CN118125932A - 一种可电离脂质分子及其纳米颗粒组合物在核酸递送中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种可电离脂质分子及其制备方法，以及其在活性治疗剂(例如核酸)递送中的应用。本发明的可电离脂质分子具有可降解性、低毒和增强的肝外靶向性，可以提供较高的活性物质包封率，更好的细胞或体内转染率，尤其适合于制备实心结构的脂质纳米颗粒。
Description
技术领域
本发明属于药用化合物技术领域，具体涉及一种可电离脂质分子、其制备方法、包含所述可电离脂质分子的纳米颗粒，以及它们在活性治疗剂(例如核酸)递送中的应用。
背景技术
不同类型的核酸制剂正被研发用于治疗各种重大疾病如传染性疾病、癌症、罕见病等。该类核酸制剂包括：DNA、反义核酸(ASO)、小干扰RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)、小激活RNA(saRNA)、信使RNA(mRNA)、适配体(aptamer)、核酶(ribozyme)等。其中，利用mRNA为活性治疗剂的，例如mRNA疫苗，根据关键蛋白质可反推、设计、合成，无须耗费大量资源利用活体生物或细胞合成，本身又可以引发全面有效的人体免疫反应，且mRNA疫苗不存在减毒疫苗潜在的逆转危险；不存在灭活疫苗的恢复突变问题。另外，mRNA被翻译成蛋白质后易被降解，其瞬时表达的特性不仅确保了mRNA药物的安全性，而且使其剂量可控，避免了疫苗药物长期暴露引起的抗原免疫耐受(对特定抗原无反应的状态)。因此mRNA疫苗在安全性、快速制备和免疫原性方面具有颠覆性的优势。基于mRNA修饰和递送技术的不断更新，mRNA作为新型治疗药物开发的钥匙，更有着近乎无限的应用前景。长期来看，mRNA技术在肿瘤疫苗、基因编辑、CAR T细胞治疗、蛋白替代疗法及其他传染病预防性疫苗领域都将逐步成熟，各种产品管线正在临床开发中推进。
但是，一方面核酸制剂带负电，而且多数分子量较大很难直接进入细胞内，另一方面，RNA不稳定，在引入体内的过程中极易被核酸酶降解，从而失去生物功能。因此，开发高效安全并且通用的核酸递送系统，是核酸药物转化过程中亟待解决的问题。
目前，脂质纳米颗粒(LNP)是公认的较为成熟的核酸递送载体。2018年LNP包裹的siRNA药物Onpattro(patisiran)获批上市；2021年8月和2022年1月，FDA分别完全批准上市的两款疫苗Comirnaty(BNT162b2)和Spikevax(mRNA-1273)均是使用LNP包裹mRNA。
脂质纳米颗粒(LNP)的主要成分包括：阳离子/可电离脂质、辅助型脂质、胆固醇和聚乙二醇-脂质结合物。在这四种脂质成分中，阳离子脂质带电荷的头部能够与带负电的核酸结合，同时也能与细胞膜上的磷脂分子结合，在核酸包裹和膜融合过程中都发挥着关键的作用。由于永久性阳离子脂质潜在的毒性问题，可电离脂质制备得脂质纳米颗粒(LNP)具有更大的应用价值。可电离的阳离子脂质包括三个重要的结构组成部分：含胺基的亲水极性头部；疏水脂质链；负责连接极性头部和非极性尾部的连接链。
目前，已经应用于临床的可电离脂质主要有用于Onpattro(patisiran)的MC3和用于新冠mRNA疫苗的ALC-0315、SM-102。其中，MC3具有很强的肝靶向可能具有潜在的肝毒性，而且MC3是针对分子量较小的siRNA递送开发的，对于分子量较大的核酸制剂其负载量可能存在限制。ALC-0315和SM-102现有递送效率也需要进一步提高。
基于此，有必要针对现有的技术问题，开发可电离的脂质化合物，并筛选、优化新的纳米递送系统提高递送效率、降低毒性，例如实现核酸的安全、高效递送。
发明内容
本发明提供了一种新型可电离脂质分子，其可用于递送生物活性分子(例如，mRNA，siRNA，micRNA，蛋白质，多肽等)。鉴于胺基结构可质子化形成带正电荷的阳离子基团，本发明的可电离脂质分子尤其适用于传递带负电荷的活性物质，例如DNA、RNA或其它核苷酸分子。本发明的可电离脂质分子具有可降解性，能形成多种功能多样性的以脂质为基础的高效、低毒、具有很强的肝外靶向性的递送系统。
本发明还提供了包含所述可电离脂质分子的生物活性物质递送系统，所述递送系统可以是微粒、纳米粒子、脂质体、脂质纳米颗粒或微泡。在本发明的一个实施方式中，所述递送系统是脂质纳米颗粒。此类脂质纳米颗粒可以将生物活性物质(如mRNA)高效递送到细胞、组织或器官中，实现生物活性物质的高效调控。在本发明中，所述可电离脂质分子与生物活性物质或进一步包含其他的物质(例如，其它的阴离子、阳离子或可电离脂质化合物、合成或天然的聚合物、表面活性剂、胆固醇、碳水化合物、蛋白质、磷脂等)一同，组合形成微粒、纳米粒子、脂质体、脂质纳米颗粒或微泡。而所述的生物活性物质可呈气体、液体或固体形式，可为多核苷酸、蛋白质、肽或小分子。在本发明中，所述递送系统可接着任选地与医药赋形剂组合形成医药组合物。
本发明还提供了这些可电离脂质分子的合成方法。
本发明还提供了所述可电离脂质分子在制备生物活性物质递送系统中的应用。所述递送系统可以是微粒、纳米粒子、脂质体、脂质纳米颗粒或微泡。在本发明的一个实施方式中，所述递送系统是脂质纳米颗粒。
本发明的可电离脂质化合物具有如式I所示的结构
其中：
R1为氢，经取代或未取代的直链或支链C1-20烷基，经取代或未取代的直链或支链C2-20烯基，经取代或未取代的直链或支链C2-20炔基，所述取代的取代基团选自卤素、-OH、＝O、直链或支链的C1-10烷基、直链或支链的C1-10烷氧基；以上所有的烷基、烯基、炔基或烷氧基，其碳链中的1个或1个以上的C原子可任选被独立地选自O、S和N的杂原子所替换；
n为选自1-10的正整数(例如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10)；m为选自1-10的正整数(例如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10)；n和m可以相同或不同；
每个R2彼此独立地选自氢，经取代或未取代的直链或支链C1-30烷基，经取代或未取代的直链或支链C2-30烯基，经取代或未取代的直链或支链C2-30炔基；所述取代的取代基团选自卤素、-OH、＝O、直链或支链的C1-10烷基、直链或支链的C1-10烷氧基，直链或支链的C2-20烯基；以上所有的烷基、烯基、炔基或烷氧基，其碳链中的1个或1个以上的C原子可任选被独立地选自O、S和N的杂原子所替换；
条件是，至少有一个R2为
o独立地选自1-20的正整数(例如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20)；
R’选自经取代或未取代的直链或支链C1-30烷基，经取代或未取代的直链或支链C2-30烯基，经取代或未取代的直链或支链C2-30炔基；所述取代的取代基团选自＝O、卤素、-OH、直链或支链的C1-20烷基、直链或支链的C1-20烷氧基，直链或支链的C2-20烯基；以上所有的烷基、烯基、炔基或烷氧基，其碳链中的1个或1个以上的C原子可任选被独立地选自O、S和N的杂原子所替换；
当有至少两个R2为时，它们的结构可以相同或不同；
在本发明的一些实施方式中，优选，R1为未取代的直链或支链C1-10烷基，更优选，R1为未取代的直链或支链C1-6烷基，例如为甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基、正己基等。
在本发明的一些实施方式中，优选，n为选自1-6的正整数，m为选自1-6的正整数，例如1，2，3，4，5，6。
