DE69800178T2

DE69800178T2 - Glycerolipide verbindungen und ihre anwendung zum transport einer aktiven substanz in eine zielzelle

Info

Publication number: DE69800178T2
Application number: DE69800178T
Authority: DE
Inventors: Rainer Bischoff; Denis Heissler; Abdesslame Nazih
Original assignee: Transgene SA
Current assignee: Transgene SA
Priority date: 1997-02-10
Filing date: 1998-02-10
Publication date: 2001-02-15
Anticipated expiration: 2018-02-11
Also published as: US6218370B1; GR3034317T3; PT901463E; ATE193886T1; FR2759382A1; WO1998034910A1; CA2251999A1; DE69800178D1; ES2149043T3; DK0901463T3; EP0901463B1; JP2000510869A; US20010036927A1; AU727204B2; EP0901463A1; US6743781B2; AU6626698A

Description

Glycerolipid-Verbindungen, die für die Übertragung einer aktiven Substanz in eine Zielzelle nützlich sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft neue Glycerolipid-Verbindungen und sie umfassende neue Zusammensetzungen. Genauer betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung dieser Verbindungen oder dieser Zusammensetzungen zur Herstellung eines Vektors für eine, insbesondere therapeutisch, aktive Substanz, die negative Ladungen umfaßt, insbesondere ein Polynukleotid, zur Übertragung in eine Zielzelle, genauer eine Vertebraten-Zelle und noch genauer eine Säugerzelle.
Die Übertragung eines Gens in eine gegebene Zelle ist die Basis der Gentherapie.
Diese neue Technologie, deren Anwendungsfeld breit ist, ermöglicht es, die Behandlung von schweren Erkrankungen in Betracht zu ziehen, für die die klassischen therapeutischen Alternativen wenig wirksam sind, wenn nicht sogar nicht existieren, und betrifft sowohl Erkrankungen mit genetischem Ursprung (Hämophilie, Mukoviscidose, Myopathie, ...) als auch erworbene (Krebs, Aids, ...).
Im Verlauf der vergangenen 30 Jahre wurden zahlreiche Werkzeuge entwickelt, die die Einführung verschiedener heterologer Gene in Zellen ermöglichen, insbesondere in Säugerzellen. Diese verschiedenen Techniken können in zwei Kategorien eingeteilt werden. Die erste Kategorie betrifft die physikalischen Techniken wie die Mikroinjektion, die Elektroporation oder den Beschuß mit Partikeln, welche, obwohl effizient, im wesentlichen auf in vitro-Anwendungen beschränkt sind und deren Durchführung mühsam und schwierig ist. Die zweite Kategorie betrifft Techniken, die mit der Molekularbiologie und der Zellbiologie zusammenhängen, bei denen das zu übertragende Gen mit einem Vektor biologischer oder synthetischer Natur assoziiert ist, der die Einführung dieses Materials begünstigt.
Tatsächlich sind die wirksamsten Vektoren virale Vektoren, insbesondere adenovirale oder retrovirale. Die entwickelten Techniken beruhen auf den natürlichen Eigenschaften, über die diese Viren verfügen, um die Zellmembranen zu durchqueren, den Abbau ihres genetischen Materials zu vermeiden und ihr Genom in den Kern eindringen zu lassen. Diese Viren waren bereits Gegenstand zahlreicher Studien und bestimmte von ihnen werden von nun an in Experimenten als Genvektoren beim Menschen verwendet im Hinblick auf beispielsweise eine Impfung, eine Immuntherapie oder eine Therapie, die zur Behebung eines genetischen Defekts beabsichtigt ist. Dennoch beinhaltet dieser virale Weg zahlreiche Beshränkungen, insbesondere aufgrund der beschränkten Klonierungsfähigkeit im viralen Genom, der Verbreitungsrisiken im Wirtsorganismus und in der Umgebung für die gebildeten infektiösen viralen Partikel, des Artefakt-Mutagenese-Risikos durch Insertion in die Wirtszelle im Fall von retroviralen Vektoren und der starken Induktion der Immun- und Entzündungsantwort in vivo während der therapeutischen Behandlung, die beträchtlich die Anzahl der Gaben beschränkt, die in Betracht gezogen werden können (Mc Coy et al. 1995, Human Gene Therapy, 6, 1553 bis 1560; Yang et al., 1996, Immunity, 1, 433 bis 442). Diese zahlreichen Nachteile, insbesondere im Rahmen der Verwendung beim Menschen, haben zahlreiche Gruppen zur Entwicklung von alternativen Systemen zur Übertragung von Polynukleotiden bewogen.
Momentan sind mehrere nicht-virale Methoden verfügbar. Wir geben beispielsweise die Copräzipitation mit Calciumphosphat, die Verwendung von Rezeptoren, die das virale System imitieren (für einen Überblick siehe Cotten und Wagner, 1993, Current Opinion in Biotechnology, 4, 705 bis 710), oder die Verwendung von Polymeren wie Polyamidoamin (Haensler und Szoka, 1993, Bioconjugate Chem., 4, 372 bis 379) oder von Polymeren, wie die in WO95/24221 angegebenen, die die Verwendung von dendritischen Polymeren beschreibt, das Dokument WO96/02655, das die Verwendung von Polyethylenimin oder Polypropylenimin beschreibt, und die Dokumente US-A-5 494 897 und FR 2 719 316 an, die die Verwendung von Polylysin- Konjugaten beschreiben. Andere nicht-virale Techniken stützen sich auf die Verwendung von Liposomen, deren Eignung als Mittel, das die Einführung in das Innere von Zellen von bestimmten biologischen Makromolekülen wie beispielsweise DNA, RNA, Proteinen oder bestimmten pharmazeutisch aktiven Substanzenermöglicht, in der Literatur bereits beschrieben wurde. Zu diesem Zweck haben zahlreiche Gruppen bereits die Verwendung von kationischen Lipiden beschrieben, die eine starke Affinität für die cellulären Membranen und/oder die Nukleinsäuren zeigen. Obwohl für den Fall der Nukleinsäuren in der Tat gezeigt wurde, daß dieser Typ Makromolekül zur Durchquerung der plasmatischen Membran bestimmter Zellen in vivo fähig ist (WO90/11092), bleibt dennoch, daß die Effizienz der beobachteten Transfektion noch sehr beschränkt ist, insbesondere aufgrund der polyanionischen Natur der Nukleinsäuren, die ihre Passage durch die Zellmembran verhindert, welche selbst eine scheinbare negative Netto-Ladung aufweist. Bereits 1989 (Felgner et al., Nature, 337, 387 bis 388) wurden kationische Lipide als interessante Moleküle zur Begünstigung der Einfügung von großen anionischen Molekülen wie Nukleinsäuren in bestimmte Zellen präsentiert. Diese kationischen Lipide sind fähig zur Komplexierung mit anionischen Molekülen und tendieren so zur Neutralisation der negativen Ladungen dieser Moleküle und zur Begünstigung ihrer Annäherung an die Zellen. Zahlreiche Gruppen haben bereits verschiedene kationische Lipide entwickelt. Als Beispiele kann man DOTMA (Felgner et al., 1987, PNAS, 84, 7413 bis 7417), DOGS oder TransfectamTM (Behr et al., 1989, PNAS, 86, 6982 bis 6986), DMRIE und DORIE (Felgner et al., 1993, Methods 5, 67-75), DC-CHOL (Gao und Huang, 1991, BBRC, 179, 280 bis 285), DOTAPTM(McLachlan et al., 1995, Gene Therapy, 2, 674 bis 622) oder LipofectamineTM angeben, genauso wie diejenigen, die in den Patentanmeldungen WO9116024 oder WO9614651 beschrieben sind.
Genauer beschreibt die Anmeldung WO 9405624 kationische Lipide der Formel:
bei der die Reste R insbesondere Octadecenyl-Reste sind, die Reste Z(C&sub1;-C&sub1;&sub3;)- oder C(=O)-(C&sub1;-C&sub1;&sub3;)Alkyl- oder Acylreste sind, q eine ganze Zahl von 1 bis 6 ist, X insbesondere eine kurze Polyaminkette ist wie Spermin, Spermidin, ein Carboxyspermin oder ein Polylysin.
Die Anmeldungen EP 685 457 und EP 685 234 beschreiben insbesondere kationische Verbindungen der Formel:
wobei R insbesondere eine gesättigte oder ungesättigte Kohlenwasserstoff-Kette mit 10 bis 30 Kohlenstoffatomen ist, A insbesondere ausgewählt werden kann aus den Gruppen -O-(C=O)- und NH-(C=O)-, n von 0 bis 4 variiert und R&sub1; ein Alkyl oder eine kurze Aminoalkyl-Kette ist, bei der das primäre Amin mit einem Alkyl mit 2 bis 8 Kohlenstoffatomen substituiert ist. Diese Verbindungen zeigen eine schwache hämolytische Aktivität und ermöglichen in vitro die Einführung einer Doppelstrang-RNA, die als Wachstumsinhibierungsmittel dienen kann, in HelaS3-Zellen.
Die Anmeldung DE 195 21 412 beschreibt Verbindungen, die auch einen nichtpolaren Teil und einen polaren Teil der Formel
umfassen, wobei p von 1 bis 6 variiert, q von 0 bis 2 variiert, R entweder C(=O)-C1-23 oder C1-23 ist, gesättigt oder nicht, und Z ein Peptid, eine Aminosäure oder eine verzweigte Aminostruktur ist. Diese kationischen Verbindungen ermöglichen die Transfektion von Zellen in Kultur in vitro.
Dennoch haben zahlreiche Arbeiten (beispielsweise siehe Mahato et al., J. Pharm. Sci., 1995, 84, 1267 bis 1271, Thierry et al., 1995, P. N. A. S., 92, 9742 bis 9746) nachgewiesen, daß die Effizienz des Transfers in das anionische Makromolekül in das Innere der Zellen variieren kann als Funktion insbesondere von der Wechselwirkung zwischen den Komplexen und den cellulären Membranen, der betrachteten Zelle, der lipidischen Zusammensetzung der kationischen Verbindungen, der Größe der mit den anionischen Molekülen gebildeten Komplexe und genauer vom Verhältnis der positiven und negativen Ladungen der verschiedenen Verbindungen des Komplexes. Die Mechanismen, die insbesondere die Wechselwirkung der Komplexe mit den cellulären Membranen und den Transfer der Komplexe in das Innere der Zelle ermöglichen, sind noch weitgehend unbekannt, und die Forscher führen ihre Arbeiten nach einem stark empirischen Annährungsweg durch. Es ist daher wünschenswert, weitere kationische Lipide vorzuschlagen, die eventuell Eigenschaften aufweisen, die verbessert oder von den bereits beschriebenen verschieden sind.
Der Anmelder hat heute neue Glycerolipid-Verbindungen identifiziert, die in kationischer Form vorliegen können und insbesondere zur Übertragung einer aktiven Substanz, welche negative Ladungen umfaßt, insbesondere eines Polynukleotids, ins Innere einer Zielzelle nützlich sind, und deren Verwendung man insbesondere in vivo im Rahmen einer Gentherapie in Betracht ziehen kann.
Daher ist der Gegenstand der vorliegenden Erfindung zunächst eine Verbindung der Formel
wobei:
R&sub1;, R&sub2;, gleich oder verschieden, Alkyl- oder Alkenylreste mit 6 bis 23 Kohlenstoffatomen (als (C&sub6;-C&sub2;&sub3;) bezeichnet), verzweigt oder linear, oder Reste-C(=O)-(C&sub6;-C&sub2;&sub3;)Alkyl oder -C(-O)-(C&sub6;-C&sub2;&sub3;)Allcenyl, oder insbesondere -C(=O)-(C&sub1;&sub2;-C&sub2;&sub0;)Alkyl oder -C(=O)-(C&sub1;&sub2;-C&sub2;&sub2;)Alkenyl, linear oder verzweigt, Arylreste, Cycloalkylreste, Fluoroalkylreste, gegebenenfalls wiederholte Oxyethylen- oder Oxymethylengruppen, linear oder verzweigt, gegebenenfalls substituiert sind, X ein Sauerstoffatom oder ein Aminorest -NR&sub3; ist, wobei R&sub3; ein Wasserstoffatom oder ein Alkylradikal mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen ist,
n eine ganze positive Zahl von 1 bis 6 ist, bevorzugt von 2 bis 4,
m eine ganze positive Zahl von 1 bis 6 ist, bevorzugt von 2 bis 4, und wenn n größer 1, m gleich oder verschieden von n sein kann.
Unter dem Begriff "Alkenyl" versteht man die Angabe, daß die Kohlenstoffkette, die in Frage steht, eine oder mehrere Doppelbindungen entlang dieser Kette umfassen kann.
In einem Spezialfall der Erfindung sind die Verbindungen dadurch charakterisiert, daß R1 und/oder R2 fluoriert sind, d. h., daß mindestens ein Kohlenstoff der Polykohlenstoffkette mit einer fluorierten Gruppe substituiert ist. Beispiele für solche Moleküle sind in Beispiel N vorgeschlagen. In diesem Spezialfall kann die Anzahl der fluorierten Kohlenstoffatome in jeder Kette R&sub1; oder R&sub2; von 1 bis 12 variieren, insbesondere von 4 bis 8, und ist bevorzugt 4. In einem vorteilhaften Fall sind R1 und/oder R2 Alkylreste mit 15 Kohlenstoffatomen, und die Anzahl der fluorierten Kohlenstoffatome ist für jede der betroffenen Ketten R&sub1; und und R&sub2; 4. Die Anzahl der in den Ketten R&sub1; und/oder R&sub2; vorhandenen fluorierten Gruppen kann insbesondere von 1 bis 23, insbesondere von 9 bis 17 variieren und ist bevorzugt 9.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können darüber hinaus substituiert sein. Solche Substitutionen können insbesondere aus einem Markierungsmolekül (siehe das Markierungsmolekül in US 4711955), das beispielsweise das Sichtbarmachen der Verteilung der Verbindungen oder der Komplexe, die sie einschließen, nach Gabe in vitro oder in vivo ermöglicht, einem Zellmarkierurigsmolekül, oder einem Verankerungsmolekül bestehen. Die Erfindung betrifft daher auch eine Verbindung wie vorstehend beschrieben, die an ein oder mehrere Zielelemente gebunden ist durch Zwischenschalten von mindestens a) einem Kohlenstoffatom, insbesondere ausgewählt aus denen, die in der Gruppe R&sub1;, R&sub2; und/oder R&sub3; vorhanden sind, oder b) einem sekundären oder primären Stickstoffatom der Polyaminkeife. Solche Elemente können das Zielen auf einen bestimmten Zelltyp ermöglichen, das Eindringen in das Innere der Zelle, die Lyse der Endosomen oder auch den intracellulären Transport erleichtern, und sind in der Literatur umfangreich beschrieben. Es kann sich beispielsweise um ganze oder Teile von Zuckern, Peptiden (beispielsweise Peptid GRP, Gastrin Releasing Peptid), Oligonukleotide, Lipide, Hormone, Vitamine, Antigene, Antikörper, spezifische Liganden von Membran-Rezeptoren, Liganden, die zur Reaktion mit einem Anti-Liganden fähig sind, fusogenische Peptide, Peptide mit Kernlokalisation oder eine Kombination dieser Verbindungen handeln. Man kann insbesondere Galactosyl-Reste, die es ermöglichen, den Asyaloglycoprotein-Rezeptor auf der Oberfläche von hepatischen Zellen anzusteuern, das fusogenische Peptid INF-7, das aus der Untereinheit HA-2 des Hämaglutinin des Influenza-Virus stammt (Plank et al., 1994, J. Biol. Chem. 269, 12918 bis 12924) oder ein Kernlokalisationssignal, das vom Antigen T des Virus SV40 stammt (Lanford und Butel, 1984, Cell 37, 801 bis 813) oder das Protein EBNA-1 des Epstein-Barr-Virus (Ambinder et al., 199I, J. Virol. 65, 1466 bis 1478) angeben.
Solche Konjugate können nach den breit in der Literatur bestehenden Techniken leicht erhalten werden, und insbesondere durch chemische Kopplung, insbesondere unter Verwendung von Schutzgruppen wie Trifluoracetyl oder Fmoc oder Boc am Polyamin. Die selektive Entschützung einer Schutzgruppe ermöglicht so die Kopplung des Zielelements, und man entschützt anschließend das Glycerolipid. Es ist dennoch angebracht anzugeben, daß die Substitution der nicht reaktiven Gruppen wie der Kohlenstoffatome in den Gruppen CH oder CH&sub2; im Verlauf der Synthese der Verbindungen gemäß der Erfindung nach den Fachleuten bekannten Methoden durchgeführt wird; während die reaktiven Gruppen wie die primären oder sekundären Amine Gegenstand von Substitutionen bei den neu hergestellten Glycerolipiden gemäß der Erfindung sein können.
Nach einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung liegt die Verbindung in kationischer Form vor, d. h., daß sie durch Fixierung eines Proton auf einem oder mehreren Stickstoffatomen, die in der Polyaminkette vorhanden sind, in protonierter Form vorliegt. In diesem Fall ist das kationische Glycerolipid mit einem oder mehreren biologisch verträglichen Anionen assoziiert wie beispielsweise dem Trifluoroacetat-, Halogenid-, Monomethylsulfat-, Acetat- oder Phosphatanion, Iodid, Chlorid, Bromid... Es ist auch möglich, Verbindungen in kationischer Form durch Substitution von Aminen beispielsweise mit einem Methyl-, Ethyl-, ... -Rest zu erhalten.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen umfassen 2 bis 7 positive Ladungen, genauer 3 bis 5 und bevorzugt 5. Es wurde gezeigt, daß die Affinität eines Polyamins für DNA insbesondere von der Anzahl der Aminfunktionen abhängt, die im Polyamin vorhanden sind (Braulin, W. H., Strick, T. J., und Record, M. T., Jr. (1982) Biopolymers 21, 1301-1314). Übrigens sind die nach dem Eindringen in die Zelle durch Endocytose zwischen einer DNA und einer lipidischen kationischen Verbindung gebildeten Komplexe in den Endosomen lokalisiert, in denen die DNA durch Einwirkung von pH-abhängigen Nukleasen abgebaut werden kann. Um diesem Phänomen entgegenzuwirken, das die Effizienz der Transfektion beeintrichtigt, ist es möglich, lysosomotrope Mittel zu verwenden wie beispielsweise Chiloroquin, deren Puffer-Kapazität bei pH 5,5 die Verbesserung der Transfektion ermöglicht. Dennoch ist die Effizienz dieser Verbindungen nicht systematisch, wobei als negative Beispiele die Fälle von Polyethylenimin (PEI), LipospernLin oder Dendrimere von Polyamidoamin (PAMAM) angegeben werden. Übrigens kann die Verwendung von Chloroquin in starker Dosis ein toxisches Risiko bieten. Erfindungsgemäß besitzen die Verbindungen einen Polyamin- Kopf, der die Erzielung eines Effekts wie desjenigen von lysosomotropen Molekülen ermöglicht. Ein besonderer Vorteil dieser Verbindungen könnte dementsprechend die Vermeidung der Verwendung von Chloroquin für Anwendungen in vivo sein.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Verbindung ausgewählt aus der Gruppe, die aus den folgenden Formeln besteht:
n = 2 pcTG18 oder n = 3 pcTG33 II
n = 2 pcTG21 oder n = 3 pcTG34 III
n = 2 pcTG19 oder n = 3 peTG36 IV
n = 2 pTG20 oder n = 3 pcTG35 oder
n = 4 pcTG56 V
C18 : 1,[cis]-9
n = 2 pcTG22 oder n = 4 pcTG90 VI
Diese kationischen Verbindungen können beispielsweise hergestellt werden durch Reaktion einer Verbindung der Formel:
wobei:
R&sub4;, R&sub5; Schutzgruppen sind, die insbesondere gemeinsam einen Isopropyliden-Rest bilden,
X dieselbe Bedeutung hat wie in Formel I, mit einer Säure der Formel:
wobei m und n dieselbe Bedeutung aufweisen wie in Formel I,
wobei R&sub6; eine Schutzgruppoe ist, insbesondere t-Butoxycarbonyl (BOC).
Die Funktion O-R&sub4;, -O-R&sub5; werden anschließend entschützt, um die Reste R&sub1; und R&sub2; auf bekannte Weise durch Veresterung oder Veretherung zu fixieren.
Die erhaltene Verbindung wird in Gegenwart von Trifluoressigsäure entschützt. Die Säure der Formel VII wird auf bekannte Weise hergestellt.
Im Fall der erfindungsgemäßen Verbindungen, bei denen m = 3, n = 2 oder 3, wird Bezug genommen auf die nachstehend angegebenen Beispiele, um die praktischen Modalitäten der Synthese kennenzulernen. Die beschriebenen Verfahren sind im allgemeinen für die Synthesen der erfindungsgemäßen Verbindungen anwendbar und erfordern Anpassungen, die den Fachleuten zur Verfügung stehen. Jedenfalls sind die erfindungsgemäßen Verbindungen nicht auf diejenigen beschränkt, die durch die vorstehend beschriebenen Herstellungsweisen erhalten wurden.
Nach einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung auch eine Zusammensetzung, die mindestens eine vorstehend beschriebene Verbindung und gegebenenfalls mindestens einen Hilfsstoff umfaßt, der zur Vierbesserung der Komplexbildung zwischen einer solchen Verbindung und einer aktiven Substanz fähig ist, oder zur Verbesserung der Funktion dieser Komplexe gegenüber der Zelle.
In bevorzugter Weise ist ein solcher Hilfsstoff ein neutrales oder zwitterionisches Lipid, das beispielsweise ein Triglycerid, ein Diglycerid, ein Cholesterin (siehe beispielsweise US 5 438 044) oder ein Derivat davon ist, insbesondere ein neutrales oder zwitterionisches Lipid, das ein Phosphatidylethanolamin (PE), Phosphatidylcholin, Phosphocholin, Sphingomyelin, Ceramid oder Cerebrosid oder ein Derivat davon ist. In vorteilhafter Weise wird man Dioleylphosphaditylethanolamin (DOPE) auswählen.
Das Gewichtsverhältnis zwischen der erfindungsgemäßen Verbindung und dem neutralen oder zwitterionischen Lipid liegt im allgemeinen zwischen 0,1 und 10, wobei sich von selbst versteht, daß dieses Verhältnis entsprechend der Natur der betrachteten Verbindungen variieren kann. Dei Fachmann verfügt über ausreichende Kenntnisse, um diese geringfügigen Adaptationen vorzunehmen. Es ist auch möglich, eine Mischung von neutralen und/oder zwitterionischbn Lipiden zu verwenden.
Die Erfindung betrifft darüber hinaus einen Komplex, der mindestens eine Verbindung oder mindestens eine Zusammensetzung wie vorstehend beschrieben und mindestens eine aktive Substanz umfaßt, insbesondere eine therapeutisch aktive, welche mindestens eine negative Ladung umfaßt. Nach einer Variante der Erfindung kann dieser Komplex darüber hinaus ein oder mehrere kationische Amphiphile einschließen, wie diejenigen, die in der Literatur beschrieben sind und von denen Beispiele weiter oben vorgeschlagen wurden. Im allgemeinen verwendet man therapeutisch aktive Substanzen, die insbesondere im Rahmen der Gentherapie eingesetzt werden können.
Nach einer besonderen Ausführungsform wird diese aktive Substanz ausgewählt aus Nukleinsäuren und Proteinen Bevorzugt ist die aktive Substanz des erfindungsgemäßen Komplexes ein Polynukleotid, wobei diese Verbindung oder diese Zusammensetzung die Verbesserung der Transfektionskraft des Polynukleotids in einer Zelle ermöglicht.
