CN117486832A - 一种能够实现早期溶酶体逃逸的用于rna递送的阳离子脂质分子 - Google Patents

一种能够实现早期溶酶体逃逸的用于rna递送的阳离子脂质分子 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种可电离阳离子脂质化合物，其通过可电离的含胺的脂质分子在弱酸环境下触发质子化，不仅能够增强与RNA之间的静电相互作用，提高RNA的负载率，还能够在早期溶酶体内的弱酸环境下(pH≈6.0‑6.5)发生质子化，引发“质子海绵效应”，实现RNA从早期溶酶体逃逸，从而快释放，提高其表达效率。

Description

一种能够实现早期溶酶体逃逸的用于RNA递送的阳离子脂质 分子
技术领域
本发明属于核酸递送技术领域，尤其涉及一种能够实现早期溶酶体逃逸的递送RNA的可电离阳离子脂质分子，其制备方法、递送系统、及应用。
背景技术
以RNA为基础的治疗疗法，通过递送siRNA来沉默致病基因，或通过递送外源mRNA到细胞来表达治疗蛋白，在各种疾病的治疗中具有巨大的应用潜力。由于mRNA不存在整合到宿主基因组的风险，也不需要进入细胞核进行翻译，因此即使在不分裂的细胞中也可以正常表达，产生目的蛋白来获得治疗效果。目前，基于mRNA 的疗法被视为安全且实用的治疗策略并在多种疾病展现出治疗潜力，包括恶性肿瘤、传染性疾病和各种遗传性疾病等。然而，RNA 疗法也面临着巨大的挑战，如mRNA体积较大、具有一定的免疫原性、细胞摄取有限以及对RNA酶敏感降解等，这些都极大的阻碍了其作为治疗药物的应用。更为重要的是，即使RNA经过以上重重障碍进入细胞后，还需要及早的逃脱溶酶体以避免溶酶体酶的降解。虽然mRNA修饰可在一定程度上增加稳定性，然而RNA被递送到受体细胞的细胞质并且实现早期溶酶体逃逸需要更为安全、高效的转运载体。
脂质纳米颗粒(LNPs)是目前最先进的RNA递送体系，它能够为 mRNA递送提供相对稳定的保护性载体。基于LNP的新冠疫苗由于其高效、持久、安全的免疫效果而备受关注。另外，用于其他相关疾病治疗的基于LNP 递送技术的mRNA疫苗也已经进入人体或灵长动物安全性评估阶段。例如，非人类灵长类动物中Fabry病的临床前研究，弗里德赖希共济失调和甲基丙二酸的疾病动物模型，寨卡病毒和流感病毒的免疫原性的临床前和临床试验研究等等。然而，由于LNPs的内体逃逸能力有限，限制了其作为RNA递送载体的使用。事实上，绝大部分 LNPs能够被细胞内吞或者吸收，但仅有大约2％的mRNA能够发挥作用。大多数没有从早期溶酶体破膜逃逸的mRNA将面临着被溶酶体降解的命运，这也为mRNA的高效递送带来巨大的障碍。因此，开发能够实现早期溶酶体逃逸的LNP体递送体系，实现mRNA的高效递送，对于提高mRNA疗法的治疗疗效具有重要的意义。
由于现有LNP负载mRNA能力有限，进入细胞后无法高效完成溶酶体逃逸，大多数mRNA无法被释放进入细胞质翻译成蛋白质发挥功能。因此，仍然需要设计一种更高效的LNP核酸递送策略。
发明概述
本发明的可电离阳离子脂质分子通过可电离的含胺的脂质分子在弱酸环境下触发质子化，不仅能够增强与mRNA之间的静电相互作用，提高mRNA的负载率；此外还能够在早期溶酶体内的弱酸环境下(pH≈6.0-6.5)发生质子化，引发“质子海绵效应”，实现早期溶酶体逃逸，从而快速释放mRNA，提高其表达效率。
在一些实施方案中，本发明提供一种弱酸环境下易发生质子化的阳离子脂质化合物，其具有式(I)结构：
第二方面，本发明提供一种包含式(I)阳离子脂质化合物的脂质纳米颗粒。
第三方面，本发明提供一种药物组合物，包含式(I)阳离子脂质化合物或其脂质纳米颗粒。
第四方面，本发明提供一种包含式(I)阳离子脂质化合物或其脂质纳米颗粒的药物组合物在疾病的诊断或治疗中用途。
第五方面，本发明提供一种包含式(I)阳离子脂质化合物或其脂质纳米颗粒在制备用于疾病的诊断或治疗组合物中的用途。
第六方面，本发明提供一种脂质纳米颗粒的制备方法，所述脂质纳米颗粒包含式(I)阳离子脂质化合物。
第七方面，本发明提供一种式(I)阳离子脂质分子的合成方法。
本发明技术通过调节阳离子脂质分子与其他脂质分子的比例，以及与RNA的比例，制备了对RNA高效包载的脂质纳米颗粒 (LNPs)，实现了良好的递送和表达效果。本发明技术的脂质分子易于合成，成本低廉，生物相容性好；所形成的LNPs具有较高的 mRNA递送效率，促进mRNA表达；并适用于不同核酸分子量长度，不同核酸序列的mRNA组装及递送，易于临床推广，在mRNA治疗领域具备广阔的应用前景。
发明详述
阳离子脂质化合物
在一些实施方案中，本发明提供一种弱酸环境下易发生质子化的阳离子脂质化合物，其具有式(I)结构。
首先获得以下分子骨架，对该分子骨架的氨基进行修饰，以引入可质子化的结构。
R1，R2为分支或未分支、环状或非环状的、饱和或者非饱和的 C2-30的脂肪烃基。
R3，R4为通过酰胺键、氨基甲酸酯、酯键等化学键连接的胺类结构，所述胺类结构包括环状或非环状的伯胺、仲胺和叔胺。
R3，R4的具体结构可独立选自：
通式中胺类A选自：
n＝1-20，m＝0-20，通式中A为以上结构中的一种。
在一些实施方案中，R1，R2独立的选自分支或未分支、环状或非环状的、饱和或者非饱和的C2-30的脂肪烃基。C2-30的脂肪烃基包括C2脂肪烃基至C30脂肪烃基中间的任意整数碳原子的情形。
优选地，R1，R2为分支或未分支、环状或非环状的、饱和或者非饱和的C10-20的脂肪烃基。
最优选地，R1，R2为分支或未分支、环状或非环状的、饱和或者非饱和的C12-18的脂肪烃基。
进一步优选地，R1，R2为分支或未分支、环状或非环状的、非饱和的C12-18的脂肪烃基。
更优选地，R1，R2为分支或未分支、非环状的、非饱和的C12-18的脂肪烃基。
优选地，对于R3，R4为结构式通式(1)和(6)的结构，其中 n＝1-20。
更优选地，对于R3，R4为结构式通式(1)和(6)的结构，其中n＝1-5。
最优选地，对于R3，R4为结构式通式(1)和(6)的结构，其中n＝1-3。
对于R3，R4为结构式通式(1)的结构，其中氮杂环烷烃的结构 A：
优选地，氮杂环烷烃为四氢吡咯、哌啶、环己亚胺和氮杂环庚烷、氮杂环辛烷。
更优选地，氮杂环烷烃为环己亚胺、氮杂环庚烷。
最优选地，氮杂环烷烃为氮杂环庚烷。
对于R3，R4为结构式通式(3)、(4)、(5)、(6)、(7)、 (8)的结构，通过脂质骨架N1的氨基与一定结构的溴代羧酸、溴代胺以及溴代醇反应，增加可进行酯化或者酰胺化反应的位点，并使原骨架N1的伯胺转化成为仲胺或者叔胺，可作为第二质子化位点。
优选地，对于R3，R4为结构式通式(3)、(4)、(5)、(6)、 (7)、(8)的结构，其氮杂环烷烃为四氢吡咯、哌啶、环己亚胺和氮杂环庚烷。
