JP6640750B2 - カチオン性脂質 - Google Patents
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Description
また、カチオン性脂質を含む核酸導入剤を用いて核酸導入を達成する方法を提供することである。
[1]式(1)
Xa及びXbは独立して、エステル結合、アミド結合、カーバメート結合、又はエーテル結合を表し、
R2a及びR2bは独立して、ステロール残基、脂溶性ビタミン残基、又は炭素数13〜23の脂肪族炭化水素基を表す)で示されるカチオン性脂質。
[2]R1a及びR1bが独立して、アルキレン基である[1]記載のカチオン性脂質。
[3]Xa及びXbがエステル結合である、[1]又は[2]に記載のカチオン性脂質。
[4]R2a及びR2bが独立して、脂溶性ビタミン残基、又は炭素数13〜23の脂肪族炭化水素基である[1]〜[3]のいずれかに記載のカチオン性脂質。
[5]R2a及びR2bが独立して、脂溶性ビタミン残基である[1]〜[4]のいずれかに記載のカチオン性脂質。
[6]R2a及びR2bが独立して、炭素数13〜23の脂肪族炭化水素基である[1]〜[4]のいずれかに記載のカチオン性脂質。
[7][1]〜[6]のいずれかに記載のカチオン性脂質を膜の構成脂質として含む脂質膜構造体。
[8][1]〜[6]のいずれかに記載のカチオン性脂質、又は[7]記載の脂質膜構造体を含む核酸導入剤。
[9][1]〜[6]のいずれかに記載のカチオン性脂質、又は[7]記載の脂質膜構造体に抗炎症剤を封入した核酸導入剤。
[10]生体外において、核酸を内封した[8]又は[9]記載の核酸導入剤と細胞とを接触させることを含む、当該核酸を当該細胞内へ送達する方法。
[11]核酸を封入した[8]又は[9]記載の核酸導入剤を、標的細胞へ送達されるように、生体へ投与することを含む、当該核酸を当該細胞内へ導入する方法。
R1aおよびR1bは独立して、炭素数8以下(炭素数1〜8)のアルキレン基を表し、
XaおよびXbはエステル結合を表し、
R2aおよびR2bは独立して、脂溶性ビタミン残基(例、トコフェロールヘミコハク酸エステル由来の基)を表す。
一態様において、
R1aおよびR1bは独立して、炭素数8以下(炭素数1〜8)のアルキレン基を表し、
XaおよびXbはエステル結合を表し、
R2aおよびR2bは独立して、炭素数13〜23の脂肪族炭化水素基(例、ヘプタデカジエニル基、ヘプタデセニル基)を表す。
R1aおよびR1bは、炭素数8以下(炭素数1〜8)のアルキレン基を表し、
XaおよびXbは、エステル結合を表し、
R2aおよびR2bは、脂溶性ビタミン残基(例、トコフェロールヘミコハク酸エステル由来の基)を表し、
R1aはR1bと同一であり、
R2aはR2bと同一である。
一態様において、
R1aおよびR1bは、炭素数8以下(炭素数1〜8)のアルキレン基を表し、
XaおよびXbは、エステル結合を表し、
R2aおよびR2bは、炭素数13〜23の脂肪族炭化水素基(例、ヘプタデカジエニル基、ヘプタデセニル基)を表し、
R1aはR1bと同一であり、
R2aはR2bと同一である。
R1aおよびR1bは、エチレン基を表し、
XaおよびXbは、−CO−O−を表し、
R2aおよびR2bは独立して、脂溶性ビタミン残基(例、トコフェロールヘミコハク酸エステル由来の基)を表す。
一態様において、
R1aおよびR1bは、エチレン基を表し、
XaおよびXbは、−CO−O−を表し、
R2aおよびR2bは独立して、炭素数13〜23の脂肪族炭化水素基(例、ヘプタデカジエニル基、ヘプタデセニル基)を表す。
R1aおよびR1bは、エチレン基を表し、
XaおよびXbは、−CO−O−を表し、
R2aおよびR2bは、脂溶性ビタミン残基(例、トコフェロールヘミコハク酸エステル由来の基)を表し、
R2aはR2bと同一である。
一態様において、
R1aおよびR1bは、エチレン基を表し、
XaおよびXbは、−CO−O−を表し、
R2aおよびR2bは、炭素数13〜23の脂肪族炭化水素基(例、ヘプタデカジエニル基、ヘプタデセニル基)を表し、
