CN114213295B - 一种阳离子化合物、制备方法及其复合物和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种阳离子化合物、制备方法及其复合物和用途，属于生物医药技术领域，上述阳离子化合物的用途包括如下1）‑4）中的至少一种，1）包封治疗或预防剂；2）治疗或预防剂体外细胞转染；3）制备治疗或预防剂体内递送试剂；4）制备转染试剂盒。上述的复合物包括治疗或预防剂和用于递送治疗剂或预防剂的载体，载体为上述的阳离子化合物。本发明提供的复合物具有较高的转染效率、良好的递送效率和较低的毒性，可应用于治疗剂或预防剂的体内和体外递送，特别是核酸药物，解决了核酸药物递送困难的问题，促进核酸药物的发展。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种阳离子化合物、制备方法及其复合物和用途。
背景技术
核酸药物作为一大类新兴的药物领域，具有设计快、应用广、安全性高等特点，是未来药物发展的主要方向之一。然而，由于核酸药物自身的细胞穿透性差并且容易降解，导致核酸药物的体内应用面临巨大的挑战。因此，需要开发特定的化合物及递送系统来改善这一现状，以促进核酸药物可以作为疾病预防和治疗的重要手段。目前，可电离的阳离子脂质制备的脂质体是递送核酸药物比较安全和有效的手段，但是已上市的可用的可电离脂质还很少，还需要大量设计和筛选。
对现有文献及专利检索发现，申请公布号为CN 112979483 A的中国发明专利申请公开了一种阳离子脂质化合物、包含其的组合物及应用，提出通式
所示的阳离子脂质化合物，或其药物可用的盐，上述的阳离子脂质化合物可用于递送DNA、RNA或小分子药物，丰富了阳离子脂质化合物种类，对核酸预防剂及治疗剂的发展和应用具有重要的意义。申请公布号为CN 113185421 A的中国发明专利申请公开了一种脂质化合物及其组合物，提出通式
所示的脂质化合物，这类脂质化合物的递送效果好于脂肪链结构的可离子化脂质。当与其它脂质成分形成脂质纳米颗粒后，能够有效地递送mRNA或药物分子到细胞内发挥生物功能。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有较高的转染效率、良好的递送效率和优异的生物安全性的复合物，可用于制备药物组合物或疫苗组合物。
本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：
一种阳离子化合物，其结构式如式1或式2或式3所示，
本发明阳离子化合物可制备用于药物的递送的脂质纳米粒，由本发明阳离子化合物组成的脂质纳米粒递送系统可应用于药物的体内和体外递送，该脂质纳米粒递送系统具有较高的转染效率、良好的递送效率和较低的毒性，可以作为药物特别是核酸药物的递送新方法，解决了核酸药物递送困难的问题，促进核酸药物的发展。
本发明还提供了一种制备上述的阳离子化合物的方法，包括如下步骤：
1）在1,4-二氮杂二环[2.2.2]辛烷作用下，经叔丁氧羰基修饰的丙烯基化合物与1-十八醇或(9Z,12Z)-十八烷-9,12-二烯-1-醇发生反应，即得化合物A；
2）在DCM/MeOH溶液中，化合物A与3-(二甲基氨基)-1-丙硫醇发生反应，即得阳离子化合物。
可选的，叔丁氧羰基修饰的丙烯基化合物如式1-2或式3-1所示，
可选的，步骤1）中，叔丁氧羰基修饰的丙烯基化合物、1-十八醇和DABCO的摩尔比为1:1.5-2.5:0.05-0.2。
可选的，步骤1）中，叔丁氧羰基修饰的丙烯基化合物、(9Z,12Z)-十八烷-9,12-二烯-1-醇和DABCO的摩尔比为1:1.5-2.5:0.05-0.2。
可选的，步骤1）中，反应在DCE中进行，叔丁氧羰基修饰的丙烯基化合物和DCE的用量比为1 mmol: 10-30 mL。
可选的，步骤1）中，反应温度为40-80℃，反应时间为6-24小时。
可选的，步骤2）中，DCM/MeOH溶液中DCM和MeOH体积比为2-10:1。
可选的，步骤2）中，化合物A与3-(二甲基氨基)-1-丙硫醇的摩尔比为1:2-8。
可选的，步骤2）中，反应温度为30-80℃，反应时间为6-24小时。
可选的，式1所示阳离子化合物的合成路线为：
可选的，式2所示阳离子化合物的合成路线为：
可选的，式3所示阳离子化合物的合成路线为：
本发明还提供了一种阳离子脂质体，为如下1）-2）中的至少一种，
1）由上述的阳离子化合物制成；
2）由上述的阳离子化合物和辅脂制成；
上述的辅脂包括磷脂和/或结构性脂质和/或聚乙醇化脂质。