更优选地，对于R3，R4为结构式通式(3)、(4)、(5)、(6)、 (7)、(8)的结构，其氮杂环烷烃为哌啶、环己亚胺和氮杂环庚烷。。
最优选地，对于R3，R4为结构式通式(3)、(4)、(5)、(6)、 (7)、(8)的结构，其氮杂环烷烃为环己亚胺和氮杂环庚烷。
优选地，对于R3，R4为结构式通式(3)、(4)、(5)、(6)、(7)、(8)的结构，其中n＝1-20。
更优选地，对于R3，R4为结构式通式(3)、(4)、(5)、(6)、(7)、(8)的结构，其中n＝1-5。
最优选地，对于R3，R4为结构式通式(3)、(4)、(5)、(6)、 (7)、(8)的结构，其中n＝1-2。
优选地，对于R3，R4为结构式通式(3)、(4)、(5)、(6)、 (7)、(8)的结构，其中m＝1-20。
更优选地，对于R3，R4为结构式通式(3)、(4)、(5)、(6)、 (7)、(8)的结构，其中m＝1-5。
本发明具体的阳离子脂质化合物可以选自：
脂质纳米颗粒
在另一些实施方案中，本发明提供一种包含式(I)阳离子脂质化合物的脂质纳米颗粒。该脂质分子中的仲胺以及环状含氮杂环具有弱酸环境下响应能力，有利于在胞质内体循环初期即实现早期溶酶体逃逸，提高RNA释放以及蛋白表达。
在一些实施方案中，本发明提供一种脂质纳米颗粒，其包含本发明的式(I)阳离子脂质化合物。本发明的式(I)阳离子脂质化合物与其他脂质分子共同制备包载RNA的脂质纳米颗粒(LNPs)。
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含本发明的式(I)阳离子脂质化合物，以及中性脂质、聚乙二醇脂质、甾族脂质中的一种或数种。
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒的脂主要包含四种成分：可离子化的本发明的式(I)阳离子脂质化合物、中性脂质、聚乙二醇脂质和甾族脂质。
聚乙二醇脂质选自：2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-二十四烷基乙酰胺(ALC-0159)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油甲氧基聚乙二醇 (PEG-DMG)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基(聚乙二醇)](PEG-DSPE)、PEG-二甾醇基甘油(PEG-DSG)、PEG-二棕榈油基、PEG-二油基、PEG-二硬脂基、PEG-二酰基甘油酰胺(PEG-DAG)、 PEG-二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(PEG-DPPE)或PEG-1,2-二肉豆蔻酰基氧基丙基-3-胺(PEG-c-DMA)。
中性脂质选自：1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2- 二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPPE)、1,2- 二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DMPE)、2-二油酰基-sn-甘油-3- 磷酸-(1'-rac-甘油)(DOPG)、油酰磷脂酰胆碱(POPC)、1-棕榈酰基 -2-油酰基磷脂酰乙醇胺(POPE)。
甾族脂质选自：燕麦甾醇、β-谷甾醇、菜子甾醇、麦角骨化醇、菜油甾醇、胆甾烷醇、胆固醇、粪甾醇、脱氢胆固醇、链甾醇、二氢麦角骨化醇、二氢胆固醇、二氢麦角甾醇、黑海甾醇、表胆甾醇、麦角甾醇、岩藻甾醇、六氢光甾醇、羟基胆固醇；羊毛甾醇、光甾醇、海藻甾醇、谷甾烷醇、谷甾醇、豆甾烷醇、豆甾醇、胆酸、甘氨胆酸、牛磺胆酸、脱氧胆酸和石胆酸。
在一些实施方案中，本发明的阳离子脂质化合物在全部脂质中的重量比为10％-70％，优选30％-60％，50％；
在一些实施方案中，聚乙二醇脂质在全部脂质中的重量比为 1％-20％，优选1％-10％，2％。
在一些实施方案中，胆固醇在全部脂质中的重量比为5％-60％，优选10％-50％，40％。
在一些实施方案中，DSPC在全部脂质中的重量比为1％-30％，优选5％-15％，8％。
在一些实施方案中，本发明的脂质纳米颗粒进一步包含治疗性成分。所述治疗性成分优选经修饰或未经修饰的RNA,所述RNA优选mRNA、siRNA、microRNA或反义核酸。
在一些实施方案中，本发明的脂质纳米颗粒中全部脂质(阳离子脂质化合物、聚乙二醇脂质、胆固醇、DSPC)与任意种类的RNA 的重量比为5:1-50:1，优选10:1-30:1，25:1。
在一些实施方案中，治疗性成分优选经修饰或未经修饰的RNA, 所述RNA优选mRNA、siRNA、microRNA或反义核酸。
在一些实施方案中。通过脂质混合物和治疗剂(例如核酸)的缓冲水溶液而产生的脂质包封的治疗剂(例如核酸)复合物的大小可被设定以达到所需的大小范围和脂质颗粒大小的相对窄分布。本发明的脂质纳米颗粒具有如下所述的粒径分布或平均粒径：30-80nm、优选 30-60nm、35-55nm、更优选45nm。
脂质纳米颗粒的制备方法
在另一些实施方案中，本发明提供一种脂质纳米颗粒的制备方法。这些脂质纳米颗粒的组成如前所述，其制备方法包括步骤(B1) -步骤(B3)。
步骤(B1)将阳离子脂质分子，聚乙二醇脂质体，胆固醇，二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)以一定比例混合，用有机溶剂溶解，形成有机相溶液；
步骤(B2)将mRNA用适当pH的缓冲溶液溶解，形成水相溶液；
步骤(B3)将步骤(B1)中的脂质体有机相溶液和步骤(B2) 中的RNA水相溶液按照一定的质量比和体积比，缓慢将水相滴入有机相，制备包载mRNA的LNPs，之后使用对LNPs进行超滤或透析，得到可用于生物实验的包载mRNA的LNPs。
优选地，步骤(B1)中用于溶解脂质分子的有机溶剂为甲醇、乙醇、四氢呋喃、丙酮、二甲基亚砜、N，N-二甲基甲酰胺。
更优选地，步骤(B1)中用于溶解脂质分子的有机溶剂为乙醇、四氢呋喃、丙酮。
以下步骤(B1)-步骤(B3)中各脂质的比例％是相对于全部脂质的重量百分数。全部脂质加和后总重量为100％。
最优选地，步骤(B1)中用于溶解脂质分子的溶剂为乙醇。
优选地，步骤(B1)中阳离子脂质分子的比例为10％-70％。
更优选地，步骤(B1)中阳离子脂质分子的比例为30％-60％。
最优选地，步骤(B1)中阳离子脂质分子的比例为50％。
优选地，步骤(B1)中聚乙二醇脂质体的比例为1％-20％。
更优选地，步骤(B1)中聚乙二醇脂质体的比例为1％-10％。
最优选地，步骤(B1)中聚乙二醇脂质体的比例为2％。
