CN109157514B - 一种以脂肪酸为膜材的阳离子脂质体及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种以脂肪酸为膜材的阳离子脂质体及其制备方法和应用。所述的阳离子脂质体具有膜，所述的膜包含脂肪酸、阳离子脂质和胆固醇。本发明的阳离子脂质体具有高效、安全、稳定、靶向均一性好、质量稳定和可靠、制备工艺简便等优点。作为核酸类药物阳离子基因转染试剂，本发明提供的一种以新型脂肪酸为组分的阳离子脂质体与市售商品化基因转染试剂liposome 2000相比具有明显较低的细胞毒性，和显著升高的基因转染效率，可以作为新型类脂质基因载体功能试剂在核酸类药物的转染中得到应用。

Description

一种以脂肪酸为膜材的阳离子脂质体及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种以脂肪酸为膜材的阳离子脂质体及其制备方法和应用。
背景技术
随着分子生物学的发展以及人类基因组计划的完成，基因治疗逐渐成为针对遗传性疾病、恶性肿瘤、艾滋病以及心脑血管疾病等严重威胁人类健康的重大疾病的一种的治疗方法。该方法是将正常基因或有治疗作用的基因通过特定方式导入靶细胞以纠正基因缺陷，最终达到治疗疾病的目的。与传统治疗方法相比，基因治疗可针对目的细胞进行特异性治疗，具有长期疗效。但由于外源基因进入细胞后易被核酸酶全部或部分降解，使外源基因表达效率降低，因此，选择安全高效的基因传递载体携带基因进入细胞并完成基因表达是实现基因治疗的关键。基因传递载体可分为病毒载体和非病毒载体两大类，病毒载体尽管转染效率高，但是存在免疫原性、致癌性等多种弊端，限制了其在临床基因治疗上的应用。与病毒载体相比，非病毒载体具有安全性好、无免疫原性、导入基因容量大、易于规模化生产等优势，在临床应用和治疗过程中可以替代病毒载体，具有重要的应用潜力。因此，研制安全高效的非病毒基因载体是目前基因治疗中亟待解决的问题。
阳离子脂质体(cationic liposomes,CLs)是目前非病毒基因载体领域的研究热点，其介导的基因转移具有无毒无免疫原性、可重复转染、外源基因不易被降解等优点。1987年，阳离子脂质体首先由Felgner等应用于核酸类药物的传递。目前，阳离子脂质体介导的基因转移被认为是最具发展前景的基因治疗方法。
然而，到目前为止，虽然国内外已经报道了多种阳离子脂质体，市面上也有出售的阳离子脂质体如：LipofectamineTM2000TransfectionReagent、LipofectamineTM LTXReagent with PLUSTM Reagent，但是大多数阳离子脂质体在血液循环中不稳定，还具有较高的细胞毒性。因此，如何提高转染效率、降低细胞毒性和提高其稳定性是影响阳离子脂质体作为非病毒载体应用于基因治疗的关键。
此外，目前阳离子脂质体所采用的常用原料有阳离子脂质和辅助磷脂。阳离子脂质主要有氯化三甲基-2,3-二油烯氧基丙基铵、溴化三甲基-2,3-二油酰氧基丙基铵、三氟乙酸二甲基-2,3-二油烯氧基丙基-2-(2-精胺甲酰氨基)乙基铵、溴化三甲基十二烷基铵、1，2-二油酰-3-琥珀酰-sn-甘油胆碱酯、3β-[N-(N’，N’-二甲基胺乙基)胺基甲酰基]胆固醇、溴化二甲基双十八烷基铵。由与这些原料本身的物理化学性质，使得所制备的阳离子脂质体存在如成本较高，毒性大，稳定性差，储存周期短等问题。
不饱和脂肪酸是构成体内脂肪的一种脂肪酸，人体必需的脂肪酸。不饱和脂肪酸根据双键个数的不同，分为单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸二种。食物脂肪中，单不饱和脂肪酸有油酸，多不饱和脂肪酸有亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸等。人体不能合成亚油酸和亚麻酸，必须从膳食中补充。根据双键的位置及功能又将多不饱和脂肪酸分为ω-6系列和ω-3系列。亚油酸和花生四烯酸属ω-6系列，亚麻酸、DHA、EPA属ω-3系列。
它具有以下的生理功能：1.保持细胞膜的相对流动性，以保证细胞的正常生理功能；2.使胆固醇酯化，降低血中胆固醇和甘油三酯；3.是合成人体内前列腺素和凝血恶烷的前躯物质；4.降低血液粘稠度，改善血液微循环；5.提高脑细胞的活性，增强记忆力和思维能力。它还具有调节血脂、清理血栓、免疫调节、维护视网膜提高视力、补脑健脑、改善关节炎症状减轻疼痛的作用。
