CN113402404B - 脂质化合物及包含其的脂质载体、核酸脂质纳米粒组合物和药物制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明属于基因治疗技术领域，具体涉及一系列脂质化合物及包含其的脂质载体、核酸脂质纳米粒组合物和药物制剂。本发明提供的具有式(I)结构的化合物，可与其它脂质化合物共同制备脂质载体，展现出pH响应性，对核酸药物的包封效率高，大大提升了核酸药物在体内的递送效率；而且，可通过选用不同结构的脂质化合物作为脂质载体来调节核酸药物在不同器官的富集情况，具有良好的市场应用前景。
Figure DDA0003115883940000011

Description

脂质化合物及包含其的脂质载体、核酸脂质纳米粒组合物和 药物制剂
技术领域
本发明属于基因治疗技术领域，具体涉及一种脂质化合物及包含其的脂质载体、核酸脂质纳米粒组合物和药物制剂。
背景技术
基因治疗技术是现代生物医药领域研究的热点，利用核酸药物可预防癌症、细菌和病毒感染及治疗具有遗传病因的疾病等。由于核酸药物具有易降解、难以进入细胞等特点，需要借助载体将其封装起来递送至靶细胞，因此，开发安全高效的递送载体就成为基因治疗在临床应用的前提。
脂质纳米颗粒(Lipid nanoparticle，LNP)目前是非病毒基因载体领域的研究热点。2018年，FDA批准了LNP递送patisiran(onpattro)来治疗遗传性转甲状腺素蛋白淀粉样变性，自此运用LNP技术递送核酸药物的研究呈现迸发式地增长；特别是2020年底，FDA分别批准了Moderna和BioNtech&辉瑞针对COVID-19的新冠病毒疫苗，这两种疫苗均是采用LNP技术递送mRNA药物，从而实现了对COVID-19病毒的预防。
LNP通常由四种脂质化合物组成，即阳离子脂质、中性脂质、甾醇和两亲性脂质，其中，阳离子脂质的选择对LNP的影响最大，如影响核酸药物的包封率、核酸药物在体内的递送效率以及细胞毒性等。
有鉴于此，开发出一种可作为阳离子脂质的新型化合物将具有重要的意义。
发明内容
发明要解决的问题
本发明旨在提供一系列化合物，该化合物可与其它脂质化合物共同制备脂质载体，提升核酸药物在体内的递送效率，可通过选用不同结构的脂质化合物作为脂质载体来调节核酸药物在不同器官的富集情况。
本发明还提供包含上述化合物的脂质载体。
本发明还提供包含上述化合物或上述脂质载体的核酸脂质纳米粒组合物。
本发明还提供包含上述化合物、或上述脂质载体、或上述核酸脂质纳米粒组合物的药物制剂。
用于解决问题的方案
<第一方面>
本发明提供了式(I)化合物或其药学上可接受的盐、立体异构体、互变异构体、溶剂化物、螯合物、非共价复合物或前体药物，
Figure BDA0003115883920000011
其中：
每个A和B各自独立地为-O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-C(＝O)-、-O-、-S(O)-、-S-S-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-、-NRaC(＝O)-、-C(＝O)NRa-、-NRaOC(＝O)-、-OC(＝O)NRa-、-NRaOC(＝O)NRa-、-NRaC(＝O)NRa-或-NRaC(＝O)O-中的一种或多种；
每个R1、R2、R3和R4各自独立地为H、含有1至16个碳原子的烷基，所述烷基任选地被至少一个W所中断，每个W各自独立地为-O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-S-S-、-CH＝CH-、-C(＝O)-、-O-、-S(O)-、-C(＝O)S-、-NRaC(＝O)-、-NRaC(＝O)NRa-、-C(＝O)NRa-、-NRaOC(＝O)-、-OC(＝O)NRa-或-NRaOC(＝O)NRa-中的一种或多种；
R5为氢、C1-12烷基或末端被羟基取代的C1-12烷基；
每个Ra各自独立地为氢或含有1至24个碳原子的烃基；
每个a、b、d和e各自独立地为0至14的任一整数；
每个c各自独立地为0或1；
优选地，式(I)化合物：
每个A和B各自独立地为-O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-C(＝O)-、-O-、-S(O)-、-S-S-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-、-NHC(＝O)-、-C(＝O)NH-、-NHC(＝O)NH-、-OC(＝O)NH-或-NHC(＝O)O-中的一种或多种；
每个R1、R2、R3和R4各自独立地为H、含有1至16个碳原子的烷基，所述烷基任选地被至少一个W所中断，每个W各自独立地为-O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-S-S-、-CH＝CH-、-C(＝O)-、-O-、-S(O)-、-C(＝O)S-、-NHC(＝O)-、-NHC(＝O)NH-或-OC(＝O)NH-中的一种或多种；
R5为氢、C1-12烷基或末端被羟基取代的C1-12烷基；
每个a、b、d和e各自独立地为0至14的任一整数；
每个c各自独立地为0或1。
优选地，所述的化合物具有式(I-1)所示的结构：
Figure BDA0003115883920000021
其中，A、B、R1、R2、R3、R4、R5、a、b、c、d和e的定义如式(I)中所定义。
进一步优选地，所述的化合物具有式(I-1-1)所示的结构：
Figure BDA0003115883920000022
其中，A、R1、R2、R3、R4、R5、a、b、d和e的定义如式(I-1)中所定义；
更进一步优选地，R5为C1-12烷基。
进一步优选地，所述的化合物具有式(I-1-2)所示的结构：
Figure BDA0003115883920000031
其中，R1、R2、R3、R4、R5、a、b、d和e的定义如式(I-1)中所定义；
更进一步优选地，所述的化合物具有式(I-1-2-1)所示的结构：
Figure BDA0003115883920000032
其中，R1、R2、R3、R4、a、b、d和e的定义如式(I-1-2)中所定义，f为0或1；
更进一步优选地，所述的化合物具有式(I-1-2-2)所示的结构：
Figure BDA0003115883920000033
其中，R1、R2、R3、R4、a、b、d和e的定义如式(I-1-2)中所定义，g为3或4。
优选地，所述的化合物具有式(I-2)所示的结构：
Figure BDA0003115883920000034
其中，A、B、R1、R2、R3、R4、R5、a、b、c、d和e的定义如式(I)中所定义；
优选地，e为0或1。
<第二方面>
本发明提供了下列化合物或其药学上可接受的盐、立体异构体、互变异构体、溶剂化物、螯合物、非共价化合物或前体药物：
Figure BDA0003115883920000041