R2aはR2bと同一である。
pDNA:プラスミドDNA
Chol:コレステロール
PEG2000−DMG:1,2−ジミリストイル−sn−グリセロール,メトキシポリエチレングリコール(PEG MW 2000)
PEG2000−DSG:1,2−ジステアロイル−sn−グリセロール,メトキシポリエチレングリコール(PEG MW 2000)
PEG5000−DSG:1,2−ジステアロイル−sn−グリセロール,メトキシポリエチレングリコール(PEG MW 5000)
DOPE:1,2−ジオレオイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン
SOPC:1−ステアロイル−2−オレオイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン
Dex−Pal:デキサメタゾンパルミチン酸エステル
DiR:1,1’−ジオクタデシル−3,3,3’,3’−テトラメチルインドトリカルボシアニン アイオダイド
PBS:リン酸緩衝生理食塩水
15PGDH:15−ヒドロキシプロスタグランジンデヒドロゲナーゼ
<メシル化>
ビス(2−ヒドロキシエチル)ジスルフィド15g(東京化成工業社製)(97mmol)にアセトニトリル143mLを加え、20〜25℃にて溶解させた。トリエチルアミン33.3g(関東化学社製)(328mmol)を加えた後、攪拌しながら10℃に冷却した。温度が20℃以下になるように塩化メタンスルホニル34.5g(関東化学社製)(300mmol)を1時間かけて滴下した。滴下終了後、20〜25℃で3時間反応させた。TLC分析(展開溶媒:クロロホルム、ヨウ素発色)により、ビス(2−ヒドロキシエチル)ジスルフィドのスポットが消失していることを確認し、反応を終了した。反応溶液にエタノール29mLを加え、反応を停止させた後に、ろ過にて不溶物をろ別除去した。ろ液に10%重曹水150gを加え、5分攪拌した後、10分間静置した。水層を除去後、さらに4回重曹水で抽出精製を行った。得られた有機層に硫酸マグネシウム4.5gを加えて、脱水を行った。ろ過にて不溶物をろ別除去した後、エバポレーターを用いてろ液の溶媒を留去し、褐色固体(以下、「di−Ms体」と称する)を29.4g得た。
得られた化合物di−Ms体の1H−NMRスペクトルの分析結果を以下に示す。
δ2.95〜3.20ppm(m、CH 3−SO2−O−CH2−CH 2−S−、10H)、δ4.45〜4.50ppm(t、CH3−SO2−O−CH 2−CH2−S−、4H)
di−Ms体1.2g(4mmol)にアセトニトリル31mLを加え、20〜25℃で溶解させた後、炭酸カリウム1.3g(関東化学工業社製)(10mmol)を加えて、5分間攪拌した。その後、4−ピペラジンエタノール5.0g(東京化成工業社製)(39mmol)を加え、25〜35℃で13時間反応させた。TLC分析(展開溶剤:クロロホルム/メタノール/28%アンモニア水=80/20/2(v/v/v)、ヨウ素発色)により、di−Ms体のスポットが消失していることを確認し、反応を終了した。ろ過にて不溶物をろ別除去した後、エバポレーターにてろ液の溶媒を留去した。得られた褐色液体をクロロホルム25mLに溶解させた後、蒸留水25mLを加え、5分攪拌した。攪拌後、10分静置した後、水層を除去した。その後、さらに2回蒸留水で抽出精製を行った。得られた有機層に硫酸マグネシウム0.6gを加えて、脱水を行った。ろ過にて不溶物をろ別除去した後、エバポレーターを用いてろ液の溶媒を留去し、淡黄色の液体(以下、「di−PZ4C2体」と称する)を1.0g得た。
得られた化合物di−PZ4C2体の1H−NMRスペクトルの分析結果を以下に示す。
δ2.40〜2.66ppm(m、HO−CH2−CH 2−N−CH 2−CH 2−N−、20H)、δ2.67〜2.72ppm(m、−N−CH2−CH 2−S−、4H)、2.74〜2.85ppm(m、HO−CH2−、−N−CH 2−CH2−S−、6H)、3.60〜3.65ppm(t、HO−CH 2−CH2−、4H)