Unter "Polynukleotid" wird die Bezeichnung eines DNA- und/oder RNA- Fragments, Doppelstrang oder Einzelstrang, linear oder zirkular, isoliert natürlich oder synthetisch verstanden, das eine präzise Kette von Nukleotiden, modifiziert oder nicht, (siehe beispielsweise US 55257111), markiert oder nicht (siehe beispielsweise US 4711955 oder EP 302 175) bezeichnet, welches die Definition eines Fragments oder einer Region einer Nukleinsäure ohne Größenbeschränkung ermöglicht. Unter Polynukleotid wird insbesondere eine cDNA, eine genomische DNA, eine plasmidische DNA, eine Messenger-RNA, eine Antisense-RNA, ein Ribozym, eine Transfer-RNA, eine ribosomische RNA oder eine für solche RNA kodierende DNA verstanden. Im Rahmen der vorliegenden Anmeldung sind "Polynukleotid" oder "Nukleinsäure" synonyme Begriffe.
Nach einer besonderen Ausführungsform der Erfindung umfaßt dieses Polynukleotid ein interessierendes Gen und Elemente, die die Expression dieses interessierenden Gens ermöglichen. In dieser Ausführungsform liegt dieses Polynukleotid vorteilhafterweise in Plasmid-Form vor. Die die Expression ermöglichenden Elemente sind die Gesamtheit der Elemente: die die Transkription des DNA-Fragments in RNA (Antisense-RNA oder mRNA) und die Translation der mRNA in Polypeptid ermöglichen. Es handelt sich insbesondere um Promoter-Sequenzen und/oder Regulations-Sequenzen, die in der Zelle wirksam sind, und gegebenenfalls die um Sequenzen, die für die Exkretion oder Expression dieses Polypeptids an der Oberfläche der Zellen erforderlich sind. Als Beispiel kann man die Promotoren angeben wie die Promotoren der Viren RSV, MPSV, SV40, CMV oder 7,5k, des Vaccinia-Virus, die Promotoren des Gens, das für die muskuläre Kreatinkinase, für Aktin, für das Lungensurfactant kodiert. Es ist darüber hinaus möglich, eine Promoter-Sequenz auszuwählen, die spezifisch ist für einen gegebenen Zelltyp oder die unterdefinierten Bedingungen aktivierbar ist. Die Literatur bietet eine große Menge an Informationen bezüglich solcher Promoter-Sequenzen. Übrigens kann das Polynukleotid mindestens zwei identische oder verschiedene Sequenzen umfassen, die eine Tränskriptions-Promoter-Aktivität zeigen, und/oder mindestens zwei kodierende DNA-Sequenzen, identisch oder verschieden, die bezogen aufeinander direkt aneinanderhängen oder voneinander entfernt, in derselben Richtung oder in gegenläufiger Richtung aalgeordnet sind, solange die Funktion des Transkriptions- Promoters oder die Transkription dieser Sequenz nicht beeinträchtigt wird. Genauso ist es bei diesen Konstruktions-Typ vom Nukleinsäure möglich "neutrale" Nukleinsäure- Sequenzen oder Introns einzuführen, die die Transkription nicht beeinträchtigen und die vor dem Translationsschritt gespleißt werden. Solche Sequenzen und ihre Verwendungen sind in der Literatur beschrieben. Das Polynukleotid kann auch Sequenzen einschließen, die für den intracellulären Transport, für die Replikation und/oder für die Integration erforderlich sind. Solche Sequenzen sind Fachleuten gut bekannt. Übrigens können die erfindungsgemäßen Polynukleotide auch dahingehend modifizierte Polynukleotide sein, daß es ihnen nicht möglich ist, sich in das Genom der Zielzelle zu integrieren, oder mit Hilfe von Mitteln wie beispielsweise Spermin stabilisierte Polynukleotide.
Im Rahmen der vorliegen den Erfindung kann das Polynukleotid zur Zielzelle homolog oder hetereolog sein. Es kann vorteilhaft sein, ein Polynukleotid zu verwenden, das für die Gesamtheit oder einen Teil eines Polypeptids kodiert, insbesondere eines Polypeptids, das eine therapeutische oder prophylaktische Aktivität zeigt, und insbesondere eine immunogene Aktivität vom cellulären oder humoralen Typ. Der Begriff Polypeptid versteht sich ohne Beschränkung betreffend die Größe oder den Modifikationsgrad (beispielsweise Glykosylierungsgrad). Man kann als Beispiel die Gene angeben, die für ein Enzym, ein Hormon, ein Cytokin, einen Membran-Rezeptor, ein Strukturpolypeptid, ein einen Membran-Kanal bildendes Polypeptid, ein Transportpolypeptid, ein Adhäsioinsmolekül, einen Liganden, einen Regulationsfaktor für die Transkription, die Translation, die Replikation, die Stabilisation der Transkripte, oder einen Antikörper codieren angeben wie beispielsweise das Gen, das für das Protein CFTR, Dystrophin, Faktor VIII oder IX, E6/E7 von HPV, MUC1, BRAC1, β-Interferon, γ -Interferon, Interleukin (IL)-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-12, Tumornekrosefaktor (TNF) vom α- Typ, GM-CSF (Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Facor), das Gen tk des Herpes-Simplex-Virus vom Typ 1 (HSV-1), das mit Retinoblastom assoziierte Gen oder p53 oder die gesamten oder Teile von Immunoglobulinen wie die Fragmente F(ab)&sub2;, Fab', Fab oder die Anti-Idiotype (US 4: 699,880) codiert. Selbstverständlich ist diese Liste nicht beschränkend, und es können andere Gene verwendet werden.
Nach einer bevorzugten Ausfihrungsform sind die erfindungsgemäßen Komplexe von geringer Größe (weniger als 500 nm, vorteilhafterweise kleiner als 200 nm und bevorzugt kleiner als 100 nm).
Übrigens zeigen die durch geführten Transfektions-Experimente, daß das Gewichtsverhältnis der erfindungsgemäßen lipidischen Verbindung zum Polynukleotid vorteilhafterweise von 0,01 bis 100 beträgt. Das optimale Verhältnis liegt bei 0,05 bis 10. Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung von Komplexen aus kationischen Verbindungen/aktiven Substanzen, die mindestens eine negative Ladung umfassen, wobei das Verfahren dadurch charakterisiert ist, daß man eine oder mehrere erfindungsgemäße Zusammensetzungen in Gegenwart von einer oder mehreren aktiven Substanzen bringt, die mindestens eine negative Ladung umfassen, und daß man den Komplex isoliert, gegebenenfalls nach einem Reinigungsschritt.
Zunächst werden nach einer ersten Variante eine oder mehrere kationische Verbindungen mit einer geeigneten Menge Lösungsmittel oder Lösungsmittelmischung gelöst, die mit Wasser mischbar sind, insbesondere Ethanol, Dimethylsulfoxid (DMSO) oder bevorzugt einer Mischung Ethanol/DMSO 1 : 1 (v : v), um lipidische Aggregate zu bilden nach einer bekannten Methode wie beispielsweise in der Patentanmeldung WO-8- 9603977 beschrieben, oder sie werden nach einer zweiten Variante mit einer geeigneten Menge einer Lösung eines Detemgens wie beispielsweise Octylglucosid wie n-Octyl-β-D- glucopyranosid oder 6-O-(N-Hej tylcarbamoyl)-methyl-α-D-glucopyranosid suspendiert.
Die Suspension kann anschließend mit einer Lösung von aktiver Substanz, die negative Ladungen umfaßt, gemischt werden.
In dem Fall, in dem man wünscht, daß ein neutrales oder zwitterionisches Lipid im Endkomplex vorhanden ist, bildet man auf bekannte Weise vor dem Lösen im mit Wasser mischbaren Lösungsmittel oder in der Detergens-Lösung einen Film mit einer Mischung, die eine kationische Verbindung und ein neutrales oder zwitterionisches Lipid einschließt, wie beispielsweise DOPE.
Eine der wichtigen Eigenschaften des Verfahrens liegt in der Auswahl des Verhältnisses zwischen den positiven Ladungen des kationischen Lipids und den negativen Ladungen der aktiven Substanz.
Ohne auf ein spezifisches Verhältnis beschränkt werden zu wollen, wählt man die Mengen der verschiedenen Ladungen so aus, daß das Verhältnis zwischen der Zahl der positiven Ladungen der Verbindung oder der kationischen Zusammensetzung und der Zahl der negativen Ladungen der aktiven Substanz zwischen 0,05 und 20, insbesondere zwischen 0,1 und 15 und bevorzugt zwischen 5 und 10 liegt.
Die Berechnung zur Erzielung eines solchen Verhältnisses berücksichtigt die negativen Ladungen, die von der aktiven Substanz getragen werden, und man stellt die Menge der Verbindung, die zur Erzielung des oben angegebenen Verhältnisses notwendig ist, ein. Die Mengen und die Konzentrationen für andere Verbindungen werden als Funktion ihrer jeweiligen molaren Masse und ihrer Anzahl von positiven und/oder negativen Ladungen eingestellt.
Dieses Verhältnis der Ladungen stellt auch eine vorteilhafte Eigenschaft des erfindungsgemäßen Komplexes dar.
Im Fall der zweiten Variante und wahlweise kann man mit einer anschließenden Dialyse fortfahren, um das Detergens zu vermindern und die Komplexe zu isolieren. Das Prinzip einer solchen Methode wird beispielsweise beschrieben von Hofland et al. (1996, PNAS 93, Seiten 7305-7309) und in Kapitel 11 des Dokuments Philippot et al. (G. Gregoriadis, 81-89, CRC Press 1993).
Man hat gezeigt, daß die erste Variante zu hervorragenden Ergebnissen im Hinblick auf die Größe der erhaltenen Komplexe führt.
Nach einer dritten Variante werden eine oder mehrere kationische Verbindungen oder Zusammensetzungen in einem Puffer suspendiert, und anschließend wird die Suspension bis zur visuellen Homogenität mit Ultraschall beschallt. Die lipidische Suspension wird dann durch zwei mikroporöse Membranen unter geeignetem Druck extrudiert. Die lipidische Suspension wird dann mit einer Lösung der aktiven Substanz gemischt, die negative Ladung umfaßt. Diese Beschallung-Extrusion genannte Technik ist im Stand der Technik gut bekannt.
Die Verwendung eines neutralen oder zwitterionischen Lipids wie DOPE kann sich als vorteilhaft zur Herstellung von Komplexen mit geringer Größe erweisen (weniger als 200 nm, bevorzugt weniger als 100 nm).
Die Eigenschaften der gebildeten Komplexe können mit verschiedenen Mitteln beurteilt werden, die die Bestimmung ermöglichen von beispielsweise:
- Zustand der Komplexierang mit der aktiven Substanz, insbesondere durch Suchen nach freien Nukleinsäurern durch Agarose-Gelelektrophorese in dem Fall, in dem die Substanzen Nukleinsäuren sind,
- Größe von Partikeln durch quasi elastische Lichtdiffusion,
- Langzeit-Abwesenheit von Ausfällungen.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch die Komplexe, die durch Durchführung der oben aufgezählten Verfahren erhalten werden.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung einer Verbindung, einer Zusammensetzung oder eines Komplexes gemäß der Erfindung zur Übertragung von mindestens einer aktiven Substanz, insbesondere einer therapeutisch aktiven, insbesondere einer Nukleinsäure, in Zielzellen in vitro, ex vivo oder in vivo, insbesondere in vivo.
Unter "Zielzellen" gemäß der Erfindung versteht man prokariotische Zellen, Hefezellen und eukariotische Zeihen, Pflanzenzellen, Humanzellen oder Tierzellen, und insbesondere Säugerzellen. Marn kann auch die Krebszellen angeben. In vivo kann die Erfindung im Bereich des interstitiellen Raums oder luminalen Raums von Geweben wie Lunge, Luftröhre, Haut, Muskel, Gehirn, Leber, Herz, Milz, Knochenmark, Thymus, Harnblase, Lymphe, Blut, Pankreas, Magen, Nieren, Eierstöcken, Testikeln, Rektum, peripherem oder zentralem Nervensystem, Augen, lymphoiden Organen, Knorpel, Endothel angewendet werden. Nach einer vorteilhaften Auswahl gemäß der Erfindung ist die Zielzelle eine Muskelzelle, eine blutbildende Zelle oder auch eine Zelle der Atemwege, insbesondere eine Zelle des respiratorischen Epithels.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Übertragung in vitro einer therapeutisch aktiven Substanz in eine Zielzelle, nachdem man diese Zelle in Kontakt mit einem erfindungsgemäßen Komplex bringt.
Die erfindungsgemäßen Komplexe sind als Medikament mit kurativem, präventivem oder Impfungsziel verwendbar. Aus diesem Grund sind Gegenstand der Erfindung auch die Komplexe der Erfindung als Medikament mit kurativem, präventivem oder Impfziel. Diese Komplexe konnen bei einer therapeutischen Behandlungsmethode eingesetzt werden, die aus der Übertragung von mindestens einer therapeutisch aktiven Substanz, insbesondere eines Polynukleotids, in Zielzellen, insbesondere eine Säugerzelle und genauer eine Muskelzelle, eine blutbildende Zelle, eine Zelle der Atemwege, genauer eine Tracheal- oder Pulmonalzelle, eine Zelle des respiratorischen Epithels besteht. Noch weiter betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Einführung einer aktiven Substanz, welche negative Ladungen umfaßt, in das Innere einer Zelle, dadurch charakterisiert, daß man auf einem geeigneten Medium kultivierte Zellen mit einer Suspension von Komplexen kationische Verbindung/aktive Substanz, umfassend negative Ladungen, bringt. Nach einer bestimmten Inkubationszeit werden die Zellen gewaschen und isoliert. Die Bestätigung der Einführung der aktiven Substanz kann mit jedem geeigneten Mittel bewirkt werden (gegebenenfalls Lyse der Zelle).
Das Einführungsverfahren ist an sich bekannt. Unter dem Begriff "Einführung" versteht man, daß die aktive Substanz, die negative Ladung umfaßt, in die Zelle übertragen wird und am Ende des Verfahrens im Inneren dieser Zelle oder an deren Membran lokalisiert ist. In dem Fall, in dem die aktive Substanz eine Nukleinsäure ist, spricht man genauer von "Transfektion". In diesem Fall kann die Bestätigung der Transfektion der Nukleinsäure durch jedes geeignete Mittel erfolgen, beispielsweise durch die Expression des betrachteten Gens oder die Konzentration des exprimierten Proteins.
Die Erfindung betrifft genauer die Verwendung einer Verbindung, einer Zusammensetzung oder eines Komplexes gemäß der Erfindung zur Herstellung eines Medikaments mit kurativem, präventivem oder Impfziel, bestimmt zur Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers, insbesondere durch die Gentherapie.
Nach einer ersten Möglichkeit kann das Medikament direkt in vivo gegeben werden (beispielsweise in einen Muskel, in die Lungen durch Aerosol...). Man kann auch den ex vivo-Weg wählen, der aus der Entnahme von Zellen aus dem Patienten (Knochenmarkzellen, Lymphocyten des peripheren Bluts, Muskelzellen...), der Transfektion in vitro gemäß der vorliegenden Erfindung und der Wiedereinführung in den Patienten besteht.
Die erfindungsgemäßen Komplexe können auf intramuskulärem, intratrachealem, intranasalem, intracerebralem, intrapleuralem, intratumoralem, intrakardialem, intragastrischem, intraperetonealem, epidermischen, intravenösen, intraarteriellem Weg durch Spritzen oder jedes andere äquivalente Mittel, durch die zur Behandlung der Atemwege oder der Schleimhäutiadaptierten Systeme wie Inhalation, Instillation oder Aerosolisierung gegeben werden. Man kann auch die Verabreichungswege auf topischem Weg angeben wie beispielsweise durch Auftragen einer Creme, durch orale Gabe oder durch jedes andere den Fachleuten perfekt bekannte Mittel, das für die vorliegende Erfindung anwendbar ist.
Es liegt auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung, Organe oder bestimmte Gewebe durch Gabe, insbesondere auf intravenösem Weg, eines erfindungsgemäßen Komplexes zu markieren, der so hergestellt wurde, daß das Verhältnis Verbindung oder Zusammensetzung/therapeutisch wirksame Substanz im Komplex und die scheinbare Ladung des Komplexes eingestellt wird (siehe insbesondere Liu et al., 1997, Gene Therapy, 4, 517-523; Thierry et. al., 1995, P. N. A. S., 92, 9742-9746).
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Gentherapie, bestehend aus der Gabe einer geeigneten Menge einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung an einen Patienten. Erfindungsgemäß und im Rahmen einer Gentherapie in vivo ist es möglich, mehrere Male bei einem gegebenen Patienten das vorgeschlagene Verfahren zu wiederholen, ohne daß irgend eine wesentliche Immunreaktion beim Kontakt mit einer der verabreichten Verbindungen entstehen. Die Gabe kann in einer einzigen oder in einer einmal oder mehrere Male nach einem bestimmten Zeitintervall wiederholten Dosen erfolgen. Die wiederholte Gabe ermöglicht die Verminderung der Menge der therapeutisch aktiven Substanz, insbesondere der DNA, in einer gegebenen Dosis. Der Verabreichungsweg und die geeignete Dosierung variieren als Funktion von verschiedenen Parametern, beispielsweise dem Individuum oder der zu behandelnden Krankheit oder auch dem zu übertragenden Polynukleotid.
Die Erfindung betrifft genauer ein pharmazeutisches Präparat, umfassend mindestens einen Komplex wie vorstehend beschrieben, der gegebenenfalls darüber hinaus mindestens einen Hilfsstoff umfaßt, der die Stabilisierung dieses pharmazeutischen Präparats, beispielsweise im Hinblick auf seine Lagerung, und/oder die Verbesserung der Transfektionskraft des Komplexes ermöglicht. Ein solcher Hilfsstoff kann beispielsweise ausgewählt werden aus der Gruppe, die aus Chloroquin, einer polaren protischen Verbindung, insbesondere ausgewählt aus Propylenglykol, Polyethylenglykol, Glycerin, Ethanol, 1-Methyl-L-2-pyrrolidon oder ihren Derivaten bestehenden Gruppe, oder einer polaren aprotischen Verbindung, insbesondere ausgewählt aus der aus Dimethylsulfoxid (DMSO), Diethylsulfoxid, Di-n-propylsulfoxid, Dimethylsulfon, Sulfolan, Dimethylformamid, Dimethylacetimid, Tetramethylharnstoff, Acetonitril oder ihren Derivaten bestehenden Gruppe. Genauso kann das Präparat einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfassen, der die Verabreichung an einen Menschen oder ein Tier ermöglicht.
Im Rahmen der Durchführung eines Verfahrens zur Behandlung in vivo gemäß der vorliegenden Erfindung ist es darüber hinaus möglich, vor der Gabe eines pharmazeutischen Präparates, wie des zuvor beschriebenen, eine Behandlung des Patienten durchzuführen, die auf eine zeitweise Verminderung der Makrophagen abzielt, und die die Verbesserung des Traasfektionsgrad ermöglicht. Eine solche Technik wird in der Literatur beschrieben, siehe insbesondere Van Rooijen et al., 1997, TibTech, 15, 178 -184.
Die Erfindung betrifft auch eine Zelle, die durch einen wie vorstehend definierten Komplex transfiziert ist, insbesondere eine prokariotische Zelle, eine Hefezelle oder eine eukariotische Zelle, insbesondere eine Tierzelle, und besonders eine Säugerzelle, genauer eine Krebszelle. Nach einem bevorzugten Fall der Erfindung ist diese Zelle eine Zelle der Atemwege, genauer eine Tracheal- oder Pulmunalzelle und vorteilhafterweise eine Zelle des respiratorischen Epithels.
Schließlich betrifft die Erfindung eine Vorrichtung wie ein Verfahren, das die Isolierung eines interessierenden Moleküls ermöglicht, welches mindestens eine negative Ladung einschließt, insbesondere Nukleinsäuren wie die erfindungsgemäß definierten. Unter "Isolierung" wird die Bezeichnung der Abtrennung, des Nachweises, der Anreicherung, der Reinigung einer Fraktion von anionischen Molekülen nach einer spezifischen oder unspezifischen Methode auf qualitative und/oder quantitative Weise verstanden.
Genauer betrifft die Erfindung eine Vorrichtung, die aus einem festen dispersen Träger wie beispielsweise Polymerpartikeln (aus Polystyrol, Acrylamid, Methacrylamid, oder einem von ihren Derivaten oder jedem anderen Polymer, das zur Bildung von Partikeln fähig ist, von denen zahlreiche Beispiele in der Literatur beschrieben sind, insbesondere in der Literatur, die diagnostische Anwendung betrifft) oder aus einem nicht dispersen festen Träger, wie beispielsweise einem Röhrchen, beispielsweise aus Polystyrol, einer Säule, beispielsweise Hydroxyapatit, einer Säule mit reverser Phase oder Äquivalenten besteht, auf der mindestens eine Verbindung oder eine Zusammensetzung gemäß der Erfindung fixiert ist, in seiner kationischen Form. Die Fixierung am festen Träger kann auf direkte Weise (beispielsweise Adsorption) oder indirekte Weise (durch Zwischenschalten einer Brücke vom Typ Ligand/Anti-Ligand) realisiert werden. Die Realisierung solcher Vorrichtungen steht dem Fachmann zur Verfügung.
Übrigens betrifft die Erfindung ein Verfahren, das eine solche Vorrichtung einsetzt, um die Isolierung von anionischen Molekülen, insbesondere von Nukleinsäuren zu ermöglichen. Eine solche Isolierung kann insbesondere nicht-spezifisch oder bevorzugt spezifisch sein. Im zweiten Fall wird die kationische Verbindung oder Zusammensetzung vor dem Isolierungsschritt beispielsweise in Kontakt mit einem Oligonukleotid gebracht, dessen spezifische Sequenz nach einem Hybridisierungsschrift unter Bedingungen, die eine spezifische Hybridisierung ermöglichen, die Isolierung auf spezifische Weise eines Nukleinsäurefragments ermöglicht, das die gesamte oder einen Teil einer komplementären Sequenz zur Sequenz dieses Oligonukleotids einschließt. Die Durchführung eines solchen Verfahrens ist breit in der Literatur beschrieben.