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<第三方面>
本发明提供了一种脂质载体，其包含根据<第一方面>、<第二方面>所述的化合物或其药学上可接受的盐、立体异构体、互变异构体、溶剂化物、螯合物、非共价复合物或前体药物；
优选地，所述脂质载体包含第一脂质化合物和第二脂质化合物，其中，所述第一脂质化合物包含根据<第一方面>、<第二方面>所述的化合物或其药学上可接受的盐、立体异构体、互变异构体、溶剂化物、螯合物、非共价复合物或前体药物以及阳离子脂质，所述第二脂质化合物包括阴离子脂质、中性脂质、固醇和两亲性脂质中的至少一种；
优选地，所述阳离子脂质选自DLinDMA、DODMA、DLin-MC2-MPZ、DLin-KC2-DMA、DOTAP、C12-200、DC-Chol和DOTMA中的至少一种；
所述阴离子脂质选自磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸、磷脂酰甘油、DOPG和二豆蔻酰磷脂酰甘油中的至少一种；
所述中性脂质选自DOPE、DSPC、DPPC、DOPC、DPPG、POPC、POPE、DPPE、DMPE、DSPE、SOPE中的至少一种或其经阴离子或阳离子修饰基团修饰的脂质；
所述两亲性脂质选自PEG-DMG、PEG-c-DMG、PEG-C14、PEG-c-DMA、PEG-DSPE、PEG-PE、PEG修饰的神经酰胺、PEG修饰的二烷基胺、PEG修饰的二酰基甘油、吐温-20、吐温-80、PEG-DPG、PEG-s-DMG、DAA、PEG-c-DOMG和GalNAc-PEG-DSG中的至少一种。
进一步优选地，在所述脂质载体中，所述第一脂质化合物、所述阴离子脂质、所述中性脂质、所述固醇和所述两亲性脂质的摩尔比为(20～65):(0～20):(5～25):(25～55):(0.3～15)；
其中，所述第一脂质化合物中，根据<第一方面>、<第二方面>所述的化合物或其药学上可接受的盐、立体异构体、互变异构体、溶剂化物、螯合物、非共价复合物或前体药物和所述阳离子脂质的摩尔比为(1～10):(0～10)。
进一步优选地，在所述脂质载体中，所述第一脂质化合物、所述阴离子脂质、所述中性脂质、所述固醇和所述两亲性脂质的摩尔比为(20～55):(0～13):(5～25):(25～51.5):(0.5～10)；
其中，所述第一脂质化合物中，根据<第一方面>、<第二方面>所述的化合物或其药学上可接受的盐、立体异构体、互变异构体、溶剂化物、螯合物、非共价复合物或前体药物和所述阳离子脂质的摩尔比为(3～4):(0～5)。
<第四方面>
本发明提供了一种核酸脂质纳米粒组合物，其包括根据<第一方面>、<第二方面>所述的化合物或其药学上可接受的盐、立体异构体、互变异构体、溶剂化物、螯合物、非共价复合物或前体药物或根据<第三方面>所述的脂质载体，以及核酸药物；
优选地，所述核酸药物选自DNA、siRNA、mRNA、dsRNA、反义核酸、微RNA、反义微RNA、antagomir、微RNA抑制剂、微RNA激活剂和免疫刺激性核酸中的至少一种；
优选地，所述核酸药物与根据<第一方面>、<第二方面>所述的化合物或其药学上可接受的盐、立体异构体、互变异构体、溶剂化物、螯合物、非共价复合物或前体药物的质量比为1:(3～40)；或者，所述核酸药物与根据<第三方面>所述的脂质载体的质量比为1:(3～40)。
进一步优选地，所述核酸药物与根据<第一方面>、<第二方面>所述的化合物或其药学上可接受的盐、立体异构体、互变异构体、溶剂化物、螯合物、非共价复合物或前体药物的质量比为1:(3～30)，优选1:3和1:30；或者，所述核酸药物与根据<第三方面>所述的脂质载体的质量比为1:(3～30)，优选1:3和1:30。
<第五方面>
本发明提供了一种药物制剂，其包含根据<第一方面>、<第二方面>所述的化合物或其药学上可接受的盐、立体异构体、互变异构体、溶剂化物、螯合物、非共价复合物或前体药物，或根据<第三方面>所述的脂质载体，或根据<第四方面>所述的核酸脂质纳米粒组合物，以及药学上可接受的赋形剂、载体和稀释剂；
优选地，所述药物制剂的粒径为30～500nm；
优选地，所述核酸药物在所述药物制剂中的包封率大于50％。
发明的效果
本发明提供了一系列结构新颖的式(I)化合物，该化合物可作为阳离子脂质，与其它脂质化合物共同制备脂质载体，其粒径可控，分布均一，具有单分散性，对带有负电的药物具有很高的包封率。并且，可在不同pH下展现不同电位，在酸性条件下包载负电药物时展现正电，以使带正电的脂质载体与带有负电的药物相互吸引；也可在体内即中性条件下展现电中性，避免带来巨大的细胞毒性。此外，可以通过选用不同结构的脂质化合物作为脂质载体来调节核酸药物在不同器官的富集情况。
进一步地，该化合物合成路线简单，原料便宜易得，具有很高的市场潜力。
附图说明
图1为实施例26中化合物2与其它三种脂质共同制备LNP@mRNA肌肉注射6小时后成像结果；
图2为实施例26中化合物2与其它三种脂质共同制备LNP@mRNA静脉注射6小时后成像结果；
图3为实施例26中化合物2与其它三种脂质共同制备LNP@mRNA静脉注射6小时后成像解剖图；
图4为实施例26中化合物27与其它三种脂质共同制备LNP@mRNA静脉注射6小时后成像解剖图；
图5为实施例26中化合物33与其它三种脂质共同制备LNP@mRNA静脉注射6小时后成像结果；
图6为实施例26中化合物33与其它三种脂质共同制备LNP@mRNA静脉注射6小时后成像解剖图；
图7为实施例26中化合物2与其它三种脂质共同制备LNP@mRNA透射电镜图；
图8为实施例27中化合物2与其它几种脂质以不同比例共同制备的LNP@mRNA肌肉注射6小时后测试小鼠体内荧光强度最大值。
具体实施方式
在进一步描述本发明之前，应当理解，本发明不限于本文中所述的特定实施方案；还应该理解，本文中所使用的术语仅用于描述而非限定特定实施方案。
[术语定义]
除非另有说明，下列术语的含义如下：
术语“药学上可接受的盐”是指对生物体基本上无毒性的本发明的化合物的盐。药学上可接受的盐通常包括(但不限于)本发明的化合物与药学上可接受的无机/有机酸或无机/有机碱反应而形成的盐，此类盐又被称为酸加成盐或碱加成盐。常见的无机酸包括(但不限于)盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸等，常见的有机酸包括(但不限于)三氟乙酸、柠檬酸、马来酸、富马酸、琥珀酸、酒石酸、乳酸、丙酮酸、草酸、甲酸、乙酸、苯甲酸、甲磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸等，常见的无机碱包括(但不限于)氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化钡等，常见的有机碱包括(但不限于)二乙胺、三乙胺、乙胺丁醇等。