di−PZ4C2体3.0g(8mmol)とD−α−トコフェロールコハク酸エステル8.4g(SIGMA−ALDRICH社製)(16mmol)をクロロホルム45mLに20〜25℃で溶解させた。その後、4−ジメチルアミノピリジン0.4g(広栄化学工業社製)(3mmol)、EDC4.6g(東京化成工業社製)(24mmol)を加え、30℃で4時間反応させた。TLC分析(展開溶剤:クロロホルム/メタノール=9/1(v/v)、リン酸硫酸銅発色)により、D−α−トコフェロールコハク酸エステルのスポットが消失していることを確認し、反応を終了した。エバポレーターで反応溶媒を留去した後、ヘキサン200mLを加えた。その後、アセトニトリル100mLを加え、5分間攪拌した。10分間静置した後、ヘキサン層を回収し、エバポレーターにて溶剤を留去し、淡黄色の液体10.7gを得た。この液体9.0gをシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製(溶離液:クロロホルム/メタノール=99/1〜98/2(v/v))し、目的物であるTS−PZ4C2を5.7g得た。
得られた化合物TS−PZ4C2の1H−NMRスペクトルの分析結果を以下に示す。
δ0.83〜0.88ppm(m、(CH 3)2CH−(CH2)3−(CH 3)CH−(CH2)3−(CH 3)CH−、24H)、δ1.03〜1.82ppm(m、(CH3)2CH−(CH 2)3−(CH3)CH−(CH 2)3−(CH3)CH−(CH 2)3−(CH 3)C−、−C−CH 2−CH2−C−C−O−、52H)、δ1.95〜2.09ppm(m、Ar−CH 3、18H)、δ2.40〜2.60ppm(m、−N−CH 2−CH 2−N−、−C−CH2−CH 2−C−C−O−、20H)、δ2.61〜2.68ppm(m、−O−CH2−CH 2−N−、−N−CH2−CH 2−S−、8H)、δ2.75〜2.84ppm(m、Ar−O−C(O)−CH 2−、−N−CH 2−CH2−S−、8H)、δ2.91〜2.95ppm(m、Ar−O−C(O)−CH2−CH 2−、4H)、δ4.21〜4.25ppm(t、−C(O)−CH 2−CH2−N−、4H)
<アシル化>
di−PZ4C2体2.5g(7mmol)とリノール酸3.7g(日油社製)(13mmol)をクロロホルム25mLに20〜25℃で溶解させた。その後、4−ジメチルアミノピリジン0.3g(3mmol)、EDC3.8g(20mmol)を加え、30℃で4時間反応させた。TLC分析(展開溶剤:クロロホルム/メタノール=9/1(v/v)、リン酸硫酸銅発色)により、リノール酸のスポットが消失していることを確認し、反応を終了した。エバポレーターで反応溶媒を留去した後、ヘキサン57mLを加えた。その後、アセトニトリル24mLを加え、5分間攪拌した。10分間静置した後、ヘキサン層を回収し、エバポレーターにて溶剤を留去し、淡黄色の液体4.9gを得た。この液体4.9gをシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製(溶離液:クロロホルム/メタノール=99/1〜97/3(v/v))し、目的物であるL−PZ4C2を3.1g得た。
得られた化合物L−PZ4C2の1H−NMRスペクトルの分析結果を以下に示す。
δ0.87〜0.91ppm(t、CH 3−(CH2)3−CH2−、6H)、δ1.25〜1.38ppm(m、CH3−(CH 2)3−CH2−、−(CH 2)4−CH2−CH2−C(O)−、28H)、δ1.58〜1.63ppm(m、−(CH2)4−CH 2−CH2−C(O)−、4H)、δ2.00〜2.07ppm(m、−CH 2−CH=CH−CH2−CH=CH−CH 2−、8H)、δ2.30〜2.32ppm(t、−(CH2)4−CH2−CH 2−C(O)−、4H)、δ2.50〜2.70ppm(m、−N−CH 2−CH 2−N−、−N−CH2−CH 2−S−、−O−CH2−CH 2−N−、24H)、δ2.75〜2.84ppm(m、−CH=CH−CH 2−CH=CH−、−N−CH 2−CH2−S−、8H)、δ4.18〜4.21ppm(t、−O−CH 2−CH2−N−、4H)、δ5.30〜5.41ppm(m、−CH2−CH=CH−CH2−CH=CH−CH2−、8H)