在本发明的一些实施方式中，优选，每个R2彼此独立地选自氢， 经取代或未取代的直链或支链C10-30烷基，经取代或未取代的直链或支链C10-30烯基，经取代或未取代的直链或支链C10-30炔基；所述取代的取代基团选自-OH、＝O、直链或支链的C1-10烷基、直链或支链的C1-10烷氧基，直链或支链的C10-20烯基；以上所有的烷基、烯基、炔基或烷氧基，其碳链中的1个或1个以上的C原子可任选被独立地选自O、S和N的杂原子所替换。
在本发明的一些实施方式中，优选o独立地选自4-12的正整数，例如4，5，6，7，8，9，10，11，12。
在本发明的一些实施方式中，优选，R’选自经取代或未取代的直链或支链C5-30烷基，经取代或未取代的直链或支链C10-30烯基，经取代或未取代的直链或支链C10-30炔基；所述取代的取代基团选自＝O、-OH、直链或支链的C1-10烷基、直链或支链的C1-10烷氧基，直链或支链的C10-20烯基；以上所有的烷基、烯基、炔基或烷氧基，其碳链中的1个或1个以上的C原子可任选被独立地选自O、S和N的杂原子所替换。
在本发明的一些实施方式中，R’为经取代或未取代的直链或支链C5-30烷基，所述取代基为直链或支链的C1-10烷基；在本发明的另一些实施方式中，R’为其中x独立地为1-5的正整数(例如1，2，3，4，5)，y独立地为2-15的正整数(例如2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15)；在本发明的再一些实施方式中，R’为经取代或未取代的/>所述取代基为直链或支链的C1-10烷基或/>其中每个a可以相同或不同，彼此独立地选自1-10的正整数(例如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10)，每个b可以相同或不同，均彼此独立地选自1-10的正整数(例如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10)；在本发明的再一些实施方式中，R’为经取代或未取代的-(CH2)c-S-S-R”，所述取代基为直链或支链的C1-10烷基或-(CH2)c-S-S-R”，每个c可以相同或不同，彼此独立地选自1-5的正整数(例如1，2，3，4，5)，其中，R”为经取代或未取代的直链或支链C2-20烷基，经取代或未取代的直链或支链C2-20烯基，所述取代基选自卤素、-OH、＝O、直链或支链的C1-10烷基、直链或支链的C1-10烷氧基。
在本发明的一些实施方式中，R2彼此独立地选自氢，且当至少2个R2为/>时，它们结构是相同的。
在本发明的一些实施方式中，三个R2为且它们的结构是相同的，一个R2为H。
优选，式I所示的结构
其中：
R1为未取代的直链或支链C1-10烷基，更优选，R1为未取代的直链或支链C1-6烷基；
n为选自1-6的正整数，m为选自1-6的正整数；
每个R2彼此独立地选自氢，o独立地为4-12的正整数；条件是至少有一个R2为/>在进一步优选的实施方式中，当至少有两个R2为时，它们的结构是相同的；在更优选的实施方式中，三个R2为且它们的结构是相同的，一个R2为H；
R’选自经取代或未取代的直链或支链C5-30烷基，经取代或未取代的直链或支链C10-30烯基，经取代或未取代的直链或支链C10-30炔基；所述取代的取代基团选自＝O、-OH、直链或支链的C1-10烷基、直链或支链的C1-10烷氧基，直链或支链的C10-20烯基；以上所有的烷基、烯基、炔基或烷氧基，其碳链中的1个或1个以上的C原子任选被独立地选自O、S和N的杂原子所替换。
更优选，式I所示的结构
其中：
R1为未取代的直链或支链C1-10烷基，更优选，R1为未取代的直链或支链C1-6烷基；
n为选自1-6的正整数，m为选自1-6的正整数；
每个R2彼此独立地选自氢，o独立地为4-12的正整数；条件是至少有一个R2为/>在进一步优选的实施方式中，当至少有两个R2为时，它们的结构是相同的；在更优选的实施方式中，三个R2为且它们的结构是相同的，一个R2为H；
R’为：经取代或未取代的直链或支链C5-30烷基，所述取代基为直链或支链的C1-10烷基；或，其中x独立地为1-5的正整数，y独立地为2-15的正整数；或，经取代或未取代的/>所述取代基为直链或支链的C1-10烷基或/>其中每个a可以相同或不同，彼此独立地选自1-10的正整数，每个b可以相同或不同，均彼此独立地选自1-10的正整数；或，经取代或未取代的-(CH2)c-S-S-R”，所述取代基为直链或支链的C1-10烷基或-(CH2)c-S-S-R”，每个c可以相同或不同，彼此独立地选自1-5的正整数，其中，R”为经取代或未取代的直链或支链C2-20烷基，经取代或未取代的直链或支链C2-20烯基，所述取代基选自卤素、-OH、＝O、直链或支链的C1-10烷基、直链或支链的C1-10烷氧基。
在本发明的一些具体实施方式中，所述式I化合物选自所示的以下化合物：
T7：
T7-2：
T7-4：
本发明的可电离脂质分子可以采用本领域已有的方法进行合成，例如，使一当量或一当量以上的胺与一当量或一当量以上的环氧基封端化合物在合适的条件下反应形成。可电离脂质化合物的合成是在有或无溶剂的情况下进行，并且所述合成可在50-100℃范围内的较高温度下进行。可任选纯化制得的可电离脂质化合物。举例来说，可纯化可电离脂质化合物的混合物，得到特定的可电离脂质化合物。或可纯化混合物，得到特定立体异构体或区域异构体。所述环氧化物可以商业购买，或者合成制备。
在某些实施例中，胺的所有氨基都与环氧基封端化合物完全反应形成叔胺。在其它实施例中，胺的所有氨基并不都与环氧基封端化合物完全反应，由此在阳离子脂质化合物中产生伯胺或仲胺。使这些伯胺或仲胺保持原样或可与诸如不同环氧基封端化合物等另一亲电子试剂反应。本领域技术人员可知，使过量的胺与环氧基封端化合物反应将会产生多种具有各种尾部数目的不同的可电离脂质化合物。举例来说，二胺或多胺可在分子的各种氨基部分上包括一个、两个、三个或四个环氧基衍生的化合物尾部，从而产生伯胺、仲胺和叔胺。在某些实施例中，使用两种同一类型的环氧基封端化合物。在其它实施例中，使用两种或两种以上不同环氧基封端化合物。
在本发明的一些实施方式中，本发明的阳离子脂质化合物可以采用如下的一般制备方法进行制备。
步骤1：酯化
在缩合剂的存在下，将羧酸化合物A1与醇A2缩合成酯以获得化合物A3。缩合剂的实例包括但不限于DCC、EDCI等。反应所用溶剂的实例包括但不限于醚类(如乙醚、四氢呋喃和二氧六环等)，卤代烃(如氯仿、二氯甲烷和二氯乙烷等)，烃类(如正戊烷、正己烷、苯和甲苯等)，及这些溶剂的两种或以上形成的混合溶剂。
步骤2：环氧化将化合物A3在碱的存在下进行双键的环氧化反应以获得环氧化合物A4。双键环氧化试剂的实例包括但不限于间氯过氧苯甲酸、双氧水等。反应所用溶剂的实例包括但不限于二氯甲烷。
步骤3：开环反应
使化合物A4与胺A5(例如N,N-二(2-氨基乙基)甲胺)发生开环反应以获得最终化合物。反应用溶剂的实例包括但不限于乙醇、甲醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷、己烷、甲苯、乙醚等。
所述制备方法中的原料A1可以商购也可以采用常规方法合成。
本发明的可电离脂质分子具有可降解性，且低毒、有很强的肝外靶向性。其对活性物质(例如核酸如mRNA)具有较高的包封率，较好的细胞转染率。由其制备的脂质纳米颗粒，具有粒径分布均匀的特点。
本发明的可电离脂质化合物在用于药物递送系统时，可囊封药剂，包括多核苷酸、小分子、蛋白质、肽、金属等。所述可电离脂质化合物具有适合于制备药物递送系统的若干性质：1)脂质复合和“保护”不稳定药剂的能力；2)缓冲体内pH值的能力；3)充当“质子海绵”和引起体内溶解的能力；4)中和带负电活性物质上的电荷的能力。
