CN117945966A - 一种带苯环结构的可电离脂质及其复合物的制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种带苯环结构的可电离脂质及其复合物的制备和应用。本发明提供的可电离脂质具有良好的递送效率、转染效率和较低的毒性，可应用于治疗剂或预防剂的体内和体外递送，特别是核酸药物，解决了核酸药物递送困难的问题，促进核酸药物的发展。本发明提供的复合物为脂质纳米粒，其纳米粒大小均一，粒径为70至140nm，Zeta电位为‑10至15mV，包封率≥85％；本发明提供的复合物具有优异的生物安全性，对细胞的毒性低，不会引起溶血现象；本发明提供的复合物具有良好的递送效率和转染效率，制备简单，路线简短。
Description
本申请主张中国在先申请，申请号：202311664387.6，申请日2023年12月6日的优先权；其所有的内容作为本发明的一部分。
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体而言，涉及一种带苯环结构的可电离脂质及其复合物的制备和应用。
背景技术
核酸药物作为一大类新兴的药物领域，具有设计快、应用广、安全性高等特点，是未来药物发展的主要方向之一。然而，由于核酸药物自身的细胞穿透性差并且容易降解，比如裸露的mRNA直接进入体内会被降解，如何把mRNA有效地递送到细胞内，实现高效、安全的mRNA递送，从而完成蛋白的翻译制造，是mRNA药物药效的保证。因此，需要开发特定的化合物及递送系统来改善这一现状，以促进核酸药物可以作为疾病预防和治疗的重要手段。
脂质纳米颗粒(LNP)是指将药物包封于内形成的微型泡囊体，可以保护RNA不被核糖核酸酶降解、可被细胞特异性摄取、进入细胞质后能及时从内涵体中释放，使得递送的mRNA能够有效表达成目标蛋白，常用作相应药物的递送载体，现在已经发展成为成熟的一类新型制剂。与传统的单层脂质体(Liposomes)或脂质囊泡(Vesicles)等相比，纳米脂质颗粒有更为复杂的微观结构，脂质纳米颗粒主要由胆固醇、磷脂、聚乙二醇修饰脂质、阳离子脂质等的组成，被认为在药理学上无活性且毒性小，也被认为具有一定的自佐剂功能，脂质纳米颗粒递送系统具有综合优势；但当前的脂质纳米颗粒药物递送系统也具有明显的局限性，例如缺乏靶向选择性、血液循环时间短和体内不稳定性等等，从而导致递送效率低，转染效率低，对人体有潜在刺激性或毒性，例如在个别情况下引起严重不良反应等问题和隐患等问题。
目前，可电离的阳离子脂质制备的脂质纳米颗粒(LNP)是递送核酸药物比较安全和有效的手段。LNP的原料成分主要有以下4种：1)可电离脂质或类脂质分子(如DLin-MC3-DMA、L319、DLin-KC2-DMA、)。这是实现体内递送mRNA的核心成分。2)磷脂分子，是一种磷脂，它为LNP双分子层提供结构，也可能有助于核内体逃逸；3)胆固醇，增强LNP稳定性，促进膜融合；4)聚乙二醇，它可以控制并减少LNP的粒径，并“保护”LNP不受免疫细胞非特异性内吞作用的影响。
而且目前已上市的可用与制备LNP的可电离脂质还很少，还需要大量设计和筛选更合适的可电离阳离子脂质，来帮助解决LNP存在的递送效率低，转染效率低，或具有细胞毒性等问题。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种带苯环结构的可电离脂质及其复合物的制备和应用，本发明提供的可电离脂质具有良好的递送效率、转染效率和较低的毒性，可应用于治疗剂或预防剂的体内和体外递送，特别是核酸药物，解决了核酸药物递送困难的问题，促进核酸药物的发展。
一方面，本发明提供了一种可电离的阳离子化合物，具有如式(Ⅰ)所示的结构，或者含有式(Ⅰ)所示的结构的盐或衍生物，
其中，R1、R2、R3、R4、R5中的任意两个为另外三个为H，
m、n大于或等于1，A分选自-S-、-S-S-、-COO-、-O-CO-O-中的任意一种，R’为碳原子数量大于或等于1的脂肪链。
优选的，所述R2、R4为R1、R3、R5为H。
根据上述优选的化合物结构制备得到的可电离脂质，即三条尾部彼此为间位的化合物制备得到的可电离脂质，具有更低的毒性。
苯环上连接的三条链处于不同位置的化合物，化合物苯环上连接的三条链的位置与对应化合物制备的可电离脂质的mRNA递送效率、转染效率、安全性和内涵体逃逸能力、毒性有直接联系，因此可灵活调整结构以得到适合的可电离阳离子化合物。在本发明创新地提出苯环上连接的三条链的结构后，在苯环上取代在不同的位置属于本领域的常见调整，因此均属于本发明的保护范围。
本发明对符合式(Ⅰ)的多种化合物进行了测试，发现R2、R4为R1、R3、R5为H时，化合物制备得到的可电离脂质的毒性较低。
本发明中的R’为碳原子数量大于或等于1的脂肪链，是因为R’在结构上的作用是作为一条疏水链影响可电离脂质的组装结果、mRNA转染效果等，脂肪链具有疏水性，且可根据所需要的疏水性灵活调整R’的脂肪链结构，例如调整链长、支链个数等，在明确了R’结构与化合物功能之间的联系后，在脂肪链的框架内进行调整均属于本领域的常见调整，因此均属于本发明的保护范围。
此外，n的取值影响尾部长度，进而影响可电离脂质的组装结果、水解速度等，理论上n可以从整数1开始无限向上递增，逐渐增加尾部长度，在一定范围内增加长度能促进水解，进而降低毒性，而过度增加尾部长度，则难以水解，因此在明确n取值与化合物功能之间的联系后，对n取值进行调整均属于本领域的常见调整，因此均属于本发明的保护范围。
优选的，所述m选自2、3、4中的一种。
进一步优选的，所述m为3。
优选的，所述A选自-COO-或-S-S-。
根据本发明对多种A结构的测试结果，调整A的结构会对化合物制备得到的可电离脂质的性质产生影响，A选择二硫键则脂质易降解毒性低，A选择酯键则脂质的mRNA转染效率好。
从原理上看，将生物降解性引入可电离脂质的常见策略是通过包含在生理pH下稳定但在组织和细胞内酶促水解的酯键。不同类型的化学键的降解性会有所不同，会导致LNP在体内有不同的循环周期，降解过快会导致较差的效力，因此引入生物降解性需要平衡活性-降解性权衡以最大化总效益。同时酯基的位置和空间效应可以极大地影响可电离脂质清除率和效力。所以导致A为酯键的化合物在保证生物安全性的同时表现出最佳的转染效率。
本发明在苯环类的阳离子脂材中，首次引入了-S-S-键作为可降解的官能团，即A选择二硫键-S-S-，由于胞内的谷胱甘肽(GSH)浓度相较于胞外要高，在进入胞内之后，可以与GSH发生响应，然后二硫键断裂，阳离子脂材可以迅速代谢，将mRNA迅速释放，从而提高了转染效率，降低了毒性。
进一步的，所述R’不含支链，或为支链长度相同的双链，或为支链长度相同的三链。
优选的，所述R’为碳原子数量大于或等于9的脂肪链。