过去研究已经提出了用中短链脂肪酸作为材料制备脂质体，但是还没有任何关于合成的长链脂肪酸作为脂质体膜材料用于制备空白阳离子脂质体携载药物的报道，并且由于纯的中短链脂肪酸没有必需脂肪酸，应用后会有几率出现血栓性静脉炎、面部潮红、恶心、脑电图改变、脑病、乳酸酸中毒等的副作用，所以应用人体必需的长链脂肪酸制备脂质体对于基因递送载体的研究有重要意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为了克服现有的脂质体包封率低、稳定性差、制备工艺复杂以及靶向性有待进一步提高等缺陷，而提供了一种以脂肪酸为膜材的阳离子脂质体其制备方法及应用。本发明的阳离子脂质体具有高效、安全、稳定、靶向性强、均一性好、质量稳定和可靠、制备工艺简便等优点，并可用于包封核酸类药物。
本发明解决技术问题所采用的技术方案如下：一种以脂肪酸为膜材的阳离子脂质体，所述的阳离子脂质体具有膜，所述的膜包含如式I的脂肪酸：
Figure GDA0002491646830000021
作为优选，所述的膜还包含阳离子脂质；所述的如式I所示的脂肪酸与所述的阳离子脂质的质量比为0.1:1～50:1，较佳地为0.1:1～20:1，更佳地为0.1:1～10:1。
作为优选，所述的膜进一步包含胆固醇；所述的如式I所示的脂肪酸与所述的胆固醇的质量比为0.5:1～50:1，较佳地为0.5:1～20:1，更佳地为0.5:1～10:1。
作为优选，所述的阳离子脂质为阳离子类脂，较佳地为氯化三甲基-2,3-二油烯氧基丙基铵、溴化三甲基-2,3-二油酰氧基丙基铵、三氟乙酸二甲基-2,3-二油烯氧基丙基-2-(2-精胺甲酰氨基)乙基铵、溴化三甲基十二烷基铵、1，2-二油酰-3-琥珀酰-sn-甘油胆碱酯、3β-[N-(N’，N’-二甲基胺乙基)胺基甲酰基]胆固醇、溴化二甲基双十八烷基铵的一种或多种。
本发明中，所述的阳离子脂质体的是一种50～600纳米的阳离子脂质体，较优地为50～400纳米，更优地为100～300纳米的阳离子脂质体。
本发明中，所述的阳离子脂质体具有10～50毫伏的表面电位，优选为20～45毫伏的表面电位。
本发明的另一目的是提供一种上述的阳离子脂质体的制备方法，包括以下步骤：
(1)在有机溶剂中，将阳离子脂质、如式I所示的脂肪酸以及胆固醇混合，得到一澄清溶液；
(2)旋转蒸发除去有机溶剂，形成一层薄膜；
(3)加入PBS水化，超声，过膜后，得一含有阳离子脂质体的水溶液。
作为优选，所述的如式I所示的脂肪酸的制备方法如下：
(1)10-羰基十八碳酸的制备：将10-羟基十八碳酸、戴斯-马丁氧化剂和碳酸氢钠按摩尔比为(1～2)：(1～2)：(2～4)完全溶解在卤代烃类溶剂中，搅拌过夜，再加入饱和硫代硫酸钠，加入的饱和硫代硫酸钠的体积与10-羟基十八碳酸、戴斯-马丁氧化剂和碳酸氢钠混合物总质量的比1/14(ml/mg)，继续搅拌2～3小时，然后萃取，干燥，减压浓缩，分离纯化，得到10-羰基十八碳酸；其中卤代烃类溶剂较佳地为氯仿和二氯甲烷；
(2)10-氨基十八碳酸的制备：将10-羰基十八碳酸，醋酸铵和氰基硼氢化钠按摩尔比为(1～2)：(2～8)：(1～2)完全溶解于醇类溶剂中，搅拌，然后萃取、干燥、减压浓缩分离纯化，得到10-氨基十八碳酸；其中醇类溶剂较佳地为乙醇和异丙醇的一种或两种；
(3)10-氨基十八碳酸甲酯的制备：将10-氨基十八碳酸完全溶于醇类溶剂，加入二氯亚砜，加入的二氯亚砜与10-氨基十八碳酸的摩尔比为1:(10～20)，混合溶液65℃搅拌过夜，冷至室温，减压浓缩，分离纯化，得到10-氨基十八碳酸甲酯；其中醇类溶剂较佳地为乙醇和异丙醇的一种或两种；
(4)10-油酸酰胺基十八碳酸甲酯的制备：将10-氨基十八碳酸甲酯、油酸、N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride(EDCI)、羟基苯并三唑(HOBt)按摩尔比为1：1：(1～2)：(1～2)完全溶于卤代烃类溶剂中，再加入三乙胺，加入的三乙胺与10-氨基十八碳酸甲酯摩尔比为(15～20)：1，搅拌过夜，加入二氯甲烷进行稀释，然后清洗，干燥，减压浓缩，分离纯化，得到10-油酸酰胺基十八碳酸甲酯；其中卤代烃类溶剂较佳地为氯仿和二氯甲烷；
(5)10-油酸酰胺基十八碳酸的制备：将10-油酸酰胺基十八碳酸甲酯完全溶于THF-EtOH的混合溶液中，THF-EtOH的混合溶液由THF和EtOH按体积比为1：3混合而成，再加入氢氧化锂溶液，氢氧化锂与10-油酸酰胺基十八碳酸摩尔比为(10～16):1，搅拌过夜，再用盐酸调至酸性，萃取，干燥，减压浓缩，分离纯化，得到脂肪酸。