di−PZ4C2体0.8g(2mmol)とオレイン酸1.2g(日油社製)(4mmol)をクロロホルム8mLに20〜25℃で溶解させた。その後、4−ジメチルアミノピリジン0.1g(1mmol)、EDC1.2g(6mmol)を加え、30℃で3時間反応させた。TLC分析(展開溶剤:クロロホルム/メタノール=9/1(v/v)、リン酸硫酸銅発色)により、オレイン酸のスポットが消失していることを確認し、反応を終了した。エバポレーターで反応溶媒を留去した後、ヘキサン12mLを加えた。その後、アセトニトリル5mLを加え、5分間攪拌した。10分間静置した後、ヘキサン層を回収し、エバポレーターにて溶剤を留去し、淡黄色の液体1.8gを得た。この液体1.7gをシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製(溶離液:クロロホルム/メタノール=99/1〜97/3(v/v))し、目的物であるO−PZ4C2を1.1g得た。
得られた化合物O−PZ4C2の1H−NMRスペクトルの分析結果を以下に示す。
δ0.86〜0.90ppm(t、CH 3−(CH2)6−CH2−、6H)、δ1.25〜1.34ppm(m、CH3−(CH 2)6−CH2−、−CH2−(CH 2)4−CH2−CH2−C(O)−、40H)、δ1.58〜1.64ppm(m、−CH2−(CH2)4−CH 2−CH2−C(O)−、4H)、δ1.99〜2.03ppm(m、−CH 2−CH=CH−CH 2−、8H)、δ2.28〜2.32ppm(m、−CH2−(CH2)4−CH2−CH 2−C(O)−、4H)、δ2.45〜2.70ppm(m、−N−CH 2−CH 2−N−、−O−CH2−CH 2−N−、−N−CH2−CH 2−S−、24H)、δ2.80〜2.85ppm(m、−N−CH 2−CH2−S−、4H)、δ4.18〜4.21ppm(t、−O−CH 2−CH2−N−、4H)、δ5.13〜5.38ppm(m、−CH2−CH=CH−CH2−、4H)
1.各種MENDの調製
Myr−C3Mを用いたMENDの調製
(1)プラスミドDNA(pDNA)とプロタミンからなる核酸静電的複合体の形成
ベクターのコアとして、ルシフェラーゼ遺伝子をコードするpDNA溶液、プロタミン(CALBIOCHEM社製)溶液を、10mM HEPES緩衝液でそれぞれ0.15mg/mL、96.3μg/mLに希釈し、0.15mg/mLのpDNA溶液100μLを攪拌しながら96.3μg/mLプロタミン100μLを少量ずつ滴下して、プロタミンとpDNAの静電的複合体を調製した(N/P比=1.0)。
(2)エタノール希釈法によるMENDの調製
脂質のエタノール溶液は、エッペンドルフチューブに5mMのカチオン性脂質(Myr−C3M)、5mMリン脂質(SOPC)、5mMコレステロール(Chol)を総脂質330nmolになるように目的の割合で混合し、PEG2000−DSG(1mMエタノール溶液)をさらに総脂質の3モル%相当量添加し、全量で200μLとなるようにエタノールを加えた。脂質溶液をボルテックスミキサーを用いて攪拌しながら、[試験例1](1)で調製した核酸静電的複合体200μL(10mM HEPES;pH5.3)を素早く加え、その後pH5.3に調整した10mM HEPES緩衝液1.6mLを加えた。さらにpH5.3に調整した10mM HEPES緩衝液2mLを加えエタノール濃度が5%になるまで希釈し、Amicon Ultra 4(Millipore社)を用い、遠心条件(室温,1000g,15min)で約50μLまで限外濾過し濃縮した。その後、pH7.4に調整した100mM HEPES緩衝液を用いて4mLまでメスアップし、再度、室温条件で遠心(1000g,15min)を行うことで濃縮した。その後、10mM HEPES緩衝液(pH7.4)を用いて4mLまでメスアップし、再度、室温条件で遠心(1000g,15min)を行うことで濃縮した。最後に、10mM HEPES緩衝液(pH7.4)で目的の脂質濃度になるようメスアップした。