进一步优选的，所述R’为碳原子数量等于11的支链脂肪链。
进一步优选的，所述R’为碳原子数量等于17的双链脂肪链。
优选的，R2和R4各自独立选自
进一步优选的，R2为R4为/>
不同疏水链的选择提高了组装效率、递送效率，进而提高了转染效率。从原理上看，引入支链的酯基R2可以增强其蛋白表达能力，直链的酯基R4的水解是脂质代谢的第一步，过量的R4由于快速的降解会减弱蛋白表达，不同的尾部可以平衡转染效率和降解性，增强转染效率。
优选的，所述m选自2、3、4中的一种。
进一步优选的，所述m为3。
对于苯环上连接的尾部，本发明设计的结构可以通过控制投料比选择性地得到不同尾部结构的可电离脂质，同时对脂质的头部结构也可进行选择。可以通过调节尾部链的长短、支链的个数得到不同结构的尾部，达到转染效率和体内降解平衡，影响最终自组装形成的脂质体，同时可扩大脂质库的筛选范围从而更大可能得到转染效率更高的脂质。
通过本发明的试验筛选，得到了一种mRNA递送和转染效率极高、安全性和内涵体逃逸能力高。毒性低的可电离的阳离子化合物(化合物11)，具体如下式所示：
化合物11制备的脂质纳米颗粒具有最佳的mRNA转染及递送效率、安全性和内涵体逃逸能力、以及极低的毒性；从结构上来看，化合物11的三条尾部结构均不同，含N的链上含有酯基，有利于mRNA的递送和转染，另外两条尾部的链长度适中，因此具有良好的内涵体逃逸能力，此外结构中含有多个酯键，且酯键所处的化学环境利于水解，降解速率快，因此具有较低的细胞毒性。
另外，本发明筛选得到了一种低毒性的可电离的阳离子化合物(化合物1)，具体如下式所示：
化合物1含有二硫键，胞内的谷胱甘肽(GSH)浓度相较于胞外要高，在进入胞内之后，化合物1可以与GSH发生响应，然后二硫键断裂，阳离子脂材可以迅速代谢，将mRNA迅速释放，从而提高了转染效率，降低了毒性。
另一方面，本发明提供了一种脂质复合物，包括所述的可电离的阳离子化合物。
进一步的，还包括治疗或预防剂。
进一步的，治疗或预防剂选自核酸药物、小分子药物、蛋白质药物、药物活性分子中的任意至少一种。
在一些方式中，核酸药物选自DNA药物、RNA药物中的任意至少一种；RNA药物选自mRNA、siRNA、aiRNA、miRNA、dsRNA、aRNA、lncRNA中的任意至少一种。
在一些方式中，蛋白质药物选自抗体、酶、重组蛋白、多肽和短肽中的任意至少一种。
进一步的，还包括磷脂、结构性脂质、聚乙二醇化脂质中的任意一种或多种。
优选的，磷脂选自二硬脂酰磷脂胆碱(DSPC)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-磷酸胆碱、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-双十一烷酰基-sn-甘油-磷酸胆碱、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二-O-十八碳烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1-油酰基-2-胆固醇基半琥珀酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-双二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-双二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-rac-(1-甘油)钠盐、二棕榈酰基磷脂酰甘油、棕榈酰基油酰基磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰基-磷脂酰-乙醇胺、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰基磷酸乙醇胺、1-硬脂酰基-2-油酰基-硬脂酰乙醇胺、1-硬脂酰基-2-油酰基-磷脂酰胆碱、鞘磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸、棕榈酰基油酰基磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺中的任意至少一种。
进一步优选的，磷脂为二硬脂酰磷脂胆碱(DSPC)。
优选地，结构性脂质选自胆固醇、β胆固醇、粪固醇、谷固醇、麦角固醇、菜油固醇、豆固醇、菜籽固醇、番茄碱、番茄素、熊果酸、α-生育酚中的任意至少一种。
进一步优选地，结构性脂质为胆固醇。
优选地，PEG脂质选自PEG改性的磷脂酰乙醇胺、PEG改性的磷脂酸、PEG改性的神经酰胺、PEG改性的二烷基胺、PEG改性的二酰基甘油、PEG改性的二烷基甘油中的任意至少一种。
进一步优选地，PEG脂质为DMG-PEG 2000(1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇2000)。
在一些方式中，载体、磷脂、结构性脂质和聚乙二醇化脂质的摩尔比为10-100:0-50:0-50:0-5。
优选地，载体、磷脂、结构性脂质和聚乙二醇化脂质的摩尔比为30-80:2-20:30-50:0.5-5。
进一步优选地，载体、磷脂、结构性脂质和聚乙二醇化脂质的摩尔比为40-60:5-15:35-45:0.5-2。
更进一步优选地，载体、磷脂、结构性脂质和聚乙二醇化脂质的摩尔比为50:10:38.5:1.5。
在一些方式中，所述复合物为脂质纳米粒。
优选地，脂质纳米粒的粒径为30至300nm，Zeta电位为-30至30mV，
更优选地，脂质纳米粒的粒径为70至140nm，脂质纳米粒的Zeta电位为-10至15mV。
另一方面，本发明提供了一种脂质复合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)将所述的可电离的阳离子化合物，和磷脂、结构性脂质、聚乙二醇化脂质中的任意一种或多种溶于有机溶剂，获得有机相溶液；
(2)将治疗或预防剂与缓冲液混合，获得水相溶液；
(3)将有机相溶液与水相溶液混合，获得脂质复合物。
在一些方式中，有机溶剂为甲醇、乙醇、丙醇、叔丁醇、乙腈、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮中的任意至少一种。
在一些方式中，缓冲液为柠檬酸盐缓冲液。
优选地，柠檬酸盐缓冲液的浓度为5-80mM，柠檬酸盐缓冲液的pH＝2-6。
进一步优选地，柠檬酸盐缓冲液的浓度为10-50mM，柠檬酸盐缓冲液的pH＝3-5。
在一些方式中，复合物的N/P＝1-15。
优选地，复合物的N/P＝6。
另一方面，本发明提供了一种所述的可电离的阳离子化合物用于制备提高脂质复合物的递送效率和/或转染效率的制剂的用途。