优选地，步骤(B1)中胆固醇的比例为5％-60％。
更优选地，步骤(B1)中胆固醇的比例为10％-50％。
最优选地，步骤(B1)中胆固醇的比例为40％。
优选地，步骤(B1)中DSPC的比例为1％-30％。
更优选地，步骤(B1)中DSPC的比例为5％-15％。
最优选地，步骤(B1)中DSPC的比例为8％。
优选地，步骤(B2)中缓冲溶液为醋酸/醋酸钠溶液，柠檬酸/ 柠檬酸钠溶液。
最优选地，步骤(B2)中缓冲溶液为柠檬酸/柠檬酸钠溶液。
优选地，步骤(B2)中缓冲溶液的pH为3-9。
更优选地，步骤(B2)中缓冲溶液的pH为4-6。
最优选地，步骤(B2)中缓冲溶液的pH为5。
优选地，步骤(B2)中缓冲溶液的浓度为1mM-1M。
更优选地，步骤(B2)中缓冲溶液的浓度为20mM-500mM。
最优选地，步骤(B2)中缓冲溶液的浓度为100mM。
步骤
优选地，步骤(B3)中全部脂质分子与mRNA的质量比为 5:1-50:1。
更优选地，步骤(B3)中全部脂质分子与mRNA的质量比为10:1-30:1。
最优选地，步骤(B3)中全部脂质分子与mRNA的质量比为25:1。
优选地，步骤(B3)中有机相溶液与水相溶液的体积比为 1:1-1:10。
更优选地，步骤(B3)中有机相溶液与水相溶液的体积比为 1:1-1:5。
最优选地，步骤(B3)中有机相溶液与水相溶液的体积比为1:3。
药物组合物
在另一些实施方案中，本发明提供一种药物组合物，包含本发明的任意的阳离子脂质化合物或任意的脂质纳米颗粒。
在一些实施方案中，本发明提供一种药物组合物中还包含至少一种药学上可接受的载体。
这样的组合物将治疗或诊断性成分从身体的一个器官组织携带或运输至身体的另一个器官或组织。每种载体必须是在与制剂的其他成分(包括在本发明的阳离子化合物或任意的活性成分)是相容的，即“可接受的”，并且对患者无害。
据本发明施用这些组合物可经由任何常见途径，只要靶组织可经由此途径达到。这包括口服、经鼻或含服。可选地，可通过皮内、皮下、肌肉内、腹膜内、门静脉内或静脉内注射，或通过直接注射到患病的例如癌症组织中来施用。本文所公开的剂还可通过导管系统施用。
诊断或治疗中用途
在另一些实施方案中，本发提供式(I)阳离子脂质化合物或其脂质纳米颗粒在疾病诊断或治疗中用途。
在另一些实施方案中，本发提供式(I)阳离子脂质化合物或其脂质纳米颗粒在制备疾病的诊断或治疗组合物中的用途。
本发明的(I)阳离子脂质化合物或其脂质纳米颗粒的示例性的用途包括：用于核酸转染细胞，用于基因编辑细胞、用于疫苗的递送、用于治疗性RNA的细胞内递送等。
阳离子脂质化合物的合成
在另一些实施方案中，本发明提供一种式(I)阳离子脂质化合物的合成方法，包括以下步骤：
(A1)首先通过脂肪酸与二氯亚砜在溶剂中在碱的作用下以一定温度反应一定时间得到脂肪酰氯。本步骤中脂肪酸与权利要求第一方面中的R1，R2相对应。
(A2)，步骤(A1)中所获得的脂肪酰氯与N-Boc-丝氨醇在碱的作用下在溶剂中以一定温度反应一定时间，得到对应的脂肪酸丝氨酯。
(A3)，步骤(A2)得到的脂肪酸丝氨酯在酸作用下在溶剂中以一定温度反应一定时间，脱去Boc保护，得到含有氨基的脂肪酸丝氨酯，即脂质分子骨架N1。
对于R3，R4为结构式通式(1)的脂质体分子，其合成步骤如下：
(A4)，步骤(A3)得到的含有氨基的脂肪酸丝氨酯N1。在催化剂的作用下，与含氮杂环烷烃的羧酸(Amine)在溶剂中以一定温度反应一定时间，得到可电离的阳离子脂质分子。
对于R3，R4为结构式通式(3)、(4)、(5)、(6)、(7)、 (8)的脂质体分子，其合成步骤如下：
(A5)，步骤(A3)得到的含有氨基的脂肪酸丝氨酯N1。在碱的作用下，与一定结构的溴代羧酸叔丁酯、N-Boc-氨基溴、溴代醇等在溶剂中以一定温度反应一定时间，得到进一步功能化的脂质分子骨架N2。其中R5，R6为如下三种结构中的一种；或者为其中一个为如下三种结构，另一个为H。
(A6)，步骤(A5)得到的功能化脂质分子骨架N2，若功能化后为叔丁酯或者Boc保护的氨基，则在酸的作用下在溶剂中以一定温度反应一定时间，得到脱去叔丁基或者Boc保护的对应的羧酸或者氨基，获得以下结构的产物。
(A7)，对于步骤(A5)中得到的羟基功能化后脂质分子骨架N2-OH，在催化剂的作用下，与含氮杂环烷烃的羧酸(Amine)在溶剂中以一定温度反应一定时间，得到可电离的阳离子脂质分子。
或者步骤(A6)中得到的氨基功能化后脂质分子骨架N2-NH2，在催化剂的作用下，与含氮杂环烷烃的羧酸(Amine)在溶剂中以一定温度反应一定时间，得到可电离的阳离子脂质分子。
对于步骤(A6)中得到的羧基功能化后脂质分子骨架N2-COOH，在催化剂的作用下，与含氮杂环烷烃的胺或者醇(Amine)在溶剂中以一定温度反应一定时间，得到可电离的阳离子脂质分子。
对于步骤(A6)中得到的羟基功能化后脂质分子骨架N2-OH，羟基用N'N-羰基二咪唑(CDI)或对硝基氯甲酸苯酯活化，然后与含氮杂环烷烃的胺(Amine)在溶剂中以一定温度反应一定时间，得到可电离的阳离子脂质分子，连接基团为氨基甲酸酯结构。
(A8)，步骤(A1)中的溶剂为二氯甲烷、甲苯、N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、四氢呋喃。
优选地，步骤(A1)中的溶剂为二氯甲烷、甲苯、N，N-二甲基甲酰胺。
更优选地，步骤(A1)中的溶剂为二氯甲烷、甲苯。
优选地，步骤(A1)中的温度为25-120℃。
更优选地，步骤(A1)中的温度为25-80℃。
最优选地，步骤(A1)中的温度为25-60℃。
优选地，步骤(A1)中的碱为吡啶、N，N-二甲基甲酰胺、4- 二甲氨基吡啶、三乙胺、二乙胺、异丙胺、碳酸钾、碳酸钠、氢氧化钠、氢氧化钾。
更优选地，步骤(A1)中的碱为吡啶、N，N-二甲基甲酰胺、 4-二甲氨基吡啶、三乙胺、二乙胺、异丙胺。
最优选地，步骤(A1)中的碱为吡啶，N，N-二甲基甲酰胺、三乙胺、异丙胺。
优选地，步骤(A1)中的反应时间为1-24小时。
更优选地，步骤(A1)中的反应时间为2-12小时。
最优选地，步骤(A1)中的反应时间为4-6小时。
优选地，步骤(A2)中的溶剂为二氯甲烷、甲苯、N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、四氢呋喃。
更优选地，步骤(A2)中的溶剂为二氯甲烷、四氢呋喃、N， N-二甲基甲酰胺。
最优选地，步骤(A2)中的溶剂为二氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺。
优选地，步骤(A2)中的温度为0-60℃。
更优选地，步骤(A2)中的温度为0-40℃。
最优选地，步骤(A2)中的温度为0-25℃。