所述药物递送系统可以是粒子形式的。在某些实施例中，粒子直径在1μm到1000μm范围内。在某些实施例中，粒子直径在1nm到1000nm范围内。例如，粒子直径在1μm到100μm范围内，或者在1μm到10μm范围内，或者在10μm到100μm范围内，或者在20nm到800nm范围内，或者在50nm到500nm范围内，或者在80nm到200nm范围内，或者在1nm到100nm范围内，或者在1nm到10nm范围内。当粒子的粒径范围在1nm到1000nm范围内，就是本领域通常所述的纳米颗粒了。所述粒子可使用所属领域中已知的任何方法来制备。这些方法包括(但不限于)喷雾干燥、单一和双重乳液溶剂蒸发、溶剂萃取、相分离、纳米沉淀、微流控、简单和复杂凝聚以及所属领域的普通技术人员熟知的其它方法。
所述药物递送系统还可以是微泡、脂质体。
可通过本发明的可电离脂质化合物形成的递送系统传递的活性物质可为治疗剂、诊断剂或预防剂。活性物质的性质可为小分子化合物、核酸、蛋白质、肽、金属、经同位素标记的化合物、疫苗等。
由本发明的可电离脂质化合物形成的递送系统还可修饰上靶向分子，使其成为靶向剂而能靶向特定细胞、组织或器官。靶向分子可包括在整个递送系统中或可仅位于其表面上。靶向分子可为蛋白质、肽、糖蛋白、脂质、小分子、核酸等，其实例包括(但不限于)抗体、抗体片段、低密度脂蛋白(LDL)、转铁蛋白(transferrin)、脱唾液酸糖蛋白(asialycoprotein)、受体配体、唾液酸、适体等。
由本发明的可电离脂质化合物形成的递送系统可与一种或一种以上医药赋形剂组合形成适合于投予动物(包括人类)的医药组合物。术语“医药赋形剂”的意思是任何类型的无毒、惰性固体、半固体或液体填充剂、稀释剂等，包括但不限于糖，诸如乳糖、海藻糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，诸如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素和其衍生物，诸如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；明胶；滑石；油，诸如花生油、棉籽油、红花油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇，诸如丙二醇；酯，诸如油酸乙酯和月桂酸乙酯；表面活性剂，诸如吐温80(Tween80)；缓冲剂，诸如磷酸盐缓冲溶液、乙酸盐缓冲液和柠檬酸盐缓冲液；着色剂、甜味剂、调味剂和芳香剂、防腐剂和抗氧化剂等。
本发明的医药组合物可经口、经直肠、静脉内、肌注、阴道内、鼻内、腹膜内、经颊或以口服或鼻用喷雾等形式投予人类和/或动物。
一种包含脂质纳米颗粒的组合物，所述脂质纳米颗粒含有式I的可电离脂质分子，或进一步含有其他脂质分子。所述其他脂质分子可以是本领域中用于构建脂质纳米颗粒已知或常规使用的脂质分子，包括但不限于中性脂质分子、胆固醇类脂质分子、PEG化的脂质分子。
在本发明的一个实施方式中，所述脂质纳米颗粒中包含式I的可电离脂质分子、中性脂质分子、胆固醇类脂质分子和PEG化的脂质分子。
根据本发明，所述脂质纳米颗粒中含有占其总体脂质分子20-60mol％的式I的脂质分子，优选25-55mol％，例如可以为30mol％，31mol％，32mol％，33mol％，34mol％，35mol％，36mol％，37mol％，38mol％，39mol％，40mol％，41mol％，42mol％，43mol％，44mol％，45mol％，46mol％，47mol％，48mol％，49mol％，50mol％，51mol％，52mol％，53mol％，54mol％，55mol％等。
根据本发明，所述中性脂质分子是不带电脂质分子或两性离子型脂质分子，例如磷脂酰胆碱类化合物，或/和磷脂酰乙醇胺类化合物。
磷脂酰胆碱类化合物的结构如式E所示：E；磷脂酰乙醇胺类化合物的结构如式F所示：/>F，其中Ra、Rb、Rc、Rd独立的选自直链或支链的C1-30烷基，直链或支链的C2-30烯基，优选为直链或支链的C10-30烷基，直链或支链的C10-30烯基，例如CH3(CH2)17CH2-、CH3(CH2)15CH2-、CH3(CH2)13CH2-、CH3(CH2)11CH2-、CH3(CH2)9CH2-、CH3(CH2)7CH2-、CH3(CH2)7-CH＝CH-(CH2)7-、CH3(CH2)4CH＝CHCH2CH＝CH(CH2)7-、CH3(CH2)7-CH＝CH-(CH2)9-。
中性脂质分子的实例包括但不限于5-十七基苯-1,3-二醇(间苯二酚)、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)、二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)、磷酸胆碱(DOPC)、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(DMPC)、磷脂酰胆碱(PLPC)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DAPC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、卵磷脂酰胆碱(EPC)、二月桂酰基磷脂酰胆碱(DLPC)、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(DMPC)、1-肉豆蔻酰基-2-棕榈酰基磷脂酰胆碱(MPPC)、1-棕榈酰基-2-肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(PMPC)、1-棕榈酰基-2-硬脂酰基磷脂酰胆碱(PSPC)、1,2-二花生酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DBPC)、1-硬脂酰基-2-棕榈酰基磷脂酰胆碱(SPPC)、1,2-二十碳烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DEPC)、棕榈酰油酰基磷脂酰胆碱(POPC)、溶血磷脂酰胆碱、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE)、棕榈酰油酰基磷脂酰乙醇胺(POPE)、溶血磷脂酰乙醇胺以及它们的组合。
在一个实施方案中，中性脂质分子可选自由以下组成的组：二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)。在另一个实施方案中，中性脂质分子可为二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺(DMPE)。在另一个实施方案中，中性脂质分子可为二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)。
根据本发明，中性脂质分子在脂质纳米颗粒的脂质中的摩尔百分比为5-30mol％，例如8-20mol％，例如可以为8mol％，9mol％，10mol％，11mol％，12mol％，13mol％，14mol％，15mol％，16mol％，17mol％，18mol％，19mol％，20mol％。
根据本发明，胆固醇类脂质分子是指甾醇以及含有甾醇部分的脂质，包括但不限于胆固醇，5-十七基间苯二酚，粪甾醇，谷甾醇，麦角甾醇，菜油甾醇，豆甾醇，菜子甾醇，番茄次碱，番茄碱，熊果酸，α-生育酚及其混合物、胆固醇半琥珀酸酯。在一个实施方案中，胆固醇类脂质分子为胆固醇(CHOL)。在一个实施方案中，胆固醇类脂质分子为胆固醇半琥珀酸酯。
