CN116574070A - 一种多尾型可电离脂质及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种多尾型可电离脂质及其制备方法与应用；本发明的多尾型可电离脂质的结构式为 其中，R1和R2相同或不同，各自为氢或1～6个碳组成的烷基链或烷基环，或R1和R2共同组成含氮烷基环；L1和L2相同或不同，各自为长度为1～6个碳组成的烷基链或不饱和烃基；R为烷基、烷基环、不饱和烃基或杂烃基；n＝1～6；m1＝1～15，m2＝1～15；x＝0～5。本发明制备的多尾型可电离脂质合成方法简单，原料常见易得，路线设计合理。可以通过几步加成反应大量制备可电离脂质，便于高通量筛选材料；所得可电离脂质能在体内外有效表达RNA，具有高效率低毒性等优点。

Description

一种多尾型可电离脂质及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于药物载体技术领域，具体涉及一种多尾型可电离脂质及其制备方法与应用。
背景技术
核糖核酸(RNA)疗法主要包括反义寡核苷酸(ASOs)、小干扰RNA(siRNA)、小分子RNA(miRNA)信使RNA(mRNA)、环状RNA(circRNA)，通过操控不同作用模式在治疗广泛的疾病方面显示出巨大前景。然而由于RNA分子固有的负电荷和不稳定性，使得RNA难以突破生物屏障到达细胞质。为了克服这一问题，RNA需要安全、有效和稳定的递送系统，以保护核酸不被降解，并加速细胞摄取以及RNA的有效释放。脂质纳米颗粒(Lipid nanoparticles，LNPs)作为一款成功进入临床研究的递送系统，特别是LNPs-mRNA疫苗目前已经用于临床治疗2019冠状病毒(COVID-19)，这是LNP递送系统的一个重要里程碑。此外，DNA作为研发较早的核酸药物，也需要高效的递送系统，目前部分DNA疫苗已被批准作为兽用药物，如马用的西尼罗河病毒(West Nile Virus)和犬类黑素瘤(canine melanoma)等。
癌症疫苗一般有四种类型，包括肿瘤或免疫细胞疫苗、多肽疫苗、病毒载体疫苗和核酸疫苗，基于核酸的疫苗是一种很有前景的疫苗(DNA或RNA疫苗)。首先，核酸疫苗可以同时传递肿瘤相关抗原(Tumor-associated antigens,TAAs)或体细胞肿瘤突变等多种抗原，引发体液和细胞免疫，降低疫苗耐药性。其次，与多肽疫苗不同的是，核酸疫苗允许APCs同时或交叉呈递Ⅰ类和Ⅱ类患者特异性人类白细胞抗原的多个表位(Human leukocyteantigen)，因此会较少受到人类HLA类型的限制，更有可能刺激更广泛的T细胞反应。最后，核酸疫苗是非传染性的，在生产过程中不会受到蛋白质或者病毒来源的污染，因此被认为在预防和治疗应用中具有良好的耐受性。同时，脂质纳米颗粒也是癌症免疫治疗的关键支撑载体之一，在传染病疫苗，癌症疫苗以及小分子药物递送等国计民生领域发挥着重要的作用。因此，深入研究脂质递送载体，既有重要的科学意义，也有良好的应用前景。
在各种不同核酸递送系统中大致可以分为两类：病毒载体和非病毒载体，其中病毒载体转染效率相对较高，但是存在安全性、靶向性差等问题。数十年来脂质体作为代表的非病毒载体发展迅速，开发了一种新型脂质-可电离脂质，这种脂质在弱酸pH下可以质子化。使其带正电，但在生理pH下仍然保持中性。可电离脂质的pH敏感性有利于mRNA的体内递送，因为中性脂质与血细胞阴离子膜互相作用较少，从而提高纳米颗粒的生物相容性。当脂质纳米颗粒处于弱酸pH的内涵体时，可电离脂质会获得电荷从而促进膜的不稳定，增加纳米颗粒的内涵体逃逸。相对于传统阳离子脂质体，可电离脂质在体内的稳定性，转染效率都大大提升，并且在体内运输时显电中性，生物毒性小。本发明尝试合成一类新型安全高效的可电离脂质来解决上述核酸递送中的问题。
RNA分子固有的负电荷和不稳定性，使其难以渗透细胞。为了递送RNA分子至目标细胞，RNA分子需要安全、有效和稳定的递送系统，来保护核酸不被降解并且保证RNA分子的有效释放。在不同类型的递送系统中，脂质纳米颗粒由于其脂质可以通过简单化学合成，LNP的可拓展性工艺和强大的包载能力等特有的性质，已被广泛研究。而传统的核酸递送系统存在效率低，毒性大，靶向性差等问题(Y.Zhang,C.Sun,C.Wang,K.E.Jankovic,Y.Dong,Lipids and Lipid Derivatives for RNA Delivery,Chem.Rev.,2021,121,12181-12277.)。本发明的目的在于提供一类多尾可电离脂质制备方法和运用。该脂质纳米颗粒可以在哺乳动物细胞内高效递送mRNA,circRNA,pDNA以及siRNA，特异性沉默靶向基因表达。当脂质载体通过细胞内吞到达细胞内环境后，如何实现内涵体内快速逃逸是高效递送系统首先要解决的一大难题，本发明的多尾可电离脂质在结构上比双尾脂质一般多2～4个尾部基团，由于尾部区域的横截面增加，这种脂质会产生更为锥形的结构，使其具有更强的核内体破坏能力，增强递送效率。多尾可电离脂质的合成策略：通过正交反应快速合成，可以迅速合成含有众多脂质化合物的脂质库，并通过高通量细胞筛选来确定递送效率。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种多尾型可电离脂质及其制备方法与应用，该多尾型脂质为可电离脂质。这种可电离脂质的头部基团为叔胺基或仲胺基，在酸性pH下可以获得质子，从而携带正电荷，可以与带有负电荷的核酸分子或小分子药物通过静电相互作用结合，再与辅助性脂质自组装为脂质纳米颗粒，从而对基因药物进行递送。基于目前基因药物递送中遇到的低效率、高毒性等一系列问题，该多尾型可电离脂质在其化学结构设计中既权衡可降解性，并且保证脂质安全性的同时保持总体递送效率。该多尾可电离脂质的化学结构含有三个组成部分:(i)可电离头部基团，(ii)连接基团，(iii)疏水尾部。与传统阳离子脂质的苛刻复杂合成路线不同，本发明提供的多尾型可电离脂质化学骨架简单，合成路线简单，反应机理明确。通过迈克尔加成可以得到可电离脂质库，便于高通量筛选。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一种多尾型可电离脂质，结构式如下：
