CN113121381A - 一种神经酰胺类化合物及其阳离子脂质体、制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种神经酰胺类化合物及其阳离子脂质体、制备方法和应用。本发明提供了一种式I所示结构的神经酰胺类化合物，该化合物具有更强的稳定性、脂溶性，能够更好通过皮肤角质层的优点；基于该化合物的阳离子脂质体均一性好、质量稳定可靠、制备工艺简便，可高效携载并递送核酸，同时具有优异的透皮性能等多重优点。本发明提供的一种基于神经酰胺类化合物的阳离子脂质体与市售商品化基因转染试剂liposome 2000相比具有明显较低的细胞毒性，显著升高的基因转染效率，与传统脂质体相比，能够提升药物的入胞效率，具有更优秀的透皮效率，可以作为新型类脂质基因载体功能试剂在核酸类药物的转染中得到应用。
Figure DDA0003026851990000011

Description

一种神经酰胺类化合物及其阳离子脂质体、制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种神经酰胺类化合物及其阳离子脂质体、制备方法和应用。
背景技术
随着分子生物学的发展以及人类基因组计划的完成，基因治疗逐渐成为针对遗传性疾病、恶性肿瘤、艾滋病以及心脑血管疾病等严重威胁人类健康的重大疾病的一种的治疗方法。该方法是将正常基因或有治疗作用的基因通过特定方式导入靶细胞以纠正基因缺陷，最终达到治疗疾病的目的。与传统治疗方法相比，基因治疗可针对目的细胞进行特异性治疗，具有长期疗效。但由于外源基因进入细胞后易被核酸酶全部或部分降解，使外源基因表达效率降低，因此，选择安全高效的基因传递载体携带基因进入细胞并完成基因表达是实现基因治疗的关键。
核酸药物是各种具有不同功能的寡聚核糖核苷酸(RNA)或寡聚脱氧核糖核苷酸(DNA)，主要作用于基因水平，在信息流传递的上游阶段起作用，效率较高。由于其具有特定的靶点和作用机制，因此核酸药物具有广泛的应用前景。由于一般的核酸药物分子量大，又具有亲水性，与具有两亲性的细胞膜难以融合；核酸药物带负电荷，易与同样带有负电荷的细胞膜表面产生静电排斥，导致核酸药物难以被细胞吸收。通常情况下核酸药物需要载体协助递送。
基因传递载体可分为病毒载体和非病毒载体两大类，病毒载体尽管转染效率高，但是存在免疫原性、致癌性等多种弊端，限制了其在临床基因治疗上的应用。与病毒载体相比，非病毒载体具有安全性好、无免疫原性、导入基因容量大、易于规模化生产等优势，能够避免造成机体组织器官的损伤以及载体复合物的清除，在临床应用和治疗过程中可以替代病毒载体，具有重要的应用潜力。
阳离子脂质体(Cationic liposomes,CLs)是目前非病毒基因载体领域的研究热点，其介导的基因转移具有无毒无免疫原性、可重复转染、外源基因不易被降解等优点。1987年，阳离子脂质体首先由Felgner等应用于核酸类药物的传递。目前，阳离子脂质体介导的基因转移被认为是最具发展前景的基因治疗方法。
阳离子脂质体表面带正电荷，能与核酸的磷酸根通过静电作用，将分子包裹入内，形成复合体；也能被表面带负电荷的细胞膜吸附，再通过融合、细胞内吞作用或渗透作用，将药物传递进入细胞。但阳离子脂质体形成的纳米复合物尺寸较大，这在一定程度上影响了脂质体的细胞摄取；此外，大多数阳离子脂质体在血液循环中不稳定，还具有较高的细胞毒性。因此，如何提高转染效率、提高其稳定性和降低细胞毒性是影响阳离子脂质体作为非病毒载体应用于基因治疗的关键。
神经酰胺(Ceramide,CE)是以神经酰胺为骨架的一类磷脂，主要有神经酰胺磷酸胆碱和神经酰胺磷酸乙醇胺，磷脂是细胞膜的主要成分。神经酰胺在多种细胞因子、维生素D3、Fas及CD28配体等诱导生物效应中起重要信使作用，其介导细胞凋亡作用日益受到关注；神经酰胺也参与细胞的生长、增殖、分化、凋亡和损伤等多种生理及病理过程。同时，CE能够提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，具有良好的联合抗肿瘤应用能力。然而，目前尚没有CE与抗肿瘤药物协同作用的系统性研究，因此，基于CE的联合抗肿瘤方法具有巨大的研究意义和应用前景。
神经酰胺可由动物或植物细胞中提取，也可由人工化学合成得到。首先将羟基脂肪酸的羟基置换成氨基，再与脂肪酸合成酰胺，然后将该酰胺与鞘氨醇反应，最终得到一种新型神经酰胺。相较细胞中提取的神经酰胺，该新型神经酰胺为在常规神经酰胺的基础上进行化学修饰，具有更优异的透皮性能。过去研究已经提出了用中短链脂肪酸作为材料制备脂质体，但以该新型神经酰胺为主要膜材，构建阳离子脂质体，作为核酸药物的递送载体，目前为止，少有或几乎没有被报道过。因此，基于新型神经酰胺的阳离子脂质体具有巨大的研究意义和应用前景。