可选的，磷脂选自1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-磷酸胆碱、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-双十一烷酰基-sn-甘油-磷酸胆碱、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二-O-十八碳烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1-油酰基-2-胆固醇基半琥珀酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-双二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-双二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-rac-(1-甘油)钠盐、二棕榈酰基磷脂酰甘油、棕榈酰基油酰基磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰基-磷脂酰-乙醇胺、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰基磷酸乙醇胺、1-硬脂酰基-2-油酰基-硬脂酰乙醇胺、1-硬脂酰基-2-油酰基-磷脂酰胆碱、鞘磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸、棕榈酰基油酰基磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺中的任意至少一种。优选的，磷脂为1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)。
可选的，结构性脂质选自胆固醇、β-谷甾醇、粪固醇、谷固醇、麦角固醇、菜油固醇、豆固醇、菜籽固醇、番茄碱、番茄素、熊果酸、α-生育酚中的任意至少一种。优选的，结构性脂质为胆固醇。
可选的，PEG脂选自PEG改性的磷脂酰乙醇胺、PEG改性的磷脂酸、PEG改性的神经酰胺、PEG改性的二烷基胺、PEG改性的二酰基甘油、PEG改性的二烷基甘油中的任意至少一种。优选的，PEG脂质为DMG-PEG 2000。
本发明还提供了一种上述的阳离子化合物或上述的阳离子脂质体的用途，包括如下1）-4）中的至少一种，
1）包封治疗或预防剂；
2）治疗或预防剂体外细胞转染；
3）制备治疗或预防剂体内递送试剂；
4）制备转染试剂盒。
可选的，治疗或预防剂选自核酸药物、小分子药物、蛋白质药物、药物活性分子中的任意至少一种。
可选的，核酸药物选自DNA药物、RNA药物中的任意至少一种。
可选的，RNA药物选自mRNA、siRNA、aiRNA、miRNA、dsRNA、aRNA、lncRNA中的任意至少一种。
可选的，蛋白质药物选自抗体、酶、重组蛋白、多肽和短肽中的任意至少一种。
本发明还提供了一种的复合物，包括，
-治疗或预防剂；
-用于递送治疗剂或预防剂的载体，载体为上述的阳离子化合物。
本发明提供的复合物具有较高的转染效率、良好的递送效率和优异的生物安全性，可应用于治疗剂或预防剂的体内和体外递送，特别是核酸药物，解决了核酸药物递送困难的问题，促进核酸药物的发展。
可选的，治疗或预防剂选自核酸药物、小分子药物、蛋白质药物、药物活性分子中的任意至少一种。
可选的，核酸药物选自DNA药物、RNA药物中的任意至少一种。
可选的，RNA药物选自mRNA、siRNA、aiRNA、miRNA、dsRNA、aRNA、lncRNA中的任意至少一种。
可选的，蛋白质药物选自抗体、酶、重组蛋白、多肽和短肽中的任意至少一种。
可选的，复合物还包括磷脂和/或结构性脂质和/或聚乙醇化脂质。
可选的，磷脂选自1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-磷酸胆碱、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-双十一烷酰基-sn-甘油-磷酸胆碱、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二-O-十八碳烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1-油酰基-2-胆固醇基半琥珀酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-双二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-双二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-rac-(1-甘油)钠盐、二棕榈酰基磷脂酰甘油、棕榈酰基油酰基磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰基-磷脂酰-乙醇胺、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰基磷酸乙醇胺、1-硬脂酰基-2-油酰基-硬脂酰乙醇胺、1-硬脂酰基-2-油酰基-磷脂酰胆碱、鞘磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸、棕榈酰基油酰基磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺中的任意至少一种。优选的，磷脂为1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)。