作为优选，步骤(1)中，所述的有机溶剂为C1～C4的醇类溶剂和卤代烃类溶剂中的一种或多种；所述的C1～C4的醇类溶剂较佳地为乙醇和异丙醇的一种或两种；所述的卤代烃类溶剂较佳地为氯仿和二氯甲烷；所述的有机溶剂的体积与步骤(1)中所有组分的质量总和之比为1-10mL/mg。
作为优选，脂肪酸、阳离子脂质和胆固醇的质量比为1:(0.02～10):(0.02～2)，较佳地为1:(0.05～10):(0.05～2)，更佳地为1:(0.1～10):(0.1～2)。
作为优选，步骤(1)中，所述的混合的温度为10～80℃，较佳地为20～80℃，更佳地为20～70℃；
步骤(2)中，除去澄清溶液的有机溶剂的操作可为本领域常规操作，一般使用旋转蒸发器或者膜蒸发器除去有机溶剂，其中，所述的除去有机溶剂的温度根据需要除去的有机溶剂进行常规选择，旋转蒸发除去有机溶剂的合适温度为25～80℃；
步骤(3)中，用PBS水化的时间为0.1～2h，水化的温度为50～80℃；
步骤(3)中，超声为使用探头超声，超声功率为300～900W，超声时间为1～10分钟；
步骤(3)中，所述的过滤的操作可为本领域脂质体制备方法中常规的操作，其目的是除去细菌、固体颗粒、特别大的脂质体(在负载活性物质的脂质体的制备方法中，也可除去未包封的游离药物)等。本发明中，所述的过滤较佳地为微孔滤膜过滤。所述的微孔滤膜的孔径较佳地为0.22微米。
本发明还提供一种上所制备得到的阳离子脂质体在制备基因传递载体材料中的应用，所述的阳离子脂质体其携载的核酸为siRNA，DNA，质粒等。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的有益之处在于：本发明的阳离子脂质体具有高效、安全、稳定、靶向性强、均一性好、制备工艺简便的优点。不饱和脂肪酸是构成体内脂肪的一种脂肪酸，人体必需的脂肪酸。它具有以下的生理功能：1.保持细胞膜的相对流动性，以保证细胞的正常生理功能；2.使胆固醇酯化，降低血中胆固醇和甘油三酯；3.是合成人体内前列腺素和凝血恶烷的前躯物质；4.降低血液粘稠度，改善血液微循环；5.提高脑细胞的活性，增强记忆力和思维能力。它还具有调节血脂、清理血栓、免疫调节、维护视网膜提高视力、补脑健脑、改善关节炎症状减轻疼痛的作用。同时它的资源丰富，原料成本低。这将大大促进脂质体的临床应用和扩大转化，实现阳离子脂质体在基因治疗过程中的基因有效传递，对于基因治疗手段的开发具有关键的意义。
附图说明
下面结合附图对本发明作进一步地说明；
图1为实施案例1制备的新型脂肪酸的核磁共振氢谱图；
图2为实施案例1制备的新型脂肪酸的核磁共振碳谱图；
图3为10-油酸酰胺基十八碳酸鞘氨脂的核磁共振氢谱图；
图4为10-油酸酰胺基十八碳酸鞘氨脂的核磁共振碳谱图；
图5为实施案例4制得的脂质体的粒径分布图；
图6为实施案例5制得的脂质体的粒径分布图；
图7为实施案例6制得的脂质体的粒径分布图；
图8为实施案例7制得的脂质体的粒径分布图；
图9为实施案例8制得的脂质体的粒径分布图；
图10为实施案例9制得的脂质体的粒径分布图；
图11为实施案例10制得的脂质体的粒径分布图；
图12为实施例12中control组、siRNA组、市售基因转染试剂liposome 2000+siRNA组和实施案例10制得的阳离子基因载体A+siRNA组对萤光素酶标记的人结直肠癌细胞存活率的统计图；
图13为实施例13中control组、siRNA组、市售基因转染试剂liposome 2000+siRNA组、实施案例10制得的阳离子基因载体A1+siRNA组和存放两个月后实施案例10制得的阳离子基因载体A2+siRNA组对萤光素酶标记的人结直肠癌细胞的相对荧光强度统计图；
图14-1为实施例14中control组显微镜观察图；
图14-2为实施例14中crisper/Cas9双质粒组显微镜观察图；
图14-3为实施例14中市售基因转染试剂liposome 2000+crisper/Cas9双质粒组显微镜观察图；
图14-4为实施例14中市售基因转染试剂PEI+crisper/Cas9双质粒组显微镜观察图；
图14-5为实施例14中实施案例10制得的阳离子基因载体A1+crisper/Cas9双质粒组显微镜观察图；
图14-6为实施例14中存放两个月后实施案例10制得的阳离子基因载体A2+crisper/Cas9双质粒组显微镜观察图。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明。