pDNA溶液(1mg/mL)、100mMリンゴ酸緩衝液(pH4.0)、5M塩化ナトリウム水溶液および滅菌水を混合し、それぞれ終濃度が0.1mg/mL、20mM、40mMとなる溶液を調製し、DNA溶液とした。
脂質のエタノール溶液は、5mLチューブに5mMのカチオン性脂質(TS−PZ4C2またはTS−C3M)、10mMコレステロール(Chol)を総脂質600nmolになるように目的の割合で混合し、PEG2000−DMG(5mMエタノール溶液)をさらに総脂質の3モル%相当量添加し、全量で200μLとなるようにエタノールを加えた。脂質溶液をボルテックスミキサーを用いて攪拌しながら、上記のDNA溶液300μLを素早く加え、その後20mM リンゴ酸緩衝液(pH4.0、100mM塩化ナトリウム含有)500μLを加えた後にリン酸緩衝生理食塩水を加え、エタノール濃度が10%になるまで希釈した。同様の作業を3度行った後に更にリン酸緩衝生理食塩水を加え、エタノール濃度が5%になるまで希釈した。その後、Amicon Ultra 15(Millipore社)を用い、遠心条件(室温,2267rpm,20min)で約200μLまで限外濾過し濃縮した。その後、リン酸緩衝生理食塩水を用いて15mLまでメスアップし、再度、室温条件で遠心(2267rpm,20min)を行うことで濃縮した。最後に、リン酸緩衝生理食塩水で目的の脂質濃度になるようメスアップした。
粒子径並びに表面電位は、動的光散乱法(Zetasizer Nano;Malvern社)を用いて測定した。上記1.で調製された各種MENDの粒子径、表面電位を表3〜5に示す。
いずれのカチオン性脂質においても、生理的pHでの電荷は、好ましい形態である−15〜+10mVであった。
1.各種MENDの調製
各種MENDは、[試験例1]に記載の方法で調製した。
2.遺伝子発現活性評価
調製したMEND溶液を各々20μg DNA相当、4週齢の雄のICRマウスに尾静脈投与した。24、48時間後にマウスを頸椎脱臼法によって安楽死させ、肝臓を摘出し、液体窒素で凍結処理した。これをLysis緩衝液中で融解させ、ホモジネートの作製を行った。これを13,000rpm,10分,4℃で遠心し、上清を採取し、これを測定サンプルとした。サンプル溶液20μLをルシフェラーゼ基質50μLと混合し、Luminescenser−PSN(AB2200 ATTO)を用いてルシフェラーゼ活性を測定した。また、サンプル中のタンパク質濃度を、BCA protein assay kitを用いて定量し、遺伝子発現活性をRLU/mg proteinとして測定した。
3.結果
結果を図1に示す。値が高い程、即ちルシフェラーゼ活性が高い程、遺伝子発現活性が高いことを意味する。本発明のカチオン性脂質を用いた脂質膜構造体は、比較例1(特許文献1・実施例1)及び比較例2(特許文献1・実施例5)のカチオン性脂質を用いた脂質膜構造体に比べより高い遺伝子発現活性を示した。TS−C3MやMyr−C3M等の特許文献1記載のカチオン性脂質が、DOTAPやDODAP等のカチオン性脂質と比較して、より高い核酸送達効率を示すことが知られており(特許文献1)、従って、本発明のカチオン性脂質は、TS−C3MやMyr−C3Mに加え、従来のカチオン性脂質であるDOTAPやDODAPよりも優れたインビボでの遺伝子導入活性を有することがわかる。
1.MENDの調製
[試験例1]に記載されたMENDの調製時に、デキサメタゾンパルミチン酸エステルのエタノール溶液を終濃度0.5mMとなるように脂質溶液に加えることで、デキサメタゾンパルミチン酸エステルが内封されたMENDの調製を行った。
2.遺伝子発現活性評価
[試験例3]1.の項で示した方法で調製したMEND溶液を各々20μg DNA相当、4週齢の雄のICRマウスに尾静脈投与した。投与1、3、7、10日後に3mg相当のルシフェリン(in vivo grade, Promega)をマウスに腹腔内投与し、IVIS LuminaII(Caliper Life Sciences)を用いてイメージングを行った。取得した画像からマウス腹部における輝度の平均値をphotons/sec/cm2/srとして算出し、これを肝臓における遺伝子発現活性の指標とした。