另一方面，本发明提供了一种所述的可电离的阳离子化合物用于制备降低脂质复合物的细胞毒性的制剂的用途。
另一方面，本发明还提供了一种所述的可电离的阳离子化合物或其药物可用的盐的用途，包括如下1)-4)中的至少一种，
1)包封治疗或预防剂；
2)治疗或预防剂体外细胞转染；
3)制备治疗或预防剂体内递送试剂；
4)制备转染试剂盒。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明为可电离脂质设计了一种全新的可电离的阳离子化合物，能够制备一种全新的可电离脂质及其复合物，可应用于治疗剂或预防剂的体内和体外递送，特别是核酸药物，解决了核酸药物递送困难的问题，促进核酸药物的发展；
2、本发明提供的复合物为脂质纳米粒，其纳米粒大小均一，粒径为70至140nm，Zeta电位为-10至15mV，包封率≥85％；
3、本发明提供的复合物具有优异的生物安全性，对细胞的毒性低，不会引起溶血现象；
4、本发明提供的复合物具有良好的递送效率和转染效率，制备简单，路线简短。
附图说明
图1为化合物1-1的氢谱图；
图2为化合物1-2的氢谱图；
图3为化合物1-4的氢谱图；
图4为化合物1的氢谱图；
图5为化合物2的氢谱图；
图6为化合物3的氢谱图；
图7为化合物4的氢谱图；
图8为化合物5的氢谱图；
图9为化合物6的氢谱图；
图10为化合物7的氢谱图；
图11为化合物8-1的氢谱图；
图12为化合物8的氢谱图；
图13为化合物9的氢谱图；
图14为化合物10的氢谱图；
图15为化合物11-1的氢谱图；
图16为化合物11-2的氢谱图；
图17为化合物11的氢谱图；
图18为化合物12-1的氢谱图；
图19为化合物12-2的氢谱图；
图20为化合物12的氢谱图；
图21为化合物13的氢谱图
图22为脂质纳米粒转染Luciferase mRNA的转染效率；
图23为脂质纳米粒在中性环境下的溶血情况；
图24为脂质纳米粒在酸性环境下的溶血情况；
图25为脂质纳米粒的细胞毒性。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细描述，需要指出的是，以下所述实施例旨在便于对本发明的理解，而对其不起任何限定作用。以下实施例中采用的实验试剂、耗材及实验仪器若未写明来源，均为市售商品。
实施例1：可电离的阳离子化合物的合成
根据化合物结构的不同，本实施例提供了13种可电离的阳离子化合物，及13种可电离的阳离子化合物的制备方法。属于本发明可电离的阳离子化合物通式的其他分子，也能够选择性地应用本实施例的方法设计合成路线并进行合成。
所述的13种可电离的阳离子化合物如下：
一、可电离的阳离子化合物1的合成方法，其合成方法的路线为：
一种可电离的阳离子化合物1的合成方法，包括如下步骤：
步骤1：化合物1-1的合成
室温条件下，向溴己酸(1950mg，10mmol，1equiv)和9-十七醇(2048mg，8mmol，0.8equiv)的混合二氯溶液(50mL)中加DMAP(1464mg，12mmol，1.2equiv)和EDCI(2304mg，12mmol，1.2equiv)，室温下搅拌8h，经TLC检测显示醇完全消失，真空除去溶剂，得到粗产物，将粗产物通过柱色谱法(硅胶柱，洗脱液为PE:EA＝20：1)纯化，并将纯产物馏分蒸发，得到无色油状化合物1-1(3048mg，收率88％)。化合物1-1的氢谱图如图1，1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ4.87(p,J＝6.3Hz,1H),3.47(dt,J＝51.5,6.7Hz,2H),2.30(t,J＝7.4Hz,2H),1.95–1.80(m,2H),1.65(p,J＝7.5Hz,2H),1.59–1.42(m,6H),1.35–1.16(m,25H),0.98–0.75(m,6H).
步骤2：化合物1-2的合成
将化合物1-1(2580mg，6mmol，3equiv)溶解在超干DMF(50mL)溶液中，加入3，5二羟基苯甲醇(280mg，2mmol，1equiv)和无水碳酸钾(2760mg，20mmol，10equiv)以及碘化钾(33.2mg，0.2mmol，0.1equiv)，在80℃加热环境下反应24h。TLC监测反应完成之后，将反应混合物用乙酸乙酯洗涤，过滤得到的溶液用乙酸乙酯和饱和食盐水萃取，最后用饱和氯化锂萃取，萃取8-10次后将合并有机相层，用无水Na2SO4干燥。经真空除去溶剂后通过柱色谱法(硅胶柱，洗脱液为PE:EA＝15：1)纯化，并将纯产物馏分蒸发，得到无色油状化合物1-2(483mg，收率28.6％)。化合物1-2的氢谱图如图2，1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ6.49(d,J＝2.3Hz,2H),6.35(t,J＝2.3Hz,1H),4.87(p,J＝6.3Hz,2H),4.61(s,2H),3.93(t,J＝6.5Hz,4H),2.32(t,J＝7.5Hz,4H),1.79(p,J＝6.6Hz,4H),1.72–1.66(m,4H),1.54–1.46(m,12H),1.25(d,J＝3.6Hz,52H),0.89–0.84(m,12H).
步骤3：化合物1-3的合成
将化合物1-2(329mg，0.39mmol，1equiv)溶解在超干DCM(20mL)溶液中，加入MsCl(45mg，0.39mmol，1equiv)，搅拌过程中滴加三乙胺(0.054mL，0.39mmol，1equiv)。搅拌反应2h后，TLC检测1-2完全反应完，得到化合物1-3。粗样直接用于下一步反应。
步骤4：化合物1-4的合成
在化合物1-3的反应溶液中直接加入AcSK(133mg，1.17mmol，3equiv)，室温下反10h，经TLC检测化合物1-3完全反应完，真空除去溶剂后得到粗产物，通过柱色谱法(洗脱溶液为PE:EA＝10:1)纯化，并将纯产物馏分蒸发，得到无色油状化合物1-4(139mg，39.4％收率)。化合物1-4的氢谱图如图3，1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ6.67(dd,J＝14.0,2.2Hz,2H),6.50(dt,J＝4.2,2.1Hz,1H),4.89–4.81(m,2H),4.73(s,1H),4.59(d,J＝4.9Hz,1H),4.00–3.88(m,4H),2.42(q,J＝12.5,9.1Hz,2H),2.31(t,J＝7.5Hz,4H),1.78(p,J＝6.6Hz,4H),1.68(p,J＝7.6Hz,4H),1.48(dd,J＝10.6,4.8Hz,13H),1.39(t,J＝7.3Hz,9H),1.24(d,J＝3.4Hz,48H),0.89–0.83(m,12H).