Legende der Figuren:

Fig. 1: Diese Figur illustriert das Syntheseverfahren für die in A beschriebenen Verbindungen.
Fig. 2: Analyse der Größen von Partikeln aus Komplexen, die zwischen den Glycerolipiden der Erfindung und dem Plasmid pTG11033 (Patentanmeldung Nr. FR 9708267) mit 0,1 mg/ml gebildet wurden und hergestellt wurden durch die Technik mit Ethanol, die zuvor beschrieben wurde. Die Ergebnisse sind für verschiedene Ladungsverhältnisse angegeben. Bei jeder Messung wurden drei unabhängige Präparate getestet, und das Maß der Reproduzierbarkeit wird durch die Standardabweichung zwischen den Präparaten angegeben. Die Größe der Partikel wird durch PCS (Photon Correlation Spectroscopy) gemessen. Die schraffierten Säulen zeigen die in Abwesenheit von DOPE erhaltenen Komplexe und die dunklen Säulen die in Gegenwart einer äquimolaren Mengen DOPE erhaltenen Komplexe. Die Komplexe, für die man eine Ausfällung beobachtet, sind durch eine Säule dargestellt, die über die Säule hinausgeht.
A) Glycerolipide, umfassend 3 positive Ladungen (C-14 = pcTG 18, C-16 = pcTG21, C- 18 = pcTG19, Oleoyl = peTG20); B) Glycerolipide, umfassend 4 positive Ladungen (C-14 = peTG33, C-16 = pcTG34, C-18 = peTG36, Oleoyl = peTG35); C) Glycerolipide, umfassend Oleoylketten und 3 (peTG20), 4 (pcTG35) oder 5 positive Ladungen (pcTG56).
Fig. 3: Intravenöse Injektion von erfindungsgemäßen Komplexen. Die Luciferase-Aktivität wird in RL/mg Protein angegeben.
Fig. 4: Diese Figur zeigt das Syntheseverfahren für fluorierte Glycerolipide aus Beispiel N.
Fig. 5 A bis G: In vitro-Transfektion von Zellen A549 in Gegenwart von Komplexen, die verschiedene fluorierte Glycerolipide gemäß der Erfindung einschließen.

Beispiele

Die folgenden Beispiele illustrieren die Erfindung, ohne sie in irgend einer Weise zu beschränken, in Verbindung mit den beigefügten Figuren, die einen wesentlichen Bestandteil der Beschreibung bilden.