实验中所用的荧光素酶标记的人结直肠癌细胞是通过基因工程的方法构建的。细胞培养方法：将涉及的细胞株置于含5％CO2的37℃培养箱中，用DMEM或RPMI1640完全培养基(含10％胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素)培养，0.25％胰酶-EDTA消化传代，每周传代2-3次。
实施例1脂肪酸的制备
将30.0mg10-羟基十八碳酸(0.1mmol)溶在5mL二氯甲烷中，加入84.8mg戴斯-马丁氧化剂(DMP,0.2mmol)和33.6mg碳酸氢钠(0.4mmol)。混合溶液室温(25±5℃)搅拌过夜。往混合溶液中加入10.6mL饱和硫代硫酸钠继续搅拌2小时，然后乙酸乙酯萃取，有机相无水硫酸镁干燥，减压浓缩，粗产品快速柱层析分离纯化，得到10-羰基十八碳酸；
收集30.0mg 10-羰基十八碳酸(0.1mmol)，将其溶在2mL甲醇中，然后加入61.6mg醋酸铵(0.8mmol)，室温反应1.5小时。往混合溶液中加入4.8mg氰基硼氢化钠(0.1mmol)，搅拌2天，然后用乙酸乙酯萃取，有机相无水硫酸镁干燥，减压浓缩，粗产品快速柱层析分离纯化，得到10-氨基十八碳酸，收率为45％；
收集30.0mg 10-氨基十八碳酸(0.1mmol)，将其溶于10mL甲醇，加入7μL二氯亚砜(0.01mmol)，混合溶液65℃搅拌过夜，冷至室温，减压浓缩，粗产品快速柱层析分离纯化，得到10-氨基十八碳酸甲酯；
收集15.6mg 10-氨基十八碳酸甲酯(0.05mmol)，将其溶于2mL二氯甲烷中，再依次加入14.4mg油酸(0.05mmol)，9.8mg N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimidehydrochloride(0.05mmol)，6.8mg HOBt(0.05mmol)，再加入0.75mmol三乙胺，室温搅拌过夜，加入二氯甲烷稀释，然后用2％盐酸溶液洗3次，再用5％的碳酸氢钠溶液洗3次，有机相用无水硫酸镁干燥，减压浓缩，粗产品快速柱层析分离纯化，得到10-油酸酰胺基十八碳酸甲酯；
收集24.3mg 10-油酸酰胺基十八碳酸甲酯(0.04mmol)，将其溶于10mL THF-EtOH(THF-EtOH的混合溶液由THF和EtOH按体积比为1：3混合而成)混合溶液中，加入0.8mL摩尔浓度为0.8mol/L的氢氧化锂溶液，室温搅拌过夜。混合溶液用6mol/L盐酸调至酸性，乙酸乙酯萃取，有机相无水硫酸镁干燥，减压浓缩，粗产品快速柱层析分离纯化，得到新型脂肪酸，收率75％。
实施例2脂肪酸的制备
将30.0mg10-羟基十八碳酸(0.1mmol)溶在5mL氯仿中，加入42.414mg戴斯-马丁氧化剂(DMP,0.1mmol)和8.4mg碳酸氢钠(0.1mmol)。混合溶液室温搅拌过夜。往混合溶液中加入5.772mL饱和硫代硫酸钠继续搅拌3小时，然后乙酸乙酯萃取，有机相无水硫酸镁干燥，减压浓缩，粗产品快速柱层析分离纯化，得到10-羰基十八碳酸；
收集30.0mg 10-羰基十八碳酸(0.1mmol)，将其溶在2mL异丙醇中,然后加入7.708mg醋酸铵(0.1mmol)，室温反应1.5小时。往混合溶液中加入4.8mg氰基硼氢化钠(0.1mmol)，搅拌2天，然后用乙酸乙酯萃取，有机相无水硫酸镁干燥，减压浓缩，粗产品快速柱层析分离纯化，得到10-氨基十八碳酸，收率为40％；
收集30.0mg 10-氨基十八碳酸(0.1mmol)，将其溶于10mL异丙醇，加入3.5uL二氯亚砜(0.005mmol),混合溶液65℃搅拌过夜，冷至室温，减压浓缩，粗产品快速柱层析分离纯化，得到10-氨基十八碳酸甲酯；
收集15.6mg 10-氨基十八碳酸甲酯(0.05mmol)，将其溶于2mL氯仿中，再依次加入14.4mg油酸(0.05mmol)，19.7mg N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimidehydrochloride(0.1mmol)，13.6mg HOBt(0.1mmol)，再加入1mmol三乙胺，室温搅拌过夜，加入二氯甲烷稀释，然后用2％盐酸溶液洗3次，再用5％的碳酸氢钠溶液洗3次，有机相用无水硫酸镁干燥，减压浓缩，粗产品快速柱层析分离纯化，得到10-油酸酰胺基十八碳酸甲酯；