步骤5：化合物1的合成
将化合物1-4(108mg，0.12mmol，1equiv)溶解在氯仿(30mL)溶液中，依次加入2-二甲氨基乙硫醇(63mg，0.6mmol，5equiv)和四氢吡硌(0.1ml，1.2mmol，10equiv)，在50℃加热条件下反应12h。TLC监测化合物1-4完全反应完。真空除去溶剂得到粗产物。通过柱色谱法(硅胶柱，洗脱液为含5-10％MeOH(体积百分比)的DCM溶液)纯化，将纯产物馏分蒸发，得到无色油状化合物1(54mg，46.9％收率)。化合物1的氢谱图见图4，1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ6.46(d,J＝2.2Hz,2H),6.33(t,J＝2.3Hz,1H),4.87(p,J＝6.3Hz,2H),3.92(t,J＝6.4Hz,4H),3.82(s,2H),2.59(d,J＝6.4Hz,2H),2.53(s,2H),2.32(t,J＝7.5Hz,4H),2.23(t,J＝3.8Hz,6H),1.79(p,J＝6.7Hz,4H),1.74–1.63(m,5H),1.50(tt,J＝6.4,4.3Hz,12H),1.30–1.21(m,55H),0.89–0.85(m,13H)。
二、可电离的阳离子化合物2的合成方法，其合成方法的路线为：
将实施例1得化合物1-4(337mg，0.367mmol，1equiv)溶解在氯仿(30mL)溶液中，依次加入3-(二甲基氨基)-1-丙硫醇(218mg，1.835mmol，5equiv)和四氢吡硌(0.3ml，3.67mmol，10equiv)，在50℃加热条件下反应12h。TLC监测化合物1-4完全反应完。真空除去溶剂得到粗产物。通过柱色谱法(硅胶柱，洗脱液为含5-10％MeOH(体积百分比)的DCM溶液)纯化，将纯产物馏分蒸发，得到无色油状化合物2(191mg，53.2％收率)。化合物2的氢谱图见图5，1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ6.45(d,J＝2.2Hz,2H),6.33(t,J＝2.2Hz,1H),4.87(p,J＝6.3Hz,2H),3.92(t,J＝6.4Hz,4H),3.81(s,2H),2.53(t,J＝7.3Hz,2H),2.30(dt,J＝12.4,7.3Hz,6H),2.20(s,6H),1.79(dtd,J＝11.0,6.6,3.2Hz,6H),1.73–1.65(m,4H),1.55–1.45(m,12H),1.26(d,J＝7.6Hz,49H),0.87(t,J＝6.8Hz,12H).
三、可电离的阳离子化合物3的合成方法，其合成方法的路线为：
将2-二甲氨基乙硫醇(3equiv)称量加入烧瓶中，抽换氮气三次后加入20mL超干THF，在负80℃温度条件下缓慢滴加正丁基锂(2equiv)，搅拌30min后将反应液转移至1-3(1equiv)的反应体系中，继续反应12h，TLC监测化合物1-3完全反应完后，真空除去溶剂，通过柱色谱法(硅胶柱，洗脱液为含5-10％MeOH(体积百分比)的DCM溶液)纯化，将纯产物馏分蒸发，得到无色油状化合物3。化合物3的氢谱图见图6，1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ6.44(d,J＝2.2Hz,2H),6.30(t,J＝2.3Hz,1H),4.86(p,J＝6.3Hz,2H),3.91(t,J＝6.5Hz,4H),3.63(s,2H),2.53(ddd,J＝8.6,6.2,1.9Hz,2H),2.50–2.42(m,2H),2.31(t,J＝7.5Hz,4H),2.27–2.23(m,1H),2.21(s,6H),1.78(p,J＝6.7Hz,4H),1.68(q,J＝7.7Hz,4H),1.49(ddt,J＝12.5,5.8,3.3Hz,13H),1.30–1.20(m,57H),0.89–0.84(m,14H).
四、可电离的阳离子化合物4的合成方法，其合成方法的路线为：
将3-(二甲基氨基)-1-丙硫醇(3equiv)称量加入烧瓶中，抽换氮气三次后加入20mL超干THF，在负80℃温度条件下缓慢滴加正丁基锂(2equiv)，搅拌30min后将反应液转移至1-3(1equiv)的反应体系中，继续反应12h，TLC监测化合物1-3完全反应完后，真空除去溶剂，通过柱色谱法(硅胶柱，洗脱液为含5-10％MeOH(体积百分比)的DCM溶液)纯化，将纯产物馏分蒸发，得到无色油状化合物4。化合物4的氢谱图见图7，1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ6.44(d,J＝2.2Hz,2H),6.30(t,J＝2.2Hz,1H),4.87(p,J＝6.3Hz,2H),3.91(t,J＝6.4Hz,4H),3.62(s,2H),2.47(t,J＝7.1Hz,4H),2.35–2.28(m,10H),1.82–1.74(m,6H),1.68(q,J＝7.6Hz,4H),1.54–1.45(m,12H),1.26(d,J＝8.0Hz,60H),0.89–0.84(m,13H).
五、可电离的阳离子化合物3的合成方法，其合成方法的路线为
将实施例1得化合物1-2(252mg，0.3mmol，1equiv)溶于20mLDCM溶液中，依次加入N,N-二甲基-Β-丙氨酸(60mg，0.5mmol，1.7equiv)，EDCI(96mg，0.5mmol，1.7equiv)。搅拌过程中加入三乙胺(0.11ml，0.9mmol，3equiv)。继续搅拌12h，TLC监测化合物1-2完全反应完，真空除去溶剂，通过柱色谱法(硅胶柱，洗脱液为含5-10％MeOH(体积百分比)的DCM溶液)纯化，将纯产物馏分蒸发，得到无色油状化合物5(100.2mg，35.3％收率)。化合物5的氢谱图见图8，1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ6.46(d,J＝2.3Hz,2H),6.37(t,J＝2.3Hz,1H),5.03(s,2H),4.87(p,J＝6.3Hz,2H),3.92(t,J＝6.4Hz,4H),2.65(dd,J＝7.5,6.1Hz,2H),2.54(dd,J＝7.5,6.2Hz,2H),2.32(t,J＝7.5Hz,5H),2.25(s,6H),1.83–1.74(m,4H),1.69(p,J＝7.5Hz,5H),1.57–1.44(m,13H),1.26(d,J＝7.4Hz,56H),0.90–0.82(m,13H).
六、可电离的阳离子化合物6的合成方法，其合成方法的路线为
将实施例1得化合物1-2(84mg，0.1mmol，1equiv)溶于20mLDCM溶液中，依次加入4-二甲基氨基丁酸盐酸盐(33mg，0.2mmol，2equiv)，EDCI(38mg，0.2mmol，2equiv)。搅拌过程中加入三乙胺(0.04ml，0.3mmol，3equiv)。继续搅拌12h，TLC监测化合物1-2完全反应完，真空除去溶剂，通过柱色谱法(硅胶柱，洗脱液为含5-10％MeOH(体积百分比)的DCM溶液)纯化，将纯产物馏分蒸发，得到无色油状化合物6(41mg，42.8％收率)。化合物6的氢谱图见图9，1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ6.45(d,J＝2.3Hz,2H),6.36(t,J＝2.3Hz,1H),5.01(s,2H),4.86(p,J＝6.3Hz,2H),3.91(t,J＝6.4Hz,4H),2.40(q,J＝7.3Hz,4H),2.31(t,J＝7.5Hz,5H),2.27(s,6H),1.86(q,J＝7.4Hz,2H),1.78(dd,J＝8.5,6.4Hz,4H),1.68(q,J＝7.6Hz,4H),1.49(tq,J＝6.4,4.1,3.5Hz,13H),1.25(d,J＝7.4Hz,58H),0.86(t,J＝6.8Hz,14H).