A.: Synthese von Säuren der Formel VII mit m = 3; n = 2; R&sub6; = BOC (Säure 7a) oder m = 3; n = 3; R&sub6; = BOC (Saure 7b) (siehe Fig. 1)

Aminosäuren 4, 6 und 15

Eine Lösung von Acrylnitril (9,6 ml, 146 mmol) in 50 ml 1,4-Dioxan wird tropfenweise zu einer eisgekuhlten Lösung von Glycin (10,0 g, 132 mmol) und 1 N Soda (133 ml) in einer Mischung 1/1 Wasser und 1,4-Dioxan (200 ml) gegeben. Das Reaktionsmedium wird bei 0ºC während 1 Stunde und bei Raumtemperatur während 4 zusätzlicher Stunden gerührt. Eine Lösung von Ditertiärbutyldicarbonat (35,0 g, 159 mmol) in 1,4-Dioxan (100 ml) wird anschließend tropfenweise zugegeben, und das Reaktionsmedium wird während 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach Extraktion mit Ether (2 · 100 ml) wird die wäßrige Phase mit 1 N Salzsäure angesäuert (ph 2 bis 3) und mit Ethylacetat (2 · 100 ml) extrahiert. Die kombinierten organischen Phasen werden getrocknet und konzentriert. Die erhaltene Cyanosäure 1 (24,4 g, Ausbeute 81%) liegt in Form eines weißen Feststoffs mit einem Schmelzpunkt von 87 bis 89ºC vor.
¹H-NMR (200 MHz, D&sub2;O): δ 3,88 und 3,87 (2 s, 2H, -CH&sub2;-CO&sub2;H), 3,48 und 3,45 (2 t, J = 6,3 Hz, 2H, -CH&sub2;-N(BOC)-), 2,58 und 2,56 (2 t, J = 6,3 und 6,4 Hz, 2H, -CH&sub2;- CN), 1,30 und 1,24 (2s, 9H, t-Bu-).
Eine Lösung der Säure 1 (1,5 g, 50,4 mmol) in 100 ml Ethanol, enthaltend 4,04 g (100 mmol) Soda wird in Gegenwart von Raney-Nickel (3,2 g) während 18 Stunden bei Raumtemperatur hydriert. Die Mischung wird über Celite filtriert und der Katalysator mit Methanol gewaschen (2 · 30 ml). Das Filtrat wird auf pH 4,5 mit 10%iger Salzsäure angesäuert und im Vakuum konzentriert und ergibt einen weißen Feststoff, der in Chloroform (50 ml) gelöst wird, um den größten Teil des Natriumchlorids auszufällen. Nach Filtration, Konzentration des Filtrats im Vakuum und Umkristallisation in Tetrachlorkohlenstoff erhält man die Aminosäure 2 (10,4 g, Ausbeute 89%), deren Schmelzpunkt 201 bis 202ºC beträgt.
¹H-NMR (200 MHz, D&sub2;O): δ 3,53 (s, 2H, -CH&sub2;-CO&sub2;H), 3,17 (t, J = 6,6 Hz, 2H,- CH&sub2;-N(BOC)-), 2,83 (t, J = 7,5 Hz, 2H, -CH&sub2;-NH&sub2;), 1,69 (quint, J = 7 Hz, 2H, -CH&sub2;-), 1,26 und 1,21 (25, 9H, t-Bu).
Dasselbe Verfahren wie zur Herstellung für Cyanosäure 1 führt zur Herstellung von Cyanosäure 3 ausgehend von Aminosäure 2.
¹H-NMR (200 MHz, CDCl&sub3;), δ 4,00 - 3,85 (m, 2H, -CH&sub2;-CO&sub2;H), 3,55 - 3,43 (m, 2H, -CH&sub2;-CH&sub2;-CN), 3,31 (t, J = 7,2 Hz, 4H, -CH&sub2;-N(BOC)-), 2,61 (m, 2H, -CH&sub2;-CN), 1,78 (quint, J = 7,2 Hz, 2H, -CH&sub2;-), 1,47 und 1,44 (2s, 18H, t-Bu-).
Aminosäure 4 wird mit einer Ausbeute von 87% nach Reinigung durch Chromatographie über Kieselgel (Eluens: Methanol/Dichlormethan 3/7, dann 6/4) ausgehend von Cyanosäure 3 nach demselben Verfahren erhalten, das zur Aminosäure 2 geführt hat. Der Schmelzpunkt ist 189 bis 190ºC.
¹H-NMR (200 MHz), D&sub2;O): δ 3,57 und 3,54 (2s, 2H, -CH&sub2;-CO&sub2;H), 3,2 - 3,0 (m, 6 H, -CH&sub2;-N(BOC)-), 2,80 (t, J = 7,7 Hz), 2H, -CH&sub2;-NH&sub2;), 1,80 - 1,50 (m, 4H, -CH&sub2;-), 1,27 und 1,22 (25, 18H, t-Bu-).
Dasselbe Verfahren wie für Cyanosäure 1 ermöglicht die Herstellung der Cyanosäure 5 ausgehend von Aminosäure 4.
¹H-NMR (200 MHz, CDCl&sub3;): δ 3,85 (s breit, 2H, -CH&sub2;-CO&sub2;H), 3,47 (t, J = 6,6 Hz, 2H, -CH&sub2;-CH&sub2;-CN), 3,35 - 3,05 (m, 8H, -CH&sub2;-N(BOC)-), 2,60 (m, 2H, -CH&sub2;-CN), 1,85 -1,60 (m, 4H, -CH&sub2;-), 1,46 und 1,44 (2 s, 27H, t-Bu-).
Aminosäure 6 wird mit einer Ausbeute von 83% nach Reinigung durch Chromatographie auf Kieselgel (Eluens: Methanol/Dichlormethan 3/7, dann 6/4) ausgehend von Cyanosäure 5 nach demselben Verfahren erhalten, das zur Aminosäure 2 geführt hat.
¹H-NMR (200 MHz, D&sub2;O): δ 3,76 und 3,73 (2s, 2H, -CH&sub2;-CO&sub2;H), 3,25 - 2,75 (m, 12H, -CH&sub2;-N(BOC)- und -CH&sub2;-NH&sub2;), 1,85-1,50 (m, 6H, -CH&sub2;-), 1,28 und 1,23 (2 s, 27 H, t-Bu-).
Dasselbe Verfahren wie für Cyanosäure 1 ermöglicht die Herstellung der Cyanosäure 14 ausgehend von Aminosäure 6.
¹H-NMR (200 MHz, CDCl&sub3;): δ 3,95 und 3,87 (2 s, breit, 2H, -CH&sub2;-CO&sub2;H), 3,47 (t, J = 6,5 Hz, 2H, -CH&sub2;-CH&sub2;-CN), 3,40 - 3,05 (m, 12H, -CH&sub2;-N(BOC)-), 2,61 (m, 2H,- CH&sub2;-CN), 1,90-1,60 (m, 6H, -CH&sub2;-), 1,47, 1,45 und 1,44 (3 s, 36H, t-Bu-).
Aminosäure 15 wird mit einer Ausbeute von 71% nach Reinigung durch Chromatographie über Kieselgel (Eluens: Methanol/Dichlormethan 1/9, dann 3/7) ausgehend von Cyanosäure 14 nach einem identischen Verfahren wie das, das zur Aminosäure 2 geführt hat, erhalten.
¹H-NMR (200 MHz, D&sub2;O - CD&sub3;OD): δ 3,57 (m, 2H, -CH&sub2;-CO&sub2;H), 3,15-2,80 (m, 14H, -CH&sub2;-N(BOC)-), 2,70 (t, J = 7,5 Hz, 2H, -CH&sub2;-NH&sub2;), 1,75-1,35 (m, 8H, -CH&sub2;-), 1,17 und 1,13 (2 s, 36H, t-Bu-)

Säuren 7a, 7b und 7c

Eine Lösung von Ditertiärbutyldicarbonat (1,09 g, 5,01 mmol) in Tetrahydrofuran (4 ml) wird zu einer Lösung der Aminosäure 4 (1,50 g, 3,85 mmol) und von Triethylamin (1,07 ml, 7,7 mmol) in einer Mischung 1/1 von Tetrahydrofuran und Wasser (8 ml) gegeben. Das Reaktionsmedium wird während 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Es wird anschließend mit einer 10% igen wäßrigen Salzsäurelösung auf pH 3 angesäuert und mit Ethylacetat extrahiert. Die organische Phase wird mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und konzentriert und ergibt ein farbloses Öl, das nach Chromatographie auf einer Kiesilgelsäule (Eluens: Ethylacetat) die Säure 7a ergibt (1,79 g; Ausbeute: 95%).
¹H-NMR (200 MHz, CD&sub3;OD): δ 3,79 (s, 2H, -CH&sub2;-CO&sub2;H), 3,30-3,15 (m, 6H,- CH&sub2;-N(BOC)-), 3,03 (t, J = 6,7 Hz 2H, -CH&sub2;-N(BOC)-), 1,85-1,60 (m, 4H- CH&sub2;-), 1,46 und 1,43 (2 s, 27H, t-Bu-).
Dasselbe Verfahren wie für die Säure 7a ermöglicht die Herstellung der Säure 7b (7,31 g; Ausbeute: 95%) ausgehend von Aminosäure 6 (6,50 g).
¹H-NMR (200 MHz, CDCl&sub3;): δ 3,93 und 3,86 (m, 2H, -CH&sub2;-CO&sub2;H), 3,40-3,05 (m, 12H, -CH&sub2;-N(BOC)-), 1,85-1,60 (m, 6H, -CH&sub2;-), 1,44 (s breit, 36H, t-Bu).
Dasselbe Verfahren wie fur die Säure 7a ermöglicht die Herstellung der Säure 7c (3,37 g; Ausbeute: 92% nach Chnmatographie über Kieselgel; Eluens: Methanol/Dichlormethan 5/95, dann 10/90) ausgehend von Aminosäure 15 (3,20 g; 4,55 mmol).
¹H-NMR (200 MHz, CDCl&sub3;): δ 3,85 (m, 2H, -CH&sub2;-CO&sub2;H), 3,45 - 3,05 (m, 16H,- CH&sub2;-N(BOC)-), 1,85 -1,60 (m, 8H, -CH&sub2;-), 1,45, 1,44 und 1,43 (3 s, 45H, t-Bu).

Synthese von kationischem Glycerolipiden

Ester 8a, 8b und 8c

Eine Lösung von Dicyclohexylcarbodiimid (0,60 g, 2,9 mmol) in trockenem Dichlormethan (1 ml) wird zu einer Lösung der Säure 7a (1,10 g, 2,25 mmol), von (S)- (+)-2,2-Dimethyl-1,3-dioxolan-4-methanol (0,39 g, 2,9 mmol) und 4- (Dimethylamino)pyridin (27 mg, 0,23 mmol) in trockenem Dichlormethan (3 ml) gegeben. Das Reaktionsmedium wird während 18 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Der Dicyclohexylharnstoff-Niederschlag wird durch Filtration abgetrennt und das Filtrat wird im Vakuum konzentriert und anschließend auf einer Kieselgelsäule chromatographiert (Eluens: Ether/Hexan 6/4) und ergibt den Ester 8a (0,72 g; 53%).
¹H-NMR (200 MHz, CDCl&sub3;): δ 4,40-4,02 (m, 4H, -CH&sub2;-O-), 3,98 und 3,90 (2 s breit, 2H, -CH&sub2;-CO&sub2;-), 3,73 (m, 1H, CH-O-), 3,35-3,00 (m, 8H), 1,85-1,55 (m, 4H,- CH&sub2;-), 1,45, 1,43 und 1,42 (3 s, 30H), 1,36 (s, 3H, Me-).
Dasselbe Verfahren wie für Ester 8a ermöglicht die Herstellung des Esters 8b (3,08 g; Ausbeute: 49%) ausgebend von der Säure 7b (5,32 g, 8,22 mmol).
¹H-NMR (200 MHz, CDCl&sub3;): δ 4,40-4,02 (m, 4H, -CH&sub2;-O-) 3,99 und 3,91 (2 s breit, 2H, -CH&sub2;CO&sub2;-), 373 (m, 1H, CH-O-), 3,32-3,00 (m, 12H, -CH&sub2;-N(BOC)-), 1,85- 1,55 (m, 6H, -CH&sub2;-), 1,45, 1,44, 1,43 und 1,41 (4 s, 39H, t-Bu- und Me-), 1,36 (2 s, 3H, Me-).
Dasselbe Verfahren wie Für Ester 8a ermöglicht die Herstellung des Esters 8c (1,73 g; Ausbeute: 95%) ausgehend von der Säure 7c (1,60 g; 1,99 mmol).
¹H-NMR (200 MHz, CDCl&sub3;): δ 4,35-4,04 (m, 4H, -CH&sub2;-O-), 3,99 und 3,92 (2 s, 2 H, -CH&sub2;-CO&sub2;-), 3,74 (m, 1H, > CH-O-), 3,30-3,00 (m, 16H, -CH&sub2;-N(BOC)-), 1,85-1,55 (m, 8H, -CH&sub2;-), 1,46, 1,45, 1,44 und 1,42 (4 s, 48H, t-Bu- und Me-), 1,36 (s, 3H, Me-).

Dihydroxyester 9a, 9b und 9c

Eine Lösung des Esters 8a (663 mg, 1,10 mmol) und von 1 N Salzsäure (0,44 ml) in Methanol (19 ml) wird während 16 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Triethylamin (0,5 ml) wird anschließend bis zu: Neutralität zugegeben. Eindampfen im Vakuum, gefolgt von Chromatographie auf einer Kieselgelsäule (Eluens: Ether, dann Ethylacetat) ergibt den Dihydroxyester 9a (497 mg; Ausbeute: 80%) in Form eines farblosen Öls.
¹H-NMR (200 MHz, CDCl&sub3;): δ 4,26 (m, 2H, -CH&sub2;-OC(=O)-), 4,00-3,50 (m, 5H, CH-OH, -CH&sub2;-OH und -CH&sub2;-C(O&sub2;-), 3,40-3,00 (m, 8H, -CH&sub2;-N(BOC)-), 1,85-1,55 (m, 4H, -CH&sub2;-), 1,45 und 1,43 (2 s, 27H, t-Bu-).
Dasselbe Verfahren wie für Dihydroxyester 9a ermöglicht die Herstellung von Dihydroxyester 9b (340 mg; Ausbeute: 71%) ausgehend von Ester 8b (500 mg, 0,66 mmol).
¹H-NMR (200 MHz, CDCl&sub3;): δ 4,26 (m, 2H, -CH&sub2;-OC(=O)-), 4,00-3,40 (m, 5H, CH-OH, CH&sub2;OH, und-CH&sub2;-CO&sub1;-), 3,40-3,00 (m, 12H, -CH&sub2;-N(BOC)-), 1,85-1,55 (m, 6H, -CH&sub2;-), 1,46, 1,45 und 1,43 (3 s, 36H, t-Bu-).
Dasselbe Verfahren wie für Dihydroxyester 9a ermöglicht die Herstellung von Dihydroxyester 9c (1,23 g; Ausbeute: 83% nach Chromatographie über Kieselgel; Eluens: Methanol/Dichlormethar 5/95) ausgehend von Ester 8c (1,55 g; 1,69 mmol).
¹H-NMR (200 MHz, CDCl&sub3;): δ 4,25 (m, 2H, -CH&sub2;-OC(=O)-), 4,00-3,40 (m, 5H, CH-OH, -CH&sub2;OH und-CH&sub2;-CO&sub2;-), 3,40-3,00 (m, 16H, -CH&sub2;-N(BOC)-), 1,90-1,60 (m, 8 H, -CH&sub2;-), 1,46, 1,45, 1,44 und 1,42 (4 s, 45H, t-Bu-).

Triester 10a, 11a, 12a ung 13a

Eine Lösung von Dicyclohexylcarbodiimid (142 mg, 0,69 mmol) in trockenem Dichlormethan (1 ml) wird zu einer Lösung von Dihydroxyester 9a (130 mg, 0,23 mmol) Ölsäure (195 mg, 0,69 mmol; Fluka puriss.) und 4-(Dimethylamino)pyridin (3 mg, 0,02 mmol) in trockenem Dichlormethan (2 ml) gegeben. Das Reaktionsmedium wird während 16 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Der Dicyclohexylhamstoff-Niederschlag wird durch Filtration entfernt und das Filtrat wird im Vakuum konzentriert und über eine Kieselgelsäule chromatographleit (Eluens: Ether/Hexan 3/7, dann 4/6) und ergibt den Triester 10a (142 mg; 57%) in Form eines farblosen Öls.
¹H-NMR (200 MHz, CDCl&sub3;): δ 5,34 (m, 4H, -CH=), 5,26 (m, 1H, CH-OC(=O)-), 4,40-4,05 (m, 4H, -CH&sub2;-OC(=O)-), 3,95 und 3,88 (2 m, 2H, -N(BOC)-CH&sub2;-CO&sub2;-), 3,35- 3,00 (m, 8H, -CH&sub2;-N(BOC)-), 2,31 (t, J = 7,5 Hz, 4H, -CH&sub2;-CO&sub2;-), 2,01 (m, 8H, -CH&sub2;- CH=), 1,85-1,50 (m, 8H, -CH&sub2;-), 1,46, 1,44 und 1,42 (3 s, 27H, t-Bu-), 1,30 und 1,27 (2 s breit, 44H, -CH&sub2;-), 0,88 (t, J = 6,4 Hz, 6H, Me-).
Dasselbe Verfahren wie für Triester 10a ermöglicht die Herstellung der Triester 11a (Ausbeute: 65%), 12a (Ausbeute: 64%) und 13a (Ausbeute: 58%) ausgehend von Dihydroxyester 9a und jeweils Myristinsäure, Palmitinsäure und Stearinsäure.
11a ¹H-NMR (200 MHz, CDCl&sub3;): δ 5,26 (m, 1H CH-OC(=O)-), 4,45-4,05 (m, 4 H, -CH&sub2;-OC(=O)-), 3,95 und 3,88 (2 m, 2H, -N(BOC)-CH&sub2;-CO&sub2;-), 3,35-3,00 (m, 8H,- CH&sub2;-N(BOC)-), 2,31 (t, J = 7,5 Hz, 4H, -CH&sub2;-CO&sub2;-), 1,85-1,50 (m, 8H, -CH&sub2;-), 1,46, 1,44 und 1,42 (3 s, 27H, t-Bu-), 1,26 (s, 40H, -CH&sub2;), 0,88 (t, J = 6,4 Hz, 6H, Me-).
12a ¹H-NMR (200 MHz, CDCl&sub3;): δ 5,26 (m, 1H CH-OC(=O)-), 4,40-4,05 (m, 4 H, -CH&sub2;-OC(=O)-), 3,95 und 3,88 (2 m, 2H, -N(BOC)-CH&sub2;-CO&sub2;-), 3,35-3,00 (m, 8H,- CH&sub2;-N(BOC)-), 2,31 (t, J = 7,5 Hz, 4H, -CH&sub2;-CO&sub2;-), 1,85-1,50 (m, 8H, -CH&sub2;-), 1,46, 1,44 und 1,42 (3 s, 27H, t-Bu-), 1,25 (s, 48H, -CH&sub2;-), 0,88 (t, J = 6,4 Hz, 6H, Me-).
13a ¹H-NMR (200 MHz, CDCl&sub3;): δ 5,26 (m, 1H, CH-OC(=O)-), 4,40-4,05 (m, 4 H, -CH&sub2;-OC(=O)-), 3,95 und 3,88 (2 m, 2H, -N(BOC)-CH&sub2;-CO&sub2;-), 3,35-3,00 (m, 8H,- CH&sub2;-N(BOC)-), 2,31 (t, J = 7,5 Hz, 4H, -CH&sub2;-CO&sub2;-), 1,85-1,50 (m, 8H, -CH&sub2;-), 1,46, 1,44 und 1,42 (3 s, 27H, t-Bu-), 1,26 (s, 56H, -CH&sub2;-), 0,88 (t, J = 6,4 Hz, 6H, Me-).

