CN113292608B - 一种外泌体药物递送系统及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种外泌体药物递送系统及其制备方法和应用，提供一种利用磷脂化合物将顺铂前药装载在外泌体上的主动载药系统，解决外泌体载药策略导致膜破裂和载药量低等问题；本发明预先制备顺铂药物前体，将其制备成脂质体后，再于外泌体混合实现主动载药，利用了磷脂类化合物与外泌体膜的融合作用，保护了外泌体膜的完成性，而且提高了外泌体对抗癌药物的载药量。

Description

一种外泌体药物递送系统及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，尤其是涉及一种外泌体药物递送系统及其制备方法和应用。
背景技术
外泌体(exosomes)是一种直径在30-150nm之间的茶托型结构的小囊泡，包含RNA、蛋白质、microRNA、DNA片段等多种成分。全部真核细胞和一些原核细胞均可分泌，主要分布在血液、唾液、尿液、羊水和母乳等多种体液中。它是由细胞质膜内陷形成早期的核内体，核内体内陷包裹物质形成多泡体，而后多泡体在与质膜融合后得以释放。正是外泌体的结构（磷脂双分子层和囊泡状结构）和生理特性，使它们具有很好的生物相容性。并且外泌体可以自由的穿过血脑屏障（BBB），低免疫原性和毒性使其可以很容易的被任何器官和组织中的细胞摄取，且不会引起机体的免疫反应，具有无毒、生物相容性好、组织和肿瘤靶向性和循环半衰期长等优点，是新型药物递送系统的理性候选者。
外泌体作为有效药物递送载体的关键是外泌体对治疗药物的“装载”。如今的装载策略大致分两类：被动和主动装载。无论是被动转载和主动转载策略，外泌体的载药量都受到候选药物亲水性、疏水性、药物分子量的影响，同时外泌体膜的完整性也是检验载药策略好坏的重要因素。被动装载的原理是利用治疗药物的由高浓度向低浓度的扩散，使药物被动穿过磷脂双分子层。此方法对候选药物要求很高，即容易穿过磷脂双分子膜结构又不易降解。主动装载是相对于被动装载提出的概念，是一种以增加载药量和扩大候选药物范围为目的的策略总称。主要包括：超声、挤压、电转和药物交联等技术，且电转策略是运用最为广泛。电转则是利用电场使外泌体膜上产生诸多暂时性的小孔，药物同样是以扩散的方式进入到外泌体中，再利用磷脂膜的流动性使小孔恢复完成药物装载。现阶段，外泌体作为递送载体的载药量较低，仅有少部分策略的载药量能达1%。同时，载药过程中外泌体膜的完整性也困扰着广大的研究学者。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种外泌体药物递送系统及其制备方法和应用。
本发明采用的技术方案是：一种顺铂药物前体，结构如式1所示，
Figure 777737DEST_PATH_IMAGE002
式 1；
其中，n为10、11、12、13或14。
制备顺铂药物前体的方法，其特征在于：具体步骤如下：
步骤一使用H2O2活化顺铂(CDDP)获得二羟基二胺二氯铂；
步骤二将二羟基二胺二氯铂与琥珀酸酐酯化反应获得琥珀酸羟基二胺二氯铂；
步骤三将琥珀酸羟基二胺二氯铂与磷脂酰乙醇胺通过酰胺键反应获得式1所示药物前体。
优选地，步骤一中活化温度为55-80℃，避光搅拌4.5-7.5h，4℃冷却2h；
优选地，活化温度为70℃，活化时间为6h。
优选地，步骤二以4-二甲氨基吡啶(DMAP)为催化剂，二羟基二胺二氯铂与琥珀酸酐的摩尔比为1：1-3；反应温度为60-80℃，搅拌3h；
优选地，步骤二中二羟基二胺二氯铂与琥珀酸酐的摩尔比为1:1，反应温度为75℃。
优选地，在步骤三中加入N-羟基丁二酰亚胺(NHS)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)作为催化剂；
优选地，琥珀酸羟基二胺二氯铂与磷脂酰乙醇胺的摩尔比为1:4，反应温度为24-40℃，避光反应16h。
优选地，磷脂酰乙醇胺为二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)。