优选地，步骤(A2)中的碱为吡啶、N，N-二甲基甲酰胺、4- 二甲氨基吡啶、三乙胺、二乙胺、异丙胺、碳酸钾、碳酸钠、氢氧化钠、氢氧化钾。
更优选地，步骤(A2)中的碱为吡啶、N，N-二甲基甲酰胺、 4-二甲氨基吡啶、三乙胺、二乙胺、异丙胺。
最优选地，步骤(A2)中的碱为吡啶、N，N-二甲基甲酰胺、三乙胺、异丙胺。
优选地，步骤(A2)中的反应时间为1-48小时。
更优选地，步骤(A2)中的反应时间为6-24小时。
最优选地，步骤(A2)中的反应时间为6-12小时。
优选地，步骤(A3)中的溶剂为二氯甲烷、甲苯、N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、甲醇、四氢呋喃。
更优选地，步骤(A3)中的溶剂为二氯甲烷、甲醇、四氢呋喃、二甲基亚砜、N，N-二甲基甲酰胺。
最优选地，步骤(A3)中的溶剂为二氯甲烷、甲醇。
优选地，步骤(A3)中的温度为-20-100℃。
更优选地，步骤(A3)中的温度为0-40℃。
最优选地，步骤(A3)中的温度为0-25℃。
优选地，步骤(A3)中的酸为盐酸、硫酸、硝酸、三氟乙酸、乙酸、甲酸。
更优选地，步骤(A3)中的酸为盐酸、硫酸、三氟乙酸。
最优选地，步骤(A3)中的酸为盐酸、三氟乙酸。
优选地，步骤(A3)中的反应时间为0.5-48小时。
更优选地，步骤(A3)中的反应时间为0.5-12小时。
最优选地，步骤(A3)中的反应时间为0.5-6小时。
优选地，步骤(A4)中的溶剂为二氯甲烷、甲苯、N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、四氢呋喃甲醇、丙酮。
更优选地，步骤(A4)中的溶剂为二氯甲烷、四氢呋喃、二甲基亚砜、N，N-二甲基甲酰胺、丙酮。
最优选地，步骤(A4)中的溶剂为二氯甲烷、四氢呋喃、N， N-二甲基甲酰胺。
优选地，步骤(A4)中的温度为0-100℃。
更优选地，步骤(A4)中的温度为25-80℃。
最优选地，步骤(A4)中的温度为25-60℃。
优选地，步骤(A4)中的催化剂为二环己基碳二亚胺(DCC)、二异丙基碳二亚胺(DIC)和1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDCI)、碳鎓六氟磷酸盐(HATU)、二甲氨基吡啶。
更优选地，步骤(A4)中的催化剂为二环己基碳二亚胺(DCC)、和1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDCI)、碳鎓六氟磷酸盐 (HATU)、二甲氨基吡啶。
最优选地，步骤(A4)中的催化剂为和1-(3-二甲胺基丙基)-3- 乙基碳二亚胺(EDCI)、碳鎓六氟磷酸盐(HATU)、二甲氨基吡啶 (DMAP)。
优选地，步骤(A4)中的反应时间为1-48小时。
更优选地，步骤(A4)中的反应时间为6-24小时。
最优选地，步骤(A4)中的反应时间为6-12小时。
优选地，步骤(A5)中的碱为吡啶、N，N-二甲基甲酰胺、4- 二甲氨基吡啶、三乙胺、二乙胺、异丙胺、碳酸钾、碳酸钠、氢氧化钠、氢氧化钾。
更优选地，步骤(A5)中的碱为三乙胺、二乙胺、异丙胺、碳酸钾、碳酸钠、氢氧化钠、氢氧化钾。
最优选地，步骤(A5)中的碱为碳酸钾、碳酸钠。
优选地，步骤(A5)中的溶剂为二氯甲烷、甲苯、N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、甲醇、四氢呋喃。
更优选地，步骤(A5)中的溶剂为二氯甲烷、甲醇、四氢呋喃、二甲基亚砜、N，N-二甲基甲酰胺。
最优选地，步骤(A5)中的溶剂为四氢呋喃、N，N-二甲基甲酰胺。
优选地，步骤(A5)中的温度为-20-100℃。
更优选地，步骤(A5)中的温度为0-60℃。
最优选地，步骤(A5)中的温度为25-60℃。
优选地，步骤(A5)中的反应时间为1-48小时。
更优选地，步骤(A5)中的反应时间为6-24小时。
最优选地，步骤(A5)中的反应时间为6-12小时。
优选地，步骤(A6)中的酸为盐酸、硫酸、硝酸、三氟乙酸、乙酸、甲酸。
更优选地，步骤(A6)中的酸为盐酸、硫酸、三氟乙酸。
最优选地，步骤(A6)中的酸为盐酸、三氟乙酸。
优选地，步骤(A6)中的反应时间为0.5-48小时。
更优选地，步骤(A6)中的反应时间为0.5-12小时。
最优选地，步骤(A6)中的反应时间为0.5-6小时。
优选地，步骤(A7)中的溶剂为二氯甲烷、甲苯、N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、四氢呋喃甲醇、丙酮。
更优选地，步骤(A7)中的溶剂为二氯甲烷、四氢呋喃、二甲基亚砜、N，N-二甲基甲酰胺、丙酮。
最优选地，步骤(A7)中的溶剂为二氯甲烷、四氢呋喃、N， N-二甲基甲酰胺。
优选地，步骤(A7)中的温度为0-100℃。
更优选地，步骤(A7)中的温度为25-80℃。
最优选地，步骤(A7)中的温度为25-60℃。
优选地，步骤(A7)中的催化剂为二环己基碳二亚胺(DCC)、二异丙基碳二亚胺(DIC)和1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亚胺 (EDCI)、碳鎓六氟磷酸盐(HATU)、二甲氨基吡啶。
更优选地，步骤(A7)中的催化剂为二环己基碳二亚胺(DCC)、和1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDCI)、碳鎓六氟磷酸盐 (HATU)、二甲氨基吡啶。
最优选地，步骤(A7)中的催化剂为和1-(3-二甲胺基丙基)-3- 乙基碳二亚胺(EDCI)、碳鎓六氟磷酸盐(HATU)、二甲氨基吡啶 (DMAP)。
优选地，步骤(A7)中的反应时间为1-48小时。
更优选地，步骤(A7)中的反应时间为6-24小时。
最优选地，步骤(A7)中的反应时间为6-12小时。
定义
下面列出了用于描述本文公开的化合物和组合物的各种术语的定义。这些定义适用于如整个本说明书和权利要求书中所使用的术语，在特定情况下另有限制除外，这些术语或单独地或作为一个更大的组的一部分使用。
如本文所用，术语“一种(个)”和“所述”通常被解释为涵盖单数和复数形式。
本文所采用术语“包括”意指词组“包括(但不限于)”，并可与其交换使用。本文所采用术语“包含”意指词组“包含(但不限于)”，并可与其交换使用。本专利中的使用“包括”或“包含”的技术方案，可以进一步限定成“组成”或“构成”。
本文所用的％，无特殊说明时均为重量％，当使用固体和液体混合时为重量体积百分比，当使用液体和液体混合时为体积百分比。
本文所用的比例，无特殊说明时均为重量比例，当使用液体和液体混合时为体积比例。