术语“立体异构体”(或称“旋光异构体”)是指由于具有至少一个手性因素(包括手性中心、手性轴、手性面等)而导致具有垂直的不对称平面，从而能够使平面偏振光旋转的稳定异构体。由于本发明化合物中存在可能导致立体异构的不对称中心以及其它化学结构，因此本发明也包括这些立体异构体及其混合物。由于本发明的化合物及其盐包括不对称碳原子，因而能够以单一立体异构体形式、外消旋物、对映异构体和非对映异构体的混合物形式存在。通常，这些化合物能够以外消旋混合物的形式制备。然而，如果需要的话，可以将这类化合物制备或分离后得到纯的立体异构体，即单一对映异构体或非对映异构体，或者单一立体异构体富集化(纯度≥98％、≥95％、≥93％、≥90％、≥88％、≥85％或≥80％)的混合物。化合物的单一立体异构体是由含有所需手性中心的旋光起始原料合成制备得到的，或者是通过制备得到对映异构体产物的混合物之后再分离或拆分制备得到的，例如转化为非对映异构体的混合物之后再进行分离或重结晶、色谱处理、使用手性拆分试剂，或者在手性色谱柱上将对映异构体进行直接分离。具有特定立体化学的起始化合物既可以商购得到，也可以按照下文中描述的方法制备再通过本领域熟知的方法拆分得到。
术语“互变异构体”(或称“互变异构形式”)是指具有不同能量的可通过低能垒互相转化的结构异构体。若互变异构是可能的(如在溶液中)，则可以达到互变异构体的化学平衡。例如，质子互变异构体(或称质子转移互变异构体)包括(但不限于)通过质子迁移来进行的互相转化，如酮-烯醇异构化、亚胺-烯胺异构化、酰胺-亚胺醇异构化等。除非另外指出，本发明的化合物的所有互变异构体形式都在本发明的范围之内。
术语“溶剂化物”是指由本发明的化合物或其药学上可接受的盐与至少一种溶剂分子通过非共价分子间作用力结合而形成的物质。常见的溶剂化物包括(但不限于)水合物、乙醇合物、丙酮合物等。
术语“螯合物”是具有环状结构的配合物，是通过两个或多个配位体与同一金属离子形成螯合环的螯合作用而得到。
术语“非共价复合物”是通过化合物与另一分子的相互作用而形成的，其中该化合物与该分子之间不形成共价键。例如，可以通过范德华相互作用、氢键键合和静电相互作用(也称作离子键合)来发生复合。
术语“前体药物”是指在适用于患者后能够直接或间接地提供本发明的化合物的衍生化合物。特别优选的衍生化合物或前药是在施用于患者时可以提高本发明的化合物的生物利用度的化合物(例如，更易吸收入血)，或者促进母体化合物向作用位点(例如，淋巴系统)递送的化合物。除非另外指出，本发明的化合物的所有前药形式都在本发明的范围之内，且各种前药形式是本领域熟知的。
术语“各自独立地”是指结构中存在的取值范围相同或相近的至少两个基团(或环系)可以在特定情形下具有相同或不同的含义。例如，取代基X和取代基Y各自独立地为氢、卤素、羟基、氰基、烷基或芳基，则当取代基X为氢时，取代基Y既可以为氢，也可以为卤素、羟基、氰基、烷基或芳基；同理，当取代基Y为氢时，取代基X既可以为氢，也可以为卤素、羟基、氰基、烷基或芳基。
术语“任选”或“任选地”是指随后描述的事件或情况可能发生或可能不发生，该描述包括发生所述事件或情况和不发生所述事件或情况。
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
本发明中，“当量(eq)”比指的是溶剂或药品的摩尔比。
本发明中，“适量的”指的是所加入溶剂量或药品量可调范围较大，且对合成结果影响较小，可以不作具体限定。
在下述的实施例中，所用溶剂和药品均为分析纯或化学纯；溶剂在使用前均经过重新蒸馏；无水溶剂均按照标准方法或文献方法进行处理。
实施例
实施例1化合物1的合成
将2-己基癸酸(1.5eq)溶解于适量的二氯甲烷中，加入DMAP(0.5eq)、EDC(1.5eq)活化羧基，30min后加入2-溴乙醇(1.0eq)，室温搅拌16h。TLC确认2-溴乙醇反应完全，用饱和碳酸氢钠溶液多次萃取，加入无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，得到溴化中间产物。
将溴化中间产物(4.8eq)加入到适量的乙醇中，将N,N-双(3-氨丙基)甲胺(1.0eq)溶于适量的乙醇中，加入碳酸钾(4.8eq)，110℃搅拌回流反应过夜。TLC确认N,N-双(3-氨丙基)甲胺反应完全，使用甲醇和二氯甲烷过层析柱，浓缩，得到化合物1。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.42-4.26(d,8H),3.34-3.01(d,8H),2.56-2.49(d,8H),2.46-2.36(m,4H),2.26(s,3H),1.75-1.14(m,100H),0.88-0.79(m,24H)。
实施例2化合物2的合成
将2-丁基辛酸(1.5eq)溶解于适量的二氯甲烷中，加入DMAP(0.5eq)、EDC(1.5eq)活化羧基，30min后加入2-溴乙醇(1.0eq)，室温搅拌16h。TLC确认2-溴乙醇反应完全，用饱和碳酸氢钠溶液多次萃取，加入无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，得到溴化中间产物。
将溴化中间产物(4.8eq)加入到适量的乙醇中，将N,N-双(3-氨丙基)甲胺(1.0eq)溶于适量的乙醇中，加入碳酸钾(4.8eq)，110℃搅拌回流反应过夜。TLC确认N,N-双(3-氨丙基)甲胺反应完全，使用甲醇和二氯甲烷过层析柱，浓缩，得到化合物2。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.45-4.21(d,8H),3.41-3.11(d,8H),2.64-2.52(d,8H),2.50-2.41(m,4H),2.19(s,3H),1.77-1.11(m,68H),0.90-0.80(m,24H)。
实施例3化合物3的合成
将2-己基癸酸(1.5eq)溶解于适量的二氯甲烷中，加入DMAP(0.5eq)、EDC(1.5eq)活化羧基，30min后加入3-溴丙醇(1.0eq)，室温搅拌16h。TLC确认3-溴丙醇反应完全，用饱和碳酸氢钠溶液多次萃取，加入无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，得到溴化中间产物。
将溴化中间产物(4.8eq)加入到适量的乙醇中，将N,N-双(3-氨丙基)甲胺(1.0eq)溶于适量的乙醇中，加入碳酸钾(4.8eq)，110℃搅拌回流反应过夜。TLC确认N,N-双(3-氨丙基)甲胺反应完全，使用甲醇和二氯甲烷过层析柱，浓缩，得到化合物3。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.27-4.24(d,8H),2.63-2.59(d,8H),2.56-2.49(d,8H),2.39-2.31(m,4H),2.19(s,3H),1.69-1.24(m,108H),0.93-0.81(m,24H)。
实施例4化合物4的合成
