、1:7、1:7.5、1:8、1:8.5、1:9、1:9.5等，优选1:1。
优选地，所述脂质分子包括非阳离子脂质分子、阳离子脂质分子、聚乙二醇脂质分子或固醇类脂质分子中的任意一种或至少两种组合。
优选地，所述非阳离子脂质分子包括1,2-二油烯基-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺(DOPE)、胆固醇(Chol)、1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DOPC)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱(DSPC)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱(DPPC)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺(DPPE)、1,2-(肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺(DMPE)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酰-rac-(1-甘油)钠盐(DOPG)、1,2-棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、1-棕榈酰基-2-油酰基卵磷脂(POPC)、1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰乙醇胺(POPE)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)、1-硬脂酰基-2-油酰基磷脂酰胆碱(SOPC)、1-硬脂酰基-2-油酰基-磷脂酰乙醇胺(SOPE)、鞘磷脂、神经酰胺、脑磷脂、脑苷脂、二酰基甘油或鞘磷脂中的任意一种或至少两种组合。
优选地，所述阳离子脂质分子包括N,N-二油基-N,N-二甲基氯化铵(DODAC)、N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化铵(DDAB)、N-(1-(2,3-二油酰氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTAP)、N-(1-(2,3-二油氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)、N,N-二甲基-2,3-二油基氧基)丙基胺(DODMA)、1,2-二亚油基氧基-3-(二甲基氨基)乙酰氧基丙烷(DLin-DAC)、1,2-二亚油酰基-3-二甲基氨基丙烷(DLinDAP)、1-亚油酰基-2-亚油氧基-3-二甲基氨基丙烷(DLin-2-DMAP)、1,2-二亚油基氧基-3-(N-甲基哌嗪基)丙烷(DLin-MPZ)、3-(N,N-二油基氨基)-1,2-丙二醇(DOAP)、1,2-二亚油基氧代基-3-(2-N,N-二甲基氨基)乙氧基丙烷(DLin-EG-DMA)、1,2-二亚麻基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)或2,2-二亚油基-4-二甲基氨基甲基-[1,3]-二氧戊环(DLin-K-DMA)中的任意一种或至少两种组合。
优选地，所述聚乙二醇(PEG)脂质分子包括PEG-磷脂酰乙醇胺、PEG-磷脂酸、PEG-神经酰胺、PEG-二烃基胺、PEG-甘油二酯中的任意一种或至少两种组合，优选1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇(DMG-PEG)、1,2-二月桂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DLPE-PEGs)、1,2-十四酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DMPE-PEGS)、二棕榈酸磷脂酰胆碱-聚乙二醇(DPPC-PEGS)或二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEGs)。
优选地，所述聚乙二醇脂质分子的重均分子量为1000-10000。优选地，所述固醇类脂质分子包括固醇。本发明的目的之四在于提供一种负载药物，所述负载药物包括目的之三所述的脂样纳米粒以及负载在所述脂样纳米粒上的药物。
优选地，所述药物包括核酸药物、小分子药物、肽类药物或蛋白类药物，优选核酸药物。
优选地，所述核酸药物包括mRNA药物、siRNA药物、miRNA药物、反义核酸药物、适配体药物或DNA药物，优选mRNA药物，进一步优选β-半乳糖苷酶mRNA(β-galactosidase mRNA)或绿色荧光蛋白mRNA(GFP mRNA)。