其中，R1和R2相同或不同，各自为氢或1～6个碳组成的烷基链或烷基环，或R1和R2共同组成含氮烷基环；L1和L2相同或不同，各自为长度为1～6个碳组成的烷基链或不饱和烃基；R为烷基、烷基环、不饱和烃基或杂烃基；n＝1～6；m1＝1～15，m2＝1～15；x＝0～5。
优选的，所述的多尾型可电离脂质的结构式包括实施例列举的结构式和如下结构式：
上述的多尾型可电离脂质的制备方法，由有机胺化合物和含有支链的尾部化合物通过迈克尔加成反应得到；
所述含有支链的尾部化合物的结构如下：
其中，R为烷基、烷基环、不饱和烃基或杂烃基；n＝1～6；m1＝1～15，m2＝1～15；x＝0～5；
所述有机胺化合物至少含有一个氨基。
优选的，所述有机胺化合物为以下化合物的一种：
优选的，所述的含有支链的尾部化合物由丙烯酸氯与化合物1酯化得到；
所述化合物1的结构如下：
其中，R为烷基、烷基环、不饱和烃基或杂烃基；n＝1～6；m1＝1～15，m2＝1～15；x＝0～5。
上述的多尾型可电离脂质在制备药物载体中的应用。
优选的，所述药物的活性成分包括核酸分子、蛋白质药物。
进一步优选的，所述核酸分子包括siRNA，miRNA，mRNA,circRNA,antisense RNA，CRISPR guide RNAs，可复制型RNA，环状二核苷酸，poly IC，CpG ODN，plasmid DNA，微环DNA；所述蛋白质类药物包括细胞集落刺激因子，白介素类，淋巴毒素，干扰素类蛋白，肿瘤坏死因子，抗体类，蛋白抗原。
优选的，所述药物载体的制备方法包括以下步骤：
(a)将所述的多尾型可电离脂质与胆固醇或胆固醇衍生物(β-谷甾醇等)，辅助脂质，聚乙二醇修饰的脂质的乙醇溶液混合，制成脂质混合溶液；将药物与酸性缓冲液混合，再将其与脂质混合溶液混匀；室温孵育15min～1h,PBS稀释或透析即得药物载体；
或(b)将所述的多尾型可电离脂质与胆固醇或胆固醇衍生物溶于氯仿中，氮气吹干使溶剂挥发，加入酸性或中性缓冲液超声1～20min，制成脂质体纳米颗粒备用；取鱼精蛋白与药物混合,再与所述脂质体纳米颗粒混合，静置5～30min，加入聚乙二醇修饰的脂质，30～65℃下放置5～20min，即得药物载体。
进一步优选的，步骤(a)所述多尾型可电离脂质与胆固醇或胆固醇衍生物，辅助脂质，聚乙二醇修饰的脂质的物质的量之比为10～100：0～90：0～90：0～90；所述多尾型可电离脂质中可质子化胺基与核酸药物的氮磷比为1～100：1；
步骤(a)所述的辅助脂质包括蛋黄卵磷脂、氢化蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂、氢化大豆卵磷脂、鞘磷脂、磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰乙醇胺、二油酰基卵磷脂、二油酰磷脂酰胆碱、二月桂酰磷脂酰胆碱中的至少一种；
进一步优选的，步骤(b)所述的多尾型可电离脂质与胆固醇或胆固醇衍生物的物质的量之比为1：5～5：1；所述多尾型可电离脂质与药物的质量之比为1～100：1；
进一步优选的，步骤(a)和(b)中所述的聚乙二醇修饰的脂质包括DSPE-PEG，C14-PEG，DMG-PEG，ALC-0159，DSPE-PEG-Maleimide，DSPE-PEG-COOH，DSPE-PEG-NH2以及化学修饰产物中的至少一种；
进一步优选的，步骤(a)所述的酸性缓冲液pH＝3～7；所述酸性缓冲液为醋酸钠或柠檬酸钠缓冲液；
进一步优选的，步骤(b)所述的酸性或中性缓冲液pH＝3～7；所述的酸性或中性缓冲液为柠檬酸钠、醋酸钠缓冲液或DEPC水。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)本发明制备的多尾型可电离脂质合成方法简单，原料常见易得，路线设计合理。可以通过几步加成反应大量制备可电离脂质，便于高通量筛选材料；所得可电离脂质能在体内外有效表达RNA，具有高效率低毒性等优点。
(2)本发明制备的多尾型可电离脂质的化学骨架中含有较多酯键，在体内有效释放RNA后可以快速被酶水解，易于体内代谢清除，具有生物降解性；其尾部结构中带有支链烷基，可以增加脂质尾部的横截面积，帮助RNA等药物从内涵体中逃脱，进而增强转染效果；可电离脂质的电荷可以随着所处环境pH的改变而改变，在生理条件下呈电中性，减小因正电荷过多而带来的细胞毒性，进而增加脂质纳米颗粒稳定性，并有助于延长所负载的核酸药物的循环时间、改善药物动力学特征。
附图说明
图1为实施例2制备的目标产物B的氢谱图。
图2为实施例3制备的目标产物C的氢谱图。
图3为实施例4制备的可电离脂质3-5-C2C6的氢谱图。
图4为实施例5制备的目标产物D的氢谱图。
图5为实施例6制备的目标产物E的氢谱图。
图6为实施例7制备的目标产物F的氢谱图。
图7为实施例8制备的可电离脂质3-5-CA的氢谱图。
图8为实施例10制备的目标产物H的氢谱图。
图9为实施例11制备的目标产物I的氢谱图。
图10为实施例12制备的可电离脂质8-5-C8C10的氢谱图。
图11为实施例13制备的可电离脂质14-5-C8C10的氢谱图。
图12为实施例14的脂质纳米颗粒进行细胞转染的相对荧光素酶活性结果图。
图13为实施例15的不同中性磷脂的脂质纳米颗粒进行细胞转染的相对荧光素酶活性结果图。
图14为实施例16的不同组分比例的脂质纳米颗粒进行细胞转染的相对荧光素酶活性结果图。
图15为实施例17的不同氮磷比例的脂质纳米颗粒进行细胞转染的相对荧光素酶活性结果图。
图16为实施例18的不同缓冲液的脂质纳米颗粒进行细胞转染的相对荧光素酶活性结果图。
图17为实施例19的脂质纳米颗粒进行小鼠体内转染的荧光素酶活性结果图。
图18为实施例19的脂质纳米颗粒进行小鼠体内转染的成像图。
图19为实施例20的脂质纳米颗粒进行细胞转染的相对荧光素酶活性结果图。
图20为实施例21的脂质纳米颗粒进行小鼠体内转染的荧光素酶活性结果图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明的多尾型可电离脂质的制备方法包括以下步骤：
(1)合成疏水尾部