可选的，结构性脂质选自胆固醇、β-谷甾醇、粪固醇、谷固醇、麦角固醇、菜油固醇、豆固醇、菜籽固醇、番茄碱、番茄素、熊果酸、α-生育酚中的任意至少一种。优选的，结构性脂质为胆固醇。
可选的，PEG脂选自PEG改性的磷脂酰乙醇胺、PEG改性的磷脂酸、PEG改性的神经酰胺、PEG改性的二烷基胺、PEG改性的二酰基甘油、PEG改性的二烷基甘油中的任意至少一种。优选的，PEG脂质为DMG-PEG 2000。
可选的，载体、磷脂、结构性脂质和聚乙醇化脂质的摩尔比为10-100:0-50:0-50:0-50。优选的，载体、磷脂、结构性脂质和聚乙醇化脂质的摩尔比为30-80:2-20:30-50:0.5-5。更优选的，载体、磷脂、结构性脂质和聚乙醇化脂质的摩尔比为40-60:5-15:35-45:0.5-2。更进一步优选的，载体、磷脂、结构性脂质和聚乙醇化脂质的摩尔比为50:10:38.5:1.5。
可选的，复合物为脂质纳米粒。优选的，脂质纳米粒的粒径为30-300nm，Zeta电位为-30至30 mV，更优选的，脂质纳米粒的粒径为90-150nm，脂质纳米粒的Zeta电位为-10至30 mV。
本发明还提供了一种上述复合物的制备方法，上述的制备方法包括，
-将载体溶于有机溶剂，获得有机相溶液；
-将治疗或预防剂加到缓冲液，获得水相溶液；
-将有机相溶液和水相溶液混合，获得复合物；
或，上述的制备方法，包括，
-将载体、治疗或预防剂溶于有机溶剂，获得有机相溶液；
-将有机相溶液和水相溶液混合，上述的水相溶液为纯水或缓冲液，获得复合物。
可选的，有机溶剂为甲醇、乙醇、丙醇、叔丁醇、乙腈、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、 N-甲基吡咯烷酮中的任意至少一种。
可选的，缓冲液为柠檬酸盐缓冲液。优选的，柠檬酸盐缓冲液的浓度为5-80mM，柠檬酸盐缓冲液的pH = 2-6。更优选的，柠檬酸盐缓冲液的浓度为10-50mM，柠檬酸盐缓冲液的pH = 3-5。
可选的，有机相溶液和水相溶液的体积比为1:1-10。
可选的，复合物的N/P=1-15。优选的，复合物的N/P=4-12。
本发明还提供了一种上述复合物在制备药物或疫苗组合物中的用途。
本发明由于采用了结构式如式1或式2或式3所示的阳离子化合物制备复合物，因而具有如下有益效果：本发明提供的复合物为脂质纳米粒，其纳米粒大小均一，粒径为30-300nm，Zeta电位为-30至30 mV，包封率≥90%；本发明提供的复合物具有优异的生物安全性，对细胞的毒性低，不会引起溶血现象；本发明提供的复合物具有较高的转染效率，优于目前已上市的SM-102和Dlin-MC3的脂质纳米粒；本发明提供的复合物具有良好的递送效率，在小动物体内递送Luciferase mRNA的能力比目前上市的SM-102的优异。因此，本发明的目的在于提供一种具有较高的转染效率、良好的递送效率和优异的生物安全性的复合物，该可应用于治疗剂或预防剂的体内和体外递送，特别是核酸药物，解决了核酸药物递送困难的问题，促进核酸药物的发展。
附图说明
图1为化合物1-1的氢谱图；
图2为化合物1-2的氢谱图；
图3为化合物1-3的氢谱图；
图4为化合物1的氢谱图；
图5为化合物2-1的氢谱图；
图6为化合物2的氢谱图；
图7为化合物3-2的氢谱图；
图8为化合物3的氢谱图；
图9为实施例6-8脂质纳米粒转染Luciferase mRNA的转染效率；
图10为实施例4-8脂质纳米粒的溶血情况；
图11为实施例4-8脂质纳米粒的细胞毒性；
图12为实施例9-17和实施例19脂质纳米粒的转染荧光图；
图13为实施例10-19脂质纳米粒的细胞毒性；
图14为实施例4-6脂质纳米粒的动物荧光成像图；
图15为实施例20-25脂质纳米粒递送SARS-CoV2 Spike mRNA的效果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1：
一种阳离子化合物1的合成方法，其合成方法的路线为：
一种阳离子化合物1的合成方法，包括如下步骤：
步骤1：化合物1-1的合成