优选地，所述β-galactosidase mRNA编码区为：
AUGAGCUUCACCCUGACCAACAAGAACGUGAUCUUCGUGGCCGGCCUGGGCGGCAUCGGCCUGGACACCAGCAAGGAGCUGCUGAAGCGGGACCCCGUGGUGCUGCAGCGGCGGGACUGGGAGAACCCCGGCGUGACCCAGCUGAACCGGCUGGCCGCCCACCCCCCCUUCGCCAGCUGGCGGAACAGCGAGGAGGCCCGGACCGACCGGCCCAGCCAGCAGCUGCGGAGCCUGAACGGCGAGUGGCGGUUCGCCUGGUUCCCCGCCCCCGAGGCCGUGCCCGAGAGCUGGCUGGAGUGCGACCUGCCCGAGGCCGACACCGUGGUGGUGCCCAGCAACUGGCAGAUGCACGGCUACGACGCCCCCAUCUACACCAACGUGACCUACCCCAUCACCGUGAACCCCCCCUUCGUGCCCACCGAGAACCCCACCGGCUGCUACAGCCUGACCUUCAACGUGGACGAGAGCUGGCUGCAGGAGGGCCAGACCCGGAUCAUCUUCGACGGCGUGAACAGCGCCUUCCACCUGUGGUGCAACGGCCGGUGGGUGGGCUACGGCCAGGACAGCCGGCUGCCCAGCGAGUUCGACCUGAGCGCCUUCCUGCGGGCCGGCGAGAACCGGCUGGCCGUGAUGGUGCUGCGGUGGAGCGACGGCAGCUACCUGGAGGACCAGGACAUGUGGCGGAUGAGCGGCAUCUUCCGGGACGUGAGCCUGCUGCACAAGCCCACCACCCAGAUCAGCGACUUCCACGUGGCCACCCGGUUCAACGACGACUUCAGCCGGGCCGUGCUGGAGGCCGAGGUGCAGAUGUGCGGCGAGCUGCGGGACUACCUGCGGGUGACCGUGAGCCUGUGGCAGGGCGAGACCCAGGUGGCCAGCGGCACCGCCCCCUUCGGCGGCGAGAUCAUCGACGAGCGGGGCGGCUACGCCGACCGGGUGACCCUGCGGCUGAACGUGGAGAACCCCAAGCUGUGGAGCGCCGAGAUCCCCAACCUGUACCGGGCCGUGGUGGAGCUGCACACCGCCGACGGCACCCUGAUCGAGGCCGAGGCCUGCGACGUGGGCUUCCGGGAGGUGCGGAUCGAGAACGGCCUGCUGCUGCUGAACGGCAAGCCCCUGCUGAUCCGGGGCGUGAACCGGCACGAGCACCACCCCCUGCACGGCCAGGUGAUGGACGAGCAGACCAUGGUGCAGGACAUCCUGCUGAUGAAGCAGAACAACUUCAACGCCGUGCGGUGCAGCCACUACCCCAACCACCCCCUGUGGUACACCCUGUGCGACCGGUACGGCCUGUACGUGGUGGACGAGGCCAACAUCGAGACCCACGGCAUGGUGCCCAUGAACCGGCUGACCGACGACCCCCGGUGGCUGCCCGCCAUGAGCGAGCGGGUGACCCGGAUGGUGCAGCGGGACCGGAACCACCCCAGCGUGAUCAUCUGGAGCCUGGGCAACGAGAGCGGCCACGGCGCCAACCACGACGCCCUGUACCGGUGGAUCAAGAGCGUGGACCCCAGCCGGCCCGUGCAGUACGAGGGCGGCGGCGCCGACACCACCGCCACCGACAUCAUCUGCCCCAUGUACGCCCGGGUGGACGAGGACCAGCCCUUCCCCGCCGUGCCCAAGUGGAGCAUCAAGAAGUGGCUGAGCCUGCCCGGCGAGACCCGGCCCCUGAUCCUGUGCGAGUACGCCCACGCCAUGGGCAACAGCCUGGGCGGCUUCGCCAAGUACUGGCAGGCCUUCCGGCAGUACCCCCGGCUGCAGGGCGGCUUCGUGUGGGACUGGGUGGACCAGAGCCUGAUCAAGUACGACGAGAACGGCAACCCCUGGAGCGCCUACGGCGGCGACUUCGGCGACACCCCCAACGACCGGCAGUUCUGCAUGAACGGCCUGGUGUUCGCCGACCGGACCCCCCACCCCGCCCUGACCGAGGCCAAGCACCAGCAGCAGUUCUUCCAGUUCCGGCUGAGCGGCCAGACCAUCGAGGUGACCAGCGAGUACCUGUUCCGGCACAGCGACAACGAGCUGCUGCACUGGAUGGUGGCCCUGGACGGCAAGCCCCUGGCCAGCGGCGAGGUGCCCCUGGACGUGGCCCCCCAGGGCAAGCAGCUGAUCGAGCUGCCCGAGCUGCCCCAGCCCGAGAGCGCCGGCCAGCUGUGGCUGACCGUGCGGGUGGUGCAGCCCAACGCCACCGCCUGGAGCGAGGCCGGCCACAUCAGCGCCUGGCAGCAGUGGCGGCUGGCCGAGAACCUGAGCGUGACCCUGCCCGCCGCCAGCCACGCCAUCCCCCACCUGACCACCAGCGAGAUGGACUUCUGCAUCGAGCUGGGCAACAAGCGGUGGCAGUUCAACCGGCAGAGCGGCUUCCUGAGCCAGAUGUGGAUCGGCGACAAGAAGCAGCUGCUGACCCCCCUGCGGGACCAGUUCACCCGGGCCCCCCUGGACAACGACAUCGGCGUGAGCGAGGCCACCCGGAUCGACCCCAACGCCUGGGUGGAGCGGUGGAAGGCCGCCGGCCACUACCAGGCCGAGGCCGCCCUGCUGCAGUGCACCGCCGACACCCUGGCCGACGCCGUGCUGAUCACCACCGCCCACGCCUGGCAGCACCAGGGCAAGACCCUGUUCAUCAGCCGGAAGACCUACCGGAUCGACGGCAGCGGCCAGAUGGCCAUCACCGUGGACGUGGAGGUGGCCAGCGACACCCCCCACCCCGCCCGGAUCGGCCUGAACUGCCAGCUGGCCCAGGUGGCCGAGCGGGUGAACUGGCUGGGCCUGGGCCCCCAGGAGAACUACCCCGACCGGCUGACCGCCGCCUGCUUCGACCGGUGGGACCUGCCCCUGAGCGACAUGUACACCCCCUACGUGUUCCCCAGCGAGAACGGCCUGCGGUGCGGCACCCGGGAGCUGAACUACGGCCCCCACCAGUGGCGGGGCGACUUCCAGUUCAACAUCAGCCGGUACAGCCAGCAGCAGCUGAUGGAGACCAGCCACCGGCACCUGCUGCACGCCGAGGAGGGCACCUGGCUGAACAUCGACGGCUUCCACAUGGGCAUCGGCGGCGACGACAGCUGGAGCCCCAGCGUGAGCGCCGAGCUGCAGCUGAGCGCCGGCCGGUACCACUACCAGCUGGUGUGGUGCCAGAAGUGA
优选地，所述GFP mRNA编码区序列为：
AUGGUGAGCAAGGGCGAGGAGCUGUUCACCGGGGUGGUGCCCAUCCUGGUCGAGCUGGACGGCGACGUAAACGGCCACAAGUUCAGCGUGUCCGGCGAGGGCGAGGGCGAUGCCACCUACGGCAAGCUGACCCUGAAGUUCAUCUGCACCACCGGCAAGCUGCCCGUGCCCUGGCCCACCCUCGUGACCACCCUGACCUACGGCGUGCAGUGCUUCAGCCGCUACCCCGACCACAUGAAGCAGCACGACUUCUUCAAGUCCGCCAUGCCCGAAGGCUACGUCCAGGAGCGCACCAUCUUCUUCAAGGACGACGGCAACUACAAGACCCGCGCCGAGGUGAAGUUCGAGGGCGACACCCUGGUGAACCGCAUCGAGCUGAAGGGCAUCGACUUCAAGGAGGACGGCAACAUCCUGGGGCACAAGCUGGAGUACAACUACAACAGCCACAACGUCUAUAUCAUGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCAUCAAGGUGAACUUCAAGAUCCGCCACAACAUCGAGGACGGCAGCGUGCAGCUCGCCGACCACUACCAGCAGAACACCCCCAUCGGCGACGGCCCCGUGCUGCUGCCCGACAACCACUACCUGAGCACCCAGUCCGCCCUGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGAUCACAUGGUCCUGCUGGAGUUCGUGACCGCCGCCGGGAUCACUCUCGGCAUGGACGAGCUGUACAAGUAA
优选地，所述药物为核酸药物，所述脂样分子中N原子与核酸药物中P原子的摩尔比为(0.125～16):1，例如1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1等，优选1.5:1。
本发明的目的之五在于提供一种目的之四所述的负载药物的制备方法，所述制备方法包括：将脂样分子、药物与溶剂混合，得到所述负载药物；