将2-己基癸酸(1.5eq)溶解于适量的二氯甲烷中，加入DMAP(0.5eq)、EDC(1.5eq)活化羧基，30min后加入3-溴丙醇(1.0eq)，室温搅拌16h。TLC确认3-溴丙醇反应完全，用饱和碳酸氢钠溶液多次萃取，加入无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，得到溴化中间产物。
将溴化中间产物(4.8eq)加入到适量的乙醇中，将3-(双(3-氨丙基)氨基)-1-丙醇(1.0eq)溶于适量的乙醇中，加入碳酸钾(4.8eq)，110℃搅拌回流反应过夜。TLC确认3-(双(3-氨丙基)氨基)-1-丙醇反应完全，使用甲醇和二氯甲烷过层析柱，浓缩，得到化合物4。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ4.16-4.10(d,8H),3.52-3.49(d,2H),2.49-2.46(d,10H),2.38-2.35(d,8H),2.15-2.10(m,4H),1.74-1.31(m,110H),0.95-0.89(m,24H)。
实施例5化合物7的合成
将2-辛基十一烷酸(1.5eq)溶解于适量的二氯甲烷中，加入DMAP(0.5eq)、EDC(1.5eq)活化羧基，30min后加入2-溴乙醇(1.0eq)，室温搅拌16h。TLC确认2-溴乙醇反应完全，用饱和碳酸氢钠溶液多次萃取，加入无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，得到溴化中间产物。
将溴化中间产物(4.8eq)加入到适量的乙醇中，将N,N-双(3-氨丙基)甲胺(1.0eq)溶于适量的乙醇中，加入碳酸钾(4.8eq)，110℃搅拌回流反应过夜。TLC确认N,N-双(3-氨丙基)甲胺反应完全，使用甲醇和二氯甲烷过层析柱，浓缩，得到化合物7。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.38-4.20(d,8H),3.24-3.06(d,8H),2.53-2.42(d,8H),2.45-2.34(m,4H),2.22(s,3H),1.81-1.11(m,124H),0.89-0.78(m,24H)。
实施例6化合物9的合成
将2-(2-(丁基二硫烷基)乙基)辛酸(1.5eq)溶解于适量的二氯甲烷中，加入DMAP(0.5eq)、EDC(1.5eq)活化羧基，30min后加入2-溴乙醇(1.0eq)，室温搅拌16h。TLC确认2-溴乙醇反应完全，用饱和碳酸氢钠溶液多次萃取，加入无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，得到溴化中间产物。
将溴化中间产物(4.8eq)加入到适量的乙醇中，将N,N-双(3-氨丙基)甲胺(1.0eq)溶于适量的乙醇中，加入碳酸钾(4.8eq)，110℃搅拌回流反应过夜。TLC确认N,N-双(3-氨丙基)甲胺反应完全，使用甲醇和二氯甲烷过层析柱，浓缩，得到化合物9。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.35-4.30(d,8H),2.98-2.89(d,8H),2.65-2.59(m,16H),2.46-2.36(m,8H),2.30-2.19(m,4H),2.10(s,3H),1.92-1.14(m,68H),0.93-0.87(m,24H)。
实施例7化合物11的合成
将2-己基癸酸(1.5eq)溶解于适量的二氯甲烷中，加入DMAP(0.5eq)、EDC(1.5eq)活化羧基，30min后加入2-溴乙醇(1.0eq)，室温搅拌16h。TLC确认2-溴乙醇反应完全，用饱和碳酸氢钠溶液多次萃取，加入无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，得到溴化中间产物。
将溴化中间产物(4.8eq)加入到适量的乙醇中，将4-(双(3-氨丙基)氨基)-1-丁醇(1.0eq)溶于适量的乙醇中，加入碳酸钾(4.8eq)，110℃搅拌回流反应过夜。TLC确认4-(双(3-氨丙基)氨基)-1-丁醇反应完全，使用甲醇和二氯甲烷过层析柱，浓缩，得到化合物11。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.28-4.20(d,8H),3.51-3.42(d,2H),3.08-2.91(m,10H),2.48-2.40(m,8H),2.15-2.08(m,4H),1.65-1.14(m,104H),0.92-0.87(m,24H)。
实施例8化合物12的合成
将2-丁基辛酸(1.5eq)溶解于适量的二氯甲烷中，加入DMAP(0.5eq)、EDC(1.5eq)活化羧基，30min后加入2-溴乙醇(1.0eq)，室温搅拌16h。TLC确认2-溴乙醇反应完全，用饱和碳酸氢钠溶液多次萃取，加入无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，得到溴化中间产物。
将溴化中间产物(4.8eq)加入到适量的乙醇中，将4-(双(3-氨丙基)氨基)-1-丁醇(1.0eq)溶于适量的乙醇中，加入碳酸钾(4.8eq)，110℃搅拌回流反应过夜。TLC确认4-(双(3-氨丙基)氨基)-1-丁醇反应完全，使用甲醇和二氯甲烷过层析柱，浓缩，得到化合物12。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.34-4.25(d,8H),3.50-3.43(d,2H),3.15-2.98(m,10H),2.45-2.38(m,8H),2.14-2.05(m,4H),1.68-1.15(m,72H),0.90-0.85(m,24H)。
实施例9化合物15的合成
将2-(3-(丙基二硫烷基)丙基)辛酸(1.5eq)溶解于适量的二氯甲烷中，加入DMAP(0.5eq)、EDC(1.5eq)活化羧基，30min后加入2-溴乙醇(1.0eq)，室温搅拌16h。TLC确认2-溴乙醇反应完全，用饱和碳酸氢钠溶液多次萃取，加入无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，得到溴化中间产物。
将溴化中间产物(4.8eq)加入到适量的乙醇中，将N,N-双(3-氨丙基)甲胺(1.0eq)溶于适量的乙醇中，加入碳酸钾(4.8eq)，110℃搅拌回流反应过夜。TLC确认N,N-双(3-氨丙基)甲胺反应完全，使用甲醇和二氯甲烷过层析柱，浓缩，得到化合物15。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.25-4.17(d,8H),3.05-2.96(d,8H),2.62-2.54(m,16H),2.46-2.41(m,8H),2.31-2.26(m,4H),2.14(s,3H),1.64-1.16(m,68H),1.01-0.86(m,24H)。
实施例10化合物17的合成