收集24.3mg 10-油酸酰胺基十八碳酸甲酯(0.04mmol)，将其溶于10mL THF-EtOH(THF-EtOH的混合溶液由THF和EtOH按体积比为1：3混合而成)混合溶液中，加入0.5mL摩尔浓度为0.8mol/L的氢氧化锂，室温搅拌过夜。混合溶液用6mol/L盐酸调至酸性，乙酸乙酯萃取，有机相无水硫酸镁干燥，减压浓缩，粗产品快速柱层析分离纯化，得到新型脂肪酸，收率为80％。
实施例3新型脂肪酸的结构鉴定
利用核磁共振光谱测定实施例1制备得到的新型脂肪酸分子结构，得到相应的核磁共振氢谱图和核磁共振碳谱图，如图1-2所示。所述的核磁共振光谱测定方法为本领域常规的技术手段，在此不再赘述。
实施例4阳离子脂质体基因载体的制备
称取1mg脂肪酸、10mgDOTAP和2mg胆固醇，加入15ml氯仿中混合，混合温度为20～70℃，在室温下，搅拌形成澄清溶液；在25-80℃的恒温水浴中，旋转蒸发除去有机溶剂，成膜，加入5mlPBS，50℃水化0.1h，在超声功率为300W，超声时间为1-10分钟的探头超声作用下，使脂质体颗粒在0.1-0.3微米，通过0.22微米的微孔滤膜，得到阳离子脂质体基因载体。经检测，该脂质体的平均粒径为186.4nm(具体见表1和图5)。
表1实施例4阳离子脂质体基因载体的粒径、粒径分布、强度和宽度
Figure GDA0002491646830000081
实施例5阳离子脂质体基因载体的制备
称取1mg脂肪酸、0.02mgDOTAP和0.02mg胆固醇，加入5ml氯仿中混合，混合温度为20～80℃，在室温下，搅拌形成澄清溶液，在25-80℃的恒温水浴中，旋转蒸发除去有机溶剂，成膜，加入5mlPBS，80℃水化0.1h，在超声功率为900W，超声时间为1-10分钟的探头超声作用下，使脂质体颗粒在0.1-0.3微米，通过0.22微米的微孔滤膜，得到阳离子脂质体基因载体。经检测，该脂质体的平均粒径为186.9nm(具体见表2和图6)
表2实施例5阳离子脂质体基因载体的粒径、粒径分布、强度和宽度
Figure GDA0002491646830000082
实施例6阳离子脂质体基因载体的制备
称取1mg脂肪酸、0.05mgDOTAP和0.05mg胆固醇，加入10ml氯仿中混合，混合温度为10～80℃，在室温下，搅拌形成澄清溶液，在25-80℃的恒温水浴中，旋转蒸发除去有机溶剂，成膜，加入5mlPBS，80℃水化2h，在超声功率为900W，超声时间为1-10分钟的探头超声作用下，使脂质体颗粒在0.1-0.3微米，通过0.22微米的微孔滤膜，得到阳离子脂质体基因载体。经检测，该脂质体的平均粒径为190.5nm(具体见表3和图7)
表3实施例6阳离子脂质体基因载体的粒径、粒径分布、强度和宽度
Figure GDA0002491646830000091
实施例7阳离子脂质体基因载体的制备
称取3mg脂肪酸、0.3mgDOTAP和0.3mg胆固醇，加入5ml氯仿中混合，混合温度为20～70℃，在室温下，搅拌形成澄清溶液，在25-80℃的恒温水浴中，旋转蒸发除去有机溶剂，成膜，加入5mlPBS，80℃水化0.1h，在超声功率为300W，超声时间为1-10分钟的探头超声作用下，使脂质体颗粒在0.1-0.3微米，通过0.22微米的微孔滤膜，得到阳离子脂质体基因载体。经检测，该脂质体的平均粒径为197.9nm(具体见表4和图8)
表4实施例7阳离子脂质体基因载体的粒径、粒径分布、强度和宽度
Figure GDA0002491646830000092
实施例8阳离子脂质体基因载体的制备
称取1mg脂肪酸、10mgDOTAP、2mg胆固醇，加入15ml无水乙醇中混合，混合温度为20～70℃，在室温下，搅拌形成澄清溶液，在25-80℃的恒温水浴中，旋转蒸发除去有机溶剂，成膜，加入3mlPBS，80℃水化1h，在超声功率为300W，超声时间为1-10分钟的探头超声作用下，使脂质体颗粒在0.1-0.3微米，通过0.22微米的微孔滤膜，得到阳离子脂质体基因载体。经检测，该脂质体的平均粒径为154.2nm(具体见表5和图9)
表5实施例8阳离子脂质体基因载体的粒径、粒径分布、强度和宽度
Figure GDA0002491646830000101
实施例9阳离子脂质体基因载体的制备
称取2mg脂肪酸、3mgDOTAP、1mg胆固醇，加入10ml无水乙醇中混合，混合温度为20～70℃，在室温下，搅拌形成澄清溶液，在25-80℃的恒温水浴中，旋转蒸发除去有机溶剂，成膜，加入3mlPBS，50℃水化0.1h，在超声功率为300W，超声时间为1-10分钟的探头超声作用下，使脂质体颗粒在0.1-0.3微米，通过0.22微米的微孔滤膜，得到阳离子脂质体基因载体。经检测，该脂质体的平均粒径为208.8nm(具体见表6和图10)，其PDI和稳定性较差。