具体步骤为：在50mL的反应管中依次加入5mmol烷基醇，15ml N,N'-羰基二咪唑，10mmol三乙胺(TEA)，20mL二氯甲烷(DCM)以及磁子，将反应管置于40℃的加热套中反应24h，待反应完毕。将反应混合液移入分液漏斗中，加入DCM(2x100mL)和饱和食盐水(2x100mL)萃取，使用1MHCl(2x20mL)洗涤。收集有机层用无水硫酸镁干燥并过滤，获得产物无需进一步纯化，即可进行下一步反应。
使用上步产物5mmol，10mmol氨基醇和20mL DCM加入到装有磁子的50mL反应管中，将反应管置于40℃的加热套中反应24h，待反应冷却至室温，反应混合液移入分液漏斗中，加入DCM(2x100mL)和饱和食盐水(2x100mL)萃取,使用1M HCl(2x20mL)洗涤。收集有机层用无水硫酸镁干燥并过滤，然后使用减压旋转蒸发仪除去有机溶剂。产物通过薄层色谱柱分离。
(2)合成连接基团
在装有磁子的三口烧瓶中依次加入5mmol上步合成产物疏水烷基尾部，7.5mmolTEA和20mL DCM，三口烧瓶在冰浴下预冷30min，使用恒压漏斗缓慢滴加6.25mmol丙烯酰氯(预混在10mL二氯甲烷中)，待丙烯酰氯滴加完毕，移走冰浴。反应在室温下过夜，然后用DCM(30mL)稀释并用1MHCl(50mL)洗涤。有机层用无水硫酸镁干燥并过滤，产物通过快速色谱层析柱分离。
(3)头部基团与尾部基团反应
选取化学当量步骤(2)合成的烷基尾部，100mg胺，依次加入到3mL的带四氟乙烯内衬的反应瓶中，反应在90℃加热48h，反应结束后，产物可以直接进行细胞转染实验或经过快速色谱层析柱分离。
本发明所合成的可电离脂质库，反应步骤简单，条件温和，可以在一周内大量制备；此可电离脂质可以高效转染mRNA，可以满足新一代RNA疫苗的递送要求。其中优选的可电离脂质转染效果与几种脂质上市产品相当，甚至更优。
实施例1：
在50mL的反应管中依次加入5mmol 3-壬醇，15mmol N,N'-羰基二咪唑，10mmolTEA，20mL DCM以及磁子，将反应管置于40℃的加热套中反应24h，使用薄层色谱(ThinLayer Chromatography,TLC)检测反应进度，待反应完毕。将反应混合液移入分液漏斗中，加入DCM(2x100mL)和饱和食盐水(2x100mL)萃取,使用1M HCl(2x20mL)洗涤。收集有机层用无水硫酸镁干燥并过滤，然后使用减压旋转蒸发仪除去有机溶剂。获得产物A无需进一步纯化，即可进行下一步反应。
实施例2：
在装有磁子的50mL反应管中依次加入5mmol中间产物A，10mmol 5-氨基-1-戊醇和20mL DCM，将反应管置于40℃的加热套中反应24h，使用TLC检测反应进度，待反应完毕。将反应混合液移入分液漏斗中，加入DCM(2x100mL)和饱和食盐水(2x100mL)萃取，使用1M HCl(2x20mL)洗涤。收集有机层用无水硫酸镁干燥并过滤，然后使用减压旋转蒸发仪除去有机溶剂。产物通过薄层色谱柱分离，得到目标产物B，收率达85％。
所得产物氢谱图如图1所示，氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3):4.90(t,J＝5.6Hz,1H),4.61-4.56(m,1H),3.55-3.51(m,2H),3.11-3.06(m,2H),2.83(s,1H),1.53-1.41(m,8H),1.35-1.19(m,10H),0.82-0.78(m,6H).
实施例3：
在装有磁子的三口烧瓶中依次加入5mmol中间产物B，7.5mmol TEA和20mL DCM，三口烧瓶在冰浴下预冷30min，使用恒压漏斗缓慢滴加6.25mmol丙烯酰氯(预混在10mL DCM中)，待丙烯酰氯滴加完毕，移走冰浴。反应溶液在室温条件下反应24h，使用TLC检测反应进度，待反应完毕。使用DCM(2x50mL)稀释并用1M HCl(2x20mL)洗涤。收集有机层用无水硫酸镁干燥并过滤，然后使用减压旋转蒸发仪除去有机溶剂。产物通过薄层色谱柱分离，得到目标产物C，收率达90％。
所得产物氢谱图如图2所示，氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3):6.37(d,J＝17.2,1H),6.08(q,J＝6.8Hz,1H),5.79(d,J＝10.4,1H),4.69-4.62(m,2H),4.13(t,J＝6.4Hz,2H),3.16-3.13(m,2H),1.70-1.63(m,2H),1.55-1.36(m,8H),1.27-1.24(m,8H),0.85(dd,J＝5.6Hz,J＝3.6Hz,6H).
实施例4：
在装有磁子的5mL反应瓶(瓶盖带四氟乙烯内衬)内加入100mg 1-(2-氨乙基)吡咯烷，2倍化学当量的中间产物C，在90℃条件下反应48h。待反应完毕，产物通过薄层色谱柱分离，得到可电离脂质3-5-C2C6。
所得产物氢谱图如图3所示，氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3):4.78-4.65(m,4H),4.08-4.03(m,4H),3.19-3.02(m,8H),2.81-2.77(m,2H),2.63-2.42(m,10H),1.80-1.48(m,20H),1.39-1.25(m,20H),0.87(dd,J＝6.8Hz,J＝5.2Hz,12H).
实施例5：
在50mL的反应管中依次加入5mmol 1-金刚醇，15mmol N,N'-羰基二咪唑，10mmolTEA，20mL DCM以及磁子，将反应管置于40℃的加热套中反应24h，使用TLC检测反应进度，待反应完毕。将反应混合液移入分液漏斗中，加入DCM(2x100mL)和饱和食盐水(2x100mL)萃取,使用1M HCl(2x20mL)洗涤。收集有机层用无水硫酸镁干燥并过滤，然后使用减压旋转蒸发仪除去有机溶剂。产物通过薄层色谱柱分离，得到目标产物D，收率达80％。
所得产物氢谱图如图4所示，氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3):8.03(s,1H),7.32(s,1H),6.98(s,1H),2.22-2.19(m,9H),1.68-1.66(m,6H).