术语“脂肪烃基”其涵盖具有二至约三十个碳原子的未分支、分支环状、非环状的、饱和或者非饱和基团，表示为C2-30脂肪烃基。碳原子的数量包括2至30个之间的任意具体数值，例如10、11、12、 13、14、15、16、17、18、19、20、25、30等。其中的“非饱和”包括双键和叁键，非饱和键的数量任选1个、2个或3个。此类脂肪烃基的实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、己基、辛基、月桂基、肉豆蔻基、棕榈基、硬脂基、十五碳烯基、十六碳烯基、十七碳烯基、十八碳烯基等。
术语“脂质”涵盖但不限于不溶于水但溶于有机溶剂、来源于天然来源和/或合成生产的生物分子，以及这种生物分子的非天然类似物和衍生物。脂质另外描述为“类脂质(lipid-like)”或“类脂质 (lipidoid)”的化合物，以及式(I)化合物。脂质的其他实例包括但不限于包含天然脂质的合成分子、其衍生物及其类似物，即使所述合成分子本身是水溶性的。脂质的其他实例包括但不限于包含一个或多个中性脂质、聚乙二醇脂质、甾族脂质及其类似物和衍生物。
在本文中“含氮杂环烷烃的羧酸、胺或醇”与“经羧酸基、胺基或醇基修改的含氮杂环烷烃”可以互换。在阳离子脂质合成中及其反应式中的“Amine”在没有特别说明的情况下表示的是“含氮杂环烷烃的羧酸、胺或醇”或“经羧酸基、胺基或醇基修改的含氮杂环烷烃”。其具体实例包括氮-1-基乙酸、氮/>-1-基乙氨、氮/>-1- 基乙醇、氮/>-1-基甲酸、四氢吡咯-1-基乙酸、哌啶-1-基乙酸、环己亚胺-1-基乙酸或氮杂环辛烷-1-基乙酸、哌啶-1-基甲酸、环己亚胺-1- 基甲氨。
“质子海绵效应”是指具有较高缓冲能力和适应性的物质(如阳离子脂质分子)进入胞内体后，为缓冲胞内体内酸性环境，大量吸收质子，造成跨膜电压的不同，为达到电荷平衡和浓度平衡，细胞质中的氯离子和水大量内流，最终胞内体溶涨破裂，内容物释放到细胞质中。在本发明技术中，脂质纳米粒子被早期溶酶体吞噬后，粒子中的阳离子脂质分子会导致“质子海绵效应”，使早期溶酶体破裂，释放mRNA，从而保护mRNA并促进其表达。
有益效果
本发明技术通过可电离的含胺的脂质分子在弱酸环境下即可触发质子化，一方面可增强与mRNA之间的静电相互作用，提高mRNA 的负载率；另一方面可以在早期溶酶体内的弱酸环境下(pH≈6.0- 6.5)发生质子化，引发“质子海绵效应”，实现早期溶酶体逃逸，从而快速释放mRNA，提高其表达效率。
本发明技术的优点在于：
1、LNPs生物相容性好，循环稳定。
2、与mRNA结合更为紧密，mRNA的负载率更高。
3、可电离的阳离子可实现早期溶酶体内体弱酸环境下的快速逃逸，有利于mRNA的释放，减少在溶酶体内被RNA酶降解，增加目的蛋白表达。
4、本发明技术合成简单，原料价格低廉，适合大规模生产。
5、该脂质体适合于不同核酸分子量长度，不同序列的核酸，包括mRNA,siRNA，micro RNA，反义核酸，DNA等，具有很强的普适性。
附图说明
图1可实现早期溶酶体逃逸的可离子化脂质分子Y1的1H NMR(CDCl3,400M,298.15K)谱图。
图2可实现早期溶酶体逃逸的可电离阳离子脂质分子Y1的13C NMR(CDCl3,400M,298.15K)谱图。
图3可实现早期溶酶体逃逸的可电离阳离子脂质分子Y1的 ESI-MS，[M+H]理论值为m/z＝759.7，实测值m/z＝759.66。
图4可实现早期溶酶体逃逸的可电离阳离子脂质分子Y2的1H NMR(CDCl3,400M,298.15K)谱图。
图5可实现早期溶酶体逃逸的可电离阳离子脂质分子Y2的13C NMR(CDCl3,400M,298.15K)谱图。
图6可实现早期溶酶体逃逸的可电离阳离子脂质分子(Y2)的 ESI-MS，[M+H]理论值为m/z＝759.7，实测值m/z＝759.66。
图7含Y2的LNPs@EGFP-mRNA(LNPs-Y2@EGFP-mRNA) 的粒径分布。
图8LNPs-Y2@EGFP-mRNA的TEM照片。
图9LNPs-Y2@EGFP-mRNA的细胞内表达实验，EGFP为绿色荧光蛋白的特异性发光。
图10LNPs-Y2@EGFP-mRNA的细胞毒性实验(MTT)。
图11lipo8000和LNPs-Y2分别装载EGFP-mRNA后对HEK293 的转染效果。
图12对照组(control)和LNPs-Y2@EGFP-mRNA纳米粒子的激光共聚焦荧光染色。
图13LNPs-Y2@EGFP-mRNA的生物安全性分析。
图14PBS和LNPs-Y2@mRNA处理后的小鼠的主要器官H&E 染色结果。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体描述，本实施例只用于对本发明作进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据上述发明的内容做出的一些非本质的改进和调整，均属本发明保护范围。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
缩写
实施例1阳离子脂质分子Y1的合成
将油酸溶在甲苯中与二氯亚砜在60℃反应5小时，随后真空除去溶剂和二氯亚砜，得到油酰氯。将油酰氯和N-Boc-丝氨醇溶解在二氯甲烷中，加入三乙胺，过夜反应。得到的反应液经洗涤、干燥和浓缩后用色谱柱分离纯化，对所得产物Boc保护的油酸丝氨酯进行1HNMR、13C NMR以及ESI-TOF MS表征。然后，将上步所得产物溶解于二氯甲烷，加入三氟乙酸，反应4小时，脱去Boc保护，得到的反应液经洗涤、干燥和浓缩后用色谱柱分离纯化，得到油酸丝氨酯，并进行1H NMR表征。接下来将油酸丝氨酯与氮-1-基乙酸在EDC和DMAP的作用下，在二氯甲烷中反应过夜，最终获得阳离子脂质分子Y1。产物经经洗涤、干燥和浓缩后用色谱柱分离纯化，并用1H NMR、13C NMR以及ESI-TOF MS进行表征(参见图1-3)。 ESI-MS，[M+H]理论值m/z＝759.7，实测值m/z＝759.66。
实施例2阳离子脂质分子Y2的合成
将油酸溶在甲苯中与二氯亚砜在60℃反应5小时，随后真空除去溶剂和二氯亚砜，得到硬脂酰氯。将油酰氯和N-Boc-丝氨醇溶解在二氯甲烷中，加入三乙胺，过夜反应。得到的反应液经洗涤、干燥和浓缩后用色谱柱分离纯化，对所得产物Boc保护的硬脂酸丝氨酯进行1H NMR、13C NMR以及ESI-TOF MS表征。然后，将上步所得产物溶解于二氯甲烷，加入三氟乙酸，反应4小时，脱去Boc保护，得到的反应液经洗涤、干燥和浓缩后用色谱柱分离纯化，得到油酸丝氨酯，并进行1H NMR表征。将所得的油酸丝氨酯与溴乙酸叔丁酯溶解于四氢呋喃中，在碳酸钾的作用下反应12小时，得到的反应液经洗涤、干燥和浓缩后用色谱柱分离纯化，得到油酸丝氨酯的乙酸叔丁酯用1H NMR表征。然后，将上步所得产物溶解于二氯甲烷，加入三氟乙酸，反应4小时，脱去Boc保护，得到的反应液经洗涤、干燥和浓缩后用色谱柱分离纯化，得到油酸丝氨酯的羧基功能化的产物N2-COOH。接下来将N2-COOH与氮-1-基乙醇在 EDC和DMAP的作用下，在二氯甲烷中反应过夜，最终获得阳离子脂质分子Y2。产物经洗涤、干燥和浓缩后用色谱柱分离纯化，并用1H NMR、13C NMR以及ESI-TOF MS表征(参见图4-6)。ESI-MS， [M+H]理论值m/z＝759.7，实测值m/z＝759.66。