根据本发明，胆固醇类脂质分子在脂质纳米颗粒的脂质中的摩尔百分比为30-60mol％，例如可以为30mol％，31mol％，32mol％，33mol％，34mol％，35mol％，36mol％，37mol％，38mol％，39mol％，40mol％，41mol％，42mol％，43mol％，44mol％，45mol％，46mol％，47mol％，48mol％，49mol％，50mol％等，优选35-55mol％，进一步优选37-49mol％。
根据本发明，PEG化的脂质分子包含脂质部分和基于PEG的聚合物部分。在一些实施方案中，PEG化的脂质分子可表示为“脂质部分-PEG-数均分子量”或者“PEG-脂质部分”或者“PEG-数均分子量-脂质部分”，所述脂质部分是二酰基甘油或二酰基甘油酰胺，选自二月桂酰甘油、二肉豆蔻酰甘油、二棕榈酰甘油、二硬脂酰甘油、二月桂基甘油酰胺、二肉豆蔻基甘油酰胺、二棕榈酰甘油酰胺、二硬脂酰甘油酰胺、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺；PEG的数均分子量为约130至约50,000，例如约150至约30,000，约150至约20,000，为约150至约15,000，为约150至约10,000，为约150至约6,000，为约150至约5,000，为约150至约4,000，为约150至约3,000，为约300至约3,000，为约1,000至约3,000，为约1,500至约2,500，例如约2000。
在一些实施方案中，PEG化的脂质分子可选自PEG-二月桂酰甘油、PEG-二肉豆蔻酰甘油(PEG-DMG)、PEG-二棕榈酰甘油、PEG-二硬脂酰甘油(PEG-DSPE)、PEG-二月桂基甘油酰胺、PEG-二肉豆蔻基甘油酰胺、PEG-二棕榈酰甘油酰胺和PEG-二硬脂酰甘油酰胺、PEG-胆固醇(1-[8'-(胆甾-5-烯-3[β]-氧基)甲酰胺基-3',6'-二氧杂辛基]氨基甲酰基-[ω]-甲基-聚(乙二醇)、PEG-DMB(3,4-二-十四氧基苯甲基-[ω]-甲基-聚(乙二醇)醚)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](DMG-PEG2000)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](DSPE-PEG2000)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-甲氧基聚乙二醇(DSG-PEG2000)、聚(乙二醇)-2000-二甲基丙烯酸酯(DMA-PEG2000)和1,2-二硬脂酰氧基丙基-3-胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](DSA-PEG2000)。
根据本发明，PEG化的脂质分子在脂质纳米颗粒的脂质中的摩尔百分比为0.4-10mol％，例如0.5-5mol％，例如可以为0.4mol％，0.5mol％，0.6mol％，0.7mol％，0.8mol％，0.9mol％，1.0mol％，1.1mol％，1.2mol％，1.3mol％，1.4mol％，1.5mol％，1.6mol％，1.7mol％，1.8mol％，1.9mol％，2.0mol％，2.1mol％，2.2mol％，2.3mol％，2.4mol％，2.5mol％，2.6mol％，2.7mol％，2.8mol％，2.9mol％，3.0mol％，3.1mol％，3.2mol％，3.3mol％，3.4mol％，3.5mol％，3.6mol％，3.7mol％，3.8mol％，3.9mol％，4.0mol％，4.1mol％，4.2mol％，4.3mol％，4.4mol％，4.5mol％，4.6mol％，4.7mol％，4.8mol％，4.9mol％，5.0mol％等。
在本发明的一些实施方式中，所述包含脂质纳米颗粒的组合物进一步包含活性物质，活性物质位于脂质纳米颗粒中。
在本发明的一些实施方式中，所述包含脂质纳米颗粒的组合物是冻干制剂形式。
所述冻干制剂复溶后形成的液体制剂中，所述脂质纳米颗粒的粒径在1-1000nm，多分散性指数≤0.5，电动电位在-45～60mV；优选为，粒径在20-500nm，多分散性指数≤0.5，电动电位在-45～60mV；进一步优选为，粒径在45-300nm，多分散性指数≤0.5，电动电位在-45～50mV；更优选为，粒径在60-300nm，多分散性指数≤0.3，电动电位在-45～50mV。
发明人通过研究发现，冻干制剂复溶后的液体制剂中的脂质纳米颗粒的粒径会比冻干前的粒径有所增大，增大的范围不会超过100nm，通常在80nm以下，推测原因可能是冻干过程中和/或复溶过程中存在脂质纳米颗粒的融合等。因此可以根据复溶后制剂中所要求的的脂质纳米颗粒的粒径大小，来调整冻干前制剂中脂质纳米颗粒的粒径。
所述冻干制剂中进一步含有冻干保护剂。所述冻干保护剂可以是本领域中常用的冻干保护剂，包括但不限于蔗糖、海藻糖和麦芽糖。在本发明的一些实施方式中，所述冻干保护剂是蔗糖、海藻糖和麦芽糖中的一种或任意两种的混合物或三种的混合物。在本发明的一个实施方式中，所述冻干保护剂是蔗糖。所述冻干保护剂的含量占冻干制剂复溶后的液态制剂的5-30w/v％，优选为8-15w/v％，例如5.5w/v％，6w/v％，6.5w/v％，7w/v％，7.5w/v％，8w/v％，8.5w/v％，9w/v％，9.5w/v％，10w/v％，10.5w/v％，11w/v％，11.5w/v％，12w/v％，12.5w/v％，13w/v％，13.5w/v％，14w/v％，14.5w/v％，15w/v％，15.5w/v％，16w/v％，16.5w/v％，17w/v％，17.5w/v％，18w/v％，18.5w/v％，19w/v％，19.5w/v％，20w/v％，20.5w/v％，21w/v％，21.5w/v％，22w/v％，22.5w/v％，23w/v％，23.5w/v％，24w/v％，24.5w/v％，25w/v％，25.5w/v％，26w/v％，26.5w/v％，27w/v％，27.5w/v％，28w/v％，28.5w/v％，29w/v％，29.5w/v％等。
所述冻干制剂中进一步含有缓冲盐。所述缓冲盐可以是本领域中常用的缓冲盐，包括但不限于Tris，Hepe，EDTA，柠檬酸-柠檬酸盐，乙酸-乙酸盐，磷酸盐-磷酸氢盐，碳酸盐-碳酸氢盐等。所述缓冲盐的含量占冻干制剂复溶后的液体制剂的0.05-1w/v％，优选为0.1-0.5w/v％。冻干制剂复溶后的液体制剂的pH值可以为4-9。对于静脉注射用液体制剂，通常更优选pH为6-8。对于非静脉注射用液体制剂，例如肌肉注射用，可以容忍相对较宽的pH值。
所述冻干制剂中进一步含有渗透压调节剂。所述渗透压调节剂可以是本领域中常用的渗透压调节剂，包括但不限于氯化钠、氯化钾、氯化钙、葡萄糖、磷酸盐、枸橼酸盐等。所述渗透压调节剂的用量使得冻干制剂复溶后的液体制剂为0.5～3个等渗浓度的溶液。对于静脉注射用液体制剂，通常更优选为0.9～1.5个等渗浓度的溶液。对于非静脉注射用液体制剂，例如肌肉注射用，其等渗浓度范围可以在较大范围内被身体容忍，一般可以是0.5～3个等渗浓度的溶液。
在使用前，可以采用本领域已知的方法，通过使用注射用溶液将所述冻干制剂复溶成液态制剂，然后进行注射给药。所述注射用溶液可以是注射用水、0.9％注射用氯化钠溶液、或者注射用葡萄糖溶液。
可以采用本领域已知的冻干技术，在获得包含所述脂质纳米颗粒的液态组合物后，制备本发明的冻干制剂。