将2-己基癸酸(1.5eq)溶解于适量的二氯甲烷中，加入DMAP(0.5eq)、EDC(1.5eq)活化羧基，30min后加入6-溴己醇(1.0eq)，室温搅拌过夜。TLC确认6-溴己醇反应完全，用饱和碳酸氢钠溶液多次萃取，加入无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，得到溴化中间产物。
将溴化中间产物(4.8eq)加入到适量的乙醇中，将2mL N,N-双(3-氨丙基)甲胺(1.0eq)溶于适量的乙醇中，加入碳酸钾(4.8eq)，110℃搅拌回流反应过夜。TLC确认N,N-双(3-氨丙基)甲胺反应完全，使用甲醇和二氯甲烷过层析柱，浓缩，得到化合物17。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.11-4.07(d,8H),3.33-3.20(d,8H),2.75-2.62(d,8H),2.55-2.51(m,4H),2.23(s,3H),1.92-1.07(m,132H),0.95-0.88(m,24H)。
实施例11化合物20的合成
将2-己基癸酸(1.5eq)溶解于适量的二氯甲烷中，加入DMAP(0.5eq)、EDC(1.5eq)活化羧基，30min后加入9-溴-1-壬醇(1.0eq)，室温搅拌16h。TLC确认9-溴-1-壬醇反应完全，用饱和碳酸氢钠溶液多次萃取，加入无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，得到溴化中间产物。
将溴化中间产物(4.8eq)加入到适量的乙醇中，将N,N-双(3-氨丙基)甲胺(1.0eq)溶于适量的乙醇中，加入碳酸钾(4.8eq)，110℃搅拌回流反应过夜。TLC确认N,N-双(3-氨丙基)甲胺反应完全，使用甲醇和二氯甲烷过层析柱，浓缩，得到化合物20。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.11-4.05(d,8H),3.05-2.97(d,8H),2.56-2.49(d,8H),2.41-2.32(m,4H),2.26(s,3H),1.79-1.13(m,156H),0.90-0.79(m,24H)。
实施例12化合物21的合成
将2-丁基辛酸(1.5eq)溶解于适量的二氯甲烷中，加入DMAP(0.5eq)、EDC(1.5eq)活化羧基，30min后加入9-溴-1-壬醇(1.0eq)，室温搅拌16h。TLC确认9-溴-1-壬醇反应完全，用饱和碳酸氢钠溶液多次萃取，加入无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，得到溴化中间产物。
将溴化中间产物(4.8eq)加入到适量的乙醇中，将N,N-双(3-氨丙基)甲胺(1.0eq)溶于适量的乙醇中，加入碳酸钾(4.8eq)，110℃搅拌回流反应过夜。TLC确认N,N-双(3-氨丙基)甲胺反应完全，使用甲醇和二氯甲烷过层析柱，浓缩，得到化合物21。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.13-4.06(d,8H),3.08-2.93(d,8H),2.52-2.45(d,8H),2.40-2.31(m,4H),2.25(s,3H),1.78-1.11(m,124H),0.93-0.78(m,24H)。
实施例13化合物24的合成
将2-己基癸酸(1.5eq)溶解于适量的二氯甲烷中，加入DMAP(0.5eq)、EDC(1.5eq)活化羧基，30min后加入9-溴-1-壬醇(1.0eq)，室温搅拌16h。TLC确认9-溴-1-壬醇反应完全，用饱和碳酸氢钠溶液多次萃取，加入无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，得到溴化中间产物。
将溴化中间产物(4.8eq)加入到适量的乙醇中，将3-(双(3-氨丙基)氨基)-1-丙醇(1.0eq)溶于适量的乙醇中，加入碳酸钾(4.8eq)，110℃搅拌回流反应过夜。TLC确认3-(双(3-氨丙基)氨基)-1-丙醇反应完全，使用甲醇和二氯甲烷过层析柱，浓缩，得到化合物24。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.08-4.06(d,8H),3.52-3.48(d,2H),3.11-3.02(d,8H),2.54-2.45(d,10H),2.21-2.18(m,4H),1.75-1.21(m,158H),0.88-0.80(m,24H)。
实施例14化合物26的合成
将2-己基癸酸(1.5eq)溶解于适量的二氯甲烷中，加入DMAP(0.5eq)、EDC(1.5eq)活化羧基，30min后加入6-溴己醇(1.0eq)，室温搅拌16h。TLC确认6-溴己醇反应完全，用饱和碳酸氢钠溶液多次萃取，加入无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，得到溴化中间产物。
将溴化中间产物(4.8eq)加入到适量的乙醇中，将4-(双(3-氨丙基)氨基)-1-丁醇(1.0eq)溶于适量的乙醇中，加入碳酸钾(4.8eq)，110℃搅拌回流反应过夜。TLC确认4-(双(3-氨丙基)氨基)-1-丁醇反应完全，使用甲醇和二氯甲烷过层析柱，浓缩，得到化合物26。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.11-4.08(d,8H),3.51-3.47(d,2H),3.08-3.01(d,10H),2.51-2.42(d,8H),2.23-2.15(m,4H),1.71-1.16(m,136H),0.92-0.83(m,24H)。
实施例15化合物27的合成
将2-丁基辛酸(1.5eq)溶解于适量的二氯甲烷中，加入DMAP(0.5eq)、EDC(1.5eq)活化羧基，30min后加入6-溴己醇(1.0eq)，室温搅拌过夜。TLC确认6-溴己醇反应完全，用饱和碳酸氢钠溶液多次萃取，加入无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，得到溴化中间产物。
将溴化中间产物(4.8eq)加入到适量的乙醇中，将2mL N,N-双(3-氨丙基)甲胺(1.0eq)溶于适量的乙醇中，加入碳酸钾(4.8eq)，110℃搅拌回流反应过夜。TLC确认N,N-双(3-氨丙基)甲胺反应完全，使用甲醇和二氯甲烷过层析柱，浓缩，得到化合物27。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.15-4.02(d,8H),3.23-3.21(d,8H),2.65-2.60(d,8H),2.49-2.38(m,4H),2.11(s,3H),1.86-1.12(m,100H),0.92-0.85(m,24H)。
实施例16化合物28的合成