七、可电离的阳离子化合物7的合成方法，其合成方法的路线为
将实施例1得化合物1-2(168mg，0.2mmol，1equiv)溶于20mLDCM溶液中，依次加入5-(二甲氨基)戊酸(58mg，0.4mmol，2equiv)，EDCI(77mg，0.4mmol，2equiv)。搅拌过程中加入三乙胺(0.1ml，0.8mmol，4equiv)。继续搅拌12h，TLC监测化合物1-2完全反应完，真空除去溶剂，通过柱色谱法(硅胶柱，洗脱液为含5-10％MeOH(体积百分比)的DCM溶液)纯化，将纯产物馏分蒸发，得到无色油状化合物7(83mg，42.7％收率)。化合物7的氢谱图见图10，1HNMR(400MHz,Chloroform-d)δ6.45(d,J＝2.3Hz,2H),6.37(t,J＝2.2Hz,1H),5.01(s,2H),4.87(p,J＝6.3Hz,2H),3.92(t,J＝6.4Hz,4H),2.39(t,J＝7.4Hz,2H),2.32(t,J＝7.5Hz,6H),2.26(s,6H),1.79(p,J＝6.6Hz,4H),1.72–1.65(m,7H),1.50(tt,J＝8.2,4.0Hz,14H),1.31–1.18(m,56H),0.90–0.83(m,14H).
八、可电离的阳离子化合物8的合成方法，其合成方法的路线为
一种可电离的阳离子化合物8的合成方法，包括如下步骤：
步骤1：化合物8-1的合成
将实施例1得化合物1-2(844mg，1mmol，1equiv)溶于40mLDCM溶液中，0℃环境下依次加入对硝基氯甲酸苯酯(402mg，2mmol，2equiv)，DMAP(12mg，0.1mmol，0.1equiv)。搅拌过程中加入三乙胺(0.35ml，2mmol，2equiv)。继续在0℃下搅拌2h，TLC监测化合物1-2完全反应完，真空除去溶剂，快速通过柱色谱法(硅胶柱，洗脱液为PE:EA＝13:1)纯化，将纯产物馏分蒸发，得到无色油状化合物8-1(800mg，79.2％收率)。化合物8-1的氢谱图见图11，1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.32–8.24(m,3H),7.42–7.35(m,3H),6.53(d,J＝2.2Hz,2H),6.43(t,J＝2.3Hz,1H),5.20(s,2H),4.87(p,J＝6.3Hz,3H),4.29(t,J＝6.6Hz,1H),3.94(t,J＝6.4Hz,4H),2.33(td,J＝7.4,1.5Hz,5H),1.80(td,J＝7.3,3.6Hz,4H),1.72–1.67(m,4H),1.57(s,4H),1.50(ddt,J＝8.1,5.9,2.7Hz,14H),1.31–1.20(m,66H),0.89–0.84(m,16H).
步骤2：化合物8的合成
将化合物8-1(89mg，0.09mmol，1equiv)溶解在20mL超干THF溶液中，加入N,N-二甲基乙醇胺(80mg，0.9mmol，10equiv)。搅拌反应12h，TLC监测化合物8-1完全反应完，真空除去溶剂，通过柱色谱法(硅胶柱，洗脱液为含5-10％MeOH(体积百分比)的DCM溶液)纯化，将纯产物馏分蒸发，得到无色油状化合物8(30mg，34.7％收率)。化合物8的氢谱图见图12，1HNMR(400MHz,Chloroform-d)δ6.48(d,J＝2.2Hz,2H),6.38(t,J＝2.3Hz,1H),5.06(s,2H),4.87(p,J＝6.3Hz,2H),4.28–4.21(m,2H),3.92(t,J＝6.4Hz,4H),2.61(td,J＝5.8,1.6Hz,2H),2.33(d,J＝7.4Hz,4H),2.29(d,J＝1.3Hz,6H),1.78(dd,J＝8.6,6.3Hz,4H),1.72–1.65(m,4H),1.55–1.45(m,12H),1.26(d,J＝7.5Hz,53H),0.90–0.84(m,12H).
九、可电离的阳离子化合物9的合成方法，其合成方法的路线为
将化合物8-1(60mg，0.06mmol，1equiv)溶解在20mL超干THF溶液中，加入3-二甲氨基-1-丙醇(62mg，0.6mmol，10equiv)。搅拌反应12h，TLC监测化合物8-1完全反应完，真空除去溶剂，通过柱色谱法(硅胶柱，洗脱液为含5-10％MeOH(体积百分比)的DCM溶液)纯化，将纯产物馏分蒸发，得到无色油状化合物9(24mg，44.1％收率)。化合物9的氢谱图见图13，1HNMR(400MHz,Chloroform-d)δ6.48(d,J＝2.2Hz,2H),6.38(t,J＝2.3Hz,1H),5.05(s,2H),4.86(p,J＝6.3Hz,2H),4.21(t,J＝6.4Hz,2H),3.92(t,J＝6.4Hz,4H),2.45(t,J＝7.5Hz,2H),2.32(d,J＝7.4Hz,4H),2.29(s,6H),1.94–1.85(m,2H),1.78(p,J＝6.6Hz,4H),1.68(q,J＝7.6Hz,4H),1.55–1.46(m,13H),1.26(d,J＝13.4Hz,60H),0.89–0.84(m,14H)
十、可电离的阳离子化合物10的合成方法，其合成方法的路线为
将化合物8-1(200mg，0.2mmol，1equiv)溶解在20mL超干THF溶液中，加入二甲氨丁醇(200mg，2mmol，10equiv)。搅拌反应12h，TLC监测化合物8-1完全反应完，真空除去溶剂，通过柱色谱法(硅胶柱，洗脱液为含5-10％MeOH(体积百分比)的DCM溶液)纯化，将纯产物馏分蒸发，得到无色油状化合物10(79mg，40％收率)。化合物10的氢谱图见图14，1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ6.48(d,J＝2.3Hz,2H),6.38(t,J＝2.3Hz,1H),5.06(s,2H),4.87(p,J＝6.3Hz,2H),4.17(t,J＝6.4Hz,2H),3.92(t,J＝6.4Hz,4H),2.37(t,J＝7.7Hz,2H),2.31(d,J＝7.6Hz,4H),2.28(s,6H),1.78(dd,J＝8.5,6.4Hz,4H),1.74–1.66(m,6H),1.61(q,J＝8.2Hz,2H),1.54–1.45(m,12H),1.26(d,J＝8.6Hz,48H),0.89–0.84(m,12H).
十一、可电离的阳离子化合物11的合成方法，其合成方法的路线为
一种可电离的阳离子化合物11的合成方法，包括如下步骤：
步骤1：化合物11-1的合成
将化合物1-1(2580mg，6mmol，3equiv)溶解在超干DMF(50mL)溶液中，加入3，5二羟基苯甲醇(280mg，2mmol，1equiv)和无水碳酸钾(2760mg，20mmol，10equiv)以及碘化钾(33.2mg，0.2mmol，0.1equiv)，在80℃加热环境下反应24h。TLC监测反应完成之后，将反应混合物用乙酸乙酯洗涤，过滤得到的溶液用乙酸乙酯和饱和食盐水萃取，最后用饱和氯化锂萃取，萃取8-10次后将合并有机相层，用无水Na2SO4干燥。经真空除去溶剂后通过柱色谱法(硅胶柱，洗脱液为PE:EA＝10：1)纯化，并将纯产物馏分蒸发，得到无色油状化合物11-1(213mg，收率21.4％)。化合物11-1的氢谱图如图15，1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ6.52–6.40(m,2H),6.34(t,J＝2.3Hz,1H),4.93–4.79(m,1H),4.58(d,J＝3.8Hz,2H),3.92(td,J＝6.5,3.0Hz,2H),2.32(td,J＝7.5,1.6Hz,2H),1.77(ddt,J＝12.0,9.6,4.1Hz,2H),1.68(qd,J＝7.6,2.0Hz,2H),1.56–1.43(m,6H),1.26(d,J＝7.8Hz,24H),0.87(td,J＝6.8,1.4Hz,6H).