在本发明的一些实施方式中，制备含有脂质纳米颗粒的液体组合物的方法包括：1)制备含有式I化合物、中性脂质分子、胆固醇类脂质分子、PEG化的脂质分子的有机相；2)制备含有活性成分的水相；3)将有机相和水相进行混合，制备脂质纳米颗粒混悬液；4)将所述混悬液浓缩后，加入冻干保护剂，或进一步加入缓冲盐和/或渗透压调节剂。所述步骤1)中，优选，使用无水乙醇或乙醇的水溶液作为溶剂。所述步骤2)中，优选使用水作为溶剂。所述步骤3)中，优选有机相和水相的体积比为1:2～4。
在本发明中，步骤4)中浓缩得到的混悬液在加入冻干保护剂等物质后，就是冻干前液体制剂，其体积与冻干制剂复溶后形成的液体制剂的体积优选是相同的，这样，加入到混悬液中的冻干保护剂、缓冲盐和/或渗透压调节剂等辅料的含量，与冻干制剂复溶后形成的液体制剂中各物质的含量是相同的。
在本发明的一些实施方式中，冻干制剂的制备方法包括预冻、一次干燥和二次干燥。优选所述预冻为-40℃至-60℃保持2-50h；所述一次干燥为在真空度为0.02mbar-0.6mbar条件下，-30℃至-55℃保持10-80h；所述二次干燥为在真空度为0.02mbar-0.6mbar条件下，4℃至20℃保持10-30h。
如本文中所使用，术语“烷基”是指从含有碳原子的烃部分通过去除单个氢原子得到的饱和烃基。烷基的实例包括(但不限于)甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、正己基、正庚基、正辛基、正癸基、正十一烷基和正十二烷基。
术语“烯基”表示从具有至少一个碳-碳双键的烃部分通过去除单个氢原子得到的单价基团。烯基包括例如例如乙烯基、丙烯基、丁烯基、1-甲基-2-丁烯-1-基等。
术语“炔基”是指从具有至少一个碳-碳三键的烃通过去除单个氢原子得到的单价基团。代表性炔基包括乙炔基、2-丙炔基(炔丙基)、1-丙炔基等。
术语“烷氧基”是指如前文所定义的烷基通过氧原子连接于母体分子。烷氧基的实例包括(但不限于)甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、叔丁氧基、新戊氧基和正己氧基。
术语“卤基”和“卤素”是指选自氟、氯、溴和碘的原子。
术语“经取代”(无论前面是否存在术语“任选地”)和“取代基”是指将一个官能团变为另一个官能团的能力，条件是维持所有原子的价数。当任何特定结构中的一个以上位置可经一个以上选自指定群组的取代基取代时，所述取代基可在每一位置相同或不同。
术语“包含”为开放式表达，即包括本发明所指明的内容，但并不排除其他方面的内容。应当理解，术语“包含”可以涵盖封闭式的含义，即“由…组成”。
当公开了数值范围的下限和上限时，落入该范围中的任何数值和任何包括的范围都被具体公开。特别地，本文公开的值的每个取值范围应理解为表示涵盖于较宽范围中的每个数值和范围。
附图说明
图1实施例2制备的LNP的冷冻电镜照片。图中左下角标尺为50nm。
图2实施例2制备的LNP的细胞培养后细胞存活率统计图。
图3实施例2制备的LNP与Lipofectamine 2000Reagent或ALC-0315作为载体，对Luciferase mRNA递送入细胞后，相对荧光强度统计图；其中，上图为T7与Lipofectamine2000Reagent的对比图，下图为T7(Target 7)与ALC-0315的对比图。
图4静脉注射mRNA-LNP(T7)和mRNA-LNP(ALC-0315)后，动物离体器官荧光成像
图5肌肉注射mRNA-LNP(T7)和mRNA-LNP(ALC-0315)后，动物活体及离体器官荧光成像
图6肌肉注射mRNA-LNP(T7)和mRNA-LNP(ALC-0315)后，动物淋巴结荧光成像
图7T7 mRNA-LNP在冻干复溶后和冻存复融后细胞转染效率统计图
图8T7 mRNA-LNP在冻干复溶后和冻存复融后细胞毒性数据统计图
图9T7-4 mRNA-LNP的细胞毒性对比图
图10T7-4 mRNA-LNP的细胞转染效果对比图
具体实施方式
下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。所用生物学方法都是本领域已知和常规的生物学方法，或者可以参照所用试剂盒的说明指引进行操作。
实施例1阳离子脂质分子的合成
1、化合物T7的合成
底物化合物10-十一烯酸(10.0克，54.3毫摩尔，1.0当量)溶于二氯甲烷(70毫升)，室温下加入化合物3-辛醇(7.07克，54.3毫摩尔，1.0当量)和EDCI(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐)(12.5克，65.1毫摩尔，1.2当量)和4-二甲基氨基吡啶(663毫克，5.43毫摩尔，0.1当量)。得到的反应液在15度下搅拌15小时。TLC(石油醚，产品Rf值为0.7，碘显色)点板监测原料反应完全有个小极性的主点生成。反应液通过滴加100毫升水淬灭，用二氯甲烷(200毫升，100毫升)萃取。合并有机相蒸发浓缩，得到的粗产品用柱层析纯化，用石油醚比乙酸乙酯30/1到20/1洗脱得到产品化合物2(11.0克,37.1毫摩尔，68.4％收率)无色油。1H NMR:400MHz(CDCl3)δ5.74-5.89(m,1H),4.90-5.07(m,2H),4.82(quin,J＝6.0Hz,1H),2.29(t,J＝7.6Hz,2H),2.04(q,J＝6.8Hz,2H),1.46-1.66(m,6H),1.17-1.40(m,16H),0.81-0.96(m,6H).
底物化合物2(11.0克，37.1毫摩尔，1.0当量)溶于二氯甲烷(70毫升)，室温下加入间氯过氧苯甲酸(12.0克，55.6毫摩尔，1.5当量)。得到的反应液在15度下搅拌15小时。TLC(石油醚比乙酸乙酯10/1，产品Rf值为0.45，碘显色)点板监测原料反应完全有个大极性的主点生成。反应液通过滴加200毫升的10％亚硫酸氢钠淬灭，用二氯甲烷(200毫升，100毫升)萃取。合并有机相用碳酸氢钠水溶液洗涤，蒸发浓缩，得到的粗产品用柱层析纯化，用石油醚比乙酸乙酯100/1到10/1洗脱得到产品化合物3(10.0克,32毫摩尔，86.3％收率)无色油。1HNMR:400MHz(CDCl3)δ4.82(quin,J＝6.4Hz,1H),2.86-2.95(m,1H),2.75(t,J＝4.4Hz,1H),2.47(dd,J＝4.8,2.8Hz,1H),2.29(t,J＝7.2Hz,2H),1.39-1.69(m,10H),1.20-1.39(m,14H),0.84-0.93(m,6H).
底物化合物4N,N-二(2-氨基乙基)甲胺(1.0克，8.53毫摩尔，1.0当量)溶于乙醇(15毫升)，室温下加入化合物3(8.0克，25.6毫摩尔，2.5当量)。得到的反应液在90度(油浴温度)下氮气保护搅拌10小时。反应液通过滴加200毫升的10％亚硫酸氢钠淬灭，用二氯甲烷(200毫升，100毫升)萃取，粗产品用柱层析纯化TLC(二氯甲烷比甲醇＝10/1，产品Rf值为0.4，碘显色)，用二氯甲烷比甲醇20/1到5/1洗脱得到产品化合物T7(6.0克,54.1％收率)无色油。1H NMR:400MHz(CDCl3)δ4.82(quin,J＝6.4Hz,3H),3.51-3.75(m,3H),2.32-2.95(m,13H),2.21-2.32(m,10H),1.41-1.66(m,22H),1.29(br s,48H),0.83-0.94(m,18H).MS(ESI)：calcd for C62H123N3O9[M+2H]2+,528.0；found,528.0.