表6实施例9阳离子脂质体基因载体的粒径、粒径分布、强度和宽度
Figure GDA0002491646830000102
实施例10阳离子脂质体基因载体的制备
称取2mg脂肪酸、3mgDOTAP、0.5mg胆固醇，加入10ml无水乙醇中混合，混合温度为20～70℃，在室温下，搅拌形成澄清溶液，在25-80℃的恒温水浴中，旋转蒸发除去有机溶剂，成膜，加入3mlPBS，80℃水化1h，在超声功率为300W，超声时间为1-10分钟的探头超声作用下，使脂质体颗粒在0.1-0.3微米，通过0.22微米的微孔滤膜，得到阳离子脂质体基因载体。经检测，该脂质体的平均粒径为150.4nm(具体见表7和图11)
表7实施例10阳离子脂质体基因载体的粒径、粒径分布、强度和宽度
Figure GDA0002491646830000111
实施例11阳离子脂质体核酸类药物制剂的制备
(1)制备核酸类药物制剂平衡液：取PBS作为核酸类药物制剂的平衡液。
(2)制备阳离子脂质体核酸类药物制剂：按照N/P比为10:1，取相应量的siRNA溶于10ul的PBS，与溶有阳离子脂质体的核酸类药物制剂溶液混合，复合30min，制备得本发明所述的阳离子脂质体核酸类药物制剂。
本发明中所述的N/P比是阳离子脂质体基因载体中的氮的摩尔含量和核酸中磷的摩尔含量之比，这是基因转染领域中的技术人员所熟知的常识，在此不再赘述。所述的阳离子脂质体为实施例10所述的阳离子脂质体基因载体。
实施例12阳离子脂质体核酸类药物制剂对萤光素酶标记的人结直肠癌细胞的细胞毒性
良好的生物相容性是核酸类药物制剂应用的前提，本实验采用萤光素酶标记的人结直肠癌细胞，比较了在一定N/P比条件下的阳离子脂质体核酸类药物制剂与市售基因转染试剂liposome 2000的细胞毒性。
具体的细胞毒性评价操作如下：
(1)将阳离子脂质体基因载体按实施例11所述的方法携载siRNA成为离子脂质体核酸类药物制剂，以下将至简称为A。
(2)种板：培养荧光素酶标记的人结直肠癌细胞，传入96孔板中，分成4组，分别为control组(空白对照组)、siRNA组(阴性对照组)、liposome 2000+siRNA组(阳性对照组)和阳离子脂质体基因载体A+siRNA组(实验组)，每个设置3个复孔。细胞密度为1×105个/ml，培养24h。
(3)加药：在转染前，将24孔板的培养液换成100ul不含血清的RPMI1640培养液培养。在每孔细胞中，加入10ul阳离子脂质体核酸类药物制剂，轻轻混匀，于常规条件下培养，细胞孵育6-8小时后，换成含10％血清的RPMI1640培养液。
(4)细胞毒性评价：通过CCK-8试剂盒法进行检测。采用酶联免疫检测仪在波长为450nm条件下测定吸光度值，以未处理细胞为参照，计算细胞存活率。细胞存活率的计算公式如下：
细胞存活率(％)＝OD490(样品)/OD490(对照)×100％；其中，OD490(样品)为实验组的OD值，OD490(对照)为空白对照组的OD值。
实验结果：
图12为实施例12中control组、siRNA组、市售基因转染试剂liposome 2000+siRNA组和实施案例10制得的阳离子基因载体A+siRNA组对萤光素酶标记的人结直肠癌细胞存活率的统计图；细胞毒性实验表明，新型脂肪酸为膜材的阳离子脂质体的Sample组其细胞存活率大于70％，远优于市售基因转染试剂liposome 2000，说明该核酸类药物制剂具有很好的生物相容性。
实施例13阳离子脂质体核酸类药物制剂对萤光素酶标记的人结直肠癌细胞转染活性评价
具体的转染活性评价操作如下：
(1)将阳离子脂质体基因载体按实施例11所述的方法携载siRNA成为离子脂质体核酸类药物制剂，以下将至简称为A。
(2)种板：培养荧光素酶标记的人结直肠癌细胞，传入24孔板中，分成5组，分别为control组(空白对照组)、siRNA组(阴性对照组)、liposome 2000+siRNA组(阳性对照组)、新制阳离子脂质体基因载体A1+siRNA组(实验组1)和存放两个月的阳离子脂质体基因载体A2+siRNA组(实验组2)，每个设置3个复孔。细胞密度为1×105个/ml，待细胞达到60-70％进行转染。
(3)加药：在转染前，将24孔板的培养液换成500ul不含血清的RPMI1640培养液培养。在每孔细胞中，加入50ul阳离子脂质体核酸类药物制剂，轻轻混匀，于常规条件下培养，细胞孵育6-8小时后，换成含10％血清的RPMI1640培养液。