发明内容
为了克服现有技术中的技术问题，本发明一方面提供了一种神经酰胺类化合物，该化合物具有如式I所示的结构式：
Figure BDA0003026851970000031
本发明还进一步公开了所述神经酰胺类化合物的制备方法，其包括如下步骤：
1)10-羰基十八碳酸的制备：
将10-羟基十八碳酸、戴斯-马丁氧化剂和碳酸氢钠按摩尔比为(1～400)：(1～400)：(2～800)完全溶解在卤代烃类溶剂中，搅拌过夜，再加入饱和硫代硫酸钠，加入的饱和硫代硫酸钠的体积与10-羟基十八碳酸、戴斯-马丁氧化剂和碳酸氢钠混合物总质量的比1：(1～150)mL/mg，继续搅拌2～3小时，反应结束后分离纯化，得到10-羰基十八碳酸；
2)10-氨基十八碳酸的制备：
将10-羰基十八碳酸，醋酸铵和氰基硼氢化钠按摩尔比为(1～200)：(1～400)：(1～200)完全溶解于醇类溶剂中，搅拌反应，反应结束后分离纯化，得到10-氨基十八碳酸；
3)10-氨基十八碳酸甲酯的制备：
将10-氨基十八碳酸完全溶于醇类溶剂，加入二氯亚砜，加入的二氯亚砜与10-氨基十八碳酸的摩尔比为1:(100～200)，混合溶液50～80℃搅拌反应，冷至室温，分离纯化，得到10-氨基十八碳酸甲酯；
4)10-油酸酰胺基十八碳酸甲酯的制备：
将10-氨基十八碳酸甲酯、油酸、N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride(EDCI)、羟基苯并三唑(HOBt)按摩尔比为1：10：(100～200)：(100～200)完全溶于卤代烃类溶剂中，再加入三乙胺反应，加入的三乙胺与10-氨基十八碳酸甲酯摩尔比为(15～2000)：1，反应结束分离纯化，得到10-油酸酰胺基十八碳酸甲酯；
5)10-油酸酰胺基十八碳酸的制备：
将10-油酸酰胺基十八碳酸甲酯完全溶于THF-EtOH的混合溶液中，THF-EtOH的混合溶液由THF和EtOH按体积比为1：300混合而成，再加入氢氧化锂溶液搅拌反应，氢氧化锂与10-油酸酰胺基十八碳酸甲酯摩尔比为(100～560):1，反应结束分离纯化，得到10-油酸酰胺基十八碳酸。
6)式I化合物的制备：
将10-油酸酰胺基十八碳酸、鞘氨醇、EDCI、HOBt按摩尔比为1:10：(1～200)：(1～200)完全溶于卤代烃类溶剂中，再加入三乙胺搅拌反应，加入的三乙胺与10-油酸酰胺基十八碳酸摩尔比为(150～2000)：1，反应结束分离纯化，得到神经酰胺类化合物I。
优选的，所述的卤代烃类溶剂选自氯仿或二氯甲烷；所述醇类溶剂为乙醇和异丙醇的一种或两种。
另一方面，为了克服现有的脂质体包封率低、稳定性差、制备工艺复杂以及靶向性有待提高等缺陷，与此同时，基于临床各种皮肤及浅表疾病的基因治疗与皮肤的基因美容疗法等需求，以一种改性神经酰胺为主要膜材，利用其参与细胞多种生理及病理过程和联合抗肿瘤应用能力，而提供了一种基于新型神经酰胺的阳离子脂质体及其制备方法及应用。本发明的阳离子脂质体具有高效、安全、稳定、均一性好、质量稳定和可靠、制备工艺简便，可高效携载并递送核酸，同时具有优异的透皮性能等多重优点。
本发明所述的阳离子脂质体，其所述阳离子脂质体的膜包含如式I所示的神经酰胺类化合物。
本发明中，所述的阳离子脂质体的是一种50～600纳米的阳离子脂质体，较优地为50～400纳米，更优地为100～300纳米的阳离子脂质体。
所述的阳离子脂质体具有10～50毫伏的表面电位，优选为20～45毫伏的表面电位。
进一步的，其制备方法包括如下步骤：
(1)在有机溶剂中，将阳离子脂质、如式I所示的神经酰胺类化合物以及胆固醇混合，得到一澄清溶液；所述神经酰胺类化合物与所述阳离子脂质的质量比为0.1:1～50:1；所述神经酰胺类化合物与所述的胆固醇的质量比为0.5:10～5:100；
(2)旋转蒸发除去有机溶剂，形成一层薄膜；
(3)加入PBS水化，超声，过膜后，得一含有阳离子脂质体的水溶液。
进一步的，所述步骤(1)中的有机溶剂为C1～C4的醇类溶剂和卤代烃类溶剂中的一种或多种，所述的有机溶剂的体积与步骤(1)中所有组分的质量总和之比为1-10mL/mg。进一步的，所述的卤代烃类溶剂选自氯仿或二氯甲烷；所述醇类溶剂为乙醇和异丙醇的一种或两种。
进一步的，所述神经酰胺类化合物与所述阳离子脂质的质量比为0.1:1～200:10。所述神经酰胺类化合物与所述的胆固醇的质量比为0.5:1～200:10。