在零度条件下，向丙烯酰氯（900 mg, 10 mmol，1equiv.）和(9Z,12Z)-十八烷-9,12-二烯-1-醇（2.66 g, 10 mmol，1equiv.）的二氯甲烷（60 mL）溶液中缓慢加入三乙胺（2.4 mL, 15 mmol, 1.5 equiv.）。继续搅拌2小时后，TLC监测显示醇完全消失。将反应混合物用DCM（100mL）稀释，并用水（100mL）和盐水（100mL）洗涤。合并有机层经Na2SO4干燥，并真空除去溶剂，得到粗产物，将粗产物通过柱色谱法（硅胶柱，洗脱液为含5％ EA（体积百分比）的正己烷溶液）纯化，并将纯产物馏分蒸发，得到无色油状化合物1-1（3.1 g，93％收率）。化合物1-1的氢谱图见图1，1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 6.38 (dd, J =17.4, 1.5 Hz, 1H), 6.10 (dd, J = 17.3, 10.4 Hz, 1H), 5.79 (dd, J = 10.4, 1.6Hz, 1H), 5.45 - 5.28 (m, 4H), 4.13 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 2.76 (t, J = 6.5 Hz,2H), 2.04 (q, J = 6.8 Hz, 4H), 1.79 - 1.56 (m, 2H), 1.53 - 1.18 (m, 16H),0.98 - 0.70 (m, 3H). LCMS：MS m/z (ESI): 320.7 [M+H] +。
步骤2：化合物1-2的合成
将化合物1-1（3.1 g, 9.3 mmol，1equiv.）溶解在60度的四氢呋喃（60 mL）溶液中，依次加入多聚甲醛（1.84 g, 46 mmol, 5 equiv.）、DABCO（5.15 g, 46 mmol，5equiv.）和10 mL的水。继续搅拌12小时后，TLC监测显示化合物1-1完全消失。将反应混合物用乙酸乙酯（100mL）萃取，并用水（100mL）和盐水（100mL）洗涤。合并有机层经Na2SO4干燥，并真空除去溶剂，得到粗产物。将粗产物溶解于DCM（80 mL）中，并加入Boc2O（3.04 g, 14mmol，1.5 equiv.）和DMAP（113 mg, 0.93 mmol，0.1equiv.）。继续搅拌2小时后，TLC监测显示原料完全消失，真空除去溶剂并通过柱色谱法（硅胶柱，洗脱液为含1-5％ EA（体积百分比）的正己烷溶液）纯化，并将纯产物馏分蒸发，得到无色油状化合物1-2（3.6 g，84％收率）。化合物1-2的氢谱图见图2， 1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 6.35 (q, J = 1.1Hz, 1H), 5.85 (q, J = 1.5 Hz, 1H), 5.50 - 5.09 (m, 4H), 4.79 (t, J = 1.3 Hz,2H), 4.16 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 2.91 – 2.66 (m, 2H), 2.21 - 1.91 (m, 4H), 1.72- 1.60 (m, 2H), 1.48 (s, 9H), 1.39 - 1.21 (m, 16H), 0.94 - 0.82 (m, 3H).LCMS：MS m/z (ESI): 450.9 [M+H] +。
步骤3：化合物1-3的合成
将化合物1-2（135 mg, 0.3 mmol，1.0 equiv.）溶解在60度的DCE（5 mL）溶液中，依次加入1-十八醇（116 mg, 0.6 mmol, 2.0 equiv.）和DABCO（3.4 mg, 0.03 mmol，0.1equiv.）。继续搅拌12小时后，TLC监测显示化合物1-2完全消失。真空除去溶剂，得到粗产物并通过柱色谱法（硅胶柱，洗脱液为含1-3％EA（体积百分比）的正己烷溶液）纯化，并将纯产物馏分蒸发，得到无色油状化合物1-3（128 mg，71％收率）。化合物1-3的氢谱图见图3，1HNMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 6.28 (q, J = 1.5 Hz, 1H), 5.86 (t, J = 1.8 Hz,1H), 5.43 - 5.27 (m, 4H), 4.24 - 4.06 (m, 4H), 3.48 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 2.77(t, J = 6.7 Hz, 2H), 2.05 (q, J = 6.9 Hz, 4H), 1.72 - 1.55 (m, 4H), 1.39 -1.17 (m, 46H), 0.88 (td, J = 6.9, 4.1 Hz, 6H). LCMS：MS m/z (ESI): 603.2 [M+H]+。
步骤4：化合物1的合成