Triester 10b, 11b, 12b und 13b

Dasselbe Verfahren wie für Triester 10a ermöglicht die Herstellung von Triester 10b (137 mg; Ausbeute: 61%) ausgehend von Dihydroxyester 9b (130 mg, 0,18 mmol) und Ölsäure (153 mg, 0,54 mmol; Fluka puriss.).
¹H-NMR (200 MHz, CDCl&sub3;): δ 5,34 (m, 4H, -CH=), 5,26 (m, 1H, CH-OC(=O)-), 4,40-4,05 (m, 4H, -CH&sub2;-OC(=O)-), 3,96 und 3,89 (2 m, 2H, -N(BOC)-CH&sub2;-CO&sub2;-), 3,35- 3,00 (m, 12H, -CH&sub2;-N(BOC)-), 2,31 (t, J = 7,5 Hz, 4H, -CH&sub2;-CO&sub2;-), 2,01 (m, 8H, -CH&sub2;- CH=), 1,85-1,50 (m, 10H, -CH&sub2;-), 1,46, 1,45, 1,44 und 1,41 (4 s, 36H, t-Bu-), 1,30 und 1,27 (2 s breit, 44H, -CH&sub2;-), 0,88 (t, J = 6,4 Hz, 6H, Me-).
Dasselbe Verfahren wie Für Triester 10a ermöglicht die Herstellung der Triester 11b (Ausbeute: 64%), 12b (Ausbeute: 58%) und 13b (Ausbeute: 63%) ausgehend von Dihydroxyester 9b und jeweils von Myristinsäure, Palmitinsäure und Stearinsäure.
11b ¹H-NMR (200 MHz, CDCl&sub3;): δ 5,26 (m, 1H CH-OC(=O)-), 4,40-4,05 (m, 4 H, -CH&sub2;-OC(=O)-), 3,97 und 3,89 (2 m, 2H, -N(BOC)-CH&sub2;-CO&sub2;-), 3,35-3,00 (m, 12H,- CH&sub2;-N(BOC)-), 2,31 (t, J = 7,5 Hz, 4H, -CH&sub2;-CO&sub2;-), 1,85-1,50 (m, 10H, -CH&sub2;-), 1,46, 1,45, 1,44 und 1,41 (4 s, 27H, t-Bu-), 1,26 (s, 40H, -CH&sub2;-), 0,88 (t, J = 6,4 Hz, 6H, Me-).
12b ¹H-NMR (200 MHz, (CDCl&sub3;): δ 5,26 (m, 1H CH-OC(=O)-), 4,40-4,05 (m, 4 H, -CH&sub2;-OC(=O)-), 3,97 und 3,89 (2 m, 2H, -N(BOC)-CH&sub2;-CO&sub2;-), 3,35-3,00 (m, 12H,- CH&sub2;-N(BOC)-), 2,31 (t, J = 7,5 Hz, 4H, -CH&sub2;-CO&sub2;-), 1,85-1,50 (m, 10H, -CH&sub2;-), 1,46, 1,45, 1,44 und 1,41 (4 s, 27H, t-Bu-), 1,25 (s, 48H, -CH&sub2;-), 0,88 (t, J = 6,4 Hz, 6H, Me-).
13b ¹H-NMR (200 MHz, CDCl&sub3;): δ 5,26 (m, 1H CH-OC(=O)-), 4,40-4,05 (m, 4 H, -CH&sub2;-OC(=O)-), 3,97 und 3,89 (2 m, 2H, -N(BOC)-CH&sub2;-CO&sub2;-), 3,35-3,00 (m, 12H,- CH&sub2;-N(BOC)-), 2,31 (t, J = 7,5 Hz, 4H, -CH&sub2;-CO&sub2;-), 1,85-1,50 (m, 10H, -CH&sub2;-), 1,46, 1,45, 1,44 und 1,41 (3 s, 27H, t-Bu-), 1,25 (s, 56H, -CH&sub2;-), 0,88 (t, J = 6,4 Hz, 6H, Me-).

Triester 10c

Dasselbe Verfahren wie fur Triester 10a ermöglicht die Herstellung von Triester 10c (0,75 g; Ausbeute: 47%) ausgehend von Dihydroxyester 9c (1,00 g; 1,14 mmol) und Ölsäure (0,97 g; 3,42 mmol; Fluka puriss.).
¹H-NMR (200 MHz, CDCl&sub3;): δ 5,34 (m, 4H, -CH=), 5,26 (m, 1H, CH-OC(=O), 4,40-4,05 (m, 4H, -CH&sub2;-OC(=O)-), 3,95 und 3,89 (2 m, 2H, -N(BOC)-CH&sub2;-CO&sub2;-), 3,35- 3,00 (m, 16H, -CH&sub2;-N(BOC)-), 2,31 (t, J = 7,5 Hz, 4H, -CH&sub2;-CO&sub2;-), 2,01 (m, 8H, -CH&sub2;- CH=), 1,85-1,50 (m, 12H, -CH-), 1,46, 1,44, 1,43 und 1,41 (4 s, 45H, t-Bu-), 1,30 und 1,27 (2 s breit, 44H, -CH&sub2;-), 0,8,8 (t, J = 6,4 Hz, 6H, Me-).

Glycerolipide pcTG20

Der Triester 10a (120 mg, 0,11 mmol) in Lösung in trockenem Dichlormethan (1 ml) wird während 3 Stunden mit einer Mischung 1/1 aus Trifluoressigsäure und trockenem Dichlormethan (20 ml) bei 0ºC behandelt. Man gibt anschließend Hexan (50 ml) zu, und die Mischung wird im Vakuum eingedampft und ergibt einen Film, der in destilliertem Ether (5 bis 10 ml) suspendiert wird (Vortex). Die Filtration ergibt ein weißes Pulver, das mit Ether gewaschen und im Vakuum getrocknet wird, und ergibt das Glycerolipid pcTG20 (124 mg; 99%). Schmelzpunkt: Zersetzung bei 160ºC.
¹H-NMR (200 MHz, CDCl&sub3; - CF&sub3;C O&sub2;D): δ 5,34 (m, 5H, -CH= und CH- OC(=O)-), 4,60 - 4,15 (m, 4H, CH&sub2;-OC)=O)-), 3,99 (s breit, 2H, -NH&sub2;&spplus;-CH&sub2;-CO&sub2;-), 3,45-3,20 (m, 8H, -CH&sub2;-NH&sub2;&spplus;-), 2,39 (t, J = 7,5 Hz, 4H, -CH&sub2;-CO&sub2;-), 2,50-2,20 (m, 4H, -CH&sub2;-CH&sub2;-NH&sub2;-), 2,01 (m, 8H, -CH&sub2;-CH=), 1,61 (m, 4H, -CH&sub2;-CH&sub2;-CO&sub2;-), 1,30 und 1,27 (2 s, 44H, -CH&sub2;-), 0,88 (t, J = 6,4 Hz, 6H, Me-).
Elementaranalyse: berechnet für C&sub5;&sub3;H&sub9;&sub2;F&sub9;N&sub3;O&sub1;&sub2;: C, 56,12%, H, 8,18%, N, 3,70 %. Gefunden: C, 56,3%, H, 7,9%; N, 3,7%.

Glycerolipid pcTG35

Dasselbe Verfahren wie für das kationische Lipid pcTG20 ermöglicht die Herstellung des kationischen Lipicls pcTG35 (101 mg; Ausbeute: 97%) ausgehend von Triester 10b (100 mg, 0,08 mmol). Schmelzpunkt: Zersetzung bei 190ºC.
¹H-NMR (200 MHz, CDCl&sub3; - CF&sub3;C O&sub2;D): δ 5,35 (m, 5H, -CH= und CH-OC(=O)-), 4,60 -4,15 (m, 4H, -CH&sub2;- OC)=O)-), 4,00 (s breit, 2H, -NH&sub2;&spplus;-CH&sub2;-CO&sub2;-), 3,45-3,10 (m, 12 H, -CH&sub2;-NH&sub2;&spplus;-), 2,40 (t, J = 7,5 Hz, 4H, -CH&sub2;-CO&sub2;-), 2,45-2,20 (m, 6H, -CH&sub2;-CH&sub2;- NH&sub2;&spplus;-), 2,01 (m, 8H, -CH&sub2;-CH=), 1,60 (m, 4H, -CH&sub2;-CH&sub2;-CO&sub2;-), 1,30 und 1,27 (2 s, 44 H, -CH&sub2;-), 0,87 (t, J = 6,4 Hz, 6H, Me-).
Elementaranalyse: berechnet für C&sub5;&sub8;H&sub1;&sub0;&sub0;F&sub1;&sub2;N&sub4;O&sub1;&sub4;: C, 53,36%, H, 7,72%; N, 4,29 %. Gefunden: C, 53,2%, H, 7,6%; N, 4,3%. Das Massenspektrum wurde bei 849,8 Da gemessen (berechnet: 849,3 Da).

Glycerolinid pcTG56

Dasselbe Verfahren wie für Glycerolipid pcTG20 ermöglicht die Herstellung von Glycerolipid pcTG56 (0,51 g; Ausbeute: 93%) ausgehend vom Triester 10c (0,52 g; 0,37 mmol). Schmelzpunkt: Zersetzung bei 220ºC.
¹H-NMR (200 MHz, CDCl&sub3; - CF&sub3;C O&sub2;D): δ 5,36 (m, 5H, -CH= und CH- OC(=O)-), 4,60-4,15 (m, 4H, -C H&sub2;-OC(=O)-), 4,00 (s breit, 2H, -NH&sub2;&spplus;-CH&sub2;-CO&sub2;-), 3,45-3,10 (m, 16H, -CH&sub2;-NH&sub2;&spplus;-), 2,41 (t, J = 7,5 Hz, 4H, -CH&sub2;-CO&sub2;-), 2,28 (m, 8H,- CH&sub2;-CH&sub2;-NH&sub2;&spplus;-), 2,01 (m, 8H, -CH&sub2;-CH=), 1,61 (m, 4H, -CH&sub2;-CH&sub2;-CO&sub2;-), 1,30 und 1,27 (2 s, 44H, -CH&sub2;-), 0,87 (t, = 6,4 Hz, 6H, Me-).

Glycerolipide pcTG18, pcTG21 und pcTG19

Dasselbe Verfahren wie für Glycerolipid pcTG20 ermöglicht die Herstellung der Glycerolipide pcTG18 (Ausbeute: 97%; fest; Zersetzung bei 165ºC), pcTG12 (Ausbeute: 96%; fest; Zersetzung bei 1700C) und pcTG19 (Ausbeute: 92%; fest; Zersetzung bei 186ºC) ausgehend jeweils von den Triestern 11a, 12a und 13a.
pcTG18 ¹H-NMR (200 MHz, CDCl&sub3; - CF&sub3;C O&sub2;D): δ 5,35 (m, 1H, -CH- OC(=O)-), 4,60-4,15 (m, 4H, -CH&sub2;-OC(=O)-), 3,97 (s breit, 2H, -NH&sub2;&spplus;-CH&sub2;-CO&sub2;-), 3,45-3,15 (m, 8H, -CH&sub2;NH&sub2;&spplus;-, 2,38 (t, J = 7,5 Hz, 4H, -CH&sub2;-CO&sub2;-), 2,45-2,20 (m, 4H, -CH&sub2;-CH&sub2;-NH&sub2;&spplus;-), 1,60 (m, 4H, -CH&sub2;-CH&sub2;-CO&sub2;-), 1,25 (s, 40H, -CH&sub2;-), 0,87 (t, J = 6,4 Hz, 6H, Me-). Massenspektrum: berechnet 684,1 Da; gemessen 684,5 Da.
pcTG21 ¹H-NMR (200 MHz, CDCl&sub3; - CF&sub3;CD&sub3;OD): δ 5,20 (m, 1H, -CH- OC(=O)-), 4,45-4,00 (m, 4H, -CH&sub2;-OC(=O)-), 3,78 (s breit, 2H, -NH&sub2;&spplus;-CH&sub2;-CO&sub2;-), 3,15-2-40 (m, 8H, -CH&sub2;-NH&sub2;&spplus;-), 2,24 (t, J = 7,5 Hz, 4H, -CH&sub2;-CO&sub2;-), 2,18-1,92 (m, 4H, -CH&sub2;-CH&sub2;-NH&sub2;&spplus;-), 1,52 (m, 4H, -CH&sub2;-CH&sub2;-CO&sub2;-), 1,17 (s, 48H, -CH&sub2;-), 0,79 (t, J = 6,4 Hz, 6H, Me-). Massenspektrum: berechnet 740,2 Da; gemessen 740,6 Da.
pcTG19 ¹H-NMR (200 MHz, CDCl&sub3; - CF&sub3;C O&sub2;D): δ 5,38 (m, 1H, -CH- OC(=O)-), 4,60-4,15 (m, 4H, -CH&sub2;-OC(=O)-), 4,01 (s breit, 2H, -NH&sub2;&spplus;-CH&sub2;-CO&sub2;-), 3,45-3,20 (m, 8H, -CH&sub2;-NH&sub2;&spplus;-), 2,41 (t, J = 7,5 Hz, 4H, -CH&sub2;-CO&sub2;-), 2,50-2,25 (m, 4H, -CH&sub2;-CH&sub2;-NH&sub2;&spplus;-), 1,61 (m, 4H, -CH&sub2;-CH&sub2;-CO&sub2;-), 1,26 (s, 56H, -CH&sub2;-), 0,88 (t, J = 6,4 Hz, 6H, Me-). Massenspektrum: berechnet 796,3 Da; gemessen 796,8 Da.

Glycerolipide pcTG33, pcTG34 und pcTG36

Dasselbe Verfahren wie für Glycerolipid pcTG20 ermöglicht die Herstellung der Glycerolipide pcTG33 (Ausbeute: 97%; fest; Zersetzung bei 205ºC), pcTG34 (Ausbeute: 94%; fest; Zersetzung bei 215ºC) und pcTG36 (Ausbeute: 92%; fest; Zersetzung bei 220ºC) ausgehend jeweils von den Triestern 11b, 12b und 13b.
pcTG33 ¹H-NMR (200 MHz, CDCl&sub3; - CF&sub3;C O&sub2;D): δ 5,37 (m, 1H, -CH- OC(=O)-), 4,60-4,15 (m, 4H, -CH&sub2;-OC(=O)-), 4,00 (s breit, 2H, -NH&sub2;&spplus;-CH&sub2;-CO&sub2;-), 3,45-3,15 (m, 12H, -CH&sub2;-NH&sub2;&spplus;-), 2,39 (t, J = 7,5 Hz, 4H, -CH&sub2;-CO&sub2;-), 2,45-2,17 (m, 6 H, -CH&sub2;-CH&sub2;-NH&sub2;&spplus;-), 1,60 (m, 4H, -CH&sub2;-CH&sub2;-CO&sub2;-), 1,25 (s, 40H, -CH&sub2;-), 0,87 (t, J = 6,4 Hz, 6H, Me-). Massenspektaum: berechnet 741,2 Da; gemessen 741,6 Da.
pcTG34 ¹H-NMR (200 MHz, CDCl&sub3; - CF&sub3;C O&sub2;D): δ 5,37 (m, 1H, -CH- OC(=O)-), 4,60-4,15 (m, 4H, -CH&sub2;-OC(=O)-), 3,98 (s breit, 2H, -NH&sub2;&spplus;-CH&sub2;-CO&sub2;-), 3,45-3,10 (m, 12H, -CH&sub2;-NH&sub2;&spplus;), 2,39 (t, J = 7,5 Hz, 4H, -CH&sub2;-CO&sub2;-), 2,45-2,15 (m, 6 H, -CH&sub2;-CH&sub2;-NH&sub2;&spplus;-), 1,60 (m, 4H, -CH&sub2;-CH&sub2;-CO&sub2;-), 1,25 (s, 48H, -CH&sub2;-), 0,87 (t, J = 6,4 Hz, 6H, Me-). Massenspektrnm: berechnet 797,3 Da; gemessen 797,8 Da.
pcTG36 ¹H-NMR (200 MHz, CDCl&sub3; - CF&sub3;C O&sub2;D): δ 5,35 (m, 1H, -CH-OC(=O)- ), 4,60-4,15 (m, 4H, -CH&sub2;-OC(=O)-), 3,98 (s breit, 2H, -NH&sub2;&spplus;-CH&sub2;-CO&sub2;-), 3,45-3,10 (m, 12H, -CH&sub2;-NH&sub2;&spplus;-), 2,37 (t, J = 7,5 Hz, 4H, -CH&sub2;-CO&sub2;-), 2,45-2,15 (m, 6H, -CH&sub2;-CH&sub2;- NH&sub2;&spplus;-), 1,59 (m, 4H, -CH&sub2;-CH&sub2;-CO&sub2;-), 1,25 (s, 56H, -CH&sub2;-), 0,87 (t, J = 6,4 Hz, 6H, Me-). Massenspektrum: berechnet 854,4 Da; gemessen 854,0 Da.