进一步的，所述的阳离子脂质为阳离子类脂，较佳地为氯化三甲基-2,3-二油烯氧基丙基铵、溴化三甲基-2,3-二油酰氧基丙基铵、三氟乙酸二甲基-2,3-二油烯氧基丙基-2-(2-精胺甲酰氨基)乙基铵、溴化三甲基十二烷基铵、1，2-二油酰-3-琥珀酰-sn-甘油胆碱酯、3β-[N-(N’，N’-二甲基胺乙基)胺基甲酰基]胆固醇、溴化二甲基双十八烷基铵的一种或多种。
进一步的，步骤(1)中，所述的混合的温度为10～80℃；较佳地为20～80℃，更佳地为20～70℃；
步骤(2)中，除去澄清溶液的有机溶剂的操作可为本领域常规操作，一般使用旋转蒸发器或者膜蒸发器除去有机溶剂，其中，所述的除去有机溶剂的温度根据需要除去的有机溶剂进行常规选择，旋转蒸发除去有机溶剂的合适温度为25～80℃；
步骤(3)中，用PBS水化的时间为0.1～2h，水化的温度为50～80℃；
步骤(3)中，超声为使用探头超声，超声功率为300～900W，超声时间为1～10分钟；
步骤(3)中，所述的过滤的操作可为本领域脂质体制备方法中常规的操作，其目的是除去细菌、固体颗粒、特别大的脂质体(在负载活性物质的脂质体的制备方法中，也可除去未包封的游离药物)等。本发明中，所述的过滤较佳地为微孔滤膜过滤。孔径较佳为0.15～0.25微米。
本发明还提供一种上所制备得到的阳离子脂质体在制备基因传递载体材料中的应用，所述的阳离子脂质体其携载的核酸为siRNA，DNA，质粒等。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
与现有神经酰胺相比，本发明提供的神经酰胺类化合物引起其两条长链烷基结构，所以具有更强的脂溶性，能够更好通过皮肤角质层，且安全性能好，对皮肤无刺激；其脂肪酸铵结构能够起到乳化作用，所以以该神经酰胺类化合物为膜材，构建阳离子脂质体，能够增强其膜，提高脂质体的稳定性。
本发明的有益之处在于：本发明的阳离子脂质体具有高效、安全、稳定、靶向性强、均一性好、制备工艺简便的优点。神经酰胺是以神经酰胺为骨架的一类磷脂，主要有神经酰胺磷酸胆碱和神经酰胺磷酸乙醇胺，磷脂是细胞膜的主要成分。神经酰胺在多种细胞因子、维生素D3、Fas及CD28配体等诱导生物效应中起重要信使作用，其介导细胞凋亡作用日益受到关注；同时神经酰胺也参与细胞分化等多种生理及病理过程。在表皮角质形成细胞培养过程中，神经酰胺可诱导凋亡发生。神经酰胺是生物膜双层中鞘磷脂分解产物，是公认第二信使；且在细胞的生长、增殖、分化、凋亡和损伤过程中，神经酰胺发挥广泛而重要作用。且相较细胞提取的神经酰胺，本发明合成的新型神经酰胺具有更优异的透皮性能。同时它的资源丰富，原料成本低，这将大大促进脂质体的临床应用和扩大转化，实现阳离子脂质体在基因治疗过程中的基因有效传递，对于基因治疗手段的开发具有关键的意义。
附图说明
下面结合附图对本发明作进一步地说明；
图1为实施案例1制备的神经酰胺的核磁共振氢谱图；
图2为实施案例1制备的神经酰胺的核磁共振碳谱图；
图3为实施案例4制得的脂质体的粒径分布图；
图4为实施案例4制得的脂质体的表面电位图；
图5为实施例6中control组、siRNA组、市售基因转染试剂liposome 2000+siRNA组和实施案例4制得的阳离子基因载体A+siRNA组对荧光素酶标记的人结直肠癌细胞存活率的统计图；
图6为实施例7中control组、siRNA组、liposome 2000+siRNA组和阳离子脂质体基因载体A+siRNA组对荧光素酶标记的人结直肠癌细胞的相对荧光强度统计图；
图7-1为实施例8中空白组倒置荧光显微镜观察图；
图7-2为实施例8中crisper/cas9组倒置荧光显微镜观察图；
图7-3为实施例8中Lipo-crisper/cas9组倒置荧光显微镜观察图；
图7-4为实施例8中NPs-crisper/cas9组倒置荧光显微镜观察图；
图8-1为实施例9中空白细胞组CLSM观察图；
图8-2为实施例9中Lipo-DiI组CLSM观察图；
图8-3为实施例9中NPs-Dil组CLSM观察图；
图9-1为实施例10中DiI组透过皮肤切片显微镜观察图。
图9-2为实施例10中Lipo-Dil组透过皮肤切片显微镜观察图。
图9-3为实施例10中NPs-Dil组透过皮肤切片显微镜观察图。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明。
实验中所用的荧光素酶标记的人结直肠癌细胞是通过基因工程的方法构建的。细胞培养方法：将涉及的细胞株置于含5％CO2的37℃培养箱中，用DMEM或RPMI1640完全培养基(含10％胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素)培养，0.25％胰酶-EDTA消化传代，每周传代2-3次。