3.結果
結果を図2に示す。本発明のカチオン性脂質を用いた脂質膜構造体に抗炎症剤であるデキサメタゾンパルミチン酸エステルを内包することで、遺伝子発現活性が向上した。さらに、生体内で10日間の遺伝子発現が達成された。
1.核酸導入剤の調製
naked−pDNAはHEPES緩衝液に2.4μg/150μLとなるように希釈した。リポフェクトアミン2000(Invitrogen)+pDNAは、HEPES緩衝液に9.6μL/75μLとなるようリポフェクトアミン2000を添加し5分間室温でインキュベートした溶液に、HEPES緩衝液に2.4μg/75μLとなるようpDNAを添加した溶液を等量混合し、20分間室温でインキュベートすることで作成した。TS−PZ4C2_MENDは[試験例1](2)のエタノール希釈法により、PEG脂質としてPEG2000−DMGを用いて作成した。
2.遺伝子発現活性評価
[試験例4]1.の項で示した方法で調製したnaked−pDNA、リポフェクトアミン2000+pDNAをそれぞれ2.4μgDNA相当、またTS−PZ4C2_MEND溶液を1.2μgDNA相当、6週齢の雌のBALB/cマウスの頸の後ろに皮下投与した。24時間後に、3mg相当のルシフェリン(in vivo grade, Promega)をマウスに腹腔内投与し、IVIS LuminaII(Caliper Life Sciences)を用いてイメージングを行った。取得した画像からマウス頸部における輝度を算出し、photons/secとして算出し、これを遺伝子発現活性の指標とした。
3.結果
結果を図3に示す。pDNA単体あるいは市販の核酸導入剤であるリポフェクトアミン2000を用いた場合のいずれよりも、本発明のカチオン性脂質を用いた脂質膜構造体を核酸導入剤として用いた場合の方がより高い活性を示した。
1.各種MENDの調製
(カチオン性脂質:DOPE:Chol)=(5:2:3),(4:3:3),(3:4:3)の組成のMENDは[試験例1](2)のエタノール希釈法により、リン脂質としてDOPEを用い、PEG脂質としてPEG2000−DMGを用いて作成した。(カチオン性脂質:Chol)=(7:3)の組成のMENDについては、[試験例1]に記載の方法で調製した。
2.遺伝子発現活性評価
[試験例5]1.の項で示した方法で調製したTS−PZ4C2_MEND溶液およびTS−C3M_MEND溶液を各々1.2μgDNA相当、6週齢の雌のBALB/cマウスの頸の後ろに皮下投与し、[試験例4]2.の項と同様の方法で評価を行った。
3.結果
結果を図4に示す。2つの脂質成分及び2つのアミノ基で構成される比較例2に比べて、2つの脂質成分及び4つのアミノ基を有する本願発明の方がより遺伝子導入効率が高いことがわかる。
1.各種MENDの調製
TS−PZ4C2またはMyr−C3Mを用いたMENDの調製
各種MENDの調製は、[試験例1](2)のエタノール希釈法により実施し、リン脂質にはDOPCを用いた。またPEG脂質にはPEG5000−DSGを用い、Myr−C3MのMENDでは総脂質の5モル%相当、およびTS−PZ4C2のMENDでは10モル%相当を添加した。
L−PZ4C2またはO−PZ4C2を用いたMENDの調製
pDNA溶液(1mg/mL)、100mMリンゴ酸緩衝液(pH4.0)、5M塩化ナトリウム水溶液および滅菌水を混合し、それぞれ終濃度が0.1mg/mL、20mM、40mMとなる溶液を調製し、DNA溶液とした。