一种外泌体药物递送系统，将顺铂药物前体制成脂质体，再由外泌体主动载顺铂药物前体形成外泌体药物递送系统。
优选地，将顺铂药物前体溶于盛有甲醇的容器中，使用氮气连续吹2h，去除溶剂后，在容器内壁上形成透明状薄膜，向容器中加入PBS溶解全部薄膜，通过脂质体挤出器挤压制成脂质体；
优选地，脂质体大小为30nm。
优选地，主动载药过程为将外泌体与脂质体混合，24~40℃下避光融合2h；脂质体与外泌体颗粒数比为1:1-5，优选为1:4。
外泌体为牛奶外泌体。
外泌体药物递送系统在抗肿瘤药物中的应用。
本发明具有的优点和积极效果是：提供了一种基于饱和磷脂类化合物的外泌体主动载药系统，此载药系统不但利用了磷脂类化合物与外泌体膜的融合作用，保护了外泌体膜的完成性，而且提高了外泌体对抗癌药物的载药量；
外泌体作为药物载体，其来源广泛，低免疫原性和毒性使其可以很容易的被任何器官和组织中的细胞摄取，且不会引起机体的免疫反应，具有无毒、生物相容性好、组织和肿瘤靶向性和循环半衰期长等优点；
药物前体是由磷脂酰乙醇胺、琥珀酸酐和二羟基二氨二氯铂化学反应而来，稳定性高，安全性好，符合临床用药的要求，符合大规模工业化生产的要求，具备良好的市场前景与临床应用价值；
外泌体为牛奶来源，大规模生产的可能性大，性质稳定可耐酸、不会引起机体的免疫反应。纯度高达95%且其他成分不影响细胞活性。
附图说明
图1DSPE脂质体表征：其中A为30nm脂质体电镜图，标尺为500nm；B为使用DID对脂质体染色后的阳性率；
图2牛奶外泌体表征：其中A为外泌体电镜图，标尺为500nm；B为此外泌体的粒径分布；
图3 牛奶外泌体的纯度分析；
图4 牛奶外泌体的CYTO 9核酸染料染色后的阳性率；
图5 DSPE脂质体与牛奶外泌体融合效率；
图6 为制备的顺铂药物前体形成脂质体的透射电镜图与粒径图，标尺为500nm；
图7 为载药前后牛奶外泌体的形态和粒径的比较：A为牛奶外泌体载药后的形态表征，标尺为500nm；B为牛奶外泌体载药前后粒径比较；
图8 为主动载药外泌体递送体系在谷胱甘肽作用下的铂分子释放曲线图；
图9 为载药外泌体抑制SKOV-3肿瘤细胞的增殖的能力。
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施例对本发明作进一步详述。
本发明公开一种外泌体药物递送系统及其制备方法和应用，提供一种利用磷脂化合物将顺铂前药装载在外泌体上的主动载药系统，解决外泌体载药策略导致膜破裂和载药量低等问题。
顺铂药物前体结构如式1所示，
Figure 350670DEST_PATH_IMAGE002
式 1；
其中，n为10、11、12、13或14。
顺铂药物前体的制备方法，具体步骤如下：
步骤一使用浓度为30% (W /V)的H2O2活化顺铂(CDDP)，反应温度为55-80℃，避光搅拌4.5-7.5h,4℃冷却2h，通过减压过滤得到淡黄色固体，并依次使用水、乙醇、乙醚清洗，最终获得二羟基二胺二氯铂；
Figure 723882DEST_PATH_IMAGE004
步骤二以4-二甲氨基吡啶(DMAP)为催化剂将二羟基二胺二氯铂与琥珀酸酐酯化反应，二羟基二胺二氯铂与琥珀酸酐的摩尔比为1：1-3；反应温度为60-80℃，搅拌3h，获得琥珀酸羟基二胺二氯铂；
步骤三以N-羟基丁二酰亚胺(NHS)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)作为催化剂将琥珀酸羟基二胺二氯铂与磷脂酰乙醇胺进行酰胺键反应，琥珀酸羟基二胺二氯铂与磷脂酰乙醇胺的摩尔比为1:4，反应温度为24-40℃，避光反应16h；获得式1所示顺铂药物前体。
Figure 587933DEST_PATH_IMAGE006
n可以为10、11、12、13、14。
其中，磷脂酰乙醇胺优选为二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)。饱和磷脂酰乙醇胺与活化的CDDP通过酰胺键连接，而酰胺键本身很稳定可以在血液中循环而不被降解，只在肿瘤的微环境和肿瘤细胞中酸和酶同时存在时才会断裂，释放出CDDP；而CDDP在还原酶谷胱甘肽的作用下四价铂药物前体被还原成二价顺铂并释放；该顺铂药物前体具有较高特异性。