将2-丁基辛酸(1.5eq)溶解于适量的二氯甲烷中，加入DMAP(0.5eq)、EDC(1.5eq)活化羧基，30min后加入6-溴己醇(1.0eq)，室温搅拌16h。TLC确认6-溴己醇反应完全，用饱和碳酸氢钠溶液多次萃取，加入无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，得到溴化中间产物。
将溴化中间产物(4.8eq)加入到适量的乙醇中，将4-(双(3-氨丙基)氨基)-1-丁醇(1.0eq)溶于适量的乙醇中，加入碳酸钾(4.8eq)，110℃搅拌回流反应过夜。TLC确认4-(双(3-氨丙基)氨基)-1-丁醇反应完全，使用甲醇和二氯甲烷过层析柱，浓缩，得到化合物28。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.13-4.07(d,8H),3.50-3.46(d,2H),3.09-3.02(d,10H),2.50-2.43(d,8H),2.24-2.15(m,4H),1.68-1.18(m,104H),0.93-0.85(m,24H)。
实施例17化合物29的合成
将2-乙基己酸(1.5eq)溶解于适量的二氯甲烷中，加入DMAP(0.5eq)、EDC(1.5eq)活化羧基，30min后加入2-溴乙醇(1.0eq)，室温搅拌16h。TLC确认2-溴乙醇反应完全，用饱和碳酸氢钠溶液多次萃取，加入无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，得到溴化中间产物。
将溴化中间产物(4.8eq)加入到适量的乙醇中，将N,N-双(3-氨丙基)甲胺(1.0eq)溶于适量的乙醇中，加入碳酸钾(4.8eq)，110℃搅拌回流反应过夜。TLC确认N,N-双(3-氨丙基)甲胺反应完全，使用甲醇和二氯甲烷过层析柱，浓缩，得到化合物29。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.22-4.18(d,8H),3.11-2.98(d,8H),2.46-2.38(d,8H),2.30-2.21(m,4H),2.16(s,3H),1.86-1.32(m,36H),0.95-0.86(m,24H)。
实施例18化合物33的合成
将2-丁基辛酸(1.5eq)溶解于适量的二氯甲烷中，搅拌，加入EDC(1.5eq)，DMAP(0.5)和三乙胺(1eq)，室温搅拌0.5h，加入丙烯酸4-羟基丁酯(1.0eq)，室温反应过夜。TLC确认原料反应完全，加入醋酸调节pH＝6～7，多次萃取，柱层析得到无色透明液体。
将上述得到的无色透明液体(4.8eq)溶解于适量的甲醇中，加入碳酸钾(4.8eq)，然后加入N,N-双(3-氨丙基)甲胺(1.0eq)75℃搅拌过夜；TLC监控原料反应完全，浓缩反应液，使用甲醇和二氯甲烷过层析柱，浓缩，得到化合物33。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.11-4.05(d,16H),2.76-2.72(d,8H),2.43-2.39(d,12H),2.32-2.25(m,8H),2.16(s,3H),1.71-1.17(m,84H),0.87-0.83(m,24H)。
实施例19化合物34的合成
将2-丁基辛酸(1.5eq)溶解于适量的二氯甲烷中，搅拌，加入EDC(1.5eq)，DMAP(0.5eq)和三乙胺(1.0eq)，室温搅拌0.5h，加入2-溴乙醇(1.0eq)，室温反应过夜。TLC确认原料反应完全，加入醋酸调节pH＝6～7，多次萃取，使用甲醇和二氯甲烷过层析柱，浓缩，得到无色透明液体。
将上述得到的无色透明液体(2.1eq)溶解于适量的乙醇中，加入碳酸钾(2.4eq)，然后加入N,N-双(3-氨丙基)甲胺(1.0eq)75℃搅拌过夜；TLC监控原料反应完全，浓缩反应液，使用甲醇和二氯甲烷过层析柱，浓缩，得到淡黄色油状物。
将上述得到的油状物(1.0eq)溶解于适量的甲醇中，加入丙烯酸异癸酯(2.5eq)45℃搅拌过夜；TLC监控原料反应完全，浓缩反应液，使用甲醇和二氯甲烷过层析柱，浓缩，得到化合物34。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.23-4.19(m,8H),3.74-3.70(d,4H),2.87-2.84(d,4H),2.52-2.41(m,12H),2.31-2.25(m,2H),2.08(s,3H),1.76-1.14(m,62H),0.91-0.83(m,24H)。
实施例20化合物35的合成
将2-丁基辛酸(1.5eq)溶解于适量的二氯甲烷中，搅拌，加入EDC(1.5eq)、DMAP(0.5eq)和三乙胺(1.0eq)，室温搅拌0.5h，加入2-溴乙醇(1.0eq)，室温反应过夜。TLC确认原料反应完全，加入醋酸调节pH＝6～7，多次萃取，使用甲醇和二氯甲烷过层析柱，浓缩，得到无色透明液体。
将上述得到的无色透明液体(2.1eq)溶解于适量的乙醇中，加入碳酸钾(2.4eq)，然后加入N,N-双(3-氨丙基)甲胺(1.0eq)75℃搅拌过夜；TLC监控原料反应完全，浓缩反应液，使用甲醇和二氯甲烷过层析柱，浓缩，得到淡黄色油状物。
将上述得到的油状物(1.0eq)溶解于适量的甲醇中，加入丙烯酸癸酯(2.5eq)45℃搅拌过夜；TLC监控原料反应完全，浓缩反应液，使用甲醇和二氯甲烷过层析柱，浓缩，得到化合物35。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.23-4.19(d,8H),3.74-3.70(d,4H),2.87-2.84(d,4H),2.52-2.41(m,12H),2.31-2.25(m,2H),2.08(s,3H),1.76-1.14(m,68H),0.91-0.83(m,18H)。
实施例21化合物36的合成
将2-乙基丁酸(1.5eq)溶解于适量的二氯甲烷中，搅拌，加入EDC(1.5eq)、DMAP(0.5eq)和三乙胺(1.0eq)，室温搅拌0.5h，加入6-溴己醇(1.0eq)，室温反应过夜。TLC确认原料反应完全，加入醋酸调节pH＝6～7，多次萃取，使用甲醇和二氯甲烷过层析柱，浓缩，得到无色透明液体。
将上述得到的无色透明液体(4.8eq)溶解于适量的乙醇中，加入碳酸钾(4.8eq)然后加入N,N-双(3-氨丙基)甲胺(1.0eq)75℃搅拌过夜；TLC监控原料反应完全，浓缩反应液，使用甲醇和二氯甲烷过层析柱，浓缩，得到化合物36。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.15-4.10(d,8H),2.94-2.87(d,8H),2.51-2.47(d,8H),2.42-2.39(m,4H),2.22(s,3H),1.85-1.23(m,52H),0.95-0.90(m,24H)。
实施例22化合物37的合成