实施例1神经酰胺的制备
将0.15g 10-羟基十八碳酸(0.5mmol)溶在5mL二氯甲烷中，加入0.848g戴斯-马丁氧化剂(DMP,2mmol)和0.84g碳酸氢钠(10mmol)。混合溶液室温(25±5℃)搅拌过夜。往混合溶液中加入20mL饱和硫代硫酸钠继续搅拌2小时，然后乙酸乙酯萃取，有机相无水硫酸镁干燥，减压浓缩，粗产品快速柱层析分离纯化，得到10-羰基十八碳酸；
收集0.15g 10-羰基十八碳酸(0.5mmol)，将其溶在5mL甲醇中，然后加入0.616g醋酸铵(8mmol)，室温反应1.5小时。往混合溶液中加入0.24g氰基硼氢化钠(5mmol)，搅拌2天，然后用乙酸乙酯萃取，有机相无水硫酸镁干燥，减压浓缩，粗产品快速柱层析分离纯化，得到10-氨基十八碳酸，收率为45％；
收集0.18g 10-氨基十八碳酸(0.6mmol)，将其溶于10mL甲醇，加入2.8μL二氯亚砜(0.004mmol)，混合溶液65℃搅拌过夜，冷至室温，减压浓缩，粗产品快速柱层析分离纯化，得到10-氨基十八碳酸甲酯；
收集15.6mg 10-氨基十八碳酸甲酯(0.05mmol)，将其溶于5mL二氯甲烷中，再依次加入0.144g油酸(0.5mmol)，1.568g N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimidehydrochloride(EDCI)(8mmol)，0.816g HOBt(6mmol)，再加入0.75mmol三乙胺，室温搅拌过夜，加入二氯甲烷稀释，然后用2％盐酸溶液洗3次，再用5％的碳酸氢钠溶液洗3次，有机相用无水硫酸镁干燥，减压浓缩，粗产品快速柱层析分离纯化，得到10-油酸酰胺基十八碳酸甲酯；
收集24.3mg 10-油酸酰胺基十八碳酸甲酯(0.04mmol)，将其溶于10mLTHF-EtOH(THF-EtOH的混合溶液由THF和EtOH按体积比为1：300混合而成)混合溶液中，加入16mL摩尔浓度为0.8mol/L的氢氧化锂溶液，室温搅拌过夜。混合溶液用6mol/L盐酸调至酸性，乙酸乙酯萃取，有机相无水硫酸镁干燥，减压浓缩，粗产品快速柱层析分离纯化，得到10-油酸酰胺基十八碳酸，收率75％。
收集28.5mg10-油酸酰胺基十八碳酸(0.05mmol)溶于2mL二氯甲烷中，依次加入0.168g鞘氨醇(0.5mmol)，0.59g EDCI(3mmol)，0.581g HOBt(4.2mmol)和0.72mL三乙胺，室温搅拌过夜，加入二氯甲烷稀释，然后用2％盐酸溶液洗3次，再用5％的碳酸氢钠溶液洗3次，有机相用无水硫酸镁干燥，减压浓缩，粗产品快速柱层析分离纯化，得到神经酰胺，收率81％。
实施例2神经酰胺的制备
将0.15g 10-羟基十八碳酸(0.5mmol)溶在5mL氯仿中，加入0.424g戴斯-马丁氧化剂(DMP,1mmol)和1.68g碳酸氢钠(20mmol)。混合溶液室温搅拌过夜。往混合溶液中加入5.772mL饱和硫代硫酸钠继续搅拌3小时，然后乙酸乙酯萃取，有机相无水硫酸镁干燥，减压浓缩，粗产品快速柱层析分离纯化，得到10-羰基十八碳酸；
收集0.15g 10-羰基十八碳酸(0.5mmol)，将其溶在5mL异丙醇中,然后加入0.385g醋酸铵(5mmol)，室温反应1.5小时。往混合溶液中加入0.288g氰基硼氢化钠(6mmol)，搅拌2天，然后用乙酸乙酯萃取，有机相无水硫酸镁干燥，减压浓缩，粗产品快速柱层析分离纯化，得到10-氨基十八碳酸，收率为40％；
收集0.15g 10-氨基十八碳酸(0.5mmol)，将其溶于10mL异丙醇，加入2.1μL二氯亚砜(0.003mmol),混合溶液65℃搅拌过夜，冷至室温，减压浓缩，粗产品快速柱层析分离纯化，得到10-氨基十八碳酸甲酯；
收集31.2mg 10-氨基十八碳酸甲酯(0.1mmol)，将其溶于5mL氯仿中，再依次加入0.288g油酸(1mmol)，1.97g N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimidehydrochloride(EDCI)(10mmol)，2.45g HOBt(18mmol)，再加入1mmol三乙胺，室温搅拌过夜，加入二氯甲烷稀释，然后用2％盐酸溶液洗3次，再用5％的碳酸氢钠溶液洗3次，有机相用无水硫酸镁干燥，减压浓缩，粗产品快速柱层析分离纯化，得到10-油酸酰胺基十八碳酸甲酯；