步骤2：化合物11-2的合成
将化合物11-1(147.6mg，0.3mmol，1equiv)溶解在超干DMF(20mL)溶液中，依次加入化合物12-1(105mg，0.3mmol，1equiv)，无水K2CO3(414mg，3mmol，10equiv)，以及KI(5mg，0.03mmol，0.1equiv)。80℃加热环境下反应24h。TLC监测反应反应完成之后，将反应混合物用乙酸乙酯洗涤，过滤得到的溶液用乙酸乙酯和饱和食盐水萃取，最后用饱和氯化锂溶液萃取，萃取8-10次后将合并有机相层，用无水Na2SO4干燥。经真空除去溶剂后通过柱色谱法(硅胶柱，洗脱液为PE:EA＝10：1)纯化，并将纯产物馏分蒸发，得到无色油状化合物11-2。化合物11-2的氢谱图如图16，1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ6.49(d,J＝2.2Hz,2H),6.35(t,J＝2.3Hz,1H),4.89–4.84(m,1H),4.61(s,2H),4.06(t,J＝6.8Hz,3H),3.93(t,J＝6.4Hz,4H),2.32(td,J＝7.5,4.6Hz,5H),1.81–1.75(m,4H),1.69(dt,J＝15.2,7.4Hz,8H),1.60(q,J＝7.1Hz,4H),1.50(dq,J＝8.0,5.0Hz,9H),1.31–1.20(m,58H),0.88(dd,J＝6.6,2.8Hz,9H).
步骤3：化合物11的合成
将化合物11-2(80mg，0.1mmol，1equiv)溶于20mLDCM溶液中，依次加入4-二甲基氨基丁酸盐酸盐(33mg，0.2mmol，2equiv)，EDCI(38mg，0.2mmol，2equiv)。搅拌过程中加入三乙胺(0.04ml，0.3mmol，3equiv)。继续搅拌12h，TLC监测化合物1-2完全反应完，真空除去溶剂，通过柱色谱法(硅胶柱，洗脱液为含5-10％MeOH(体积百分比)的DCM溶液)纯化，将纯产物馏分蒸发，得到无色油状化合物6(41mg，46.9％收率)。化合物11的氢谱图见图17，1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ6.45(d,J＝2.2Hz,2H),6.37(d,J＝2.3Hz,1H),5.02(s,2H),4.86(p,J＝6.3Hz,1H),4.05(t,J＝6.8Hz,2H),3.92(t,J＝6.4Hz,4H),2.44(dt,J＝16.1,7.4Hz,4H),2.35–2.29(m,10H),1.90(q,J＝7.4Hz,2H),1.79(d,J＝7.3Hz,4H),1.72–1.66(m,4H),1.55–1.45(m,9H),1.31–1.21(m,49H),0.87(td,J＝6.9,2.8Hz,11H).
十二、可电离的阳离子化合物12的合成方法，其合成方法的路线为
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一种可电离的阳离子化合物12的合成方法，包括如下步骤：
步骤1：化合物12-1的合成
室温条件下，向溴己酸(1950mg，10mmol，1equiv)和1-十一醇(1384mg，8mmol，0.8equiv)的混合DCM溶液(50mL)中加DMAP(1464mg，12mmol，1.2equiv)和EDCI(2304mg，12mmol，1.2equiv)，室温下搅拌8h，经TLC检测显示醇完全消失，真空除去溶剂，得到粗产物，将粗产物通过柱色谱法(硅胶柱，洗脱液为PE:EA＝20：1)纯化，并将纯产物馏分蒸发，得到无色油状化合物12-1(2375mg，收率85％)。化合物12-1的氢谱图如图18，1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ4.06(t,J＝6.8Hz,2H),3.41(t,J＝6.8Hz,2H),2.32(t,J＝7.4Hz,2H),1.92–1.82(m,2H),1.70–1.59(m,4H),1.52–1.44(m,2H),1.33(s,2H),1.26(d,J＝4.4Hz,14H),0.90–0.85(m,3H).
步骤2：化合物12-2的合成
将化合物12-1(2100mg，6mmol，3equiv)溶解在超干DMF(40mL)溶液中，加入3，5二羟基苯甲醇(280mg，2mmol，1equiv)和无水碳酸钾(2760mg，20mmol，10equiv)以及碘化钾(33.2mg，0.2mmol，0.1equiv)，在80℃加热环境下反应24h。TLC监测反应完成之后，将反应混合物用乙酸乙酯洗涤，过滤得到的溶液用乙酸乙酯和饱和食盐水萃取，最后用饱和氯化锂萃取，萃取8-10次后将合并有机相层，用无水Na2SO4干燥。经真空除去溶剂后通过柱色谱法(硅胶柱，洗脱液为PE:EA＝15：1)纯化，并将纯产物馏分蒸发，得到无色油状化合物12-2(392mg，收率29％)。化合物12-2的氢谱图如图19，1HNMR(400MHz,Chloroform-d)δ6.49(d,J＝2.2Hz,2H),6.35(t,J＝2.3Hz,1H),4.61(s,2H),4.06(t,J＝6.7Hz,6H),3.94(t,J＝6.4Hz,4H),3.65(t,J＝6.5Hz,2H),2.32(td,J＝7.5,5.7Hz,6H),1.83–1.74(m,4H),1.72–1.66(m,4H),1.64–1.54(m,15H),1.51–1.46(m,4H),1.32–1.22(m,50H),0.88(t,J＝6.7Hz,10H).
步骤3：化合物12的合成
将化合物12-2(203mg，0.3mmol，1equiv)溶于20mLDCM溶液中，依次加入4-二甲基氨基丁酸盐酸盐(100mg，0.6mmol，2equiv)，EDCI(115.2mg，0.6mmol，2equiv)，搅拌过程中加入三乙胺(0.15ml，1.2mmol，4equiv)。继续搅拌12h，TLC监测化合物12-2完全反应完，真空除去溶剂，通过柱色谱法(硅胶柱，洗脱液为含5-10％MeOH(体积百分比)的DCM溶液)纯化，将纯产物馏分蒸发，得到无色油状化合物12(104mg，43.8％收率)。化合物12的氢谱图如图20，1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ6.45(d,J＝2.2Hz,2H),6.37(t,J＝2.3Hz,1H),5.02(s,2H),4.06(t,J＝6.7Hz,4H),3.92(t,J＝6.4Hz,4H),2.41(t,J＝7.4Hz,2H),2.33(t,J＝7.5Hz,6H),2.25(s,6H),1.89–1.81(m,2H),1.78(dd,J＝8.6,6.5Hz,4H),1.73–1.65(m,4H),1.65–1.56(m,4H),1.54–1.44(m,4H),1.31–1.22(m,32H),0.90–0.85(m,6H).