实验结果证明，本发明的脂质体结构具有普适性，适合于不同的脂肪烃基链，可以得到不同疏水性的阳离子脂质分子。
实施例3以Y2为制备单元的LNPs用于包载EGFP的mRNA
Y1和Y2脂质体都含有七元环可离子化位点，都能在弱酸环境下发生质子化，实现mRNA的早期溶酶体逃逸。Y1和Y2脂质体都可以用于构建LNPs递送系统，并实现对mRNA的高效递送。相比于Y1分子，Y2分子含有二个可离子化的位点，与mRNA的结合能力更强，因此接下来的实例中优先选择Y2作为实例分子。
将30％-60％(w/w)阳离子脂质分子Y2、1％-10％(w/w)聚乙二醇脂质体、10％-50％(w/w)胆固醇以及5％-15％(w/w)DSPC比混合(四种脂质总量为100％)溶解在乙醇溶液中，形成有机相溶液，有机相中脂质浓度为2mg/mL。EGFP的mRNA用pH为5.0的柠檬酸钠(100mM)缓冲溶液溶解，形成水相溶液。有机相溶液和水相溶液体积比为1:3，所含阳离子脂质脂质Y2与EGFP mRNA按25:1 的质量比例混合，得到白色乳液。随后超滤除去乙醇，得到包载EGFP mRNA的LNPs-Y2@EGFP-mRNA纳米颗粒。
使用动态光散射(DLS)和透射电镜(TEM)对所获得的LNPs 进行粒径分布表征以及形貌表征。DLS实验结果如图7所示， LNPs-Y2@EGFP-mRNA纳米颗粒主要分布在30-80nm的范围内，其平均粒径约为45nm。TEM实验结果如图8所示， LNPs-Y2@EGFP-mRNA微粒呈球形，粒径约为30-80nm，该粒径范围与DLS获得的粒径分布一致。
实施例4以Y2为制备单元的LNPs-Y2@EGFP-mRNA纳米颗粒的细胞内表达实验
将实施例2制备的LNPs-Y2@EGFP-mRNA(0.2μg/ml)纳米颗粒与HEK293细胞共孵育24h，使其表达绿色荧光蛋白，去除细胞培养皿中的培养基，用PBS冲洗3次。通过激光共聚焦显微镜观察 LNPs-Y2@EGFP-mRNA纳米颗粒的递送及表达效率。图9左侧图为蓝色荧光，图9中间图显示绿色荧光，图9右侧图为蓝色荧光和绿色荧光的重叠图。结果显示，超过95％的细胞表达出绿色荧光，说明本专利阳离子脂质体递送系统可以实现EGFP-mRNA的胞内高效转染表达。
实施例5 LNPs-Y2@EGFP-mRNA纳米颗粒体外细胞毒性测试
将HEK293细胞接种在96孔板的DMEM培养基(10％胎牛血清和1％青霉素)中。将细胞在37℃下在含有5％CO2的气氛中孵育。细胞孵育24小时后更换新鲜培养基。加入实施例3制备的不同浓度的LNPs-Y2@EGFP-mRNA纳米颗粒(0-200μM)，分别将细胞孵育24和48小时后，用含有0.5mg/mL的3-(4,5-二甲基噻唑-2- 基)-2,5-二苯基四氮唑(MTT)培养基替换原培养基。继续孵育4小时后，除去含有MTT的培养基，用PBS小心洗涤3次。然后，加入 DMSO(100μL)，在BioTek Synergy H4读数器中测量在570nm 的波长下吸光度，计算得到24和48h的细胞存活率，验证本发明得到的递送体系的细胞毒性。图10显示，孵育24和48h后的细胞存活率均在95％以上，表明LNPs-Y2@EGFP-mRNA纳米颗粒具有较低的细胞毒性，展现出了良好的生物安全性能。
实施例6 LNPs-Y2@mRNA在不同时间节点的细胞内表达实验
根据实施例3中所述方法，制备LNPs-Y2@EGFP-mRNA颗粒。使用同等浓度的LNPs-Y2@EGFP-mRNA和lipo8000@EGFP-mRNA 分别对HEK293细胞进行转染。在转染4小时和12小时后，对两种转染方式处理的细胞进行统计，得到不同时间节点的转染比率(图 11a)。另外在转染24小时后，用荧光显微镜获得两种转染方式处理的细胞的绿色荧光蛋白的发光强度(图11b)。转染比例和荧光强度的数据均说明，在4小时，12小时和24小时的转染中，实施例3制备的阳离子脂质体表现出与商品化转染试剂lipo8000相当的转染能力(图11)，说明该阳离子脂质体具备相当可靠的商业化转化潜力。
实施例7 LNPs-Y2@EGFP-mRNA颗粒的早期溶酶体逃逸
根据实施例3中所述方法，制备LNPs-Y2@EGFP-mRNA。使用同等浓度的LNPs-Y2@EGFP-mRNA/Rho(本发明脂质体 LNPs-Y2@mRNA包载的罗丹明染料)与常规脂质体包载的罗丹明染料(对照组control)分别对HEK293细胞进行共孵育。约4h后分别采用DAPI染料蓝染细胞核，Lysotracker染料绿染溶酶体，而罗丹明(Rho)的红色荧光则用来实施追踪纳米材料位置。采用激光共聚焦荧光成像对两种脂质体材料的溶酶体逃逸性能进行评估，结果如图12所示。图12中DAPI组为蓝色荧光，Lysotracker组为绿色荧光， Rhodamine(罗丹明/Rho)组为红色荧光，Merge/对照组为DAPI组、 Lysotracker组和Rhodamine组的重叠图像，Merge/ LNPs-Y2@EGFP-mRNA/Rho为Lysotracker组和Rhodamine组的重叠图像。在对照组可以看到，重叠图像中溶酶体的绿色荧光(对照组 /Lysotracker)与Rho的红色荧光(对照组/Rhodamine)显示出较好地共定位效应，说明常规脂质体纳米材料绝大部分仍在溶酶体内。而在LNPs-Y2@EGFP-mRNA/Rho组，可以明显的看到罗丹明的红色荧光(LNPs-Y2@mRNA/Rho)在绿色的溶酶体内逃离，显示出异位的荧光效果，说明本专利纳米材料LNPs-Y2@EGFP-mRNA/Rho 已经在共孵育4h时破膜逃离溶酶体，能够避免溶酶体的降解，实现细胞内的mRNA高效递送及表达。
实施例8 LNPs-Y2@EGFP-mRNA颗粒的生物安全性分析
将BALB/c小鼠分为三组，每组5只，分别经尾静脉注射PBS 和实施例3获得的LNPs@EGFP-mRNA颗粒，注射后在第3天与小鼠内眦静脉取血，离心取上清液，测定肝功能各项指标。
实验结果表明：LNPs-Y2@EGFP-mRNA颗粒未引起显著的肝肾功能变化，其对应指标基本与PBS持平(图13)。说明LNPs@mRNA 纳米粒子具有良好的生物安全性。
实施例9 LNPs-Y2@mRNA的系统毒性分析
根据实施例8，对经过PBS和LNPs-Y2@EGFP-mRNA颗粒处理的小鼠的主要器官：心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏进行H&E染色。