收集60.75mg 10-油酸酰胺基十八碳酸甲酯(0.1mmol)，将其溶于10mL THF-EtOH(THF-EtOH的混合溶液由THF和EtOH按体积比为1：300混合而成)混合溶液中，加入22mL摩尔浓度为0.8mol/L的氢氧化锂，室温搅拌过夜。混合溶液用6mol/L盐酸调至酸性，乙酸乙酯萃取，有机相无水硫酸镁干燥，减压浓缩，粗产品快速柱层析分离纯化，得到10-油酸酰胺基十八碳酸，收率为80％。
收集57mg 10-油酸酰胺基十八碳酸(0.1mmol)溶于2mL二氯甲烷中，依次加入0.336g鞘氨醇(1mmol)，1.57g EDCI(8mmol)，0.968g HOBt(7mmol)和2.88mL三乙胺，室温搅拌过夜，加入二氯甲烷稀释，然后用2％盐酸溶液洗3次，再用5％的碳酸氢钠溶液洗3次，有机相用无水硫酸镁干燥，减压浓缩，粗产品快速柱层析分离纯化，得到神经酰胺，收率76％。
实施例3神经酰胺的结构鉴定
利用核磁共振光谱测定实施例1制备得到的神经酰胺结构，得到相应的核磁共振氢谱图和核磁共振碳谱图，如图1和2所示，从谱图结果得到该神经酰胺具有式I所示的结构式。所述的核磁共振光谱测定方法为本领域常规的技术手段，在此不再赘述。
1H NMR(600MHz,CDCl3):δ6.50(d,J＝7.1Hz,1H),5.78(dt,J＝15.1,6.9Hz,1H,H-5),5.53(dd,J＝15.1,5.5Hz,1H,H-4),5.31-5.38(m,2H),5.18(d,J＝9.3Hz,1H),4.30-4.31(m,1H),3.90-3.97(m,3H),3.68-3.70(m,2H),3.48(b,1H),2.23(t,J＝7.5Hz,2H),2.15(q,2H),2.05(q,2H),2.01(q,4H),1.61-1.65(m,4H),1.42-1.47(m,2H),1.26-1.36(m,64H),0.87-0.89(m,9H)。
13C NMR(150MHz,CDCl3):δ173.8,173.0,133.6,130.0,129.7,129.1,74.6,62.5,54.4,48.9,37.2,36.7,35.4,35.2,35.2,32.3,31.9,31.9,31.9,29.8,29.7,29.7,29.7,29.7,29.6,29.6,29.6,29.6,29.5,29.4,29.3,29.3,29.3,29.2,29.2,29.1,29.1,28.9,28.8,28.8,28.8,28.7,27.2,27.2,26.0,26.0,25.9,25.6,25.6,22.7,22.7,22.7,14.1。
与现有神经酰胺相比，该神经酰胺类化合物引起其两条长链烷基结构，所以具有更强的稳定性、脂溶性，能够更好通过皮肤角质层；其脂肪酸铵结构能够起到乳化作用，所以以该神经酰胺类化合物为膜材，构建阳离子脂质体，能够增强其膜，提高脂质体的稳定性。
Figure BDA0003026851970000101
实施例4阳离子脂质体基因载体的制备
称取1mg实施例1所得的神经酰胺、10mg DOTAP和2mg胆固醇，加入15mL氯仿中混合，混合温度为20～70℃，在室温下，搅拌形成澄清溶液；在25～80℃的恒温水浴中，旋转蒸发除去有机溶剂，成膜，加入5mLPBS，50℃水化0.1h，在超声功率为300W，超声时间为1-10分钟的探头超声作用下，使脂质体颗粒在0.1-0.3微米，通过0.22微米的微孔滤膜，得到阳离子脂质体基因载体。经检测，该脂质体的平均粒径为140nm(具体见图3)，表面电位为26.5mV(具体见图4)。
实施例5阳离子脂质体核酸类药物制剂的制备
(1)制备核酸类药物制剂平衡液：取PBS作为核酸类药物制剂的平衡液。
(2)制备阳离子脂质体核酸类药物制剂：按照N/P比为10:1，取相应量的siRNA溶于10μL的PBS，与溶有阳离子脂质体的平衡液混合，复合30min，制备得本发明所述的阳离子脂质体核酸类药物制剂。
本发明中所述的N/P比是阳离子脂质体基因载体中的氮的摩尔含量和核酸中磷的摩尔含量之比，这是基因转染领域中的技术人员所熟知的常识，在此不再赘述。所述的阳离子脂质体为实施例4所述的阳离子脂质体基因载体。
实施例6阳离子脂质体核酸类药物制剂对荧光素酶标记的人结直肠癌细胞的细胞毒性
良好的生物相容性是核酸类药物制剂应用的前提，本实验采用荧光素酶标记的人结直肠癌细胞，比较了在一定N/P比条件下的阳离子脂质体核酸类药物制剂与市售基因转染试剂liposome 2000的细胞毒性。
具体的细胞毒性评价操作如下：
(1)将实施例4的阳离子脂质体基因载体按实施例5所述的方法携载siRNA成为阳离子脂质体核酸类药物制剂，以下将之简称为A。