一种外泌体药物递送系统，将顺铂药物前体制成脂质体，再由外泌体主动载顺铂药物前体形成外泌体药物递送系统。步骤如下：
步骤1 将顺铂药物前体溶于盛有甲醇的容器中，使用氮气连续吹2h，去除溶剂后，在容器内壁上形成透明状薄膜，向容器中加入PBS溶解全部薄膜，通过脂质体挤出器挤压形成均一、稳定的颗粒即为脂质体；优选地，脂质体大小为30nm。
步骤2 主动载药过程为将外泌体与脂质体混合，24~40℃下避光融合2h，利用磷脂与外泌体膜的融合作用使脂质体与外泌体相结合完成主动载药；脂质体与外泌体颗粒数比为1:1-5；载药后的外泌体通过100KD超滤管(millipore，UFC910096)进行纯化，最终得到外泌体药物递送系统。
可对制成的外泌体药物递送系统进行抗肿瘤检测，具体可采用CCK-8法检测。
在本发明某些实施例中，外泌体为牛奶外泌体，来源广泛，适用于大规模的工业生产，性质稳定可耐酸、不会引起机体的免疫反应，不会影响细胞活性。本发明选用的抗肿瘤药物为四价铂，由顺铂氧化而来；与临床顺铂注射液相比较，在pH显中性的血液中循环时，四价铂能够稳定存在于外泌体表面；外泌体进入肿瘤细胞后，通过细胞内大量存在的还原性谷胱甘肽，即刻可把四价的铂前药还原成二价的铂，释放具有生物毒性的顺铂，降低了顺铂的副作用和细胞的耐药性。二作为药物载体的外泌体其来源广泛，低免疫原性和毒性使其可以很容易的被任何器官和组织中的细胞摄取，且不会引起机体的免疫反应，具有无毒、生物相容性好、组织和肿瘤靶向性和循环半衰期长等优点。
通过磷脂酰乙醇胺、琥珀酸酐和二羟基二氨二氯铂制成的药物前体，稳定性高，安全性好，符合临床用药的要求；将其制成脂质体再与外泌体融合，有效解决了传统载药方式对外泌体膜完整性的破坏的问题，另外，通过融合作用可有效提高外泌体载药量，通过本方案制得的外泌体药物递送系统，载药量可达10%。用于抗肿瘤药物中时，用药位置更为准确，药物效果更为充分。
下面结合附图对本发明方案做出说明，其中，未具体说明操作步骤的实验方法，均按照相应商品说明书进行，实施例中所用到的仪器、试剂、耗材如无特殊说明，均可从商业公司购买得到。
实施例1：顺铂药物前体的制备
二羟基二氨二氯铂的合成：将CDDP(2g)和30ml 30％双氧水(w/v)加入到圆底烧瓶中，70℃避光搅拌6小时后，4℃冷却2小时，通过减压过滤得到淡黄色晶体，再分别用水、乙醇和乙醚清洗，干燥后得到产物二羟基二氨二氯铂。
顺铂药物前体的合成：在圆底烧瓶中加入二羟基二氨二氯铂(100mg，0.3mmol)和琥珀酸酐(300mg，0.3mmol)，溶解在(DMF)中，并加入4-二甲氨基吡啶（DMAP，0 .3mmol)。75℃搅拌3小时，反应结束后加水析出淡黄色固体；然后经过水和石油醚清洗得到产物。
将上述Pt(IV)黄色固体(129mg，0.3mmol)溶解于超纯水中，依次加入EDC (34mg，0.3mmol)和NHS(56.7mg， 0.3mmol)。避光反应2h后加入二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺（n为14）溶液（DSPE,95.38mg，0.15mmol）。溶剂为CHCl3、CH3OH、H2O的混合液，各个成分比例为6.5:3.5:8，40℃下反应12h。而后旋转蒸发蒸掉溶剂，并使用1KD透析袋对样品进行纯化，最终得到顺铂药物前体。
实施例2：DSPE脂质体和牛奶外泌体的融合效率检测
将DSPE溶解于1ml CH3OH中，N2吹干溶剂并真空干燥24h。而后加入2mlPBS溶液超声溶解，再通过30nm的挤出器反复挤压20次，收集DSPE脂质体。使用DID染色剂对脂质体膜进行染色，使用10KD超滤管除去未结合的DID染色剂得到被红色染色的DSPE脂质体。通过TEM(透射电子显微镜，Transmission electron microscopy)对脂质体进行形态学表征，并使用纳米流式检测被染色的脂质体占总数的比例。如图1所示，制备的脂质体粒径分布均在30nm左右，分布均匀，且纳米流式结果显示有87.5%的脂质体被染色成功。