实施例6：
在装有磁子的50mL反应管中依次加入5mmol中间产物D，10mmol 5-氨基-1-戊醇和20mL DCM，将反应管置于40℃的加热套中反应24h，使用TLC检测反应进度，待反应完毕。将反应混合液移入分液漏斗中，加入DCM(2x100mL)和饱和食盐水(2x100mL)萃取,使用1M HCl(2x20mL)洗涤。收集有机层用无水硫酸镁干燥并过滤，然后使用减压旋转蒸发仪除去有机溶剂。产物通过薄层色谱柱分离，得到目标产物E，收率达76％。
所得产物氢谱图如图5所示，氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3):4.64(s,1H),3.61(t,J＝6.8Hz,2H),3.11-3.06(m,2H),2.13-1.98(m,10H),1.63-1.34(m,12H).
实施例7：
在装有磁子的三口烧瓶中依次加入5mmol中间产物E，7.5mmol TEA和20mL DCM，三口烧瓶在冰浴下预冷30min，使用恒压漏斗缓慢滴加6.25mmol丙烯酰氯(预混在10mL DCM中)，待丙烯酰氯滴加完毕，移走冰浴。反应溶液在室温条件下反应24h，使用TLC检测反应进度，待反应完毕。使用DCM(2x50mL)稀释并用1M HCl(2x20mL)洗涤。收集有机层用无水硫酸镁干燥并过滤，然后使用减压旋转蒸发仪除去有机溶剂。产物通过薄层色谱柱分离，得到目标产物F，收率达88％。
所得产物氢谱图如图6所示，氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3):6.39(dd,J＝16.0Hz,J＝1.6Hz,1H),6.11(q,J＝6.8Hz,1H),5.80(dd,J＝9.2Hz,J＝1.2Hz,1H),4.55(s,1H),4.15(t,J＝6.4Hz,2H),3.13-3.08(m,2H),2.15-2.08(m,9H),1.72-1.68(m,8H),1.53-1.37(m,4H).
实施例8：
在装有磁子的5mL反应瓶(瓶盖带四氟乙烯内衬)内加入100mg 1-(2-氨乙基)吡咯烷，2倍化学当量的中间产物F，在90℃条件下反应48h。待反应完毕，产物通过薄层色谱柱分离，得到可电离脂质3-5-CA。
所得产物氢谱图如图7所示，氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3):4.71-4.68(m,2H),4.05(t,J＝7.2Hz,4H),3.12-3.02(m,8H),2.65-2.62(m,8H),2.46-2.42(m,4H),2.14-2.03(m,18H),1.80-1.78(m,4H),1.66-1.60(m,16H),1.51-1.48(m,4H),1.40-1.36(m,4H).
实施例9：
在50mL的反应管中依次加入5mmol 2-辛基十二醇，15mmol N,N'-羰基二咪唑，10mmol TEA，20mL DCM以及磁子，将反应管置于40℃的加热套中反应24h，使用薄层色谱TLC检测反应进度，待反应完毕。将反应混合液移入分液漏斗中，加入DCM(2x100mL)和饱和食盐水(2x100mL)萃取，使用1M HCl(2x20mL)洗涤。收集有机层用无水硫酸镁干燥并过滤，然后使用减压旋转蒸发仪除去有机溶剂。获得产物G无需进一步纯化，即可进行下一步反应。
实施例10：
在装有磁子的50mL反应管中依次加入5mmol中间产物G，10mmol 5-氨基-1-戊醇和20mL DCM，将反应管置于40℃的加热套中反应24h，使用TLC检测反应进度，待反应完毕。将反应混合液移入分液漏斗中，加入DCM(2x100mL)和饱和食盐水(2x100mL)萃取,使用1M HCl(2x20mL)洗涤。收集有机层用无水硫酸镁干燥并过滤，然后使用减压旋转蒸发仪除去有机溶剂。产物通过薄层色谱柱分离，得到目标产物H，收率达76％。
所得产物氢谱图如图8所示，氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3):4.73(s,1H),3.93-3.92(m,2H),3.62(t,J＝6.4Hz,2H),3.19-3.15(m,2H),1.61-1.36(m,8H),1.30-1.24(m,32H),0.88-0.85(t,J＝6.4Hz,6H).
实施例11：
在装有磁子的三口烧瓶中依次加入5mmol中间产物H，7.5mmol TEA和20mL DCM，三口烧瓶在冰浴下预冷30min，使用恒压漏斗缓慢滴加6.25mmol丙烯酰氯(预混在10mL DCM中)，待丙烯酰氯滴加完毕，移走冰浴。反应溶液在室温条件下反应24h，使用TLC检测反应进度，待反应完毕。使用DCM(2x50mL)稀释并用1M HCl(2x20mL)洗涤。收集有机层用无水硫酸镁干燥并过滤，然后使用减压旋转蒸发仪除去有机溶剂。产物通过薄层色谱柱分离，得到目标产物I，收率达88％。
所得产物氢谱图如图9所示，氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3):6.38(dd,J＝15.6Hz,J＝1.6Hz,1H),6.10(q,J＝6.8Hz,1H),5.80(dd,J＝8.8Hz,J＝1.6Hz,1H),4.66(s,1H),4.15(t,J＝6.4Hz,2H),3.95-3.93(m,2H),3.20-3.15(m,2H),1.72-1.67(m,2H),1.57-1.52(m,2H),1.44-1.38(m,2H),1.31-1.25(m,32H),0.87(t,J＝6.4Hz,6H).
实施例12：
在装有磁子的5mL反应瓶(瓶盖带四氟乙烯内衬)内加入100mg 1-(2-氨基乙基)哌啶，2倍化学当量的中间产物I，在90℃条件下反应48h。待反应完毕，产物通过薄层色谱柱分离，得到可电离脂质8-5-C8C10。
所得产物氢谱图如图10所示，氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3):4.81(s,2H),4.15-3.93(m,8H),3.18-3.16(m,4H),2.79(t,J＝7.2Hz,4H),2.60-2.58(m,2H),2.41-2.27(m,10H),1.67-1.51(m,12H),1.42-1.25(m,72H),0.88(t,J＝6.4Hz,12H).
实施例13：
在装有磁子的5mL反应瓶(瓶盖带四氟乙烯内衬)内加入100mg N,N-二乙基乙二胺，2倍化学当量的中间产物I，在90℃条件下反应48h。待反应完毕，产物通过薄层色谱柱分离，得到可电离脂质14-5-C8C10。
所得产物氢谱图如图11所示，氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3):4.74(s,2H),4.07-3.94(m,8H),3.20-3.14(m,4H),2.91-2.78(m,4H),2.56-2.42(m,10H),2.04(s,4H),1.68-1.51(m,10H),1.42-1.22(m,68H),1.02(t,J＝7.2Hz,4H),0.88(t,J＝6.8Hz,12H).