或者，所述制备方法包括：将脂样分子、脂质分子、药物与溶剂混合，得到所述负载药物。
优选地，所述混合的方法包括微流控混合方法。
优选地，所述药物包括核酸药物、小分子药物、肽类药物或蛋白类药物。
优选地，所述制备方法具体包括如下步骤：
(1)将药物溶解至缓冲溶液中，得到药物溶液；
(2)根据步骤(1)中药物的质量，将所述脂样分子与可选地脂质分子溶解至溶剂中，得到脂样分子溶液；
(3)将所述脂样分子溶液加入至所述药物溶液中，吹打，静置，得到所述负载药物。
优选地，步骤(1)中，所述缓冲溶液包括PBS缓冲溶液。
优选地，步骤(1)中，所述缓冲溶液的pH为3～10，优选7.4。
优选地，步骤(1)中，所述药物溶液中药物的浓度为20～25ng/μL，优选22ng/μL。
优选地，步骤(2)中，所述溶剂为乙醇。
优选地，步骤(2)中，将所述脂样分子与脂质分子溶解至溶剂中，且所述脂样分子和脂质分子的摩尔比为1:(0.125～8)，优选1:1。
优选地，步骤(3)中，以所述脂样分子中N原子与药物中P原子的摩尔比为(0.125～16):1为准，优选1.5:1，将所述脂样分子溶液加入至所述药物溶液中。
优选地，步骤(3)中，将所述脂样分子溶液加入至所述药物溶液中，体积比为1：(1～10)，优选1:9。
优选地，步骤(3)中，所述吹打的时间为20～40s，例如21s、22s、23s、24s、25s、26s、27s、28s、30s、32s、34s、36s、38s等，优选30s。
优选地，步骤(3)中，所述吹打通过移液器进行。
优选地，步骤(3)中，所述静置的温度为室温。
优选地，步骤(3)中，静置的时间为10～30min，例如11min、12min、13min、14min、15min、16min、17min、18min、19min等，优选15min。
优选地，所述制备方法具体包括如下步骤：
(1)将200ng mRNA药物溶解至9μL pH为7.4的PBS缓冲溶液中，得到浓度为22ng/μL的药物溶液；
(2)以所述脂样分子中N原子与mRNA药物中P原子的摩尔比(N/P比)为1.5:1为准，将摩尔比为1:1的脂样分子和脂质分子的混合物溶解至乙醇中，得到1uL脂样分子溶液；
(3)将1uL所述脂样分子溶液与9uL所述药物溶液通过移液器吹打30s，室温静置15min，得到含有所述负载药物的溶液。
本发明中，为了检测得到的负载药物对于相应蛋白的表达，采用如下方法：
(1)细胞按一定密度，在96孔板中铺板，每孔含90uL的细胞培养液；
(2)次日，将10uL负载药物溶液加入至所述全细胞培养液中，放入细胞培养箱，24h检测相应蛋白的表达。
相较于现有技术，本发明具有如下有益效果：
本发明提供了一系列特定结构的脂样分子，这些脂样分子构建的LLNs可从纳米级到微米级，且能够实现核酸药物、小分子药物、肽类药物和蛋白类药物的安全高效递送。
附图说明
图1为不同脂样分子制备的负载药物LLNs的活性初筛及制剂优化图。
图2为不同N/P比的tB-UC18 LLNs负载药物的核酸电泳图。
图3为实施例10的LLNs负载药物的纳米粒径分布图。
图4a为293T细胞中，实施例10的负载药物的tB-UC18 LLNs的转染效率与时间及剂量的关系对比图。
图4b为在HeLa细胞上，实施例10的负载药物的tB-UC18 LLNs的转染效率与时间及剂量的关系对比图。
图5为实施例10的LLNs负载药物在不同负载剂量和不同细胞中的蛋白表达情况示意图。
图6为实施例23的LLNs负载药物在293T细胞中孵育不同时间后GFP蛋白表达情况示意图。
图7为实施例23的LLNs负载药物在HeLa细胞中孵育不同时间后GFP蛋白表达情况示意图。
图8为实施例10的LLNs负载药物的细胞毒性测试图。
图9为实施例10的负载药物与游离mRNA在10％血清及RNase中的时间稳定性测试图。
图10为实施例10的负载药物与游离mRNA对不同浓度RNase的稳定性测试图。
图11为实施例10的负载药物与10％血清中室温孵育后的吸光值(660nm)测试图。
图12是本发明提供的脂样纳米粒的制备流程以及活性验证图。
具体实施方式
为便于理解本发明，本发明列举实施例如下。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
合成例1合成tB-UC18
tB-UC18的具体合成方法如下：
将均苯三甲醛与按照摩尔比1:3.6混合并溶解于乙醇和二氯甲烷的混合溶剂中，在35℃下反应24h，再加入NaBH4室温还原24h，最后CHCl3萃取三次，用中压制备色谱纯化系统(λ1＝216nm、λ2＝254nm)，二氯甲烷、甲醇做流动相提纯，减压浓缩干燥，得目标产物。
表征数据：
MS(m/z):[M+H]+calcd.for C63H118N3,916.9320；found,916.9209.