(2)种板：培养荧光素酶标记的人结直肠癌细胞，传入96孔板中，分成4大组，如图5所示，分别为control组(空白对照组)、2μmol/mL siRNA组(阴性对照组)、3.3μg/mLliposome 2000+siRNA组(阳性对照组)和阳离子脂质体基因载体A+siRNA组(实验组)，其中实验组又分为4小组，分别取A浓度为2.5、5.0、10.0、20.0μg/mL。每组设置3个复孔。细胞密度为1×105个/mL，培养24h。
(3)加药：在转染前，将24孔板的培养液换成100μL不含血清的RPMI1640培养液培养。在空白对照组每孔细胞中，加入10μLPBS平衡液，阴性对照组加入10μL 2μmol/mLsiRNA，阳性对照组加入3.3μg/mL liposome 2000+siRNA，实验组各小组加入对应浓度10μLA+siRNA，轻轻混匀，于常规条件下培养，细胞孵育6-8小时后，换成含10％血清的RPMI1640培养液。
(4)细胞毒性评价：通过CCK-8试剂盒法进行检测。采用酶联免疫检测仪在波长为450nm条件下测定吸光度值，以未处理细胞为参照，计算细胞存活率。细胞存活率的计算公式如下：
细胞存活率(％)＝OD490(样品)/OD490(对照)×100％；其中，OD490(样品)为实验组的OD值，OD490(对照)为空白对照组的OD值。
实验结果如图5所示：细胞毒性实验表明，基于新型神经酰胺的阳离子脂质体的Sample组其细胞存活率均较高，远优于市售基因转染试剂liposome 2000，说明该核酸类药物制剂具有很好的生物相容性。
实施例7阳离子脂质体核酸类药物制剂对荧光素酶标记的人结直肠癌细胞转染活性评价
具体的转染活性评价操作如下：
(1)将实施例4的阳离子脂质体基因载体按实施例5所述的方法携载siRNA成为阳离子脂质体核酸类药物制剂，以下将之简称为A。
(2)种板：培养荧光素酶标记的人结直肠癌细胞，传入24孔板中，分成4组，如图6所示，分别为control组(空白对照组)、2μmol/mL siRNA组(阴性对照组)、3.3μg/mL liposome2000+siRNA组(阳性对照组)和阳离子脂质体基因载体A+siRNA组(实验组)，其中实验组又分为4小组，分别取A：SiRNA＝2.5、5、10、20。每组设置3个复孔。细胞密度为1×105个/mL，待细胞达到60-70％进行转染。
(3)加药：在转染前，将24孔板的培养液换成500μL不含血清的RPMI1640培养液培养。在空白对照组每孔细胞中，加入10μL PBS平衡液，阴性对照组加入10μL 2μmol/mLsiRNA，阳性对照组加入3.3μg/mL liposome 2000+siRNA，实验组各小组加入对应质量比10μL A+siRNA，轻轻混匀，于常规条件下培养，细胞孵育6-8小时后，换成含10％血清的RPMI1640培养液。
(4)基因转染效果的评价：荧光素酶报告基因实验是检测转录因子和其靶启动子中的特异顺序结合的重要手段。荧光素酶与底物反应，产生荧光，通过检测荧光的强度可以测定荧光素酶的活性，从而判断转录因子是否能与此靶启动子片段有作用。在本实验中，阳离子脂质体基因载体携载的是针对荧光素酶的siRNA，其产生荧光强度越弱，说明基因转染效率越高。按下式计算相对荧光强度百分率：
相对荧光强度百分率(％)＝F(实验组)/F(空白对照组)×100％
实验结果如图6所示：转染评价实验效果表明，基于新型神经酰胺的阳离子脂质体A其有良好的转染效率，体现剂量效应关系，当A：SiRNA＝20:1转染效率较市售基因转染试剂liposome 2000有提高。这说明该阳离子脂质体基因载体具有良好的携载核酸类药物的能力且稳定性佳，对新的基因治疗手段的开发具有关键的意义。
实施例8阳离子脂质体核酸类药物制剂对CRISPR/Cas9双质粒系统的转染活性评价
CRISPR----Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats是在细菌和古细菌中广泛存在的成簇的、有规律的、间隔的短回文重复序列。07年，发现细菌可以用CRISPR系统抵抗噬菌体的入侵；08年，发现细菌的CRISPR系统能够阻止外源质粒的转移。它是细菌的一种获得性免疫系统。CRISPR/Cas9----CRIPSR-Cas系统分为Type I、TypeII、Type III三种类型。在TypeII系统中包含一个标志性的Cas9蛋白(参与crRNA的成熟以及降解入侵的噬菌体DNA或外源质粒)。CRISPR/Cas系统和Cas9蛋白结合成复合体，发挥识别和降解入侵的外源DNA功能。