脂質のエタノール溶液は、5mLチューブに5mMのカチオン性脂質(L−PZ4C2、O−PZ4C2)、10mMコレステロール(Chol)、10mMDOPCを総脂質840nmolになるように目的の割合で混合し、PEG5000−DSG(1mMエタノール溶液)をさらに総脂質の5モル%相当量添加し、全量で200μL(80%エタノール溶液)となるようにエタノールおよび20mM リンゴ酸緩衝液(pH4.0)を加えた。脂質溶液をボルテックスミキサーを用いて攪拌しながら、上記のDNA溶液200μLを素早く加え、その後20mM リンゴ酸緩衝液(pH4.0)1600μLを加えた後にリン酸緩衝生理食塩水を加え、エタノール濃度が8%になるまで希釈した。同様の作業を3度行った後に更にリン酸緩衝生理食塩水を加え、エタノール濃度が4%になるまで希釈した。その後、Amicon Ultra 15(Millipore社)を用い、遠心条件(室温,2267rpm,30min)で約200μLまで限外濾過し濃縮した。その後、リン酸緩衝生理食塩水を用いて15mLまでメスアップし、再度、室温条件で遠心(2267rpm,30min)を行うことで濃縮した。最後に、リン酸緩衝生理食塩水で目的の脂質濃度になるようメスアップした。
粒子径並びに表面電位は、動的光散乱法(Zetasizer Nano)を用いて測定した。上記1.で調製された各種MENDの粒子径、表面電位を表6〜9に示す。
いずれのカチオン性脂質においても、生理的pHでの電荷は好ましい形態である−15〜+10mVであった。
1.各種MENDの調製
[試験例6]に記載されたMENDの調製時に、DiRのエタノール溶液を終濃度3.6μMとなるように脂質溶液に加えることで、蛍光標識されたMENDの調製を行った。
2.各臓器への集積性の評価
6週齢の雌のBalb/cマウスの皮下にマウス乳癌由来癌細胞株4T1細胞の懸濁液(1x106 cells/mouse)を皮下投与することで担癌マウスを作製した。癌細胞皮下移植7日後に、調製したMEND溶液を各々DiR 1 nmol相当を尾静脈内投与した。投与24時間後にマウスを頸椎脱臼法により安楽死させ、各臓器を摘出し、IVIS LuminaII(Caliper Life Sciences)を用いてイメージングを行った(励起波長:710nm、検出:ICGフィルター)。取得した画像から各臓器及び肝臓、腫瘍における輝度を算出し、[photons/sec] / [μW/cm2]として算出し、これを臓器集積性及び肝臓集積性、腫瘍集積性の指標とした。
3.結果
結果を図5に示す。本発明のカチオン性脂質TS−PZ4C2を用いた脂質膜構造体では、比較例1(特許文献1・実施例1)のカチオン性脂質を用いた脂質膜構造体と比べて、高い肝臓への集積性を示した。また本発明のカチオン性脂質L−PZ4C2またはO−PZ4C2を用いた脂質膜構造体では、比較例1(特許文献1・実施例1)のカチオン性脂質を用いた脂質膜構造体と比べて、高い腫瘍への集積性を示した。
1.各種MENDの調製
各種MENDは、[試験例6]に記載の方法で調製した。
2.遺伝子発現活性評価
6週齢の雌のBalb/cマウスの皮下にマウス乳癌由来癌細胞株4T1細胞の懸濁液(1x106 cells/mouse)を皮下投与することで担癌マウスを作製した。癌細胞皮下移植7日後に、調製したMEND溶液を各々25mgDNA相当を尾静脈内投与した。投与48時間後にマウスを頸椎脱臼法により安楽死させ、腫瘍を摘出し、液体窒素で凍結処理した。これをLysis緩衝液中で融解させ、ホモジネートの作製を行った。これを13,000rpm,10分,4℃で遠心し、上清を採取し、これを測定サンプルとした。サンプル溶液20μLをルシフェラーゼ基質50μLと混合し、Luminescenser−PSN(AB2200 ATTO)を用いてルシフェラーゼ活性を測定した。また、サンプル中のタンパク質濃度を、BCA protein assay kitを用いて定量し、遺伝子発現活性をRLU/mg proteinとして測定した。
3.結果
結果を図6に示す。値が高い程、即ちルシフェラーゼ活性が高い程、遺伝子発現活性が高いことを意味する。本発明のカチオン性脂質(L−PZ4C2やO−PZ4C2)を用いた脂質膜構造体は、比較例1(特許文献1・実施例1)のカチオン性脂質を用いた脂質膜構造体と比べて、より高い腫瘍への遺伝子送達発現活性を示した。Myr−C3Mは、DOTAPやDODAP等の従来のカチオン性脂質と比較して、より高い核酸送達効率を示すことが知られている。従って、本発明のL−PZ4C2およびO−PZ4C2は、Myr−C3Mに加えて、従来のカチオン性脂質よりも優れた腫瘍への遺伝導入活性を有していることが示唆される。