将化合物1-3（60 mg, 0.1 mmol，1.0 equiv.）溶解在50度的DCM/MeOH（4/1 mL）溶液中，加入3-(二甲基氨基)-1-丙硫醇（60 mg, 0.5 mmol, 5.0 equiv.）。继续搅拌12小时后，TLC监测显示化合物1-3完全消失。真空除去溶剂，得到粗产物并通过柱色谱法（硅胶柱，洗脱液为含5-10％ MeOH（体积百分比）的二氯甲烷溶液）纯化，并将纯产物馏分蒸发，得到无色油状化合物1（36 mg，51％收率）。化合物1的氢谱图见图4，1H NMR (400 MHz,Chloroform-d) δ 5.60 - 5.19 (m, 4H), 4.10 (td, J = 6.7, 1.4 Hz, 2H), 3.77 -3.50 (m, 2H), 3.39 (td, J = 6.6, 2.1 Hz, 2H), 2.98 - 2.69 (m, 7H), 2.55 (t, J= 7.3 Hz, 2H), 2.47 - 2.32 (m, 2H), 2.25 (s, 6H), 2.04 (q, J = 6.8 Hz, 4H),1.76 (p, J = 7.3 Hz, 2H), 1.63 (p, J = 6.9 Hz, 2H), 1.51 (q, J = 6.8 Hz, 2H),1.40 - 1.12 (m, 46H), 0.88 (td, J = 6.9, 4.5 Hz, 6H). LCMS：MS m/z (ESI):722.7 [M+H] +。
实施例2：
一种阳离子化合物2的合成方法，其合成方法的路线为：
一种阳离子化合物2的合成方法，包括如下步骤：
步骤1：化合物2-1的合成
将实施例1得化合物1-2（135 mg, 0.3 mmol，1.0 equiv.）溶解在60度的DCE（5mL）溶液中，依次加入(9Z,12Z)-十八烷-9,12-二烯-1-醇（116 mg, 0.6 mmol, 2.0equiv.）和DABCO（3.4 mg, 0.03 mmol，0.1 equiv.）。继续搅拌12小时后，TLC监测显示化合物1-2完全消失。真空除去溶剂，得到粗产物并通过柱色谱法（硅胶柱，洗脱液为含1-3％EA（体积百分比）的正己烷溶液）纯化，并将纯产物馏分蒸发，得到无色油状化合物2-1（131mg，73％收率）。化合物2-1的氢谱图见图5，1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 6.21 (d,J = 1.6 Hz, 1H), 5.78 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 5.29 (qd, J = 11.1, 9.6, 3.9 Hz,8H), 4.07 (dd, J = 13.9, 7.2 Hz, 4H), 3.41 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 2.70 (t, J =6.5 Hz, 4H), 1.98 (q, J = 6.9 Hz, 8H), 1.69 - 1.46 (m, 4H), 1.40 - 1.04 (m,32H), 0.82 (t, J = 6.7 Hz, 6H). LCMS：MS m/z (ESI): 599.2 [M+H] +。
步骤2：化合物2的合成
将化合物2-1（30 mg, 0.05 mmol，1.0 equiv.）溶解在50度的DCM/MeOH（4/1 mL）溶液中，加入3-(二甲基氨基)-1-丙硫醇（30 mg, 0.25 mmol, 5.0 equiv.）。继续搅拌12小时后，TLC监测显示化合物2-1完全消失。真空除去溶剂，得到粗产物并通过柱色谱法（硅胶柱，洗脱液为含5-10％ MeOH（体积百分比）的二氯甲烷溶液）纯化，并将纯产物馏分蒸发，得到无色油状化合物2（20 mg，55％收率）。化合物2的氢谱图见图6，1H NMR (400 MHz,Chloroform-d) δ 5.36 (qq, J = 10.6, 6.9 Hz, 8H), 4.11 (t, J = 6.7 Hz, 2H),3.76 - 3.56 (m, 2H), 3.40 (td, J = 6.6, 2.1 Hz, 2H), 2.93 - 2.68 (m, 7H),2.59 - 2.50 (m, 2H), 2.38 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 2.25 (s, 6H), 2.05 (q, J = 6.9Hz, 8H), 1.76 (p, J = 7.3 Hz, 2H), 1.63 (p, J = 6.8 Hz, 2H), 1.52 (q, J = 6.7Hz, 2H), 1.47 - 1.12 (m, 32H), 0.89 (t, J = 6.7 Hz, 6H). LCMS：MS m/z (ESI):718.3 [M+H] +。
实施例3：
一种阳离子化合物3的合成方法，其合成方法的路线为：
一种阳离子化合物3的合成方法，包括如下步骤：
步骤1：化合物3-2的合成