Glycerolipid pcTG22

Ein etwas verschiedener Weg von dem vorstehend beschriebenen ermöglichte die Herstellung von Glycerolipod pTG23 ausgehend von 3-Amino-1,2-propandiol.
¹H-NMR (200 MHz, CDCl&sub3; - CD&sub3;OD): δ 5,04 (m, 1H, -CH-OC(=O)-), 4,27-3,92 (m, 2H, -CH&sub2;-OC(=O)-), 3,63 (s breit, 2H, -CH&sub2;-C(=O)-NH-), 3,10-2,90 (m, 8H, -CH&sub2;- NH&sub2;&spplus;-), 2,24 und 2,23 (2 t, J = 7,5 Hz, 4H, -CH&sub2;-CO&sub2;-), 2,15-1,95 (m, 4H, -CH&sub2;-CH&sub2;- NH&sub2;-), 1,51 (m, 4H, -CH&sub2;-CH&sub2;-CO&sub2;-), 1,17 (s, 56H, -CH&sub2;-), 0,79 (t, J = 6,7 Hz, 6H, Me-). Massenspektrum: berechnet 795,3 Da; gemessen 795,3 Da.

Glycerolipid pcTG90

Ein analoges Verfahren wie das für die Synthese des Lipids pcTG56 beschriebene ermöglicht die Herstellung des Lipids pcTG90 unter Verwendung von 3-Amino-1,2- propandiol anstelle von Glycerin.

B: Herstellung von Glycerolipid-DNA-Komplexen durch Lösen in Ethanol

1. Herstellung von Komplexen Glycerolipide pcTG20, gegebenenfalls DOPE, - DNA.

Die Mengen der Lipide werden ausgehend von der End-DNA-Konzentration (0,1 mg/ml für die Versuche in cellulären Kulturen), dem gewünschten Ladungsverhältnis, der Molmasse und der Anzahl der positiven Ladungen des ausgewählten kationischen Lipids berechnet. Zur Herstellung eines Komplexes zwischen pcTG20/DOPE und plasmidischer DNA mit einem Verhältnis von 10 zwischen durch das kationische Lipid beigesteuerten positiven Ladungen und den durch die DNA beigesteuerten negativen Ladungen bei einer End-DNA-Konzentration von 0,1 mg/ml mischt man die verschiedenen Bestandteile nach der folgenden Berechnung:
0,1 mg DNA/ml entspricht (0,1/330) mmol negative Ladungen (330Da ist das mittlere Molekulargewicht eines Nukleotids) pro ml entsprechend: 0,30 umol/ml negative Ladungen. Um 10 mal mehr positive Ladung zu erhalten, ist eine Konzentration von 3,0 umol/ml positive Ladungen erforderlich, die vom kationischen Lipid beigesteuert werden. Die Molmasse von pcTG20 in Trifluoracetat-Form ist 1134 g/Mol, und das Molekül enthält 3 positive Ladungen. Daher sind 1,0 umol/ml pcTG20 erforderlich, was 1,13 mg/ml entspricht.
Um eine äquimolare Konzentration an L-α-Dioleoyl-phosphatidylethanolamin (DOPE, 744 g/Mol, Sigma; P0510) zu erhalten, sind 0,74 mg/ml im lipidischen Präparat notwendig. Die Mengen und die Konzentrationen für die weiteren Verbindungen werden als Konsequenz ihrer jeweiligen Molmassen und ihrer Anzahl an positiven Ladungen eingestellt.
Die in Chloroform aufgenommenen Lipide werden eingedampft und anschließend in Chloroform/Methanol (v/v) solubilisiert und erneut eingedampft. Die kationischen Lipide werden ausgewogen und die Menge an DOPE wird ausgehend von einer Mutterlösung von 10 oder 20 mg/ml in Chloroform in einem Glasröhrchen eingestellt, das mit Ethanol und mit UV sterilisiert wurde, zur Herstellung einer Konzentration von 2 mmol kationischem Lipid. Die Lösungsmittel werden im Vakuum (200 mbar) während 45 Minuten bei 45ºC unter Verwendung eines Vortex mit 40 Umdrehungen pro Minute (Labconco, Rapidvap, Uniequip, Martinsried, Deutschland) eingedampft. Der lipidische Film wird in Ethanol aufgenommen, so daß eine Konzentration von 50 mg/ml kationisches Lipid vorliegt.
pcTG20/DOPE 1,13 mg + 0,74 mg = 1,87 mg in 23 ul Ethanol. Diese Lösung wird auf 230 ul mit 20 mmol HEPES pH 7,5 zur Herstellung einer Lösung aufgefüllt, die 5 mg/ml Endkonzentration kationisches Lipid enthält.
Die plasmidische DNA wird in einem Plastikröhrchen ausgehend von einer Mutterlösung mit 1 mg/ml /Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 7,5) hergestellt.
Für eine 0,5 ml Endlösung entnimmt man 50 ul der Mutterlösung (50 ug DNA), zu der man 335 ul 25 mM HEPES pH 7,5 gibt. Zur Komplexierung der DNA mit lipidischen Präparaten gibt man die Lipide zur DNA. Die Suspension wird durch Aufsaugen/Austropfen mit der Pipette gemischt (10 mal). Die Komplexe werden bei +4ºC aufbewahrt.
115 ul pcTG20/DOPE werden auf 385 ul der DNA-Lösung gegeben zur Herstellung von 0,5 ml Komplex mit 0,1 mg/ml DNA und einem Ladungsverhältnis von 10.
Die Herstellung der Komplexe wird unter einer Haube mit laminarem Fluß durchgeführt.
Man erhält Komplexe, deren Eigenschaften in der folgenden Tabelle I angegeben sind.

2. Herstellung von Glycerolipid-Komplexen pcT35, pcTG22 und pcTG18, gegebenenfalls DOPE, -DNA

Nach demselben Verfahren erhält man die Komplexe, deren Eigenschaften in der folgenden Tabelle I angegeben sind.

C. Herstellung von Glycerolipid-DNA-Komplexen durch Suspendieren in einer Detergens-Lösung

1. Herstellung von Komplexen Glycerolipid pcTG20, gegebenenfalls DOPE, - DNA

Die Mengen der Lipide werden wie oben beschrieben berechnet auf der Basis der End-DNA-Konzentration (0,1 mg/ml für die in vitro-Experimente), des gewünschten Ladungsverhältnisses, der Molmasse und der Anzahl der positiven Ladungen des ausgewählten kationischen Lipids. Das Mischen der Lipide wird in einem Glasröhrchen durchgeführt, das mit Alkohol und UV sterilisiert wurde, um eine 2 mmol Lösung des kationischen Lipids zu erhalten (siehe oben). Die Lösungsmittel werden eingedampft und der lipidische Film wird in einer Lösung von n-Octyl-β-D-glucopyranosid (Octylglucosid, Sigma, O 9882) in einem Verhältnis kationisches Lipid/Detergens von 1 : 5 (Mol: Mol) aufgenommen.
Man entnimmt 253 ul einer Lösung von Octylglucosid 20 mM in HEPES 20 mM pH 7,5, mit der man den Film der lipidischen Mischung pcTG20/DOPE aufnimmt. Die plasmidische DNA wird ausgehend von einer Mutterlösung von plasmidischer DNA mit 1 mg/ml hergestellt, von der 50 ul in 0,5 ml (0,1 mg/ml Endvolumen) gegeben werden, zu der man 323,5 ul HEPES 20 mM pH 7,5 gibt. 126,5 ul der lipidischen Suspension werden zu DNA gegeben, indem mit der Pipette 10 mal aufgesaugt und ausgetropft wird, um eine Endsuspension von 0,1 mg/ml DNA und einem Ladungsverhältnis +/- von 10 zu erhalten. Zur Entfernung des Detergens wird eine Dialyse von 3 mal 4 Stunden bei Raumtemperatur gegen HEPES 20 mM pH 7,5 in Dialyse-Mikrofingern durchgeführt (Exklusionsschwelle 13,2 kD; Sartorius, Göttingen, Deutschland). Die dialysierten Komplexe DNA/Lipid werden bei 4ºC aufbewahrt. Die Herstellung erfolgt in einer Haube mit laminarem Fluß.
Man erhält die Komplexe, deren Eigenschaften in der folgenden Tabelle I angegeben sind.

2. Herstellung von Komplexen Glycerolipide pcTG35, gegebenenfalls DOPE,- DNA

Man führt dasselbe Verfahren durch wie vorstehend.

D. Herstellung von Komplexen Lipide-DNA durch Beschallung/Extrusion

Die Mengen der Lipide werden berechnet wie oben beschrieben basierend auf der Endkonzentration von DNA (0,1 mg/ml Ihr die in vitro-Versuche), dem gewünschten Ladungsverhältnis, der Molmasse und der Anzahl der positiven Ladungen des ausgewählten kationischen Lipids. Das Mischen der Lipide wird in einem Glasröhrchen durchgeführt, das mit Alkohol und UV sterilisiert wurde, zur Herstellung einer 2 mM- Lösung des kationischen Lipids, wie oben angegeben. Die Lösungsmittel werden eingedampft und der lipidische Film wird in 900 ul HEPES 20 mM pH 7,5 bei 4ºC während ungefähr 16 Stunden aufgenommen. Die Suspension wird in einem Ultraschallbad bis zur visuellen Homogenität beschallt (Bransonic 221). Die lipidische Suspension wird durch zwei Membranen von 0,2 um Porendurchmesser (Nucleopore, Costar, Cambridge, MA, USA) extrudiert und mit HEPES 20 mM pH 7,5 gewaschen (Extruder von Lipex Biomembranes, Vancouver, Kanada) bei einem maximalen Druck von 50 bar. Die lipidische Suspension wird bei Raumtemperatur während 1 Stunde gehalten. 450 ul der lipidischen Suspension werden zu 50 ul einer Mutterlösung von plasmidischer DNA (1 mg/ml) gegeben, und durch 10 mal Aufsaugen/Austropfen mit einer Pipette gemischt. Die Komplexe Lipid/DNA werden bei 4ºC konserviert. Die Herstellungen werden in einer Haube mit laminarem Fluß hergestellt.

E. Verfahren zur Beurteilung der Komplexierung von DNA durch die Lipide

Ein 1%iges (m/v) Agarosegel wird in einem TAE -Puffer (TAE: Tris 4,8 g/l + Natriumacetat 0,68 g/l + EDTA 0,336 g/l pH 7,8) hergestellt. Falls notwendig, wird die Probe mit TAE verdünnt, und dann gibt man den Probepuffer zu (0,083% Bromphenolblau, 0,083% Cyanolxylol FF, 10% Glycerin in Wasser), so daß man 50 ng DNA/ul erhält. Die Probe wird kurz mit einem Vortex homogenisiert und 30 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen. Als Vergleich verwendet man das nicht komplexierte Plasmid, das in derselben Konzentration hergestellt wurde. 10 ul (500 ng DNA) werden auf das Gel gegeben und die Migration erfolgt bei 60 mV während 3 Stunden. Das Gel wird in TAE, enthaltend 0,006% (v/v) Ethidiumbromid 10 mg/ml während mindestens 30 Minuten entwickelt. Anschließend wird das Gel mit TAE gewaschen und unter UV analysiert.

F. Verfahren zur Messung der Größe der Partikel durch quasi elastische Lichtdiffusion

Die Analysen werden auf einem Coulter N4Plus (Coultronics France S. A., Margency, Frankreich) bei 25ºC nach Äquilibrierung der Probe während 20 Minuten durchgeführt. Ein Aliquot der Probe wird mehrere Male aufgesaugt und ausgetropft, bevor es pipettiert wird. Die Probe wird in der Meßküvette verdünnt und homogenisiert. Die Messung des bei 90º gebeugten Lichts wird während 180 Sekunden nach 180 Sekunden Wartezeit durchgeführt. Der verwendete Bereich reicht von 3 nm bis 10000 nm unter Verwendung von 31 Schritten (bins). Um zuverlässig zu sein, muß die Probe zwischen 50000 und 1000000 Zähler/Sekunde ergeben.

G. Physikochemische Eigenschaften

Die drei Methoden der Formulierung "Einspritzen von Ethanol", "Dialyse von Detergens" und "Beschallung/Extrusion" werden auf die erfindungsgemäßen kationischen Lipide mit oder ohne äquimolare Mengen DOPE bei Ladungsverhältnissen von ungefähr 10 oder 5 angewendet. Die Formulierungen werden als geeignet betrachtet, wenn die DNA vollständig komplexiert ist (keine Migration im Agarosegel), und wenn die Komplexe einen durch quasi elastische Lichtdiffusion bestimmten Durchmesser von weniger als 500 nm aufweisen. Die Tabelle faßt die Ergebnisse diese Analysen zusammen. Alle Komplexe DNA/Lipid, die in der Tabelle angegeben sind, komplexieren die DNA vollständig bei den analysierten Ladungsverhältnissen. Tabelle I
1: Verhältnis zwischen den positiven Ladungen des kationischen Lipids und den negativen Ladungen der DNA.
2: Bestimmt 24 bis 48 Stunden nach Herstellung (+/- stellt die Standardabweichung der Messung dar).
3: Bestimmt 8 Stunden nach der Herstellung
Diese Analysen zeigen, daß die Formulierungen die Erfordernisse erfüllen. Die Methode "Injektion von Ethanol" ergibt die besten Ergebnisse für zahlreiche Präparate, die eine Größe von weniger als 100 nm aufweisen. Die Methoden durch Detergens- Dialyse und Beschallung/Extrusion ermöglichen auch den Erhalt von Komplexen, die dem Gegenstand der vorliegenden Erfindung entsprechen.

H. Transfektion in vitro von Satellitenzellen

Kulturen von Zellen von Hundemuskeln und Humanmuskeln werden in einem Medium HamF 14 (Life Technologies) durchgeführt, das versetzt ist mit 10% fetalem Kälberserum (SVF, Hyclone, Logan, UT), 10 ug/ml Insulin (Sigma), 10 ng/ml EGF (Sigma) und FGF (Pepro Tech Inc. Rocky Hill, NJ), 2 mM Glutamin (bioMerieux), und 40 ug/ml Gentamycin (Schering Plough).
Die Zellen werden 24 bis 48 Stunden vor der Transfektion in einer Kulturschale mit 96 Vertiefungen mit ungefähr 5 · 10³ bis 10&sup4; Zellen pro Vertiefung bis ungefähr 30% Konfluenz angeimpft und bei 37ºC in einer Atmosphäre aus 5% CO&sub2; und 95% Luft gehalten.
Die Transfektionen werden mit Mischungen von variablen Mengen Lipiden und plasmidischer DNA durchgeführt, um die optimalen Ladungsverhältnisse und DNA- Konzentrationen pro Vertiefung zu bestimmen.
Die verwendeten Komplexe werden 24 bis 48 Stunden vor der Transfektion hergestellt und mit HamF 14 plus 40 ug/ml Gentamycin und Glutamin 2 mM verdünnt.
Nach Entfernung des Kulturmediums werden 100 ul der Transfektionsmischung mit oder ohne 10% FCS in jede der Vertiefungen übertragen, und die Plaques werden während 4 Stunden bei 37ºC inkubiert.
Alle Transfektionsmedien werden dann auf 10% SVF, 10 ug/ml Insulin (Sigma), 10 ng/ml EGF (Sigma) und FGF (Pepro Tech Inc. Rocky Hill, NJ), Glutamin 2 mM (bioMérieux), und 40 ug/ml Gentamycin (Schering Plough) zu einem Endvolumen von 250 ul eingestellt. Die Kulturen werden während 48 Stunden inkubiert, und dann werden die Zellen isoliert und hinsichtlich ihrer Fähigkeit zur Exprimierung des Gens der Luciferase getestet. Die Konzentrationen der Proteine werden durch das Testsystem der Proteinmenge (Promega) bestimmt.