1.プラスミドDNA(pDNA)溶液の調製
搭載DNAとしては、ルシフェラーゼ遺伝子または15PGDH遺伝子をコードするpDNAを用いた。
2.MENDの調製
MENDは、[試験例6]の方法により、カチオン性脂質にL−PZ4C2を用いて作成した。
3.抗腫瘍効果の評価
6週齢の雌のBalb/cマウスの皮下にマウス乳癌由来癌細胞株4T1細胞の懸濁液(1x106 cells/mouse)を皮下投与することで担癌マウスを作製した。癌細胞皮下移植7日後から3日に一度、計3回にわたり、上記2.で調製したMEND溶液を各々30mgDNA相当を尾静脈内投与した。腫瘍の短径および長径を経時的に測定し、体積(mm3)=短径(mm)2x長径(mm)x0.52として体積を算出した。
4.結果
結果を図7に示す。値が低い程、腫瘍の肥大が抑制されており、抗腫瘍効果が高いことを意味する。遺伝子を封入した本発明のカチオン性脂質を用いたMENDは、腫瘍の肥大を有意に抑制していることが分かった。
本出願は、日本で出願された特願2015−16786(出願日:2015年1月30日)を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
Claims (11)
- 式(1)
(式(1)中、R1a及びR1bは独立して、炭素数8以下のアルキレン基又はオキシジアルキレン基であり、
Xa及びXbは独立して、エステル結合、アミド結合、カーバメート結合、又はエーテル結合を表し、
R2a及びR2bは独立して、ステロール残基、脂溶性ビタミン残基、又は炭素数13〜23の脂肪族炭化水素基を表す)で示されるカチオン性脂質であって、
該ステロール残基は、コレステロール、コレスタノール、スチグマステロール、β−シトステロール、ラノステロール、及びエルゴステロールから選択されるステロールの水酸基をマロン酸、コハク酸、グルタル酸、及びアジピン酸から選択されるジカルボン酸の一方のカルボン酸と反応させたステロールヘミエステルからX a 又はX b との結合に関与する反応性官能基である水酸基を除いた基であり、
該脂溶性ビタミン残基は、レチノイン酸、レチノール、レチナール、エルゴステロール、7−デヒドロコレステロール、カルシフェロール、コルカルシフェロール、ジヒドロエルゴカルシフェロール、ジヒドロタキステロール、トコフェロール、及びトコトリエノールから選択される脂溶性ビタミンの水酸基をマロン酸、コハク酸、グルタル酸、及びアジピン酸から選択されるジカルボン酸の一方のカルボン酸と反応させた脂溶性ビタミンヘミエステルからX a 又はX b との結合に関与する反応性官能基である水酸基を除いた基である。 - R1a及びR1bが独立して、アルキレン基である請求項1記載のカチオン性脂質。
- Xa及びXbがエステル結合である、請求項1又は2に記載のカチオン性脂質。
- R2a及びR2bが独立して、脂溶性ビタミン残基、又は炭素数13〜23の脂肪族炭化水素基である請求項1〜3のいずれか1項に記載のカチオン性脂質。
- R2a及びR2bが独立して、脂溶性ビタミン残基である請求項1〜4のいずれか1項に記載のカチオン性脂質。
- R2a及びR2bが独立して、炭素数13〜23の脂肪族炭化水素基である請求項1〜4のいずれか1項に記載のカチオン性脂質。
- 請求項1〜6のいずれか1項に記載のカチオン性脂質を膜の構成脂質として含む脂質膜構造体。
- 請求項1〜6のいずれか1項に記載のカチオン性脂質、又は請求項7記載の脂質膜構造体を含む核酸導入剤。
- 請求項1〜6のいずれか1項に記載のカチオン性脂質、又は請求項7記載の脂質膜構造体に抗炎症剤を封入した核酸導入剤。
- 生体外において、核酸を内封した請求項8又は9記載の核酸導入剤と細胞とを接触させることを含む、当該核酸を当該細胞内へ送達する方法。
- 核酸を封入した請求項8又は9記載の核酸導入剤を、標的細胞へ送達されるように、生体(但し、ヒトを除く)へ投与することを含む、当該核酸を当該細胞内へ導入する方法。
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