实验结果表明，经LNPs-Y2@mRNA处理的小鼠的各主要器官均未出现明显的病变，其组织结构均与PBS保持相同(图14)。

Claims (26)

1.一种阳离子脂质化合物，其具有式(I)结构：
R1，R2各自独立选自分支或未分支、环状或非环状的、饱和或者非饱和的C2-30的脂肪烃基；
R3或R4各自独立的选自H或通过酰胺键、氨基甲酸酯、酯键连接的胺类，所述胺类为任选取代的或非取代的、环状或非环状的伯胺、仲胺或叔胺，条件是R3和R4不同时为H。
2.根据权利要求1所述的阳离子脂质化合物，其特征在于，
R3或R4各自独立的选自H或(1)-(8)，条件是R3和R4不同时为H
所述胺类A选自：
n＝1-20；
m＝0-20；
·····表示R3，R4与N的连接键。
3.根据权利要求1或2所述的阳离子脂质化合物，其特征在于，
R1，R2各自独立选自分支或未分支、环状或非环状的、饱和或者非饱和的C10-20脂肪烃基；优选分支或未分支、环状或非环状的、饱和或者非饱和的C12-18脂肪烃基；更优选分支或未分支、环状或非环状的、非饱和的C12-18脂肪烃基；最优选未分支、非环状的、非饱和的C12-18脂肪烃基。
4.根据权利要求2或3所述的阳离子脂质化合物，其特征在于，
R3或R4各自独立的选自H、(1)或(6)，条件是R3和R4不同时为H；
n＝1-5，优选1-3；
A选自优选/>更优选/>
5.根据权利要求2或3所述的阳离子脂质化合物，其特征在于，
R3或R4各自独立的选自H、(3)、(4)、(5)、(6)、(7)或(8)，条件是R3和R4不同时为H；
n＝1-5，优选1-2；
m＝1-5；
A选自优选/>更优选/>
6.根据权利要求1所述的阳离子脂质化合物，其选自：
7.一种脂质纳米颗粒，其特征在于，所述载体包含权利要求1-6中任意一项所述的式(I)阳离子脂质化合物。
8.根据权利要求7所述的脂质纳米颗粒，其特征在于，所述载体进一步包含中性脂质、聚乙二醇脂质、甾族脂质中的一种或数种。
9.根据权利要求8所述的脂质纳米颗粒，其特征在于，
所述聚乙二醇脂质选自：2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-二十四烷基乙酰胺(ALC-0159)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油甲氧基聚乙二醇(PEG-DMG)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基(聚乙二醇)](PEG-DSPE)、PEG-二甾醇基甘油(PEG-DSG)、PEG-二棕榈油基、PEG-二油基、PEG-二硬脂基、PEG-二酰基甘油酰胺(PEG-DAG)、PEG-二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(PEG-DPPE)或PEG-1,2-二肉豆蔻酰基氧基丙基-3-胺(PEG-c-DMA)中的一种或数种；
所述中性脂质选自：1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPPE)、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DMPE)、2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1'-rac-甘油)(DOPG)、油酰磷脂酰胆碱(POPC)、1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰乙醇胺(POPE)中的一种或数种；
所述甾族脂质选自：燕麦甾醇、β-谷甾醇、菜子甾醇、麦角骨化醇、菜油甾醇、胆甾烷醇、胆固醇、粪甾醇、脱氢胆固醇、链甾醇、二氢麦角骨化醇、二氢胆固醇、二氢麦角甾醇、黑海甾醇、表胆甾醇、麦角甾醇、岩藻甾醇、六氢光甾醇、羟基胆固醇；羊毛甾醇、光甾醇、海藻甾醇、谷甾烷醇、谷甾醇、豆甾烷醇、豆甾醇、胆酸、甘氨胆酸、牛磺胆酸、脱氧胆酸和石胆酸中的一种或数种。
10.根据权利要求7-9中任一项所述的脂质纳米颗粒，其特征在于，
所述阳离子脂质化合物在全部脂质中的重量比为10％-70％，优选30％-60％，更优选50％。
11.根据权利要求7-10中任一项所述的脂质纳米颗粒，其特征在于，
其中的脂质包括所述式(I)阳离子脂质化合物、中性脂质、聚乙二醇脂质和甾族脂质；
所述聚乙二醇脂质在全部脂质中的重量比为1％-20％，优选1％-10％，更优选2％；
所述胆固醇在全部脂质中的重量比为5％-60％，优选10％-50％，更优选40％；
所述DSPC在全部脂质中的重量比为1％-30％，优选5％-15％，更优选8％。
12.根据权利要求7-10中任一项所述的脂质纳米颗粒，其特征在于，
所述脂质纳米颗粒的平均粒径为：30-80nm、优选30-60nm、35-55nm、更优选45nm。
13.根据权利要求7-12中任一项所述的脂质纳米颗粒，其特征在于，脂质纳米颗粒进一步包含治疗性成分，所述治疗性成分优选经修饰或未经修饰的RNA,所述RNA优选mRNA、siRNA、microRNA或反义核酸。
14.根据权利要求13所述的脂质纳米颗粒，其特征在于，全部脂质与RNA的重量比为5:1-50:1，优选10:1-30:1，更优选25:1。
15.一种药物组合物，包含权利要求1-6中任一项所述的阳离子脂质化合物或权利要求7-14中任一项所述的脂质纳米颗粒，和至少一种药学上可接受的载体。
16.权利要求1-6中任一项所述的阳离子脂质化合物或权利要求7-14中任一项所述的脂质纳米颗粒在疾病诊断或治疗中用途。
17.权利要求1-6中任一项所述的阳离子脂质化合物或权利要求7-14中任一项所述的脂质纳米颗粒在制备疾病的诊断组合物或治疗组合物中的用途。
18.权利要求7-14中任一项所述的脂质纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
步骤(B1)：将所述阳离子脂质化合物，与所述聚乙二醇脂质、胆固醇、二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)中的一种或数种以一定比例用有机溶剂溶解，形成有机相；
步骤(B2)：将所述治疗性成分用适当pH的缓冲溶液溶解，形成水相；
步骤(B3)：将步骤(B1)获得所述有机相和步骤(B2)获得所述水相按照一定的比例混合，制备脂质纳米颗粒。
19.权利要求18所述的脂质纳米颗粒的制备方法，其特征在于，将步骤(B2)获得所述水相缓慢加入到步骤(B1)获得所述有机相中；任选的，在步骤(B3)之后进一步包括分离或纯化脂质纳米颗粒的步骤，所述分离方法优选超滤或透析。