将4-甲基戊酸(1.5eq)溶解于适量的二氯甲烷中，搅拌，加入EDC(1.5eq)、DMAP(0.5eq)和三乙胺(1.0eq)，室温搅拌0.5h，加入6-溴己醇(1.0eq)，室温反应过夜。TLC确认原料反应完全，加入醋酸调节pH＝6～7，多次萃取，使用甲醇和二氯甲烷过层析柱，浓缩，得到无色透明液体。
将上述得到的无色透明液体(4.8eq)溶解于适量的乙醇中，加入碳酸钾(4.8eq)然后加入N,N-双(3-氨丙基)甲胺(1.0eq)75℃搅拌过夜；TLC监控原料反应完全，浓缩反应液，使用甲醇和二氯甲烷过层析柱，浓缩，得到化合物37。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.21-4.13(d,8H),3.02-2.92(d,8H),2.46-2.32(m,16H),2.18(s,3H),1.65-1.23(m,48H),0.91-0.90(m,24H)。
实施例23化合物38的合成
将2-己基癸酸(1.5eq)溶解于适量的二氯甲烷中，搅拌，加入EDC(1.5eq)、DMAP(0.5eq)和三乙胺(1.0eq)，室温搅拌0.5h，加入2-溴乙醇(1.0eq)，室温反应过夜。TLC确认原料反应完全，加入醋酸调节pH＝6～7，多次萃取，使用甲醇和二氯甲烷过层析柱，浓缩，得到无色透明液体。
将上述得到的无色透明液体(2.1eq)溶解于适量的乙醇中，加入碳酸钾(2.4eq)，然后加入N,N-双(3-氨丙基)甲胺(1.0eq)75℃搅拌过夜；TLC监控原料反应完全，浓缩反应液，使用甲醇和二氯甲烷过层析柱，浓缩，得到淡黄色油状物。
将上述得到的油状物(1.0eq)溶解于适量的甲醇中，加入丙烯酸异癸酯(2.5eq)45℃搅拌过夜；TLC监控原料反应完全，浓缩反应液，使用甲醇和二氯甲烷过层析柱，浓缩，得到化合物38。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.23-4.19(m,8H),3.74-3.70(d,4H),2.87-2.84(d,4H),2.52-2.41(m,12H),2.31-2.25(m,2H),2.08(s,3H),1.76-1.14(m,78H),0.91-0.83(m,24H)。
实施例24化合物39的合成
将2-己基癸酸(1.5eq)溶解于适量的二氯甲烷中，搅拌，加入EDC(1.5eq)、DMAP(0.5eq)和三乙胺(1.0eq)，室温搅拌0.5h，加入4-羟基丁基丙烯酸酯(1.0eq)，室温反应过夜。TLC确认原料反应完全，加入醋酸调节pH＝6～7，多次萃取，使用甲醇和二氯甲烷过层析柱，浓缩，得到无色透明液体。
将上述得到的油状物(4.8eq)溶解于适量的甲醇中，加入N,N-双(3-氨丙基)甲胺(1.0eq)45℃搅拌过夜；TLC监控原料反应完全，浓缩反应液，使用甲醇和二氯甲烷过层析柱，浓缩，得到化合物39。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.12-4.01(m,16H),2.76-2.64(m,12H),2.47-2.27(m,16H),2.01(s,3H),1.75-1.14(m,116H),0.88-0.85(m,24H)。
实施例25化合物45的合成
将2-丁基辛酸(1.5eq)溶解于适量的二氯甲烷中，搅拌，加入EDC(1.5eq)、DMAP(0.5eq)和三乙胺(1.0eq)，室温搅拌0.5h，加入4-羟丁基乙烯基醚(1.0eq)，室温反应过夜。TLC确认原料反应完全，加入醋酸调节pH＝6～7，多次萃取，使用甲醇和二氯甲烷过层析柱，浓缩，得到无色透明液体。
将上述得到的油状物(4.8eq)溶解于适量的甲醇中，加入N,N-双(3-氨丙基)甲胺(1.0eq)45℃搅拌过夜；TLC监控原料反应完全，浓缩反应液，使用甲醇和二氯甲烷过层析柱，浓缩，得到化合物45。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.12-4.01(m,8H),3.62-3.58(m,8H),3.48-3.45(m,8H),2.47-2.35(m,16H),2.31-2.27(m,4H),2.18(s,3H),1.75-1.14(m,84H),0.91-0.88(m,24H)。
实施例26
将化合物1、2、17、27、33分别与胆固醇、DOPE、PEG-DMG以35:46.5:16:2.5的摩尔比溶解于第一溶液中，将荧光素酶mRNA溶解于第二溶液中，其中，第一溶液为90％的乙醇与10％的pH 4.0的50mM柠檬酸缓冲盐水溶液的混合溶液，第二溶液为pH 4.0的50mM柠檬酸缓冲盐水溶液，二者体积比1:3，使用微流控将两相快速混合并使用透析或切向流将缓冲环境置换成pH 7.4的PBS，以除去乙醇，分别制备得到五种LNP@mRNA。
测试各LNP@mRNA的粒径、PDI和包封率，其结果如表1所示。其结果显示，化合物1、2、27、33与其它三种脂质共同制备的LNP@mRNA粒径较小，化合物1、2、17、33与其它三种脂质共同制备的LNP@mRNA包封率较高。
表1各LNP@mRNA的粒径、PDI、包封率
化合物 粒径(nm) PDI 包封率(％)
1 95 0.14 96
2 84 0.20 86
17 184 0.19 96
27 90 0.21 57
33 86 0.11 96
将制备的各LNP@mRNA通过尾静脉或肌肉分别注射注入小鼠体内，6小时后测试小鼠体内荧光强度及器官分布情况。图1为化合物2与其它三种脂质共同制备LNP@mRNA的肌肉注射结果；图2为化合物2与其它三种脂质共同制备LNP@mRNA尾静脉注射结果；图3为化合物2与其它三种脂质共同制备LNP@mRNA静脉注射解剖图，结果显示mRNA主要在脾脏(图3中B)表达，少量在肝脏(图3中A)表达；图4为化合物27与其它三种脂质共同制备LNP@mRNA静脉注射解剖图，结果显示mRNA主要在脾脏(图4中B)表达，少量在肝脏(图4中A)表达；图5为化合物33与其它三种脂质共同制备LNP@mRNA的尾静脉注射结果；图6为化合物33与其它三种脂质共同制备LNP@mRNA的尾静脉注射解剖图，结果显示mRNA主要在肝脏(图6中A)表达，部分在脾脏(图6中B)表达。
图7为化合物2与其它三种脂质共同制备LNP@mRNA的透射电镜图。
实施例27
将化合物2与胆固醇、DOPE、DSPC、PEG-DMG以表2中的摩尔比分别溶解于第一溶液中，将荧光素酶mRNA溶解于第二溶液中，其中，第一溶液为乙醇-水溶液，第二溶液为pH 4.0的50mM柠檬酸缓冲盐水溶液，二者体积比1:3，使用微流控将两相快速混合，并使用透析或切向流将缓冲环境置换成pH 7.4的PBS，以除去乙醇，制备得到LNP@mRNA。
表2化合物2与其它三种脂质在第一溶液中的溶解比例
Figure BDA0003115883920000241
测试上述各LNP@mRNA的粒径、PDI和包封率，其结果依次如表3中所示。
表3各LNP@mRNA的粒径、PDI、包封率
样品名称 粒径(nm) PDI 包封率(％)
比例1 93 0.36 82
比例2 77 0.14 70
比例3 58 0.15 85