将化合物3-1（136 mg, 0.3 mmol，1.0 equiv.）溶解在60度的DCE（5 mL）溶液中，依次加入(9Z,12Z)-十八烷-9,12-二烯-1-醇（116 mg, 0.6 mmol, 2.0 equiv.）和DABCO（3.4 mg, 0.03 mmol，0.1 equiv.）。继续搅拌12小时后，TLC监测显示化合物3-1完全消失。真空除去溶剂，得到粗产物并通过柱色谱法（硅胶柱，洗脱液为含1-3％ EA（体积百分比）的正己烷溶液）纯化，并将纯产物馏分蒸发，得到无色油状化合物3-2（119 mg,78％收率）。化合物3-2的氢谱图见图7，1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 6.28 (q, J = 1.5 Hz,1H), 5.85 (q, J = 1.8 Hz, 1H), 5.42 - 5.31 (m, 4H), 4.23 - 4.10 (m, 4H), 3.48(t, J = 6.6 Hz, 2H), 2.95 - 2.70 (m, 2H), 2.05 (q, J = 6.8 Hz, 4H), 1.71 -1.63 (m, 2H), 1.63 - 1.55 (m, 2H), 1.41 - 1.23 (m, 42H), 0.88 (td, J = 6.8,4.1 Hz, 6H). LCMS：MS m/z (ESI): 574.5 [M+H] +。
步骤2：化合物3的合成
将化合物3-2（29 mg, 0.05 mmol，1.0 equiv.）溶解在50度的DCM/MeOH（4/1 mL）溶液中，加入3-(二甲基氨基)-1-丙硫醇（30 mg, 0.25 mmol, 5.0 equiv.）。继续搅拌12小时后，TLC监测显示化合物3-2完全消失。真空除去溶剂，得到粗产物并通过柱色谱法（硅胶柱，洗脱液为含5-10％ MeOH（体积百分比）的二氯甲烷溶液）纯化，并将纯产物馏分蒸发，得到无色油状化合物3（17 mg，50％收率）。化合物3的氢谱图见图8，1H NMR (400 MHz,Chloroform-d) δ 5.46 - 5.20 (m, 4H), 4.10 (td, J = 6.7, 1.7 Hz, 2H), 3.69 -3.52 (m, 2H), 3.39 (td, J = 6.6, 2.0 Hz, 2H), 2.98 - 2.70 (m, 5H), 2.56 (t, J= 7.2 Hz, 2H), 2.44 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 2.30 (s, 6H), 2.13 - 1.98 (m, 4H),1.79 (p, J = 7.3 Hz, 2H), 1.71 - 1.58 (m, 2H), 1.52 (p, J = 7.0 Hz, 2H), 1.37- 1.17 (m, 42H), 0.88 (td, J = 6.8, 4.2 Hz, 6H). LCMS：MS m/z (ESI): 694.3 [M+H] +。
实施例4：
一种脂质纳米粒的制备方法，根据不同氮磷比（N/P）将本发明合成的阳离子化合物1-3、治疗或预防剂（EGFP mRNA或Luciferase mRNA或SARS-CoV2 Spike mRNA（新型冠状病毒刺突蛋白，S蛋白））制备不同的脂质纳米粒，具体见表1，其制备方法具体包括，
将阳离子化合物、DSPC（艾伟拓（上海）医药科技有限公司）、胆固醇（艾伟拓（上海）医药科技有限公司）和DMG-PEG 2000（艾伟拓（上海）医药科技有限公司）以50：10：38.5：1.5的摩尔比溶于乙醇，获得乙醇相溶液；将治疗或预防剂加到10至50mM柠檬酸盐缓冲液（pH =4）中，获得水相溶液；将体积比为1:2的乙醇相溶液和水相溶液混合，以制备脂质纳米粒，并通过多次DPBS超滤洗涤以除去乙醇和游离分子，最后，脂质纳米粒通过0.2μm无菌过滤器过滤以备用。
表1 脂质纳米粒的成分
实验例1：
1. 脂质纳米粒的理化性质
使用Malvern Zetasizer Nano ZS ZEN3600 （Malvern UK）通过动态光散射测定实施例4-8脂质纳米粒的大小及多分散指数，并测定其Zata电位，测试结果见表2。使用Quant-it Ribogreen RNA定量测定试剂盒(Thermo Fisher Scientific,UK) 测定脂质纳米粒的包封率，测试结果见表2。从表2可以看出，本发明实施例4-8脂质纳米粒的粒径为90-150nm，Zeta电位为4.0-30 mV，包封率＞90%。
表2 实施例4-8脂质纳米粒的理化性质
| 组别 | Size (nm) | PDI | Z电位 (mV) | 包封率 (%) |
| 实施例4 | 118.13 | 0.152 | 6.9 | 91.1 |
| 实施例5 | 113.53 | 0.100 | 13.1 | 93.0 |
| 实施例6 | 140.83 | 0.261 | 25.6 | 94.3 |
| 实施例7 | 98.64 | 0.201 | 8.8 | 95.8 |
| 实施例8 | 100.67 | 0.202 | 14.7 | 92.4 |
2. 脂质纳米粒的转染mRNA的效率
通过Luciferase生物发光评估实施例6-8脂质纳米粒转染mRNA的效率，具体步骤如下：在黑边透明底的96孔板中接种40000个293T细胞/孔，过夜培养，以每孔剂量为0.2μgmRNA的Luciferase mRNA脂质纳米粒转染293T细胞，游离的Luciferase mRNA作为对照组也转染细胞，转染24小时后，去掉旧培养基，换成含D-荧光素钠（1.5mg/mL）底物的新培养基，并孵育5分钟后，使用TACAN（SPARK）酶标仪检测生物发光，实施例6-8脂质纳米粒转染Luciferase mRNA的转染效率详见图9，图中，mRNA为对照组，1为实施例6脂质纳米粒，2为实施例7脂质纳米粒，3为实施例8脂质纳米粒。从图9可以看出，实施例4-8脂质纳米粒具有优异的转染效果。