2、化合物T7-2的合成
底物化合物4N,N-二(2-氨基乙基)甲胺(1.0克，8.53毫摩尔，1.0当量)溶于乙醇(15毫升)，室温下加入化合物3(10.7克，17.0毫摩尔，2.0当量)。得到的反应液在70度(油浴温度)下氮气保护搅拌6小时。反应液通过滴加200毫升的10％亚硫酸氢钠淬灭，用二氯甲烷(200毫升，100毫升)萃取。反应液蒸发浓缩，粗产品用柱层析纯化TLC(二氯甲烷比甲醇＝8/1，产品Rf值为0.3，碘显色)，用二氯甲烷比甲醇20/1到5/1洗脱得到产品化合物T7-2(5.0克,79.0％收率)无色油。1H NMR:400MHz(CDCl3)δ：4.81(m,2H),4.27-4.23(m,5H),3.72-3.65(m,2H),3.02–2.53(m,9H),2.51–2.23(m,7H),1.67-1.28(m,50H),0.91–0.83(m,12H).MS(ESI):calcd for C43H87N3O6[M+H]+,742.7；found,742.7.
3、化合物T7-4的合成
底物化合物4N,N-二(2-氨基乙基)甲胺(1.0克，8.53毫摩尔，1.0当量)溶于乙醇(15毫升)，室温下加入化合物3(13.34克，42.6毫摩尔，5.0当量)。得到的反应液在90度(油浴温度)下氮气保护搅拌8小时。反应液通过滴加200毫升的10％亚硫酸氢钠淬灭，用二氯甲烷(200毫升，100毫升)萃取。反应液蒸发浓缩，粗产品用柱层析纯化TLC(二氯甲烷比甲醇＝10/1，产品Rf值为0.3，碘显色)，用二氯甲烷比甲醇20/1到5/1洗脱得到产品化合物T7-4(7.10克,83.0％收率)无色油。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:6.02(2H),4.81(m,4H),3.59(m,4H),2.48–2.43(m,2H),2.34–2.09(m,15H),1.67–1.48(m,26H),1.43(s,4H),1.34–1.22(m,65H),0.91–0.83(m,24H).MS(ESI):calcd for C81H159N3O12[M+2H]2+,684.1；found,684.2.[M+H]+,1367.2；found,1367.2.[M+Na]+,1389.2；found,1389.1
实施例2T7包裹mRNA制备脂质纳米颗粒
准确称取化合物T7、DSPC、CHOL、DMG-PEG2000等，将每种脂质于适当容器中，无水乙醇充分溶解备用。将各脂质按下表中的摩尔比例混合均匀，作为有机相，将核酸Luciferase mRNA溶于pH4.0盐酸溶液中，作为水相。有机相与水相体积比例为3:1混合，流速为15mL/min，在微流控平台(迈安纳)上制备得到脂质纳米颗粒混悬液。将得到的脂质纳米颗粒悬浮液经100KDa超滤离心管离心过滤，纯化浓缩，将浓缩后的液体进行分装。
将制备所得脂质纳米颗粒用激光纳米粒度仪测粒径、PDI、电位，用多功能酶标仪结合RiboGreen RNA试剂盒测包封率(％)以及冷冻电镜成像(见图1)。
表1.Luc-T7-R-LNP的理化性质
1)细胞毒性实验
用含10％胎牛血清的培养基将293T细胞制成单个细胞悬液，采用血球计数板计数后，以每孔4000～10000个细胞的浓度接种于96孔板中，每孔体积为100μL，置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养过夜；细胞贴壁后加入Luciferase mRNA浓度梯度为0.25μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml的Luc-T7-R-LNP-22092104批脂质纳米颗粒悬浮液样品，继续在培养箱中培养过夜；24h后吸取孔内含有脂质纳米颗粒的培养基，并用PBS润洗1～2次，随后加入CCK-8试剂，在培养箱中继续培养2h，酶标仪检测各孔450nm处的吸光度，设定650nm吸收为参比，记录结果。
结果见图2：当Luciferase mRNA浓度在高达16μg/ml时，细胞存活率仍高达50％以上，表明T7脂质分子制备的LNP具有较低的细胞毒性，在细胞水平上T7脂质纳米颗粒安全性较好。
2)细胞转染实验
用含10％胎牛血清的培养基将293T细胞制成单个细胞悬液，采用血球计数板计数后，以每孔8000～10000个细胞的浓度接种于96孔板中，每孔体积为100μL，置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养过夜，进行细胞转染实验时，细胞密度达到70％-90％。
配制阳性对照。具体过程如下：首先加入5μl OPTI-MEM(1X)Reduced SerumMedium细胞培养基于1.5ml EP管中，并加入0.3μl Lipofectamine 2000Reagent混匀。然后将5μlOPTI-MEM(1X)Reduced Serum Medium细胞培养基于1.5ml EP管中，并加入0.3μlLuciferase mRNA混匀。将稀释后Lipofectamine 2000Reagent和稀释后Luciferase mRNA1:1(v/v)混合，室温静置10min。阳性对照组Luciferase mRNA浓度为1μg/ml。
将阳性对照组、阴性对照组以及前述Luc-T7-R-LNP-22092104批脂质纳米颗粒悬浮液样品均匀滴加到对应每孔细胞中，每组3个复孔；阳性对照组中滴加Lipofectamine2000Reagent混合后的Luciferase mRNA，“Nagative control”(NC)为阴性对照组不添加mRNA样品。阳性对照组和脂质纳米颗粒悬浮液样品浓度为1μg/ml。混匀后放入二氧化碳培养箱培养24h。
细胞培养24h后，从细胞培养箱中取出含哺乳动物细胞的培养板，放置5-15min，平衡至室温。加入与待测细胞培养液等体积并平衡至室温的检测试剂(辉光型萤火虫萤光素酶缓冲液)。为了使得细胞裂解充分，在水平摇床上室温混匀5-10min，在化学发光检测仪或带化学发光模块的多功能酶标仪上检测发光信号，加入检测试剂后2h内完成检测。
结果如图3上图：其中“Luc-T7-R-LNP-22092104”是前述配方包载的LuciferasemRNA，“lipo2000-Luc mRNA”是Lipofectamine 2000 Reagent包载Luciferase mRNA，“Nagative control”为不含mRNA的空白脂质纳米颗粒。从图3可以看出包裹LuciferasemRNA浓度为1μg/ml时，Luc-T7-R-LNP-22092104的相对荧光强度较强，其转染效率高于商品化的Lipofectamine 2000 Reagent。
ALC 0315为：((4-羟基丁基)氮杂二基)双(己烷-6,1-二基)双(2-己基癸酸酯)。分别按照前述方法和BioNtech公布数据进行T7和ALC 0315的脂质纳米颗粒制备，具体摩尔配比为：T7:DSPC:CHOL:DMG-PEG2000＝45:15:38.5:1.5；ALC 0315:DSPC:CHOL:ALC 0159＝46.3：9.4：42.7：1.6；包载Luciferase mRNA。
制备得到的脂质纳米颗粒理化质控数据如下表所示：
| 样本信息 | 粒径(nm) | PDI | Zeta电位 | 包封率 |
| mRNA-LNP(T7) | 81.21±0.38 | 0.050 | 22.48 | 99.16 |