本发明合成得到的多尾型可电离脂质的结构如下(其他结构的多尾型可电离脂质的合成方法参考实施例1-13)：
实施例14：
在293T细胞系中验证含有可电离脂质的LNP递送编码绿色荧光蛋白(Greenfluorescent protein，GFP)和萤火虫荧光素酶(Luciferase，Luc)的自扩增RNA(repRNA-GFP-Luc)的效率。使用可电离脂质3-6-C8、7-6-C8、8-6-C8、10-6-C8、11-6-C8、12-6-C8、13-6-C8、14-6-C8、16-6-C8、3-5-C2C6、7-5-C2C6、8-5-C2C6、10-5-C2C6、11-5-C2C6、12-5-C2C6、13-5-C2C6、14-5-C2C6、16-5-C2C6、3-5-CA、7-5-CA、8-5-CA、10-5-CA、11-5-CA、12-5-CA、13-5-CA、14-5-CA、16-5-CA、3-5-C6C8、7-5-C6C8、8-5-C6C8、10-5-C6C8、11-5-C6C8、12-5-C6C8、13-5-C6C8、14-5-C6C8、16-5-C6C8、3-5-C8C10、7-5-C8C10、8-5-C8C10、10-5-C8C10、11-8C10、12-5-C8C10、13-5-C8C10、14-5-C8C10、16-5-C8C10以及商业化材料ALC-0315，SM-102分别作为递送材料在细胞内表达repRNA-GFP-Luc。
具体步骤：
1.细胞培养
实验前一天将培养好的293T细胞种在96孔细胞培养板，待细胞密度生长至70～80％左右，进行细胞转染实验。
2.制备脂质纳米颗粒LNP-repRNA-GFP-Luc进行细胞转染
使用可电离脂质3-6-C8、7-6-C8、8-6-C8、10-6-C8、11-6-C8、12-6-C8、13-6-C8、14-6-C8、16-6-C8、3-5-C2C6、7-5-C2C6、8-5-C2C6、10-5-C2C6、11-5-C2C6、12-5-C2C6、13-5-C2C6、14-5-C2C6、16-5-C2C6、3-5-CA、7-5-CA、8-5-CA、10-5-CA、11-5-CA、12-5-CA、13-5-CA、14-5-CA、16-5-CA、3-5-C6C8、7-5-C6C8、8-5-C6C8、10-5-C6C8、11-5-C6C8、12-5-C6C8、13-5-C6C8、14-5-C6C8、16-5-C6C8、3-5-C8C10、7-5-C8C10、8-5-C8C10、10-5-C8C10、11-8C10、12-5-C8C10、13-5-C8C10、14-5-C8C10、16-5-C8C10与二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)，胆固醇(Cholesterol)，DSPE-PEG依次按照10mg/mL，3mg/mL，6mg/mL，1mg/mL浓度溶于无水乙醇中，按照可电离脂质:Cholesterol:DSPC:DSPE-PEG＝40:48:10:2的摩尔比例均匀混合，同时吸取适量repRNA-GFP-Luc溶于醋酸钠缓冲液中(醋酸钠缓冲液体积为脂质混合物总体积的两倍，pH＝5.2～5.3)，然后将mRNA缓冲液与脂质混合物溶液快速混合，室温孵育15min，组装成稳定的LNP(每孔转染含150ng repRNA-GFP-Luc的LNP)。使用两倍体积的无菌PBS稀释，分别加入到96孔细胞培养板中进行转染。其中可电离脂质与mRNA的氮磷比例为24:1，即可质子化氨基与mRNA上的磷酸基团之间的摩尔比(下同)。
阳性对照组：使用商业化脂质ALC-0315、SM-102，按照已公开的制备方法组装成LNP。具体操作如下：将ALC-0315或SM-102，DSPC，Cholesterol，ALC-0159或DMG-PEG2000依次按照5mg/mL，1.5mg/mL，3mg/mL，1mg/mL浓度溶于无水乙醇，按照ALC-0315:Cholesterol:DSPC:ALC-0159＝46.3:42.7:9.4:1.6或SM-102:Cholesterol:DSPC:DMG-PEG2000＝50:38.5:10:1.5的摩尔比例均匀混合，同时吸取适量repRNA-GFP-Luc溶于柠檬酸钠缓冲液中(柠檬酸钠缓冲液体积为脂质混合物总体积的三倍，pH＝4.0)，然后将mRNA缓冲液与脂质混合物溶液快速混合，室温孵育15min以组装成稳定的LNP(每孔转染含150ng repRNA-GFP-Luc的LNP)。使用两倍体积的无菌PBS稀释，分别加入到96孔细胞培养板中进行转染。其中ALC-0315、SM-102与mRNA的氮磷比例为6:1。
阴性对照组：正常培养293T细胞，加入未包载的repRNA-GFP-Luc。
3.细胞转染效率分析
在细胞转染36h后，使用荧光显微镜检测绿色荧光蛋白的表达；将96孔细胞培养板培养基吸尽，加入细胞裂解液在在冰上裂解细胞30min，离心后取上清，转移至白色96孔检测板，加入萤火虫荧光素酶底物，用酶标仪检测萤火虫荧光素酶含量(化学发光)。相对荧光素酶活性结果如图12所示。结果显示本发明所合成的可电离脂质能极大增强自扩增RNA的转染效率。当可电离脂质尾部为6-C8，5-C6C8和5-C8C10时，RNA表达效率最高，当尾部为5-C2C6以及5-CA时，RNA表达效率较弱。以14-6-C8，8-5-C8C10，14-5-C8C10为代表的脂质转染效率要优于商业化脂质ALC-0315、SM-102，效率提高约2～3倍，验证了本发明所设计的可电离脂质总体化学结构的合理性和高效性。
实施例15：
在293T细胞系中验证含有可电离脂质的LNP递送编码绿色荧光蛋白和萤火虫荧光素酶的自扩增RNA(repRNA-GFP-Luc)的效率。使用可电离脂质14-6-C8，8-5-C8C10，14-5-C8C10，对LNP的辅助脂质进行优化。
具体步骤：
1.参考实施例14，区别在于实施例15中，实验组使用的可电离脂质为：14-6-C8，8-5-C8C10，14-5-C8C10。可电离脂质，二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、DSPC或二油酰基卵磷脂(DOPC)，Cholesterol，DSPE-PEG，依次按照10mg/mL，3mg/mL，6mg/mL，1mg/mL溶度溶于无水乙醇中，使用比例为可电离脂质14-6-C8、8-5-C8C10或14-5-C8C10：Cholesterol：DOPE、DSPC或DOPC：DSPE-PEG＝40:48:10:2。
2.细胞转染效率分析
转染36h后，将96孔细胞培养板培养基吸尽，加入细胞裂解液在冰上裂解细胞30min，离心后取上清，转移至白色96孔检测板，加入萤火虫荧光素酶底物，用酶标仪检测萤火虫荧光素酶含量(化学发光)。相对荧光素酶活性结果如图13所示。结果显示辅助脂质的化学结构会极大程度影响RNA递送效率，当辅助脂质为DSPC时，三种可电离脂质的递送效率都明显优于DOPE或DOPC，所以辅助脂质优选为DSPC。