3. 脂质纳米粒的安全性
2.1脂质纳米粒的溶血性测试
通过脂质纳米粒在体外的溶血实验来验证，具体操作如下：分别将mRNA终浓度为5μg/ml的游离mRNA或脂质纳米粒与小鼠红细胞溶液（最终体积百分比等于4%）在37℃条件下共孵育1小时，然后离心收集上清液，并测定上清液在540 nm的紫外吸收来证明溶血情况，实施例4-8脂质纳米粒的溶血情况如图10所示，图中，mRNA为游离mRNA，Dlin-MC3为实施例4脂质纳米粒，SM-102为实施例5脂质纳米粒，1为实施例6脂质纳米粒，2为实施例7脂质纳米粒，3为实施例8脂质纳米粒。从图10可以看出，实施例4-8脂质纳米粒不会引起溶血现象，这表明实施例1-3合成获得的阳离子化合物1-3具有优异的生物安全性。
2.2脂质纳米粒的细胞毒性测试
通过市售的细胞增殖检测试剂盒（MTS，Promega）评估脂质纳米粒的细胞毒性，在96孔板中接种40000个293T细胞/孔，过夜培养，以每孔剂量为0.2μg mRNA的LuciferasemRNA脂质纳米粒转染293T细胞，游离的Luciferase mRNA作为阴性对照组，可电离阳离子脂质Dlin-MC3和SM-102作为阳性对照，转染24小时后，去掉旧培养基，换成含MTS的新培养基，在培养箱中孵育2小时左右，使用TACAN（SPARK）酶标仪检测490nm处吸光度，实施例4-8脂质纳米粒的细胞毒性如图11所示，图中，mRNA为对照组，Dlin-MC3为实施例4脂质纳米粒，SM-102为实施例5脂质纳米粒，1为实施例6脂质纳米粒，图中2为实施例7脂质纳米粒，图中3为实施例8脂质纳米粒。从图11可以看出，实施例4-8脂质纳米粒具有具有较低的细胞毒性，这表明实施例1-3合成获得的阳离子化合物1-3具有较好的生物安全性。
实验例2：
脂质纳米粒在新型冠状病毒mRNA疫苗上的应用
1. 脂质纳米粒的理化性质
以合成的可电离阳离子脂质化合物1为例，制备了不同的N/P比的脂质纳米粒来递送EGFP mRNA（实施例9-19脂质纳米粒），按照实验例1中脂质纳米粒的理化性质测试方法测定实施例9-19脂质纳米粒的大小、多分散指数、Zata电位和包封率，结果详见表3。从表3可以看出，实施例9-19脂质纳米粒的粒径都比较接近，大小在50-150 nm之间，PDI都小于0.4，说明其纳米粒大小均一。
表3实施例9-19脂质纳米粒的理化性质
| 组别 | Size (nm) | PDI | Z电位 (mV) | 包封率 (%) |
| 实施例9 | 80.98 | 0.179 | 11.7 | 95.99 |
| 实施例10 | 102.4 | 0.128 | 10 | 94.84 |
| 实施例11 | 86.44 | 0.176 | 15.5 | 93.47 |
| 实施例12 | 93.23 | 0.159 | 10.8 | 96.71 |
| 实施例13 | 99.09 | 0.144 | 6.94 | 97.41 |
| 实施例14 | 94.04 | 0.187 | 8.59 | 96.98 |
| 实施例15 | 95.3 | 0.251 | 18.1 | 96.40 |
| 实施例16 | 101.2 | 0.188 | 12.2 | 96.18 |
| 实施例17 | 125.3 | 0.188 | 23.6 | 96.04 |
| 实施例18 | 104.1 | 0.178 | 25.2 | 96.32 |
| 实施例19 | 87.21 | 0.196 | 24.6 | 93.49 |
2. 细胞转染实验
在黑边透明底的96孔板中接种40000个293T细胞/孔，过夜培养，以每孔0.2 μg的mRNA剂量转染细胞，将实施例9-19脂质纳米粒孵育293T细胞24小时后通过奥林巴斯CKX53荧光显微镜拍摄荧光图像，实施例9-17和实施例19脂质纳米粒的转染荧光图见图12，图中，Dlin-MC3 N/P=4为实施例9脂质纳米粒，SM-102 N/P=6为实施例10脂质纳米粒，1 N/P=4为实施例11脂质纳米粒，1 N/P=5为实施例12脂质纳米粒，1 N/P=6为实施例13脂质纳米粒，1N/P=7为实施例14脂质纳米粒，1 N/P=8为实施例15脂质纳米粒，1 N/P=9为实施例16脂质纳米粒，1 N/P=10为实施例17脂质纳米粒，1 N/P=12为实施例19脂质纳米粒；实施例10-19脂质纳米粒的细胞毒性见图13，图中，SM-102 N/P=6为实施例10脂质纳米粒，1 N/P=4为实施例11脂质纳米粒，1 N/P=5为实施例12脂质纳米粒，1 N/P=6为实施例13脂质纳米粒，1 N/P=7为实施例14脂质纳米粒，1 N/P=8为实施例15脂质纳米粒，1 N/P=9为实施例16脂质纳米粒，1 N/P=10为实施例17脂质纳米粒，1 N/P=11为实施例18脂质纳米粒，1 N/P=12为实施例19脂质纳米粒。从图12和图13可以看出，不同氮磷比的本发明实施例9-19脂质纳米粒均具有很高的转染效率，并且呈现较低的细胞毒性，优于目前已上市的SM-102和Dlin-MC3的脂质纳米粒。