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ＝7.26(s,3H),5.42-5.24(m,6H),4.16-4.07(m,3H),3.63(s,6H),2.72-2.59(m,6H),1.99(d,J＝5.3Hz,12H),1.24(d,J＝4.0Hz,72H),0.86(t,J＝6.6Hz,12H).
本发明中其他具体化合物的合成方法与合成例1相同，区别仅在于替换不同的原料，不一一赘述。
实施例1
本实施例提供一种负载药物，负载药物包括脂样纳米粒以及负载在所述脂样纳米粒上的mRNA药物(β-galactosidase mRNA)，所述脂样纳米粒包括摩尔比为0.125:1的tB-UC18和DOPE，所述tB-UC18中N原子与mRNA药物中P原子的摩尔比(简称N/P比)为1:1。
上述负载药物的制备方法如下：
(1)将mRNA药物溶解至pH为7.4的PBS缓冲溶液中，得到浓度为22ng/μL的药物溶液；
(2)将所述脂样分子和脂质分子按摩尔比为0.125:1溶解至乙醇中，得到一定浓度的脂样分子溶液；
(3)以所述脂样分子中N原子与mRNA药物中P原子的摩尔比(N/P比)为1:1为准，将所述脂样分子溶液按体积比1:9加入至所述药物溶液中，通过移液器吹打30s，室温静置15min，得到含有所述负载药物的溶液。
实施例2-7
与实施例1的区别仅在于tB-UC18和DOPE的摩尔比不同，具体详见表1。
表1
| tB-UC18和DOPE摩尔比 | N/P比 | |
| 实施例1 | 0.125:1 | 1:1 |
| 实施例2 | 0.25:1 | 1:1 |
| 实施例3 | 0.5:1 | 1:1 |
| 实施例4 | 1:1 | 1:1 |
| 实施例5 | 2:1 | 1:1 |
| 实施例6 | 4:1 | 1:1 |
| 实施例7 | 8:1 | 1:1 |
实施例8-15
与实施例4的区别仅在于N/P比，具体详见表2。
表2
| tB-UC18和DOPE摩尔比 | N/P比 | |
| 实施例4 | 1:1 | 1:1 |
| 实施例8 | 1:1 | 0.25:1 |
| 实施例9 | 1:1 | 0.5:1 |
| 实施例10 | 1:1 | 1.5:1 |
| 实施例11 | 1:1 | 2:1 |
| 实施例12 | 1:1 | 3:1 |
| 实施例13 | 1:1 | 4:1 |
| 实施例14 | 1:1 | 8:1 |
| 实施例15 | 1:1 | 16:1 |
实施例16-22
与实施例4的区别在于，将tB-UC18替换为其他脂样分子，具体详见表3。
表3
实施例23
与实施例10的区别在于，将β-gal mRNA替换为的GFP mRNA，保证N/P比为1.5:1。
性能测试
针对上述实施例得到的负载药物进行测试和数据分析，具体如下：
图1为不同脂样分子制备的LLNs负载药物(即实施例4、16～22)的递送效率初筛图(上)、脂样分子tB-UC18和脂质分子DOPE的摩尔比(即实施例1～7)优化图(中)、脂样分子tB-UC18中N原子与核酸药物中的P原子的摩尔比(N/P，即实施例4、8～15)优化图(下)。图中β-半乳糖苷酶的活性是相对于赛默飞的Lipofectamine 2000而言。初筛及优化结果表明：当tB-UC18与DOPE的摩尔比为1:1，tB-UC18与mRNA的氮磷比为1.5:1时(即实施例10)，LLNs递送mRNA的效率最优。
图2为不同N/P比的tB-UC18 LLNs负载药物(即实施例4、8～15)的核酸电泳图，图中，tB-UC18与DOPE的比例为二者摩尔比，tB-UC18与mRNA的比例为二者的N/P比，图1显示了tB-UC18与DOPE构建的LLNs负载mRNA的情况，证明当tB-UC18与DOPE的摩尔比为1:1，tB-UC18与mRNA的氮磷比为1.5:1时，该LLNs成功负载mRNA，负载率大于90％。
图3为tB-UC18与mRNA的N/P比为1.5:1的LLNs负载药物(即实施例10)的纳米粒径分布图，图中显示包载mRNA的该LLNs纳米粒的水合粒径在300nm左右，证明该LLNs成功负载mRNA，并形成纳米粒。