20.权利要求18-19中任一项所述的脂质纳米颗粒的制备方法，其特征在于，
步骤(B1)中所述的有机溶剂为甲醇、乙醇、四氢呋喃、丙酮、二甲基亚砜、N，N-二甲基甲酰胺；优选乙醇、四氢呋喃、丙酮，更优选乙醇；
步骤(B2)中所述缓冲溶液的pH为3-9，优选pH为4-6或5；或者缓冲溶液为醋酸/醋酸钠溶液、柠檬酸/柠檬酸钠溶液，优选柠檬酸/柠檬酸钠溶液；缓冲液的浓度为1mM-1M，优选20mM-500mM，更优选100mM。
21.权利要求1-6中任一项所阳离子脂质化合物的合成方法，包括步骤(A4)：
其中，R3或R4独立的选自H或(1)，条件是R3和R4不同时为H；
将脂肪酸丝氨酯N1，在催化剂的作用下，与羧酸基团修饰的含氮杂环烷烃(Amine)在溶剂中以一定温度反应一段时间后，得到所述阳离子脂质化合物。
22.权利要求21所述的阳离子脂质化合物的制备方法，其特征在于，在步骤(A4)前还包括以下步骤：
步骤(A1)：通过脂肪酸与二氯亚砜在溶剂中在碱的作用下以一定温度反应一定时间得到脂肪酰氯,
步骤(A2)：将步骤(A1)中获得的脂肪酰氯与N-Boc-丝氨醇在碱的作用下在溶剂中以一定温度反应一定时间，得到对应的脂肪酸丝氨酯，
步骤(A3)：步骤(A2)获得的脂肪酸丝氨酯在酸作用下在溶剂中以一定温度反应一定时间，脱去Boc保护，得到含有氨基的脂肪酸丝氨酯N1，
23.权利要求1-6中任一项所阳离子脂质化合物的制备方法，包括以下步骤(A7)：其中
R3或R4各自独立的选自(3)、(4)、(5)、(6)、(7)或(8)，条件是R3和R4不同时为H；
步骤(A7)：将与经修饰的含氮杂环烷反应，制备所述阳离子脂质化合物；
所述中的R5或R6是各自独立的选自H或/>条件是R5和R6不同时为H。
24.权利要求23所述的阳离子脂质化合物的制备方法，其特征在于，
在催化剂的作用下，将与经羧酸基修饰的含氮杂环烷烃在溶剂中以一定温度反应一定时间，得到所述阳离子脂质化合物；或者
在催化剂的作用下，将与经胺基或者醇基修饰的含氮杂环烷烃在溶剂中以一定温度反应一定时间，得到所述阳离子脂质化合物；或者
在催化剂的作用下，将中的羟基用N'N-羰基二咪唑(CDI)或对硝基氯甲酸苯酯活化，然后与胺基修饰的含氮杂环烷烃在溶剂中以一定温度反应一定时间，得到所述阳离子脂质化合物；或者
在催化剂的作用下，将与经羧酸基修饰的含氮杂环烷烃，在溶剂中以一定温度反应一定时间，得到所述阳离子脂质化合物。
25.权利要求23或24所述的阳离子脂质化合物的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：
步骤(A5)：将权利要求22中步骤(A3)获得的含有氨基的脂肪酸丝氨酯N1，在碱的作用下，与一定结构的溴代羧酸叔丁酯、N-Boc-氨基溴或溴代醇在溶剂中以一定温度反应一定时间，得到进一步功能化的脂质分子骨架N2，
其中R5或R6各自独立的选自：H、 条件是R5和R6不同时为H；
步骤(A6)：将步骤(A5)得到的叔丁酯或者Boc保护氨基的功能化脂质分子骨架N2，在酸的作用下在溶剂中以一定温度反应一定时间，脱去叔丁基或者Boc保护的对应的羧酸或者氨基后，得到
26.权利要求21-25中任一项所述的阳离子脂质化合物的制备方法，其特征在于，
步骤(A4)中的溶剂为二氯甲烷、甲苯、N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、四氢呋喃甲醇、丙酮；优选地二氯甲烷、四氢呋喃、二甲基亚砜、N，N-二甲基甲酰胺、丙酮；更优选二氯甲烷、四氢呋喃、N，N-二甲基甲酰胺；
步骤(A4)中的温度为0-100℃，优选25-80℃，更优选25-60℃；
步骤(A4)中的催化剂为二环己基碳二亚胺(DCC)、二异丙基碳二亚胺(DIC)和1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDCI)、碳鎓六氟磷酸盐(HATU)、二甲氨基吡啶(DMAP)；优选二环己基碳二亚胺(DCC)、和1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDCI)、碳鎓六氟磷酸盐(HATU)、二甲氨基吡啶(DMAP)；更优选1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDCI)、碳鎓六氟磷酸盐(HATU)、二甲氨基吡啶(DMAP)；
步骤(A4)中的反应时间为1-48小时；优选6-24小时；更优选6-12小时；
步骤(A5)中的碱为吡啶、N，N-二甲基甲酰胺、4-二甲氨基吡啶、三乙胺、二乙胺、异丙胺、碳酸钾、碳酸钠、氢氧化钠、氢氧化钾；优选三乙胺、二乙胺、异丙胺、碳酸钾、碳酸钠、氢氧化钠、氢氧化钾；更优选碳酸钾、碳酸钠；
步骤(A5)中的溶剂为二氯甲烷、甲苯、N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、甲醇、四氢呋喃；优选二氯甲烷、甲醇、四氢呋喃、二甲基亚砜、N，N-二甲基甲酰胺，更优选四氢呋喃、N，N-二甲基甲酰胺；
步骤(A5)中的温度为-20-100℃；优选0-60℃；更优选25-60℃；
步骤(A5)中的反应时间为1-48小时；优选6-24小时；更优选6-12小时；
步骤(A6)中的酸为盐酸、硫酸、硝酸、三氟乙酸、乙酸、甲酸；优选盐酸、硫酸、三氟乙酸；更优选盐酸、三氟乙酸；
步骤(A6)中的反应时间为0.5-48小时；优选0.5-12小时；更优选地0.5-6小时；
步骤(A7)中的溶剂为二氯甲烷、甲苯、N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、四氢呋喃甲醇、丙酮；优选二氯甲烷、四氢呋喃、二甲基亚砜、N，N-二甲基甲酰胺、丙酮；更优选二氯甲烷、四氢呋喃、N，N-二甲基甲酰胺；
步骤(A7)中的温度为0-100℃；优选25-80℃；更优选25-60℃；
步骤(A7)中的催化剂为二环己基碳二亚胺(DCC)、二异丙基碳二亚胺(DIC)和1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDCI)、碳鎓六氟磷酸盐(HATU)、二甲氨基吡啶；优选二环己基碳二亚胺(DCC)、和1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDCI)、碳鎓六氟磷酸盐(HATU)、二甲氨基吡啶；更优选1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDCI)、碳鎓六氟磷酸盐(HATU)、二甲氨基吡啶(DMAP)；
步骤(A7)中的反应时间为1-48小时，优选6-24小时；更优选6-12小时。
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