I. Transfektion von A549-Zellen mit lipidischen Komplexen

Die A549-Zellen (Epithelzellen aus Human-Lungenkarzinom) werden in einem Eagle-Medium, modifiziert durch Dulbecco (DMEM), kultiviert, enthaltend 10% fetales Kälberserum (Gibco BRL), 24 Stunden vor Beginn der Transfektion in Platten mit 96 Vertiefungen (2 · 10&sup4; Zellen pro Vertiefung) in einer feuchten Atmosphäre bei 37ºC und 5% CO&sub2;/95% Luft. Für die Transfektion in Abwesenheit von Serum wird das Medium entnommen und durch Medium ohne Serum ersetzt. In einer anderen Mikroplatte werden die folgenden Suspensionen der Komplexe LipidJDNA hergestellt (Komplexe Lipid/DNA bei 0,1 mg/ml DNA und mit angegebenem Ladungsverhältnis): 44 ul (4,4 ug DNA), 22 ul (2,2 ug DNA), 5,5 ul (0,55 ug DNA) Vorratslösung in den ersten drei Vertiefungen, und 11 ul (0,11 ug DNA) der Vorratslösung, 10fach verdünnt, in der folgenden Vertiefung. Das Volumen wird mit DMEM auf 110 ul aufgefüllt, und 100 ul werden auf die Zellen A549 übertragen. Die Inkubation wird mit 4,2,0,5 und 0,1 ug DNA pro Vertiefung während 4 Stunden durchgeführt. Anschließend werden 50 ug DMEM + 30% fetales Kälberserum 4 Stunden nach Beginn der Transfektion zugefügt, anschließend 100 ul DMEM + 10% FCS 24 Stunden nach Beginn der Transfektion. Die Transfektionen in Gegenwart von 10% fetalem Kälberserum werden in identischer Weise durchgeführt, außer daß die Transfektion im Medium mit Serum abläuft.

J. Analyse der Transfektion

48 Stunden nach der Transfektion wird das Medium entfernt, und die Zellen werden mit 100 ul Phosphatlösung PBS gewaschen und mit 50 ul Lyse-Puffer (Promega) lysiert. Die Lysate werden bei -80ºC eingefroren bis zur Messung der Aktivität der exprimierten Luciferase. Diese findet mit 20 ul der Mischung während 1 Minute unter Verwendung des Bestimmungskits für "Luciferase" (Promega) (Luminometer LB96P Berthold) in Platten mit 96 Vertiefungen auf kinetische Weise statt.

K. Transfektion in vitro

Einige dieser Präparate wurden bei der Transfektion in vitro unter Verwendung der A549-Zellen und der primären Satelliten-Hund-Zellen beurteilt.
Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 11 angegebenen und zeigen die relativen Lichteinheiten (RLU) pro Vertiefung. Die angegebenen Werte werden mit 2 ug DNA pro Vertiefung erhalten. Alle Komplexe werden hergestellt unter Verwendung der Ethanol-Injektionsmethode. Die Gesamtkonzentration des Proteins pro Vertiefung wird durch die üblichen Techniken bestimmt (BCA-Test, Pierce). Als Hinweis enthält eine Vertiefung ungefähr 20 bis 30 ug pro Protein. Tabelle II
1: Verhältnis zwischen positiven Ladungen des kationischen Lipids und der negativen Ladung der DNA.
2: Freie DNA zwischen 0 und 270 Einheiten relatives Licht.
Die Expression der Luciferase (RLU/min), angegeben in mg Protein ergibt die folgenden Werte:
pcTG 35 R +/- 10 (A549), 3,4 · 10¹³ RLU/min/mg Protein
pcTG35 R +/- 5 (A549), 2,8 · 10¹&sup0; RLU/min/mg Protein
pcTG35/DOPEv R +/- 5 (A549 + Serum) 1,0 · 10¹&sup0; RLU/min/mg Protein
Die Verbindungen pcTG20 und pcTG35 sind zur effizienten Transfektion der beiden getesteten Zelltypen fähig, wenn sie mit plasmidischer DNA komplexiert sind. Man stellt fest, daß bestimmte Formulierungen höhere Resultate in Gegenwart von Serum ergeben und daß das Serum keinen inhibitorischen Effekt auf diesen Typ Präparat ausübt.
Auf dieselbe Weise ermöglichten die Transfektionsanalysen in vitro, die mit A549-Zellen durchgeführt wurden, den Nachweis, daß a) die Verbindung pcTG90, komplexiert mit einem Plasmid pcTGl 1033, eine effiziente Transfektion unter gleichen Bedingungen wie den vorstehend beschriebenen in Abwesenheit oder Gegenwart von DOPE, in Abwesenheit oder Gegenwart von Serum ermöglicht und b) daß DOPE durch ein anderes Adjuvans ersetzt werden kann, beispielsweise 1,2-Di-stearoyl-snglycerophosphoethanolamin (Avanti 850715), 1,2-Di-phytanoyl-sn-glycero-3- phosphoethanolamin (Avanti 850402), 1,2-Di-myristoyl-sn-glycero-3 - phosphoethanolamin (Avanti 850745), 1,2-Di-lauroyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin (Avanti 850702), 1,2-Di-palmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin (Avanti 850705), 1,2-Di-elaidoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin (Avanti 850725), 1,2-Di-palmitoleylsn-glycero-3-phosphoethanolamin (Avanti 850706) oder 1,2-Di-linoleoyl-sn-glycero-3- phosphoethanolamin (Avanti 850755).

L. Anale der Partikelgröße (nach dem in F beschriebenen Verfahren).

Die mit PCS durchgeführten Analysen zeigen, daß die Größe der Partikel und ihre Aggregation stark vom Ladungsverhältnis, der Struktur des Lipids wie von der Gegenwart oder Abwesenheit von DOPE abhängt.
Stabile Komplexe mit 100 bis 200 nm wurden auf reproduzierbare Weise mit einem Ladungsverhältnis von 10 erhalten, während das kationische Glycerolipid im Überschuß bezogen auf die DNA vorliegt (siehe Fig. 2). Die Ergebnisse zeigen, daß nur die Komplexe, die ein Glycerolipid C18 einschließen (pcTG19, pcTG36) ein Problem der Suspension zeigen, was große Komplexe liefert, deren Größe variabel ist. Im Gegensatz dazu ermöglichen die Lipide vom Typ Oleoyl, die 4 oder 5 Ladungen tragen (pcTG35, pcTG56), Komplexe mit ungefähr 200 nm bei einem Ladungsverhältnis von 5 zu erhalten. Übrigens haben wir gezeigt, daß eine äquimolare Menge DOPE leicht die Partikelgröße erhöht und die Tendenz erniedrigt, daß sich die Komplexe bei einem schwachen Ladungsverhältnis aggregieren (siehe Fig. 2A und 2B). DOPE ermöglicht darüber hinaus die Erzielung eines stabilisierenden Effekts für die Komplexe, die Glycerolipide C- 14 oder C-16 mit drei Amingruppen einschließen (Fig. 2A); dieser Effekt wird nicht für die homologen Verbindungen beobachtet, die vier Aminfunktionen tragen (Fig. 2B). Die Tendenz der Komplexe zur Aggregation steigt beträchtlich bei einem Ladungsverhältnis von 5, was suggeriert, daß die Abstoßungen der Ladungen ein bestimmender Faktor zur Vermeidung des Aggregationsphänomens sind. Der Vergleich der Komplexe mit Glycerolipiden, die Fettsäuren mit zunehmender Länge aufweisen, zeigen geringe Unterschiede zwischen den Derivaten C-14, C-16 und Oleoyl bei einem Ladungsverhältnis von 10, insbesondere im Fall der Glycerolipide, die 4 Amingruppen einschließen. Die Anzahl der Amingruppen am polaren Kopf der Glycerolipide, die Oleoyl enthalten, zeigt einen leichten Effekt auf die Größe der Komplexe (Fig. 2C).
Im übrigen kann man feststellen, daß die durch diese Technik zur Größenmessung der Komplexe beobachteten Ergebnisse durch Elektronenmikroskopie bestätigt wurden.

M. Intravenöse Injektion der erfindungsgemäßen Komplexe.

Die Ergebnisse sind in Fig. 3 zusammengefaßt. Erfindungsgemäße Komplexe wurden nach den vorstehend beschriebenen Methoden hergestellt, ausgehend von den Glycerolipiden pcTG35, pcTG56 und pcTG90 in Gegenwart einer äquimolaren Menge DOPE bei einem fixen Ladungsverhältnis von 5 unter Verwendung eines Plasmids pTG11033, das das Gen der Luciferase enthält (französische Patentanmeldung 97/08267).
Die verwendeten Mäuse sind weibliche Mäuse C57BL/6 von 9 bis 11 Wochen. Die intravenösen Injektionen werden nach Desinfektion der Haut mit 70% Ethanol in den Schwanz durchgeführt. Das injizierte Volumen ist 200 ul und die DNA-Konzentration ist 0,24 mg/ml (Lipidkonzentration: 10 mg/ml).
Zwei Tage nach den Injektionen werden die Mäuse getötet. Nach Extraktion werden die Gewebe in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80ºC aufbewahrt. Zur Messung der Luciferase-Aktivität werden die Gewebe mechanisch mit Hilfe eines Mörsers auf Trockeneis zerstampft. 500 ul oder 200 ul Lyse-Puffer (Promega) werden zu den aus den Lungen oder der Luftröhre jeweils erhaltenen Geweben gegeben und drei Schritten Einfrieren/Auftauen unterzogen. Die Zelltrümmer werden durch Zentrifugation entfernt und die Luciferase-Aktivität (in RLU/min. Einheit des relativen Lichts pro Minute) wird in 20 ul überstehende Flüssigkeit entsprechend den Anweisungen des Herstellers (Promega) durch Zugabe von 100 ul Reagens durch Messung der Aktivität durch Lumineszenz gemessen. Die gemessene Luciferase-Aktivität wird bezogen auf die Proteinmenge mit Hilfe einer Eichskala standardisiert, die ausgehend von im Handel erhältlicher Luciferase erhalten wurde (Promega). Die Gesamt-Proteinmenge wird übrigens bestimmt durch die kolorimetrische Methode Bicinchoninsäure BCA (Smith et al. 1985, Anal. Biochem., 150, 76 bis 85 Pierce), ausgehend von einem Aliquot überstehender Flüssigkeit. Dies ermöglicht es, die Luciferase-Aktivität in RLU pro Milligramm aus den Geweben extrahiertes Protein auszudrücken.
Die Ergebnisse zeigen, daß die Expression des Luciferase-tragenden Gens in den Lungen nach intravenöser Injektion der Komplexe, die eines der zuvor angegebenen Glycerolipide aufweisen, in Gegenwart von DOPE bezogen auf die Injektion von DNA allein um einen Faktor von ungefähr 5 bis 30 mal verbessert ist. Die angegebenen Werte sind Mittelwerte, die aus Genen von 2 bis 6 injizierten Mäusen erhalten wurden.

N - Synthese der fluorierten Glycerolipide pcTG69 bis pcTG72.

1. Synthese der Triester (siehe Fig. 4)

Triester 6 : 232 mg (1,12 mmol) Dicyclohexylcarbodiimid in 1 ml Dichlormethan werden zu einer Lösung von Dihydroxyester 5 (270 mg, 0,37 mmol), fluorierter Säure 1 (454 mg, 1,12 mmol) und 4-(Dimethylamino)pyridin (5 mg, 0,038 mmol) in 4 ml Dichlormethan gegeben. Die Reaktion wird unter Rühren während 16 Stunden bei Raumtemperatur durchgeführt. Der Dicyclohexylharnstoff Niederschlag wird durch Filtration entfernt, und das Filtrat wird im Vakuum konzentriert und einer Chromatographie auf einer Kieselgelsäule unterzogen (Eluens: Ether: Hexan, 4 : 6, v/v), um den Triester 6 (275 mg, 48%) in Form einer viskosen Flüssigkeit zu erhalten.
¹H-NMR (200 MHz, CDCl&sub3;): δ 5,25 (m, 1H, > CH-OC(O)-), 4,40 - 4,08 (m, 4H, -CH&sub2;-OC(O)-), 3,95 und 3,89 (2 m, 2H, -N(BOC)-CH&sub2;-CO&sub2;-), 3,35 - 3,00 (m, 12H,- CH&sub2;-N(BOC)-), 2,31 (t, J = 7,5 Hz, 4H, -CH&sub2;-CO&sub2;-), 2,20 -1,88 (m, 4H, -CH&sub2;-CF&sub2;-), 1,82-1,50 (m, 10H, -CH&sub2;-), 1,45, 1,44, 1,43 und 1,41 (4 s, 36H, t-Bu-), 1,29 (br s, 28H,- CH&sub2;-), ¹&sup9;F NMR (376 MHz, CDCl&sub3;): d -81,6, -115,1, -125,0, -126,5.
Triester 7: Nach einem identischen Verfahren wie für Triester 6 beschrieben, wird der Triester 7 (220 mg, 49%) ausgehend vom Dihydroxyester 5 (170 mg, 0,236 mmol) und der fluorierten Säure 2 (426 mg, 0,707 mmol) erhalten.
¹H-NMR (200 MHz, CDCl&sub3;): δ 6,40 (dtt, J = 15,6, 6,9, 2,2 Hz, 2H, =CH-CF&sub2;-), 5,59 (dt, J = 15,6, 12,3 Hz, 2H, =CH-CH&sub2;-), 5,25 (m, 1H, > CH-OC(O)-), 4,40 - 4,05 (m, 4H, -CH&sub2;-OC(O)-), 3,96 und 3,89 (2 m, 2H, -N(BOC)-CH&sub2;-CO&sub2;-), 3,35 - 3,00 (m, 12 H, -CH&sub2;-N(BOC)-), 2,31 (t, J = 7,2 Hz, 4H, -CH&sub2;-CO&sub2;-), 2,20 (m, 4H, allylisches H), 1,80- 1,50 (m, 10H, -CH&sub2;-); 1,45, 1,44, 1,43 und 1,41 (4 s, 36H, t-Bu-), 1,30 (br s, 20H, -CH&sub2;-). ¹&sup9;F NMR (376 MHz, CDCl&sub3;): d-81,3, -111,6, -121,9, -122,4, -123,2, -123,9,- 126,6.
Triester 8: Nach einem gleichen Verfahren wie dem für Triester 6 beschriebenen, wird der Triester 8 (230 mg, 47%) ausgehend vom Dihydroxyester 5 (210 mg, 0,291 mmol) und der fluorierten Säure 3 (441 mg, 0,874 mmol) erhalten.
¹H-NMR (200 MHz, CDCl&sub3;): δ 5,25 (m, 1H, > CH-OC(O)-), 4,40-4,10 (m, 4H,- CH&sub2;-OC(O)-), 3,95 und 3,89 (2 m, 2H, -N(BOC)-CH&sub2;-CO&sub2;-), 3,35-3,00 (m, 12H, -CH&sub2;- N(BOC)-), 2,31 (t, J = 7,5 Hz, 4H, -CH&sub2;-CO&sub2;-), 2,20- 1,90 (m, 4H, -CH&sub2;-CF&sub2;-), 1,82- 1,50 (m, 10H, -CH&sub2;-), 1,45, 1,44, 1,43 und 1,41 (4 s, 36H, t-Bu-), 1,29 (br s, 28H, -CH&sub2;-). ¹&sup9;F NMR (376 MHz, CDCl&sub3;): d -81,3, -114,9, -122,4, -123,2, -124,0, -126,6.
Triester 9: Nach einem gleichen Verfahren wie dem für den Triester 6 beschriebenen, wird der Triester 9 (165 mg, 49%) ausgehend vom Dihydroxyester 5 (160 mg, 0,222 mmol) und der fluorierten Säure 4 (280 mg, 0,666 mmol) erhalten.
¹H-NMR (200 MHz, CDCl&sub3;): δ 5,25 (m, 1H, > CH-OC(O)-), 4,45-4,08 (m, 4H,- CH&sub2;-OC(O)-), 3,95 und 3,89 (2 m, 2H, -N(BOC)-CH&sub2;-CO&sub2;-), 3,35-3,00 (m, 12H, -CH&sub2;- N(BOC)-), 2,37 (m, 4H, -CH&sub2;-CO&sub2;-), 2,26 -1,95 (m, 4H, -CH&sub2;-CF&sub2;-), 1,85 - 1,55 (m, 14H, -CH&sub2;-), 1,45, 1,44, 1,43 und 1,41 (4 s, 36H, t-Bu-), ¹&sup9;F NMR (376 MHz, CDCl&sub3;): d -81,3, -114,9, -122,4, -123,4, -124,1, -126,7.