十三、可电离的阳离子化合物13的合成方法，其合成方法的路线为
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步骤1：化合物13-1的合成
将化合物1-1(1290mg，3mmol，3equiv)溶解在超干DMF(50mL)溶液中，加入3,4-二羟基苄醇(140mg，1mmol，1equiv)和无水碳酸钾(1380mg，10mmol，10equiv)以及碘化钾(16.6mg，0.1mmol，0.1equiv)，在80℃加热环境下反应24h。TLC监测反应完成之后，将反应混合物用乙酸乙酯洗涤，过滤得到的溶液用乙酸乙酯和饱和食盐水萃取，最后用饱和氯化锂萃取，萃取8-10次后将合并有机相层，用无水Na2SO4干燥。经真空除去溶剂后通过柱色谱法(硅胶柱，洗脱液为PE:EA＝15：1)纯化，并将纯产物馏分蒸发，得到无色油状化合物13-1(215mg，收率25.2％)。直接用于下一步反应。
步骤2：化合物13的合成
将化合物13-1(84mg，0.1mmol，1equiv)溶于20mLDCM溶液中，依次加入4-二甲基氨基丁酸盐酸盐(33mg，0.2mmol，2equiv)，EDCI(38mg，0.2mmol，2equiv)。搅拌过程中加入三乙胺(0.04ml，0.3mmol，3equiv)。继续搅拌12h，TLC监测化合物1-2完全反应完，真空除去溶剂，通过柱色谱法(硅胶柱，洗脱液为含5-10％MeOH(体积百分比)的DCM溶液)纯化，将纯产物馏分蒸发，得到无色油状化合物6(43mg，44.1％收率)。化合物13的氢谱图见图21，1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ6.90–6.80(m,3H),5.01(s,2H),4.87(q,J＝6.2Hz,2H),3.97(td,J＝6.7,1.9Hz,4H),2.39(t,J＝7.4Hz,4H),2.32(dd,J＝7.4,1.9Hz,4H),2.29(s,6H),1.83(tdd,J＝9.8,6.6,3.3Hz,6H),1.69(tt,J＝7.4,3.6Hz,4H),1.55–1.45(m,13H),1.25(d,J＝7.4Hz,53H),0.86(t,J＝6.7Hz,12H).
十四、对照化合物的合成
选取自己实验室发明的具有良好转染效率的可电离脂质中的化合物作为对照，对照化合物结构如上式所示，对照化合物采用“CN202310896945.5”中方法制备获得。
实施例2：脂质纳米粒的制备
将可电离的阳离子化合物、DSPC(艾伟拓(上海)医药科技有限公司)、胆固醇(艾伟拓(上海)医药科技有限公司)和DMG-PEG 2000(艾伟拓(上海)医药科技有限公司)以50:10:38.5:1.5的摩尔比溶于乙醇，获得乙醇相溶液；将治疗或预防剂加到10至50mM柠檬酸盐缓冲液(pH＝4)中，获得水相溶液；将体积比为2:1的乙醇相溶液和水相溶液混合，以制备脂质纳米粒，并通过多次DPBS超滤洗涤以除去乙醇和游离分子，最后，脂质纳米粒通过0.2μm无菌过滤器过滤以备用。
表1中，mRNA(Luciferase mRNA，购自APExBIO公司)浓度为1mg/mL，体积为40μL且水相总体积为900μL，可电离脂质浓度为10mg/mL，体积为40μL且有机相总体积为450μL，胆固醇浓度为5mg/mL，PEG浓度为5mg/mL，辅助脂质浓度为5mg/mL，可电离脂质与mRNA的重量比约为10:1，采用微流控混合法，让脂质溶液与和mRNA溶液在微混合器中充分、迅速的形成粒径均一的LNP，具体为：将制剂在透析盒中针对PBS(pH 7.4)透析至少2小时。使用超离心过滤器浓缩制剂，使其通过0.22mm过滤器，并在4℃下储存直至使用。通过形成的14组样品，进行以下的测试。
表1脂质纳米粒的成分
实施例3：脂质纳米粒的理化性质
使用Malvern Zetasizer Nano ZS ZEN3600(Malvern UK)通过动态光散射测定脂质纳米粒1～13及对照组的大小及多分散指数，并测定其Zeta电位；使用Quant-itRibogreen RNA定量测定试剂盒(Thermo Fisher Scientific,UK)测定脂质纳米粒的包封率，测试结果见表2。
表2脂质纳米粒的理化性质
| 编号 | Size(nm) | PDI | Z电位(mV) | 包封率(％) | pKa |
| 1 | 84.04 | 0.27 | -6.87 | 95.6 | 5.278 |
| 2 | 80.92 | 0.07 | -1.95 | 100 | 6.043 |
| 3 | 76.59 | 0.11 | -2.34 | 96.6 | 5.789 |
| 4 | 110.07 | 0.07 | -1.66 | 100 | 6.374 |
| 5 | 70.98 | 0.08 | -0.68 | 94.8 | 5.488 |
| 6 | 80.07 | 0.09 | 2.32 | 100 | 6.715 |
| 7 | 75.55 | 0.11 | 13.16 | 98.4 | 7.333 |
| 8 | 69.67 | 0.17 | -4.51 | 95.1 | 5.792 |
| 9 | 80.67 | 0.12 | -2.27 | 97.5 | 6.412 |
| 10 | 100.44 | 0.14 | -6.50 | 87.4 | 6.748 |
| 11 | 91.21 | 0.09 | -0.18 | 98.9 | 7.217 |
| 12 | 133.80 | 0.19 | 6.64 | 96.4 | 7.158 |
| 13 | 90.03 | 0.06 | 7.37 | 100 | 7.372 |
| 14 | 86.85 | 0.02 | 7.75 | 100 | 6.846 |
从表2可以看出，本发明脂质纳米粒的粒径为70至140nm，Zeta电位为-10至15mV，包封率＞87％。
实施例4：脂质纳米粒的转染mRNA的效率
通过Luciferase生物发光评估脂质纳米粒转染mRNA的效率，具体步骤如下：在黑边透明底的96孔板中接种40000个293T细胞/孔，过夜培养，以每孔剂量为0.2μg mRNA的Luciferase mRNA脂质纳米粒转染293T细胞，游离的Luciferase mRNA作为对照组也转染细胞，转染24小时后，去掉旧培养基，换成含D-荧光素钠(1.5mg/mL)底物的新培养基，并孵育5分钟后，使用TACAN(SPARK)酶标仪检测生物发光，脂质纳米粒转染Luciferase mRNA的转染效率详见图22。
从图22可以看出，本发明制备的脂质纳米粒具有优异的转染效果，转染效果最优的是化合物11制备的脂质纳米粒。