具体的转染活性评价操作如下：
(1)将实施例4的阳离子脂质体基因载体按实施例5所述的方法携载CRISPR/Cas9双质粒成为阳离子脂质体核酸类药物制剂，以下将之简称为A。
(2)种板：培养荧光素酶标记的人结直肠癌细胞，传入24孔板中，分成4组，分别为空白组、1.3μg/mL crisper/cas9组、3.3μg/mL Lipo-crisper/cas9组和3.3μg/mL NPs-crisper/cas9组。每组设置3个复孔，细胞密度为1×105个/mL，待细胞达到60-70％进行转染。
(3)加药：在转染前，将24孔板的培养液换成500μL不含血清的RPMI1640培养液培养。在空白组每孔细胞中，加入50μL PBS平衡液，crisper/cas9组加入50μL 1.3μg/mLcrisper/cas9，Lipo-crisper/cas9组加入50μL 3.3μg/mL Lipo-crisper/cas9，NPs-crisper/cas9组加入50μL 3.3μg/mL A，轻轻混匀，于常规条件下培养，细胞孵育6-8小时后，换成含10％血清的RPMI1640培养液。
(4)基因转染效果的评价：
我们准备能够编码绿色荧光蛋白(GFP)的gRNA质粒(GFP-sgPlk1质粒)。从GFP的表达上看出细胞的转染效率。通过倒置荧光显微镜检测，观察所制备阳离子脂质体的转染效率。
实验结果如图7-1～7-4所示：转染评价实验效果表明，基于新型神经酰胺的阳离子脂质体A对CRISPR/Cas9双质粒系统有良好的转染效率，修饰后的神经酰胺能够显著提高核酸类药物的入胞能力，这为阳离子脂质体在递送CRISPR/Cas9双质粒系统对肿瘤其治疗作用的领域有着重要的意义。
实施例9阳离子脂质体核酸类药物制剂对细胞摄取核酸类药物效率评价
荧光染料Dil被认为以类似于磷脂的方式与脂蛋白结合，最初用于荧光显微镜下观察细胞结合或内吞脂蛋白，并能进行半定量分析。用有机溶剂提取细胞膜受体结合的Dil标记的脂蛋白或用NaOH/SDS裂解液裂解细胞后直接进行荧光分析,可以定量检测脂蛋白受体活性,这一方法被广泛用于脂蛋白受体结构与功能关系的研究。
具体的实验操作如下：
(1)将实施例4的阳离子脂质体基因载体按实施例5所述的方法携载Dil成为阳离子脂质体核酸类药物制剂，以下将之简称为A。
(2)种板：培养荧光素酶标记的人结直肠癌细胞，传入24孔板中，分成3组，如图8-1、图8-2、图8-3所示，分别为空白细胞组、3.3μg/mL Lipo-Dil组和3.3μg/mL NPs-Dil组，每组设置3个复孔。细胞密度为1×105个/mL，待细胞达到60-70％进行转染。
(3)加药：在转染前，将24孔板的培养液换成500μL不含血清的RPMI1640培养液培养。在空白组每孔细胞中，加入50μL PBS平衡液，Lipo-Dil组加入50μL 3.3μg/mL Lipo-Dil，NPs-Dil组加入50μL 3.3μg/mL A，轻轻混匀，于常规条件下培养，细胞孵育6-8小时后，换成含10％血清的RPMI1640培养液。
(4)细胞摄取效率的评价：
我们通过CLSM显微镜检测，观察所制备阳离子脂质体的细胞摄取效率。
实验结果如图8-1～8-3所示：细胞摄取效率实验效果表明，脂质体能够提升核酸类药物的入胞效率，但远未达到预期目标；基于新型神经酰胺的阳离子脂质体A能够大幅度提升核酸类药物的入胞效率，增强细胞对核酸类药物的吸收。
实施例10阳离子脂质体核酸类药物制剂对药物透皮效率评价
具体的实验操作如下：
(1)将实施例4的阳离子脂质体基因载体按实施例5所述的方法携载Dil成为阳离子脂质体核酸类药物制剂，以下将之简称为A。
(2)制皮：将小鼠断颈处死，取腹部皮肤，用生理盐水反复冲洗干净，将皮肤固定于Franz扩散池上。
(3)加药：实验设置组别为3组，分别为Dil组、3.3μg/mL Lipo-Dil组和3.3μg/mLNPs-Dil组，取适量生理盐水加入接收池，Dil组中加入1mLPBS，Lipo-Dil组加入1mL 3.3μg/mL Lipo-Dil，NPs-Dil组加入1mL3.3μg/mLA，用保鲜膜将供给池封闭。
(4)药物透皮效率的评价：
实验结束后取皮肤纵切面制片，在显微镜下摄影。
实验结果如图9-1～9-3所示：脂质体透皮效率实验效果表明，Dil作为一种荧光染料无法透皮吸收，而使用基于新型神经酰胺的阳离子脂质体包裹核酸类药物可以大大促进药物的透皮效率。

Claims (10)

1.一种神经酰胺类化合物，其特征在于，具有如式I所示的结构式：