比例4 76 0.32 80
比例5 139 0.17 69
将制备出的mRNA@LNP通过肌肉注射注入小鼠体内，6小时后测试小鼠体内荧光强度及器官分布情况。图8为化合物2与其它几种脂质以不同比例共同制备的LNP@mRNA肌肉注射6小时后测试小鼠体内荧光强度最大值，结果显示比例1制备的mRNA@LNP在小鼠体内表达量最高。
测试不同摩尔比制备的LNP@mRNA在不同pH下Zeta电位变化情况，结果如下表4。通过表4可以看到，该类化合物制备的LNP可以在不同pH下展现出不同的电荷：在酸性条件下带有正电，可以与负电的核酸药物相互吸引；在中性条件下可以展现电中性或者负电，在体内不会与负电的细胞膜作用，避免产生细胞毒性。
表4 LNP@mRNA在不同pH下Zeta电位变化
Zeta(mV) pH 4.0 pH 7.4 pH 10.0
1 10.8 -1.1 -41.8
2 9.05 -4.29 -39.4
3 8.42 -9.63 -32.5
4 9.35 -10.6 -33.3
5 8.19 -14.4 -44.1
实施例28
将化合物2与DOTAP、胆固醇、DSPC、PEG-DMG以30:20:38.5:10:1.5摩尔比溶解于第一溶液中，将荧光素酶mRNA溶解于第二溶液中，其中，第一溶液为乙醇，第二溶液为pH 4.0的50mM柠檬酸缓冲盐水溶液，二者体积比1:3，使用微流控将两相快速混合，并使用透析或切向流将缓冲环境置换成pH 7.4的PBS，制备得到LNP@mRNA。加入冻存保护剂蔗糖，得到核酸脂质纳米粒药物制剂。
实施例29
将化合物34与DOTAP、磷脂酰丝氨酸、胆固醇、DSPC、PEG-DMG(总15mg)以20:25:15:25:5:10摩尔比溶解于第一溶液中，将荧光素酶mRNA(5mg)溶解于第二溶液中，其中，第一溶液为乙醇，第二溶液为pH 4.0的50mM柠檬酸缓冲盐水溶液，二者体积比1:3，使用微流控将两相快速混合，并使用透析或切向流将缓冲环境置换成pH 7.4的PBS，制备得到LNP@mRNA。加入冻存保护剂蔗糖，得到核酸脂质纳米粒药物制剂。
实施例30
将化合物37与Dlin-KC2-DMA、DOPG、胆固醇、DSPC、吐温-80(总30mg)以15:5:3:51.5:25:0.5摩尔比溶解于第一溶液中，将荧光素酶mRNA(1mg)溶解于第二溶液中，其中，第一溶液为乙醇，第二溶液为pH 4.0的50mM柠檬酸缓冲盐水溶液，二者体积比1:3，使用微流控将两相快速混合，并使用透析或切向流将缓冲环境置换成pH 7.4的PBS，制备得到LNP@mRNA。加入冻存保护剂蔗糖，得到核酸脂质纳米粒药物制剂。
需要说明的是，尽管以具体实例介绍了本发明的技术方案，但本领域技术人员能够理解，本发明应不限于此。以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。本文中所用术语的选择，旨在最好地解释各实施例的原理、实际应用或对市场中的技术改进，或者使本技术领域的其它普通技术人员能理解本文披露的各实施例。

Claims (12)

1.式(I-1-1)化合物或其药学上可接受的盐，
Figure FDA0003492189990000011
其中：
每个A各自独立地为-O(C＝O)-或-(C＝O)O-；
每个R1、R2、R3和R4各自独立地为含有1至16个碳原子的烷基；
R5为C1烷基；
a为3，b为2，e为0；
每个d各自独立地为0至14的任一整数。
2.下列化合物或其药学上可接受的盐：
Figure FDA0003492189990000012
3.一种脂质载体，其包含根据权利要求1或2所述的化合物或其药学上可接受的盐。
4.根据权利要求3所述的脂质载体，其特征在于，
所述脂质载体包含第一脂质化合物和第二脂质化合物，其中，所述第一脂质化合物包含根据权利要求1或2所述的化合物或其药学上可接受的盐以及阳离子脂质，所述第二脂质化合物包含阴离子脂质、中性脂质、固醇和两亲性脂质中的至少一种。
5.根据权利要求4所述的脂质载体，其特征在于，
所述阳离子脂质选自DLinDMA、DODMA、DLin-MC2-MPZ、DLin-KC2-DMA、DOTAP、C12-200、DC-Chol和DOTMA中的至少一种；
所述阴离子脂质选自磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸、磷脂酰甘油、DOPG和二豆蔻酰磷脂酰甘油中的至少一种；
所述中性脂质选自DOPE、DSPC、DPPC、DOPC、DPPG、POPC、POPE、DPPE、DMPE、DSPE、和SOPE中的至少一种或其经阴离子或阳离子修饰基团修饰的脂质；
所述两亲性脂质选自PEG-DMG、PEG-c-DMG、PEG-C14、PEG-c-DMA、PEG-DSPE、PEG-PE、PEG修饰的神经酰胺、PEG修饰的二烷基胺、PEG修饰的二酰基甘油、吐温-20、吐温-80、PEG-DPG、PEG-s-DMG、DAA、PEG-c-DOMG和GalNAc-PEG-DSG中的至少一种。
6.根据权利要求3-5任一项所述的脂质载体，其特征在于，
在所述脂质载体中，所述第一脂质化合物、所述阴离子脂质、所述中性脂质、所述固醇和所述两亲性脂质的摩尔比为(20～65):(0～20):(5～25):(25～55):(0.3～15)；
其中，所述第一脂质化合物中，根据权利要求1或2所述的化合物或其药学上可接受的盐和所述阳离子脂质的摩尔比为(1～10):(0～10)。
7.一种核酸脂质纳米粒组合物，其包含根据权利要求1或2所述的化合物或其药学上可接受的盐或根据权利要求3-6任一项所述的脂质载体，以及核酸药物。
8.根据权利要求7所述的核酸脂质纳米粒组合物，其特征在于，
所述核酸药物选自DNA、siRNA、mRNA、dsRNA、反义核酸、微RNA、反义微RNA、antagomir、微RNA抑制剂、微RNA激活剂和免疫刺激性核酸中的至少一种。
9.根据权利要求7或8所述的核酸脂质纳米粒组合物，其特征在于，
所述核酸药物与根据权利要求1或2所述的化合物或其药学上可接受的盐的质量比为1:(3～40)；或者，所述核酸药物与根据权利要求3-6任一项所述的脂质载体的质量比为1:(3～40)。
10.一种药物制剂，其包含根据权利要求1或2所述的化合物或其药学上可接受的盐，或根据权利要求3-6任一项所述的脂质载体，或根据权利要求7-9任一项所述的核酸脂质纳米粒组合物，以及药学上可接受的赋形剂、载体和稀释剂。
11.根据权利要求10所述的药物制剂，其特征在于，
所述药物制剂的粒径为30～500nm。
12.根据权利要求10或11所述的药物制剂，其特征在于，
所述核酸药物在所述药物制剂中的包封率大于50％。
CN202110662426.3A 2021-04-30 2021-06-15 脂质化合物及包含其的脂质载体、核酸脂质纳米粒组合物和药物制剂 Active CN113402404B (zh)

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