图4a为在293T细胞上，tB-UC18和DOPE摩尔比为1:1、tB-UC18与mRNA的N/P比为1.5:1时tB-UC18 LLNs负载药物(即实施例10)在不同负载剂量和LLNs与细胞不同孵育时间情况下的相对活性对比图。图中以负载200ng mRNA、孵育24小时的tB-UC18 LLNs的活性作为100％；随着负载剂量的增加，孵育时间的增长,该LLNs递送mRNA的活性也就越高，证明β-gal mRNA的表达呈现剂量和时间依赖性，当负载量达到200ng，孵育时间达24h，该LLNs即可达到比较高的递送活性。
图4b为在HeLa细胞上，tB-UC18和DOPE摩尔比为1:1，tB-UC18与mRNA的N/P比为1.5:1时tB-UC18 LLNs负载药物(即实施例10)在不同负载剂量和LLNs与细胞不同孵育时间情况下的相对活性对比图。图中以负载200ng mRNA、孵育24小时的tB-UC18 LLNs的活性作为100％；随着负载剂量的增加，孵育时间的增长，该LLNs递送mRNA的活性也就越高，证明β-gal mRNA的表达呈现剂量和时间依赖性，当负载量达到200ng，孵育时间达24h，该LLNs即可达到比较高的递送活性。
图5为实施例10的LLNs负载药物在不同负载剂量和不同细胞中的蛋白表达情况示意图，图中显示负载不同剂量β-gal mRNA的tB-UC18 LLNs在293T和HeLa细胞中表达β-gal蛋白的原位染色结果，进一步证明β-gal mRNA在细胞内成功表达β-gal蛋白，且呈现剂量依赖性。
图6为实施例23的LLNs负载GFP mRNA在293T细胞中孵育不同时间后，GFP蛋白表达情况示意图，图中显示随着孵育时间的增长，GFP蛋白的表达量随之增加，证明GFP mRNA的表达呈现时间依赖性。
图7为实施例23的LLNs负载GFP mRNA在HeLa细胞中孵育不同时间后，GFP蛋白表达情况示意图，图中显示随着孵育时间的增长，GFP蛋白的表达量随之增加，证明GFP mRNA的表达呈现时间依赖性。
图8为实施例10的负载药物的细胞毒性测试图，图中显示不同剂量tB-UC18 LLNs对293T和HeLa细胞存活率的影响，证明tB-UC18 LLNs在测试范围内，对这两种细胞没有明显的细胞毒性。
图9为实施例10的负载药物与游离mRNA在10％血清及RNase中的时间稳定性测试图，图中显示在10％血清中，tB-UC18 LLNs可以有效保护mRNA，使mRNA在24h不被明显降解，而游离的mRNA在1分钟即被完全降解。在RNase中，游离的mRNA在5分钟即有被降解，而tB-UC18 LLNs保护mRNA被RNase降解的时间至少达到12小时。证明tB-UC18LLNs可有效地保护mRNA，即tB-UC18 LLNs抗血清、抗RNase酶能力强。
图10为实施例10的负载药物与游离mRNA对不同浓度RNase的稳定性测试图，图中显示即使当RNase浓度达到50000ng/mL时，mRNA也没有降解，而游离mRNA在2ng/mL的RNase时，即被完全降解，证明tB-UC18 LLNs抗RNase能力强，强有力地保护了mRNA不被RNase降解。
图11为实施例10的负载药物在10％血清中室温孵育后的吸光值(660nm)测试图，图中显示负载药物未发生明显的聚集。
上述实验结果表明，本发明提供的脂样分子构建的脂样纳米粒能够实现药物的安全高效递送，其中，当负载药物中脂样分子tB-UC18和脂质分子DOPE的摩尔比为1:1、脂样分子中N原子与mRNA核酸药物中的P原子的摩尔比为1.5:1时，递送效果更佳。本发明提供的脂样纳米粒的制备流程以及活性验证结果如图12所示。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (57)
1.一种脂样纳米粒，其特征在于，所述脂样纳米粒由脂样分子与脂质分子共同构成，所述脂质分子的结构与脂样分子的结构不同；
所述脂样分子具有式Ⅴ或Ⅵ所示的结构；
所述R1、R2和R3各自独立地选自如下基团中的任意一种：
其中，波浪线标记处代表基团的连接键；
所述n为1；
所述X—为Br—、I—、Cl—、OH—或NO3 —；
所述脂样分子和脂质分子的摩尔比为1:(0.5-2)。
2.根据权利要求1所述的脂样纳米粒，其特征在于，所述X—为I—。
3.根据权利要求1所述的脂样纳米粒，其特征在于，所述脂样分子具有如下结构中的任意一种：
4.根据权利要求1所述的脂样纳米粒，其特征在于，所述脂样分子采用如下方法合成，所述合成方法包括如下步骤：
(1)化合物E与H2N-R1反应，得到化合物F，反应式如下：
(2)化合物F通过还原反应，得到化合物M，反应式如下：
(3)化合物M与R2X反应，得到式Ⅴ的脂样分子，反应式如下：
(4)式Ⅴ的脂样分子与R3X反应，得到式Ⅵ的脂样分子，反应式如下：