| mRNA-LNP(ALC 0315) | 71.29±0.95 | 0.103 | 23.56 | 92.95 |
由上表可见，由T7制备的LNP与ALC 0315制备的LNP理化性质无显著性差异，粒径均小于100nm，PDI<0.2，包封率均达到90％以上，但在PDI与包封率上T7较ALC 0315更优异。
采用相同的转染方式，将制备的脂质纳米颗粒转染细胞，了解蛋白的表达情况，结果如图3下图所示，T7制备的脂质纳米颗粒携带mRNA转染细胞之后，相对荧光强度高于mRNA-LNP(ALC 0315)，说明细胞中蛋白表达量高于ALC 0315。因此，与ALC0315可电离脂质的转染效果相比，T7制成的脂质纳米颗粒具有更高的转染效果。
3)体内递送与器官靶向性
按照前述制备方法制备mRNA-LNP(T7)和mRNA-LNP(ALC-0315)动物实验用样品，-80℃冻存处理后进行体内表达实验。实验动物为C57小鼠，给药方式为静脉注射和肌肉注射两种，给药剂量为0.75mg/kg，成像时间为给药后6h，评价方式为小动物活体成像。静脉注射后，各组脂质纳米颗粒主要通过血液分布到各器官，其中荧光信号强弱代表脂质纳米颗粒在体内分布的强弱。
静脉注射方式下小动物离体器官成像结果见图4：mRNA-LNP(T7)主要分布于肝和脾，少量分布于肺部；mRNA-LNP(ALC-0315)主要分布于肝，且其在肝部的荧光强度高于mRNA-LNP(T7)的，其他器官无明显荧光信号。
这说明，与mRNA-LNP(ALC-0315)相比，mRNA-LNP(T7)潜在的肝毒性较弱，肝部代谢脂质纳米颗粒比例降低，免疫器官靶向性增强，可更好地发挥免疫作用。
肌肉注射方式下小动物活体和离体器官成像结果分别见图5和图6。肌肉部位有大量淋巴细胞，可通过淋巴途径将脂质纳米颗粒转运至淋巴循环，发挥免疫作用，也可通过在注射部位表达蛋白，蛋白进入血液循环后，发挥免疫作用。由图5可见，mRNA-LNP(ALC-0315)和mRNA-LNP(T7)在注射部位荧光强度无显著性差异，且均分布于肝和脾，其中mRNA-LNP(T7)在脾中的荧光信号强度高于mRNA-LNP(ALC-0315)。图6结果显示mRNA-LNP(T7)在淋巴结中的荧光信号强度高于mRNA-LNP(ALC-0315)，表明mRNA-LNP(T7)淋巴组织靶向性更强，可更好地发挥免疫作用。
4)脂质纳米颗粒冻干样品制备
按照前述制备方法进行T7脂质纳米颗粒液态样品制备，包载Luciferase mRNA，分别冻干和-80℃冻存处理。冻干程序包含预冻、退火、一次干燥、二次干燥。预冻-40℃保持40h；退火-5℃保持2h；一次干燥在真空度为0.03-0.6mbar情况下，-35℃保持40h；二次干燥在真空度为0.03-0.6mbar情况下，10℃保持20h。
冻干后复溶和冻存后复融的脂质纳米颗粒液态样品理化质控数据如下表所示：
| 样本信息 | 粒径(nm) | PDI | Zeta电位 | 包封率 |
| T7 mRNA-LNP(冻干) | 213.80±4.50 | 0.141 | 27.31 | 96.10 |
| T7 mRNA-LNP(冻存) | 90.79±1.50 | 0.155 | 20.35 | 97.37 |
由上表可见，冻干后复溶的T7 mRNA-LNP的理化数据仍符合指控标准：脂质纳米颗粒的粒径在60-300nm，PDI≤0.3，Zeta电位在-45～50mV，包封率≥80％。
将冻干后复溶的和冻存后复融的脂质纳米颗粒进行细胞转染，了解蛋白的表达情况。结果如图7所示，T7 mRNA-LNP冻存样品的相对荧光强度高于冻干样品，但与商业化阳离子试剂lipo2000转染mRNA能力相当(p>0.05)，表明虽然T7脂质纳米颗粒冻干制剂转染能力有所降低，但是仍可以高效递送mRNA至细胞并表达。T7 mRNA-LNP冻干和冻存样品的细胞毒性结果如图8所示，T7 mRNA-LNP(冻干)和T7 mRNA-LNP(冻存)的细胞存活率较高，IC50值均高于16μg/ml，细胞毒性低。
实施例3 T7-4制备脂质纳米颗粒
准确称取化合物T7-4、DSPC、CHOL、DMG-PEG2000等，将每种脂质于适当容器中，无水乙醇充分溶解备用。将各脂质按摩尔比例(T7-4:DSPC:CHOL:DMG-PEG2000＝25：20：53：2)混合均匀，作为有机相，将核酸Luciferase mRNA溶于pH5.0醋酸盐缓冲溶液中，作为水相。水相与有机相体积比例为3:1混合，流速为12mL/min，在微流控平台(迈安纳)上制备得到脂质纳米颗粒混悬液。将得到的脂质纳米颗粒悬浮液经100KDa超滤离心管离心过滤，纯化浓缩，将浓缩后的液体进行分装，-80℃冻存处理。
将新鲜制备所得脂质纳米颗粒用激光纳米粒度仪测粒径、PDI、电位，用多功能酶标仪结合RiboGreen RNA试剂盒测包封率(％)。
1)细胞毒性实验
用含10％胎牛血清的培养基将293T细胞制成单个细胞悬液，采用血球计数板计数后，以每孔4000～10000个细胞的浓度接种于96孔板中，每孔体积为100μL，置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养过夜；细胞贴壁后加入Luciferase mRNA浓度梯度为0.25μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml的Luc-T7-4-R-LNP-22110908批脂质纳米颗粒悬浮液样品，继续在培养箱中培养过夜；24h后吸取孔内含有脂质纳米颗粒的培养基，并用PBS润洗1～2次，随后加入CCK-8试剂，在培养箱中继续培养2h，酶标仪检测各孔450nm处的吸光度，设定650nm吸收为参比，记录结果。
结果如图9：与Lipo2000相比，Luc-T7-4-R-LNP-22110908的细胞毒性较低，表明在细胞水平上T7-4脂质纳米颗粒安全性较好。
2)细胞转染实验
用含10％胎牛血清的培养基将293T细胞制成单个细胞悬液，采用血球计数板计数后，以每孔8000～10000个细胞的浓度接种于96孔板中，每孔体积为100μL，置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养过夜，进行细胞转染实验时，细胞密度达到70％-90％。
配制阳性对照。具体过程如下：首先加入5μl OPTI-MEM(1X)Reduced SerumMedium细胞培养基于1.5ml EP管中，并加入0.3μl Lipofectamine 2000Reagent混匀。然后将5μlOPTI-MEM(1X)Reduced Serum Medium细胞培养基于1.5ml EP管中，并加入0.3μlLuciferase mRNA混匀。将稀释后Lipofectamine 2000Reagent和稀释后Luciferase mRNA1:1(v/v)混合，室温静置10min。阳性对照组Luciferase mRNA浓度为1μg/ml。
将阳性对照组、阴性对照组以及前述Luc-T7-4-R-LNP-22110908批脂质纳米颗粒悬浮液样品均匀滴加到对应每孔细胞中，每组3个复孔；阳性对照组中滴加Lipofectamine2000Reagent混合后的Luciferase mRNA，为阴性对照组不添加mRNA样品。阳性对照组和脂质纳米颗粒悬浮液样品浓度为1μg/ml。混匀后放入二氧化碳培养箱培养24h。