实施例16：
在293T细胞系中验证含有可电离脂质的LNP递送repRNA-GFP-Luc的效率。使用可电离脂质14-6-C8，8-5-C8C10，14-5-C8C10，对LNP中各组分的比例进行优化。
具体步骤：
1.参考实施例14，区别在于实施例16中，实验组使用的可电离脂质为：14-6-C8，8-5-C8C10，14-5-C8C10。可电离脂质，DSPC，Cholesterol，DSPE-PEG，依次按照10mg/mL，3mg/mL，6mg/mL，1mg/mL溶度溶于无水乙醇中，使用五种不同摩尔比例进行混合，比例A为可电离脂质：Cholesterol：DSPC：DSPE-PEG＝40:48:10:2；比例B为可电离脂质：Cholesterol：DSPC：DSPE-PEG＝30:28.5:10:0.75；比例C为可电离脂质：Cholesterol：DSPC：DSPE-PEG＝50:38.5:10:1.5；比例D为可电离脂质：Cholesterol：DSPC：DSPE-PEG＝35:46:16:2.5；比例E为可电离脂质：Cholesterol：DSPC：DSPE-PEG＝46.3:42.7:9.4:1.6
2.细胞转染效率分析
转染36h后，将96孔细胞培养板培养基吸尽，加入细胞裂解液在冰上裂解细胞30min，离心后取上清，转移至白色96孔检测板，加入萤火虫荧光素酶底物，用酶标仪检测萤火虫荧光素酶含量(化学发光)。相对荧光素酶活性结果如图14所示。结果显示LNP各组分之间的摩尔比例在一定程度上也会影响RNA递送效率，比例A可电离脂质：Cholesterol：DSPC：DSPE-PEG＝40:48:10:2为最优比例。
实施例17：
在293T细胞系中验证含有可电离脂质的LNP递送repRNA-GFP-Luc的效率。使用可电离脂质14-6-C8，8-5-C8C10，14-5-C8C10，对LNP的氮磷比例进行优化。
具体步骤：
1.参考实施例14，区别在于实施例17中，实验组使用的可电离脂质为：14-6-C8，8-5-C8C10，14-5-C8C10。可电离脂质，DSPC，Cholesterol，DSPE-PEG，按照10mg/mL，3mg/mL，6mg/mL，1mg/mL浓度溶于无水乙醇中，使用比例为可电离脂质化合物14-6-C8、8-5-C8C10或14-5-C8C10：Cholesterol：DSPC：DSPE-PEG＝40:48:10:2。其中LNP的氮磷比例依次为12:1，18:1，24:1，32:1。
2.细胞转染效率分析
转染36h后，将96孔细胞培养板培养基吸尽，加入细胞裂解液在在冰上裂解细胞30min，离心后取上清，转移至白色96孔检测板，加入萤火虫荧光素酶底物，用酶标仪检测萤火虫荧光素酶含量(化学发光)。相对荧光素酶活性结果如图15所示。结果显示氮磷比例为18:1时，repRNA-GFP-Luc的转染效率最优。
实施例18：
在293T细胞系中验证含有可电离脂质的LNP递送repRNA-GFP-Luc的效率。使用可电离脂质14-6-C8，8-5-C8C10，14-5-C8C10，对LNP的缓冲液配方进行优化。
具体步骤：
1.参考实施例14，区别在于实施例18中，实验组使用的可电离脂质为：14-6-C8，8-5-C8C10，14-5-C8C10。可电离脂质，DSPC，Cholesterol，DSPE-PEG，按照10mg/mL，3mg/mL，6mg/mL，1mg/mL浓度溶于无水乙醇中，使用比例为可电离脂质化合物14-6-C8、8-5-C8C10或14-5-C8C10：Cholesterol：DSPC：DSPE-PEG＝40:48:10:2。其中预混RNA的溶液为醋酸钠或柠檬酸钠缓冲液，制备LNP的氮磷比例为18:1。
2.细胞转染效率分析
转染36h后，将96孔细胞培养板培养基吸尽，加入细胞裂解液在冰上裂解细胞30min，离心后取上清，转移至白色96孔检测板，加入萤火虫荧光素酶底物，用酶标仪检测萤火虫荧光素酶含量(化学发光)。相对荧光素酶活性结果如图16所示。结果显示制备纳米颗粒的缓冲液为醋酸钠缓冲液时，RNA递送效率优于柠檬酸钠缓冲液。因此优选为醋酸钠缓冲液。
实施例19：
使用含有可电离脂质14-6-C8，8-5-C8C10，10-5-C8C10，14-5-C8C10以及商业化脂质SM-102，ALC-0315的LNP在Balb/c小鼠体内递送编码萤火虫荧光素酶的自扩增RNA(repRNA-Luc)，在肌肉注射后第2、5、7、10、12、15天使用体内成像系统(in vivo imagingsystem,IVIS)检测报告基因荧光素酶的表达情况。
1.具体步骤参考实施例14，区别在于实施例19中，实验组使用的可电离脂质为：14-6-C8，8-5-C8C10，10-5-C8C10，14-5-C8C10。可电离脂质，DSPC，Cholesterol，DSPE-PEG，按照10mg/mL，6mg/mL，12mg/mL，5mg/mL浓度溶于无水乙醇中，吸取适量repRNA-Luc溶于醋酸钠缓冲液中(醋酸钠缓冲液体积为脂质混合物总体积的两倍，pH＝5.3)，吸取含repRNA-Luc的缓冲液加入至脂质混合物乙醇溶液中，并快速混合均匀以组装成LNP，将混合好的溶液室温孵育15min，使用透析袋(MWCO＝14000MW)在PBS中透析1h后，进行肌肉注射(每针注射含1.5μg repRNA-Luc的LNP)。使用比例为可电离脂质14-6-C8、8-5-C8C10、10-5-C8C10或14-5-C8C10：Cholesterol：DSPC：DSPE-PEG＝40:48:10:2。其中预混RNA的溶液为醋酸钠缓冲液，制备LNP的氮磷比例为18:1。
阳性对照组：使用商业化脂质ALC-0315、SM-102，按照已公开的制备方法组装成相应的阳性对照LNP。具体操作如下：将ALC-0315或SM-102，DSPC，Cholesterol，ALC-0159或DMG-PEG2000依次按照5mg/mL，1.5mg/mL，3mg/mL，1mg/mL浓度溶于无水乙醇，按照ALC-0315:Cholesterol:DSPC:ALC-0159＝46.3:42.7:9.4:1.6或SM-102:Cholesterol:DSPC:DMG-PEG2000＝50:38.5:10:1.5的摩尔比例均匀混合，同时吸取适量repRNA-Luc溶于柠檬酸钠缓冲液中(柠檬酸钠缓冲液体积为脂质混合物总体积的三倍，pH＝4.0)，然后将含mRNA的缓冲液与脂质混合物溶液快速混合，室温孵育15min以组装成LNP，然后使用透析袋(MWCO＝14000MW)在PBS中透析1h，进行肌肉注射(每针注射含1.5μgrepRNA-Luc的LNP)。其中ALC-0315、SM-102与mRNA的氮磷比例为6:1。