所述n、R1、R2、R3和X—均具有与权利要求1相同的限定范围。
5.根据权利要求4所述的脂样纳米粒，其特征在于，步骤(1)中，所述化合物E与H2N-R1的摩尔比1:(1～1.5)。
6.根据权利要求5所述的脂样纳米粒，其特征在于，步骤(1)中，所述化合物E与H2N-R1的摩尔比1:1.2。
7.根据权利要求4所述的脂样纳米粒，其特征在于，步骤(1)中，所述反应的溶剂包括乙醇和二氯甲烷的组合。
8.根据权利要求4所述的脂样纳米粒，其特征在于，步骤(1)中，所述反应的体系中还含有无水硫酸钠。
9.根据权利要求4所述的脂样纳米粒，其特征在于，步骤(1)中，所述反应的温度为30～50℃。
10.根据权利要求9所述的脂样纳米粒，其特征在于，步骤(1)中，所述反应的温度为35℃。
11.根据权利要求4所述的脂样纳米粒，其特征在于，步骤(1)中，所述反应的时间为16～48h。
12.根据权利要求11所述的脂样纳米粒，其特征在于，步骤(1)中，所述反应的时间为24h。
13.根据权利要求4所述的脂样纳米粒，其特征在于，步骤(2)中，所述还原反应的原料包括NaBH4或者NaBH(OAc)3。
14.根据权利要求4所述的脂样纳米粒，其特征在于，步骤(2)中，所述还原反应的溶剂包括乙醇和二氯甲烷的组合。
15.根据权利要求4所述的脂样纳米粒，其特征在于，步骤(2)中，所述还原反应的时间为16～48h。
16.根据权利要求15所述的脂样纳米粒，其特征在于，步骤(2)中，所述还原反应的时间为24h。
17.根据权利要求4所述的脂样纳米粒，其特征在于，步骤(3)中，所述反应在碱性条件下进行。
18.根据权利要求17所述的脂样纳米粒，其特征在于，步骤(3)中，所述反应在Cs2CO3存在下进行。
19.根据权利要求4所述的脂样纳米粒，其特征在于，步骤(3)中，所述反应的溶剂包括四氢呋喃。
20.根据权利要求4所述的脂样纳米粒，其特征在于，步骤(3)中，所述反应的时间为10～15h。
21.根据权利要求20所述的脂样纳米粒，其特征在于，步骤(3)中，所述反应的时间为12h。
22.根据权利要求4所述的脂样纳米粒，其特征在于，步骤(4)中，所述反应在缚酸剂的存在下进行。
23.根据权利要求22所述的脂样纳米粒，其特征在于，步骤(4)中，所述缚酸剂包括K2CO3。
24.根据权利要求4所述的脂样纳米粒，其特征在于，步骤(4)中，所述反应的时间为2～3天。
25.根据权利要求24所述的脂样纳米粒，其特征在于，步骤(4)中，所述反应的时间为2天。
26.根据权利要求4所述的脂样纳米粒，其特征在于，所述合成方法还包括：对反应产物依次进行提纯、浓缩和干燥。
27.根据权利要求26所述的脂样纳米粒，其特征在于，所述提纯的方法包括萃取和/或色谱纯化。
28.根据权利要求27所述的脂样纳米粒，其特征在于，所述色谱纯化的流动相包括二氯甲烷和甲醇的组合。
29.根据权利要求26所述的脂样纳米粒，其特征在于，所述浓缩为减压浓缩。
30.根据权利要求1所述的脂样纳米粒，其特征在于，所述脂样分子和脂质分子的摩尔比为1:1。
31.根据权利要求1所述的脂样纳米粒，其特征在于，所述脂质分子包括非阳离子脂质分子、阳离子脂质分子、聚乙二醇脂质分子或固醇类脂质分子中的任意一种或至少两种组合。
32.一种负载药物，其特征在于，所述负载药物包括权利要求1～31任一项所述的脂样纳米粒以及负载在所述脂样纳米粒上的药物。
33.根据权利要求32所述的负载药物，其特征在于，所述药物包括核酸药物、小分子药物、肽类药物或蛋白类药物。
34.根据权利要求33所述的负载药物，其特征在于，所述药物包括核酸药物。
35.根据权利要求33所述的负载药物，其特征在于，所述核酸药物包括mRNA药物、siRNA药物、miRNA药物、反义核酸药物、适配体药物或DNA药物。
36.根据权利要求35所述的负载药物，其特征在于，所述核酸药物包括mRNA药物。
37.根据权利要求36所述的负载药物，其特征在于，所述核酸药物包括β-半乳糖苷酶mRNA或绿色荧光蛋白mRNA。
38.根据权利要求32所述的负载药物，其特征在于，所述药物为核酸药物，所述脂样分子中N原子与核酸药物中的P原子的摩尔比为(0.125～16):1。
39.根据权利要求38所述的负载药物，其特征在于，所述药物为核酸药物，所述脂样分子中N原子与核酸药物中的P原子的摩尔比为1.5:1。
40.一种根据权利要求32～39任一项所述的负载药物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：将脂样分子、脂质分子、药物与溶剂混合，得到所述负载药物。