(4)基因转染效果的评价：荧光素酶报告基因实验是检测转录因子和其靶启动子中的特异顺序结合的重要手段。荧光素酶与底物反应，产生荧光，通过检测荧光的强度可以测定荧光素酶的活性，从而判断转录因子是否能与此靶启动子片段有作用。在本实验中，阳离子脂质体基因载体携载的是针对荧光素酶的siRNA，其产生荧光强度越弱，说明基因转染效率越高。按下式计算相对荧光强度百分率：
相对荧光强度百分率(％)＝F(实验组)/F(空白对照组)×100％
实验结果：
图13为实施例13中control组、siRNA组、市售基因转染试剂liposome 2000+siRNA组、实施案例10制得的阳离子基因载体A1+siRNA组和存放两个月后实施案例10制得的阳离子基因载体A2+siRNA组对萤光素酶标记的人结直肠癌细胞的相对荧光强度统计图；转染评价实验效果表明，新型脂肪酸为膜材的新制阳离子脂质体A其有良好的转染效率，并且较市售基因转染试剂liposome 2000有提高，存放两个月后其转染效率仍然很好。这说明该阳离子脂质体基因载体具有良好的携载核酸类药物的能力且稳定性佳，对新的基因治疗手段的开发具有关键的意义。
实施例14阳离子脂质体核酸类药物制剂对CRISPR/Cas9双质粒系统的转染活性评价
CRISPR----Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats是在细菌和古细菌中广泛存在的成簇的、有规律的、间隔的短回文重复序列。07年，发现细菌可以用CRISPR系统抵抗噬菌体的入侵；08年，发现细菌的CRISPR系统能够阻止外源质粒的转移。它是细菌的一种获得性免疫系统。CRISPR/Cas9----CRIPSR-Cas系统分为Type I、TypeII、Type III三种类型。在TypeII系统中包含一个标志性的Cas9蛋白(参与crRNA的成熟以及降解入侵的噬菌体DNA或外源质粒)。CRISPR/Cas系统和Cas9蛋白结合成复合体，发挥识别和降解入侵的外源DNA功能。
具体的转染活性评价操作如下：
(1)将阳离子脂质体基因载体按实施例11所述的方法携载CRISPR/Cas9双质粒成为阳离子脂质体核酸类药物制剂，以下将至简称为A。
(2)种板：培养荧光素酶标记的人结直肠癌细胞，传入24孔板中，分成6组，如图14-1到图14-6所示，分别为control组(空白对照组)、CRISPR/Cas9双质粒组(阴性对照组)、liposome 2000+CRISPR/Cas9双质粒组(阳性对照组)、PEI+CRISPR/Cas9双质粒组(阳性对照组)、新制阳离子脂质体基因载体A1+CRISPR/Cas9双质粒组(实验组1)和存放两个月的阳离子脂质体基因载体A2+CRISPR/Cas9双质粒组(实验组2)，每个设置3个复孔。细胞密度为1×105个/ml，待细胞达到60-70％进行转染。
(3)加药：在转染前，将24孔板的培养液换成500ul不含血清的RPMI1640培养液培养。在每孔细胞中，加入50ul阳离子脂质体核酸类药物制剂，轻轻混匀，于常规条件下培养，细胞孵育6-8小时后，换成含10％血清的RPMI1640培养液。
(4)基因转染效果的评价：
我们准备能够编码绿色荧光蛋白(GFP)的gRNA质粒(GFP-sgPlk1质粒)。从GFP的表达上看出细胞的转染效率。通过荧光倒置显微镜检测，观察所制备阳离子脂质体的转染效率。
实验结果：
转染评价实验效果表明，新型脂肪酸为膜材的新制阳离子脂质体A对CRISPR/Cas9双质粒系统有良好的转染效率，并且较市售基因转染试剂liposome 2000和PEI有提高，存放两个月后其转染效率仍然很好。这为阳离子脂质体在递送CRISPR/Cas9双质粒系统对肿瘤其治疗作用的领域有着重要的意义。

Claims (17)

1.一种以脂肪酸为膜材的阳离子脂质体，其特征在于，所述的阳离子脂质体具有膜，所述的膜包含如式I的脂肪酸：
Figure FDA0002491646820000011
。
2.如权利要求1所述的阳离子脂质体，其特征在于，所述的膜还包含阳离子脂质；所述的如式I所示的脂肪酸与所述的阳离子脂质的质量比为0.1:1～50:1。
3.如权利要求2所述的阳离子脂质体，其特征在于，所述的如式I所示的脂肪酸与所述的阳离子脂质的质量比为0.1:1～20:1。
4.如权利要求3所述的阳离子脂质体，其特征在于，所述的如式I所示的脂肪酸与所述的阳离子脂质的质量比为0.1:1～10:1。
5.如权利要求2所述的阳离子脂质体，其特征在于，所述的膜进一步包含胆固醇；所述的如式I所示的脂肪酸与所述的胆固醇的质量比为0.5:1～50:1。