3. 动物研究
以10 μg/只的剂量对6-8周龄雌性Babl/c小鼠通过腿部肌肉注射的方式递送包裹了Luciferase mRNA的实施例4-6脂质纳米粒（N/P=6），并在给药后6小时、12小时和24小时分别进行小动物活体荧光成像（IVIS Lumina III，PE公司），在最后一个时间点成像后，安乐死小鼠，并对小鼠的主要器官（心、肝、脾、肺、肾）和注射部位的肌肉进行成像，实施例4-6脂质纳米粒的动物荧光成像图见图14，图中，Dlin-MC3为实施例4脂质纳米粒，SM-102为实施例5脂质纳米粒，1为实施例6脂质纳米粒。从图14可以看出，实施例4-6脂质纳米粒在小动物体内递送Luciferase mRNA的能力比目前上市的SM-102的优异。
实施例4：
脂质纳米粒在新型冠状病毒mRNA疫苗上的应用
不同N/P比的实施例20-25脂质纳米粒来递送新型冠状病毒刺突蛋白（SARS-CoV2Spike，S蛋白）的mRNA，在48孔板接种293T细胞，培养过夜后，以2μg/mL mRNA的量的脂质纳米粒转染孵育24小时，对照组转染不含mRNA的培养基，取其培养上清，通过市售的S蛋白ELISA试剂盒（义翘神州，KIT40591）进行检测，结果见图15，图中，PBS为对照组，Dlin-MC3为实施例20脂质纳米粒，SM-102为实施例21脂质纳米粒，1 N/P=4为实施例22脂质纳米粒，1N/P=6为实施例23脂质纳米粒，1 N/P=8为实施例24脂质纳米粒，1 N/P=10为实施例25脂质纳米粒。从图15可以看出，不同N/P比的实施例20-25脂质纳米粒均可以有效递送S蛋白的mRNA进入细胞。
本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述的仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种化合物，其结构式如式1或式2或式3所示，
2.一种制备权利要求1所述的化合物的方法，包括如下步骤：
1）在1,4-二氮杂二环[2.2.2]辛烷作用下，经叔丁氧羰基修饰的丙烯基化合物与1-十八醇或(9Z,12Z)-十八烷-9,12-二烯-1-醇发生反应，即得化合物A；
2）在DCM/MeOH溶液中，化合物A与3-(二甲基氨基)-1-丙硫醇发生反应，即得化合物；
所述的叔丁氧羰基修饰的丙烯基化合物如式1-2或式3-1所示，
3.一种阳离子脂质体，为如下1）-2）中的至少一种，
1）由权利要求1所述的化合物制成；
2）由权利要求1所述的化合物和辅脂制成；
所述的辅脂包括磷脂和/或结构性脂质和/或聚乙醇化脂质。
4.权利要求1所述的化合物或权利要求3所述的脂质体的用途，包括如下1）-3）中的至少一种，
1）包封治疗或预防剂；
2）制备治疗或预防剂体内递送试剂；
3）制备转染试剂盒。
5.一种复合物，包括，
-治疗或预防剂；
-用于递送治疗剂或预防剂的载体，所述的载体为权利要求1所述的化合物。
6.根据权利要求5所述的一种复合物，其特征在于，所述的治疗或预防剂选自核酸药物、小分子药物、蛋白质药物中的任意至少一种。
7.根据权利要求5所述的一种复合物，其特征在于，所述的复合物还包括磷脂和/或结构性脂质和/或聚乙醇化脂质。
8.权利要求5所述的一种复合物的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括，
-将载体溶于有机溶剂，获得有机相溶液；
-将治疗或预防剂加到缓冲液，获得水相溶液；
-将有机相溶液和水相溶液混合，获得复合物；
或，所述的制备方法，包括，
-将载体、治疗或预防剂溶于有机溶剂，获得有机相溶液；
-将有机相溶液和水相溶液混合，所述水相溶液为纯水或缓冲液，获得复合物。
9.权利要求5所述的一种复合物在制备药物组合物或疫苗组合物中的用途。
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| CN107207428A (zh) * | 2014-11-18 | 2017-09-26 | 阿克丘勒斯治疗公司 | 用于rna递送的可电离阳离子脂质 |
| CN107118340A (zh) * | 2017-04-12 | 2017-09-01 | 北京师范大学 | 基于δ ‑戊内酯的聚合物及其制备方法与应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
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Also Published As
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