Figure FDA0003026851960000011
2.一种权利要求1所述神经酰胺类化合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)将10-羟基十八碳酸、戴斯-马丁氧化剂和碳酸氢钠按摩尔比为(1～400)：(1～400)：(2～800)完全溶解在卤代烃类溶剂中，搅拌过夜，再加入饱和硫代硫酸钠，加入的饱和硫代硫酸钠的体积与10-羟基十八碳酸、戴斯-马丁氧化剂和碳酸氢钠混合物总质量的比1：(1～150)mL/mg，继续搅拌2～3小时，反应结束后分离纯化，得到10-羰基十八碳酸；
2)将10-羰基十八碳酸，醋酸铵和氰基硼氢化钠按摩尔比为(1～200)：(1～400)：(1～200)完全溶解于醇类溶剂中，搅拌反应，反应结束后分离纯化，得到10-氨基十八碳酸；
3)将10-氨基十八碳酸完全溶于醇类溶剂，加入二氯亚砜，加入的二氯亚砜与10-氨基十八碳酸的摩尔比为1:(100～200)，混合溶液50～80℃搅拌反应，冷至室温，分离纯化，得到10-氨基十八碳酸甲酯；
4)将10-氨基十八碳酸甲酯、油酸、N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride(EDCI)、羟基苯并三唑(HOBt)按摩尔比为1：10：(100～200)：(100～200)完全溶于卤代烃类溶剂中，再加入三乙胺反应，加入的三乙胺与10-氨基十八碳酸甲酯摩尔比为(15～2000)：1，反应结束分离纯化，得到10-油酸酰胺基十八碳酸甲酯；
5)将10-油酸酰胺基十八碳酸甲酯完全溶于THF-EtOH的混合溶液中，THF-EtOH的混合溶液由THF和EtOH按体积比为1：300混合而成，再加入氢氧化锂溶液搅拌反应，氢氧化锂与10-油酸酰胺基十八碳酸甲酯摩尔比为(100～560):1，反应结束分离纯化，得到10-油酸酰胺基十八碳酸。
6)将10-油酸酰胺基十八碳酸、鞘氨醇、EDCI、HOBt按摩尔比为1:10：(1～200)：(1～200)完全溶于卤代烃类溶剂中，再加入三乙胺搅拌反应，加入的三乙胺与10-油酸酰胺基十八碳酸摩尔比为(150～2000)：1，反应结束分离纯化，得到神经酰胺类化合物I。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的卤代烃类溶剂选自氯仿或二氯甲烷；所述醇类溶剂为乙醇和异丙醇的一种或两种。
4.一种阳离子脂质体，其特征在于，所述阳离子脂质体的膜包含如式I所示的神经酰胺类化合物。
5.如权利要求4所述的阳离子脂质体，其特征在于，其制备方法包括如下步骤：
(1)在有机溶剂中，将阳离子脂质、如式I所示的神经酰胺类化合物以及胆固醇混合，得到一澄清溶液；所述神经酰胺类化合物与所述阳离子脂质的质量比为0.1:1～50:1；所述神经酰胺类化合物与所述的胆固醇的质量比为0.5:10～5:100；
(2)旋转蒸发除去有机溶剂，形成一层薄膜；
(3)加入PBS水化，超声，过膜后，得一含有阳离子脂质体的水溶液。
6.如权利要求5所述的阳离子脂质体，其特征在于，所述步骤(1)中的有机溶剂为为C1～C4的醇类溶剂和卤代烃类溶剂中的一种或多种，所述的有机溶剂的体积与步骤(1)中所有组分的质量总和之比为1-10mL/mg。
7.如权利要求5所述的阳离子脂质体，其特征在于，所述神经酰胺类化合物与所述阳离子脂质的质量比为0.1:1～200:10；所述神经酰胺类化合物与所述的胆固醇的质量比为0.5:1～200:10。
8.如权利要求5所述的阳离子脂质体，其特征在于，所述的阳离子脂质为氯化三甲基-2,3-二油烯氧基丙基铵、溴化三甲基-2,3-二油酰氧基丙基铵、三氟乙酸二甲基-2,3-二油烯氧基丙基-2-(2-精胺甲酰氨基)乙基铵、溴化三甲基十二烷基铵、1，2-二油酰-3-琥珀酰-sn-甘油胆碱酯、3β-[N-(N’，N’-二甲基胺乙基)胺基甲酰基]胆固醇、溴化二甲基双十八烷基铵的一种或多种。
9.如权利要求5所述的阳离子脂质体，其特征在于，
步骤(1)中，所述的混合的温度为10～80℃；
步骤(2)中，旋转蒸发除去有机溶剂的合适温度为25～80℃；
步骤(3)中，用PBS水化的时间为0.1～2h，水化的温度为50～80℃；
步骤(3)中，超声为使用探头超声，超声功率为300～900W，超声时间为1～10分钟；
步骤(3)中，所述的过膜所使用孔径大小为0.15～0.25μm的微孔滤膜。
10.如权利要求3-9任一项所述的阳离子脂质体在制备基因传递载体材料中的应用。
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