2. Synthese von pcTG69

Der Triester 6 (120 mg, 0,079 mmol) in 1 ml Dichlormethan wird 3 Stunden mit 16 ml einer Lösung von Trifluoressigsäure und Dichlormethan (1 : 1, v/v) bei 0ºC behandelt. 100 ml Hexan werden zugegeben und die Mischung wird im Vakuum verdampft, um einen Film zu erhalten, der mit destilliertem Ether aufgenommen wird. Nach Filtration erhält man ein weißes Pulver, das mit Ether gewaschen und im Vakuum getrocknet wird und die Verbindung pcTG69 ergibt (115 mg, 94%). Smp.: = 205ºC

3. Synthese von pcTG70

Das Glycerolipid pcTG70 (185 mg, 86%) wird in Form eines weißen Pulvers ausgehend vom Triester 7 (210 mg, 0,111 mmol) nach einem identischen Verfahren wie dem für pcTG69 beschriebenen erhalten. Smp.: = 210ºC.

4. Synthese von pcTG71

Das Glycerolipid pcTG71 (141 mg, 90%) wird in Form eines weißen Pulvers ausgehend vom Triester 8 (150 mg, 0,089 mmol) nach einem identischen Verfahren wie dem für pcTG69 beschriebenen erhalten. Smp.: = 220ºC.

5. Synthese von pcTG72

Das Glycerolipid pcTG72 (87 mg, 92%) wird in Form eines weißen Pulvers ausgehend vom Triester 9 (90 mg, 0,06 mmol) nach einem identischen Verfahren wie dem für pcTG69 beschriebenen erhalten. Smp.: = 220ºC.
Die fluorierten Verbindungen entsprechen dem Aufbau von pcTG35 (4 Amingruppen) mit einer Kohlenstoffkette variabler Größe (C11, C15, C17 oder C19 ungesättigt). Sie wurden nach der Ethanol-Injektionsmethode hergestellt.

O. Transfektion in vitro von Komplexen, die die fluorierten Verbindungen tragen.

Die Effizienz der Komplexe, die nach der vorstehend beschriebenen Methode mit den fluorierten Verbindungen gebildet wurden (siehe Beispiel N) wurde mit einer Kultur von A549-Zellen nach der in Beispiel I beschriebenen Technik untersucht. Die getesteten Ladungsverhältnisse werden ausgewählt aus den Verhältnissen 10, 5, 2,5, 1,25 und 0,8 (siehe Fig. 5A bis G). Die Versuche wurden auch in Abwesenheit oder in Gegenwart (in den Figuren durch ser. bezeichnet) von Serum oder DOPE und mit verschiedenen Mengen DNA durchgeführt (0,1, 0,5, 2 oder 4 ug). Die Ergebnisse (Fig. 5A bis G) zeigen, daß:
- pcTG69 (Fig. 5C) es ermöglicht, daß unter den getesteten Bedingungen Expressionsmengen von Luciferase beobachtet werden, die vergleichbar sind mit denen, die mit den analogen nicht fluorierten Verbindungen C14 oder C16 erhalten wurden. Übrigens haben andere Ergebnisse, die nicht in Fig. 5 gezeigt sind, gezeigt, daß die besseren Resultate mit pcTG69 mit einem Ladungsverhältnis von 2,5 in Gegenwart oder Abwesenheit von DOPE oder Serum erhalten wurden,
- pcTG72 (Fig. 5A und B) es ermöglicht, zufriedenstellende Transfektionsmengen bei einem Ladungsverhältnis von 10 in Gegenwart oder Abwesenheit von DOPE oder von Serum zu erhalten; im Gegensatz dazu stellt man bei einem Ladungsverhältnis von 1,25 oder 0,8 fest, daß die Gegenwart von DOPE ein Faktor ist, der die Verbesserung der Transfektionsmenge ermöglicht, insbesondere in Gegenwart von DNA-Mengen von mehr als 0,1 ug,
- pcTG71 (Fig. 5D und E) es nicht ermöglicht, zufriedenstellende Transfektionsmengen in Gegenwart von DOPE für die Ladungsverhältnisse von 1,25, 0,8 oder 10 zu erhalten, insbesondere für die DNA-Mengen von mehr als 0,5 ug. Unter den getesteten Bedingungen scheinen die Transfektionen in Gegenwart von DOPE nicht durch die Gegenwart von Serum im Medium beeinträchtigt zu werden.
- pcTG70 (Fig. 5F und G): für die Ladungsverhältnisse von 10 oder 5 sind die beobachteten Transfektionsmengen wirksam, in Gegenwart oder in Abwesenheit von DOPE oder Serum. Im Gegensatz dazu ist für die schwächeren Ladungsverhältnisse (1,25 oder 0,8) die Gegenwart von DOPE erforderlich.

Claims

1. Verbindung der Formel I:

wobei:

R&sub1;, R&sub2;, gleich oder verschieden, lineare oder verzweigte (C&sub6;-C&sub2;&sub3;)Alkyl- oder Alkenylreste oder lineare oder verzweigte -C(=O)-(C&sub6;-C&sub2;&sub3;)Alkyl- oder -C(=O)-(C&sub6;- C&sub2;&sub3;)Alkenylreste sind,

X ein Sauerstoffatom oder ein Aminorest -NR&sub3; ist, wobei R&sub3; ein Wasserstoffatom oder ein Alkylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen ist,

n eine ganze positive Zahl von 1 bis 6 ist,

m eine ganze positive Zahl von 1 bis 6 ist, und wenn n größer 1, m gleich oder verschieden sein kann.

2. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch charakterisiert, daß R&sub1;, R&sub2;, gleich oder verschieden, lineare -C(=O)Alkylreste oder lineare -C(=O)Alkenylreste sind.

3. Verbindung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch charakterisiert, daß R&sub1;, R&sub2;, gleich oder verschieden, -C(=O)-Alkyl- oder -C(=O)-Alkenylreste sind, die 12 bis 20 Kohlenstoffatome umfassen.

4. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch charakterisiert, daß n eine ganze Zahl ist, die aus den Zahlen 2, 3 oder 4 ausgewählt wird.

5. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch charakterisiert, daß m eine ganze Zahl ist, die aus den Zahlen 2, 3 oder 4 ausgewählt wird.

6. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch charakterisiert, daß sie darüber hinaus an ein oder mehrere Zielelemente durch Zwischenschalten von mindestens a) eines der Kohlenstoffatome, insbesondere ausgewählt aus denen, die in den Gruppen R&sub1;, R&sub2; und/oder R&sub3; vorhanden sind, oder b) eines der sekundären oder primären Stickstoffatome der Polyaminkette gebunden sind.

7. Verbindung nach Anspruch 6, dadurch charakterisiert, daß das Zielelement ausgewählt wird aus der Gruppe, die aus ganzen oder Teilen von Zuckern, Peptiden, Oligonukleotiden, Lipiden, Hormonen, Vitaminen, Antigenen, Antikörpern, spezifischen Liganden von Membran-Rezeptoren, zur Reaktion mit einem Anti-Liganden fähigen Liganden, Fusionspeptiden, Peptiden mit Kernlokalisation oder einer Kombination dieser Verbindungen besteht.

8. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch charakterisiert, daß sie in kationischer Form vorliegt.

9. Verbindung nach Anspruch 8 in kationischer Form, dadurch charakterisiert, daß eines oder mehrere Amine mit einem (mehreren) Methyl- oder Ethylrest(en) substituiert sind.

10. Verbindung nach den Ansprüchen 8 oder 9, dadurch charakterisiert, daß sie 2 bis 7, genauer 3 bis 5 und bevorzugt 5 positive Ladungen trägt.

11. Verbindung nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch charakterisiert, daß sie ausgewählt wird aus der durch die Verbindungen der folgenden Formel gebildeten Gruppe:

n = 2 pcTG18 oder n = 3 pcTG33

n = 2 pcTG21 oder n = 3 pcTG34

n = 2 pcTG19 oder n = 3 pcTG36

n = 2 pTG20 oder n = 3 pcTG35

n = 4 pcTG56

C18:1,[cis]-9

n = 2 pcTG22 oder n 4 pcTG90

12. Zusammensetzung, dadurch charakterisiert, daß sie mindestens eine Verbindung nach einem der vorstehenden Ansprüche und gegebenenfalls mindestens einen Hilfsstoff umfaßt, der insbesondere zur Verbesserung der Komplexbildung zwischen einer dieser Verbindungen und einer aktiven Substanz fähig ist.

13. Zusammensetzung nach Anspruch 12, dadurch charakterisiert, daß der Hilfsstoff ein neutrales oder zwitterionisches Lipid ist.

14. Zusammensetzung nach Anspruch 13, dadurch charakterisiert, daß das neutrale oder zwitterionische Lipid ein Triglycerid, ein Diglycerid, Cholesterin, ein Phosphatidylethanolamin (PE), Phosphatidylcholin, Phosphocholin, Sphingomyelin, Ceramid oder Cerebrosid ist oder davon abgeleitet ist.

15. Verbindung nach Anspruch 14, dadurch charakterisiert, daß das neutrale oder zwitterionische Lipid Dioleylphosphatidylethanolamin (DOPE) ist.

16. Verbindung nach den Ansprüchen 12 bis 15, dadurch charakterisiert, daß das Gewichtsverhältnis Verbindung/Hilfsstoff zwischen 0,1 und 10 liegt.

17. Komplex, umfassend mindestens eine Verbindung nach einem der Ansprüche 8 bis 11 oder mindestens eine Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 12 bis 16 und mindestens eine, insbesondere therapeutisch, aktive Substanz, die mindestens eine negative Ladung trägt.

18. Komplex nach Anspruch 17, dadurch charakterisiert, daß die aktive Substanz ausgewählt wird aus Nukleinsäuren und Proteinen.

19. Komplex nach Anspruch 18, dadurch charakterisiert, daß die therapeutisch wirksame Substanz eine Nukleinsäure ist, die ausgewählt wird aus der aus cDNA, genomischer DNA, plasmidischer DNA, Antisense-Polynukleotiden, Messenger-RNA, ribosomischer RNA, Ribozymen, Transfer-RNA oder für solche RNAs codierender DNA bestehenden Gruppe.

20. Komplex nach Anspruch 19, dadurch charakterisiert, daß die Nukleinsäure ein interessierendes Gen und Elemente umfaßt, die die Expression dieses interessierenden Gens ermöglichen.

21. Komplex nach einem der Ansprüche 17 bis 20, dadurch charakterisiert, daß er eine Größe von weniger als 500 nm, vorteilhafterweise weniger als 200 nm aufweist.

22. Komplex nach einem der Ansprüche 17 bis 21, dadurch charakterisiert, daß er eine Größe von weniger als 100 nm aufweist.

23. Komplex nach einem der Ansprüche 17 bis 22, dadurch charakterisiert, daß das Verhältnis zwischen der Anzahl der positiven Ladungen des oder der kationischen Verbindungen und/oder Zusammensetzungen und der Zahl der negativen Ladungen der aktiven Substanz zwischen 0,05 bis 20, genauer zwischen 0,1 bis 15 und bevorzugt von 5 bis 10 variiert.

24. Verfahren zur Herstellung eines Komplexes nach den Ansprüchen 17 bis 23, dadurch charakterisiert, daß man eine oder mehrere Verbindungen nach einem der Ansprüche 8 bis 11 und/oder mindestens eine Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 12 bis 16 in Gegenwart einer oder mehrerer aktiver Substanzen bringt, die mindestens eine negative Ladung umfassen, und daß man den Komplex isoliert, gegebenenfalls nach einem Reinigungsschritt.

25. Verfahren zur Herstellung nach Anspruch 24, dadurch charakterisiert, daß die Verbindungen und/oder Zusammensetzungen zunächst in einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel gelöst werden, insbesondere Ethanol oder Dimethylsulfoxid oder einer Mischung dieser beiden.

26. Herstellungsverfahren nach Anspruch 24, dadurch charakterisiert, daß die Verbindungen und/oder Zusammensetzungen zunächst in einer Detergens-Lösung suspendiert werden.

27. Herstellungsverfahren nach Anspruch 26, dadurch charakterisiert, daß man darüber hinaus einen Reinigungsschritt dieses Komplexes durch Dialyse durchführt.

28. Herstellungsverfahren nach Anspruch 24, dadurch charakterisiert, daß die Verbindungen und/oder Zusammensetzungen zunächst einem Beschallungs/Extrusionsschritt unterworfen werden.

29. Komplex, dadurch charakterisiert, daß er durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 25 bis 28 erhalten werden kann.

30. Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 11, einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 12 bis 16, eines Komplexes nach einem der Ansprüche 17 bis 23 zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Überführung von mindestens einer, insbesondere therapeutisch, aktiven Substanz, insbesondere einer Nukleinsäure, in Zielzellen in vitro, ex vivo oder in vivo, insbesondere in vivo.

31. Verwendung nach Anspruch 30, dadurch charakterisiert, daß die Zielzelle eine Säugerzelle ist.

32. Verwendung nach Anspruch 31, dadurch charakterisiert, daß die Zielzelle ausgewählt wird aus einer Muskelzelle, einer blutbildenden Zelle, einer Zelle der Atemwege, insbesondere einer Tracheal- oder Pulmonarzelle.

33. Verfahren zur Überführung in vitro einer therapeutisch aktiven Substanz in eine Zielzelle, dadurch charakterisiert, daß man diese Zelle mit einem Komplex nach einem der Ansprüche 17 bis 23 in Kontakt bringt.

34. Komplex nach einem der Ansprüche 17 bis 23 oder 29 als Medikament mit kurativem, präventivem oder Impfziel.

35. Komplex nach Anspruch 34 zur Durchführung einer Methode zur therapeutischen Behandlung, die aus der Übertragung von mindestens einer therapeutisch wirksamen Substanz, insbesondere einer Nukleinsäure, in Zielzellen besteht.

36. Komplex nach Anspruch 35, dadurch charakterisiert, daß die Zielzelle eine Säugerzelle ist.

37. Komplex nach Anspruch 36, dadurch charakterisiert, daß die Zielzelle ausgewählt wird aus einer Muskelzelle, einer blutbildenden Zelle, einer Zelle der Atemwege, insbesondere einer Tracheal- oder Pulmonarzelle, einer Zelle des Atemwegsepithels.

38. Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 11, einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 12 bis 16, eines Komplexes nach einem der Ansprüche 17 bis 23 zur Herstellung eines Medikaments mit kurativem, präventivem oder Impfziel, das bestimmt ist zur Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers, insbesondere durch Gentherapie.

39. Verwendung nach Anspruch 38, dadurch charakterisiert, daß das Medikament bestimmt ist zur Verabreichung durch intramuskuläre Injektion, durch Inhalation, durch intratracheale Injektion, durch Einträufeln, durch Aerosolisierung, auf topischem Weg oder auf oralem Weg.

40. Pharmazeutisches Präparat, dadurch charakterisiert, daß es mindestens einen Komplex nach einem der Ansprüche 17 bis 23 oder 29 umfaßt.

41. Präparat nach Anspruch 40, dadurch charakterisiert, daß es darüber hinaus mindestens einen Hilfsstoff umfaßt, der die Transfektionskraft dieses Komplexes verbessern kann.

42. Präparat nach Anspruch 41, dadurch charakterisiert, daß der Hilfsstoff ausgewählt wird aus der Gruppe, die besteht aus Chloroquin, einer polaren protischen Verbindung, insbesondere ausgewählt aus Propylenglykol, Polyethylenglykol, Glycerin, Ethanol, 1- Methyl-L-2-pyrrolidon oder deren Derivaten, oder einer polaren aprotischen Verbindung, insbesondere ausgewählt aus Dimethylsulfoxid (DMSO), Diethylsulfoxid, Di-n- propylsolfoxid, Dimethylsulfon, Sulfolan, Dimethylformamid, Dimethylacetamid, Tetramethylharnstoff, Acetonitril oder deren Derivaten.

43. Präparat nach einem der Ansprüche 40 bis 42, dadurch charakterisiert, daß es darüber hinaus einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfaßt, der seine Verabreichung an Menschen oder Tiere ermöglicht.

44. Mit einem Komplex nach einem der Ansprüche 17 bis 23 oder 29 und 35 transfizierte Zelle.

45. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 11, Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 12 bis 16, Komplex nach einem der Ansprüche 17 bis 23 oder 29, dadurch charakterisiert, daß R&sub1; und/oder R&sub2; fluoriert ist.

46. Verbindung, Zusammensetzung oder Komplex nach Anspruch 45, dadurch charakterisiert, daß die Anzahl der fluorierten Kohlenstoffatome in R&sub1; und/oder R&sub2; von 1 bis 12, insbesondere von 4 bis 8 variieren kann.

47. Verbindung, Zusammensetzung oder Komplex nach Anspruch 45, dadurch charakterisiert, daß R&sub1; und/oder R&sub2; Alkylreste mit 15 Kohlenstoffatomen sind und daß die Anzahl der fluorierten Kohlenstoffatome in den Ketten R&sub1; und/oder R&sub2; 4 beträgt.