2.体内成像结果分析
IVIS结果表明(图17-18)肌肉注射第2天起，本发明的可电离脂质10-5-C8C10表达强度优于商业化脂质SM-102、ALC-0315，且8-5-C8C10在体内表达量的下降程度较商品化脂质缓慢。
根据文献报道自扩增RNA表达值在注射后7-10天达到峰值，而普通mRNA则在注射后48h达到峰值，说明本发明的可电离脂质递送自扩增RNA表达时间更长、表达量更高，可在mRNA疫苗应用方面带来更加高效持久的免疫效果。
实施例20：
在293T细胞系中验证含有可电离脂质的LNP递送编码萤火虫荧光素酶的环状RNA(circRNA-Luc)的效率。使用可电离脂质3-6-C8、7-6-C8、8-6-C8、10-6-C8、11-6-C8、12-6-C8、13-6-C8、14-6-C8、16-6-C8、3-5-C2C6、7-5-C2C6、8-5-C2C6、10-5-C2C6、11-5-C2C6、12-5-C2C6、13-5-C2C6、14-5-C2C6、16-5-C2C6、3-5-CA、7-5-CA、8-5-CA、10-5-CA、11-5-CA、12-5-CA、13-5-CA、14-5-CA、16-5-CA、3-5-C6C8、7-5-C6C8、8-5-C6C8、10-5-C6C8、11-5-C6C8、12-5-C6C8、13-5-C6C8、14-5-C6C8、16-5-C6C8、3-5-C8C10、7-5-C8C10、8-5-C8C10、10-5-C8C10、11-8C10、12-5-C8C10、13-5-C8C10、14-5-C8C10、16-5-C8C10以及商业化脂质ALC-0315、SM-102分别作为递送材料在细胞内表达circRNA-Luc。
具体步骤：
1.参考实施例14，区别在于实施例20中，repRNA-GFP-Luc替换为circRNA-Luc。
2.细胞转染效率分析
在细胞转染24h后，将96孔细胞培养板培养基吸尽，加入细胞裂解液在冰上裂解细胞30min，离心后取上清，转移至白色96孔检测板，加入萤火虫荧光素酶底物，用酶标仪检测萤火虫荧光素酶含量(化学发光)。相对荧光素酶活性结果如图19所示。结果显示本发明所合成的可电离脂质能增强circRNA的转染效率。当可电离脂质尾部为6-C8、5-C6C8和5-C8C10时，RNA表达效率最高，当尾部为5-C2C6、5-CA时，RNA表达效率较弱。以10-6-C8、14-6-C8、16-6-C8、7-5-C6C8、13-5-C8C10、14-5-C8C10为代表的脂质转染效率要优于商业化脂质ALC-0315、SM-102，转染效率提高2～3倍，说明本发明所涉及的可电离脂质应用范围广泛，可用于不同种类mRNA的递送。
实施例21：
使用含有可电离脂质8-5-C8C10、10-5-C8C10或商业化脂质SM-102、ALC-0315的LNP在Balb/c小鼠体内递送circRNA-Luc，肌肉注射后6h、12h、1天、2天、3天、4天、5天，使用IVIS检测。
1.具体步骤参考实施例14和实施例19，区别在于实施例21中，实验组使用的可电离脂质为：8-5-C8C10、10-5-C8C10。可电离脂质，DSPC，Cholesterol，DSPE-PEG，依次按照10mg/mL，6mg/mL，12mg/mL，5mg/mL浓度溶于无水乙醇中，吸取适量circRNA-Luc溶于醋酸钠缓冲液中(醋酸钠缓冲液体积为脂质混合物总体积的两倍，pH＝5.3)，吸取含有circRNA-Luc的缓冲液加入至脂质混合物溶液中，并快速混合均匀以组装成LNP，将混合好的溶液室温孵育15min，使用透析袋(MWCO＝14000MW)在PBS中透析1h后，进行肌肉注射(每针注射含1.5μg circRNA-Luc的LNP)。使用比例为可电离脂质8-5-C8C10或10-5-C8C10：Cholesterol：DSPC：DSPE-PEG＝40:48:10:2。其中预混RNA的溶液为醋酸钠，可电离脂质和RNA的氮磷比例为18:1。
阳性对照组：商业化脂质ALC-0315、SM-102，按照已公开的制备方法组装LNP。具体操作如下：将ALC-0315或SM-102，DSPC，Cholesterol，ALC-0159或DMG-PEG2000依次按照5mg/mL，1.5mg/mL，3mg/mL，1mg/mL浓度溶于无水乙醇，按照ALC-0315:Cholesterol:DSPC:ALC-0159＝46.3:42.7:9.4:1.6或SM-102:Cholesterol:DSPC:DMG-PEG2000＝50:38.5:10:1.5的摩尔比例均匀混合，同时吸取适量circRNA-Luc溶于柠檬酸钠缓冲液中(柠檬酸钠缓冲液体积为脂质混合物总体积的三倍，pH＝4.0)，然后将含有circRNA的缓冲液与脂质混合物溶液快速混合，室温孵育15min以组装成稳定的LNP，使用透析袋(MWCO＝14000MW)在PBS中透析1h后，进行肌肉注射(每针注射含1.5μg circRNA-Luc的LNP)。其中ALC-0315，SM-102与RNA的氮磷比例为6:1。
2.体内成像结果分析
IVIS结果表明(图20)包载circRNA-Luc的LNP的表达峰值在12～24h。其中本发明的可电离脂质8-5-C8C10表达强度与商业化脂质SM-102、ALC-0315相当。
以上实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种多尾型可电离脂质，其特征在于，结构式如下：
其中，R1和R2相同或不同，各自为氢或1～6个碳组成的烷基链或烷基环，或R1和R2共同组成含氮烷基环；L1和L2相同或不同，各自为长度为1～6个碳组成的烷基链或不饱和烃基；R为烷基、烷基环、不饱和烃基或杂烃基；n＝1～6；m1＝1～15，m2＝1～15；x＝0～5。
2.根据权利要求1所述的多尾型可电离脂质，其特征在于，结构式如下：
3.权利要求1-2任一项所述的多尾型可电离脂质的制备方法，其特征在于，由有机胺化合物和含有支链的尾部化合物通过迈克尔加成反应得到；
所述含有支链的尾部化合物的结构如下：
其中，R为烷基、烷基环、不饱和烃基或杂烃基；n＝1～6；m1＝1～15，m2＝1～15；x＝0～5；
所述有机胺化合物至少含有一个氨基。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述有机胺化合物为以下化合物的一种：
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的含有支链的尾部化合物由丙烯酸氯与化合物1酯化得到；
所述化合物1的结构如下：
其中，R为烷基、烷基环、不饱和烃基或杂烃基；n＝1～6；m1＝1～15，m2＝1～15；x＝0～5。