41.根据权利要求40所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法具体包括如下步骤：
(1)将药物溶解至缓冲溶液中，得到药物溶液；
(2)根据步骤(1)中药物的质量，将所述脂样分子与可选地脂质分子溶解至溶剂中，得到脂样分子溶液；
(3)将所述脂样分子溶液加入至所述药物溶液中，吹打，静置，得到所述负载药物。
42.根据权利要求41所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述缓冲溶液包括PBS缓冲溶液。
43.根据权利要求41所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述缓冲溶液的pH为3～10。
44.根据权利要求41所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述药物溶液中药物的浓度为20～25ng/μL。
45.根据权利要求41所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述溶剂包括乙醇。
46.根据权利要求41所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，将所述脂样分子与脂质分子溶解至溶剂中，且所述脂样分子和脂质分子的摩尔比为1:(0.125～8)。
47.根据权利要求46所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，将所述脂样分子与脂质分子溶解至溶剂中，且所述脂样分子和脂质分子的摩尔比为1:1。
48.根据权利要求41所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，以所述脂样分子中N原子与药物中P原子的摩尔比为(0.125～16):1为准，将所述脂样分子溶液加入至所述药物溶液中。
49.根据权利要求48所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，以所述脂样分子中N原子与药物中P原子的摩尔比为1.5:1为准，将所述脂样分子溶液加入至所述药物溶液中。
50.根据权利要求41所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述脂样分子溶液和所述药物溶液的体积比为1：(1～10)。
51.根据权利要求50所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述脂样分子溶液和所述药物溶液的体积比为1:9。
52.根据权利要求41所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述吹打的时间为20～40s。
53.根据权利要求52所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述吹打的时间为30s。
54.根据权利要求41所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述吹打通过移液器进行。
55.根据权利要求41所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，静置的时间为10～30min。
56.根据权利要求55所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，静置的时间为15min。
57.根据权利要求40所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法具体包括如下步骤：
(1)将200ng mRNA药物溶解至9μL pH为7.4的PBS缓冲溶液中，得到浓度为22ng/μL的药物溶液；
(2)以所述脂样分子中N原子与mRNA药物中P原子的摩尔比为1.5:1为准，将摩尔比为1:1的脂样分子和脂质分子的混合物溶解至乙醇中，得到1uL脂样分子溶液；
(3)将1uL所述脂样分子溶液与9uL所述药物溶液通过移液器吹打30s，室温静置15min，得到含有所述负载药物的溶液。
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