将新鲜牛奶通过酸沉、离心、超速离心分离牛奶外泌体，并通过观察外泌体的形态和检测纯度来对此方法分离的外泌体进行评估。而后，使用NTA分析粒径和颗粒数，并使用CYTOTM 9(S34854)核酸染料对外泌体中核酸进行染色。如图2-4所示，通过TEM和高效液相色谱的结果可知，牛奶外泌体有标准的外泌体茶托状结构，纯度为97.85%；而被染色的外泌体占总外泌体个数的比例结果为72.5%。
将被染色的牛奶源外泌体与被染色的脂质体按照4:1比例(颗粒数比)混合，总体积为100ul，40℃下恒温孵育2小时。待混合液冷却至室温，检测外泌体和DSPE的结合效率。结果如图5所示，证明牛奶外泌体和DSPE脂质体可以通过膜融合作用成功结合。
实施例3：外泌体药物递送系统的制备
顺铂药物前体脂质体制备：将顺铂药物前体溶解于1ml CH3OH中，N2吹干溶剂并真空干燥24h。而后加入2mlPBS溶液超声溶解，再通过30nm的挤出器反复挤压20次，收集顺铂药物前体脂质体。通过TEM(透射电子显微镜，Transmission electron microscopy)对脂质体进行表征，并且通过软件image pro对粒径进行统计计算，如图6所示，制备的脂质体粒径分布均在30nm左右，且分布均匀。
外泌体主动载药：将牛奶源外泌体与脂质体按照4:1比例(颗粒数比)混合，总体积为100ul，40℃下恒温孵育2小时。待混合液冷却至室温，使用100KD超滤管除去未结合的顺铂药物前体纯化外泌体。通过TEM对载药前后的外泌体进行形态表征，并且通过NTA对粒径进行统计对比，如图7所示，载药前后外泌体形态无变化，且粒径无变化；尺寸的变化对药物载体的吸收和屏障的穿透是有影响的，本方案中，载药后外泌体形态和粒径无变化说明外泌体在温和的孵育过程中膜的完整性没有被破坏。
测定外泌体药物递送系统在谷胱甘肽作用下的顺铂释放情况。结果如图8所示，该纳米递送体系在谷胱甘肽作用下1h内可以释放出大量的顺铂分子。通过公式计算此主动载药外泌体递送体系的载药量，载药量公式如下：
载药量（%）=［（W0）/W］×100%
式中：W0为顺铂总含量；W为载药外泌体的总重量。
计算可知，外泌体药物递送系统载药量可达10%。
实施例4：载药外泌体体外抗肿瘤效果
考察载药外泌体体外抗肿瘤效果，具体方法如下：取对数生长期的卵巢癌细胞系(SKOV-3)，接种于96孔培养板(5000个细胞/孔)。放入在37℃细胞培养箱中恒温培养24h后，加入载药外泌体，取4个浓度梯度(100,50,25,12.5ug)，以顺铂注射液作为对照组，每种药每个浓度4个重复值，加完药后将96孔细胞板放入细胞培养箱中培养72h后，加入10ul CCK-8试剂，继续培养4h后，用酶标仪检测490nm处的吸光值。计算细胞存活率，得到药物对细胞生长的IC50(如图9)。
以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。

Claims (5)

1.一种外泌体药物递送系统，其特征在于：将式1顺铂药物前体制成脂质体，再由牛奶外泌体主动载顺铂药物前体形成外泌体药物递送系统，脂质体与外泌体颗粒数比为1:1-5；
Figure DEST_PATH_IMAGE001
式 1；
其中，n为10、11、12、13或14。
2.根据权利要求1所述的外泌体药物递送系统，其特征在于：将顺铂药物前体溶于盛有甲醇的容器中，使用氮气连续吹2h，去除溶剂后，在容器内壁上形成透明状薄膜，向容器中加入PBS溶解全部薄膜，通过脂质体挤出器挤压制成脂质体；所述脂质体大小为30nm。
3.根据权利要求1所述的外泌体药物递送系统，其特征在于：主动载药过程为将牛奶外泌体与脂质体混合，24~40℃下避光融合2h。
4.根据权利要求3所述的外泌体药物递送系统，其特征在于：脂质体与外泌体颗粒数比为1:4。
5.权利要求1-4中任一所述的外泌体药物递送系统在制备抗肿瘤药物中的应用。
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