6.权利要求1-2任一项所述的多尾型可电离脂质在制备药物载体中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述药物的活性成分包括核酸分子、蛋白质药物。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述核酸分子包括siRNA，miRNA，mRNA,circRNA,antisense RNA，CRISPR guide RNAs，可复制型RNA，环状二核苷酸，poly IC，CpGODN，plasmid DNA，微环DNA；所述蛋白质类药物包括细胞集落刺激因子，白介素类，淋巴毒素，干扰素类蛋白，肿瘤坏死因子，抗体类，蛋白抗原。
9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述药物载体的制备方法包括以下步骤：
(a)将所述的多尾型可电离脂质与胆固醇或胆固醇衍生物，辅助脂质，聚乙二醇修饰的脂质的乙醇溶液混合，制成脂质混合溶液；将药物与酸性缓冲液混合，再将其与脂质混合溶液混匀；室温孵育15min～1h,PBS稀释或透析即得药物载体；
或(b)将所述的多尾型可电离脂质与胆固醇或胆固醇衍生物溶于氯仿中，氮气吹干使溶剂挥发，加入酸性或中性缓冲液超声1～20min，制成脂质体纳米颗粒备用；取鱼精蛋白与药物混合，再与所述脂质体纳米颗粒混合，静置5～30min，加入聚乙二醇修饰的脂质，30～65℃下放置5～20min，即得药物载体。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，步骤(a)所述多尾型可电离脂质与胆固醇或胆固醇衍生物，辅助脂质，聚乙二醇修饰的脂质的物质的量之比为10～100：0～90：0～90：0～90；所述多尾型可电离脂质中可质子化胺基与核酸药物的氮磷比为1～100：1；
步骤(a)所述的辅助脂质包括蛋黄卵磷脂、氢化蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂、氢化大豆卵磷脂、鞘磷脂、磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰乙醇胺、二油酰基卵磷脂、二油酰磷脂酰胆碱、二月桂酰磷脂酰胆碱中的至少一种；
步骤(b)所述的多尾型可电离脂质与胆固醇或胆固醇衍生物的物质的量之比为1：5～5：1；所述多尾型可电离脂质与药物的质量之比为1～100：1；
步骤(a)和(b)中所述的聚乙二醇修饰的脂质包括DSPE-PEG，C14-PEG，DMG-PEG，ALC-0159，DSPE-PEG-Maleimide，DSPE-PEG-COOH，DSPE-PEG-NH2中的至少一种；
步骤(a)所述的酸性缓冲液pH＝3～7；所述酸性缓冲液为醋酸钠或柠檬酸钠缓冲液；
步骤(b)所述的酸性或中性缓冲液pH＝3～7；所述的酸性或中性缓冲液为柠檬酸钠、醋酸钠缓冲液或DPEC水。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117164468A (zh) * 2023-10-26 2023-12-05 南京澄实生物医药科技有限公司 一种可电离脂质化合物及其应用
WO2024207721A1 (zh) * 2023-04-07 2024-10-10 华南理工大学 一种多尾型可电离脂质及其制备方法与应用

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10335491B2 (en) * 2011-07-21 2019-07-02 The Regents Of The University Of California Catalytic delivery nanosubstrates (CDNS) for highly efficient delivery of biomolecules
CN117279888A (zh) * 2021-04-28 2023-12-22 富士胶片株式会社 化合物或其盐、脂质颗粒及药物组合物
CN113402404B (zh) * 2021-04-30 2022-03-11 苏州科锐迈德生物医药科技有限公司 脂质化合物及包含其的脂质载体、核酸脂质纳米粒组合物和药物制剂
CN113264842B (zh) * 2021-07-21 2022-03-01 苏州科锐迈德生物医药科技有限公司 一种脂质化合物及包含其的脂质载体、核酸脂质纳米粒组合物和药物制剂
EP4430026A1 (en) * 2021-11-11 2024-09-18 Arcturus Therapeutics, Inc. Ionizable cationic lipids for rna delivery
WO2023107648A2 (en) * 2021-12-09 2023-06-15 Massachusetts Institute Of Technology Synthesis of ester, carbonate, and carbamate-derived novel biodegradable ionizable lipids from methyl ricinoleate or methyl 12-hydroxystearate and its applications
CN117377651A (zh) * 2021-12-31 2024-01-09 厦门赛诺邦格生物科技股份有限公司 一种侧链含功能性基团的阳离子脂质及其应用
CN114507195B (zh) * 2022-01-14 2024-02-13 华南理工大学 一种脂质化合物、包含其的组合物及应用
WO2023164544A2 (en) * 2022-02-24 2023-08-31 Sorrento Therapeutics, Inc. Novel ionizable cationic lipids
CN114957164B (zh) * 2022-06-10 2024-03-01 华南理工大学 一种脂质化合物及其制备方法与应用
CN116574070A (zh) * 2023-04-07 2023-08-11 华南理工大学 一种多尾型可电离脂质及其制备方法与应用

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024207721A1 (zh) * 2023-04-07 2024-10-10 华南理工大学 一种多尾型可电离脂质及其制备方法与应用
CN117164468A (zh) * 2023-10-26 2023-12-05 南京澄实生物医药科技有限公司 一种可电离脂质化合物及其应用
CN117164468B (zh) * 2023-10-26 2024-01-30 南京澄实生物医药科技有限公司 一种可电离脂质化合物及其应用

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