细胞培养24h后，从细胞培养箱中取出含哺乳动物细胞的培养板，放置5-15min，平衡至室温。加入与待测细胞培养液等体积并平衡至室温的检测试剂(辉光型萤火虫萤光素酶缓冲液)。为了使得细胞裂解充分，在水平摇床上室温混匀5-10min，在化学发光检测仪或带化学发光模块的多功能酶标仪上检测发光信号，加入检测试剂后2h内完成检测。
结果如图10：其中“Luc-T7-4-R-LNP-22110908”是前述配方包载的LuciferasemRNA，“lipo2000-Luc mRNA”是Lipofectamine 2000Reagent包载Luciferase mRNA，从图中可以看出Luc-T7-4-R-LNP-22110908的转染属于浓度依赖型，在Luciferase mRNA浓度为2μg/ml时转染效率最高，比商品化Lipofectamine 2000转染效率略低。
以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种可电离脂质分子，其具有如式I所示的结构其中：
R1为氢，经取代或未取代的直链或支链C1-20烷基，经取代或未取代的直链或支链C2-20烯基，经取代或未取代的直链或支链C2-20炔基，所述取代的取代基团选自卤素、-OH、＝O、直链或支链的C1-10烷基、直链或支链的C1-10烷氧基；以上所有的烷基、烯基、炔基或烷氧基，其碳链中的1个或1个以上的C原子可任选被独立地选自O、S和N的杂原子所替换；
n为选自1-10的正整数；m为选自1-10的正整数；n和m可以相同或不同；优选，n为选自1-6的正整数，m为选自1-6的正整数；
每个R2彼此独立地选自氢，经取代或未取代的直链或支链C1-30烷基，经取代或未取代的直链或支链C2-30烯基，经取代或未取代的直链或支链C2-30炔基；所述取代的取代基团选自卤素、-OH、＝O、直链或支链的C1-10烷基、直链或支链的C1-10烷氧基，直链或支链的C2-20烯基；以上所有的烷基、烯基、炔基或烷氧基，其碳链中的1个或1个以上的C原子可任选被独立地选自O、S和N的杂原子所替换；
条件是，至少有一个R2为
o独立地选自1-20的正整数；
R’选自经取代或未取代的直链或支链C1-30烷基，经取代或未取代的直链或支链C2-30烯基，经取代或未取代的直链或支链C2-30炔基；所述取代的取代基团选自＝O、卤素、-OH、直链或支链的C1-20烷基、直链或支链的C1-20烷氧基，直链或支链的C2-20烯基；以上所有的烷基、烯基、炔基或烷氧基，其碳链中的1个或1个以上的C原子可任选被独立地选自O、S和N的杂原子所替换；
当有至少两个R2为时，它们可以相同或不同。
2.如权利要求1所述的可电离脂质分子，其特征在于，R1为未取代的直链或支链C1-10烷基；
优选，R1为未取代的直链或支链C1-6烷基。
3.如权利要求1或2所述的可电离脂质分子，其特征在于，每个R2彼此独立地选自氢，经取代或未取代的直链或支链C10-30烷基，经取代或未取代的直链或支链C10-30烯基，经取代或未取代的直链或支链C10-30炔基；所述取代的取代基团选自-OH、＝O、直链或支链的C1-10烷基、直链或支链的C1-10烷氧基，直链或支链的C10-20烯基；以上所有的烷基、烯基、炔基或烷氧基，其碳链中的1个或1个以上的C原子可任选被独立地选自O、S和N的杂原子所替换；
优选，o独立地选自4-12的正整数。
4.如权利要求1-3任一项所述的可电离脂质分子，其特征在于，R’选自经取代或未取代的直链或支链C5-30烷基，经取代或未取代的直链或支链C10-30烯基，经取代或未取代的直链或支链C10-30炔基；所述取代的取代基团选自＝O、-OH、直链或支链的C1-10烷基、直链或支链的C1-10烷氧基，直链或支链的C10-20烯基；以上所有的烷基、烯基、炔基或烷氧基，其碳链中的1个或1个以上的C原子可任选被独立地选自O、S和N的杂原子所替换；
优选，R’为经取代或未取代的直链或支链C5-30烷基，所述取代基为直链或支链的C1-10烷基；或，
优选，R’为其中x独立地为1-5的正整数，y独立地为2-15的正整数；或，
优选，R’为经取代或未取代的所述取代基为直链或支链的C1-10烷基或/>其中每个a可以相同或不同，彼此独立地选自1-10的正整数，每个b可以相同或不同，均彼此独立地选自1-10的正整数；或，
优选，R’为经取代或未取代的-(CH2)c-S-S-R”，所述取代基为直链或支链的C1-10烷基或-(CH2)c-S-S-R”，每个c可以相同或不同，彼此独立地选自1-5的正整数，其中，R”为经取代或未取代的直链或支链C2-20烷基，经取代或未取代的直链或支链C2-20烯基，所述取代基选自卤素、-OH、＝O、直链或支链的C1-10烷基、直链或支链的C1-10烷氧基。
5.如权利要求1-4任一项所述的可电离脂质分子，其特征在于，R2彼此独立地选自氢，且当至少2个R2为/>时，它们结构是相同的；
优选，三个R2为且它们的结构是相同的，一个R2为H。
6.如权利要求1-5任一项所述的可电离脂质分子，其选自如下化合物：
7.一种包含脂质纳米颗粒的组合物，所述脂质纳米颗粒含有权利要求1-6任一项所述的式I的可电离脂质分子；
优选，所述脂质纳米颗粒中进一步包含中性脂质分子、胆固醇类脂质分子和PEG化的脂质分子；
优选，所述脂质纳米颗粒中含有占其总体脂质分子20-60mol％的式I的脂质分子；
优选，所述中性脂质分子选自磷脂酰胆碱类化合物或/和磷脂酰乙醇胺类化合物；
优选，所述中性脂质分子在脂质纳米颗粒的脂质中的摩尔百分比为5-30mol％；
优选，所述胆固醇类脂质分子选自胆固醇，5-十七基间苯二酚，粪甾醇，谷甾醇，麦角甾醇，菜油甾醇，豆甾醇，菜子甾醇，番茄次碱，番茄碱，熊果酸，α-生育酚及其混合物、胆固醇半琥珀酸酯；
优选，所述胆固醇类脂质分子在脂质纳米颗粒的脂质中的摩尔百分比为30-60mol％；
优选，所述PEG化的脂质分子包含脂质部分和基于PEG的聚合物部分，所述脂质部分是二酰基甘油或二酰基甘油酰胺，PEG的数均分子量为130至50,000；
优选，所述PEG化的脂质分子在脂质纳米颗粒的脂质中的摩尔百分比为0.4-10mol％。
8.如权利要求7所述的组合物，其特征在于，所述组合物是冻干制剂形式；
优选，所述冻干制剂复溶后形成的液体制剂中，所述脂质纳米颗粒的粒径在1-1000nm，多分散性指数≤0.5，电动电位在-45～60mV；优选为，粒径在20-500nm，多分散性指数≤0.5，电动电位在-45～60mV；进一步优选为，粒径在45-300nm，多分散性指数≤0.5，电动电位在-45～50mV；更优选为，粒径在60-300nm，多分散性指数≤0.3，电动电位在-45～50mV。
9.如权利要求8所述的组合物，其特征在于，所述冻干制剂中进一步含有冻干保护剂，所述冻干保护剂的含量占冻干制剂复溶后的液态制剂的5-30w/v％；
优选，所述冻干制剂中进一步含有缓冲盐，所述缓冲盐的含量占冻干制剂复溶后的液体制剂的0.05-1w/v％；
优选，所述冻干制剂中进一步含有渗透压调节剂，所述渗透压调节剂的用量使得冻干制剂复溶后的液体制剂为0.5～3个等渗浓度的溶液。
10.权利要求1-7任一项所述的可电离脂质分子在制备生物活性物质递送系统中的应用；
优选，所述递送系统是微粒、纳米粒子、脂质体、脂质纳米颗粒或微泡；
优选，所述生物活性物质是核酸、蛋白或小分子化合物。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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