6.如权利要求5所述的阳离子脂质体，其特征在于，所述的如式I所示的脂肪酸与所述的胆固醇的质量比为0.5:1～20:1。
7.如权利要求6所述的阳离子脂质体，其特征在于，所述的如式I所示的脂肪酸与所述的胆固醇的质量比为0.5:1～10:1。
8.如权利要求5所述的阳离子脂质体，其特征在于，所述的阳离子脂质为阳离子类脂。
9.如权利要求8所述的阳离子脂质体，其特征在于，所述的阳离子类脂为氯化三甲基-2,3-二油烯氧基丙基铵、溴化三甲基-2,3-二油酰氧基丙基铵、三氟乙酸二甲基-2,3-二油烯氧基丙基-2-(2-精胺甲酰氨基)乙基铵、溴化三甲基十二烷基铵、1，2-二油酰-3-琥珀酰-sn-甘油胆碱酯、3β-[N-(N’，N’-二甲基胺乙基)胺基甲酰基]胆固醇、溴化二甲基双十八烷基铵的一种或多种。
10.一种如权利要求3-9任一项所述的阳离子脂质体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)在有机溶剂中，将阳离子脂质、如式I所示的脂肪酸以及胆固醇混合，得到一澄清溶液；
(2)旋转蒸发除去有机溶剂，形成一层薄膜；
(3)加入PBS水化，超声，过膜后，得一含有阳离子脂质体的水溶液。
11.如权利要求10所述的制备方法，其特征在于，所述的如式I所示的脂肪酸的制备方法如下：
(1)10-羰基十八碳酸的制备：将10-羟基十八碳酸、戴斯-马丁氧化剂和碳酸氢钠按摩尔比为(1～2)：(1～2)：(2～4)完全溶解在卤代烃类溶剂中，搅拌过夜，再加入饱和硫代硫酸钠，加入的饱和硫代硫酸钠的体积与10-羟基十八碳酸、戴斯-马丁氧化剂和碳酸氢钠混合物总质量的比1/14(ml/mg)，继续搅拌2～3小时，然后萃取、干燥、减压浓缩、分离纯化，得到10-羰基十八碳酸；
(2)10-氨基十八碳酸的制备：将10-羰基十八碳酸，醋酸铵和氰基硼氢化钠按摩尔比为(1～2)：(2～8)：(1～2)完全溶解于醇类溶剂中，搅拌，然后萃取，干燥，减压浓缩，分离纯化，得到10-氨基十八碳酸；
(3)10-氨基十八碳酸甲酯的制备：将10-氨基十八碳酸完全溶于醇类溶剂，加入二氯亚砜，加入的二氯亚砜与10-氨基十八碳酸的摩尔比为1:(10～20)，混合溶液65℃搅拌过夜，冷至室温，减压浓缩，分离纯化，得到10-氨基十八碳酸甲酯；
(4)10-油酸酰胺基十八碳酸甲酯的制备：将10-氨基十八碳酸甲酯、油酸、N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride、羟基苯并三唑按摩尔比为1：1：(1～2)：(1～2)完全溶于卤代烃类溶剂中，再加入三乙胺，加入的三乙胺与10-氨基十八碳酸甲酯摩尔比为(15～20)：1，搅拌过夜，加入二氯甲烷进行稀释，然后清洗，干燥，减压浓缩，分离纯化，得到10-油酸酰胺基十八碳酸甲酯；
(5)脂肪酸的制备：将10-油酸酰胺基十八碳酸甲酯完全溶于THF-EtOH的混合溶液中，THF-EtOH的混合溶液由THF和EtOH按体积比为1：3混合而成，再加入氢氧化锂溶液，氢氧化锂与10-油酸酰胺基十八碳酸甲酯摩尔比为(10～16):1，搅拌过夜，再用盐酸调至酸性，萃取，干燥，减压浓缩，分离纯化，得到脂肪酸。
12.如权利要求10所述的制备方法，其特征在于，所述的有机溶剂为C1～C4的醇类溶剂和卤代烃类溶剂中的一种或多种；所述的卤代烃类溶剂选自氯仿和二氯甲烷；所述的有机溶剂的体积与步骤(1)中所有组分的质量总和之比为1-10ml/mg。
13.如权利要求12所述的制备方法，其特征在于，所述的C1～C4的醇类溶剂为乙醇和异丙醇的一种或两种。
14.如权利要求10所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的混合的温度为10～80℃；
步骤(2)中，旋转蒸发除去有机溶剂的合适温度为25～80℃；
步骤(3)中，用PBS水化的时间为0.1～2h，水化的温度为50～80℃；
步骤(3)中，超声为使用探头超声，超声功率为300～900W，超声时间为1～10分钟；
步骤(3)中，所述的过膜所使用孔径大小为0.22um的微孔滤膜。
15.如权利要求14所述的制备方法，其特征在于，所述的混合的温度为20～80℃。
16.如权利要求15所述的制备方法，其特征在于，所述的混合的温度为20～70℃。
17.如权利要求10所制备得到的阳离子脂质体在制备基因传递载体材料中的应用。
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