从原理上看，将生物降解性引入可电离脂质的常见策略是通过包含在生理pH下稳定但在组织和细胞内酶促水解的酯键。不同类型的化学键的降解性会有所不同，会导致LNP在体内有不同的循环周期，降解过快会导致较差的效力，因此引入生物降解性需要平衡活性-降解性权衡以最大化总效益。同时酯基的位置和空间效应可以极大地影响可电离脂质清除率和效力。所以导致Linker为酯键的化合物11在保证生物安全性的同时表现出最佳的转染效率。
此外，化合物11相较于化合物6、化合物12，R2、R4两条尾部的结构不同，这样不同疏水链的选择提高了组装效率、递送效率，进而提高了转染效率。从原理上看，引入支链的酯基R2可以增强其蛋白表达能力，直链的酯基R4的水解是脂质代谢的第一步，过量的R4由于快速的降解会减弱蛋白表达，不同的尾部可以平衡转染效率和降解性，增强转染效率。
实施例5：脂质纳米粒的安全性和内涵体逃逸能力测试
mRNA逃逸的实现，主要是因为pH敏感性脂质体在胞内酸性环境(pH＝3-5.5)中破坏内涵体膜而实现的。以下实验模拟了LNP在中性pH环境下与细胞膜的相互作用；以及胞内内涵体的酸性pH环境中，LNP和内涵体膜的相互作用；从而验证可电离脂质化合物制备得到的LNP的安全性和内涵体逃逸能力。通过脂质纳米粒在体外的溶血实验来验证，具体操作如下：分别将mRNA终浓度为5μg/ml的游离mRNA或脂质纳米粒与小鼠红细胞溶液(最终体积百分比等于4％)在37℃条件下共孵育1小时，然后离心收集上清液，并测定上清液在575nm的紫外吸收来证明溶血情况，在中性和酸性条件下，化合物1～12及对照化合物制备得到的脂质纳米粒的溶血情况分别如图23和图24所示。
从图23可以看出，在中性pH环境中红细胞溶解率很低，脂质纳米粒对细胞膜的破坏作用很低，不会引起溶血现象，这表明实施例1获得的可电离的阳离子化合物1～12具有优异的生物安全性，尤其是除化合物7外的其余化合物，溶血率均低于2％，安全性极佳。
由图24可知：本发明结构特征的可电离脂质化合物制备得到的LNP在酸性pH环境中红细胞溶解率较中性环境显著提高，说明本发明结构特征的可电离脂质能够在进入细胞后，在内涵体内破坏内涵体膜的作用较强，显示较强的内涵体逃逸作用，由此产生较高的转染效率，其中化合物11、化合物7的内涵体逃逸作用强，对应具有最好的转染效率。
综上所述，由化合物11制备的脂质纳米颗粒在具有较好内涵体逃逸能力的同时安全性也较好。化合物11含有多个可降解酯键，体内循环周期较短，故而有良好的生物安全性。相较于其他可电离脂质，化合物11具有适中数量的尾部，可能是其具有良好内涵体逃逸的原因。
实施例6：脂质纳米粒的细胞毒性测试
通过市售的细胞增殖检测试剂盒(MTS，Promega)评估脂质纳米粒的细胞毒性，在96孔板中接种40000个293T细胞/孔，过夜培养，以每孔剂量为0.2μg mRNA的LuciferasemRNA脂质纳米粒转染293T细胞，对照化合物作为阳性对照，转染24小时后，去掉旧培养基，换成含MTS的新培养基，在培养箱中孵育2小时左右，使用TACAN(SPARK)酶标仪检测490nm处吸光度，脂质纳米粒的细胞毒性如图25所示。从图25可以看出，脂质纳米粒具有具有较低的细胞毒性，这表明实施例1合成获得的可电离的阳离子化合物1～13具有较好的生物安全性。
其中，化合物1，2，11制备的脂质纳米颗粒具有较低的细胞毒性。这些可离脂质结构中均含有可降解的化学键，分解速度较快，因此具有较低的细胞毒性。
其中化合物1，2的毒性较低，是由于本发明首次在可电离的苯环类阳离子化合物中引入了二硫键-S-S-，由于胞内的谷胱甘肽(GSH)浓度相较于胞外要高，在进入胞内之后，化合物可以与GSH发生响应，然后二硫键断裂，阳离子脂材可以迅速代谢，将mRNA迅速释放，从而提高了转染效率，降低了毒性；化合物11的毒性较低，是由于化合物11中含有多个酯键，且酯键位于合适的化学环境利于脱去，降解速率极快，因此毒性较低。
因此根据实施例4～实施例6内容，化合物11制备的脂质纳米颗粒具有最佳的mRNA转染及递送效率、安全性和内涵体逃逸能力、以及极低的毒性；从结构上来看，化合物11的三条尾部结构均不同，含N的链上含有酯基，有利于mRNA的递送和转染，另外两条尾部的链长度适中，因此具有良好的内涵体逃逸能力，此外结构中含有多个酯键，且酯键位于合适的化学环境利于脱去，降解速率快，因此具有较低的细胞毒性。
对比苯环上不同取代位置，可以发现三条尾部相间的结构的化合物毒性更低，为优选；对比R2和R4不同或相同的选择，R2和R4不同地选自 时mRNA的递送和转染的效率更高，为优选；对比A的选择，A为二硫键时毒性低，A为酯键时mRNA的递送和转染的效率更高，为优选；对比碳链长度，m＝3时总体效果更好，为优选。
虽然本发明披露如上，但本发明并非限定于此。任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种更动与修改，因此本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。
Claims (10)
1.一种可电离的阳离子化合物，其特征在于，具有如式(Ⅰ)所示的结构，或者含有式(Ⅰ)所示的结构的盐或衍生物，
其中，R1、R2、R3、R4、R5中的任意两个为另外三个为H，
m、n大于或等于1，A选自-S-、-S-S-、-COO-、-O-CO-O-中的任意一种，R’为碳原子数量大于或等于1的脂肪链。
2.如权利要求1所述的可电离的阳离子化合物，其特征在于，所述R2、R4为R1、R3、R5为H。
3.如权利要求2所述的可电离的阳离子化合物，其特征在于，所述m选自2、3、4中的一种，n选自2-12中的一种。
4.如权利要求3所述的可电离的阳离子化合物，其特征在于，所述A选自-COO-或-S-S-。
5.如权利要求4所述的可电离的阳离子化合物，其特征在于，所述R’为直链或者支链；包含或者不包含酯基。
6.如权利要求5所述的可电离的阳离子化合物，其特征在于，R2和R4各自独立选自
7.如权利要求6所述的可电离的阳离子化合物，其特征在于，所述m选自2-6中的一种。
8.一种脂质复合物，其特征在于，包括如权利要求1～7任一项所述的可电离的阳离子化合物、治疗或预防剂，还包括磷脂、结构性脂质、聚乙二醇化脂质中的任意一种或多种。
9.如权利要求1～7任一项所述的可电离的阳离子化合物用于制备提高脂质复合物的递送效率和/或转染效率的制剂的用途。
10.如权利要求1～7任一项所述的可电离的阳离子化合物用于制备降低脂质复合物的细胞毒性的制剂的用途。
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